WO1998048045A2 - Verfahren zur nichtinvasiven erkennung bösartiger tumoren der lunge - Google Patents

Verfahren zur nichtinvasiven erkennung bösartiger tumoren der lunge Download PDF

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Definitions

  • the invention relates to a method for the detection of malignant lung tumors in humans and the use of breathing air for the isolation of genomic DNA and for the early detection of malignant lung tumors.
  • Lung tumors are among the most common cancers worldwide and rank first in mortality statistics. The problem of these diseases is particularly evident in the fact that an early diagnosis has so far not been possible and that the prognosis is generally fatal after the classic diagnosis has been made.
  • Lung tumors are currently being diagnosed using imaging methods (X-ray examinations), in special cases using computed tomography. In this way, it is usually only possible to diagnose manifest tumors that are space-consuming processes.
  • a histological examination is carried out after any abnormalities in the imaging examination. The acquisition of sample material is tied to surgical manipulation. It is therefore not without problems and, as a rule, must also be repeated.
  • a number of such molecular tumor markers in lung tumors are known to be genetically modified.
  • Molecular tumor markers in question include the proto-oncogene Kira and the tumor suppressor genes.
  • the frequency of mutations in these tumor markers is between 50-70%.
  • the invention is based on the knowledge that the changes in the DNA sequences of these genes often occur at an early stage of tumor development. Finding and characterizing these changes clearly serves to make an early diagnosis.
  • Such a detection method can only be used sensibly if a routine system for the examination of risk groups (smokers, miners, persons exposed to dust) is available.
  • the invention was therefore based on the object of developing a detection method for the early detection of malignant lung tumors while avoiding complex x-ray examinations which are unsuitable for early diagnosis and surgical measures for obtaining test material.
  • the molecular diagnosis of genetic aberrations of relevant tumor marker genes takes place directly from a breath condensate.
  • the breathing condensate is obtained using commercially available breathing condensate collectors, with which the patient's exhaled air is transferred to a cooled collecting hose.
  • the condensate obtained is then concentrated and is the starting material for isolating the patient's genomic DNA.
  • the source of the DNA isolation are, on the one hand, exfoliated epitheal cells of the lungs contained in the respiratory condensate or so-called naked DNA contained in the condensate.
  • DNA isolation is achieved using a highly sensitive extraction method according to claims 2-5.
  • the lysate is thus incubated with a mineral carrier material for binding the DNA;
  • the carrier material is preferably highly disperse, non-porous SiO 2 particles with a grain size of 7 nm-1 ⁇ m, preferably 40 nm, with a specific surface area of 10-300 m 2 / g, preferably 50 m 2 / g,
  • the mineral carrier material with the bound genomic DNA is placed on a membrane made of polysulfone ether, which is located at the bottom of a microfilter vessel or a filter microtest plate, and is fixed on this membrane by centrifugation or by means of vacuum.
  • a washing solution preferably made of ethanol, sodium chloride and Tris-HCl
  • the nucleic acid is eluted from the carrier material with a low salt buffer, preferably from Tris-HCl and EDTA.
  • the DNA obtained is now the starting material for selective enzymatic amplification reactions using classic molecular biological techniques. Depending on the objective, different tumor marker genes can be duplicated. The subsequent investigation of genetic changes is achieved using allele-specific hybridization reactions. This allows highly sensitive detection of mutated DNA sequence regions, even from mixed samples of healthy and mutated cells.
  • the hybridization reaction is detected in the form of a direct enzymatic method in which the
  • Hybridization probe is marked against
  • the method is significantly simplified in that, instead of an indirect enzymatic detection method, a direct optical measurement of the probe marking is carried out. This allows the duration of such proof to be shortened considerably.
  • the invention also relates to the use of breathing air, preferably in the form of condensates, for isolating DNA and for detecting malignant lung tumors in humans.
  • the simple possibility of being able to use breathing air as a starting material for the detection method according to the invention represents a new development in medicine.
  • the great advantage is that it is not only a simple and inexpensive method for routine examinations, in particular for the early detection of lung tumors Is available, but at the same time numerous sufferers are spared the pain of a painful examination.
  • the breathing condensate is obtained using a commercially available exhaled air collector. About 150-300 l of air are collected and the breathing condensate is then concentrated.
  • the DNA extraction is carried out by adding 500 ⁇ l lysis buffer binding buffer (guanidine isothiocyanate, N-lauryl-sarcosyl; DTT) and incubating for 5 min at room temperature. Add 10 ⁇ l of the DNA binding matrix (non-porous nanoparticles of pure silicon dioxide in aqueous solution) and incubate for 1 min. Transfer the total solution to a microcentrifugation column with a polysulfone ether membrane and centrifugation for 30 s at 10,000 xg and discarding the filtrate.
  • lysis buffer binding buffer guanidine isothiocyanate, N-lauryl-sarcosyl; DTT
  • the double-stranded amplification product is transferred via the biotin label to a streptavidin-coated microtest plate and the unbound strand is washed off by means of alkaline denaturation.
  • Hybridization oligonucleotides are then used to hybridize against the DNa section of the Ki-ras gene immobilized on the plate surface. Very stringent washing steps remove all hybridization probes that are not clearly complementary to the target sequence and thus enable highly sensitive identification of single-base mutations.
  • the hybridization oligonucleotides are provided with a label which is subsequently detected using standard methods.
  • the characterization of the DNA sequence of the Ki-ras gene to be examined can be evaluated.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erkennung von bösartigen Lungentumoren des Menschen durch Isolierung genomischer DNA aus Atemkondensaten sowie den Einsatz dieser DNA als Substrat für eine spezifische Vervielfältigung von Abschnitten relevanter Tumormarkergene und Nachweis von Veränderungen in der DNA-Sequenz dieser Abschnitte über allelspezifische Hybridisierungsreaktionen.

Description

Verfahren zur nichtinvasiven Erkennung bösartiger Tumoren der Lunge
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erkennung von bösartigen Lungentumoren des Menschen sowie die Verwendung von Atemluft zur Isolierung genomischer DNA und zur Früherkennung von bösartigen Lungentumoren.
Lungentumore gehören weltweit zu den häufigsten Krebserkrankungen und stehen dabei an erster Stelle in der Mortalitätstatistik. Die Problematik dieser Erkrankungen tritt besonders dadurch zutage, daß eine frühzeitige Diagnose bisher nicht erbracht werden kann und nach erfolgter klassischer Diagnose die Progose generell fatal ist.
Gegenwärtig erfolgt die Diagnostik von Lungentumoren mit bildgebenden Verfahren (Röntgenuntersuchungen) , in Spezialfällen mittels Computertomographien. Diagnostiziert werden können auf einem solchen Wege in der Regel erst manifeste Tumoren, welche schon raumfordernde Prozesse darstellen. Eine histologische Untersuchung erfolgt nach Auffälligkeiten in der bildgebenden Untersuchung. Dabei ist die Gewinnung von Probenmaterial an eine chirurgische Manipulation gebunden. Sie ist deshalb nicht unproblematisch und muß in der Regel auch wiederholt werden.
Für eine Erkennung von Lungentumoren bzw. für die Früherkennung präneoplastischer Veränderungen gibt es bisher noch kein routinetaugliches und nichtinvasives Verfahren.
Eine mögliche Alternative für die Früherkennung von bösartigen Erkrankungen der Lunge bietet der molekularbiologische Nachweis von mutativen Veränderungen in Onkogenen oder Tumorsuppressorgenen.
Es ist bekannt, daß eine Reihe von solchen molekularen Tumormarkern in Lungentumoren genetisch verändert sind. Als in Frage kommende molekulare Tumormarker zählen das Protoonkogen Ki- ras sowie die Tumorsuppressorgene. In Abhängigkeit vom histologisch charakterisierten Tumortyp liegt die Häufigkeit des Vorliegens von Mutationen in diesen Tumormarkern zwischen 50-70%. Der Erfindung liegt die Erkenntnis zu Grunde, daß die Veränderungen der DNA-Sequenzen dieser Gene oftmals in einem frühzeitigen Stadium der Tumorentwicklung auftreten. Das Auffinden und die Charakterisierung dieser Veränderungen dient somit eindeutig einer frühen Diagnosefindung.
Ein solches Nachweisverfahren kann aber nur dann sinnvoll eingesetzt werden, wenn ein routinetaugliches System für die Unteruchung von Risikogruppen (Raucher, Bergbauarbeiter, Staub- Exponierte) verfügbar ist.
Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, unter Vermeidung aufwendiger und für eine frühzeitige Diagnostik ungeeigneter Röntgenuntersuchungen und chirurgischer Maßnahmen der Gewinnung von Untersuchungsmaterial ein Nachweisverfahren zur Früherkennung bösartiger Lungentumoren zu entwickeln.
Diese Aufgabe konnte überraschend durch Verwendung von Atemluft gelöst werden und wird durch die Ansprüche realisiert.
Erfindungsgemäß erfolgt die molekulare Diagnostik genetischer Abberationen relevanter Tumormarkergene direkt aus einem Atemkondensat. Die Gewinnung des Atemkondensates wird mit kommerziell verfügbaren Atemkondensatsammlern, mit denen die Ausatemluft von Patienten in einen gekühlten Sammelschlauch überführt wird, durchgeführt. Das gewonnene Kondensat wird anschließend eingeengt und ist Ausgangsmaterial für die Isolierung genomischer DNA des Patienten. Quelle für die DNA Isolierung sind zum einem im Atemkondensat enthaltene abgeschilferte epitheale Zellen der Lunge bzw. auch im Kondensat enthaltene sogenannte nackte DNA.
Die DNA-Isolierung gelingt mit einem hochempfindlichen Exktraktionsverfahren gemäß der Ansprüche 2-5. So erfolgt die Inkubation des Lysates mit einem mineralischen Trägermaterial zur Bindung der DNA; vorzugsweise handelt es sic bei dem Trägermaterial um hochdisperse, nichtporöse Si02- Partikeln mit einer Korngröße von 7 nm - 1 μm, vorzugsweise 40 nm, bei einer spezifischen Oberfläche von 10-300 m2/g, vorzugsweise 50 m2/g,
In einer bevorzugten Ausführungsvariante wird dabei das mineralische Trägermaterial mit der gebundenen genomischen DNA auf eine Membran aus Polysulfonether verbracht, welche sich am Boden eines Mikrofiltergefäßes oder einer Filter-Mikrotestplatte befindet und es wird auf dieser Membran durch Zentrifugation oder mittels Vakuum fixiert. Dabei zeigte sich erstaunlicherweise, daß durch die Wahl des Lyse-Bindungspuffers die bevorzugt verwendeten Nanopartikel des Trägermaterials auf der Membran verbleiben und in Folgeschritten hervorragend mittels einer Waschlösung, vorzugsweise aus aus Ethanol, Natriumchlorid und Tris-HCl, von kontaminierenden Substanzen gereinigt und in einem finalen Schritt die Nukleinsäure vom Trägermaterial mit einem Niedrigsalzpuffer, vorzugsweise aus Tris-HCl und EDTA, eluiert wird. Diese erfindungsgemäße Ausführung ermöglicht die Automatisierung der Probengewinnung und liefert darüber hinaus in der manuellen Ausführung eine extrem schnelle und hochempfindliche Isolierung genomischer DNA. Die Isolierung der DNA ist in weniger als 10 Minuten beendet und damit schneller als alle anderen bisher beschriebenen Verfahren.
Die gewonnene DNA ist nun Ausgangsmaterial für selektive enzymatische Vervielfältigungsreaktionen mittels klassischer molekularbiologischer Techniken. Dabei können je nach Zielstellung unterschiedliche Tumormarkergene vervielfältigt werden. Die nachfolgende Untersuchung genetischer Veränderungen wird mittels allelspezifischer Hybridisierungsreaktionen erreicht. Dies gestattet einen hochempfindlichen Nachweis mutierter DNA-Sequenzbereiche auch aus Mischproben von gesunden und mutierten Zellen. Der Nachweis der Hybridisierungsreaktion erfolgt in Form eines direkten enzymatischen Verfahrens, bei welchem die
Hybridisierungssonde mit einer Markierung versehen ist gegen
-welche ein enzymkonjugierter Antikörper gerichtet ist. Nach Zugabe eines Substrates wird anschließend eine kolorimetrische
Messung durchgeführt, die als Indikator der Hybridisierungsreaktion fungiert.
Das Verfahren wird in einer Variante wesentlich dadurch vereinfacht, daß anstelle eines indirekten enzymatischen NachweisVerfahrens eine direkte optische Messung der Sondenmarkierung erfolgt. Dies gestattet die Zeitdauer eines solchen Nachweises ganz erheblich zu verkürzen.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Atemluft, vorzugsweise in Form von Kondensaten, zur Isolierung von DNA und zur Erkennung von bösartigen Lungentumoren des Menschen.
Die einfache Möglichkeit, Atemluft als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Nachweisverfahren einsetzen zu können, stellt ein neuartige Entwicklung in der Medizin dar. Der große Vorteil liegt darin, daß damit nicht nur eine einfache und kostengünstige Methode für Routineuntersuchungen, insbesondere für die Früherkennung von Lungentumoren, zur Verfügung steht, sondern gleichzeitig zahlreichen Betroffenen die Pein einer schmerzvollen Untersuchung erspart wird.
Die Erfindung wird nachfolgend an einem Ausführungsbeispiel dargestellt.
Beispiel
Nachweis von Mutationen im Protoonkogen Ki-ras in
Atemkondensaten.
Die Gewinnung des Atemkondensates erfolgt mit einem kommerziell erhältlichen Ausatemluftsammler. Dabei werden ca. 150-300 1 Luft gesammelt,und das Atemkondensat wird anschließend eingeengt. Die DNA-Extraktion erfolgt durch Zugabe von 500 μl Lysepuffer- Bindungspuffer (Guanidinisothiocyanat, N-Lauryl-Sarcosyl; DTT) und Inkubation für 5min bei Raumtemperatur. Zugabe von 10 μl der -DNA-Bindungsmatrix (unporöse Nanopartikel von reinem Siliziumdioxyd in wäßriger Lösung) und Inkubation für 1 min. Überführen der Gesamtlösung auf eine Mikrozentrifugationssäule mit einer Polysulfonethermembran und Zentrifugation für 30 s bei 10.000 x g und Verwerfen des Filtrates.
Zugabe von 600 μl einer Waschlösung (70% Ethanol; NaCl, Tris-HCl) und erneute Zentrifugation für 30 s bei 10.000 x g. Verwerfen des Filtrates und Wiederholung des letzten Schrittes. Nochmalige lminütige Zenrifugation und Überführen des Zentrifugations- einsatzes in ein neues Reaktionsgefäß, Zugabe von 50 μl eines auf 70 °C vorgewärmten Elutions ittels (lOmM Tris-HCl; O.l M DTA; pH 9.0) und Zentrifugation für 1 min bei 10 000 x g. Die so gewonnene DNA ist Substrat für die selektive Vervielfältigung des zu untersuchenden DNA-Abschnittes (Kodon 12) des Tumormarkergens Ki-ras. Dabei wird ein Primer mit einer Biotinmarkierung eingesetzt.
Nach der Vervielfältigungsreaktion wird das doppelsträngige Vervielfältigungsprodukt über die Biotinmarkierung an eine Streptavidin-beschichtete Mikrotestplatte überführt und mittels einer alkalischen Denaturierung der nichtgebundene Strang abgewaschen. Gegen den an der Plattenoberfäche immobilisierten DNa-Abschnitt des Ki-ras-Gens wird anschließend mit verschiedenen Hybridisierungsoligonukleotiden hybridisiert. Durch sehr stringente Waschschritte erfolgt die Entfernung aller zur Zielsequenz nicht eindeutig komplementären Hybridisierungssonden und ermöglicht so eine hochsensitive Identifizierung von Einzelbasenmutationen. Die Hybridisierungsoligonukleotide sind mit einer Markierung versehen, welche anschließend mit Standardmethoden nachgewiesen werden.
Anhand der erhaltenen kolorimetrischen Meßergebnisse kann die Charakterisierung der zu untersuchenden DNA-Sequenz des Ki-ras- Gen ausgewertet werden.

Claims

Patentansprüche
-1. Verfahren zur Erkennung von bösartigen Lungentumoren des Menschen durch Isolierung genomischer DNA aus Atemkondensaten, Einsatz dieser als Substrat für eine spezifische Vervielfältigung von Abschnitten relevanter Tumormarkergene und Nachweis von Veränderungen in der DNA-Sequenz dieser Abschnitte über allelspezifische Hybridisierungsreaktionen.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die genomische DNA aus Atemkondensaten, welche aus der Ausatemluft stammen, isoliert wird, indem die Atemkondensate mit einem Lyse-Bindungspuffer sowie mit einem mineralischen Trägermaterial zur Bindung genomischer DNA inkubiert werden und nach Durchführung von Waschschritten die genomische DNA vom Trägermaterial wieder abgelöst wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2 , dadurch gekennzeichnet, daß als mineralisches Trägermaterial Silicamaterialien, vozugsweise nichtporöses Siliziumdioxyd mit einer Teilchengröße von 7nm-lμm verwendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß als Lyse-Bindungspuffer Guanidinisothiocyanat, Lithiumchlorid oder Guanidinhydrochlorid in Kombination mit Detergenzien verwendet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 2-4 , dadurch gekennzeichnet, daß die unter Lyse-Bindungspuffer am Trägermaterial fixierte genomische DNA auf eine Membran aus Polysulfonether mit einer bevorzugten Porengröße von 0,2 μm-0,5 μm aufgetragen und durch einen Zentrifugationsschritt oder eine Vakuumfiltration das Trägermaterial auf der Membran fixiert, durch Zugabe eines Waschpuffers auf der Membran gewaschen und mit einem Niedrigsalzpuffer eluiert wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als molekularer Tumormarker relevante DNA-Abschnitte von Protoonkogenen und Tumor- suppressorgenen untersucht werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis klinisch relevanter Veränderungen der DNA Sequenz der Tumormarkergene über basenkomplementäre Hybridisierungsreaktionen mit Hybridisierungs- oligonukleotiden definierter Komplementärität zu den veränderten Sequenzabschnitten der DNA-Abschnitte der Tumormarkergene erfolgt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die jeweiligen vervielfältigten diagnostisch relevanten Sequenzabschnitte oder die zu diesen Sequenzabschnitten jeweils spezifischen Hybridisierungssonden sich an einer festen Phase befinden und mit den jeweilgen Hy- bridisierungspartnern inkubiert werden
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridisierungs-Oligonukleotide oder die zu untersuchenden vervielfältigten DNS-Abschnitte der Tumormarkergene mit einer Markierung versehen sind und daß das Ergebnis der Hybridisierungsreaktion über einen indirekten enzymatischen Nachweis oder einem direkten optischen Nachweis der Markierung erfolgt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß das zu untersuchende Tumormarkergen Tumormarkergen Ki-ras ist.
11. Verwendung von Atemluft in Form von Atemkonensaten zur Isolierung von DNA.
12. Verwendung von Atemluft in Form von Atemkondensaten zur nichtinvasiven Erkennung bösartiger Tumoren der Lunge.
PCT/DE1998/001082 1997-04-18 1998-04-14 Verfahren zur nichtinvasiven erkennung bösartiger tumoren der lunge WO1998048045A2 (de)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7364553B2 (en) 2002-12-20 2008-04-29 Amidex, Inc. Breath aerosol management and collection system

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999032616A2 (de) * 1997-12-18 1999-07-01 Invitek Gmbh Verfahren zur isolierung von kurz- und langkettigen nukleinsäuren
DE102006029926B4 (de) * 2006-06-29 2008-11-20 Siemens Ag Anordnung und Verfahren zur Identifizierung von Personen

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995001359A1 (de) * 1993-07-01 1995-01-12 Qiagen Gmbh Verfahren zur chromatographischen reinigung und trennung von nucleinsäuregemischen
WO1995013397A1 (en) * 1993-11-12 1995-05-18 The Johns Hopkins University School Of Medicine Nucleic acid mutation detection by analysis of sputum
WO1995034569A1 (de) * 1994-06-14 1995-12-21 Invitek Gmbh Universelles verfahren zur isolierung und reinigung von nukleinsäuren aus extrem geringen mengen sowie sehr stark verunreinigten unterschiedlichsten ausgangsmaterialien
DE4422044A1 (de) * 1994-06-14 1995-12-21 Invitek Gmbh Verfahren zur Isolierung, Reinigung und ggf. Lagerung von Nukleinsäuren
DE19506887A1 (de) * 1995-02-17 1996-08-22 Invitek Gmbh Verfahren zur simultanen Isolierung von genomischer DNS und hochreiner Total RNS
WO1998008971A1 (de) * 1996-08-26 1998-03-05 Invitek Gmbh Verfahren zum nachweis klinisch relevanter veränderungen der dns-sequenz des ki-ras-onkogens, seine verwendung und testkit zur früherkennung von tumoren

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4772559A (en) * 1985-10-10 1988-09-20 Monell Chemical Senses Center Method of detecting the presence of bronchogenic carcinoma by analysis of expired lung air
DE3932784C3 (de) * 1989-09-30 2002-08-01 Nmi Univ Tuebingen Verfahren zur Gewinnung nichtflüchtiger Substanzen als analytisches Probenmaterial aus der menschlichen Atemluft
US5465728A (en) * 1994-01-11 1995-11-14 Phillips; Michael Breath collection
EP0759169B1 (de) * 1994-05-13 1998-01-14 Filt Forschungsgesellschaft Für Lungen- Und Thoraxerkrankungen Mbh Verfahren und vorrichtung zum sammeln von ausgeatmetem atemkondensat

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995001359A1 (de) * 1993-07-01 1995-01-12 Qiagen Gmbh Verfahren zur chromatographischen reinigung und trennung von nucleinsäuregemischen
WO1995013397A1 (en) * 1993-11-12 1995-05-18 The Johns Hopkins University School Of Medicine Nucleic acid mutation detection by analysis of sputum
WO1995034569A1 (de) * 1994-06-14 1995-12-21 Invitek Gmbh Universelles verfahren zur isolierung und reinigung von nukleinsäuren aus extrem geringen mengen sowie sehr stark verunreinigten unterschiedlichsten ausgangsmaterialien
DE4422044A1 (de) * 1994-06-14 1995-12-21 Invitek Gmbh Verfahren zur Isolierung, Reinigung und ggf. Lagerung von Nukleinsäuren
DE19506887A1 (de) * 1995-02-17 1996-08-22 Invitek Gmbh Verfahren zur simultanen Isolierung von genomischer DNS und hochreiner Total RNS
WO1998008971A1 (de) * 1996-08-26 1998-03-05 Invitek Gmbh Verfahren zum nachweis klinisch relevanter veränderungen der dns-sequenz des ki-ras-onkogens, seine verwendung und testkit zur früherkennung von tumoren

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BERNDT ET AL.: "A MICROPLATE ASSAY FOR K-ras GENOTYPING" EUR.J.CLIN.CHEM.CLIN.BIOCHEM., Bd. 34, 1996, Seiten 837-840, XP002082636 *
HESKETH: "THE ONCOGENE FACTS BOOK" 1995 , ACADEMIC PRESS , LONDON,GB XP002082641 214530 RAS siehe Seite 225 - Seite 234 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7364553B2 (en) 2002-12-20 2008-04-29 Amidex, Inc. Breath aerosol management and collection system

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