DE60104149T2

DE60104149T2 - Vorrichtung zur analyse und/oder zur behandlung mit einem flexiblen schaft

Info

Publication number: DE60104149T2
Application number: DE60104149T
Authority: DE
Inventors: Alain Pompidou; Albert-Claude Benhamou
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-03-17
Filing date: 2001-03-16
Publication date: 2005-08-18
Anticipated expiration: 2021-03-17
Also published as: WO2001069257A2; US6689603B2; EP1358481B1; PT1358481E; DE60104149D1; US20030049679A1; ATE270433T1; TR200402421T4; WO2001069257A3; EP1358481A2; ES2223814T3; AU2001246608A1; WO2001069257A9

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung, welche die Durchführung einer Fernuntersuchung und/oder Fernbehandlung in situ auf der Ebene eines Substrats, beispielsweise von Geweben oder Organen ermöglicht und aus einem flexiblen Stab besteht, an dessen einem Ende ein Mikrosystem zur Untersuchung und/oder Behandlung befestigt ist.
Im Stand der Technik sind Mikrosysteme zur Untersuchung beschrieben, die eine Anordnung von biologischen Molekülen verwenden, die an bestimmten Positionen einer Oberfläche angeordnet sind. Diese unter der Bezeichnung "Biochips" oder DNA-Chips bekannten Systeme sind nützlich zur Untersuchung von Polynucleotid- oder Aminosäure-Sequenzen. Beispiele solcher Systeme sind beschrieben beispielsweise in den Europäischen Patentanmeldungen Nr. 619 321, Nr. 373 203, Nr. 691 978. Andere Mikrosysteme zur Untersuchung sind beispielsweise die Mikroanalysetests, die Reaktionen vom Typ Ligand/Rezeptor benutzen oder Mikroimmunoanalysen, die Reaktionen vom Typ Antigen/Antikörper benutzen.
Im Stand der Technik sind auch Vorrichtungen zur in vivo-Untersuchung von Organen oder Geweben vom Typ eines Katheters bekannt, der aus einem in die Gefäße oder durch natürliche Wege eingeführten flexiblen Rohr besteht, das beispielsweise mit einem Laser, einer Faseroptik, einer Sonde oder einem Meßfühler zusammenwirkt. Diese Vorrichtungen können auch die Verabreichung von aktiven Substanzen wie Medikamenten oder diagnostischen Agenzien ermöglichen, wie beispielsweise die im amerikanischen Patent US 5,938,595 beschriebene Vorrichtung.
Dieses Dokument betrifft eine Vorrichtung zur Analyse und Behandlung mit einer Faseroptik, von der eines ihrer Enden mit einer Hülle überzogen ist, welche mit einem fluoreszierenden Molekül markierte Antikörper aufweist. Falls diese Vorrichtung zu Zwecken der Behandlung (beispielsweise von Gefäßkrankheiten) verwendet wird, ist diese Faseroptik in einen Katheter integriert, der durch das Gefäßsystem bis zur Verschlußstelle geführt werden kann, und thrombolytische Agenzien können direkt in das Gerinnsel abgegeben werden. Die ses System kann mit einer anderen Vorrichtung zur Behandlung, wie Laser, verbunden werden, die verwendet wird, um das Gerinnsel besser zu zerstören.
Das amerikanische Patent US 5,837,196 beschreibt einen Bio-Meßfühler, der aus Lichtleitfasern besteht, die ggf. in situ beim Menschen und Tier verwendet werden können, um eine Vielzahl von Analyten zu erkennen. Dieses Dokument beschreibt eine Methode zur Fixierung einer biologischen Substanz an einer festen Oberfläche mittels einer Polymerisatmatrix. So wird dieser Bio-Meßfühler hergestellt, indem am Ende jeder der Lichtleitfasern des Bündels eine biologische Substanz fixiert wird, welche die Erkennung der Zielanalyten ermöglicht.
Die Erfinder haben nun eine Vorrichtung zur in situ-Analyse und/oder -Behandlung entwickelt, die aus der Ferne bewegbar ist, und die zwei oben angegebenen Verfahrensmaßnahmen zusammenführt. Es erscheint tatsächlich nützlich, über neue Mittel zur Untersuchung und/oder Behandlung in situ auf der Ebene eines Substrats eines Organismus in vivo oder in vitro zu verfügen, die so wenig wie möglich traumatisieren, besonders im Fall eines menschlichen Patienten, und es ermöglichen (I) nützliche Informationen sowohl hinsichtlich der Diagnostik wie des Screenings beispielsweise für therapeutische Indikationen zu gewinnen oder (II) neue Arten der Verabreichung von pharmazeutisch wirksamen Agenzien direkt auf der Ebene eines Substrats zu erhalten, das beispielsweise aus Zielzellen besteht.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch eine Vorrichtung zur in situ-Analyse und/oder -Behandlung, in der ein System zur Untersuchung und/oder Behandlung in einem medizinischen Instrument gleitet, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie aufweist: (i) ein Mikrosystem zur Untersuchung eines Substrats anders als durch Analyse eines fluoreszierenden Signals, und/oder zur Ausschüttung aktiver Agenzien auf der Ebene eines Substrats, (ii) einen flexiblen Stab, an dessen einem Ende das Mikrosystem befestigt ist und dessen anderes Ende zur Betätigung des besagten Mikrosystems bestimmt ist, (iii) ein medizinisches Instrument mit einem internen Kanal (Lumen), in dem der flexible Stab gleiten kann, (iv) ein auf Substratebene lösbares System zum Schutz des Mikrosystems, und (v) auf der Ebene des besagten Mikrosystems ein System zur Gewebs- oder Zellzerkleinerung.
Vorteilhafterweise sind das Mikrosystem und der flexible Stab in situ fest miteinander verbunden. So bleiben erfindungsgemäß das Mikrosystem und der flexible Stab bei ihrer in situ-Verwendung miteinander verbunden und werden erst vor oder nach dem in situ-Eingriff voneinander getrennt, so daß das Mikrosystem kein in situ implantierbares oder ausbringbares System bildet.
In einer ersten Ausführungsform ist das Mikrosystem vom Typ, das einen Träger aufweist, auf dessen Oberfläche vordefinierte Regionen angeordnet sind, die jede verschiedene chemische oder biologische Substanzen zur Untersuchung oder Behandlung des Substrats enthalten, mit dem das Mikrosystem durch den flexiblen Stab in Berührung gebracht wird. Diese Oberfläche weist wenigstens zwei, vorzugsweise mehr als 100 und besonders bevorzugt mehr als 1000 vordefinierte Regionen auf einer Oberfläche in der Größenordnung von einigen cm², vorzugsweise in der Größenordnung von 1 cm² oder weniger auf. Jede vordefinierte Zone weist eine andere chemische oder biologische Substanz auf, jedoch läßt das erfindungsgemäße Verfahren auch zu, daß mehrere oder auch alle dieser vordefinierten Regionen die gleiche chemische oder biologische Substanz aufweisen, beispielsweise im Fall der gleichen Analyse oder der Abgabe des gleichen Wirkstoffs im Verlauf der Zeit.
Der Träger kann auch mehrere Seiten aufweisen, von denen mindestens eine aus einer aktiven Oberfläche besteht. Diese ist der Ort eines oder mehrerer Agenzien zur biologischen Bindung. Im Bereich dieser aktiven Oberfläche sind vordefinierte Regionen ausgebildet.
Diese Oberfläche in der Größenordnung eines cm² kann eben sein und in einer einzigen Ebene liegen, sie kann auch bandförmig ausgebildet sein und sich spiralförmig um einen starren Träger wickeln, der den flexiblen Stab verlängert und so das Mikrosystem von gleicher Art wie das vorangehende jedoch in einer weiterentwickelten Konformation aufweist. 1 zeigt ein Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung die aus einem flexiblen Stab (1) wie beispielsweise einem verformbaren Katheter besteht, an dessen Ende in den Kanal des flexiblen Stabs das Mikrosystem (2) eingesetzt ist, das aus einem Träger (3) besteht, auf den ein Band (4) gewickelt ist, wo Antikörper fixiert sind, die spezifisch für ein auf der Ebene des analysierten Substrats vorhandenes Antigen sind. Der Träger (3) ist starr, während der flexible Stab (1) verhältnismäßig verformbar ist. Der flexible Stab (1) kann kombiniert sein mit einem endovaskulären Explorationssystem (5), wie beispielsweise ein Endoskop.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann kombiniert sein mit einem System zur endokavitären oder endovaskulären Exploration, welches ermöglicht, das Mikrosystem in Berührung mit dem Zielsubstrat oder in dessen Nähe zu bringen.
In einer zweiten Ausführungsform kann die erfindungsgemäße Vorrichtung zusammengesetzt sein aus einem flexiblen Stab, der ggf. zu einem System zur endokavitären oder endovaskulären Exploration gehört. Dieser Stab endet in einem Mikrosystem, das aus einem gelenkigen Segment besteht, das abwechselnd aus starren Substanzen (vom Typ Platinkugeln) und einem mehr oder weniger hydrophilen Gel (Hydrogel) besteht, an dem die reaktiven Gruppen, Moleküle oder Substanzen fixiert sind. Die den starren Träger umgebende Schicht kann ein ebenes Band oder ein rundes Seil sein, auf dem die Reagenzien abgeschieden und fixiert sind. Es kann sich um Liganden und besonders Antigene oder Antikörper aber auch um Nukleotide handeln. So besteht bei dieser Ausführungsform das Mikrosystem aus einem Träger, der die Form eines Bandes hat, das um ein Ende des flexiblen Stabes gewickelt ist. Ein Beispiel dieser Ausführungsform ist in der 1 der beigefügten Zeichnungen dargestellt.
Wie oben angegeben kann jede vordefinierte Zone die gleiche chemische oder biologische aktive Substanz aufweisen, beispielsweise im Fall der gleichen Analyse oder der Abgabe der gleichen aktiven Substanz, die im Verlauf der Zeit wiederholt werden. Jede vordefinierte Zone kann auch eine jeweils andere chemische oder biologische Substanz aufweisen, und das so eine Mehrzahl von verschiedenen chemischen oder biologischen Substanzen tragende Mikrosystem dient zur Durchführung einer Mehrfachanalyse.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist nützlich:

– im therapeutischen Bereich, um in situ Wirkstoffe auf der Ebene eines Substrats abzugeben, und
– im diagnostischen Bereich für die in situ-Analyse eines Substrats.

Besonders ist die erfindungsgemäße Vorrichtung nützlich für therapeutische Anwendungen, die im Rahmen der gerichteten Therapie durchgeführt werden, wie es vorgeschlagen wird für die intrakardiale Gen-Therapie, die vorsieht, autologe Myoid-Zellen in situ zu bringen, nachdem von der endokavitären Sonde her der zellulare Gewebezustand des zu behandelnden Myokard-Bereichs bewertet wurde. Und zwar mit Hilfe verschiedener Systeme und besonders von erfindungsgemäßen Systemen zur Diagnose oder anschließenden Therapie.
Im Rahmen von therapeutischen Anwendungen sind die auf der Ebene jeder vordefinierten Region der Oberfläche des Mikrosystems angeordneten biologischen oder chemischen Substanzen Wirkstoffe, besonders therapeutische Substanzen. Die Wirkstoffe können jede andere Substanz sein, die in der Behandlung von Krankheiten brauchbar ist, welche eine Intervention auf der Ebene von Zielzellen oder Zielgeweben erfordern, wie Krebszellen, Infektionsherde usw.
Im Rahmen von diagnostischen Anwendungen sind die auf der Ebene jeder vordefinierten Region der Oberfläche des Mikrosystems angeordneten biologischen oder chemischen Substanzen solche Substanzen, welche den Nachweis spezifischer Analyten des Substrats wohin das Mikrosystem gebracht wird, oder auch radiomarkierte Substanzen, welche die Sichtbarmachung des Zielorgans aus der Entfernung durch jede bekannte Methode der medizinischen Bildgebung ermöglichen.
Diese Substanzen können auf der Ebene jeder vordefinierten Region des Trägers entweder reversibel fixiert sein, damit sie ggf. durch das Mikrosystem abgegeben werden können, damit sie nach dem Zurückziehen des Mikrosystems ihre Funktion "in vivo" ausüben, oder irreversibel an dem Träger fixiert sein. Die Fixierung kann durch einfache Adsorption oder mittels eines Kupplungsprodukts erfolgen.
Die Wirkstoffe werden auf der Ebene des Substrats freigesetzt:

– durch einfachen Kontakt mit diesem, und in diesem Fall sind sie physisch geschützt, wie im folgenden beschrieben, bis das Mikrosystem auf die Ebene des Substrats gebracht ist, oder
– durch ein komplementäres System der Freisetzung auf der Ebene des Mikrosystems.

Eine bevorzugte Durchführung der therapeutischen Anwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung besteht darin, aktive Substanzen zu verwenden, die Nukleinsäuren sind, wie nackte DNA's, Antisense-Nucleotide, die an der Oberfläche des Trägers des Mikrosystems durch Hybridisierung fixiert sind. Die aktiven Substanzen können jedoch auch Proteine oder Antikörper sein, die an jeder vordefinierten Region durch eine immunologische Bindung fixiert sind. Als Beispiel eines Mikrosystems, das im Aufbau einer erfindungsgemäßen Behandlungsvorrichtung seinen Platz findet, seien erwähnt die Biochips, welche elektrisch die Aktivität von Zellen so steuern, daß therapeutisch wirksame Mittel freigesetzt werden.
Für die diagnostischen Anwendungen und allgemeiner die Analyse eines Substrats ist das Mikrosystem der erfindungsgemäßen Vorrichtung ein Mikrosystem zur Untersuchung.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind die chemischen oder biologischen Substanzen in der Lage, mit entsprechenden Substanzen zu reagieren, die ggf. auf der Ebene des Substrats vorhanden sind, wohin das Mikrosystem zur Untersuchung dank des flexiblen Stabes gebracht wird.
So ist das Mikrosystem vorzugsweise ein Mikrosystem-Rezeptor/Ligand, das Paare von chemischen oder biologischen Substanzen benutzt, von denen das eine oder andere oder besonders bei therapeutischen Anwendungen die beiden Glieder des Paares an jeder vordefinierten Region fixiert sind.
Vorteilhafterweise benutzt das erfindungsgemäße Mikrosystem biologische Substanzen, die Polynucleotid- oder Aminosäure-Sequenzen sind. Die Erfindung sieht als chemische oder biologische Substanzen, die in jeder vordefinierten Region vorhanden sind, chemische oder biologische Substanzen vor, welche:

– eine Anordnung von Polynucleotid-Sequenzen bilden, die sich mit Nucleinsäuren hybridisieren können, die auf der Ebene des Substrats vorhanden sind, das besonders den Untersuchungsort bildet, oder
– eine Anordnung von Peptiden, Polypeptiden oder Proteinen bilden, die mit einem entsprechenden Rezeptor oder immunologisch mit Antikörpern oder Antigenen reagieren können, die auf der Ebene des Substrats vorhanden sind, das besonders den Untersuchungsort bildet.

Das Mikrosystem zur Untersuchung kann jedoch auch chemische Substanzen benutzen, die durch verschiedene chemische Reaktionen mit entsprechenden chemischen Substanzen reagieren können, die auf der Ebene des analysierten Substrats vorhanden sind. So ermöglicht das erfindungsgemäße System zur Untersuchung die gleichzeitige Analyse mehrerer physiologischer Faktoren in situ.
Unter Berücksichtigung der Verschiedenheit von biologischen oder chemischen Reaktionstypen, die auf der Ebene des Mikrosystems zur Untersuchung benutzt werden können, ermöglicht die erfindungsgemäße Vorrichtung die Identifizierung von Genen oder ihren DNA-, RNA-Komponenten, von maßgeblichen Nucleotid-Sequenzen oder deren spezifischen Proteinprodukten, aber auch von Agonisten und ihren Rezeptoren. Sie ermöglicht auch in vitro und in vivo die Identifizierung von Viren, Bakterien, Parasiten oder ihren spezifischen Komponenten, sowie von pathogenen Agenzien vom Typ Prion.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann daher verwendet werden:

– zu Zwecken der Analyse verschiedener Typen von Genomen und besonders ihrer Sequenzierung,
– zur Identifizierung von Zellen, Gewebe und Organen oder von verschiedenen Typen von spezifischen normalen oder pathologischen Rezeptoren,
– zu diagnostischen Zwecken, wie beispielsweise durch die Identifizierung von Genen, ihren Komponenten oder ihres Produkts,
– zu Zwecken des Screenings von Molekülen oder chemischen oder biologischen Substanzen mit bekannten oder potentiellen therapeutischen Eigenschaften,
– zur Verfolgung der Aktivität von neuen oder bereits bekannten therapeutischen Mitteln (Möglichkeit von stufenweisen und wiederholten Untersuchungen).

Die obige Liste ist nicht erschöpfend, und der Fachmann kann mit Hilfe der vorliegenden Angaben die Nutzung der erfindungsgemäßen Vorrichtung auf jeden anderen Typ von Analyse ausweiten, wie solche, welche die Antigen-Antikörperbindung oder die Liganden-Systeme ausnutzen, in dem Maß wo die in vivo eintretenden Bindungen mindestens teilweise mit Hilfe der beschriebenen Mikrosysteme nachweisbar sind, selbst wenn ergänzende Bindungen später realisiert werden zum ex-vivo oder in vitro-Nachweis einer Reaktion, die in vivo und in situ erfolgt ist.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung bietet besonders eine wesentliche Verbesserung für Methoden der Diagnose, der therapeutischen Indikation, der Behandlung und therapeutischen Verfolgung sowie für Screening von Medikamenten, die durch Genom- und Proteinom- (oder Proteom-) Technik gewonnen wurden.
Die erfindungsgemäß Vorrichtung ist dadurch bemerkenswert, daß sie nicht invasiv oder nicht destruktiv mikroinvasiv ist und die Identifizierung aus der Ferne von allen chemischen oder biologischen Substanzen ermöglicht, die mehr oder weniger spezifisch mit den auf dem Mikrosystem zur Untersuchung fixierten aktiven Substanzen reagieren können. Es kann sich insbesondere um Moleküle oder Substanzen handeln, die ausschließlich in situ im Organ, dem Gewebe oder auf der Ebene der Zellen vorhanden sind (intrazellulare Fusion). Diese exklusive Anwesenheit hängt damit zusammen, daß diese Moleküle oder Substanzen außerhalb des untersuchten Gewebes rasch metabolisiert werden, sobald sie aus ihrer örtlichen Umgebung austreten. Das zeigt das Interesse, daß man daran hat, in situ mit Hilfe des beschriebenen Mikrosystems zu arbeiten.
Es ist daher geeignet für eine Analyse oder eine Behandlung:

– in vitro: an Kulturen von natürlichen oder genetisch modifizierten Zellen, Geweben oder Organen, die durch Entnahme aus Lebewesen gewonnen wurden.
– in vivo: unter invasiven oder mikro-invasiven Bedingungen. Es ermöglicht die Führung, die Orientierung und Positionierung des Mikrosystems, das besonders zur molekularen Hybridisierung in situ auf der Ebene von Zielzellen, Zielgeweben oder Zielorganen bestimmt ist.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist außerdem dadurch besonders bemerkenswert, daß sie es ermöglicht, zur Analyse oder Behandlung Stellen zu erreichen, die durch übliche Methoden nicht oder nur schwer zugänglich sind.
Der flexible Stab ermöglicht das Mikrosystem in Kontakt mit dem zu analysierenden Substrat heranzuführen und dann zu positionieren, gleichgültig ob es sich um ein lebendes oder totes biologisches Material (frisch, fixiert, gefroren, mumifiziert oder Fossil) handelt, das aus identischen oder vergleichbaren Zellen, mono- oder plurizellularen Geweben, Organen, direkt oder nach Mikroeffraktion des Mesotheliums oder des Epitheliums der Hülle und der konjunktiven Kapsel sowie von vaskulären Endothelien im Fall von endovaskulären Explorationen besteht. Der flexible Stab gewährleistet die Festigkeit und Kohärenz der Vorrichtung und sorgt für ihre Flexibilität und die Übertragung von Bewegungen, die ihr manuell oder durch Roboter aus der Entfernung erteilt werden. Selbstverständlich muß die Vorrichtung biokompatibel und vorteilhafterweise steril sein, mindestens in ihrem Endabschnitt, der mit dem zu behandelnden oder zu analysierenden Substrat in Berührung kommt.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung weist daher abgesehen von dem Mikrosystem, wo die chemischen oder biologischen Reaktionen realisiert werden, einen Stab auf, der die manuelle oder durch Roboter erfolgende Steuerung der Vorrichtung ermöglicht.
Der flexible Handhabungstab der Vorrichtung ermöglicht mindestens die zwei folgenden Funktionen:

– die Führung des Mikrosystems bis auf die Höhe des analysierten oder behandelten Substrats,
– die Orientierung und Positionierung des Mikrosystems auf der Ebene des analysierten oder behandelten Substrats einschließlich der Einführung in einen flexiblen Katheter, der selbst zu Beginn durch ein System zur endokavitären oder endovaskulären Exploration geführt wird.

In bestimmten Fällen kann das Mikrosystem direkt in das hohle Ende des Systems zur endokavitären oder endovaskulären Exploration eingesetzt werden.
Der flexible Stab ist vorteilhafterweise zur Kooperation mit verschiedenen medizinischen Instrumenten vorgesehen, die für diagnostische, therapeutische oder experimentelle Zwecke verwendet werden. Es handelt sich um:

– nicht invasive Vorrichtungen, die zur Exploration von natürlichen Hohlräumen in Kontakt mit dem Außenmilieu bestimmt sind, wie Instrumente zur ORL, bronchopulmonaren, digestiven, urologischen oder gynäkologischen Exploration;
– mikroinvasive Vorrichtungen, zur Exploration von natürlichen Hohlräumen ohne direkten Kontakt mit dem äußeren Milieu. Es handelt sich hier um Instrumente, die in der Arthroskopie, Koloskopie usw., verwendet werden, oder um ein System zur endovaskulären Exploration oder auch um ein Instrument zur Biopsie von oberflächlichem Geweben oder Organen, besonders auf transcutanem Weg, wie ein System zur Parenchymeffraktion, wie Nadeln, geschärfte Spitzen, Schneidinstrumente usw.

Der flexible Stab wirkt so zusammen mit einem dieser medizinischen Instrumente. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist der flexible Stab mikroadaptiert, so daß er in die obigen Instrumente eingeführt werden kann, welche ein Lumen (Innenkanal) aufweisen. Der flexible Stab kann dann in diesem Innenkanal gleiten, ggf. mit Hilfe einer speziell zu diesem Zweck ausgebildeten Führungsnut, und so die Handhabung der erfindungsgemäßen Vorrichtung in vivo im Verlauf von verschiedenen Stufen einer Exploration zu diagnostischem oder therapeutischem Zweck ermöglichen.
Der flexible Stab kann aber auch aus diesen verschiedenen medizinischen Instrumenten selbst bestehen, die dann als Handhabungsstab des Mikrosystems zur Untersuchung oder Behandlung verwendet werden.
Das Mikrosystem ist an einem der Enden des flexiblen Stabs befestigt, entweder an dessen Außenseite oder in das Lumen des flexiblen Stabs eingesetzt, und zwar mittels jedes geeigneten Verbindungsmittels. Dieses Verbindungsmittel kann ein Zapfensystem sein, das die Orientierung und Positionierung des Mikrosystems ausgehend von dem flexiblen Stab im Raum und aus der Entfernung ermöglicht. Das Verbindungsmittel kann aus einem elektronisch und aus der Ferne gesteuerten verformbaren Material bestehen. Es kann sich auch um einen biologischen Klebstoff und besonders um einen Typ von Klebstoff handeln, wie er zur Reparatur von Knochengeweben verwendet wird.
In allen Fällen muß das Verbindungsmittel die folgenden Bedingungen erfüllen: Haftung, Festigkeit und Flexibilität (Beständigkeit bei Handhabungen und gegenüber den Spannungen, die mit Bewegungen zusammenhängen, die aus der Entfernung bewirkt werden), Bioverträglichkeit und Sterilität.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann ausgehend von einer Form mit anpaßbarer Konfiguration realisiert werden, in der ein oder mehrere homogene Materialien oder mit elektronischen Komponenten gegossen werden, um die gewünschte Form zu erhalten. Die zur Realisierung des Zapfensystems und ggf. einer temporären Maske bestimmte Vorrichtung kann in einem ausgewählten Bereich der Form entweder in Form einer Zwischenvorrichtung oder in Form eines Materials gegossen werden, das geeignet ist, die Realisierung der Gesamtheit der oben beschriebenen Vorrichtung zu ermöglichen. Sie gewinnt so an Effektivität und bewahrt gleichzeitig ihre funktionelle Kohärenz.
Das Verbindungsmittel kann fernbetätigbar sein, um das Mikrosystem in situ freizugeben. So umfaßt die erfindungsgemäße Vorrichtung die zwei oben beschriebenen Ausführungsformen.
Gemäß einer ersten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ermöglicht der Manövrierstab das Einführen, Positionieren und dann Herausziehen des Mikrosystems nachdem die gewünschten chemischen biologischen Reaktionen auf der Ebene des Substrats abgelaufen sind.
Um den Kontakt zwischen dem in situ angeordneten Mikrosystem und dem Substrat zu verbessern, kann eine Dreh- oder Hin- und Her-Bewegung dem Mikrosystem örtlich mit Hilfe des flexiblen Führungstabs aufgezwungen werden, gleichgültig ob dieser als Vollkörper ausgebildet ist (wobei das Mikrosystem dann an seinem Ende durch ein entsprechendes System ggf. mit einem robotisierten Kugelgelenk befestigt ist) oder ob der Stab hohl, rohrförmig ist, um die Basis des Mikrosystems aufzunehmen, die dann teilweise dort eingedrückt ist. Das Ziel ist, das Gewebe zu zerteilen, d. h. eine Lyse der Zellen herbeizuführen durch Zuführung von geeigneten reaktiven Substanzen, die durch den Katheter bis zum Mikrosystem herangeführt werden.
Diese Arbeitsgänge werden entweder manuell oder mittels Roboterunterstützung gesteuert. Für die Anwendungen der Analyse eines Substrats wird das Mikrosystem nach Rückgewinnung im Laboratorium nach klassischen Methoden der Erkennung von chemischen Reaktionen besonders vom Typ Rezeptor-Ligand untersucht, die sich ggf. nach präparativen Stufen wie einer Kettenpolarisationsreaktion gebildet haben. In dieser Ausführungsform ist das Mikrosystem nach der Extraktion vom flexiblen Stab befreit und das Verbindungsmittel braucht nicht fernbetätigbar zu sein. Das Verbindungsmittel muß jedoch eine Kohäsion und genügende Flexibilität gewährleisten, um die Fernsteuerung im Hinblick auf die Führung, Orientierung und Positionierung und ggf. die Extraktion des Mikrosystems in situ zu ermöglichen.
Gemäß einer zweiten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist das Verbindungsmittel zwischen dem flexiblen Stab und dem Mikrosystem fernbetätigbar, so daß die Vorrichtung auf der Ebene der zu analysierenden Stelle positioniert wird. Der Transport und die Positionierung des Mikrosystems können mit Hilfe eines kompatiblen sterilen Ballons realisiert werden. In dieser Ausführungsform kann das Mikrosystem aus der Entfernung durch Meßfühlersysteme analysiert werden, welche die Analyse von chemischen oder biologischen Reaktionen ermöglichen, die ggf. auf der Ebene des Mikrosystems der Untersuchung abgelaufen sind. Jeder Mikroprozessor oder jede Vorrichtung, welche die Empfindlichkeit, Wirksam keit und damit die Leistung des Mikrosystems oder die Fernsteuerung der Einbringung (Führung, Orientierung und Positionierung) des Mikrochips ermöglichen kann, liegt im Rahmen und kann im Rahmen der erfindungsgemäßen Vorrichtung eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann ein System zum Schutz des Mikrosystems zur Untersuchung aufweisen, das vom Schutz freigegeben wird, nachdem es an die zu analysierende Stelle gebracht und dort positioniert wurde. Dieses Schutzsystem, beispielsweise mit einem lösbaren Vorhang, einem verformbaren Gitter kann das ganze Mikrosystem oder nur seine aktive Fläche abdecken. Dieses Schutzsystem kann auf der Ebene des Verbindungsmittels angeordnet oder auf der Höhe des Mikrosystems selbst plaziert sein.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann auf der Ebene des Endes, wo das Mikrosystem fixiert ist, jedes System zur Unterstützung der Funktion des Mikrosystems aufweisen, wie ein System zur Beheizung und/oder Kühlung, zur Freisetzung von biologischer oder chemischer Substanz, wie Puffer, Nachweisreagenzien, jedes Produkt der biologischen Modifikation oder alle Moleküle der zellularen Umgebung.
Sie kann ergänzt werden durch jedes System, das das untersuchte Gewebe zerkleinert, oder durch ein System, das Substanzen beibringt, welche die Lyse der Zellen an Ort und Stelle herbeiführen können, um Zugang zum Inhalt derselben zu erhalten, wobei jedoch in situ die erforderliche Zeit für eine Reaktion der optimalen Fixierung von Molekülen des Substrats an denen der reaktiven Schicht bleibt.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann mit jeder Vorrichtung zusammengesetzt werden, welche aus der Entfernung ermöglicht:

– die Überwachung durch Sensor-Rezeptoren (taktile, optische, physiko-chemische und besonders elektronische oder digitale) oder für jedes System zur Signalerfassung oder -verarbeitung,
– die Realisierung von Biopsien beliebiger Größe,
– die Behandlung, beispielsweise von Tumoren,
– die örtliche Injektion von chemischen oder biologischen Produkten (Zellen oder Gewebe, die Vektoren von Genen oder deren Komponenten sowie unabhängige Vektoren übertragen oder nicht übertragen), zellulären oder Gewebeprodukten, chemischen oder physikochemischen molekularen Agenzien, Markierungsagenzien (von jeder Art ob radioaktiv oder nicht radioaktiv).

Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann gleichzeitig oder aufeinanderfolgend mit Vorrichtungen verwendet werden, die auf chemischen oder biologischen Reaktionen beruhen, die andere sind als die auf der Ebene des Mikrosystems verwendeten, oder mit komplementä ren Vorrichtungen zur zellularen Zerkleinerung, zellularen Lyse, Biopsie, Injektion oder Sensor-Meßfühlern.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist dadurch bemerkenswert, daß sie bei jeder Art von biologischem oder chemischem Substrat verwendet werden kann, das zu Lebewesen oder gestorbenen Lebewesen ob menschlich, tierisch oder pflanzlich gehört.
Beispielsweise wird sie beim Tier unter normalen Bedingungen oder experimentellen Bedingungen zur Untersuchung eines pathologischen Zustands verwendet oder bei transgenischen Tieren, welche maligne Tumore oder verschiedene pathologische Schädigungen aufweisen, sowie im Verlauf von Transplantationen von Zellen, Geweben oder Organen, um die Toleranz oder Abstoßung festzustellen. Sie ermöglicht die Verfolgung der biologischen Entwicklung von Tieren zur Entwicklung von selektiven Behandlungen, die Selektionen von Tierrassen, die Verfolgung von viralen, mikrobiellen, parasitären Krankheiten und solchen mit Agenzien vom Typ Prione. Die erfindungsgemäße Vorrichtung ermöglicht beim Tier die Verbesserung der Methoden zur reproduktiven Klonierung oder zur Gewinnung von Zellinien mit regenerativer therapeutischer Aktivität, die von embryonalen Stammzellen oder Stammzellen gewonnen werden, die nach der Geburt entnommen wurden, sogenannten "adulten" Stammzellen. Es handelt sich um Zellen der Gefäße der Nabelschnur, jedoch auch um autologe adulte Zellen, die in vitro aktiviert sind und die Charakteristika von Stammzellen aufweisen, die in der Lage sind, sich später in situ zu differenzieren, besonders nach einer gelenkten regenerativen Therapie auf der Ebene des Myocards.
Beim Menschen ermöglicht die erfindungsgemäße Vorrichtung, auf nicht invasive oder mikroinvasive Art die Isolierung und Sequenzierung von Genen und/oder die Identifizierung ihres funktionalen Produkts, die Präzisierung einer Diagnose durch chemische oder biologische Methoden, die Identifizierung von therapeutischen Indikationen mit größerer Gewißheit, das Testen von neuen biologischen Präparaten oder neuen Molekülen mit therapeutischer Aktivität, die Verfolgung der therapeutischen Wirksamkeit in Folge von gerichteten stufenweisen, wiederholten Untersuchungen ohne größeres Risiko, angesichts des nicht invasiven oder mikroinvasiven Charakters der Anwendung der Vorrichtung. Die erfindungsgemäße Vorrichtung dient so zur Analyse der Pathologie von benignen oder malignen Tumore einschließlich von festen oder flüssigen Tumoren wie den Krebsarten oder Leukämien, neurologischen, muskulären, hämatologischen, kardio-vaskulären, metabolischen oder degenerativen Pathologien, besonders unabhängig davon ob sie mit einer identifizierten genetischen Anomalie, wie einer pathologischen Prädisposition mit genetischer Komponente, zusammenhängen oder nicht. Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist auch geeignet für die Praxis und die Über wachung der zellulare Therapie, der Gentherapie, von regenerativen Behandlungen, die ausgehend von Kulturen von embryonalen Stammzellen oder nach der Geburt entnommenen Stammzellen durchgeführt wurden, oder auch für die Präimplantationsdiagnose nach in vitro-Befruchtung (IVF). Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist auch nützlich beim sich entwickelnden Menschen, beispielsweise beim Embryo nach IVF unter Respektierung der geltenden ethischen Regeln, beim Fötus im Rahmen der pränatalen Diagnose, besonders im Hinblick auf die Diagnose von genetischen Anomalien, jedoch auch im Rahmen von pränatalen Therapien, die in utero durchgeführt werden, wobei die Verwendung der Vorrichtung die Indikation erweitern kann. Die erfindungsgemäße Vorrichtung findet ebenfalls eine Anwendung im Bereich der Gerichtsmedizin und im Verlauf von eigenen wissenschaftlichen Untersuchungen der Polizei.
Bei Pflanzen oder im Bereich der Umwelt kann die erfindungsgemäße Vorrichtung ein wertvolles Werkzeug zur Identifizierung und Selektion von Pflanzensorten, der Gewinnung von genetisch modifizierten Organismen, der Überwachung von viralen oder parasitären Krankheiten, der Überwachung von Böden, der Überwachung von ökologischen Ungleichgewichten von biologischer oder chemischer Art sein, dank der Anwendungen in vitro und in vivo insbesondere zur Identifizierung von biologischen oder chemischen Verschmutzungen von Ökosystemen.
Im Landwirtschafts- und Lebensmittelbereich ist die erfindungsgemäße Vorrichtung nützlich zur Ausarbeitung und Verfolgung von OGM, besonders zur Überwachung der Regulierung und Expression von Genen, zur Überwachung von möglichen Kontaminierungen im Verlauf der Gesamtheit der Nahrungskette ohne vorherige Denaturierung von Nahrungsmitteln, beispielsweise zur Identifizierung von Mikroorganismen, Parasiten, Viren, Rikettsien oder Proteinen vom Typ Prion. So ist die erfindungsgemäße Vorrichtung brauchbar zur Überwachung der verschiedenen Stufen von Konservierungsverfahren, besonders durch Kälte.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung findet auch Interesse auf dem Gebiet der Paleontologie zur Identifizierung und Analyse von chemischen oder biologischen Merkmalen von als Mumien oder Fossilien vorliegenden Zellen, Geweben und Organen mit dem Vorteil, daß die analysierten Objekte nicht zerstört werden, und sie ermöglicht die Verbesserung der Werkzeuge zur Identifizierung der verschiedenen Stufen der Evolution der Spezien.
Die Erfindung wird erläutert durch die folgenden Beispiele einer besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung, worin
die 1 zeigt ein Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung,
die 2 bis 6 zeigen ein Prinzipschema des Immunfangens gemäß der ELISA-Methode jeweils mit einem anti-Mannan-Antikörper und mit einem anti-Laminin-Antikörper,
die 3 zeigt ein Modell des flexiblen Systems, das zur Führung des Trägers verwendet wird,
die 4 zeigt ein Schema des Trägers mit einer Mehrzahl von durch einen Antikörper sensibilisierten Regionen,
die 5 zeigt eine Pilotvorrichtung in der der starre Kunststoffträger in das Führungssystem eingesetzt ist.
Diese Arbeiten wurden mit einem System zur "in situ"-Entnahme eines Analyten für seine spätere Charakterisierung in vitro realisiert. Die Entnahme des Analyten wurde durch Immun- oder Affin-Fangen vorgenommen und das Abnahme-System zeigte folgende Merkmale:

– Starrheit,
– Führung durch ein flexibles System,
– Verbindung eines Polymers, welche die Kupplung des Antikörpers (Ab) oder des Liganden für ein Immun- oder ein Affin-Fangen des Analyten ermöglichte. Zwei Modelle wurden für diese Arbeiten gewählt:
– ein erstes Modell umfaßt die Analyse einer bei der Maus verbreiteten Candidose durch Nachweis von Antigenen (Ag) vom Typ Mannane von Candida albicans in den Nieren oder der Leber,
– ein zweites Modell beruht auf der Analyse des Engelbreth-Holm-Swarm-Tumors (E. H. S.) bei der Maus durch Nachweis des Laminins auf der Ebene des Tumors des Schenkels.

Zur Untersuchung dieser zwei Modelle wurde ein System des Immunfangens mit Hilfe des anti-Candida-Ab oder des anti-Laminin-Ab verwendet.
Zuvor wurden die verschiedenen folgenden Parameter in einem System von Mikroplatten untersucht:

– die Konzentration des Abs für das Immunfangen
– die Spezifizität des Abs für das Immunfangen
– die Markierung des Nachweis-Abs durch das Biotin
– der Nachweis des biotinylierten Ag durch den Streptavidin-Enzym-Komplex.

Die folgenden Merkmale der Träger wurden in einem in vitro-Immunfangsystem untersucht:

– ihre Art: Polystyrol oder andere
– die Aktivierung durch verschiedene Agenzien
– die Kupplung der Abs an den Trägern.

Die bei diesen Untersuchungen erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß es möglich ist (i) an einem starren Träger (mit einem flexiblen Stab verbunden) zwei Antikörper mit verschiedenen Spezifizitäten (anti-Candida und anti-Laminin) zu fixieren, (ii) entsprechende Analyten abzunehmen (Candida und Laminin-Antigene) und (iii) diese Analyte durch Antikörper zu identifizieren, die mit Biotin markiert sind, das anschließend durch einen Streptavidin-Enzym-Komplex nachgewiesen wird.
I. Konzeption und Entwicklung des Systems zum Nachweis von Mannan-Antigenen von C. albicans
1) Prinzip der Reaktion
Es handelt sich um eine Immunfangreaktion gemäß ELISA auf Mikroplatte oder Kunststoffträgern (ELISA: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), dessen Prinzip der beigefügten 2 dargestellt ist.
2) Herstellung und Kontrolle der Reagenzien
a) Reinigung des monoclonalen anti-Mannan-Antikörpers (anti-M Ab)
Der monoclonale anti-Mannan-Antikörper wurde gereinigt und geliefert durch SR2B.
b) Markierung des anti-M durch Biotin
Der gereinigte Antikörper, 3 mg/ml wurde über Nacht bei 4°C gegen Borat-Puffer 0,1 M pH 8,8 dialysiert. Eine Biotin-Lösung (Ester der 6-Biotinamidocaproylamido-Capronsäure und von N-Hydroxysuccinimid; Sigma^®) 10 mg/ml in DMSO wurde dann in einem Verhältnis von 50 μg/mg Antikörper zugefügt. Nach 4 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur und unter Rühren wurde 1 M Ammoniumchlorid in einem Verhältnis von 20 μl/250 μg Biotin zugefügt und die erhaltene Lösung wurde erneut 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach Blockierung der Reaktion wurde der markierte Antikörper durch 2 M Ammoniumsulfat ausgefällt und nach Zentrifugieren der Bodensatz in TBS-Puffer (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM) aufgenommen und 24 Stunden bei +4°C gegen diesen gleichen Puffer dialysiert.
Dieser markierte Antikörper wird in Form von Aliqots bei –20°C konserviert.
c) Herstellung des Mannan-Antigens
Die verschiedenen Herstellungsstufen sind die folgenden:

– Man gewinnt Blastosporen von Candida albicans ATCC 66396, 48 Stunden auf Sabouraud Dextrose Agar bei 22°C.
– Lyophilisierung der Hefen.
– Das Lyophilisat wird in einem Citrat-Puffer pH 7,2, 02 M aufgenommen.
– Autoclavieren 2 Stunden bei 131°C (1,3 bar).
– Zentrifugieren der Suspension 15 Minuten bei 3000 g.
– Zugabe von 2 Volumen Ethanol absolut zum Überstand und Fällung eine Nacht bei +4°C.
– Zentrifugieren 15 Minuten bei 3000 g und Waschen des Bodensatzes mit 60%-igem Ethanol;
– Zentrifugieren 15 Minuten bei 3000 g und Zugabe von Aceton zum Entwässern des Bodensatzes.
– Aufnehmen des Bodensatzes in destilliertem Wasser.

Die Dosierung der Kohlehydrate wird nach der Methode von Dubois vorgenommen. Die Konzentration an Kohlehydraten beträgt 21 mg/ml.
d) Wahl der Kunststoffträger
Flexible Systeme
Von den verschiedenen für die Führung des Trägers getesteten flexiblen Systemen wurde das ausgewählt, welches in den Photographien in den 3 und 5 dargestellt ist. Es handelt sich um einen flexiblen hohlen Kunststoffschlauch, in den der Träger eingesetzt ist.
Starre Kunststoffträger
Drei Typen von Kunststoffträgern wurden ausgewählt und zur Realisierung des Systems verwendet: einer als Kunststoff "gelb" bezeichnet, einer als Kunststoff "blau" bezeichnet und einer als Kunststoff "weiß" bezeichnet. Für jede der drei Kupplungsmethoden wurden, wie in der beigefügten 4 dargestellt, getestet: Kupplung ohne Behandlung (∅), Kupplung mit Behandlung durch Kupplungsreagenz 1 (A1), Kupplung mit Behandlung durch Kupplungsreagenz 2 (A2). Die drei Typen des Trägers wurden getestet unbehandelt oder behandelt mit A1 oder A2 und für jedes System wurden die verwendeten Träger mit anti-M Ab sensibilisiert (U). Die Träger "weiß" und "blau" lieferten ähnliche Ergebnisse. Nur der aus dem Kunststoff "weiß" bestehende Träger mit einer Länge von 2 cm und mit dem Kupplungsreagenz A2 behandelt wurde für die folgenden Untersuchungen gewählt.
e) Kontrolle der Reagenzien und Bestimmung der Parameter Empfindlichkeit, Spezifizität auf Mikroplatte und Kunststoffträgern in vitro
Auf Mikroplatte
Die Methode wurde durchgeführt auf Mikroplatte für ELISA (Greiner^®). Die für eine maximale Sensibilität gewählten Parameter sind: Konzentration des anti-M-Ab für das Immunfangen 1 μg/ml, Sättigung mit PBS-Milch 10% 1 Nacht bei 4°C, Konzentration des biotinylierten anti-M-Ab 0,01 mg/ml. Bei diesen Parametern beträgt die Empfindlichkeit 0,01 μg/ml für die Konzentration an Kohlehydraten (und nicht an Mannanen).
Auf Kunststoffträgern
Die Methode wurde durchgeführt in Hämolyse-Mikroreagenzgläsern (Fisher^®). Die für eine maximale Empfindlichkeit gewählten Parameter sind: Konzentration des anti-M-Ab für das Immunfangen 10 μg/ml, Sättigen mit PBS-Milch 10% 1 Nacht bei +4°C, Konzentration des biotinylierten anti-M-Ab 0,02 mg/ml. Mit diesen Parametern beträgt die Empfindlichkeit 0,01 μg/ml für die Kohlehydrat-Konzentration (und nicht für Mannane).
3) Nachweis von Mannan-Ags ex vivo
a) Bestimmung der Parameter um eine bei der Maus disseminierte Candidose zu erhalten

– Verwendung des Stamms Candida albicans ATCC 66396, Kultur auf Sabouraud Dextrose Agar 24 Stunden bei 37°C.
– Anfangskonzentration der Hefen 10⁷/ml in NaCl 0,15 M.
– IV-Impfen von 100 μl auf der Höhe der Caudalisvene der Maus.
– Man erhält eine disseminierte Candidose mit Auftreten von renalen und hepatischen Abszessen.

b) Nachweis von Mannan-Ags in der Leber, den Nieren, dem Blut
Am Tag J = 0: Intravenöse Impfung der Mäuse mit Blastosporen von C. albicans ATCC 66396.
Am Tag J = 2: die Mäuse werden geopfert.
Das Blut wird gesammelt durch periorbitale Abnahme in Reagenzgläser aus Glas, und nach Dekantieren wird das Serum für den Nachweis von zirkulierendem Mannan-Ag getestet.
Die Nieren oder die Leber werden entnommen und in eine sterile Petri-Schale gegeben. Das Immunfangen wird realisiert, indem man den "weißen" Kunststoffträger, der mit anti-M-Ab sensibilisiert wurde, in diese Organe eindrückt.
Nach 15 Minuten Inkubation erfolgt die Untersuchung auf Mannan-Ag auf den Träger nach dem oben in vitro beschriebenen Prinzip.
Die Nieren, die Leber oder das Blut von gesunden Mäusen bilden die Negativkontrollen.
c) Ergebnisse
Die Ergebnisse sind ausgedrückt als optische Dichte (DO) nach Subtraktion der DO der Kontrollen, welche die gesunden Mäuse sind.
Die Nieren betreffend wurden die rechte Niere und die linke Niere der Candidosen aufweisenden Mäuse unabhängig voneinander getestet mit Bezug auf Nieren von gesunder Maus. Ein signifikanter Unterschied wurde beobachtet zwischen dem Signal, das bei Anwesenheit von Mannan-Ags in den "kranken" Nieren erhalten wurde und dem für die Nieren von gesunden Mäusen erhaltenen Signal (beispielsweise ist der Unterschied der optischen Dichte etwa 0,4).
Hinsichtlich der Leber wird das Mannan-Ags ebenfalls durch die Sonde mit einer signifikanten Differenz nachgewiesen (Differenz der optischen Dichte 0,6).
Im Blut (verdünnt auf 1/10) von gesunden Mäusen oder Candidosen aufweisenden Mäusen wurden die zirkulierenden Mannan-Ags nicht nachgewiesen.
II. Konzeption und Entwicklung des Systems für den Nachweis von Laminin
1) Prinzip der Reaktion
Es handelt sich um eine Immunfangreaktion nach der ELISA-Methode auf Mikroplatte oder Kunststoffträgern. (ELISA: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), dessen Prinzip in der beigefügten 6 dargestellt ist.
2) Herstellung und Kontrolle der Reagenzien
a) Markierung des Antikörpers anti-Laminin (anti-L-Ab) mit Biotin
Der für den Nachweis des Laminins gewählte Antikörper ist ein polyclonaler Antikörper, der beim Kaninchen produziert und durch Affinität gereinigt wird (Rockland^®). Die Methode der Markierung mit Biotin ist identisch mit der für das anti-M verwendeten.
b) Laminin
Das für die Durchführung in vitro gewählte Laminin ist das gereinigte Laminin der Maus (Sigma^®).
c) Wahl der Kunststoffträger

– Flexible Systeme wie die oben für Candida albicans beschriebenen.
– Starre Kunststoffträger wie oben für Candida albicans beschrieben.

d) Kontrolle der Reagenzien und Bestimmen der Parameter von Empfindlichkeit Spezifität auf Mikroplatte und Kunststoffträgern in vitro
Auf Mikroplatte
Die Methode wurde auf Mikroplatte für ELISA realisiert (Greiner^®). Die für eine maximale Empfindlichkeit gewählten Parameter sind:

– Konzentration des anti-L-Abs für das Immunfangen 5 μg/ml.
– Sättigung mit PBS-Milch 10% eine Nacht bei +4°C.
– Konzentration des biotinylierten anti-L-Abs 5 μg/ml.

Mit diesem Parameter beträgt die Empfindlichkeit 0,01 mg/ml für die Laminin-Konzentration.
Auf Kunststoffträgern
Die Methode wurde in Hämolyse-Mikroreagenzgläsern (Fisher^®) durchgeführt. Die für eine maximale Empfindlichkeit gewählten Parameter sind die gleichen wie bei Mikroplatte, nämlich:

– Konzentration von anti-L-Ab für das Immunfangen 5 μg/ml.
– Sättigung mit PBS-Milch 10% eine Nacht bei +4°C.
– Konzentration an biotinylierten anti-L-Ab 5 μg/ml.

Mit diesen Parametern beträgt die Empfindlichkeit 0,01 mg/ml für die Laminin-Konzentration.
3) Nachweis des Laminins ex vivo
a) Bestimmung der Parameter für das Auftreten eines mit bloßem Auge sichtbaren „Laminin"-Tumors

– Auftauen des Sarkoms E. H. S. (Engelbreth-Holm-Swarm) der Maus.
– Impfen in die Schenkel der Mäuse.
– Nach 3 Wochen werden die Mäuse getötet, die Tumore werden entnommen, zerkleinert und an andere Mäuse geimpft.

b) Nachweis des Laminins auf der Höhe des Tumors des Schenkels der Maus
Die Mäuse werden getötet und das Immunfangen wird realisiert indem man den mit anti-L sensibilisierten "weißen" Kunststoffträger in den Tumor des Schenkels eindrückt. Schenkel von gesunden Mäusen bilden die Negativkontrollen.
c) Ergebnisse
Die Ergebnisse werden ausgedrückt als optische Dichte (DO) nach Subtraktion der DO von Kontrollen, welche die gesunden Mäuse sind.
Eine signifikante Differenz wird beobachtet zwischen dem Signal, das für die Anwesenheit von Laminin im Tumor erhalten wird, und dem Signal, das für die Schenkel von gesunden Mäusen erhalten wird (beispielsweise beträgt die Differenz der optischen Dichte etwa 0,3).
III. Kupplung der zwei Systeme: Gleichzeitiger Nachweis von Ag von Mannanen und Laminin ex vivo
1) Sensibilisierung der Sonde
Der aus dem "weißen" Kunststoff bestehende und durch das flexible Führungssystem gehaltene Träger wird mit anti-M-Ab und anti-L-Ab mit den zuvor festgelegten Konzentrationen sensibilisiert.
2) Nachweis der Ag von Mannanen und Laminin ex vivo
Das Immunfangen wird realisiert bei:

– gesunden Mäusen (Kontrollen)
– Mäusen, die von Candidosen befallen sind
– Mäusen mit einem Laminin-Tumor (E. H. S.)

Die Träger werden:

– entweder zunächst in die Nieren oder die Leber einer von disseminierter Candidose befallenen Maus und dann in den Tumor (E. H. S.) des Schenkels einer anderen Maus gebracht.
– oder sie werden zunächst in den Tumor (E. H. S.) des Schenkels einer Maus und dann in die Nieren oder die Leber einer anderen von disseminierter Candidose befallenen Maus gebracht.

Die Träger werden anschließend mit dem anti-M oder dem anti-L oder einem Gemisch dieser zwei entwickelt.
Negative Kontrollen werden realisiert, indem man Träger in die Nieren oder die Leber einer gesunden Maus und dann in den Schenkel der gleichen Maus und umgekehrt brachte.
3) Ergebnisse
Die Ergebnisse sind ausgedrückt als optische Dichte (DO) nach Subtraktion der DO von Kontrollen, welche die gesunden Mäuse sind.
Unabhängig von der Reihenfolge in der der Träger in die verschiedenen Organe implantiert wird, wird das Mannan-Ag oder das Laminin signifikant nachgewiesen mit Bezug auf gesunde Mäuse wenn das System mit nur einem der zwei Antikörper entwickelt wird (DO: 0,4 für Mannan-Ag und 0,4 für das Laminin).
Wenn das Gemisch der zwei biotinylierten Antikörper zum Entwickeln verwendet wird, ist das erhaltene Signal viel stärker (beispielsweise Mäuse mit Candidose und Laminin DO = 0,7).
Das Mannan-Ag konnte im Blut von gesunden Mäusen oder solchen mit disseminierten Candidosen nicht nachgewiesen werden.

Claims

Eine Vorrichtung zur in situ-Analyse und/oder Behandlung, in der ein System zur Untersuchung und/oder Behandlung in einem medizinischen Instrument gleitet, dadurch gekennzeichnet, daß sie aufweist: i) ein Mikrosystem zur Untersuchung eines Substrats anders als durch Analyse eines fluoreszierenden Signals, und/oder zur Ausschüttung aktiver Agenzien auf der Ebene eines Substrats, ii) einen flexiblen Stab, an dessen einem Ende das Mikrosystem befestigt ist und dessen anderes Ende zur Betätigung des besagten Mikrosystems bestimmt ist, iii) ein medizinisches Instrument mit einem internen Schlitz, in dem der flexible Stab gleiten kann, iv) ein auf Substratebene lösbares System zum Schutz des Mikrosystems, und v) auf der Ebene des besagten Mikrosystems ein System zur Gewebs- oder Zelldilazeration (Zerkleinerung).
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Mikrosystem und der flexible Stab bei ihrer in situ-Verwendung miteinander verbunden sind und nur vor oder nach dem in situ-Eingriff voneinander getrennt sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Mikrosystem vom Typ ist, das einen Träger aufweist, auf dessen Oberfläche vordefinierte Regionen angeordnet sind, die jeweils chemische oder biologische identische oder unterschiedliche Substanzen zur Untersuchung oder Behandlung des Substrats enthalten, wohin das Mikrosystem mit dem flexiblen Stab geführt wird.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Mikrosystem ein Rezeptor/Ligand-Mikrosystem ist, das Paare chemischer oder biologischer Substanzen verwendet, von denen das eine oder andere oder die beiden Glieder des Paares auf jeder vordefinierten Region fixiert sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Mikrosystem ein Rezeptor/Ligand-Mikrosystem ist, daß Antigen/Antikörper-Paare verwendet.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die chemischen oder biologischen Substanzen Polynucleotid- oder Aminosäure-Sequenzen sind.
Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die biologischen Substanzen bilden: – eine Anordnung von Polynucleotiden, die mit auf Ebene des Substrats vorhandenen Nucleinsäuren hybridisieren können, oder – eine Anordnung von Peptiden, Polypeptiden oder Proteinen, die mit einem entsprechenden Rezeptor oder immunologisch mit auf Ebene des Substrats vorhandenen Antikörpern oder Antigenen reagieren können.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die chemischen oder biologischen Substanzen auf dem Träger durch Bindungen fixiert sind, die in situ gespalten werden können.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der flexible Stab von einem medizinischen Instrument gebildet wird, das bei diagnostischen, therapeutischen oder experimentellen Zwecken Verwendung findet.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Mikrosystem an einem der Enden des flexiblen Stabs durch jedwedes Verbindungsmittel befestigt ist, das von einem Schwenksystem gebildet wird, das die Steuerung und Positionierung mit dem flexiblen Stab im Raum und vom Mikrosystem entfernt erlaubt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Mikrosystem von einem Träger gebildet wird, der sich als ein um ein Ende des flexiblen Stabs gerolltes Band darstellt.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie an dem Ende, wo das Mikrosystem befestigt ist, ein System zur Unterstützung der Funktion des besagten Mikrosystems aufweist, wie ein System zur Beheizung und/oder Kühlung oder Freisetzung einer biologischen oder chemischen Substanz.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einer oder mehreren Vorrichtungen verbunden ist, die aus Vorrichtungen zur Überwachung, zur Durchführung einer Biopsie, Behandlung, lokalen Injektion von biologischen oder chemischen Produkten ausgewählt wurde/n.