DE69732131T2

DE69732131T2 - Immuno-Assay-Vorrichtung mit teilbarem Gehäuse

Info

Publication number: DE69732131T2
Application number: DE69732131T
Authority: DE
Inventors: R. Charles CARPENTER
Original assignee: Idexx Laboratories Inc
Current assignee: Idexx Laboratories Inc
Priority date: 1996-10-25
Filing date: 1997-10-15
Publication date: 2005-12-15
Anticipated expiration: 2017-10-16
Also published as: US6893880B2; DE69732131D1; ATE286252T1; EP0937257A1; US6235539B1; EP0937257B1; US20010016360A1; WO1998019164A1; AU4817897A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet von Ligand-Rezeptor-Assays und -Vorrichtungen, einschließlich immunometrischer Assays, die für die Analyse von Analyten in einer Probe konstruiert sind.
Hintergrund der Erfindung
Ligand-Rezeptor Assays werden heute umfangreich auf solchen Gebieten wie klinischer, forensischer und veterinärer Medizin, pharmakologischer Prüfung, Umweltüberwachung, Qualitätssicherung von Lebensmitteln und anderen verwandten Gebieten verwendet, die die schnelle und wirksame Analyse von spezifischen Substanzen (die als Analyte bezeichnet werden), die häufig in niedrigen Konzentrationen in der vorgegebenen Probe gefunden werden, erfordern.
Diese Assays sind insbesondere bei der in vitro Bestimmung des Vorhandenseins und der Konzentration von Analyten in physiologischen Flüssigkeiten verwendbar. Zum Beispiel hat die Bestimmung von spezifischen Proteinen, Enzymen, Hormonen, Metaboliten und therapeutischen oder toxischen Medikamenten in Blut, Urin oder Liquor die Wirksamkeit von diagnostischen Methoden in der klinischen Medizin deutlich erweitert.
Darüber hinaus hat die Entwicklung von nicht-radioaktiven Markerbestandteilen, die die direkte Visualisierung der abgeschlossenen Reaktion erlauben, die Verwendung von Ligand-Rezeptor Assay-Verfahren außerhalb des „typischen" Labors ermöglicht. Zum Beispiel sind nicht-radioaktiv-markierte Ligand-Rezeptor Assays in klinischen Amtseinrichtungen verwendbar, um schnelle, einfache Verfahren, die durchgeführt werden können, während der Patient noch in der Praxis ist, bereitzustellen. So kann die Diagnose ohne Verzögerung durchgeführt werden und die Behandlung während eines einzigen Besuchs eingeleitet werden.
Ohne solche Assays war es häufig notwendig, während eines ersten Besuches dem Patienten eine Probe zu entnehmen und die biologische Probe zu einer späteren Zeit durch ein klinisches Labor analysieren zu lassen. Während dieser Zeit wurde der Patient nach Hause geschickt, und es war oft erforderlich, für einen zweiten Praxisbesuch zurückzukehren, um die richtige Behandlung und/oder Medikation zu erhalten. Eine solche Verzögerung ist bestenfalls ineffizient und schlimmstenfalls potentiell lebensbedrohlich.
Der Ausdruck „Ligand-Rezeptor Assay", wie hierin verwendet, bezieht sich auf einen Assay für ein spezifisches Analyt, das durch die Bildung eines Komplexes zwischen einem Ligand und einer anderen Substanz, die zu einer spezifischen Interaktion mit dem Ligand in der Lage ist (z. B. einem Rezeptor), detektiert werden kann. Der Ligand kann das Analyt selbst oder eine Substanz sein, die, sofern sie detektierbar ist, verwendet werden kann, um auf die Anwesenheit des Analyts in der Probe zu schließen. In dem Kontext der vorliegenden Erfindung schließt der Ausdruck „Ligand" Verbindungen wie Proteine, modifizierte Proteine, Nukleinsäuren wie z. B. Desoxyribonukleinsäure (DNA), Ribonukleinsäure (RNA), Peptidnukleinsäure (PNA), Haptene, Antigene, Antikörper und jeden Metaboliten dieser Substanzen genauso wie jede andere Verbindung (entweder natürlich oder synthetisch), die von diagnostischem Interesse sein könnte und die einen spezifischen Ligand-Bindungspartner besitzt (z. B. der Rezeptorteil des Ligand-Rezeptor-Assays) ein, aber ist nicht darauf beschränkt.
Um die Konzentration der Liganden in der Testprobe zu bestimmen, sind Ligand-Rezeptor Assays auf die Bindung der Liganden durch Rezeptoren angewiesen. Ligand-Rezeptor Assays können als entweder kompetitiv oder nicht-kompetitiv in ihrer Natur differenziert und kategorisiert werden. Nicht-kompetitive Assays verwenden im Allgemeinen den Rezeptorbestandteil in einem beträchtlichen Überschuss über der Konzentration des in dem Assay zu bestimmenden Liganden.
Ein Beispiel eines nicht-kompetitiven Assays, der „Sandwich Assay", verwendet eine Methode, wobei der Ligand über seine Bindung an zwei verschiedene Rezeptoren detektiert wird – wobei ein Rezeptor markiert sein kann, um die folgende Detektion zu ermöglichen und der andere häufig an eine feste Phase immobilisiert ist, um die Trennung von ungebundenen Reaktionsbestandteilen (z. B. ungebundenem markiertem erstem Rezeptor) zu ermöglichen. Im Gegensatz dazu schließen kompetitive Ligand-Rezeptor Assays im allgemeinen Liganden aus der Testprobe, einen gereinigten Liganden oder ein Ligand-Analog, der/das markiert ist, um die Detektion zu ermöglichen und eine raten-limitierende Konzentration des Ligand-Rezeptors ein. Dem Proben-Ligand und den markierten Liganden/Ligand-Analog-Resten wird im folgenden erlaubt, um die begrenzte Anzahl von Bindungsstellen zu konkurrieren, die durch die Rezeptoren bereitgestellt werden, die in der Assay-Mischung vorhanden sind.
Kompetitive Ligand-Rezeptor-Assays können in ihrer Art weiter als homogen oder heterogen differenziert werden. In homogenen Assays werden alle an der Konkurrenzreaktion teilnehmenden Reaktanden zusammengemischt, und die Konzentration des Liganden wird durch seine Wirkung auf das Ausmaß der Bindung zwischen Ligand-Rezeptor und markiertem Ligand-Analog bestimmt. Das Signal, das beobachtet wird, ist eine direkte Funktion dieser Bindung und kann zu der Gesamtkonzentration des in der Testprobe enthaltenden Liganden in Beziehung gesetzt werden. U.S. Pat. Nr. 3,817,837 offenbart so einen homogenen, kompetitiven immunometrischen Assay, in dem das markierte Ligand-Analog ein Ligand-Enzym-Konjugat und der Ligand-Rezeptor ein Antikörper ist, der in der Lage ist, entweder den Liganden oder das Ligand-Analog zu binden. Im Allgemeinen erfordern homogene Assay-Systeme sowohl externe Instrumentierung, um das Ergebnis zu bestimmen als auch die vorige Kalibrierung des beobachteten Signals durch separate Tests, die mit bekannten Konzentrationen des spezifischen Liganden in einem Prozess, der als Standardisierung bekannt ist, durchgeführt werden. Obwohl homogene Assays die Entwicklung von kompetitiven immunometrischen Assay-Systemen dominiert haben, sind solche Systeme nicht in der Lage, Ergebnisse für die Bestimmung von vielfältigen Liganden in einer Testprobe in einem Einzeltestformat, das keine externe Instrumentierung erfordert, bereitzustellen.
Heterogene kompetitive Ligand-Rezeptor-Assays erfordern die Trennung des gebundenen markierten Liganden oder Rezeptors von dem freien markierten Liganden oder Rezeptor und die folgende Messung entweder der Konzentration der gebundenen oder der freien Fraktion. Die Methode zum Durchführen dieser Assays wird in U.S. Pat. Nr. 3,654,090, 4,298,685, und 4,506,009 beschrieben. Beim Gebrauch dieser Methode kann die quantitative oder semi-quantitative Messung der Liganden-Konzentration nicht ohne die Verwendung von zusätzlichen Tests, um die Assay-Ergebnisse zu kalibrieren, durchgeführt werden. Daher kann ohne zusätzliche Instrumentierung oder Tests nur die An- oder Abwesenheit des Liganden bestimmt werden. Kürzlich wurden jedoch Methoden für die interne Kalibrierung von Ligand-Rezeptor Assays durch das Bereitstellen einer Vorrichtung entwickelt, die Referenzzonen enthält, wobei die vorgegebene Antwort in der Referenzzone die Assay-Antwort für eine spezifische Konzentration des Liganden darstellt. Um die Konzentration des Liganden in der Testprobe in einer quantitativen oder semi-quantitativen Weise zu bestimmen, wird die durch die unbekannte Konzentration von Ligand erzeugte Antwort in der Testprobe dann mit der Antwort in der Referenzzone verglichen. Das U.S. Pat. Nr. 4,540,659 beschreibt ein System, das verschiedene Standards von Ligandenkonzentrationen enthält, die die Fähigkeit bereitstellen, semi-quantitative Bestimmungen von Ligandenkonzentrationen in kompetitiven Ligand-Rezeptor Assays über direkte visuelle Auswertung durchzuführen.
Die Mittel zur Probenentnahme und Zuführung sind auf dem entsprechenden Gebiet bekannt. Zum Beispiel wird in U.S. Patent Nr. 5,169,789 und 4,770,853 ein Zuführungsbestandteil beschrieben, das aus einem gesonderten stabähnlichen Bestandteil mit einem an ein Ende angebrachten saugfähigen Material besteht. Für den Assay wird die Probe durch einfache Absorption der wässrigen Probe gesammelt und der Sammel-Bestandteil anschließend in dem Assay-Gerät platziert. U.S. Patent Nr. 4,624,929 offenbart einen Probensammler, der aus einer, innerhalb eines Gehäuses begrenzten, saugfähigen Membran besteht. Das Sammeln der Probe wird durch das Kontaktieren des Probensammlers mit der gewünschten wässrigen Probe ermöglicht. Die Europäischen Patentanmeldungen Nr. 0291194 und 0383619 offenbaren einen dochtähnlichen Probensammler, der aus saugfähigem Material besteht, das mit dem internen Chromatographiematerial zusammenhängt.
Obwohl es zahlreiche Ligand-Rezeptor Assay-Vorrichtungen und Mittel zur Probensammlung und -Zuführung gibt, die zur Zeit innerhalb der relevanten Gebiete in Verwendung sind, dient die Vorrichtung, die hierin offenbart wird, dazu, etliche der Schwierigkeiten zu mindern, denen häufig bei der Verwendung dieser Vorrichtungen begegnet wird. Zum Beispiel wird das Erfordernis großer anfänglicher Probenvolumina, manchmal so viel wie mehrere Milliliter, mit vielen kommerziell erhältlichen Vorrichtungen oft problematisch. Dieses Volumenerfordernis ist eine Funktion der vergleichsweise ineffizienten Mittel zur Probensammlung und/oder -Zuführung, die diese Vorrichtungen besitzen. Außerdem kann das Erfordernis von solchen großen anfänglichen Probenvolumina potentiell zu Schwierigkeiten führen, wenn nur kleine Probenvolumina oder nur eine einzige Testprobe verfügbar sind.
Im Gegensatz dazu erfordert die vorliegende Erfindung aufgrund der Verwendung eines neuen Probensammlers und -Zuführers vergleichsweise kleine anfängliche Probenvolumina für die Analyse von Analytkonzentrationen. Die Eigenschaften der vorliegenden Erfindung negieren ebenfalls den Bedarf nach sekundären, externen Probensammlern/-zuführern, die viele, wenn nicht alle, der zurzeit verwendeten Vorrichtungen erfordern. Des Weiteren reduziert die vorliegende Erfindung stark die Wahrscheinlichkeit von Probenkontaminierung oder Kreuzkontaminierung, denen bei der Verwendung von solchen sekundären Mitteln häufig begegnet wird. Eine zusätzliche einzigartige Eigenschaft des Probensammler/-zuführungsbestandteils der vorliegenden Vorrichtung ist die Fähigkeit, eine getrocknete Probe, die vermeintlich das Analyt enthält, ohne die Verwendung von sekundären Instrumentierungen oder Methoden zu lösen und zu sammeln.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf Ligand-Rezeptor-Assays und Vorrichtungen gerichtet, die einen chromatographischen, kapillar-vermittelten Transport für die qualitative oder quantitative Analyse von ausgewählten Analyten in Proben, wie in den Ansprüchen offenbart, verwenden. Das offenbarte Assay-System besteht aus einer Chromatographie-Vorrichtung, die einen Probensammel- und zuführungsbestandteil für die Zuführung der gelösten Probe direkt in den chromatographischen Fluss enthält. Das offenbarte Gerät erfüllt vielfältige, unbefriedigte Erfordernisse innerhalb der relevanten Gebiete und bietet die folgenden Vorteile, aber ist nicht darauf begrenzt: (1) alle erforderlichen Bestandteile des Assay-Systems sind in einer einzigen vereinheitlichten Vorrichtung enthalten, die zu einem Probensammler/-zuführer und einem Mittel zur Detektion auseinanderbaubar ist; (2) das Assay-System erlaubt das Sammeln der Probe und die nachfolgende Zuführung auf die chromatographischen Bestandteile in solch einer Weise, dass jeder potentielle Schwund der Probe als Folge von nicht vollständiger Probenzuführung minimiert wird; (3) das Assay-System erlaubt das Sammeln eines vergleichsweise kleinen Probenvolumens; (4) das Assay-System negiert das Erfordernis einer zusätzlichen externen Instrumentierung, die die Probe sammelt und der Assay-Vorrichtung zuführt; (5) das Assay- System minimiert die Wahrscheinlichkeit von Probenkontaminierung und/oder Kreuzkontaminierung, die durch die Verwendung von nicht integrierten, externen Probensammel- und/oder Zuführungsvorrichtungen verursacht werden; und (6) eine Ausführungsform des vorliegenden Assay-Systems offenbart die Verwendung von geschlossenen, zerbrechbaren, Reagenzbehältern für die Zuführung von verschiedenen Lösungen, die bei der Analyse der Probe verwendet werden.
Zurzeit ist das Sammeln der Testprobe und dessen folgende Zuführung in die Assay-Vorrichtung ein großes Problem, das mit Ligand-Rezeptor Assays verbunden ist. Viele, wenn nicht alle, der kommerziell erhältlichen Vorrichtungen erfordern das Sammeln vergleichsweise großer Probenvolumina, weil die Vorrichtungen bei der Zuführung der aufgenommenen Probe auf die chromatographischen Mittel ineffizient sind. Die vorliegende Vorrichtung verringert diese Schwierigkeiten jedoch stark über einen neuen Probenzuführer, der einen absorbierenden Docht-ähnlichen Bestandteil und einen Luftspalt verwendet, um die Probenzuführung auf die angeschlossenen chromatographischen Bestandteile, die in dem Gerät enthalten sind, zu ermöglichen. Daher kann die Probe, die vermeintlich den Liganden enthält, zu den chromatographischen Mitteln dadurch überführt werden, dass die Reagenzien durch den Probensammler/Zuführer fließen und gleichzeitig die Probe auf die chromatographischen Mittel waschen.
Beschreibung der Zeichnungen
Die vorliegende Erfindung kann unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen besser verstanden und ihre Vorteile durch den Durchschnittsfachmann gewürdigt werden, wobei:
1 eine Seitenansicht der Vorrichtung zeigt und den Probenzuführer, die chromatographischen Bestandteile und das Gehäuse für diese Vorrichtung detailliert wiedergibt.
2 eine Aufsicht auf das Gerät zeigt, die den Probenzuführer, die chromatographischen Bestandteile und das Gehäuse für diese Vorrichtung detailliert wiedergibt.
3 eine senkrechte Ansicht zeigt, die den Probenzuführer, die chromatographischen Bestandteile und eine Explosionsdarstellung des Gehäuses für diese Vorrichtung detailliert wiedergibt.
4 eine senkrechte Ansicht zeigt, die die Reagenzbehälter detailliert wiedergibt. Es können, abhängig von der exakten Art des Assays, der durchgeführt wird, einer oder mehrere von diesen Behältern mit der Vorrichtung verbunden sein.
5 eine senkrechte Ansicht mit der zusätzlichen Detektionsöffnung zeigt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt einen Ligand-Rezeptor Assay und eine Vorrichtung, wie in den Ansprüchen definiert, bereit, die einen kapillar-vermittelten chromatographischen Transport für die qualitative oder quantitative Analyse von ausgewählten Analyten in Proben verwendet. Die Vorrichtung umfasst ein Gehäuse, Mittel für das Sammeln und Zuführen einer Probe, die vermeintlich das Analyt von Interesse enthält, in die Assay-Vorrichtung und Mittel für die Detektion, wie z. B. durch direkte Visualisierung der Ergebnisse des Ligand-Rezeptor Assays, einschließt. Die Vorrichtung kann des Weiteren auch ein Gehäuse mit, in diesem Gehäuse enthaltenen, Mitteln für die Konjugierung einen eines Markers an einen spezifischen, zu detektierenden Liganden in der Probe (Markerübertragungspad), ein Mittel für die Absonderung von diesem spezifischen Ligand in einen begrenzten räumlichen Ort (Einfang-Zone), und Mittel, um Flüssigkeiten und jeden nicht abgesonderten, gelösten, darin enthaltenen Materialien zu erlauben, kapillar-vermitteltem Transport weg von dieser Einfang-Zone für die folgende Absorption innerhalb eines separaten Gebiets (Blotter-Pad) unterzogen zu werden, umfassen.
Die vorliegende Erfindung hat breite Anwendungsmöglichkeiten und kann in jeder Anzahl von Assays benutzt werden, wobei saugfähige Materialien verwendet werden, um den Fluss weg von einer anfänglichen räumlichen Stelle zu vermitteln, wobei dieses saugfähiges Material mit einem Medium in Kontakt gebracht wird, das vermeintlich entweder das zu bestimmende Analyt oder Reagenzien, die für die Analyse von diesem Analyt benötigt werden, enthält.
Bevor die detaillierte Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung fortgesetzt wird, wird eine Reihe von Begriffen definiert.
Definitionen
Ligand: Die Substanz oder Verbindung, die in dem Assay gemessen werden soll.
Ligand-Analog: Ein spezifisches Derivat des Ziel-Liganden, das optional entweder kovalent oder nicht-kovalent an andere chemische Gruppen (z. B. einen Marker) gekoppelt sein kann. Das Ligand-Analog kann z. B. verwendet werden, um mit dem analogen Ziel-Liganden um die Bindung an einen spezifischen Rezeptor zu konkurrieren (d. h. Kompetitions-Assay). Wo die Modifikation des Liganden Mittel bereitstellt, das Ligand-Analog an ein anderes Molekül zu binden, oder wo der Ligand eine Funktionalität besitzt, die für die direkte Bindung an ein anderes Molekül verwendet wird, wird auf den Liganden-Anteil des Konjugats als ein Ligand-Analog Bezug genommen.
Rezeptor: Ein Molekül, wie z. B. ein Antikörper oder Antikörperfragment, das die Fähigkeit besitzt, mit einem anderen Molekül in einer hochspezifischen polaren und räumlichen Art und Weise zu wechselwirken.
Antikörper: Ein Immunglobulin oder ein Derivat oder Fragment davon, das in der Lage ist, spezifisch an ein Antigen in einer Rezeptor-Ligand basierten Reaktion zu binden. Der Antikörper kann entweder polyklonal oder monoklonal sein oder aus einem Antikörperfragment bestehen. Die Herstellung von Antikörpern ist im Stand der Technik gut bekannt. Zum Beispiel können Antikörper durch die Immunisierung von einem Wirt, gefolgt von dem Abnehmen von Serum (polyklonal) oder durch Hybridomzelllinien-basierte Technologien (monoklonal), erzeugt werden.
Marker: Jedes Molekül, das an ein anderes Molekül oder festen Träger gebunden ist (über kovalente oder nicht-kovalente Mittel) und das aufgrund spezifischer Eigenschaften ausgewählt wird, die die Detektion der markierten Molekülen erlauben. Im Allgemeinen umfassen Marker die folgenden Typen, sind aber nicht darauf begrenzt: Fein verteiltes Metall und Metall-Derivate, Radioisotope, Katalyse-basierte Reaktanden, chromogene Substrate und Chromophore, fluoreszierende und chemolumineszente Moleküle und Phosphor. Die Verwendung von einem Marker erzeugt ein Signal, das durch Mittel wie die Detektion von elektromagnetischer Strahlung oder direkte Visualisierung detektiert und optional gemessen werden kann.
Saugfähiges Material: Ein poröses Material, das gegenüber dem Durchfluß eines flüssigen Mediums als Antwort auf die Kapillarkraft empfänglich ist. Solche Materialien können hydrophil sein oder sind in der Lage hydrophil gemacht zu werden und schließen natürliche polymere Substanzen (z. B. Zellulosematerialien), faserhaltige Papiere (z. B. Filter- und Chromatographiepapiere), und synthetische oder modifizierte natürlich vorkommende Polymere (z. B. Nitrozellulose, Zelluloseacetat, Polyacrylamid, quervernetzte Dextrose oder Agarose) ein, die entweder alleine oder in Kombination mit anderen Materialien eingesetzt werden. Das saugfähige Material kann polyfunktional sein, oder kann in der Lage sein, polyfunktional gemacht zu werden, z. B. um die kovalente Bindung von Rezeptoren, Antikörpern oder anderen Verbindungen, die als Bestandteile der spezifischen Assay-Methode wirken, zu erlauben.
Kapillärer Verbindungskontakt: Wenn zwei der Elemente der Vorrichtung in kapillarem Verbindungskontakt sind, sind die Elemente der Vorrichtung, wenn Flüssigkeit anwesend ist, in der Lage, die Flüssigkeit durch Kapillarwirkung von einem Element zu dem anderen zu überführen.
Die Vorrichtung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren und eine Vorrichtung für Ligand-Rezeptor Assays, wie in den Ansprüchen definiert, bereit, das einen kapillar-vermittelten, chromatographischen Transport für die qualitative oder quantitative Analyse eines ausgewählten Liganden, der vermeintlich in einer Testprobe enthalten ist, verwendet.
1–4 zeigen ein Gerät für die Detektion eines spezifischen Analyten in einer Probe, das zwei verschiedene Komponenten umfasst: das Probenehmer-(1)- und das Detektions-(2)-Element. Das Probenehmerelement (1) besteht aus einem absorbierenden Docht oder Schlauch (6), der Kapillarität besitzt, und einem Reagenzzuführungssystem (22). Der Docht oder der Schlauch (6) ist in einem Gehäuse (4) eingeschlossen, das aus einem starren oder semi-starren, nicht-wasser-durchlässigem Material hergestellt ist. Wenn für Element 6 ein Docht verwendet wird, besteht er aus einem saugfähigen Material. Wenn für Element 6 ein Schlauch verwendet wird, kann es ein kapillärer Schlauch aus Glas, Kunststoff oder anderen passenden Materialien sein.
Das Reagenzzuführungssystem (22) kann in dem Gehäuse (4), teilweise innerhalb und teilweise außerhalb des Gehäuses (4), oder vollständig außerhalb des Gehäuses (4) enthalten sein. Optional ist ein absorbierendes Reagenzpad (3) in dem Gehäuse (4) als ein Teil des Reagenzzuführungssystems (22) eingeschlossen. Eine Öffnung, die Reagenzzuführungsöffnung (5), kann optional in dem Gehäuse (4) des Probenehmerbestandteils bereitgestellt werden, um die Zugabe von verschiedenen Lösungen durch das Reagenzzuführungssystem (22), optional über das absorbierende Reagenzpad (3), zu ermöglichen.
Der Docht oder der Schlauch (6) ist über das absorbierende Reagenzpad (3) oder über irgendeine andere Reagenzquelle in kapillärem Verbindungskontakt mit dem Reagenzzuführungssystem (22). Eine Abgrenzungslinie (7) kann in dem absorbierenden Docht oder dem Schlauch (6) verwendet werden, um das Sammeln eines vorherbestimmten Volumens einer flüssigen Probe über Kapillarkräfte zu ermöglichen.
Das Detektionselement (2) besteht aus einem Gehäuse, das aus einem starren oder semi-starren, nicht flüssigkeitsdurchlässigem Material hergestellt ist, und stellt optional eine obere (8) und eine untere (9) Sektion bereit. Das Gehäuse dient sowohl dem Beinhalten als auch dem Positionieren verschiedener Bestandteile der Assay-Vorrichtung.
In dem Gehäuse enthalten ist ein Chromatographiebereich (24), der ein Chromatographiemedium (10), das aus mindestens einer Transit-Zone (20) und einer Einfangzone (13) besteht, verwendet. Die Transit-Zone (20) kann optional ein proximal angeordnetes Markerübertragungspad (11) einschließen. Wenn verwendet, enthält das Markerübertragungspad (11) ein markiertes spezifisches Ligand-Bindungsreagenz (L-SLBR) oder die Bestandteile und Mittel zum Zusammensetzen eines L-SLBRs. Wenn die Bestandteile und Mittel für das Zusammensetzen des L-SLBRS verwendet werden, müssen die Bestandteile in der Lage sein, zusammen zu passen und in Form eines L-SLBRs mit dem Analyt wechselzuwirken. Das L-SLBR oder seine Bestandteile sind in dem Markerübertragungspad (11) enthalten, während das absorbierende Material, aus dem das Pad besteht, im trocknen Zustand ist. Wenn Bestandteile und Mittel zum Zusammenbau eines L-SLBRs verwendet werden, wird das L-SLBR, vor oder während das Analyt im Verlauf des Assays durch das Übertragungspad (11) bewegt wird, zusammengesetzt. Das L-SLBR (entweder anfänglich vorhanden oder im Folgenden zusammengebaut) wird sowohl durch das Markerübertragungspad (11) (wenn verwendet) als auch durch das poröse Chromatographiemedium (10) frei beweglich, wenn es mit der Assayflüssigkeit kontaktiert wird. Alternativ oder zusätzlich können Marker und/oder Bestandteile und Mittel zum Zusammenbau des L-SLBRs über eine Detektionsöffnung (19) in dem Detektionselement (2), die optional an dem proximalen Ende der Transit-Zone (20) lokalisiert ist, zugegeben werden. Das so zugegebene oder zusammengebaute L-SLBR dringt in die Transit-Zone ein und wird sowohl durch das Markerübertragungspad (11) (wenn verwendet) als auch das poröse Chromatographiemedium (10) frei beweglich, wenn es mit einer Lösung in Kontakt gebracht wird.
Die Detektionsöffnung (19) kann ebenfalls für die Zugabe von Puffern, Reagenzien und/oder anderen Reaktionsbestandteilen, die in dem Assay verwendet werden sollen, verwendet werden. Zum Beispiel kann ein Reagenz, das bei der Visualisierung des L-SLBRs verwendbar ist, durch die Detektionsöffnung zugegeben werden; in gleicher Weise kann durch die Detektionsöffnung (19) ein Puffer zum Lösen des L-SLBRs, das in dem Markerübertragungspad (11) gefangen ist, zugegeben werden.
Das Chromatographiemedium (10) kann optional in kapillären Verbindungskontakt mit einem distal lokalisierten Blotter-Pad (12) sein. Das Chromatographiemedium (10) umfasst eine räumlich-eindeutige Stelle, die als die Einfangzone (13) definiert wird, wobei diese Zone sich unterhalb der Transitzone (20) und des optionalen Markerübertragungspads (11) und/oder des optionalen Detektionszugangs (19) und oberhalb des Blotter-Pads (12) befindet. Ein Reagenzunlösliches, nicht markiertes, spezifisches Ligand-bindendes Reagenz (SLBR) wird, wenn es verwendet wird, auf dem Markerübertragungspad (11) immobilisiert. Das L-SLBR und das SLBR können, abhängig von der Art des Assays, der durchgeführt werden soll, dieselbe oder verschiedene reaktive Stellen haben.
In einer möglichen Ausführungsform wird der Assay der Probe, die vermeintlich den Ligand von Interesse enthält, durch eine Trennung des Probenehmer- (1) und Detektions-(2)elements voneinander initiiert. Der distale Endteil (16) des absorbierenden Dochts oder des Schlauches (6) wird als nächstes in Kontakt mit der ausgewählten flüssigen Probe (z. B. ein Blutstropfen) gebracht. Die Probe wird über Kapillarkräfte in den absorbierenden Docht oder die Röhre (6) gezogen, bis die gewünschte Menge der Probe gesammelt worden ist (z. B. bis der Pegel der gesammelten flüssigen Probe die Abgrenzungslinie (7) erreicht hat).
Die Assay-Vorrichtung wird dann durch das Einsetzen des Probenehmerelementes (1) in das Detektionselement (2) wieder zusammengebaut, so dass der absorbierende Docht oder Schlauch (6) in kapillärem Verbindungskontakt mit dem Chromatographiemedium (10), das an dem proximalen Ende des Markertransferpads (11) vorhanden ist, platziert wird. Dann wird eine Lösung (z. B. Puffer) durch die Reagenzzuführungsöffnung (5) zugegeben, so dass das absorbierende Reagenzpad (3) gesättigt wird. Die Lösung wird durch seine inhärente Kapillarität in den absorbierenden Docht oder Schlauch (6) gezogen, was die Bewegung der Testprobe durch den absorbierenden Docht oder Schlauch (6) und in das Markerübertragungspad (11) verursacht.
Ein Luftspalt (14) wird verwendet, um das absorbierende Reagenzpad (3) von dem Markerübertragungspad (11) zu trennen, wobei der Luftspalt (14) durch den absorbierenden Docht oder Schlauch (6) bei dem Wiederzusammenbau der Assay-Vorrichtung überbrückt wird.
Die Verwendung des Luftspalts (14) maximiert durch das Erzwingen eines kapillär-vermittelten Transfers der Flüssigkeit von dem absorbierenden Reagenzpad (3) durch den absorbierenden Docht oder die Röhre (6), was gleichzeitig die Probenübertragung ermöglicht, die Übertragung der flüssigen Probe, die in dem absorbierenden Docht oder der Röhre (6) enthalten ist, in das Markerübertragungspad (11).
In dieser Ausführungsform verursacht die Bewegung der Testprobe und des flüssigen Reagenz in dem Markerübertragungspad (11) die Auflösung des L-SLBRs und ermöglicht so die Bildung eines Komplexes zwischen dieser markierten Gruppe und jedem spezifischen Liganden, der vermeintlich in der Testprobe enthalten ist. Der Ligand/L-SLBR-Komplex interagiert im folgenden mit dem immobilisierten, nicht markierten SLBR, das in der Einfangzone (13) lokalisiert ist, und wird dadurch abgesondert. Abhängig von der Art des gewählten Markers, kann die Detektion dieses abgesonderten Komplexes durch direkte Visualisierung über die transparente Beobachtungsöffnung (15) erfolgen, die in dem oberen Teil (8) des Detektionselementes (2) über der Einfangzone (13) lokalisiert ist, um das Sichtbarmachen der Einfangzone (13) zu erlauben.
Jedes aufgelöste, nicht-komplexierte und nicht-abgesonderte Material, das innerhalb der Einfangzone gefunden wird, kann durch einen kontinuierlichen, kapillar-basierten Fluss der Lösung (z. B. Puffer), der auf das absorbierende Reagenzpad (3) angewendet wird, und der diese nicht-abgesonderten Bestandteile an der Einfangzone (13) vorbeiwäscht, minimiert werden. Im Allgemeinen wird dieser Fluss fortgesetzt, bis entweder das absorbierende Reagenzpad geleert ist oder das Blotter-Pad (12) gesättigt ist.
In einer anderen Ausführungsform, die in 4 dargestellt ist, beinhaltet das Gerät einen oder mehrere in sich geschlossene, zerbrechbare Reagenzbehälter (17). Der Reagenzbehälter (17) umschließt eine Lösung, die, wenn sie freigesetzt wird, in und/oder durch das absorbierende Reagenzpad (3) fließt. Diese Lösung kann optional eine Reihe von Substanzen enthalten, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, einen Liganden, ein Ligand-Analog, ein spezifisches Ligand-Bindungsreagenz, ein Signal-erzeugendes Reagenz (z. B. ein Substrat für einen Enzym katalysierten Marker), oder jedes andere ergänzende Reagenz. Der Behälter kann in das Gehäuse der Vorrichtung eingebaut sein, getrennt davon sein oder, wo mehr als ein in sich geschlossener Reagenzbehälter verwendet wird, beides.
Das Gerät kann optional eine Reagenzzuführungsöffnung (5) umfassen, so dass mindestens einer der zerbrechbaren Behälter so angeordnet werden kann, dass auf das Zerbrechen des Behälters (17) hin ein Flüssigkeitsfluss durch die Reagenzzuführungsöffnung (5) erlaubt wird. Auf das Zerbrechen des Behälters (17) hin, wird es der eingeschlossenen Lösung möglich, kapillar-vermittelt durch das optionale absorbierende Reagenzpad (3) und den absorbierenden Docht oder Schlauch (6) transportiert zu werden.
Die Reagenzbehälter (17) selbst sind vorzugsweise vor dem Zerbrechen wasserundurchlässig und können starr, halb-starr oder flexibel sein. Die darin enthaltene Lösung ist in der Lage, durch Zerdrücken, Aufschneiden, Punktieren, Schmelzen oder anderweitiges Zerbrechen des Behälters (17) oder des Siegels zwischen dem Behälter und der Assay-Vorrichtung, in die Assay-Vorrichtung freigesetzt zu werden. Materialien, die bei der Herstellung des Reagenzbehälters verwendet werden können Glas, Polymere, faserverstärkte Papiere, Plastik, Wachse und andere Materialien, die die zuvor diskutierten strukturellen Kriterien erfüllen, einschließen, aber sind nicht darauf begrenzt. Die Behälterform kann jede Form sein, die räumlich und sterisch mit dem vorliegenden Gerät kompatibel ist (z. B. sphärisch, rechteckig, elliptisch usw.). Das Gesamtvolumen des Reagenzbehälters (17) hängt von dem spezifischen flüssigen Reagenz, das darin enthalten ist, der Funktion des gegebenen Reagenz in dem Assay, der Gesamtgröße der Assay-Vorrichtung, der Gesamtabsorptionskapazität des saugfähigen Materials, das in der Assay-Vorrichtung verwendet wird, der Gesamtzahl von verwendeten Reagenzbehältern und vergleichbaren Beschränkungen ab.
Das Gehäuse, das entweder oder sowohl das Probenehmer- (1) als auch das Detektions- (2) Element der Assay-Vorrichtung umfasst, kann aus verschiedenen feuchtigkeitsundurchlässigen Materialien hergestellt werden, die thermo- und vakuumgeformtes Plastik, faserverstärkte Papierprodukte, Polymere und andere angemessene Materialien einschließen, aber nicht darauf begrenzt sind. Das Material, das zur Herstellung des Gehäuses verwendet wird, wirkt vorzugsweise nicht störend auf die Probe, das Probenmedium, oder irgendein Reagenz, das in der Assay-Prozedur verwendet wird, ein. Obwohl bei der Herstellung der Beobachtungsöffnung (15) ein transparentes Material verwendet werden kann, schließen alternative Ausführungsformen keine Abdeckung der Beobachtungsöffnung (15) ein, oder ein großer Teil des oberen Teils (8) des Detektionselementes (2) wird aus transparentem Material hergestellt.
Im Anschluss an das Einsetzen der verschiedenen chromatographischen Materialien während des Aufbaus der Vorrichtung können die oberen (8) und unteren (9) Teile des Detektionselemetes (2) mittels Ultraschallverschweißung, Klebstoffe und anderer passender Verfahren fest zusammengefügt werden. Alternativ können die Probenehmer- (1) und/oder Detektions- (2) Elemente jeweils in einem einzigen, einheitlichem Stück hergestellt werden, das anschließend benutzt wird, um die verschiedenen internen Bestandteile einzuschließen.
Sowohl das absorbierende Reagenzpad (3) als auch das Blotter-Pad (12) können aus jedem saugfähigen, porösen oder fibrösen Material hergestellt werden, das in der Lage ist, eine Flüssigkeit zu absorbieren. Beispiele schließen poröse Plastikpolymermaterialien, die Polypropylen, hochmolekulares Polyethylen, Polyvinylidenfluorid, Acrylonitril und Polyterafluoroethylen einschließen, aber nicht darauf begrenzt sind; zellulosehaltige Materialien (z. B. Nitrozellulose); oder schwere, hochabsorbierende Chromatographiepapiere ein. In der Herstellung des Blotter-Pads (12) ist im Allgemeinen aufgrund seines hohen Grades an Absorptionsvermögen und den niedrigen Kosten die Verwendung eines Chromatographiepapiers vorzuziehen. Zusätzlich ist es in Bezug auf das absorbierende Reagenzpad (3) bevorzugt, dass das gewählte Material einen gewissen Grad an struktureller Integrität behält, wenn es gesättigt ist. Unabhängig von dem gewählten Material kann es vorteilhaft sein, das Element während der Herstellung mit einem oberflächenaktiven Agenz vorzubehandeln, um so jede inhärente Hydrophobiezität zu verringern und gleichzeitig seine Fähigkeit, flüssige Proben in einer effizienten Art und Weise zu absorbieren und wieder freizusetzen zu erhöhen.
Es sollte ebenfalls angemerkt werden, dass das proximale Ende (16) des absorbierenden Docht- oder Schlauch-(6)-Elementes mit einem inerten Farbstoff (z. B. Blue Dextran) gesättigt sein kann, um das Sichtbarmachung des chromatographischen Flusses von farblosen Lösungen zu ermöglichen.
Chromatographische Medien (10), die in der vorliegenden Vorrichtung verwendet werden können, schließen solche chromatographischen Substratmaterialien ein, die die Kapillarität und die Kapazität für den chromatographischen Lösungsmitteltransport von nicht immobilisierten, flüssigkeitslöslichen Reagenzien und Probenbestandteilen besitzen. Obwohl eine große Auswahl von chromatographischen Materialien die für Papierchromatographie verwendet werden, für die Verwendung in dieser Erfindung geeignet sind, wird aufgrund der merklichen Erhöhung in der Geschwindigkeit und Auflösung, die diese Materialien bereitstellen im allgemeinen die Verwendung von mikroporösen oder mikrogranularen Dünnschichtchromatographiesubstraten bevorzugt.
Das chromatographische Material ist vorzugsweise inert sowie gegenüber jedem der Probenbestandteile, Reagenzien oder Reaktionsprodukte physikalisch und chemisch unreaktiv. Vorzugsweise könnte in der offenbarten Vorrichtung mikroporöses Mikrozellulosematerial mit einem hohen Grad an Wirksamkeit verwendet werden. Nitrozellulose hat den zusätzlichen Vorteil, dass das spezifische Ligand-bindende Reagenz (z. B. Antikörper), das in der Einfangzone anwesend ist, ohne vorige chemische Behandlung immobilisiert werden könnte.
Im Gegensatz dazu kann, wenn das chromatographische Material aus einem Chromatographiepapier besteht, die Immobilisierung des spezifischen Ligand-bindenden Reagenz z. B. über chemische Kopplungsmethoden durchgeführt werden. Allgemein verwendete Reagenzien schließen Cyanogenbromid (CnBr), Carbonyldiimidazol oder Tresylchlorid ein, aber sind nicht darauf begrenzt. Zusätzlich können in der Herstellung der vorliegenden Vorrichtung ebenfalls Reagenzien, die in der Lage sind, nicht-spezifische Bindungsstellen auf dem chromatographischen Medium, die den chromatographischen Lösungsmitteltransport der flüssigen Probe oder Reagenzien verhindern könnten, zu blockieren, verwendet werden. Allgemein verwendete Reagenzien schließen, aber sind nicht darauf begrenzt, Rinderserumalbumin (BSA), Gelantine und Casein ein, die vorzugsweise aufgrund ihrer Eigenschaften nicht mit den Probenbestandteilen, Reagenzien oder Reaktionsprodukten zu interferieren oder zu reagieren ausgewählt werden.
SLBR, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind für den Durchschnittsfachmann einfach zu identifizieren und schließen diejenigen Materialien ein, die Mitglieder eines „spezifischen Bindungspaares" sind (d. h. ein Ligand und ein Rezeptor). Der Ligand und der Rezeptor sind darin verwandt, dass der Rezeptor spezifisch an den Liganden bindet und die Eigenschaft besitzt, den Ligand von anderen Materialien, die ähnliche Eigenschaften haben, zu unterscheiden. Die Methoden und Vorrichtungen, die durch die vorliegende Erfindung offenbart werden, sind besonders bei der Anwendung von immunologischen Assaytechniken verwendbar, in denen die spezifischen Ligand-bindenden Reagenzien aus Antikörpern, Antikörperfragmenten oder synthetischen Antikörpern oder Antigenen bestehen. Die vorliegende Vorrichtung verwendet vorzugsweise ein spezifisches Bindungspaar, das aus dem gewünschten Analyt und einem Antikörper besteht, der für dieses Analyt spezifisch ist (d. h. eine Affinität daran. zu binden besitzt).
Der „Marker", der an dem L-SLBR verwendet wird, das in der vorliegenden Erfindung offenbart wird, kann aus den folgenden Kategorien ausgewählt werden, ist aber nicht darauf begrenzt: Chromogene/Fluoreszierer, partikuläre Metalle oder ihre Derivate, Bestandteile von katalysierten Reaktionen, chemolumineszierende Verbindungen und radioaktive Isotopenmarker.
Chromogene schließen diejenigen Verbindungen ein, die Licht in einem bestimmten Bereich absorbieren, so dass eine spezifische Farbe sichtbar beobachtet werden kann (d. h. Farbstoffe) oder emittieren Licht, wenn sie mit elektromagnetischer Strahlung einer spezifischen Wellenlänge oder eines Wellenlängenbereiches bestrahlt werden (d. h. fluoreszierende Verbindungen). Veranschaulichende Farbstoffarten schließen Chinolin, Acridin, Alizarin, Cyanin und Antrachinonfarbstoffe ein, aber sind nicht darauf begrenzt. Die funktionellen Gruppen fluoreszierender Verbindungen schließen Porphyrine, 2-Aminonaphthalin, p,p'-Diaminobenzophenonimine, 1,2-Benzophenazin und quaternäre Phenantridinsalze ein, aber sind nicht darauf begrenzt. Durch das Bestrahlen eines Fluoreszierers mit Licht einer bestimmten Wellenlänge kann man eine Vielzahl von Emissionen erhalten, die so mehrere messbare Ereignisse liefern.
Fein verteilte Metallsol-basierte Marker können durch die direkte oder indirekte Kopplung des gewünschten Reaktionsbestandteils (z. B. ein Antikörper) mit Partikeln einer wässrigen Dispersion eines Metalls, Metallverbindung oder Polymernuklei, beschichtet mit einem Metall oder Metallverbindung, die eine Partikelgröße von mindestens 5 nm haben, erhalten werden. Der Ausdruck „Kopplung" wird in dem relevanten Gebiet verstanden, jede Art von chemischer oder physikalischer Bindung zu umfassen, und schließt kovalente und Wasserstoffbrückenbindung, polare Anziehung, Absorption und Adsorption ein. Die Metalle, die in dieser Markierungsmethode verwendet werden, schließen Gold, Platin, Silber, Kupfer und Eisen ein, aber sind nicht darauf begrenzt. Ein Metall-Sol ist im Allgemeinen als eine Suspension von Metall oder Metallderivatpartikeln definiert, die aufgrund ihres extrem kleinen Durchmessers allein aufgrund der Auswirkung der Brownschen Molekularbewegung in Suspension bleiben. Die partikulären Metall-Sols, die als Marker verwendet werden können, können in einer Reihe von Wegen, die für sich selbst bekannt sind, hergestellt werden. Zum Beispiel wurde die Herstellung eines Gold-Sols beschrieben in (G. Frens, 241 Natural Physical Science 20 (1973)).
Katalysierte Reaktionen können entweder Enzym- oder Nicht-Enzym katalysiert sein. Überlegungen, die in Betracht gezogen werden müssen, wenn ein Enzymkatalyse-basierter Marker verwendet wird, schließen Enzymstabilität, Turnover-Rate, Sensitivität der Reaktion gegenüber Umgebungsfaktoren, die Art des Substrates und der Produkte und die Auswirkungen der Konjugierung auf die katalytischen Eigenschaften des Enzyms ein, aber sind nicht darauf begrenzt. Die Methoden, die an der enzymatischen Markierung beteiligt sind, sind in dem relevanten Gebiet gut bekannt.
Eine alternative Form der Markierung ist die Verwendung von chemolumineszenten Verbindungen. Der Ursprung der Chemolumineszenz umfasst eine Verbindung, die als Folge einer chemischen Reaktion elektronisch angeregt wird und danach entweder Licht im sichtbaren Bereich emittiert oder Energie auf eine zweite Fluoreszenzakzeptor-Verbindung überträgt. Diese schließen die 2,3-Dihydro-1,4-Phtalazindion-Familie (Luminol), die 2,4,5-Triphenylimidazol-Familie (Lophin) und die Para-Dimethylaminooxalatester-Familie (Luciferase) ein, aber sind nicht darauf begrenzt.
Radioisotopenmarker werden in immunometrischen Assays weithin verwendet. Der Radiomarker kann aus den folgenden radioaktiven Isotopen ausgewählt werden, aber ist nicht darauf begrenzt: ³H, ¹⁴C, ³²P, ¹²⁵I und ¹³¹I. Methoden zum Markieren von Substanzen mit radioaktiven Markern sind in dem relevanten Gebiet gut bekannt.
In der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung von Metall-Sol-basierten Markern bevorzugt. Zum Beispiel kann ein Gold-Sol-Marker verwendet werden, der an das spezifische Liganden-bindende Reagenz (z. B. ein Antikörper) konjugiert ist. Dieser Marker erlaubt das Sichtbarmachen des Endpunktes der Reaktion, ohne irgendeine zusätzliche Instrumentierung zu erfordern.
Die vorliegende Erfindung befriedigt mehrere unbefriedigte Bedürfnisse in dem Feld von Ligand-Rezeptor Assays. Die neue Ausführung des vereinheitlichten Probenehmerelementes ermöglicht sowohl die anfängliche Sammlung als auch den folgenden Assay der Probe, die vermeintlich den Liganden enthält. Die Verwendung eines neuen absorbierenden Docht-/Luftspaltmerkmal in dem Probenehmerbestandteil minimiert dadurch, dass es kein zweites externes Mittel für die Probensammlung (z. B. über eine Spritze, Pipette, kapilläre Röhre etc.) erfordert, nicht nur das Potential für die Kontaminierung und Kreuzkontaminierung der Probe, sondern maximiert ebenfalls die Übertragung der Probe in die Assay-Vorrichtung, und minimiert dadurch das erforderliche Probenvolumen.
Die folgenden spezifischen Ausführungsformen sind beispielhafte Beschreibungen der Verwendung der offenbarten Erfindung für den Zweck der immunometrischen Bestimmung eines spezifischen Analyts, das in einer Probe vorhanden ist. Es ist nicht beabsichtigt, dass diese Beispiele den Bereich der vorliegenden Erfindung in irgendeiner Art und Weise begrenzen, sondern sie dienen stattdessen nur dazu, einige der vielen möglichen Ausführungsformen zu veranschaulichen.
Beispiel 1
In Bezug auf 1–3 wird der Assay durch eine Trennung des Probenehmer- (1) und Detektions- (2) Elementes voneinander begonnen. Das distale Ende (16) des absorbierenden Dochtes (6) wird als nächstes in Kontakt mit der Probe, einem Blutstropfen, gebracht. Die Probe wird dann über kapillar-vermittelte Überführung in den absorbierenden Docht (6) gezogen, bis zu dem Zeitpunkt, wo der Flüssigkeitspegel die Abgrenzungslinie (7) erreicht hat, dadurch werden Mittel für das Sammeln eines vorherbestimmten Probenvolumens bereitgestellt. Die Assay-Vorrichtung wird dann durch das Einsetzen des Probenehmer-Bestandteils (1) in den Detektionsbestandteil (2) wieder zusammengebaut, so dass der absorbierende Docht (6) in kapillären Verbindungskontakt mit dem Markerübertragungspad (11) angeordnet wird. Dann wird eine Lösung zu der Reagenzzuführungsöffnung (5) gegeben, so dass das absorbierende Reagenzpad (3) gesättigt ist. Die Lösung wird danach durch seine inhärente Kapillarität in den absorbierenden Docht (6) gezogen und verursacht dadurch die Bewegung der Probe durch den absorbierenden Docht (6) in das Markerübertragungspad (11). Das Markerübertragungspad (11) enthält einen partikulären Metallmarker, der an einen Antikörper konjugiert ist, wobei der Antikörper spezifisch für den Liganden ist, der vermeintlich in der Testprobe enthalten ist. Das partikuläre Metallmarker/Antikörperkonjugat („markierter Antikörper") ist in einer getrockneten, nicht immobilisierten Form in dem Markerübertragungspad (11) zu finden. Ein Luftspalt (14) wird verwendet, um das absorbierenden Reagenzpad (3) von dem Markerübertragungspad (11) zu trennen, und wird durch den absorbierenden Docht (6) beim Wiederzusammenbau der Assay-Vorrichtung überbrückt. Die gleichzeitige Bewegung der Testprobe und der Lösung in das Markerübertragungspad (11) verursacht das Lösen des markierten Antikörpers und ermöglicht die Bildung eines Komplexes zwischen dem markierten Antikörper und jedem spezifischen Liganden, der vermeintlich in der Testprobe enthalten ist. Der Ligand/markierte Antikörperkomplex wechselwirkt anschließend mit und wird abgesondert durch den immobilisierten, nicht markierten Antikörper, der sich in der Einfangzone (13) befindet. Die Detektion dieses abgesonderten Komplexes wird über eine transparente Beobachtungsöffnung (15), die sich in der oberen Sektion (8) des Detektionselementes (2) und über der Einfangzone (13) befindet, sichtbar gemacht. Jedes flüssigkeitslösliche, nicht komplexierte Material, das in der Einfangzone (13) gefunden wird, wird durch einen kontinuierlichen, kapillar-basierten Fluss der Lösung, die anfänglich auf das absorbierende Reagenzpad (3) gegeben wird, minimiert. Dieser Fluss setzt sich fort, bis entweder das absorbierende Reagenzpad (3) von Lösung entleert ist oder das Blotter-Pad (12) gesättigt ist.
Beispiel 2
In Bezug auf 1–3 wird die Vorrichtung wie in Beispiel 1 verwendet, mit der Ausnahme, dass der markierte Antikörper sich statt an das Markertransferpad (11) in dem distalen Endteil (16) des absorbierenden Dochtes (6) befindet. Diese spezifische Ausführungsform erlaubt die Vorinkubation der Probe mit dem markierten Antikörper vor sowohl dem Wiederzusammenbau des Probenehmer- (1) und Detektions- (2) Bestandteils als auch der folgenden Zugabe einer Lösung (z. B. Puffer) zu der Reagenzzuführungsöffnung (5). Diese spezifische Ausführungsform stellt sicher, dass der markierte Antikörper aufgrund des Auflösens des markierten Antikörpers, als Folge der Zugabe einer Lösung (z. B. Puffer) zu der Reagenzanwendungsöffnung (5), die Testprobe durch den Prozess der Diffusion in schrittweise verringernden Konzentrationen erreicht. Der Zeitpunkt zwischen der anfänglichen Abnahme der Testprobe und dem folgenden Wiederzusammenbau/Lösungszugabe kann variiert werden, um die Anpassung der Assay-Sensitivität zu erlauben.
Beispiel 3
In Bezug auf 1–3 wird die Vorrichtung wie in Beispiel 1 verwendet, mit der Ausnahme dass der markierte Antikörper sich statt an dem Markertransferpad (11) an dem proximalen Endteil (18) des absorbierenden Dochtes (6) befindet. Diese spezifische Ausführungsform stellt sicher, dass der markierte Antikörper, aufgrund der Solubilisierung des markierten Antikörpers, als Folge der Zugabe einer Lösung (z. B. Puffer) zu der Reagenzanwendungsöffnung (5), durch den Prozess der Diffusion die Testprobe, im Gegensatz zu dem vorigen Beispiel (Beispiel 2), wo der markierte Antikörper die Testprobe in schrittweise sinkenden Konzentrationen erreicht, in schrittweise ansteigenden Konzentrationen erreicht. Die Erfordernisse sich unterscheidender Reaktionskinetiken können eine Ausführungsform vor der anderen bevorzugen.
Beispiel 4
In Bezug auf 1–3 wird die Vorrichtung wie in Beispiel 1 verwendet, mit dem zusätzlichen Schritt des Platzierens einer chromogenen Verbindung (z. B. einem flüssigkeitslöslichen Farbstoff) an dem distalen Endteil (16) des absorbierenden Dochtes (6). Diese spezifische Ausführungsform erlaubt die direkte Visualisierung des kapillär-vermittelten Übertragens der Testprobe durch das Chromatographiemedium (10), und ermöglicht dadurch das Beobachten von schwer zu detektierenden Proben (z. B. farblose wässrige Proben oder verschiedene physiologische Flüssigkeiten).
Beispiel 5
In Bezug auf 1–3 wird die Vorrichtung wie in Beispiel 1 verwendet, mit der Ausnahme, dass gefolgt von dem anfänglichen Auseinanderbau der Assay-Vorrichtung durch das Entfernen des Probenehmer-Bestandteils (1) von dem Detektionsbestandteil (2) und vor der eigentlichen Abnahme der Testprobe, eine Lösung (z. B. Puffer) zu der Reagenzzuführungsöffnung (5) gegeben wird. Das verursacht die Sättigung des absorbierenden Docht- (6) Bestandteils und erlaubt das Lösen und die kapillär-vermittelte Übertragung einer getrockneten, oder halbgetrockneten Probe auf das distalen Endteil (16) des absorbierenden Dochtes (6).
Beispiel 6
Mit Bezug auf 1–3 wird die Vorrichtung wie in Beispiel 1 verwendet, mit der Ausnahme, dass nach der eigentlichen Abnahme der Testprobe eine Lösung mit einem zugesetzten Reagenz, wie z. B. einem Liganden oder einem Ligand-Analog zu der Reagenzzuführungsöffnung (5) gegeben wird. Das verursacht die Sättigung des absorbierenden Docht- (6) Bestandteils und erlaubt das Lösen und die kapillär-vermittelte Übertragung einer getrockneten oder halbgetrockneten Probe auf den distalen Endteil (16) des absorbierenden Dochtes (6).
Beispiel 7
Mit Bezug auf die 1–4 wird die Vorrichtung in so einer Weise verwendet, dass es einen kompetitiven Immuno-Assay bereitstellt. Der kompetitive Assay kann von seiner Art homogen oder heterogen sein. In einem homogenen Assay werden alle Reaktanden, die an der Konkurrenzreaktion teilnehmen, zusammengemischt und die Konzentration des Liganden wird durch seinen Effekt auf das Ausmaß der Bindung zwischen dem Rezeptor und dem markierten Ligand-Analog bestimmt. Das Signal, das beobachtet wird, ist eine direkte Funktion dieser Bindung und kann zu der Gesamtkonzentration des anwesenden Liganden der Testprobe in Beziehung gesetzt werden.
In einem heterogenen kompetitiven Ligand-Rezeptor Assay ist der gebundene markierte Ligand oder Rezeptor von dem freien markierten Ligand oder Rezeptor getrennt. Die Konzentration der gebundenen oder freien Fraktion wird anschließend gemessen.
In diesem Beispiel kann das Ligand-Analog durch das Verwenden einer externen Zuführungsvorrichtung zu dem Gerät durch direkte Zuführung über die Reagenzzuführungsöffnung (5) zugegeben werden, oder alternativ kann es in den Reagenzbehältern (17) enthalten sein, die wenn sie zerbrochen werden, das Ligand-Analog in die Vorrichtung freisetzen. Das Ligand-Analog kann entweder vor oder nach der eigentlichen Entnahme der Testprobe in der Vorrichtung freigesetzt werden. Alternativ kann es in dem Docht oder dem Schlauch (6) enthalten sein.

Claims

Eine Ligand-Rezeptor Assay-Vorrichtung, die umfasst: (a) ein Gehäuse, wobei das Gehäuse in mindestens zwei Bauteile zerlegt werden kann und ferner zu einem Bauteil zusammenbaubar ist; (b) einen Probensammler, der einen absorbierenden Docht oder Schlauch zum Sammeln und Fördern einer Probe umfasst, wobei der Probensammler im Gehäuse enthalten ist; (c) einen Chromatographiebereich, der ein Chromatographiemedium mit einer Transit-Zone und einer Einfang-Zone zum Detektieren einer Probe umfasst, wobei der Probensammler über die Transit-Zone mit der Einfang-Zone verbunden ist; und (d) ein Reagenz-Beförderungssystem zum Befördern eines flüssigen Reagenzes oberhalb des Probensammlers, das ein absorbierendes Reagenzpad umfasst, wobei das absorbierende Reagenzpad in kapillar-kommunizierendem Kontakt mit dem Probensammler steht und wobei das Reagenz-Beförderungssystem so positioniert ist, dass das flüssige Reagenz durch den Probensammler und in den Chromatographiebereich fließt.
Die Vorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei das Gehäuse ein oberes und ein unteres Bauteil umfasst.
Die Vorrichtung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der absorbierende Docht oder Schlauch aus einem saugfähigen Material besteht.
Die Vorrichtung gemäß Anspruch 3, wobei das saugfähige Material aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus natürlichen polymeren Substanzen, faserhaltigen Papieren und synthetischen oder modifizierten natürlich vorkommenden Polymeren besteht oder aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Filterpapier, Chromatographiepapier, Nitrozellulose, Zelluloseacetat, Polyacrylamid, quervernetzter Dextrose und Agarose besteht.
Die Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der absorbierende Docht oder Schlauch mindestens einen Volumenmesser nahe dem distalen Ende umfasst, um das Probenvolumen anzugeben.
Die Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Probensammler in einem Probennehmerelement angeordnet ist und die Transit-Zone in einem Detektionselement angeordnet ist.
Die Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das distale Ende des Probensammlers in kapillar-kommunizierendem Kontakt mit der Transit-Zone steht, wenn die Vorrichtung zusammengebaut ist.
Die Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Transit-Zone saugfähiges Material beinhaltet.
Die Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Transit-Zone ein Marker-Übertragungspad umfasst.
Die Vorrichtung gemäß Anspruch 9, wobei das Marker-Übertragungspad am proximalen Ende der Transit-Zone angeordnet ist.
Die Vorrichtung gemäß Anspruch 9 oder 10, wobei der Probensammler so positioniert ist, dass ein kapillar-kommunizierender Kontakt mit dem Marker-Übertragungspad ermöglicht wird, wenn die Vorrichtung zusammengebaut ist.
Die Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei das Marker-Übertragungspad markierte Komponenten enthält, die ausgewählt werden aus (a) einem markierten, spezifischen, Liganden-bindenden Reagenz und (b) Bestandteilen und Mitteln zum Herstellen eines markierten, spezifischen, Liganden-bindenden Reagenzes innerhalb des Marker-Übertragungspads.
Die Vorrichtung gemäß Anspruch 12, wobei die Mittel zum Herstellen eines markierten, spezifischen, Liganden-bindenden Reagenzes eine Detektionsöffnung benachbart zum Marker-Übertragungspad beinhaltet, die so positioniert ist, dass die Zugabe von Bestandteilen, die für das Aufbauen des markierten, spezifischen, Liganden-bindenden Reagenzes erforderlich sind, ermöglicht wird.
Die Vorrichtung gemäß Anspruch 12 oder 13, wobei die markierten Komponenten auf dem Marker-Übertragungspad verteilt sind, so dass das markierte, spezifische, Liganden-bindende Reagenz nach dem Flüssigkeitskontakt zwischen dem Probensammler und dem Marker-Übertragungspad beweglich wird.
Die Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei die markierten Komponenten mit einem oder mehreren Markern markiert sind, die ausgewählt werden aus der Gruppe, die aus Radioisotopen, Metallteilchen, einem Farbstoff, einem oder mehreren Bestandteilen einer katalysierten Reaktion und einer chemilumineszierenden Verbindung besteht.
Die Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei der Probensammler markierte Komponenten umfasst, die ausgewählt werden aus (a) einem markierten, spezifischen, Liganden-bindenden Reagenz und (b) Bestandteilen und Mitteln zum Herstellen eines markierten, spezifischen, Liganden-bindenden Reagenzes innerhalb des Probensammlers.
Vorrichtung gemäß Anspruch 16, wobei die markierten Komponenten am oder nahe dem proximalen Ende des Probensammlers vorhanden sind oder am oder nahe dem distalen Ende des Probensammlers vorhanden sind.
Die Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei das Reagenz-Beförderungssystem eine Reagenz-Zuführungsöffnung umfasst.
Die Vorrichtung gemäß Anspruch 18, wobei die Reagenz-Zuführungsöffnung so positioniert ist, damit das Einbringen eines flüssigen Reagenzes am distalen Ende des Probensammlers ermöglicht wird.
Die Vorrichtung gemäß Anspruch 19, wobei das flüssige Reagenz eine Substanz enthält, die ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus einem Liganden, einem Ligandanaloga, einem spezifischen, Liganden-bindenden Reagenz, einem Reagenz zur Signalerzeugung und einem Zusatzreagenz besteht.
Die Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei das Reagenz-Beförderungssystem mindestens einen zerbrechbaren Reagenzbehälter umfasst.
Die Vorrichtung gemäß Anspruch 21, wobei mindestens ein zerbrechlicher Reagenzbehälter so positioniert ist, damit das Einbringen eines flüssigen Reagenzes am oder nahe dem distalen Ende des Probensammlers ermöglicht wird.
Die Vorrichtung gemäß Anspruch 21 oder 22, wobei das absorbierende Reagenzpad zwischen mindestens einem zerbrechbaren Reagenzbehälter und dem Probensammler positioniert ist.
Die Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23, die ferner eine Detektionsöffnung umfasst, die nahe dem proximalen Ende des Chromatographiebereiches positioniert und geformt ist, damit die Zugabe eines Reagenzes zum Chromatographiebereich ermöglicht wird.
Die Vorrichtung gemäß Anspruch 24, wobei die Detektionsöffnung benachbart zur Transit-Zone positioniert ist.
Die Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 25, die ferner einen Luftspalt zwischen dem Reagenz-Beförderungssystem und dem Chromatographiebereich umfasst, wobei der Luftspalt so angeordnet ist, dass das distale Ende des Probensammlers mit dem Chromatographiebereich und das proximale Ende mit dem Reagenz-Beförderungssystem in Kontakt steht, damit eine kapillare Kommunikation zwischen dem Probennehmer und den Detektionselementen ermöglicht wird.
Die Vorrichtung gemäß Anspruch 26, wobei der Luftspalt zwischen dem absorbierenden Reagenzpad und dem Marker-Übertragungspad liegt.
Ein Verfahren zum Durchführen eines Liganden-Rezeptor-Assays, das die Schritte umfasst: (a) Sammeln einer Probe am distalen Ende des Probensammlers der Assay-Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 27; (b) Platzieren des distalen Endes des Probensammlers in kapillar-kommunizierendem Kontakt mit dem Chromatographiemedium; (c) das Reagenz vom proximalen Ende durch den Probensammler Fließen-lassen, damit die Probe in das Chromatographiemedium gewaschen wird; und (d) die Probe mit einem spezifischen Liganden-bindenden Reagenz im Chromatographiemedium Interagierenlassen, wobei das spezifische, Liganden-bindende Reagenz markiert und/oder unmarkiert ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 28, wobei das Volumen der Probe gemessen wird, wenn es im Probensammler eingesammelt ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 28 oder 29, wobei das spezifische, Liganden-bindende Reagenz an das Chromatographiemedium in der Einfang-Zone gebunden ist.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 28 bis 30, wobei man die Probe mit einem markierten, spezifischen Liganden-bindenden Reagenz wechselwirken lässt, bevor sie mit dem unmarkierten, spezifischen, Liganden-bindenden Reagenz reagiert.
Das Verfahren gemäß Anspruch 31, wobei das unmarkierte, spezifische, Liganden-bindende Reagenz an das Chromatographiemedium in der Einfang-Zone gebunden ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 31 oder 32, wobei das markierte, spezifische, Liganden-bindende Reagenz unbeweglich in einem Marker-Übertragungspad vorliegt, bis das Marker-Übertragungspad mit der Probe und/oder dem Reagenz angefeuchtet wird.