DE19717717B4 - Verfahren zur nichtinvasiven Erkennung bösartiger Tumoren der Lunge - Google Patents

Verfahren zur nichtinvasiven Erkennung bösartiger Tumoren der Lunge Download PDF

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Abstract

Verfahren zur Erkennung von bösartigen Lungentumoren des Menschen durch Isolierung genomischer DNA aus Atemkondensaten, Einsatz dieser als Substrat für eine spezifische Vervielfältigung von Abschnitten relevanter Tumormarkergene und Nachweis von Veränderungen in der DNA-Sequenz dieser Abschnitte über allelspezifische Hybridisierungsreaktionen.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erkennung von bösartigen Lungentumoren des Menschen sowie die Verwendung von Atemluft zur Isolierung genomischer DNA und zur Früherkennung von bösartigen Lungentumoren.
  • Lungentumore gehören weltweit zu den häufigsten Krebserkrankungen und stehen dabei an erster Stelle in der Mortalitätstatistik. Die Problematik dieser Erkrankungen tritt besonders dadurch zutage, daß eine frühzeitige Diagnose bisher nicht erbracht werden kann und nach erfolgter klassischer Diagnose die Progose generell fatal ist.
  • Gegenwärtig erfolgt die Diagnostik von Lungentumoren mit bildgebenden Verfahren (Röntgenuntersuchungen), in Spezialfällen mittels Computertomographien. Diagnostiziert werden können auf einem solchen Wege in der Regel erst manifeste Tumoren, welche schon raumfordernde Prozesse darstellen. Eine histologische Untersuchung erfolgt nach Auffälligkeiten in der bildgebenden Untersuchung. Dabei ist die Gewinnung von Probenmaterial an eine chirurgische Manipulation gebunden. Sie ist deshalb nicht unproblematisch und muß in der Regel auch wiederholt werden.
  • Für eine Erkennung von Lungentumoren bzw. für die Früherkennung präneoplastischer Veränderungen gibt es bisher noch kein routinetaugliches und nichtinvasives Verfahren.
  • Eine mögliche Alternative für die Früherkennung von bösartigen Erkrankungen der Lunge bietet der molekularbiologische Nachweis von mutativen Veränderungen in Onkogenen oder Tumorsuppressorgenen.
  • Es ist bekannt, daß eine Reihe von solchen molekularen Tumormarkern in Lungentumoren genetisch verändert sind. Als in Frage kommende molekulare Tumormarker zählen das Protoonkogen Kiras sowie die Tumorsuppressorgene. In Abhängigkeit vom histologisch charakterisierten Tumortyp liegt die Häufigkeit des Vorliegens von Mutationen in diesen Tumormarkern zwischen 50–70%. Der Erfindung liegt die Erkenntnis zu Grunde, dass die Veränderungen der DNA-Seguenzen dieser Gene oftmals in einem frühzeitigen Stadium der Tumorentwicklung auftreten. Das Auffinden und die Charakterisierung dieser Veränderungen dient somit eindeutig einer frühen Diagnosefindung.
  • Vom Nachweis von K-ras Codon 12-Mutationen in Bronchoalveolären Lavagen bzw. Sputum wurde bereits berichtet (WO 95/13397 A1; MILLS, N.E.: Detection of K-ras codon 12 mutations in bronchoalveolar lavage fluid for lung cancer diagnosis. J. Natl. Cancer Inst. (1995) 87 (14) 1056–60; SCOTT, F.M. u.a.: High frequency of K-ras codon 12 mutations in bronchoalveolar lavage fluid of patients at high risk for second primary lung cancer. Clin. Cancer Res. (März 1997) 3 (3) 479–482 und JACOBSON, D.R. u.a.: Molecular genetic tumor markers in the early diagnosis and screening of non-small-cell lung cancer. Ann. Oncol. (1995) 6 (Suppl. 3) S.3–8)
  • Ein solches Nachweisverfahren kann aber nur dann sinnvoll eingesetzt werden, wenn ein routinetaugliches System für die Untersuchung von Risikogruppen (Raucher, Bergbauarbeiter, Staub-Exponierte) verfügbar ist.
  • Dokument WO 91/05255 A1 beschreibt in den Beispielen 2 und 3, Seite 4 den Nachweis von Makromolekülen, insbesondere Proteinen, in der Atemluft. Von einem Nachweis von DNA wird nicht explizit berichtet.
  • Dokument US 4 772 559 A listet in Tabelle 1, Spalte 6 Substanzen aus der Atemluft auf, die zur Diagnose von Lungenkrebs verwendbar sind, Nukleinsäuren finden sich nicht in dieser Liste.
  • In den Dokumenten WO 95/18566 A1 und WO 95/31721 A1 werden allgemein Atemkondensatsammler beschrieben und ein Isoliersystem für Nukleinsäuren beschreibt das Dokument WO 95/34569 A1.
  • Es ist bisher jedoch noch kein routinemäßig einsetzbares Untersuchungsverfahren zur nichtinvasiven Erkennung bösartiger Tumoren in der Lunge entwickelt worden.
    •
  • Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, unter Vermeidung aufwendiger und für eine frühzeitige Diagnostik ungeeigneter Röntgenuntersuchungen und chirurgischer Massnahmen der Gewinnung von Untersuchungsmaterial ein Nachweisverfahren zur Früherkennung bösartiger Lungentumoren zu entwickeln.
  • Diese Aufgabe konnte überraschend durch Verwendung von Atemluft gelöst werden und wird durch die Ansprüche realisiert.
  • Erfindungsgemäss erfolgt die molekulare Diagnostik genetischer Abberationen relevanter Tumormarkergene direkt aus einem Atemkondensat. Die Gewinnung des Atemkondensates wird mit kommerziell verfügbaren Atemkondensatsammlern, mit denen die Ausatemluft von Patienten in einen gekühlten Sammelschlauch überführt wird, durchgeführt. Das gewonnene Kondensat wird anschliessend eingeengt und ist Ausgangsmaterial für die Isolierung genomischer DNA des Patienten. Quelle für die DNA Isolierung sind zum einem im Atemkondensat enthaltene abgeschilferte epitheale Zellen der Lunge bzw. auch im Kondensat enthaltene sogenannte nackte DNA.
  • Die DNA-Isolierung gelingt mit einem hochempfindlichen Extraktionsverfahren gemäss der Ansprüche 2–5.
  • So erfolgt die Inkubation des Lysates mit einem mineralischen Trägermaterial zur Bindung der DNA; vorzugsweise handelt es sich bei dem Trägermaterial um hochdisperse, nichtporöse SiO2-Partikeln mit einer Korngröße von 7 nm–1 μm, vorzugsweise 40 nm, bei einer spezifischen Oberfläche von 10–300 m2/g, vorzugsweise 50 m2/g.
  • In einer bevorzugten Ausführungsvariante wird dabei das mineralische Trägermaterial mit der gebundenen genomischen DNA auf eine Membran aus Polysulfonether verbracht, welche sich am Boden eines Mikrofiltergefäßes oder einer Filter-Mikrotestplatte befindet und es wird auf dieser Membran durch Zentrifugation oder mittels Vakuum fixiert. Dabei zeigte sich erstaunlicherweise, daß durch die Wahl des Lyse-Bindungspuffers die bevorzugt verwendeten Nanopartikel des Trägermaterials auf der Membran verbleiben und in Folgeschritten hervorragend mittels einer Waschlösung, vorzugsweise aus aus Ethanol, Natriumchlorid und Tris-HCl, von kontaminierenden Substanzen gereinigt und in einem finalen Schritt die Nukleinsäure vom Trägermaterial mit einem Niedrigsalzpuffer, vorzugsweise aus Tris-HCl und EDTA, eluiert wird. Diese erfindungsgemäße Ausführung ermöglicht die Automatisierung der Probengewinnung und liefert darüber hinaus in der manuellen Ausführung eine extrem schnelle und hochempfindliche Isolierung genomischer DNA. Die Isolierung der DNA ist in weniger als 10 Minuten beendet und damit schneller als alle anderen bisher beschriebenen Verfahren.
  • Die gewonnene DNA ist nun Ausgangsmaterial für selektive enzymatische Vervielfältigungsreaktionen mittels klassischer molekularbiologischer Techniken. Dabei können je nach Zielstellung unterschiedliche Tumormarkergene vervielfältigt werden. Die nachfolgende Untersuchung genetischer Veränderungen wird mittels allelspezifischer Hybridisierungsreaktionen erreicht. Dies gestattet einen hochempfindlichen Nachweis mutierter DNA-Sequenzbereiche auch aus Mischproben von gesunden und mutierten Zellen.
  • Der Nachweis der Hybridisierungsreaktion erfolgt in Form eines direkten enzymatischen Verfahrens, bei welchem die Hybridisierungssonde mit einer Markierung versehen ist gegen welche ein enzymkonjugierter Antikörper gerichtet ist. Nach Zugabe eines Substrates wird anschliessend eine kolorimetrische Messung durchgeführt, die als Indikator der Hybridisierungsreaktion fungiert.
  • Das Verfahren wird in einer Variante wesentlich dadurch vereinfacht, dass anstelle eines indirekten enzymatischen Nachweisverfahrens eine direkte optische Messung der Sondenmarkierung erfolgt. Dies gestattet die Zeitdauer eines solchen Nachweises ganz erheblich zu verkürzen.
  • Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Atemluft, vorzugsweise in Form von Kondensaten, zur Isolierung von DNA und zur Erkennung von bösartigen Lungentumoren des Menschen.
  • Die einfache Möglichkeit, Atemluft als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemässe Nachweisverfahren einsetzen zu können, stellt ein neuartige Entwicklung in der Medizin dar. Der grosse Vorteil liegt darin, dass damit nicht nur eine einfache und kostengünstige Methode für Routineuntersuchungen, insbesondere für die Früherkennung von Lungentumoren, zur Verfügung steht, sondern gleichzeitig zahlreichen Betroffenen die Pein einer schmerzvollen Untersuchung erspart wird.
  • Die Erfindung wird nachfolgend an Ausführungsbeispielen dargestellt.
    •
  • Ausführungsbeispiel 1
  • Nachweis von Mutationen im Protoonkogen Ki-ras in Atemkondensaten
  • Die Gewinnung des Atemkondensates erfolgt mit einem kommerziell erhältlichen Ausatemluftsammler. Dabei werden ca. 150–300 l Luft gesammelt, und das Atemkondensat wird anschliessend eingeengt.
  • Die DNA-Extraktion erfolgt durch Zugabe von 500 μl Lysepuffer-Bindungspuffer (Guanidinisothiocyanat, N-Lauryl-Sarcosyl; DTT) und Inkubation für 5min bei Raumtemperatur. Zugabe von 10 μl der DNA-Bindungsmatrix (unporöse Nanopartikel von reinem Siliziumdioxyd in wässriger Lösung) und Inkubation für 1 min. Überführen der Gesamtlösung auf eine Mikrozentrifugationssäule mit einer Polysulfonethermembran und Zentrifugation für 30 s bei 10.000 × g und Verwerfen des Filtrates.
  • Zugabe von 600 μl einer Waschlösung (70% Ethanol; NaCl, Tris-HCl) und erneute Zentrifugation für 30 s bei 10.000 × g. Verwerfen des Filtrates und Wiederholung des letzten Schrittes. Nochmalige 1 minütige Zenrifugation und Überführen des Zentrifugationseinsatzes in ein neues Reaktionsgefäss, Zugabe von 50 μl eines auf 70 DEG C vorgewärmten Elutionsmittels (10 mmol/l Tris-HCl; 0.1 mmol/l DTA; pH 9.0) und Zentrifugation für 1 min bei 10.000 × g.
  • Die so gewonnene DNA ist Substrat für die selektive Vervielfältigung des zu untersuchenden DNA-Abschnittes (Kodon 12) des Tumormarkergens Ki-ras. Dabei wird ein Primer mit einer Biotinmarkierung eingesetzt.
  • Nach der Vervielfältigungsreaktion wird das doppelsträngige Vervielfältigungsprodukt über die Biotinmarkierung an eine Streptavidin-beschichtete Mikrotestplatte überführt und mittels einer alkalischen Denaturierung der nichtgebundene Strang abgewaschen. Gegen den an der Plattenoberfläche immobilisierten DNa-Abschnitt des Ki-ras-Gens wird anschliessend mit verschiedenen Hybridisierungsoligonukleotiden hybridisiert. Durch sehr stringente Waschschritte erfolgt die Entfernung aller zur Zielsequenz nicht eindeutig komplementären Hybridisierungssonden und ermöglicht so eine hochsensitive Identifizierung von Einzelbasenmutationen. Die Hybridisierungsoligonukleotide sind mit einer Markierung versehen, welche anschliessend mit Standardmethoden nachgewiesen werden.
  • Anhand der erhaltenen kolorimetrischen Messergebnisse kann die Charakterisierung der zu untersuchenden DNA-Sequenz des Ki-ras-Gen ausgewertet werden.
  • Ausführungsbeispiel 2
  • Aus den gewonnenen Atemkondensaten von drei Patienten mit Lungen-Tumoren (zwei Patienten (Personen Nr.1, 2) mit epidermoidem und ein Patient (Nr. 3) mit adenokarcinoidem histopathologischem Befund) und einer Person (Nr. 4) ohne Befund wurde wie oben beschrieben der zu untersuchende DNA-Abschnitt (Kodon 12) mittels einer PCR amplifiziert (Primersequenzen 5'-ATGACTGAATATAAACTTGTGGTA-3' (biotinyliert) und 5'-TGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGA-3') und die Vervielfältigungsprodukte analog in jeweils 14 Vertiefungen immobilisiert. Nach Herunterwaschen des nicht-biotinylierten Strangs und Blockierung evt. verbliebener Streptavidin Bindungsstellen mit einer Biotin-Lösung wurde mit den folgenden biotinylierten Primern inkubiert (Zweifachbestimung):
    5'-GGTGGAGCTGGTGGCGTAGG-3' (wt = native Sequenz)
    5'-GGTGGAGCTAGTGGCGTAGG-3' (mut1)
    5'-GGTGGAGCTGTTGGCGTAGG-3' (mut2)
    5'-GGTGGAGCTGATGGCGTAGG-3' (mut3)
    5'-GGTGGAGCTCGTGGCGTAGG-3' (mut4)
    5'-GGTGGAGCTTGTGGCGTAGG-3' (mut5)
    5'-GGTGGAGCTGCTGGCGTAGG-3' (mut6)
  • Nach den stringenten Waschschritten wurde mit Streptavidin-AP (Alkaline Phosphatase) inkubiert, gewaschen, das Substrat pNPP zugegeben und die Absorption bei 405 nm vermessen. Von den verwendeten Primern mit Mutation zeigten bei dem Patienten Nr. 1 mut1 und bei den Patienten Nr. 2 und 3. mut1 und mut2 deutliche Signale im Vergleich zur gesunden Person Nr. 4 mit folgenden mittleren Werten (OD405)
    Figure 00070001

Claims (12)

  1. Verfahren zur Erkennung von bösartigen Lungentumoren des Menschen durch Isolierung genomischer DNA aus Atemkondensaten, Einsatz dieser als Substrat für eine spezifische Vervielfältigung von Abschnitten relevanter Tumormarkergene und Nachweis von Veränderungen in der DNA-Sequenz dieser Abschnitte über allelspezifische Hybridisierungsreaktionen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die genomische DNA aus Atemkondensaten, welche aus der Ausatemluft stammen, isoliert wird, indem die Atemkondensate mit einem Lyse-Bindungspuffer sowie mit einem mineralischen Trägermaterial zur Bindung genomischer DNA inkubiert werden und nach Durchführung von Waschschritten die genomische DNA vom Trägermaterial wieder abgelöst wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als mineralisches Trägermaterial Silicamaterialien, vozugsweise nichtporöses Siliziumdioxyd mit einer Teilchengröße von 7nm–1μl verwendet wird.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Lyse-Bindungspuffer Guanidinisothiocyanat, Lithiumchlorid oder Guanidinhydrochlorid in Kombination mit Detergenzien verwendet wird.
  5. Verfahren nach Anspruch 2–4, dadurch gekennzeichnet, daß die unter Lyse-Bindungspuffer am Trägermaterial fixierte genomische DNA auf eine Membran aus Polysulfonether mit einer bevorzugten Porengröße von 0,2 μl–0,5 μm aufgetragen und durch einen Zentrifugationsschritt oder eine Vakuumfiltration das Trägermaterial auf der Membran fixiert, durch Zugabe eines Waschpuffers auf der Membran gewaschen und mit einem Niedrigsalzpuffer eluiert wird.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als molekularer Tumormarker relevante DNA-Abschnitte von Protoonkogenen und Tumorsuppressorgenen untersucht werden.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis klinisch relevanter Veränderungen der DNA Sequenz der Tumormarkergene über basenkomplementäre Hybridisierungsreaktionen mit Hybridisierungsoligonukleotiden definierter Komplementarität zu den veränderten Sequenzabschnitten der DNA-Abschnitte der Tumormarkergene erfolgt.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die jeweiligen vervielfältigten diagnostisch relevanten Sequenzabschnitte oder die zu diesen Sequenzabschnitten jeweils spezifischen Hybridisierungssonden sich an einer festen Phase befinden und mit den jeweiligen Hybridisierungspartnern inkubiert werden
  9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Hybridisierungs-Oligonukleotide oder die zu untersuchenden vervielfältigten DNA-Abschnitte der Tumormarkergene mit einer Markierung versehen sind und dass das Ergebnis der Hybridisierungsreaktion über einen indirekten enzymatischen Nachweis oder einem direkten optischen Nachweis der Markierung erfolgt.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1–9, dadurch gekennzeichnet, dass das zu untersuchende Tumormarkergen Ki-ras ist.
  11. Verwendung von Atemluft in Form von Atemkondensaten zur Isolierung von DNA.
  12. Verwendung von Atemluft in Form von Atemkondensaten zur nichtinvasiven Erkennung bösartiger Tumoren der Lunge.
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2315257A1 (en) * 1997-12-18 1999-07-01 Invitek Gmbh Method for isolating short and long-chain nucleic acids
WO2004058064A2 (en) 2002-12-20 2004-07-15 Amidex, Inc. Breath aerosol collection system and method
DE102006029926B4 (de) 2006-06-29 2008-11-20 Siemens Ag Anordnung und Verfahren zur Identifizierung von Personen

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4772559A (en) * 1985-10-10 1988-09-20 Monell Chemical Senses Center Method of detecting the presence of bronchogenic carcinoma by analysis of expired lung air
WO1991005255A1 (de) * 1989-09-30 1991-04-18 Nmi Naturwissenschaftliches Und Medizinisches Institut An Der Universität Tübingen In Reutlingen Diagnose von lungenkrankheiten durch analyse von nicht-flüchtigen und flüchtigen bestandteilen der atemluft
WO1995013397A1 (en) * 1993-11-12 1995-05-18 The Johns Hopkins University School Of Medicine Nucleic acid mutation detection by analysis of sputum
WO1995018566A1 (en) * 1994-01-11 1995-07-13 Michael Phillips Breath collection
WO1995031721A1 (de) * 1994-05-13 1995-11-23 Filt Forschungsgesellschaft Für Lungen- Und Thoraxerkrankungen Mbh Verfahren und vorrichtung zum sammeln von ausgeatmetem atemkondensat
WO1995034569A1 (de) * 1994-06-14 1995-12-21 Invitek Gmbh Universelles verfahren zur isolierung und reinigung von nukleinsäuren aus extrem geringen mengen sowie sehr stark verunreinigten unterschiedlichsten ausgangsmaterialien

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4321904B4 (de) * 1993-07-01 2013-05-16 Qiagen Gmbh Verfahren zur chromatographischen Reinigung und Trennung von Nucleinsäuregemischen
DE4422044A1 (de) * 1994-06-14 1995-12-21 Invitek Gmbh Verfahren zur Isolierung, Reinigung und ggf. Lagerung von Nukleinsäuren
DE19506887C2 (de) * 1995-02-17 1999-10-14 Invitek Gmbh Verfahren zur simultanen Isolierung von genomischer DNS und hochreiner Total RNS
DE19737917B4 (de) * 1996-08-26 2008-11-06 InViTek Gesellschaft für Biotechnik & Biodesign mbH Verfahren zum Nachweis klinisch relevanter Veränderungen der DNS-Sequenz des Ki-ras-Onkogens, seine Verwendung und Testkit zur Früherkennung von Tumoren

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4772559A (en) * 1985-10-10 1988-09-20 Monell Chemical Senses Center Method of detecting the presence of bronchogenic carcinoma by analysis of expired lung air
WO1991005255A1 (de) * 1989-09-30 1991-04-18 Nmi Naturwissenschaftliches Und Medizinisches Institut An Der Universität Tübingen In Reutlingen Diagnose von lungenkrankheiten durch analyse von nicht-flüchtigen und flüchtigen bestandteilen der atemluft
WO1995013397A1 (en) * 1993-11-12 1995-05-18 The Johns Hopkins University School Of Medicine Nucleic acid mutation detection by analysis of sputum
WO1995018566A1 (en) * 1994-01-11 1995-07-13 Michael Phillips Breath collection
WO1995031721A1 (de) * 1994-05-13 1995-11-23 Filt Forschungsgesellschaft Für Lungen- Und Thoraxerkrankungen Mbh Verfahren und vorrichtung zum sammeln von ausgeatmetem atemkondensat
WO1995034569A1 (de) * 1994-06-14 1995-12-21 Invitek Gmbh Universelles verfahren zur isolierung und reinigung von nukleinsäuren aus extrem geringen mengen sowie sehr stark verunreinigten unterschiedlichsten ausgangsmaterialien

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GESSNER, C. u.a.: Detection of p53 gene mutations in exhaled breath condensate of non-small cell lung cancer patients. Lung Cancer (2004) 43, 215-222 (gutachtlich) *
Jacobson, D.R. u.a.: Molecular genetic tumor markers in the early diagnosis and screening of non-small-cell lung cancer. Ann. Oncol. (1995) 6 (Suppl. 3) S3-8 *
MILLS, N.E.: Detection of K-ras oncogene mutations in bronchoalveolar lavage fluid for lung cancer diagnosis. J. Natl. Cancer Inst. (1995) 87 (14) 1056-60 *
Scott, F.M. u.a.: High frequency of K-ras codon 12 mutations in bronchoalveolar lavage fluid of patients at high risk for second primary lung cancer. Clin. Cancer Res. (März 1997) 3 (3) 479-482 *

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