DE19717717A1 - Verfahren zur nichtinvasiven Erkennung bösartiger Tumoren der Lunge - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erkennung von bösartigen Lungentumoren des Menschen sowie die Verwendung von Atemluft zur Isolierung genomischer DNA und zur Früherkennung von bösartigen Lungentumoren.

Lungentumore gehören weltweit zu den häufigsten Krebserkrankungen und stehen dabei an erster Stelle in der Mortalitätstatistik. Die Problematik dieser Erkrankungen tritt besonders dadurch zutage, daß eine frühzeitige Diagnose bisher nicht erbracht werden kann und nach erfolgter klassischer Diagnose die Prognose generell fatal ist.

Gegenwärtig erfolgt die Diagnostik von Lungentumoren mit bildgebenden Verfahren (Röntgenuntersuchungen), in Spezialfällen mittels Computertomographien. Diagnostiziert werden können auf einem solchen Wege in der Regel erst manifeste Tumoren, welche schon raumfordernde Prozesse darstellen. Eine histologische Untersuchung erfolgt nach Auffälligkeiten in der bildgebenden Untersuchung. Dabei ist die Gewinnung von Probenmaterial an eine chirurgische Manipulation gebunden. Sie ist deshalb nicht unproblematisch und muß in der Regel auch wiederholt werden.

Für eine Erkennung von Lungentumoren bzw. für die Früherkennung präneoplastischer Veränderungen gibt es bisher noch kein routinetaugliches und nichtinvasives Verfahren.

Eine mögliche Alternative für die Früherkennung von bösartigen Erkrankungen der Lunge bietet der molekularbiologische Nachweis von mutativen Veränderungen in Onkogenen oder Tumorsuppressorgenen.

Es ist bekannt, daß eine Reihe von solchen molekularen Tumormarkern in Lungentumoren genetisch verändert sind. Als in Frage kommende molekulare Tumormarker zählen das Protoonkogen Ki­ ras sowie die Tumorsuppressorgene. In Abhängigkeit vom histologisch charakterisierten Tumortyp liegt die Häufigkeit des Vorliegens von Mutationen in diesen Tumormarkern zwischen 50-70%. Der Erfindung liegt die Erkenntnis zu Grunde, daß die Veränderungen der DNA-Seguenzen dieser Gene oftmals in einem frühzeitigen Stadium der Tumorentwicklung auftreten. Das Auffinden und die Charakterisierung dieser Veränderungen dient somit eindeutig einer frühen Diagnosefindung.

Ein solches Nachweisverfahren kann aber nur dann sinnvoll eingesetzt werden, wenn ein routinetaugliches System für die Untersuchung von Risikogruppen (Raucher, Bergbauarbeiter, Staub- Exponierte) verfügbar ist.

Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, unter Vermeidung aufwendiger und für eine frühzeitige Diagnostik ungeeigneter Röntgenuntersuchungen und chirurgischer Maßnahmen der Gewinnung von Untersuchungsmaterial ein Nachweisverfahren zur Früherkennung bösartiger Lungentumoren zu entwickeln.

Diese Aufgabe konnte überraschend durch Verwendung von Atemluft gelöst werden und wird durch die Ansprüche realisiert.

Erfindungsgemäß erfolgt die molekulare Diagnostik genetischer Abberationen relevanter Tumormarkergene direkt aus einem Atemkondensat. Die Gewinnung des Atemkondensates wird mit kommerziell verfügbaren Atemkondensatsammlern, mit denen die Ausatemluft von Patienten in einen gekühlten Sammelschlauch überführt wird, durchgeführt. Das gewonnene Kondensat wird anschließend eingeengt und ist Ausgangsmaterial für die Isolierung genomischer DNA des Patienten. Quelle für die DNA Isolierung sind zum einem im Atemkondensat enthaltene abgeschilferte epitheale Zellen der Lunge bzw. auch im Kondensat enthaltene sogenannte nackte DNA.

Die DNA-Isolierung gelingt mit einem hochempfindlichen Extraktionsverfahren gemäß der Ansprüche 2-5.

So erfolgt die Inkubation des Lysates mit einem mineralischen Trägermaterial zur Bindung der DNA; vorzugsweise handelt es sich bei dem Trägermaterial um hochdisperse, nichtporöse SiO₂- Partikeln mit einer Korngröße von 7 nm-1 µm, vorzugsweise 40 nm, bei einer spezifischen Oberfläche von 10-300 m²/g, vorzugsweise 50 m²/g.

In einer bevorzugten Ausführungsvariante wird dabei das mineralische Trägermaterial mit der gebundenen genomischen DNA auf eine Membran aus Polysulfonether verbracht, welche sich am Boden eines Mikrofiltergefäßes oder einer Filter-Mikrotestplatte befindet und es wird auf dieser Membran durch Zentrifugation oder mittels Vakuum fixiert. Dabei zeigte sich erstaunlicherweise, daß durch die Wahl des Lyse-Bindungspuffers die bevorzugt verwendeten Nanopartikel des Trägermaterials auf der Membran verbleiben und in Folgeschritten hervorragend mittels einer Waschlösung, vorzugsweise aus aus Ethanol, Natriumchlorid und Tris-HCl, von kontaminierenden Substanzen gereinigt und in einem finalen Schritt die Nukleinsäure vom Trägermaterial mit einem Niedrigsalzpuffer, vorzugsweise aus Tris-HCl und EDTA, eluiert wird. Diese erfindungsgemäße Ausführung ermöglicht die Automatisierung der Probengewinnung und liefert darüber hinaus in der manuellen Ausführung eine extrem schnelle und hochempfindliche Isolierung genomischer DNA. Die Isolierung der DNA ist in weniger als 10 Minuten beendet und damit schneller als alle anderen bisher beschriebenen Verfahren.

Die gewonnene DNA ist nun Ausgangsmaterial für selektive enzymatische Vervielfältigungsreaktionen mittels klassischer molekularbiologischer Techniken. Dabei können je nach Zielstellung unterschiedliche Tumormarkergene vervielfältigt werden. Die nachfolgende Untersuchung genetischer Veränderungen wird mittels allelspezifischer Hybridisierungsreaktionen erreicht. Dies gestattet einen hochempfindlichen Nachweis mutierter DNA-Sequenzbereiche auch aus Mischproben von gesunden und mutierten Zellen.

Der Nachweis der Hybridisierungsreaktion erfolgt in Form eines direkten enzymatischen Verfahrens, bei welchem die Hybridisierungssonde mit einer Markierung versehen ist gegen welche ein enzymkonjugierter Antikörper gerichtet ist. Nach Zugabe eines Substrates wird anschließend eine kolorimetrische Messung durchgeführt, die als Indikator der Hybridisierungsreaktion fungiert.

Das Verfahren wird in einer Variante wesentlich dadurch vereinfacht, daß anstelle eines indirekten enzymatischen Nachweisverfahrens eine direkte optische Messung der Sondenmarkierung erfolgt. Dies gestattet die Zeitdauer eines solchen Nachweises ganz erheblich zu verkürzen.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Atemluft, vorzugsweise in Form von Kondensaten, zur Isolierung von DNA und zur Erkennung von bösartigen Lungentumoren des Menschen.

Die einfache Möglichkeit, Atemluft als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Nachweisverfahren einsetzen zu können, stellt ein neuartige Entwicklung in der Medizin dar. Der große Vorteil liegt darin, daß damit nicht nur eine einfache und kostengünstige Methode für Routineuntersuchungen, insbesondere für die Früherkennung von Lungentumoren, zur Verfügung steht, sondern gleichzeitig zahlreichen Betroffenen die Pein einer schmerzvollen Untersuchung erspart wird.

Die Erfindung wird nachfolgend an einem Ausführungsbeispiel dargestellt.

Beispiel Nachweis von Mutationen im Protoonkogen Ki-ras in Atemkondensaten

Die Gewinnung des Atemkondensates erfolgt mit einem kommerziell erhältlichen Ausatemluftsammler. Dabei werden ca. 150-300 l Luft gesammelt,und das Atemkondensat wird anschließend eingeengt.

Die DNA-Extraktion erfolgt durch Zugabe von 500 µl Lysepuffer- Bindungspuffer (Guanidinisothiocyanat, N-Lauryl-Sarcosyl; DTT) und Inkubation für 5min bei Raumtemperatur. Zugabe von 10 µl der DNA-Bindungsmatrix (unporöse Nanopartikel von reinem Siliziumdioxyd in wäßriger Lösung) und Inkubation für 1 min. Überführen der Gesamtlösung auf eine Mikrozentrifugationssäule mit einer Polysulfonethermembran und Zentrifugation für 30 s bei 10.000 × g und Verwerfen des Filtrates.

Zugabe von 600 µl einer Waschlösung (70% Ethanol; NaCl, Tris-HCl) und erneute Zentrifugation für 30 s bei 10.000 × g. Verwerfen des Filtrates und Wiederholung des letzten Schrittes. Nochmalige 1minütige Zenrifugation und Überführen des Zentrifugations­ einsatzes in ein neues Reaktionsgefäß, Zugabe von 50 µl eines auf 70°C vorgewärmten Elutionsmittels (10mM Tris-HCl; 0.1mM DTA; pH 9.0) und Zentrifugation für 1 min bei 10.000 × g.

Die so gewonnene DNA ist Substrat für die selektive Vervielfältigung des zu untersuchenden DNA-Abschnittes (Kodon 12) des Tumormarkergens Ki-ras. Dabei wird ein Primer mit einer Biotinmarkierung eingesetzt.

Nach der Vervielfältigungsreaktion wird das doppelsträngige Vervielfältigungsprodukt über die Biotinmarkierung an eine Streptavidin-beschichtete Mikrotestplatte überführt und mittels einer alkalischen Denaturierung der nichtgebundene Strang abgewaschen. Gegen den an der Plattenoberfläche immobilisierten DNa-Abschnitt des Ki-ras-Gens wird anschließend mit verschiedenen Hybridisierungsoligonukleotiden hybridisiert. Durch sehr stringente Waschschritte erfolgt die Entfernung aller zur Zielsequenz nicht eindeutig komplementären Hybridisierungssonden und ermöglicht so eine hochsensitive Identifizierung von Einzelbasenmutationen. Die Hybridisierungsoligonukleotide sind mit einer Markierung versehen, welche anschließend mit Standardmethoden nachgewiesen werden.

Anhand der erhaltenen kolorimetrischen Meßergebnisse kann die Charakterisierung der zu untersuchenden DNA-Sequenz des Ki-ras- Gen ausgewertet werden.

Claims (12)

1. Verfahren zur Erkennung von bösartigen Lungentumoren des Menschen durch Isolierung genomischer DNA aus Atemkondensaten, Einsatz dieser als Substrat für eine spezifische Vervielfältigung von Abschnitten relevanter Tumormarkergene und Nachweis von Veränderungen in der DNA-Sequenz dieser Abschnitte über allelspezifische Hybridisierungsreaktionen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die genomische DNA aus Atemkondensaten, welche aus der Ausatemluft stammen, isoliert wird, indem die Atemkondensate mit einem Lyse-Bindungspuffer sowie mit einem mineralischen Trägermaterial zur Bindung genomischer DNA inkubiert werden und nach Durchführung von Waschschritten die genomische DNA vom Trägermaterial wieder abgelöst wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als mineralisches Trägermaterial Silicamaterialien, vorzugsweise nichtporöses Siliziumdioxyd mit einer Teilchengröße von 7nm-1µm verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Lyse-Bindungspuffer Guanidinisothiocyanat, Lithiumchlorid oder Guanidinhydrochlorid in Kombination mit Detergenzien verwendet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 2-4, dadurch gekennzeichnet, daß die unter Lyse-Bindungspuffer am Trägermaterial fixierte genomische DNA auf eine Membran aus Polysulfonether mit einer bevorzugten Porengröße von 0,2 µm-0,5 µm aufgetragen und durch einen Zentrifugationsschritt oder eine Vakuumfiltration das Trägermaterial auf der Membran fixiert, durch Zugabe eines Waschpuffers auf der Membran gewaschen und mit einem Niedrigsalzpuffer eluiert wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als molekularer Tumormarker relevante DNA-Abschnitte von Protoonkogenen und Tumor­ suppressorgenen untersucht werden.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis klinisch relevanter Veränderungen der DNA Sequenz der Tumormarkergene über basenkomplementäre Hybridisierungsreaktionen mit Hybridisierungs­ oligonukleotiden definierter Komplementarität zu den veränderten Sequenzabschnitten der DNA-Abschnitte der Tumormarkergene erfolgt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die jeweiligen vervielfältigten diagnostisch relevanten Sequenzabschnitte oder die zu diesen Sequenzabschnitten jeweils spezifischen Hybridisierungssonden sich an einer festen Phase befinden und mit den jeweiligen Hy­ bridisierungspartnern inkubiert werden

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridisierungs-Oligonukleotide oder die zu untersuchenden vervielfältigten DNS-Abschnitte der Tumormarkergene mit einer Markierung versehen sind und daß das Ergebnis der Hybridisierungsreaktion über einen indirekten en­ zymatischen Nachweis oder einem direkten optischen Nachweis der Markierung erfolgt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß das zu untersuchende Tumormarkergen Tumormarkergen Ki-ras ist.

11. Verwendung von Atemluft in Form von Atemkondensaten zur Isolierung von DNA.

12. Verwendung von Atemluft in Form von Atemkondensaten zur nichtinvasiven Erkennung bösartiger Tumoren der Lunge.