DE102007041835B4

DE102007041835B4 - Diagnosesubstanz zur Anwendung in einem Verfahren zur Diagnose von pathologischem Gewebe und ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Diagnosesubstanz

Info

Publication number: DE102007041835B4
Application number: DE102007041835A
Authority: DE
Inventors: Jens Fehre; Dr. Nanke Ralf; Dr. Stetter Martin
Original assignee: Siemens AG
Current assignee: Siemens Healthcare GmbH
Priority date: 2007-09-03
Filing date: 2007-09-03
Publication date: 2012-04-26
Anticipated expiration: 2027-09-04
Also published as: DE102007041835A1; US20090060845A1

Abstract

Diagnosesubstanz zur Anwendung in einem Verfahren zur Diagnose von pathologischem Gewebe, welche wenigstens eine Virenpopulation mit spezifisch an für ein bestimmtes pathologisches Gewebe typische Zielmoleküle (2) bindenden Viruspartikeln enthält, wobei an die Viruspartikel jeweils ein mit Hilfe einer Detektionseinrichtung detektierbares Label (3) gebunden ist.

Description

Die Erfindung betrifft eine Diagnosesubstanz zur Anwendung in einem Verfahren zur Diagnose von pathologischem Gewebe und ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Diagnosesubstanz. In der Diagnostik komplexer Krankheiten, ist die Differenzierung zwischen Körpergeweben mit unterschiedlichen Erkrankungen oder zwischen unterschiedlichen Stadien eines pathologischen Gewebes von entscheidender Bedeutung für die jeweils optimale Vorgehensweise bei der Therapie. Zur Erkennung einer bestimmten Gewebeart ist es bekannt, dem betroffenen Gewebe – meist über die Blutbahn – eine Biomarker enthaltende Diagnosesubstanz zuzuführen. Die Biomarker umfassen ein Koppelmolekül, das an ein für ein bestimmtes pathologisches Gewebe oder ein bestimmtes Stadium eines solchen Gewebes typisches Molekül, das hier als Zielmolekül bezeichnet wird, spezifisch bindet. Bindungsereignisse am Gewebe werden mittels eines mit dem Koppelmolekül verbundenen, mit einer Detektiereinrichtung detektierbaren Label, beispielsweise einem fluoreszierenden Farbstoffmolekül, erkennbar gemacht. Unter einem Zielmolekül sind nicht nur einzelne Moleküle, sondern auch molekulare Strukturen zu verstehen, die etwa von mehreren Molekülen gebildete Bindungsstellen für ein Koppelmolekül aufweisen. Die Diagnosesubstanz kann neben Biomarkern noch weitere Komponenten, etwa ein wässriges Lösungsmittel und Hilfsstoffe enthalten. Beispielsweise im Falle des frühen hgPIN-Stadiums (high grade prostatic intraepithelial neoplasia) des Prostatakrebses wird im Endothel der dem Krebsgewebe direkt benachbarten Blutgefäße CEACAM-1-Moleküle (carcinoembryionic antigenrelated cell adhesion molecule) ausgebildet. Diese Moleküle sind somit Indikatoren für das genannte Krebsstadium. Ziel der Diagnostik ist es nun, das Vorhandensein solcher „Indikatormoleküle” bzw. Zielmoleküle zuverlässig festzustellen. Ein Biomarker, mit dem dies möglich ist, muss mit hoher Selektivität und Spezifität an das Zielmolekül bzw. die Zielstruktur anbinden, d. h. er muss in der Lage sein, aus der Gesamtmenge möglicher Bindungspartner mit hoher Wahrscheinlichkeit einen bestimmten zu erkennen und an diesen auch zuverlässig zu binden. Außerdem muss der Biomarker zumindest so lange gebunden bleiben, bis die oben erwähnte Detektion abgeschlossen ist. Hinsichtlich der Detektion muss gewährleistet sein, dass diese mit einem (möglichst nicht invasiven) Verfahren durchführbar ist.
Komplexe Krankheiten wie Krebs sind u. a. dadurch gekennzeichnet, dass es neben den oben erwähnten Stadien viele Ausprägungen, Reife- und Aggressivitätsgrade gibt. So ist z. B. für die metastasische Aktivität jedes Typs von Primärtumor (Prostata, Lunge, Darm, etc.) sowie bei gegebenem Primärtumor für jedes Zielgewebe einer Metastase ein eigener molekularer Mechanismus am Werk. Um hier eine differenzierte Diagnose vornehmen zu können, die wiederum für die Auswahl einer optimalen Therapie unerlässlich ist, sind eine große Vielzahl verschiedener Biomarker erforderlich. Zu deren Herstellung kommen ähnliche Verfahren wie bei der Wirkstoffentwicklung (drug-discovery) zur Anwendung. Ein solches Verfahren ist beispielsweise das „High-throughput-Screening”, bei dem in automatisierter Form viele tausend Proben von Targets, also von Zielmolekülen mit tausenden verschiedener Molekültypen zusammengebracht werden. Gut bindende Moleküle kommen dabei als potentielle Biomarker in Frage. Diese müssen dann aber noch im Hinblick auf ihre Bindungseigenschaften beispielsweise bei unterschiedlichen Umgebungsbedingungen, ihre Körperverträglichkeit sowie ihre Fähigkeit, ein detektierbares Label zu binden, optimiert werden. Die Herstellung von Biomarkern nach diesem Verfahren ist daher relativ langwierig und aufwändig.
Davon ausgehend ist es die Aufgabe der Erfindung, eine einfacher herstellbare Diagnosesubstanz und ein entsprechendes Herstellungsverfahren vorzuschlagen.
Die erstgenannte Aufgabe wird durch eine Diagnosesubstanz nach Anspruch 1 und die letztgenannte Aufgabe durch ein Verfahren nach Anspruch 11 gelöst. Eine erfindungsgemäße Diagnosesubstanz enthält wenigstens eine Virenpopulation mit spezifisch an für ein bestimmtes pathologisches Gewebe typische Zielmoleküle bindenden Viruspartikeln, wobei an die Viruspartikel jeweils ein mit Hilfe einer Detektionseinrichtung detektierbares Label gebunden ist. Dabei kommen natürlich nur solche Viren zum Einsatz, die unschädlich für den Menschen sind. Viruspartikel bzw. Virionen besitzen eine meist aus verschiedenen Proteinen zusammengesetzte Hülle, wobei die jeweiligen Proteine auf der DNA des Virus genetisch variabel codiert sind, d. h. das Virus kann die Struktur der Proteine etwa zur Anpassung an unterschiedliche Wirtszellen mutieren. Aufgrund der genetischen Variabilität der Virenhülle kann das Prinzip der Reproduktion und Selektion, also eine gerichtete biologische Evolution benutzt werden, um ein Protein der Virenhülle so umzugestalten, dass es an ein Zielmolekül spezifisch bindet. Besonders vorteilhaft sind für den Menschen völlig unschädliche M13-Phagen, die sich über E. coli als Wirtszellen vermehren. Es handelt sich dabei um einen fadenförmigen Phagen mit einer Dicke von etwa 5 nm und einer Länge von bis zu 1 μm. Er enthält einen einzigen DNA-Ring, der von einem Mantel aus einem Hüllprotein, hier mit Typ 1 bezeichnet, umgeben ist. An den Enden des Phagen befinden sich weitere Proteine, die hier mit Typ 2 und Typ 3 bezeichnet werden. Die genannten Proteine lassen sich durch gerichtete Evolution, wie weiter unten noch näher erläutert wird, leicht an die unterschiedlichsten Bindungspartner anpassen.
Weitere vorteilhafte Varianten der Diagnosesubstanz und das zu deren Herstellung vorgeschlagene Verfahren werden in der nun folgenden Beschreibung näher erläutert. Dabei wird auf die beigefügten Prinzipdarstellungen Bezug genommen. Es zeigen:
1 ein an ein Zielmolekül gebundenes Viruspartikel mit einem Microbubble als Label,
2 die Bindung eines Viruspartikels an ein endothelständiges Zielmolekül,
3 den Ablauf eines Herstellungsverfahrens für eine spezifisch bindende Viruspopulation.
Nachdem eine Diagnosesubstanz, etwa durch orale, intravenöse oder rektale Verabreichung über die Blutbahn einem pathologischen Gewebe, im Folgenden wird auf einen Prostatakrebs Bezug genommen, zugeführt wurde, kommt es zu einer spezifischer Bindung zwischen einem Zielmolekül und einem Hüllprotein eines als Biomarker dienenden Viruspartikels, der bei einer besonders bevorzugten Ausführungsvariante ein M13-Phage 1 ist, auf den im Folgenden exemplarisch Bezug genommen wird. M13-Phagen sind in der Genetik ein weitverbreitetes Werkzeug, so dass deren Verwendung insofern vorteilhaft ist, als auf bekannte und zuverlässige Techniken, z. B. bei deren Reproduktion, zurückgegriffen werden kann. Der fadenförmige M13-Phage 1 weist eine sich nahezu über seine gesamte Länge erstreckende, im wesentlichen zylindrischen Hülle aus einem einzigen Typ eines Proteins auf die einen einsträngigen DNA-Ring (nicht gezeigt) umschließt. An den Enden des Phagen 1 sind weitere Proteine des Typs 2 und 3 vorhanden, (jeweils angedeutet in 2). Sowohl die endständigen Proteine des Typs 2 und 3 als auch das Protein des Typs 1 der Phagenhülle eignen sich zur Anbindung an ein Zielmolekül 2 sowie an eine durch eine Detektiereinrichtung detektierbares Label 3. Das Label 3 kann entweder ein Molekül oder ein Partikel sein. Vorzugsweise ist das Label so gestaltet, dass es sich für die Detektion mit Hilfe eines bildgebenden Verfahrens eignet. Denkbar ist z. B., dass als Label 3 ferromagnetische Partikel eingesetzt werden, welche mit Hilfe von MRT-Verfahren (MRT = Magnetresonanz-Tomographie) detektierbar sind. Derartige Partikel sind naturgemäß auch mit Hilfe der Computertomographie (CT) detektierbar, müssen zu diesem Zweck jedoch nicht ferromagnetisch sein. Hier reicht es aus, wenn die Partikel aus einem für Röntgenstrahlen nicht oder nur wenig durchlässigen Material, beispielsweise aus einem beliebigen Metall, bestehen. Eine Anreicherung von Phagen 1 im Krebsgewebe 4 kann auch erkannt werden, wenn als Label 3 ein Farbstoff verwendet wird, der elektromagnetische Wellen, etwa im Nahinfrarotbereich, absorbiert. Denkbar ist auch ein vorzugsweise in dem genannten Wellenlängenbereich floureszierender Farbstoff. Elektromagnetische Strahlung im Nahinfrarotbereich hat die Eigenschaft, dass sie Körpergewebe relativ ungehindert durchdringt, so dass sie mit zum Krebsgewebe beabstandeten Sonden, etwa mit einer Rektalsonde im Falle des Prostatakrebs, detektierbar ist. Eine weitere Möglichkeit, eine Anreicherung von Phagen 1 im Krebsgewebe 4 sichtbar zu machen, besteht darin, als Label 3 sogenannte Microbubbles 5 zu verwenden. Microbubbles sind winzige Bläschen, deren Hülle beispielsweise von einer Lipid-Doppelmembran gebildet ist. Die Erkennung erfolgt durch Bestrahlung mit Ultraschall und Detektion mit entsprechenden Ultraschallsensoren.
Je nach der vorliegenden Krankheit fungieren unterschiedliche Indikator- bzw. Zielmoleküle 3 als Bindungspartner für die Phagen 1. Bei der Behandlung des Prostatakrebses, bei der die vorliegende Erfindung besonders vorteilhaft anwendbar ist, bilden sich im Endothel der Gefäßwand 6 von Blutgefäßen 2 des Krebsgewebes 4 oder dem Krebsgewebe direkt benachbarter Blutgefäße 2 für jeweils unterschiedlicher Stadien des Prostatakrebs unterschiedliche Molekültypen aus, beispielsweise im Falle des hgPIN-Stadiums, also der hochgradigen Prostataneoplasie, sogenannte CEACAM-1 Moleküle. Der Phage 1 ist in diesem Fall durch das weiter unten noch naher erläuterte Verfahren so gezüchtet, dass sein Hüllprotein an CEACAM-1 selektiv und spezifisch bindet. Ein späteres, sich bereits im Zustand der Angiogenese befindliches Krebsstadium lässt sich beispielsweise an Hand des Wachstumsfaktors VEGF oder an Hand der ebenfalls ausgebildeten Alpha(V)-beta(3)-Integrine feststellen. Die zur differenzierten Diagnose des genannten Krebsstadiums eingesetzten Phagen 1 sind durch ein direktes Evolutionsverfahren ebenfalls so angepasst, dass sie an die genannten Moleküle selektiv und spezifisch binden. Eine verabreichte Diagnosesubstanz kann nun nicht nur einen Typ eines bestimmten Phagen 1 beinhalten, sondern mehrere verschiedene, an unterschiedliche Zielmoleküle bindende Phagen 1. So ist es beispielsweise vorteilhaft wenn die Diagnosesubstanz sowohl an CEACAM-1 als auch an VEGF und/oder Alpha(V)beta(3)-Integrine bindenden Phagen 1 enthält.
Zur Herstellung eines spezifischen, an ein bestimmtes Zielmolekül bindenden Phagen 1 wird wie folgt vorgegangen (3): In einem ersten Schritt a) wird ein Behälter 9, etwa ein Becherglas, ein Reagenzglas oder ein Pharmareaktor bereitgestellt, in dem sich eine wässrige Lösung 8, beispielsweise eine isotonische Kochsalzlösung befindet. Je nach den späteren Einsatzbedingungen des Arzneimittels kann die wässrige Lösung 8 hinsichtlich ihres pH-Wertes, ihrer Temperatur, der in ihm gelösten Stoffe usw. verändert werden. In die wässrige Lösung 8 werden Zielmoleküle 2 eingebracht. Diese können gelöst oder an den Behälterwänden oder an separaten Tragstrukturen immobilisiert sein. An Stelle von Molekülen können auch ganze Zellen des kranken Gewebes oder sogar ganze Teile davon verwendet werden. In die wässrige Lösung 8 wird weiterhin eine Population n eines Virus, vorzugsweise des M13-Phagen 1 eingebracht. Ein Kontakt zwischen den Phagen 1 und den Zielmolekülen 2 kann gegebenenfalls durch Schütteln, Rühren oder dergleichen unterstützt werden. Die einzelnen Viruspartikel einer Virenpopulation sind aufgrund von Spontanmutationen hinsichtlich ihrer Hüllproteine naturgemäß nicht völlig identisch. Es besteht daher eine relativ große Wahrscheinlichkeit, dass sich Viruspartikel darunter befinden, die zumindest eine gewisse Bindungsaffinität zu den Zielmolekülen aufweisen und daher an ihnen haften bleiben. In einem Verfahrensschritt b) wird nun eine an den Zielmolekülen 2 haftende Sub-Population n_b von der restlichen, nicht bindenden Population n_nb abgetrennt. Dies kann beispielsweise durch Auswaschen des wässrigen Mediums 8 erfolgen. Im Falle von im Behälter immobilisierten Zielmolekülen 2 bleibt die bindende Subpopulation n_b im Behälter zurück. Nach einer derartigen oder auf eine sonstige Weise vorgenommenen Separierung der bindenden von der nicht bindenden Population wird die Bindung zwischen den Zielmolekülen 2 und den Phagen 1 der bindenden Population n_b etwa durch Zugabe eines Elektrolyten oder dergleichen getrennt. In einem sich dann anschließenden Reproduktionsschritt wird die bindende Subpopulation n_b mit Hilfe von Bakterien 10 vermehrt. Die reproduzierte Phagenpopulation (n + 1) wird nun in einem letzten Verfahrensschritt wieder in die wässrige Lösung 8 eingebracht, wobei die Verfahrensschritte a) bis d) wiederholt werden. Dabei werden gegebenenfalls die chemischen und/oder physikalischen und/oder physiologischen Eigenschaften der wässrigen Lösung 8 verändert, damit für die Phagen beispielsweise härtere, den Selektionsdruck erhöhende Bedingungen vorliegen. Ganz allgemein kann durch entsprechende Auslegung des Selektionsdrucks die Ausprägung der bindenden Hüllproteine so gestaltet werden, dass ganz bestimmte Eigenschaften hervorgerufen werden. So ist es etwa denkbar, dass die Reaktionsbedingungen so gewählt werden, dass ein Virus bzw. Phage mit einer sehr hohen Selektivität, d. h. ein Biomarker erhalten wird, der nur an ein ganz bestimmtes Zielmolekül mit hoher Sensitivität bindet. Hit Hilfe mehrerer solcher spezifisch und hochselektiv wirkender Biomarker lässt sich eine Abgrenzung zwischen Geweben unterschiedlicher Krankheitsbilder vornehmen. Es kann etwa der Prostatakrebs von der Prostatitis unterscheiden werden. Die Züchtung der Phagen 1 oder allgemein von Viren kann mit Hilfe des beschriebenen Verfahrens auch so erfolgen, dass an der Phagenhülle weitere Bindungsorte geschaffen werden, die sich beispielsweise zur Anbindung eines Labels 3 der oben genannten Art, beispielweise eines Microbubbles 5, eines ferromagnetischen Metallpartikels oder eines im Nahinfrarotbereich absorbierenden und/oder floureszierenden Farbstoffs eignen.

Claims

Diagnosesubstanz zur Anwendung in einem Verfahren zur Diagnose von pathologischem Gewebe, welche wenigstens eine Virenpopulation mit spezifisch an für ein bestimmtes pathologisches Gewebe typische Zielmoleküle (2) bindenden Viruspartikeln enthält, wobei an die Viruspartikel jeweils ein mit Hilfe einer Detektionseinrichtung detektierbares Label (3) gebunden ist.
Diagnosesubstanz nach Anspruch 1, bei der eine Bakteriophagen-Population enthalten ist.
Diagnosesubstanz nach Anspruch 2, enthaltend den Phagen M13.
Diagnosesubstanz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, mit einem durch eine bildgebende Detektionseinrichtung detektierbaren Label.
Diagnosesubstanz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, mit einer an eine für ein Krebsgewebe (4) typisches Molekül spezifisch bindenden Virenpopulation.
Diagnosesubstanz nach Anspruch 5, mit einer an eine für ein bestimmtes Stadium eines Krebsgewebes (4) typisches Zielmolekül (2) spezifisch bindenden Virenpopulation.
Diagnosesubstanz nach Anspruch 6, mit einer an CEACAM-1 bindenden Virenpopulation.
Diagnosesubstanz nach Anspruch 6, mit einer an einen Wachstumsfaktor eines Krebsgewebes bindenden Virenpopulation.
Diagnosesubstanz nach Anspruch 8, mit einer an VEGF bindenden Virenpopulation.
Diagnosesubstanz nach Anspruch 8, mit einer an Alpha(V)-beta(3)-Integrin bindenden Virenpopulation.
Verfahren zur Herstellung einer Diagnosesubstanz, welche wenigstens eine Virenpopulation mit spezifisch an für ein bestimmtes pathologisches Gewebe typische Zielmoleküle bindenden Viruspartikeln enthält, mit folgenden Schritten: a) Zielmoleküle (2) und eine Population (n) eines genetisch variablen Virus werden zusammen in eine wässrigen Lösung (8) eingebracht, b) in einem Selektionsschritt werden nicht bindende Viren von bindenden Viren separiert, c) in einem Reproduktionsschritt werden die bindenden Viren vermehrt, d) die reproduzierte Virenpopulation (n + 1) wird in eine wässrige Lösung (8) eingebracht, wobei die Schritte a) bis d) gegebenenfalls bei geänderten Reaktionsbedingungen wiederholt werden, bis eine Virenpopulation gefunden ist, die spezifisch an ein bestimmtes Zielmolekül bindet.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem ein Bakteriophagen-Population verwendet wird, wobei der Reproduktionsschritt c) mit Hilfe von Bakterien (10) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 12, bei dem der Phage M13 verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11, 12 oder 13, bei dem als Zielmoleküle (2) CEACAM-1-Moleküle verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11, 12 oder 13, bei dem als Zielmoleküle (2) VEGF-Moleküle verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11, 12 oder 13, bei dem als Zielmoleküle (2) Alpha(V)-beta(3)-Integrine verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, bei dem anstelle von Zielmolekülen (2) als detektierbare Label dienende Moleküle oder Partikel in die wässrige Lösung (8) eingebracht werden.