DE69634335T2 - Vorrichtung für kompetitiven immunoassay - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung ist auf Teststreifen oder Assayvorrichtungen zur Bestimmung der Charakteristika von Proben gerichtet, auf nach dem Baukastenprinzip aufgebaute Gehäuse und auf Kits, die Teststreifen und Gehäuse einschließen, sowie Verfahren zur Bestimmung der Eigenschaften von Proben unter Verwendung der Teststreifen und Gehäuse, insbesondere für die Durchführung von kompetitiven Assays.
  • Unter den vielen analytischen Systemen die zum Nachweis und/oder Bestimmung von Analyten, insbesondere von Analyten von biologischem Interesse verwendet werden, sind chromatographische Assaysysteme.
  • Derartige chromatographische Systeme werden häufig von Medizinern und Medizintechnikern für die schnelle Diagnose in der Praxis und für das therapeutische Verfolgen einer Vielzahl von Krankheitsbedingungen und Störungen verwendet. Sie werden in zunehmendem Maße auch von Patienten selbst für das Verfolgen derartiger Krankheitsbedingungen und Störungen zuhause verwendet.
  • Unter den wichtigsten derartiger Systeme sind "Dünnschicht"-Systeme, bei denen ein Lösungsmittel über ein dünnes flaches absorbierendes Medium läuft.
  • Unter den wichtigsten Tests, die mit derartigen Dünnschichtsystemen durchgeführt werden können, befinden sich Immunoassays, die von der spezifischen Wechselwirkung zwischen einem Antigen oder Hapten und einem entsprechenden Antikörper abhängen. Die Verwendung von Immunoassays als Mittel zum Testen auf die Gegenwart und/oder zur Präparierung klinisch wichtiger Moleküle ist seit einiger Zeit bekannt. J. M. Singer berichtete schon so früh wie 1956 über die Verwendung eines immunbasierten Latexagglutinationstests zum Nachweis eines Faktors, der mit rheumatoider Arthritis in Verbindung gebracht wurde (J. M. Singer et al., Am. J. Med. 22: 888–892 (1956)).
  • Unter den verwendeten chromatographischen Techniken im Zusammenhang mit Immunoassays gibt es ein Verfahren, das als Immunochromatographie bekannt ist.
  • Immunochromatographische Assays fallen in zwei hauptsächliche Kategorien: "Sandwich" und "kompetitive", in Abhängigkeit von der Art des Antigen-Antikörper-Komplexes, der nachgewiesen werden soll, und der Reaktionssequenzen, die erforderlich sind, um diesen Komplex herzustellen. Das nachzuweisende Antigen kann selber ein Antikörper sein, wie beispielsweise bei serologischen Assays auf Antikörper, die für N. pylori spezifisch sind. In derartigen Fällen kann der nachzuweisende Antikörper an ein spezifisches Antigen gebunden sein. Alternativ dazu kann das nachzuweisende Antigen indirekt nachgewiesen werden, indem ein markierter zweiter Antikörper verwendet wird, der an den ersten Antikörper des nachzuweisenden Analyten bindet.
  • Bei kompetitiven Immunoassays ist der Marker typischerweise ein markierter Analyt oder ein Analytanalogon, der mit jedem nicht markierten Analyt, der in der Probe vorhanden ist, in Bezug auf die Bindung eines Antikörpers konkurriert. Kompetitive Immunoassays werden typischerweise zum Nachweis von Analyten wie Haptene verwendet, wobei jedes Hapten monovalent ist und in der Lage ist, nur ein Antikörpermolekül zu binden. Beispiele von Vorrichtungen für kompetitive Immunoassays sind diejenigen, die durch das US-Patent Nr. 4,235,601 von Deutsch et al., das US-Patent Nr. 4,442,204 von Liotta und das US-Patent Nr. 5,208,535 von Buechler et al. offenbart sind.
  • Derzeit erhältliche Chromatographietechniken, die Teststreifen verwenden, haben, obgleich sie sehr nützlich sind, eine Anzahl von Nachteilen. Viele Proben, wie beispielsweise Kotproben, enthalten teilchenförmiges Material, das die Proben des chromatographischen Mediums verstopfen kann und so das immunochromatographische Verfahren in großem Ausmaß behindert. Andere Proben, wie beispielsweise Blut, enthalten Zellen und gefärbte Bestandteile, die es schwer machen, den Test zu lesen. Noch weitere Proben, wie beispielsweise Milch, enthalten Kügelchen oder andere Bestandteile, die Beeinträchtigungen erzeugen können. Selbst wenn die Probe keine Beeinträchtigung erzeugt, ist es oftmals schwierig, mit existierenden chromatographischen Testvorrichtungen die Probe auf das chromatographische Medium aufzubringen, so dass sich die Probenfront einheitlich durch das chromatographische Medium bewegt und gewährleistet, dass die Probe die Gegend erreicht, wo die Bindung in einheitlicher, geradliniger Weise zu erfolgen hat.
  • Andere Probleme existieren mit derzeit erhältlichen Teststreifen aufgrund der Art der zu testenden Probe oder des Assays, der durchgeführt werden soll. Mit derartigen Vorrichtungen ist es unpraktisch Waschschritte durchzuführen, die sehr oft wünschenswert sind, um die Empfindlichkeit zu verbessern und den Hintergrund zu reduzieren. Es ist ebenfalls schwierig und in vielen Fällen unmöglich, Präinkubationsschritte innerhalb der Vorrichtung durchzuführen. Außerdem gibt es einen Bedarf für eine immunochromatographische Assayvorrichtung, die einen breiten Bereich an Trennungen durchführen kann, wie beispielsweise eine Trennung von Fett aus Milch oder die Trennung von organischen Chemikalien, wie die Trennung von Benzol aus Toluol.
  • Die Probenpräparation und die Erzeugung von Abfall sind verantwortlich für andere Probleme mit derzeit erhältlichen Vorrichtungen und Techniken für die Immunochromatographie. Das zunehmende Auftreten von Krankheiten, die durch infiziertes Blut und Blutfraktionen verbreitet werden, ebenso wie durch andere Körpersekrete, wie AIDS und Hepatitis, hat diese Probleme verschärft. Es ist selten möglich, eine Probe (wie Kot) oder eine Vorrichtung für die Probennahme (wie einen Halsabstrich) direkt auf das chromatographische Medium aufzubringen. Mehrere Extraktions- und Vorbehandlungsreaktionen sind üblicherweise erforderlich, bevor die Probe auf das chromatographische Medium aufgebracht werden kann. Diese Reaktionen werden typischerweise vom Mediziner oder einem Techniker durchgeführt, der den Test in verschiedenen kleinen Gefäßen, wie Reagenzgläschen oder Mikrofugenröhrchen durchführt und der die Verwendung von Transfermitteln wie Pipetten erforderlich macht. Jede dieser Vorrichtungen ist anschließend kontaminiert und muss unter Verwendung spezieller vorbeugender Maßnahmen entsorgt werden, so dass Arbeiter oder Personen, die zufälligerweise in Kontakt mit dem Abfall kommen, nicht kontaminiert werden.
  • Weiterhin sind derzeit erhältliche Testvorrichtungen, obgleich sie brauchbar sind, im Allgemeinen nicht dazu geeignet, eine halbquantitative oder quantitative Angabe der Konzentration eines in der Testprobe vorhandenen Analyten zu liefern, insbesondere für kompetitive Immunoassays. Typischerweise erfordert die Erlangung derartiger quantitativer oder halbquantitativer Angaben die Verwendung von mehr als einer Testvorrichtung, wie beispielsweise eine für die Kalibrierung. Die Verwendung von mehr als einer Testvorrichtung erfordert einen größeren Zeitaufwand und Materialaufwand und erhöht ebenso die Möglichkeit, dass ein Fehler während der Durchführung des Assays gemacht werden kann. Insbesondere gibt es mit möglicherweise kontaminierten Proben Bedenken, dass eine Vorrichtung, von der zufälligerweise angenommen wird, dass sie nur eine Kontrolle enthält, in Wirklichkeit eine Probe enthält, die ein infektiöses Mittel enthalten kann. Es würde daher von Vorteil sein, wenn man in der Lage wäre, eine quantitative oder halbquantitative Angabe der Analytkonzentration in einer Assayvorrichtung nachzuweisen, ohne die Verwendung einer getrennten Assayvorrichtung als Kontrolle oder für die Kalibrierung.
  • Die WO/21977 und die WO 94/23300 beschreiben einzelne Assayvorrichtungen und Multiplexvorrichtungen, die eine erste gegenüberstellbare Komponente, die klappbar an eine zweite gegenüberstellbare Komponente befestigt ist, eine Probenpräparationszone und einen Absorber und ein chromatographisches Medium umfassen, die die Verwendung von getrennten Extraktionsgefäßen vermeiden. Sie offenbaren keine Vorrichtungen, die halbquantitative/quantitative Ergebnisse liefern, zusammen mit der Angabe, dass der Assay korrekt durchgeführt wurde. Stattdessen stellen sie Assayvorrichtungen bereit, die Probleme wie die Vermeidung der Beeinträchtigung durch partikelförmige Teilchen oder gefärbte Bestandteile ansprechen, wobei sie eine Vorrichtung zur Verfügung stellen, die in der bidirektionalen Chromatographie verwendet werden kann, beim indirekten Markieren oder die so ausgelegt ist, dass sie eine Proben-enthaltende Vorrichtung (wie zum Beispiel einen Abstrich) aufnehmen kann.
  • Es gibt einen weiteren Bedarf für eine Assayvorrichtung, die eine positive Angabe liefert, dass der Test korrekt durchgeführt wurde und dass der Durchfluss richtig innerhalb der chromatographischen Assayvorrichtung erfolgt ist.
  • Demgemäß besteht ein Bedarf für eine verbesserte Assayvorrichtung, die in der Lage ist, ein breites Gebiet an chromatographischen Assays zu bedienen. Eine derartige Vorrichtung sollte in der Lage sein, alle Arten von Immunoassays zu bedienen, insbesondere kompetitive Immunoassays, ebenso wie andere Arten von Assays unter Verwendung von Chromatographie. Eine derartige Vorrichtung sollte in der Lage sein, eine möglicherweise kontaminierte Probe oder eine Probenpräparationsvorrichtung aufzunehmen, um so direkt den Bedarf für Extraktionsgefäße und Transfervorrichtungen zu eliminieren. Eine derartige Vorrichtung, insbesondere in der Form eines Teststreifens, sollte ebenso in der Lage sein, immunochromatographische Assays mit gefärbten Proben oder Proben, die partikelförmige Teilchen enthalten, ohne Störung durchzuführen und sollte in der Lage sein, die Probe auf das chromatographische Medium einheitlich und gleichmäßig aufzubringen, um die Genauigkeit und die Präzision der Tests zu verbessern. Weiterhin sollte ein derartiger verbesserter Teststreifen in der Lage sein, halbquantitative oder quantitative Angaben der Analytkonzentration in einer einzigen Assayvorrichtung durchzuführen, ohne das Bedürfnis für weitere Kontrollassayvorrichtungen, und er sollte eine positive Angabe ergeben, dass ein Durchfluss innerhalb der Vorrichtung richtig durchgeführt wurde, und dass der Assay richtig funktionierte.
  • Zusammenfassung
  • Ich habe eine Testvorrichtung entwickelt, die diesen Bedürfnisse entgegenkommt und halbquantitative oder quantitative Bestimmungen der Analytkonzentration in einer einzigen Assayvorrichtung durchführt, ohne weitere Kontrollassayvorrichtungen zu erfordern. Die Assayvorrichtung der vorliegenden Erfindung stellt ebenfalls eine positive Angabe der richtigen Durchführung des Assays bereit. Die Vorrichtung kann kompetitive Immunoassays für eine große Vielzahl von Analyten, insbesondere Haptenen, durchführen.
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in einer Vorrichtung für einen kompetitiven Immunoassay umfassend:
    • (1) eine erste gegenüberstellbare Komponente einschließend:
    • (a) eine Probenherstellungszone, die einen markierten spezifischen, an einem ersten Bestandteil eines hilfsweise spezifischen Bindungspaars konjugierten Bindungspartners für einen Analyt in einer resolubilisierbaren Form einschließt; und
    • (b) einen Absorber zum Absorbieren von Flüssigkeit darin, getrennt von der Probenherstellungszone auf der ersten gegenüberstellbaren Komponente, und
    • (2) eine zweite gegenüberstellbare Komponente, die klappbar an der ersten gegenberstellbaren Komponente befestigbar ist, einschließend
    • (a) ein erstes chromatographisches Medium, das erste und zweite Enden aufweist, und darauf einschließend
    • (i) eine erste, Einfang-, Zone des immobilisierten, an das erste chromatographische Medium gebundenen Analyts oder Analogons davon und
    • (ii) eine zweite, Nachweis-, Zone eines immobilisierten Moleküls, das ein zweiter Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars mit einer spezifischen Affinität für den ersten, an das erste chromatographische Medium gebundenen Bestandteil ist,
    • (b) ein zweites chromatographisches Medium, das ein erstes Ende und ein zweites Ende aufweist und darauf einschließend eine Vergleichszone, die eine bekannte Menge des auf der Vergleichszone immobilisierten Analyts oder Analogons davon enthält, und
    • (c) eine Vergleichsmarkierungszone, darin einschließend einen markierten spezifischen Bindungspartner des Analyts oder Analogons davon in einer resolubilisierbaren Form in funktionsfähigem Kontakt mit dem zweiten chromatographischen Medium.
  • Sobald die ersten und zweiten gegenüberstellbaren Komponenten von einer Position, in der sie nicht gegenüberliegend sind, in eine gegenüberliegende Position gebracht werden, kommt die Probenherstellungszone in funktionsfähigen Kontakt mit dem ersten Ende des ersten chromatographischen Mediums, um die Probe und den markierten spezifischen Bindungspartners für den Analyt, der an Biotin konjugiert ist, auf das erste chromatographische Medium aufzubringen. Der Absorber kommt ebenfalls in funktionsfähigen Kontakt mit dem zweiten Ende des ersten chromatographischen Mediums und dem zweiten Ende des zweiten chromatographischen Mediums, um Flüssigkeit durch das erste und das zweite chromatographische Medium von ihrem ersten Ende zu ihrem zweiten Ende durchzuleiten, so dass die Vorrichtung eine nachweisbare vergleichende Anzeige für die Gegenwart eines Analyts gibt, mit einer Menge die größer ist als eine vorbestimmte Menge durch Vergleich der Intensität der Markierung, die an die Nachweiszone des ersten chromatographischen Mediums gebunden ist und an der Vergleichszone des zweiten chromatographischen Mediums.
  • Vorzugsweise umfasst die Probenherstellungszone auf der ersten gegenüberstellbaren Komponente weiterhin einen zweiten markierten spezifischen Bindungspartner, der an ein Molekül bindet, das im Wesentlichen nicht mit dem Analyt in einer resolubilisierbaren Form kreuzreagiert, und das erste chromatographische Medium umfasst weiter einen Durchflusskontrollanzeiger, der ein den zweiten markierten spezifischen Bindungspartner bindendes Molekül einschließt, so dass der Durchflusskontrollanzeiger eine positive Anzeige, dass ein Durchfluss durch das erste chromatographische Medium eingetreten ist, gibt.
  • Vorzugsweise ist der erste Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars Biotin. Wenn der erste Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars Biotin ist, ist der zweite Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars vorzugsweise Streptavidin.
  • In einer typischen Ausführungsform dieser Vorrichtung, ist der Analyt ein β-Lactamantibiotikum, die erste Zone des immobilisierten Analyts oder Analogon davon ist an Immunoglobulin konjugierte 7-Aminocephalosporansäure und der markierte spezifische, an Biotin konjugierte Bindungspartner für den Analyt ist ein biotinyliertes penicillinbindendes Protein.
  • In einer weiteren typischen Ausführungsform dieser Vorrichtung ist der Analyt ein Antibiotikum, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gentamycin, Sulfamethazin und Tetracyclin, die erste Zone des immobilisierten Analyts oder Analogons davon ist ein kovalent an Immunoglobulin konjugierter Analyt und der markierte spezifische, an einen ersten Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaares konjugierte Bindungspartner für den Analyt, ist ein biotinylierter Antianalytantikörper.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Testkit für den Nachweis und/oder die Bestimmung eines Analyts, umfassend in getrennte Behälter gepackt:
    • (1) die vorstehend beschriebene Immunoassayvorrichtung; und
    • (2) eine Flüssigkeit zum Resolubilisieren des markierten spezifischen Bindungspartners des Analyts oder Analogons davon in der Vergleichsmarkierungszone.
  • Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine weitere Version einer Vorrichtung für einen kompetitiven Immunoassay, die ein einziges chromatographisches Medium verwendet, um sowohl Nachweis- als auch Kontrollfunktionen bereitzustellen. Diese Version umfasst:
    • (1) eine erste gegenüberstellbare Komponente, einschließend:
    • (a) eine Probenherstellungszone einschließend:
    • (i) einen markierten spezifischen, an einen ersten Bestandteil eines hilfsweisen spezifischen Bindungspaars konjugierten Bindungspartner für einen Analyt in einer resolubilisierbaren Form; und
    • (ii) eine vorbestimmte Menge des Analyts oder eines Analogons davon, der kovalent an einen markierten spezifischen Bindungspartner für ein Molekül, das nicht wesentlich mit dem Analyt kreuzreagiert, gebunden ist, in einer resolubilisierbaren Form, und
    • (b) einen von der Probenherstellungszone getrennten Absorber; und
    • (2) eine zweite gegenüberstellbare Komponente, die ein chromatographisches Medium mit einem ersten und zweiten Ende einschließt, das chromatographische Medium darauf in gesonderten, nicht überlappenden Zonen einschließend:
    • (a) eine erste, Einfang-, Zone eines immobilisierten, an das chromatographische Medium gebundenen Analyts oder Analogons davon;
    • (b) eine zweite, Nachweis-, Zone, die ein immobilisiertes Molekül, das ein zweiter Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars mit einer spezifischen Affinität für den ersten, an das chromatographische Medium gebundenen Bestandteil ist, einschließt; und
    • (c) eine dritte, Kontroll-, Zone, die ein immobilisiertes Molekül, das befähigt ist, spezifisch an den markierten spezifischen, an das chromatographische Medium gebundenen Bindungspartner gebunden zu sein, und das kovalent an den Analyt oder das Analogon davon konjugiert ist, einschließt.
  • In dieser Ausführungsform einer Assayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung sind die ersten und zweiten gegenüberstellbaren Komponenten so konfiguriert, dass das in eine gegenüberliegende Position bringen der ersten und zweiten gegenüberstellbaren Komponenten von einer Position, in der sie nicht gegenüberliegend sind, den Absorber veranlasst, in funktionsfähigen Kontakt mit dem zweiten Ende des chromatographischen Mediums zu kommen und die Probenherstellungszone veranlasst, in Kontakt mit dem ersten Ende des chromatographischen Mediums zu kommen, so dass die Testprobe, der resolubilisierte markierte spezifische, an den ersten Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars konjugierte Bindungspartner für den Analyt und die vorbestimmte Menge des kovalent an einen markierten spezifischen Bindungspartner gebundenen Analyts oder Analogons davon durch das chromatographische Medium von dem ersten Ende zu dem zweiten Ende fließen, so dass die Vorrichtung eine nachweisbare vergleichende Anzeige für die Gegenwart des Analyts gibt. Als Ergebnis davon, gibt die Vorrichtung eine nachweisbare Anzeige der Gegenwart eines Analyts bei einer Menge, die größer ist als die vorbestimmte Menge, durch Vergleich der Intensität der Markierung, die an die Nachweiszone gebunden ist und an die Kontrollzone des zweiten chromatographischen Mediums.
  • In einer typischen Ausführungsform dieser Vorrichtung, bei der der erste Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars Biotin ist und der zweite Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars Streptavidin ist, ist der Analyt ein β-Lactamantibiotikum, und wobei der markierte spezifische Bindungspartner für den Analyten, der an den ersten Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars konjugiert ist, ein penicillinbindendes Protein ist, und wobei der immobilisierte Analyt oder das Analogon davon, die an die Einfangzone des chromatographischen Mediums gebunden sind, eine kovalent an Immunoglobulin G konjugierte 7-Aminocephalosporansäure ist, der markierte spezifische Bindungspartner für ein Molekül, das nicht wesentlich mit dem Analyt kreuzreagiert, ein Antikaninchenimmunoglobulin G Antikörper ist und das immobilisierte, an der Kontrollzone auf dem chromatographischen Medium gebundene Molekül Kaninchenimmunoglobulin G ist.
  • Alternativ dazu kann der Analyt ein Antibiotikum sein, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Gentamycin, Sulfamethazin und Tetracyclin, der markierte spezifische, an Biotin konjugierte Bindungspartner für den Analyt kann ein Antianalytantikörper sein, der markierte spezifische Bindungspartner für ein Molekül, das nicht wesentlich mit dem Analyt kreuzreagiert, kann Antikaninchenimmunoglobulin G sein, der immobilisierte, an der Bindungszone auf dem chromatographischen Medium gebundene Analyt oder das Analogon davon kann der kovalent an Immunoglobulin G einer Spezies, anders als Kaninchen, gebundene Analyt sein und das an der Kontrollzone gebundene immobilisierte Molekül kann Kaninchenimmunoglobulin G sein.
  • Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sind Multiplexassayvorrichtungen, die mehr als ein Assay gleichzeitig durchführen können. Eine Version einer derartigen Multiplexassayvorrichtung umfasst:
    • (1) eine erste gegenüberstellbare Komponente einschließend:
    • (a) eine Vielzahl von Probenherstellungszonen, wobei jede Probenherstellungszone einen markierten spezifischen, an einen ersten Bestandteil eines hilfsweisen spezifischen Bindungspaars konjugierten Bindungspartners für ein Analyt in einer resolubilisierbaren Form einschließt; und
    • (b) einen Absorber zum Absorbieren von Flüssigkeit darin, getrennt von der Probenherstellungszone auf der ersten gegenüberstellbaren Komponente; und
    • (2) eine zweite gegenüberstellbare Komponente, die klappbar an der ersten gegenüberstellbaren Komponente befestigbar ist, einschließend:
    • (a) eine Vielzahl von ersten chromatographischen Medien, eines für jede Probenherstellungszone, wobei jedes erste chromatographische Medium ein erstes und zweites Ende aufweist und darauf einschließend:
    • (i) eine erste Zone eines immobilisierten, an das erste chromatographische Medium konjugierten Analyts oder Analogons davon; und
    • (ii) eine zweite Zone eines immobilisierten Moleküls, das ein zweiter Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars mit spezifischer Affinität für den ersten, an das erste chromatographische Medium gebundenen Bestandteils ist;
    • (b) eine Vielzahl von zweiten chromatographischen Medien, eines für jede Probenherstellungszone, wobei jedes zweite chromatographische Medium ein erstes Ende und ein zweites Ende aufweist und darauf eine Vergleichszone einschließt, die eine bekannte Menge eines auf der Vergleichszone immobilisierten Analyts oder Analogons davon enthält; und
    • (c) eine Vielzahl von Vergleichsmarkierungszonen, eine für jedes zweite chromatographische Medium, wobei jede Vergleichsmarkierungszone darin einen markierten spezifischen Bindungspartner für den Analyt oder ein Analogon davon in einer resolubilisierbaren Form in funktionsfähigem Kontakt mit dem zweiten chromatographischen Medium einschließt.
  • In dieser Version einer Multiplexassayvorrichtung gemäß der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung, wenn die ersten und zweiten gegenüberstellbaren Komponenten aus einer Position, in der sie nicht gegenüberliegen, in eine gegenüberliegende Position gebracht werden, kommen die Probenherstellungszonen in funktionsfähigen Kontakt mit dem ersten Ende von jedem ersten chromatographischen Medium, um die Probe und den markierten spezifischen, an einen ersten Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspartners konjugierten Bindungspartner für den Analyt auf jedes erste chromatographische Medium aufzubringen, und der Absorber kommt in funktionsfähigen Kontakt mit dem zweiten Ende von jedem ersten chromatographischen Medium und dem zweiten Ende von jedem zweiten chromatographischen Medium, um Flüssigkeit durch die ersten und zweiten chromatographischen Medien von ihren ersten Enden zu ihren zweiten Enden zu leiten. Als Ergebnis gibt die Vorrichtung eine nachweisbare Anzeige der Gegenwart eines Analyts in mindestens einem ersten und zweiten chromatographischen Medium für eine Menge, die größer ist als eine vorbestimmte Menge, durch Vergleich der Intensität der Markierung, die an der Nachweiszone von jedem ersten chromatographischen Medium und an der Vergleichszone von jedem zweiten chromatographischen Medium gebunden ist.
  • Ein Testkit, die diese Version einer Multiplexassayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung einschließt, umfasst:
    • (1) die Immunoassaysvorrichtung; und
    • (2) eine Flüssigkeit zum Resolubilisieren des markierten spezifischen Bindungspartners des Analyts oder Analogons davon in jeder Vergleichsmarkierungszone.
  • Eine weitere Version einer Multiplexassayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung basiert auf der Version der Vorrichtung, die ein einziges chromatographisches Medium verwendet und umfasst:
    • (1) eine erste gegenüberstellbare Komponente einschließlich:
    • (a) eine Vielzahl von Probenherstellungszonen, wobei jede Probenherstellungszone einschließend:
    • (i) einen markierten spezifischen, an einen ersten Bestandteil eines hilfsweisen spezifischen Bindungspaars konjugierten Bindungspartner für einen Analyt in einer resolubilisierbaren Form; und
    • (ii) eine vorbestimmte Menge eines Analyts oder eines Analogons davon, der kovalent an einen markierten spezifischen Bindungspartner für ein Molekül, das nicht wesentlich mit dem Analyt kreuzreagiert, gebunden ist, in einer resolubilisierbaren Form; und
    • (b) einen Absorber, der von den Probenherstellungszonen getrennt ist; und
    • (2) eine zweite gegenüberstellbaren Komponente einschließend eine Vielzahl von chromatographischen Medien mit ersten und zweiten Enden, wobei jedes chromatographische Medium darauf in gesonderten, nicht überlappenden Zonen umfasst:
    • (a) eine erste, Einfang-, Zone eines immobilisierten Analyten oder Analogons davon der an das chromatographische Medium gebunden ist;
    • (b) eine zweite, Nachweis-, Zone einschließend ein immobilisiertes Molekül, das ein zweiter Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars mit einer spezifischen Affinität für den ersten, an das chromatographische Medium gebundenen Bestandteil ist; und
    • (c) eine dritte, Kontroll-, Zone einschließend ein immobilisierbares Molekül, das befähigt ist, spezifisch an den markierten spezifischen, an das chromatographische Medium gebundenen Bindungspartner gebunden zu sein, und das kovalent an den Analyt oder das Analogon davon konjugiert ist.
  • Bei dieser Version einer Multiplexassayvorrichtung gemäß der vorliegenden Vorrichtung sind die ersten und zweiten gegenüberstellbaren Komponenten so konfiguriert, dass das in eine gegenüberliegende Position bringen der ersten und zweiten gegenüberstellbaren Komponenten von einer Position, in der sie nicht gegenüberliegend sind, den Absorber veranlasst, in funktionsfähigen Kontakt mit dem zweiten Ende jedes chromatographischen Mediums zu kommen und die Probenherstellungszonen veranlasst, in Kontakt mit dem ersten Ende jedes chromatograpischen Mediums zu kommen, so dass die Testproben, die resolubilisierten markierten spezifischen Bindungspartner für den Analyt, die an den ersten Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars konjugiert sind, und die vorbestimmten Mengen des Analyts oder Analogons davon, die kovalent an den markierten spezifischen Bindungspartner gebunden sind, durch jedes chromatographische Medium von dem ersten Ende zu dem zweiten Ende fließen.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Diese und andere Merkmale, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden unter Bezugnahme auf die nachstehende Beschreibung, die beigefügten Ansprüche und die begleitenden Zeichnungen besser verständlich, worin:
  • 1 eine Zeichnung einer ersten Ausführungsform einer kompetitiven Immunoassayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung, die zwei chromatographische Medien benutzt, ist;
  • 2 eine Zeichnung einer zweiten Ausführungsform einer Vorrichtung für einen kompetitiven Immunoassay gemäß der vorliegenden Erfindung unter Verwendung eines einzigen chromatographischen Mediums ist;
  • 3 eine Zeichnung einer ersten Ausführungsform einer Multiplexassayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung, die gemäß den Prinzipien der Vorrichtung der 1 betrieben wird, ist; und
  • 4 eine Zeichnung einer zweiten Ausführungsform einer Multiplexassayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung, die gemäß den Prinzipien der Vorrichtung aus 2 betrieben wird, ist.
  • Beschreibung
  • Definitionen
  • Im Kontext der vorliegenden Offenbarung sind die nachstehenden Begriffe wie folgt definiert, sofern es nicht anders angegeben ist:
    Spezifischer Bindungspartner: Ein Mitglied eines Paars von Molekülen, die durch spezifische nichtkovalente Wechselwirkungen miteinander Wechselwirken, die von den dreidimensionalen Strukturen der beteiligten Moleküle abhängen. Typische Paare spezifischer Bindungspartner umfassen Antigen-Antikörper, Hapten-Antikörper, Hormon-Rezeptor, Nukleinsäurestrang-komplementärer Nukleinsäurestrang, Sub strat-Enzym, β-Lactamantibiotikum-penicillinbindendes Protein, Inhibitor-Enzym, Kohlenhydrat-Lectin, Biotin-Avidin und Virus-zellulärer Rezeptor.
    Immunoassay: Wie vorliegend verwendet, umfasst der Begriff "Immunoassay" Assays, die wenigstens einen wie vorstehend definierten spezifischen Bindungspartner verwenden, und der Begriff ist nicht notwendigerweise auf Assays beschränkt, bei denen der spezifische Bindungspartner ein Antikörper ist, falls nicht eine derartige Beschränkung genau angegeben ist.
    Funktionsfähiger Kontakt: Zwei feste Komponenten sind in funktionsfähigem Kontakt, wenn sie entweder direkt oder indirekt derart in Kontakt sind, dass eine Flüssigkeit, typischerweise eine wässrige Flüssigkeit, von einem der zwei Komponenten zur anderen im Wesentlichen ununterbrochen durch Kapillarität oder anders fließen. "Direkter Kontakt" bedeutet, dass zwei Elemente in physischem Kontakt sind, wie ein Kante-auf-Kante oder Vorderseite-auf-Hinterseite. Wenn zwei Komponenten in direktem Kontakt sind, überlappen sie typischerweise mit einer Überlappung von ungefähr 0,5 bis ungefähr 3 mm. Jedoch können die Komponenten mit direkt angepassten Kanten aufeinander angebracht sein. "Indirekter Kontakt" bedeutet, dass die zwei Elemente nicht in physikalischem Kontakt miteinander sind, sondern durch ein oder zwei Konduktoren verbunden sind.
    Analyt: Der Begriff "Analyt" schließt sowohl das wirkliche Molekül, das getestet werden soll, und Analoga und Derivate davon ein, wenn derartige Analoga und Derivate ein weiteres Molekül, das in dem Assay verwendet wird, in einer im Wesentlichen äquivalenten Art wie der Analyt selbst in Bezug auf Affinität und Kreuzreaktivität binden.
    Antikörper: Der Begriff "Antikörper" schließt sowohl intakte Antikörpermoleküle mit der geeigneten Spezifität und Antikörperfragmente ein (einschließend Fab, F(ab') und F(ab')2 Fragmente) ebenso wie chemisch modifizierte intakte Antikörpermoleküle und Antikörperfragmente, einschließlich Hybridantikörper, die durch in vitro Reassoziierung von Untereinheiten zusammengesetzt sind.
    Hilfsweise spezifisches Bindungspaar: Der Begriff "hilfsweise spezifisches Bindungspaar" bezieht sich auf ein Paar von Molekülen, die spezifische Bindungspartner zueinander sind, so wie der Begriff vorstehend definiert ist, wobei kein Mitglied des Paars eine spezifische Bindungsaffinität für irgendein anderes Molekül, das an dem Assay teilnimmt, der durch die Assayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden kann, aufweist. Ein Beispiel eines hilfsweisen spezifischen Bindungspaars ist Biotin-Avidin.
  • 1. Chromatographische Assayvorrichtungen
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst chromatographische Assayvorrichtungen, die insbesondere nützlich für den Assay von Analyten und biologischen Proben sind, insbesondere durch kompetitive Immunoassays. Diese Vorrichtungen sind für die direkte Aufbringung biologischer Proben ohne vorhergehende Fraktionsschritte geeignet und sind so konstruiert, dass die Störung mit Assayergebnissen die durch Teilchen oder gefärbte Proben hervorgerufen werden, minimieren.
  • Die Vorrichtung weist wenigstens zwei im Wesentlichen planare gegenüberstellbare Komponenten auf. Eine der im Wesentlichen planaren Komponenten weist auf ihrer Oberfläche ein chromatographisches Medium auf.
  • Die Vorrichtung weist ebenfalls Mittel zum Gegenüberstellen der gegenüberstellbaren Komponenten auf und zum Anlegen von Druck darauf. Typischerweise wird das in eine gegenüberliegende Position bringen der gegenüberstellbaren Komponenten durch direkte manuelle Schließung hervorgerufen. Der angelegte Druck ist ausreichend, um ein Fluid von einer gegenüberstellbaren Komponente zu der anderen gegenüberstellbaren Komponente in einer Richtung zu transferieren, die im Wesentlichen senkrecht zu den gegenüberstellbaren Komponenten ist, so dass die Probe auf das chromatographische Medium zum Nachweis und/oder zur Bestimmung des Analyts darauf aufgebracht wird. Der Druck lässt ein Fluid durch ein chromatographisches Medium zur Beschleunigung des Chromatographieverfahrens fließen und ergibt ein nachweisbares Ergebnis in geringerer Zeit. Außerdem ermöglicht der Druck, die Leistungsfähigkeit von Schritten, wie Extraktionsschritte, in der Vorrichtung und kann dazu verwendet werden, ein Überschlussfluid aus dem chromatographischen Medium durch Absorber zu entfernen, um den Hintergrund der Assays zu reduzieren. Der Druck wird durch das Anbringen der gegenüberstellbaren Komponenten in gegenüberliegender Stellung erzeugt und beibehalten, indem die Komponenten in gegenüberliegender Stellung durch Halter wie Schließmittel oder Spangen gehalten werden. Der Druck wird kalibriert, um für jeden spezifischen Assay optimal zu sein, und kann in Abhängigkeit von der Konstruktion der Vorrichtung, dem im chromatographischen Medium verwendeten Material, dem Volumen und der Art der Probe, der Art der spezifischen Bindungspartner und der Markierung und anderen Faktoren variieren.
  • Assayvorrichtungen gemäß der vorliegenden Erfindung führen Immunoassays durch, ohne dass sie die Anwendung von weiteren Flüssigkeiten auf das chromatographische Medium der Vorrichtungen erfordern, sobald die Probe aufgebracht ist. Dies vermeidet die Verdünnung der Probe oder der spezifischen Bindungspartner und behält die maximale Empfindlichkeit der Assays bei.
  • Typischerweise werden die erfindungsgemäßen Vorrichtungen zur Durchführung eines kompetitiven Immunoassays konstruiert. Es können jedoch auch Vorrichtungen mittels ähnlicher Prinzipien für die Durchführung von anderen Arten von Immunoassays konstruiert werden, wobei sich diese ebenfalls innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung befinden.
  • In einer Vorrichtung, geeignet für die Durchführung eines kompetitiven Immunoassays, hat das chromatographische Medium eine Nachweiszone eines spezifischen Bindungspartners für eine markierte Komponente darauf eingeschlossen. Die markierte Komponente ist ein erstes Mitglied eines hilfsweisen spezifischen Bindungspaars und die Nachweiszone schließt ein zweites Mitglied des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars ein.
  • In einer besonders bevorzugten Alternative unter Verwendung eines hilfsweisen spezifischen Bindungspaars, ist die Nachweiszone ein immobilisiertes Molekül mit spezifischer Affinität für Biotin und der Assay umfasst einen markierten spezifischen Bindungspartner für einen Analyten der an Biotin konjugiert ist. Das immobilisierte Mole kül mit spezifischer Affinität für Biotin ist typischerweise Streptavidin, es kann jedoch auch Avidin oder ein Antibiotinantikörper sein.
  • Der Begriff "Biotin", wie er hier verwendet wird, umfasst nicht nur Biotin selbst, sondern ebenso Derivate von Biotin, bei denen die Bindung zwischen dem Biotinderivat und seinem spezifischen Bindungspartner im Wesentlichen äquivalent zu derjenigen zwischen Biotin selbst und dem spezifischen Bindungspartner ist. Diese Derivate umfassen Iminobiotin und Biotin, das kovalent an einen Spacer konjugiert ist, wie beispielsweise an ε-Caproamidobiotin. Andere Biotinderivate wie diejenigen, die Spacer mit variierenden Längen einschließen, können ebenfalls verwendet werden.
  • Die Nachweiszone ist im Wesentlichen kleiner als das chromatographische Medium. Sie erstreckt sich typischerweise über die gesamte Breite des chromatographischen Mediums, kann jedoch auch auf einen Fleck beschränkt sein, der kleiner ist als die gesamte Breite des chromatographischen Mediums.
  • Typischerweise findet der Nachweis und/oder die Bestimmung des Analyts nach Durchführung des Assays durch Verwendung einer sichtbar detektierbaren markierten Komponente statt. Die markierte Komponente ist vorzugsweise entweder der Analyt oder ein Analogon davon, der an eine sichtbar nachweisbare Markierung gebunden ist, oder ein spezifischer Bindungspartner für den Analyten, der an eine sichtbar nachweisbare Markierung gebunden ist. In den nachstehend beschriebenen Ausführungsformen für kompetitive Immunoassays, ist die markierte Komponente typischerweise ein markierter spezifischer Bindungspartner für einen Analyten, der an einen ersten Bestandteil eines hilfsweisen spezifischen Bindungspaars konjugiert ist. Vorzugsweise ist der erste Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars Biotin. Wenn der erste Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars Biotin ist, ist der zweite Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars vorzugsweise Streptavidin.
  • Ligandenanaloga, einschließlich Analytanaloga sind im Stand der Technik gut bekannt und beschrieben, beispielsweise im US-Patent Nr. 3,817,837 von Rubenstein et al., welches hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Analytanaloga können an ein größeres Protein, wie zum Beispiel Immunoglobulin, das im Immunoassay nicht reaktiv ist, über einen Linker konjugiert werden. Die Länge des Linkers kann für eine optimale Leistung im Assay, der durch die Vorrichtung ausgeführt wird, ausgewählt werden. Verschiedene Verbindungsreaktionen können, in Abhängigkeit von den zur Verfügung stehenden funktionellen Gruppen, verwendet werden, um die Analytanaloga herzustellen. Derartige Verbindungsreaktionen sind beispielsweise im US-Patent Nr. 3,817,837 von Rubenstein et al. beschrieben.
  • Erfindungsgemäße Assayvorrichtungen können für die gleichzeitige Durchführung von mehr als einem Assay konstruiert werden. In derartigen Vorrichtungen weist einer der im Wesentlichen planaren Bestandteile wenigstens zwei getrennte und nicht miteinander in Kontakt stehende chromatographische Medien darauf angeordnet auf. Diese sind weiter unten beschrieben.
  • A. Elemente, die den erfindungsgemäßen Vorrichtungen gemeinsam sind
  • Eine Zahl von Elementen sind den erfindungsgemäßen Vorrichtungen gemeinsam und sind hier der Einfachheit halber diskutiert.
  • 1. Das chromatographische Medium
  • Das chromatographische Medium ist ein Streifen. Typischerweise ist der Streifen im Wesentlichen planar, obwohl dies nicht bei allen Anwendungen erforderlich ist. Er ist typischerweise rechteckig, und weist erste und zweite Enden und erste und zweite Oberflächen auf. Innerhalb dieser Beschreibung bezieht sich der Begriff "erstes Ende" auf das Ende, auf dem die Flüssigkeit zuerst auf das chromatographische Medium aufgebracht wird, und der Begriff "zweites Ende" bezieht sich auf das entgegengesetzte Ende des chromatographischen Mediums. Die am oder nahe beim ersten Ende des chromatographischen Mediums aufgebrachte Flüssigkeit kann eine Probe oder eine behandelte Probe sein, wobei dies jedoch nicht notwendig ist. Das chromatographische Medium besteht aus einem Material, das als Medium für Dünnschichtchromatographie eines Analyten und von Analytantikörperkonjugaten geeignet ist, wie Nitrocellulose, Nylon, Rayon, Cellulose, Papier oder Siliziumdioxid. Das chromatographische Medium kann vorbehandelt sein oder je nach Bedarf modifiziert sein.
  • Das Reagens, das sich in der Nachweiszone befindet, wird auf dem chromatographischen Medium so immobilisiert, dass es gegen Diffusionsbewegungen stabilisiert ist. Das Reagens kann an das chromatographische Medium entweder durch kovalente oder nichtkovalente Mittel gebunden sein; beide sind aus dem Stand der Technik gut bekannt und müssen nicht weiter hier im Detail beschrieben werden. Falls das chromatographische Medium Nitrocellulose ist, kann das Reagens in der Nachweiszone durch hydrophobe Wechselwirkung gebunden sein.
  • Die Bindung von Reagenzien an Festphasen ist beispielsweise bei P. Tijssen, "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays" (Elsevier, Amsterdam 1985), S. 297–328 beschrieben.
  • Typischerweise ist das chromatographische Medium transluzent, so dass die darauf erscheinenden farbigen Zonen von jeder Seite angesehen werden können.
  • 2. Absorber
  • In einer Anzahl von erfindungsgemäßen Vorrichtungen sind Absorber in funktionsfähigem Kontakt mit einem oder beiden Enden des chromatographischen Mediums. Die Absorber können aus jedem saugfähigem Material sein, das eine Flüssigkeit, typischerweise eine wässrige Flüssigkeit, zurückhalten kann, und zwar in ausreichendem Maße, so dass die Flüssigkeit durch das chromatographische Medium durchgeführt werden kann und sich im Absorber ansammelt. Typische Materialien umfassen, sind aber nicht begrenzt auf Filterpapier.
  • 3. Andere flüssigkeitstragende Elemente
  • Wie nachstehend beschrieben, können bei bestimmten erfindungsgemäßen Vorrichtungen andere flüssigkeitstragende Elemente als Probenvorbereitungszonen, Applikator und/oder Konduktoren verwendet werden. Diese Elemente werden ausgehend von hydrophilen Medien hergestellt, die Flüssigkeiten durchlassen, typischerweise wässrige Flüssigkeiten, ohne diese im Wesentlichen zu absorbieren. Diese Materialien sind aus dem Stand der Technik gut bekannt.
  • In einigen Fällen können diese Elemente eine Komponente in trockener Form einschließen, die durch Zugabe einer Flüssigkeit, typischerweise einer wässrigen Flüssigkeit zu dem Element resolubilisiert werden können. Dieser Bestandteil kann eine markierte Komponente oder andere Komponente der Reaktion sein.
  • 4. Gegenüberstellbare Komponenten
  • Viele der Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtungen umfassen zwei gegenüberstellbare Komponenten. Die Körper der gegenüberstellbaren Komponenten bestehen vorzugsweise aus einer laminierten Holzplatte, die im Wesentlichen gegenüber Feuchtigkeit beständig ist, um die bei der Durchführung des Assays betroffenen Flüssigkeiten zu enthalten, der von der Vorrichtung über die Zeit, während der der Assay durchgeführt wird, ausgeführt wird.
  • Andere cellulosebasierte Materialien, wie Papier oder festes gebleichtes Sulfit (SBS), können ebenfalls verwendet werden. Alternativ dazu können die Körper der gegenüberstellbaren Komponenten aus Kunststoff hergestellt sein, der gegenüber Feuchtigkeit undurchlässig ist. Ein geeignetes Kunststoffmaterial ist ein Polycarbonatplastikmaterial wie LexanTM.
  • Die gegenüberstellbaren Bestandteile sind typischerweise über eine Klappe miteinander verbunden, vorzugsweise aus einem gegenüber Flüssigkeiten, einschließlich wässriger Flüssigkeiten, undurchlässigen Material, wie ein Kunststoff, der in kompatibler Weise mit den ersten und zweiten gegenüberstellbaren Komponenten verbunden werden kann, oder das gleiche Material wie das Material ist, das für die ersten und zweiten gegenüberstellbaren Komponenten verwendet wird.
  • 5. Markierte Komponenten
  • Für erfindungsgemäße Assayvorrichtungen, die für die Durchführung eines kompetitiven Immunoassay bestimmt sind, ist die markierte Komponente typischerweise ein markierter spezifischer Bindungspartner für den Analyt, der ebenso an Biotin konjugiert ist. Jedoch können auch andere Markierungsanordnungen verwendet werden.
  • Die Markierung ist vorzugsweise eine sichtbar nachweisbare Markierung, wie eine kolloidale Metallmarkierung. Vorzugsweise ist die kolloidale Metallmarkierung Gold, Silber, Bronze, Eisen oder Zinn, am meisten bevorzugt besteht sie aus Gold. Die Herstellung von goldmarkierten Antikörpern und Antigenen ist bei J. DeMey "The Preparation and Use of Gold Probes" in Immunocytochemistry: Modern Methods and Applications (J. M. Polak & S. Van Noorden, Herausgeber, Wright, Bristol, England, 1986), Kapitel 8, S. 115 – 145 beschrieben; andere Verweise auf die Herstellung derartiger markierter Antikörper und Antigene sind bekannt. Mit kolloidalem Gold markierte Antikörper sind kommerziell erhältlich, wie beispielsweise von Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri. Alternativ dazu können andere kolloidale Markierungen, wie eine kolloidale Schwefelmarkierung oder eine Farbstoffsilikamarkierung ebenfalls verwendet werden. In einer weniger bevorzugten Alternative kann die sichtbar nachweisbare Markierung eine kolloidale Latexmarkierung sein. Es ist ebenso möglich, andere Markierungen, wie beispielsweise eine radioaktive Markierung, eine Fluoreszenzmarkierung, eine Chemilumineszenzmarkierung, eine Biolumineszenzmarkierung oder Enzymmarkierung zu verwenden.
  • B. Assayvorrichtungen für kompetitive Immunoassays
  • 1. Assayvorrichtung für kompetitive Immunoassays mit zwei chromatographischen Medien
  • Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die für die Durchführung von kompetitiven Immunoassays geeignet ist, verwendet zwei getrennte chromatographische Medien auf einer einzigen gegenüberstellbaren Komponente. Eines dieser chromatographischen Medien wird dazu verwendet, um den Immunoassay durchzuführen, während das andere eine Vergleichsmöglichkeit unter Verwendung einer bekannten Menge eines Analyten bereitstellt, um zu bestimmen, ob oder ob nicht der Analyt in der Probe bei einer Konzentration, die höher als die vorbestimmte Konzentration ist, vorhanden ist oder nicht.
  • Im Allgemeinen umfasst diese Immunoassayvorrichtung:
    • (1) eine erste gegenüberstellbare Komponente einschließend:
    • (a) eine Probenherstellungszone, die einen markierten spezifischen, an einem ersten Bestandteil eines hilfsweise spezifischen Bindungspaars konjugierten Bindungspartner für einen Analyt in einer resolubilisierbaren Form einschließt; und
    • (b) einen Absorber zum Absorbieren von Flüssigkeit darin, getrennt von der Probenherstellungszone auf der ersten gegenüberstellbaren Komponente; und
    • (2) eine zweite gegenüberstellbare Komponente, die klappbar an der ersten gegenüberstellbaren Komponente befestigbar ist, einschließend:
    • (a) ein erstes chromatographisches Medium, das erste und zweite Enden aufweist, und darauf einschließend:
    • (i) eine erste Zone des immobilisierten, an das erste chromatographische Medium gebundenen Analyts oder Analogons davon; und
    • (ii) eine zweite Zone eines immobilisierten Moleküls, das ein zweiter Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars mit einer spezifischen Affinität für den ersten, an das erste chromatographische Medium gebundenen Bestandteils ist;
    • (b) ein zweites chromatographisches Medium, das ein erstes Ende und ein zweites Ende aufweist und darauf einschließend eine Vergleichszone, die eine bekannte Menge des auf der Vergleichszone immobilisierten Analyts oder Analogons davon enthält; und
    • (c) eine Vergleichsmarkierungszone, einschließend einen markierten spezifischen Bindungspartner des Analyts oder Analogons davon in einer resolubilisierbaren Form in funktionsfähigem Kontakt mit dem zweiten chromatographischen Medium.
  • Die Vorrichtung gibt eine nachweisbare Anzeige der Gegenwart eines Analyts bei einer Menge, die größer ist als eine vorbestimmte Menge, durch Vergleich der Intensität der Markierung, die an die Nachweiszone des ersten chromatographischen Mediums und an die Vergleichszone des zweiten chromatographischen Mediums gebunden ist.
  • Diese Vorrichtung ist in 1 gezeigt.
  • Die Vorrichtung 10 umfasst eine erste gegenüberstellbare Komponente 12 und eine zweite gegenüberstellbare Komponente 14, die über eine Klappe 16 miteinander befestigt sind. Die erste gegenüberstellbare Komponente 12 umfasst eine Probenherstellungszone 18. Die Probenherstellungszone 18 schließt einen markierten spezifi schen, an einen ersten Bestandteil eines hilfsweisen spezifischen Bindungspaars konjugierten Bindungspartner für einen Analyt in einer Form ein, dass er durch Zugabe einer Flüssigkeit an die Probenherstellungszone 18 resolubilisiert werden kann. Die erste gegenüberstellbare Komponente 12 schließt weiter einen Absorber 20 zur Absorption der Flüssigkeit ein. Der Absorber 20 ist getrennt von der Probenherstellungszone 18 auf der ersten gegenüberstellbaren Komponente 12.
  • Die zweite gegenüberstellbare Komponente 14 schließt ein erstes chromatographisches Medium 22 ein. Das erste chromatographische Medium 22 weist ein erstes Ende 24 und ein zweite Ende 26 auf. Das erste chromatographische Medium 22 schließt darauf ein: (i) eine erste Zone 28 eines immobilisierten, an das erste chromatographische Medium 22 gebundenen Analyts oder Analogons davon und (ii) eine zweite Zone 30 eines immobilisierten Moleküls, das ein zweiter Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars ist, das an das erste chromatographische Medium 22 gebunden ist. Wenn der erste Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars Blotin ist, ist das immobilisierte Molekül mit spezifischer Affinität für Biotin typischerweise Streptavidin, es kann jedoch alternativ dazu Avidin oder ein Antibiotinantikörper sein.
  • Die zweite gegenüberstellbare Komponente 14 schließt auch ein zweites chromatographisches Medium 32 ein. Das zweite chromatographische Medium 32 hat ein erstes Ende 34 und ein zweites Ende 36 und schließt darauf eine Vergleichszone 38 ein, die eine bekannte Menge des auf der Vergleichszone immobilisierten Analyts oder Analogons davon enthält. Der zweite gegenüberstellbare Bestandteil 14 schließt weiter eine Vergleichsmarkierungszone 40 ein, die darauf einen markierten spezifischen Bindungspartner für ein Analyt oder Analogon davon in einer Form einschließt, so dass er durch Zugabe einer Flüssigkeit zur Vergleichsmarkierungszone 40 resolubilisiert werden kann, typischerweise durch eine wässrige Flüssigkeit. Die Vergleichsmarkierungszone 40 ist in funktionsfähigem Kontakt mit dem zweiten chromatographischen Medium 32, so dass, wenn der markierte spezifische Bindungspartner für den Analyt oder das Analogon resolubilisiert ist, er in das zweite chromatographische Medium 32 diffundiert. Die ersten und zweiten chromatographischen Medien 22 und 32 können durch eine Unterstützung 42 unterstützt werden, die ein Kunststoff, wie ein Polycarbonat (Lexan), oder ein anderer undurchlässiger Kunststoff sein kann.
  • Wenn die ersten und die zweiten gegenüberstellbaren Komponenten 12 und 14 von einer Position, in der sie nicht gegenüberliegend sind, in eine gegenüberliegende Position gebracht werden, kommt die Probenherstellungszone 18 in funktionsfähigen Kontakt mit dem ersten Ende 24 des ersten chromatographischen Mediums 22, um die Probe und den markierten spezifischen Bindungspartner für den Analyten, der an den ersten Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars an das chromatographisch Medium konjugiert ist, auf das erste chromatographische Medium 22 aufzubringen. Der Absorber 20 auf der ersten gegenüberstellbaren Komponente 12 kommt in funktionsfähigen Kontakt sowohl mit dem zweiten Ende 26 des ersten chromatographischen Mediums 22 als auch dem zweiten Ende 36 des zweiten chromatographischen Mediums 32, um Flüssigkeit durch das erste und das zweite chromatographische Medium 22 und 32 von ihren ersten Enden 24 und 34 zu ihren zweiten Enden 26 und 36 zu leiten. Der Absorber 20 ist groß genug, so dass er die Flüssigkeit von sowohl dem ersten chromatographischen Medium 22 als auch dem zweiten chromatographischen Medium 32 absorbieren kann.
  • Die zweite gegenüberstellbare Komponente 14 kann eine Öffnung 44 darin aufweisen, um die zweite Zone 30 auf dem ersten chromatographischen Medium 24 und die Vergleichszone 38 auf dem zweiten chromatographischen Medium 32 zu sehen. Die Vorrichtung 10 kann ebenfalls Festhalter wie die Schlösser 46 und 48 umfassen, um die ersten und zweiten gegenüberstellbaren Komponenten 12 und 14 in Gegenüberstellung festzuhalten, und ein Ventil 50 zur Verhinderung des Austretens von Flüssigkeiten aus der Vorrichtung.
  • Vorzugsweise schließt das erste chromatographische Medium 22 auf der zweiten gegenüberstellbaren Komponente 14 weiter einen Durchflusskontrollanzeiger 52 ein. Der Durchflusskontrollanzeiger 52 ist in der Nähe des zweiten Endes 26 des ersten chromatographischen Mediums 22 angeordnet. Wenn ein Durchflusskontrollanzeiger 52 verwendet wird, umfasst die Probenherstellungszone 18 auf der ersten gegenüberstellbaren Komponente 12 weiterhin einen zweiten markierten spezifischen Bindungspartner, der ein Molekül, das im Wesentlichen nicht mit dem Analyt kreuzreaktiv ist, in einer Form bindet, die durch Zugabe einer Flüssigkeit, typischerweise einer wässrigen Flüssigkeit, zur Probenherstellungszone resolubilisiert werden kann. Der Durchflussanzeiger 52 schließt ein Molekül ein, das den zweiten markierten spezifischen Bindungspartner bindet, so dass der Durchflusskontrollanzeiger 52 eine positive Anzeige des Durchflusses gibt, dass dieser durch das erste chromatographische Medium 22 eingetreten ist.
  • Bei der Durchführung des Assays mit der Vorrichtung für den Assay 10, wird eine Probe zu der Probenherstellungszone 18 auf der ersten gegenüberstellbaren Komponente 12 gegeben. Die Probe resolubilisiert den markierten spezifischen Bindungspartner für den Analyt, der an den ersten Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars konjugiert ist, und ebenfalls den zweiten markierten spezifischen Bindungspartner, der das Molekül, das im Wesentlichen nicht mit dem Analyten kreuzreaktiv ist, bindet, um eine Anzeige der Durchflusskontrolle zu geben. Die Vorrichtung für den Assay 10 lässt man anschließend für eine vorbestimmte Zeitdauer, typischerweise 1 Minute bis 10 Minuten, inkubieren. Diese Inkubation kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden, alternativ dazu können die Vorrichtung für den Assay 10 oder die erste gegenüberstellbare Komponente 12 der Vorrichtung für den Assay 10 in einen Inkubator gestellt werden, der die Temperatur auf eine Temperatur, die höher als Raumtemperatur ist, wie beispielsweise 30°C oder 37°C für einen schnelleren Assay erhöht. Selbst höhere Temperaturen können verwendet werden, wenn derartige Temperaturen nicht zur Deaktivierung oder Denaturierung der Antikörper oder anderer spezifischer Bindungspartner führen würden.
  • Nach der Inkubation wird ein Puffer oder ein anderes wässriges Reagens auf die Vergleichsmarkierungszone 40 auf der zweiten gegenüberstellbaren Komponente 14 aufgetragen. Der resolubilisierte markierte spezifische Bindungspartner für den Analyt oder das Analogon davon wird anschließend durch das zweite chromatographische Medium 32 von seinem ersten Ende 34 ausgehend zum zweiten Ende 36 wandern gelassen.
  • Die Vorrichtung für den Assay 10 wird anschließend geschlossen, wobei die ersten und zweiten gegenüberstellbaren Komponenten 12 und 14 gegenübergestellt werden und der resolubilisierte markierte spezifische Bindungspartner für den Analyt, der mit dem ersten Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspartners konjugiert ist, aufgebracht wird und, sofern vorhanden, der zweite markierte spezifische Bindungs partner, der ein Molekül, das nicht kreuzreaktiv mit den Analyten ist, bindet, auf das erste Ende 24 des ersten chromatographischen Mediums 22 aufgebracht wird. Wenn in der Probe ein Analyt vorhanden ist, bindet der markierte spezifische Bindungspartner für den Analyt, der mit dem ersten Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars konjugiert ist, an die erste Zone (Einfangzone) des immobilisierten Analyten oder Analogon 28 auf dem ersten chromatographischen Medium 22. In diesem Fall ist kein Signal an der zweiten Zone 30 (Nachweiszone) nachweisbar, einschließlich des immobilisierten zweiten Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars, das an das erste chromatographische Medium 22 gebunden ist.
  • In jedem Fall, das heißt, ob ein Analyt in der Probe vorhanden ist oder nicht, bindet jedoch der zweite markierte spezifische Bindungspartner ein Molekül, das im Wesentlichen nicht kreuzreaktiv mit dem Analyten ist, an die Durchflusskontrollzone 52 in der Nähe des zweiten Endes 26 des ersten chromatographischen Mediums 22 und gibt eine positive Anzeige, dass ein sauberer Durchfluss durch das erste chromatographische Medium stattgefunden hat.
  • Gleichzeitig dazu wandert der resolubilisierte markierte spezifische Bindungspartner für den Analyten oder Analogon davon, der ursprünglich in der Vergleichsmarkierungszone 40 vorhanden ist, durch das zweite chromatographische Medium 32 ausgehend vom ersten Ende 34 zum zweiten Ende 36, und der resolubilisierte markierte spezifischen Blndungspartner für den Analyt oder Analogon davon bindet anschließend an den immobilisierten Analyten oder Analogon davon, der in einer vorbestimmten Menge in der Vergleichszone 38 auf dem zweiten chromatographischen Medium 32 vorhanden ist.
  • Nach einer Zeitdauer für die Wanderung, typischerweise 1 bis 10 Minuten, sieht der Benutzer die zweite Zone des immobilisierten Analyten 30 auf dem ersten chromatographischen Medium 22 und die Vergleichszone 38 auf dem zweiten chromatographischen Medium 32 durch die Öffnung 42 zum Vergleich der relativen Intensitäten der Markierung in den Zonen, um eine halbquantitative Abschätzung der Konzentration des Analyts in der Testprobe zu erhalten. Falls beispielsweise die Vergleichszone 38 5 ng Analyt enthält, und falls die Intensität, die in der zweiten Zone 30 auf dem ersten chromatographischen Medium 22 größer ist als die Intensität der Vergleichszone 38 auf dem zweiten chromatographischen Medium 32, gibt es nicht mehr als 5 ng an Analyt, die in dem Volumen der aufgebrachten Testprobe in der Testvorrichtung 10 vorhanden sind. Ein großer Bereich von Konzentrationen kann verwendet werden.
  • 2. Assayvorrichtung unter Verwendung einer Kontrolllinie kombiniert mit einem Durchflussanzeiger
  • Eine weitere Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Testvorrichtung verwendet eine kombinierte Kontrolllinie und einen Durchflussanzeiger, die eine halbquantitative Anzeige des Analyten in der Testprobe zur Verfügung stellen. Diese Vorrichtung funktioniert ebenfalls durch ein kompetitives Assayverfahren.
  • Im Allgemeinen umfasst diese Ausführungsform:
    • (1) eine gegenüberstellbare Komponente einschließend:
    • (a) eine Probenherstellungszone einschließend:
    • (i) einen markierten spezifischen, an einen ersten Bestandteil eines hilfsweisen spezifischen Bindungspaars konjugierten Bindungspartner für einen Analyt in resolubilisierbarer Form; und
    • (ii) eine vorbestimmte Menge des Analyts oder eines Analogons davon, der kovalent an einen markierten spezifischen Bindungspartner für ein Molekül, das nicht wesentlich mit dem Analyt kreuzreagiert, gebunden ist, in einer resolubilisierbaren Form; und
    • (b) einen von der Probenherstellungszone getrennten Absorber; und
    • (2) eine zweite gegenüberstellbare Komponente, die ein chromatographisches Medium mit ersten und zweiten Enden einschließt, das chromatographische Medium darauf in gesonderten, nicht überlappenden Zonen einschließend:
    • (a) eine erste, Einfang-, Zone eines immobilisierten, an das chromatographische Medium gebundenen Analyts oder Analogons davon;
    • (b) eine zweite, Nachweis-, Zone, die ein immobilisiertes Molekül, das ein zweiter Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars mit einer spezifischen Affinität für den ersten, an das chromatographische Medium gebundenen Bestandteil ist, einschließt; und
    • (c) eine dritte, Kontroll-, Zone, die ein immobilisiertes Molekül, das befähigt ist, spezifisch an den markierten spezifischen an das chromatographische Medium gebundenen Bindungspartner gebunden zu sein und das kovalent an den Analyt oder das Analogon davon konjugiert ist, einschließt.
  • Diese Ausführungsform der Assayvorrichtung ist in 2 gezeigt. Die Assayvorrichtung 100 weist eine erste gegenüberstellbare Komponente 102 und eine zweite gegenüberstellbare Komponente 104 auf. Die ersten und zweiten gegenüberstellbaren Komponenten 102 und 104 sind über eine Klappe 106 verbunden. Die erste gegenüberstellbare Komponente 102 weist eine Probenherstellungszone 108 auf. Die Probenherstellungszone 108 umfasst: (1) einen markierten spezifischen Bindungspartner für ein Analyt, der an einen ersten Bestandteil eines hilfsweisen spezifischen Bindungspaars in einer Form konjugiert ist, so dass er durch eine Flüssigkeit resolubilisiert werden kann; und (2) eine vorbestimmte Menge des Analyten oder Analogons davon, der an einen markierten spezifischen Bindungspartner für ein Molekül gebunden ist, das nicht wesentlich mit dem Analyten kreuzreagiert, in einer Form, so dass er durch eine Flüssigkeit resolubilisiert werden kann, typischerweise durch eine wässrige Flüssigkeit. Wie vorstehend beschrieben ist, ist der erste Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars typischerweise Biotin und der zweite Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars ist ein immobilisiertes Molekül, das eine spezifische Bindungsaffinität für Biotin aufweist, wie beispielsweise Avidin, Streptavidin oder ein Antibiotinantikörper. Noch typischer ist der zweite Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars Streptavidin. Die erste gegenüberstellbare Komponente 102 weist ebenfalls einen Absorber 110 auf, der von der Probenherstellungszone 108 auf der ersten gegenüberstellbaren Komponente 102 getrennt ist.
  • Die zweite gegenüberstellbare Komponente 104 schließt ein chromatographisches Medium 112 ein, das ein erstes Ende 114 und ein zweites Ende 116 aufweist. Das chromatographische Medium 112 schließt darauf ein: (1) eine erste Einfangzone 118 eines immobilisierten Analyten oder Analogons davon, der an das chromatographische Medium 112 gebunden ist; (2) eine zweite Nachweiszone 120, einschließend ein immobilisiertes Molekül, das ein zweiter Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars mit spezifischer Affinität für den ersten Bestandteil ist, der an das chromatographische Medium 112 gebunden ist; und (3) eine dritte Kontrollzone 122, einschließend ein immobilisiertes Molekül, das in der Lage ist, spezifisch an den markierten spezifischen Bindungspartner der kovalent an den Analyten oder Analogon davon konjugiert ist, der an das chromatographische Medium 112 gebunden ist, gebunden zu werden. Diese Zonen sind so angeordnet, dass die erste Einfangzone 118 dem ersten Ende 114 des chromatographischen Mediums 112 am nächsten ist und die dritte Kontrollzone 122 dem zweiten Ende 116 des chromatographischen Mediums 112 am nächsten ist und wobei die zweite Nachweiszone 120 zwischen der ersten Einfangzone 118 und der dritten Kontrollzone 122 angeordnet ist. Das chromatographische Medium 112 kann durch eine Kunststoffunterstützung 124, wie vorstehend beschrieben ist, unterstützt sein.
  • Die zweite gegenüberstellbare Komponente 104 hat eine Öffnung 126, um einen Teil des chromatographischen Mediums 112, den Teil der die Nachweiszone 120 und die Kontrollzone 122 einschließt, zu sehen. Die ersten und zweiten gegenüberstellbaren Komponenten 102 und 104 können durch Befestigungsmittel wie Schlösser 128 und 130 zusammengehalten werden. Die ersten und zweiten gegenüberstellbaren Komponenten 102 und 104 können von einer Hülle 132 umgeben sein, um das Ausfließen von Flüssigkeiten aus der Vorrichtung zu verhindern.
  • Die ersten und zweiten gegenüberstellbaren Komponenten 102 und 104 sind so konfiguriert, dass das in eine gegenüberliegende Position bringen der ersten und zweiten gegenüberstellbaren Komponenten 102 und 104 von einer Position, in der sie nicht gegenüberliegend sind, den Absorber 110 veranlasst, in funktionsfähigen Kontakt mit dem zweiten Ende des chromatographischen Mediums zu kommen. Es bewirkt ebenso, dass die Probenherstellungszone 108 auf der ersten gegenüberstellbaren Komponente 102 in Kontakt mit dem ersten Ende 114 des chromatographischen Mediums 112 kommt, so dass die Testprobe, der resolubilisierte markierte spezifische Bindungspartner für den Analyt, der auf dem ersten Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars konjugiert ist, und die vorbestimmte Menge des Analyts oder Analogon davon, der an den markierten spezifischen Bindungspartner kovalent gebunden ist, durch das chromatographische Medium 112 vom ersten Ende 114 zum zweiten Ende 116 fließen.
  • Im Betrieb wird die Probe auf die Probenherstellungszone 108 auf der ersten gegenüberstellbaren Komponente 102 gegeben, um die markierten Reagenzien zu resolubilisieren. Die Assayvorrichtung 100 oder die erste gegenüberstellbare Komponente 102 können in einen Inkubator, wie vorstehend für die erste Ausführungsform beschrieben ist, eingeführt werden. Die ersten und zweiten gegenüberstellbaren Komponenten 102 und 104 werden anschließend in eine gegenüberliegende Position gebracht und die Probe und die resolubilisierten markierten Komponenten werden durch das chromatographische Medium 112 vom ersten Ende 114 zum zweiten Ende 116 wandern gelassen.
  • In Abwesenheit eines Analyten bindet der markierte spezifische Bindungspartner für den Analyten, der mit dem ersten Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars konjugiert ist, an die erste Einfangzone 118 des immobilisierten Analyten oder Analogons davon und erreicht nicht die zweite Nachweiszone 120, einschließend den immobilisierten zweiten Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars. Falls jedoch ein Analyt in der Probe vorhanden ist, konkurriert er in Bezug auf die Bindung an den markierten spezifischen Bindungspartner für den Analyten, der an Biotin konjugiert ist, mit dem immobilisierten Analyten oder Analogon davon, der in der ersten Einfangzone 118 vorhanden ist, und wenigstens etwas des markierten spezifischen Bindungspartners für den Analyten erreicht dann die zweite Nachweiszone 120, einschließend den zweiten immobilisierten Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars. Der markierte spezifische Bindungspartner für den Analyten, der an den ersten Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars konjugiert ist, wird anschließend in der zweiten Nachweiszone 120 gebunden und erzeugt zu diesem Zeitpunkt ein nachweisbares Signal. Die Intensität des nachweisbaren Signals ist proportional zur Konzentration des Analyten in der ursprünglichen Testprobe.
  • Jedoch erzeugt die Kontrollzone 122 ein nachweisbares Signal, egal ob ein Analyt in der Probe vorhanden ist, weil die vorbestimmte Menge des Analyten oder Analogons davon, der kolvant an den markierten spezifischen Bindungspartner für das Molekül, das nicht wesentlich mit dem vorhandenen Analyt kreuzreagiert, gebunden ist, in der Probenherstellungszone 108 an das immobilisierte Molekül bindet, das befähigt ist, spezifisch an den markierten spezifischen Bindungspartner in der Kontrollzone 122 gebunden zu werden. Dies ergibt ein konstantes Signal, das sowohl als Kontrollzone für den richtigen Durchfluss durch die Vorrichtung als auch als Vergleichszone dient, so dass eine quantitative Bestimmung der Analytenkonzentration erhalten werden kann.
  • C. Multiplexassayvorrichtungen
  • Obgleich die vorstehend beschriebenen Vorrichtungen in Bezug auf Vorrichtungen beschrieben wurden, die einen einzigen Assay durchführen, können die gleichen Prinzipien verwendet werden, um Multiplexassasyvorrichtungen zu konstruieren, die in der Lage sind, mehr als einen Assay zur gleichen Zeit durchzuführen. Diese Assayvorrichtungen können so konstruiert werden, dass die Assays gleichzeitig für den gleichen oder für verschiedene Analyten durchgeführt werden können. Beispielsweise kann eine Multiplexvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um eine Anzahl verschiedener Analyten oder verschiedener Aliquoten der gleichen Probe zu testen, wie zum Beispiel verschiedene Antibiotika in verschiedenen Aliquoten einer Milchprobe, oder sie kann verwendet werden, um den gleichen Analyten in einer Anzahl von verschiedenen Proben zu testen. Diese letztere Ausführungsform ist insbesondere nützlich beim Testen in Bezug auf einen Krankheitszustand, bei dem die Proben zu verschiedenen Zeiten vom gleichen Patienten der auf den interessierenden Analyten getestet werden muss, entnommen werden. Alternativ dazu können ein oder mehrere der Assays dazu verwendet werden, um Kontrollen oder Referenzstandards zu setzen.
  • Multiplexvorrichtungen gemäß der vorliegenden Erfindung können 2 bis 12 oder mehr Probenherstellungszonen und chromatographische Medien, in Abhängigkeit vom Assay, für den die Vorrichtung verwendet werden soll, enthalten. Typischerweise enthält die Vorrichtung zwei bis fünf getrennte Probenherstellungszonen und Chromatographiemedien.
  • Die Durchführungsprinzipien für die Multiplexassayvorrichtung sind genau die gleichen wie diejenigen für die Assayvorrichtungen, die oben in den 1 und 2 gezeigt sind, mit Ausnahme für die Durchführung von Mehrfachassays auf der gleichen Vorrichtung.
  • Eine Ausführungsform einer Multiplexassayvorrichtung, die das gleiche Prinzip wie dasjenige in 1 benutzt, ist in 3 gezeigt.
  • Im Allgemeinen umfasst diese Vorrichtung:
    • (1) eine erste gegenüberstellbare Komponente einschließend:
    • (a) eine Vielzahl von Probenherstellungszonen, wobei jede Probenherstellungszone einen markierten spezifischen, an einen ersten Bestandteil eines hilfsweisen spezifischen Bindungspaars konjugierten Bindungspartners für ein Analyt in einer resolubilisierbaren Form einschließt; und
    • (b) einen Absorber zum Absorbieren von Flüssigkeit darin, der von den Probenherstellungszonen der ersten gegenüberstellbaren Komponente getrennt ist; und
    • (2) eine zweite gegenüberstellbare Komponente, die klappbar an der ersten gegenüberstellbaren Komponente befestigbar ist; einschließend:
    • (a) eine Vielzahl von ersten chromatographischen Medien, eines für jede Probenherstellungszone, wobei jedes erste chromatographische Medium ein erstes und zweites Ende aufweist und darauf einschließend:
    • (i) eine erste Zone eines immobilisierten, an das erste chromatographische Medium gebundenen Analyts oder Analogons davon; und
    • (ii) eine zweite Zone eines immobilisierten Moleküls, das ein zweiter Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars mit spezifischer Affinität für den ersten, an das erste chromatographische Medium gebundenen Bestandteil ist;
    • (b) eine Vielzahl von zweiten chromatographischen Medien, eines für jede Probenherstellungszone, wobei jedes zweite chromatographische Medium ein erstes Ende und ein zweites Ende aufweist und darauf eine Vergleichszone einschließt, die eine bekannte Menge eines auf der Vergleichszone immobilisierten Analyts oder Analogons davon enthält; und
    • (c) eine Vielzahl von Vergleichsmarkierungszonen, eine für jedes zweite chromatographische Medium, wobei jede Vergleichsmarkierungszone darin einen markierten spezifischen Bindungspartner für den Analyt oder ein Analogon davon in einer resolubilisierbaren Form in funktionsfähigem Kontakt mit dem zweiten chromatographischen Medium einschließt.
  • Bei dieser Version einer Multiplexassayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung kommen, wenn die ersten und zweiten gegenüberstellbaren Komponenten aus einer Position, in der sie nicht gegenüberliegen, in eine gegenüberliegende Position gebracht werden, die Probenherstellungszonen in funktionsfähigen Kontakt mit dem ersten Ende von jedem ersten chromatographischen Medium, um die Probe und den markierten spezifischen, an einen ersten Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspartners konjugierten Bindungspartner für den Analyt auf jedes erste chromatographische Medium aufzubringen, und der Absorber kommt in funktionsfähigen Kontakt mit dem zweiten Ende von jedem ersten chromatographischen Medium und dem zweiten Ende von jedem zweiten chromatographischen Medium, um Flüssigkeit durch die ersten und zweiten chromatographischen Medien von ihren ersten Enden zu ihren zweiten Enden zu leiten. Als Ergebnis davon gibt die Vorrichtung eine nachweisbare Anzeige der Gegenwart eines Analyten in jedem ersten und zweiten chromatographischen Medium für eine Menge, die größer ist als eine vorbestimmte Menge, durch Vergleich der Intensität der Markierung, die an die Nachweiszone jedes ersten chromatographischen Mediums und an die Vergleichszone jedes zweiten chromatographischen Mediums gebunden ist.
  • Die Vorrichtung 200 weist eine erste gegenüberstellbare Komponente 202 und eine zweite gegenüberstellbare Komponente 204, die durch eine Klappe 206 verbunden sind, auf. Die erste gegenüberstellbare Komponente 202 weist eine Vielzahl von Probenherstellungszonen 208 auf. Die erste gegenüberstellbare Komponente 202 weist eine Vielzahl von Absorbern 210 auf, die auf der ersten gegenüberstellbaren Komponente 202 von jeder der Probenherstellungszonen 208 getrennt sind. Alternativ dazu kann ein einziger Absorber 201 verwendet werden, solange es keine Kreuzverunreinigung zwischen den Proben gibt.
  • Die gegenüberstellbare Komponente 204 weist eine Vielzahl von ersten chromatographischen Medien 212 auf, wobei jedes mit einem ersten Ende 214 und einem zweiten Ende 216 versehen ist. Jedes erste chromatographische Medium 212 weist eine erste Einfangzone eines immobilisierten Analyts 218 und eine zweite Nachweiszone eines immobilisierten Moleküls auf, das ein zweiter Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars mit einer spezifischen Affinität für den ersten Bestandteil 220 ist. Jede zweite gegenüberstellbare Komponente 204 weist ebenso eine Vielzahl von zweiten chromatographischen Medien 222 auf, jedes mit einem ersten Ende 224 und einem zweiten Ende 226. Jedes der zweiten chromatographischen Medien 222 weist darauf eine Vergleichszone 228 auf. Die zweite gegenüberstellbare Komponente 204 weist eine Vielzahl von Vergleichsmarkierungszonen 230 auf. Jede der ersten und zweiten Chromatographiemedien 212 und 222 können mit einer Kunststoffunterstützung 232 unterstützt werden. Die zweite gegenüberstellbare Komponente weist eine oder mehrere Öffnungen 234 auf, um die zweiten Einfangzonen 220 und die Vergleichszonen 228 zu sehen. Die chromatographische Vorrichtung weist ebenfalls Schlösser 236 und 238 und eine Umhüllung 240 auf. Vorzugsweise weist jedes erste chromatographische Medium 212 einen Durchflusskontrollanzeiger 242 auf.
  • Eine Multiplexassayvorrichtung, die gemäß den gleichen Prinzipien wie die Assayvorrichtung gemäß 2 funktioniert, ist in 4 gezeigt. Im Allgemeinen umfasst diese Vorrichtung:
    • (1) eine erste gegenüberstellbare Komponente einschließend:
    • (a) eine Vielzahl von Probenherstellungszonen, jede Probenherstellungszone einschließend:
    • (i) einen markierten spezifischen, an einen ersten Bestandteil eines hilfsweisen spezifischen Bindungspaars konjugierten Bindungspartner in einer resolubilisierbaren Form; und
    • (ii) eine vorbestimmte Menge eines Analyts oder eines Analogons davon, der kovalent an einen markierten spezifischen Bindungspartner für ein Molekül, das nicht wesentlich mit dem Analyt kreuzreagiert, gebunden ist, in einer resolubilisierbaren Form; und
    • (b) einen Absorber, der von den Probenherstellungszonen getrennt ist; und
    • (2) eine zweite gegenüberstellbare Komponente, einschließend eine Vielzahl von chromatographischen Medien mit ersten und zweiten Enden, wobei jedes chromatographische Medium in diskreten, nicht überlappenden Zonen darauf einschließt:
    • (a) eine erste Einfangzone des immobilisierten Analyts oder Analogons davon, der an das chromatographische Medium gebunden ist;
    • (b) eine zweite, Nachweiszone eines immobilisierten Moleküls, das ein zweiter Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars mit einer spezifischen Affinität für den ersten, an das chromatographische Medium gebundenen Bestandteil ist; und
    • (c) eine dritte, Kontroll-, Zone, die ein immobilisierbares Molekül einschließt, das befähigt ist, spezifisch an den markierten spezifischen, an das chromatographische Medium gebundenen Bindungspartner gebunden zu sein, und das kovalent an den Analyt oder das Analogon davon konjugiert ist.
  • In dieser Version einer Multiplexassayvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung sind die ersten und zweiten gegenüberstellbaren Komponenten so konfiguriert, dass das in eine gegenüberliegende Position bringen der ersten und zweiten gegenüberstellbaren Komponenten von einer Position, in der sie nicht gegenüberliegend sind, den Absorber veranlasst, in funktionsfähigen Kontakt mit dem zweiten Ende eines jeden chromatographischen Mediums zu kommen. Dies bewirkt ebenfalls, dass die Probenherstellungszonen in Kontakt mit dem ersten Ende eines jeden chromatographischen Mediums kommen, so dass die Testproben, die resolubilisierten markierten spezifischen, an den ersten Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars konjugierten Bindungspartner für den Analyten oder Analogon davon durch das chromatographische Medium von dem ersten Ende zu dem zweiten Ende fließen.
  • Die Assayvorrichtung 300 weist eine erste gegenüberstellbare Komponente 302 und eine zweite gegenüberstellbare Komponente 304 auf, die über eine Klappe 306 verbunden sind. Die erste gegenüberstellbare Komponente 302 weist eine Vielzahl von Probenherstellungszonen 308 und Absorbern 310 auf, die von den Probenherstellungszonen 308 getrennt sind.
  • Die zweite gegenüberstellbare Komponente 304 weist eine Vielzahl von chromatographischen Medien 312, jedes mit einem ersten Ende 314 und einem zweiten Ende 316. Jedes der chromatographischen Medien 312 weist eine erste Einfangzone 318, eine zweite Nachweiszone 320 und eine dritte Kontrollzone 322 auf. Jedes der chromatographischen Medien 312 kann durch eine Kunststoffunterstützung 324 unterstützt werden. Die zweite gegenüberstellbare Komponente 304 weist eine Öffnung oder eine Vielzahl von Öffnungen 302 auf, um die Nachweiszonen 320 und Kontrollzonen 322 zu sehen. Die ersten und zweiten gegenüberstellbaren Komponenten 302 und 304 werden durch Halter wie Schlösser 328 und 330 zusammengehalten und werden von einer Hülle 332 umhüllt, um den Austritt von Flüssigkeiten zu verhindern.
  • Beim Gebrauch werden die Multiplexassayvorrichtungen genauso wie die Assayvorrichtungen, die einzelne Assays, wie sie in den 1 und 2 gezeigt sind, durchführen, verwendet und ermöglichen so eine hinreichende Zeit, um eine Resolubilisierung der Reagenzien auf der Vorrichtung und eine Wanderung durch die chromatographischen Medien zu ermöglichen.
  • II. Analyte und spezifische Bindungspartner
  • A. Analyte
  • Typischerweise werden kompetitive Assays, wie diejenigen, die durch die erfindungsgemäßen Assayvorrichtungen durchgeführt werden, für monovalente Analyte verwendet. Die monovalenten Analyte sind typischerweise Haptene, aber die gleichen Prinzipien können dazu verwendet werden, um jeden Analyt der monovalent ist zu testen, wie beispielsweise normalerweise multivalente Antigene, bei denen die zusätzlichen Antikörper-bindenden Stellen blockiert oder modifiziert sind.
  • Testbare Analyte umfassen die folgenden: Theophyllin, Digoxin, Diisopyramid, Lidocain, Procainamid, Propanolol, Chinidin, Amikacin, Penicillin und andere β-Lactamantibiotika, einschließend Ampicillin, Ampicillinderivate, synthetische und halbsynthetische Penicilline und Cephalosporine, Gentamycin, Kanamycin, Netilmycin, Tobramycin, Tetracyclin, Sulfonamide, wie beispielsweise Phthalylsulfathiazol, Sulfamethizol, Sulfisoxazol, Sulfamethazin, Sulfisomidin, Sulfacetamid, Sulfanilamid, Sulfaphenazol, Sulfamethoxazol, Sulfadiazin, Sulfamethoxydiazin, Sulfamethoxypyridazin, Sulfadimethoxin, Sulfamethoxypyrazin, Sulfadoxin und 4,4'-Diaminodiphenylsulfon, tricyclische Antidepressiva, Ethosuximid, Phenobarbital, Diazepam, Phenytoin, Primidon, Valproinsäure, Acetaminophen, Acetylsalicylsäure, Ibuprofen, Methotrexat, Arzneimittel, die oft missbraucht werden, wie beispielsweise Morphin, Codein, Kokain, Fentanyl, 3-Methylfentanyl, Amphetamine, Lysergsäurediethylamid, Phencyclidin, N,α-Dimethyl-1,3-benzodioxyl-5-ethanamin ("Ecstasy") und Heroin und ihre Metaboliten, DNP, 1-substituierte-4-Hydroxy-2-nitrobenzole, 4-substituierte-2-Nitrotrialkylaniliniumsalze und Umweltkontaminate wie Benzol, Toluol, Xylol, Ethylbenzol, Chlordan, DDT und ihre Metaboliten, 2,4-D, 2,4,5-T und Atrazin.
  • Unter diesen Analyten sind besonders wichtige Analyte β-Lactamantibiotika, Sulfamethazin, Gentamycin und Tetracyclin. Diese Antibiotika treten oftmals in Milch auf und es ist daher erwünscht, ein schnelles Verfahren zu haben, um ihre Gegenwart in Milch festzustellen.
  • B. Spezifische Bindungspartner
  • Spezifische Bindungspartner, die für die Durchführung von Assays unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtungen geeignet sind, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Antikörper und spezifische Bindungsproteine. Ein Beispiel für die letzteren ist das penicillinbindende Protein (PBP), isoliert aus Bacillus stearothermophilus. Andere Beispiele für spezifische Bindungsproteine sind Proteinrezeptoren für Hormone.
  • Typischerweise werden Antikörper gegen Haptene durch Immunisierung eines Antikörper erzeugenden Tiers hergestellt, im Allgemeinen ein Säugetier wie eine Ziege, Kaninchen, Kuh, Pferd oder Schaf, mit einem Hapten, das kovalent an ein Trägerprotein konjugiert ist. Die Konjugation eines Haptens an ein Trägerprotein für die Antikörperproduktion ist im Allgemeinen bevorzugt und kann in einigen Fällen sogar erforderlich sein. Dies liegt daran, dass die meisten Haptene zumindest schwach immunogen sind, wenn sie in ein antikörperproduzierendes Tier ohne Konjugation injiziert werden.
  • Eine Vielzahl von Trägerproteinen ist aus dem Stand der Technik gut bekannt und kann Serumalbumine verschiedener Arten, Schlüssellochnapfschneckenhämocyanin, Thyroglobulin, Ovalbumin, Fibrinogen, Polylysin und gereinigte Proteinderivate von Tuberculin (PPD) einschließen.
  • Eine große Anzahl von Kopplungsreagenzien ist im Stand der Technik bekannt. Unter den Reaktionstypen, die für die Konjugation von Haptenen an Proteine verwendet werden, befinden sich acylierende Reagenzien, alklierende Reagenzien, Redoxreagenzien und elektrophile Reagenzien.
  • Die Wahl der Reaktion hängt typischerweise von den Gruppen, die in dem Hapten für die Reaktion zur Verfügung stehen, ab. Wenn ein Hapten eine freie Carboxylgruppe oder eine Gruppe enthält, die einfach carboxyliert werden kann, schließen weithin verwendete Verfahren die gemischte Anhydridmethode, die Carbodiimidmethode unter Verwendung von Carbodiimiden wie zum Beispiel 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid, N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid oder 1-Cyclohexyl-3(2-morpholinoethyl)carbodiimidmetho-p-toluolsulfonat und die N-Hydroxysuccinimidester-Verfahren, bei dem ein Carbodiimid mit N-Hydroxysuccinimid verestert wird ein.
  • Haptene mit Aminogruppen oder Nitrogruppen, die zu Aminogruppen reduziert werden können, können an Proteine über eine Vielzahl von Reaktionen gekoppelt werden. Wenn die Amine aromatisch sind, können sie zu Diazoniumsalzen durch die langsame Zugabe von Salpetersäure umgewandelt werden und reagieren mit Proteinen bei einem leicht alkalischen pH-Wert. Haptene mit aliphatischen Aminen können an Proteine über verschiedene Verfahren konjugiert werden, wie zum Beispiel die Verwendung von Carbodiimiden, Tolylen-2,4-Diisocyanat, die Verwendung von Maleimid-Verbindungen oder die Reaktion mit Natriumperiodat. Ein weiterer Zugang besteht darin, aliphatische Amine in aromatische Amine durch Reaktion mit p-Nitrobezoylchlorid und anschließender Reduktion zu p-Aminobenzoylamid umzuwandeln, welches anschließend an Proteine über Diazotisierung gekoppelt werden kann.
  • Bifunktionelle Imidatester, die mit Aminogruppen reagieren um Amidine zu bilden, können verwendet werden, um Haptene an Proteine zu konjugieren. Derartige Imidatester schließen Dimethyladipimidat, Dimethylpimelimidat, Dimethylsuberimidat und andere ähnliche Analoga ein.
  • Haptene mit Sulfhydrylgruppen können an Proteine mit Maleimiden konjugiert werden. Andere Reaktionen sind möglich, wie die Aktivierung des Proteins mit Bromacetamidgruppen, oder die Bildung von Disulfidbindungen zwischen dem Träger und dem Hapten in einem Acetatpuffer bei einem pH-Wert von 4,0.
  • Bei Haptenen mit Hydroxylgruppen ist es im Allgemeinen bevorzugt, das Hydroxyl in eine andere Gruppe umzuwandeln. Beispielsweise kann ein Alkohol in den Halbester von Succinsäure umgewandelt werden, wobei eine Carboxylgruppe, die für die Konjugation zur Verfügung steht, eingeführt wird. Das bifunktionelle Reagens Sebacoyldichlorid wandelt einen Alkohol in ein Acylchlorid um, das leicht mit Proteinen bei einem leicht alkalischen pH-Wert reagiert. Phenole können mit diazotisierter p-Aminobenzolsäure aktiviert werden, wobei eine Carboxylgruppe eingeführt wird, und können anschleißend mit dem Träger über eine gemischte Anhydridreaktion, wie vorstehend beschrieben, reagieren. Zucker können durch die Bildung eines p-Nitrophenylglycosids aktiviert werden, gefolgt von der Reduktion der Nitrogruppe zu einer Aminogruppe und Konjugation nach Diazotisierung, wie bei aromatischen Aminen. Ein anderes Verfahren basiert auf der Spaltung von vicinalen Glykolen von Zuckern zu Aldehyden, die anschließend an Amine über reduktive Alkylierung gekoppelt werden. Haptene können ebenfalls über Chlorocarbonate konjugiert werden, die mit äquimolaren Mengen an Phosgen hergestellt werden.
  • Bei Haptenen mit Aldehyd- oder Ketongruppen können Carboxylgruppen einfach durch die Bildung eines O-(Carboxymethyl)oxims eingeführt werden. Ketongruppen können ebenfalls mit p-Hydrazinbenzoesäure derivatisiert werden, um Carboxylgruppen zu erzeugen, die an den Träger, wie vorstehend für Carboxylgruppen beschrieben ist, konjugiert werden. Haptene, die Aldehyde enthalten, können direkt über die Bildung von Schiffbasen konjugiert werden, die durch Reduktion mit Natriumborhydrid stabilisiert werden.
  • Konjugationsmethoden sind ganz allgemein bei P. Tijssen, "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", (Elsevier, Amsterdam, 1985), Kapitel 12, S. 279 – 296 beschrieben. Andere Konjugationsmethoden sind im Stand der Technik bekannt und können für spezielle Haptene verwendet werden.
  • III. Testkits
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sind Testkits zur Durchführung von Assays unter Verwendung von Assayvorrichtungen gemäß der vorliegenden Erfin dung. Diese Testkits umfassen eine Assayvorrichtung der vorstehend in Abschnitt I(B)(1) beschriebenen Ausführungsform mit zwei Chromatograhiemedien.
  • Erfindungsgemäße Testkits können umfassen:
    • (1) die Vorrichtung für den Immunoassay; und
    • (b) eine Flüssigkeit zum Resolubilisieren des markierten spezifischen Bindungspartners für den Analyts oder Analogon davon in jeder Vergleichsmarkierungszone.
  • Die Flüssigkeit ist typischerweise eine wässrige Flüssigkeit. Die wässrige Flüssigkeit ist typischerweise Wasser, eine Salzlösung oder eine gepufferte Lösung, aber es können auch andere wässrige Flüssigkeiten verwendet werden. Die Immunoassayvorrichtung im Testkit kann entweder eine Assayvorrichtung, die einen einzelnen Assay durchführt, oder eine Multiplexassayvorrichtung sein. Falls die Immunoassayvorrichtung eine Multiplexassayvorrichtung ist, umfasst der Kit typischerweise genug Flüssigkeit zum Resolubilisieren des markierten spezifischen Bindungspartners an den Analyt oder Analogon davon in jeder Vergleichsmarkierungszone.
  • Die Testkits gemäß der vorliegenden Erfindung können auch andere Reagenzien enthalten, wie zum Beispiel Reagenzien zum Extrahieren oder zur Behandlung der Probe.
  • Beispiele
  • Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele veranschaulicht. Diese Beispiele haben nur erläuternde Zwecke und sind nicht dazu gedacht, dass sie den Umfang der Erfindung in irgendeiner Weise beschränken.
  • Beispiel 1
  • Assayvorrichtung zum Nachweis von β-Lactamantibiotika in Milch
  • (Prospektives Beispiel)
  • Die Assayvorrichtung, die in diesem Beispiel beschrieben ist, ist für den Nachweis von β-Lactamantibiotika in Milch gedacht (Penicilline, Ampicilline oder Cephalosporine). Sie kann ebenso für andere Assays verwendet werden.
  • Diese Vorrichtung wird gemäß 1 konstruiert. Die gegenüberstellbare Komponente 10 und die zweite gegenüberstellbare Komponente 12 sind festes gebleichtes Sulfit. Die erste gegenüberstellbare Komponente 12 umfasst eine Probenherstellungszone 18, die aus Cytosep hergestellt ist (Ahlstrom Filtration, Holly Springs, PA). Die Probenherstellungszone schließt ein penicillinbindendes Protein, das an Biotin konjugiert ist und mit kolloidalem Gold markiert ist, ein. Die Probenherstellungszone 18 schließt weiter 10% Antikaninchenimmunoglobulin G von einem Tier, wie ein Schaf oder einer Ziege, ein. Das biotinmarkierte penicillinbindende Protein und das Antikaninchenimmunoglobulin G wurden getrennt voneinander mit gleichen Volumina des konjugierten Verdünnungsmittels gemischt (5 mM Borat, 0,1% Triton X-100, 1% Rinderserumalbumin, 5% Sucrose, pH-Wert 8,0) und wurden bei 37°C für 30 Minuten getrocknet.
  • Die zweite gegenüberstellbare Komponente 14 schließt ein erstes chromatographisches Medium 22 aus 20 μM Nitrocellulose (Schleicher & Schuell (Keene, NH)) ein. Das erste chromatographische Medium 22 hat darauf in einer ersten Zone gebunden 28 7-Aminocephalosporansäure, konjugiert an Ziegenimmunoglobulin G und getrocknet auf dem ersten chromatographischen Medium vom Konjugatverdünnungsmittel, wie vorstehend beschrieben ist. Typischerweise hat das chromatographische Medium Dimensionen von ungefähr 0,5 Inch bis ungefähr 1 Inch in seiner Länge und ungefähr 0,125 Inch bis ungefähr 0,375 Inch in Bezug auf seine Breite. Das erste chromatographische Medium hat ebenfalls eine zweite Zone 30 aus Streptavidin, das an das erste chromatographische Medium 22 gebunden ist. Das Streptavidin wird im Konjugatverdünnungsmittel gelöst und wie vorstehend beschrieben getrocknet. Das erste chromatographische Medium 22 schließt weiter einen Durchflusskontrollanzeiger 52 ein, der Kaninchenimmunoglobulin G, gelöst in Konjugatpuffer ist und getrocknet wurde. Das erste chromatographische Medium 22 wird durch eine Unterstützung aus einem Polycarbonatteststreifen (Lexan) 42 unterstützt.
  • Das erste chromatographische Medium 22 schließt ebenfalls einen Durchflusskontrollanzeiger 52 ein, der Kaninchenimmunoglobulin G heruntergetrocknet aus dem Konjugatverdünnungsmittel wie vorstehend beschrieben ist. Das zweite chromatographische Medium 32 besteht aus 20 Mikron Nitrocellulose (Schleicher & Schuell) Die Dimensionen des zweiten chromatographischen Mediums sind typischerweise die gleichen wie diejenigen des ersten chromatographischen Mediums. Das zweite chromatographische Medium 32 umfasst darauf 5 ng Penicillin G, immobilisiert auf dem chromatographischen Medium durch einen Proteinträger, wie ein Schlüssellochnapfschneckenthämocyanin (KLH). Das zweite chromatographische Medium 32 schließt weiter goldmarkiertes Penicillinbindungsprotein als Vergleichsmarkierungszone 40 ein.
  • Bei der Verwendung wird eine Probe aus roher Milch auf die Probenherstellungszone 18 gegeben. Die erste gegenüberstellbare Komponente 12 kann in einen Inkubator gschoben werden. Nach dem Inkubationsschritt werden 2 Tropfen des Reagens A (0,005 M phosphatgepufferte Salzlösung, 0,4% Tween 20, 1,25 mM HEPES, 0,0025% Triton X-100, 0,0015% EDTA, 0,25% Natriumazid, pH-Wert 7,5) zu der Vergleichsmarkierungszone 40 auf der zweiten gegenüberstellbaren Komponente 32 gegeben. Die Vorrichtung wird anschließend geschlossen und die Ergebnisse abgelesen. Wenn die Testlinie weniger intensiv ist als die Kontrolllinie, enthält die Milchprobe weniger als 5 ng an Penicillin G oder ein Äquivalent davon. Wenn umgekehrt die Testlinie intensiver als die Kontrolllinie ist, enthält die Probe mehr als 5 ng Penicillin G. Die Farbe tritt immer an der Durchflusskontrollzone auf vorausgesetzt, dass ein richtiger Durchfluss stattgefunden hat.
  • Beispiel 2
  • Testvorrichtung zum Nachweis von Gentamycin, Sulfmethazin oder Tetracyclin in Milch
  • (Prospektives Beispiel)
  • Eine Vorrichtung zum Nachweis von einem der Antibiotika Gentamycin, Sulfamethazin oder Tetracyclin in Milch wird gemäß Beispiel 1 konstruiert. Mit der Ausnahme, dass das goldmarkierte penicillinbindende Protein, das an Biotin konjugiert ist, auf der Probenherstellungszone 18 der ersten gegenüberstellbaren Komponente 12 durch einen monoklonalen Antikörper für das mit Biotin konjugierte Antibiotikum ersetzt wurde und mit kolloidalem Gold markiert wurde. In gleicher Weise ist die Vergleichsmarkierungszone der gleiche monoklonale Antikörper, der mit kolloidalem Gold markiert ist. Die erste Zone 28 des immobilisierten Antigens oder Analogons davon, das an das erste chromatographische Medium 22 gebunden ist, ist das Antigen, das kovalent an Immunoglobulin G Spezies gebunden ist und das nicht spezifisch durch Antikaninchenimmunoglobulin G Antikörper gebunden ist. Die Kontrolllinie beträgt 5 ng Antigen oder ein Äquivalent, welches auf dem zweiten chromatographischen Medium 32 immobilisiert ist.
  • Andere Konstruktionsdetails und die Durchführung des Assays sind wie in Beispiel 1.
  • Beispiel 3
  • Testvorrichtung zum Nachweis von β-Lactamantibiotika in Milch (alternative Vorrichtung
  • (Prospektives Beispiel)
  • Eine Testvorrichtung zum Nachweis von β-Lactamantibiotika in Milch kann alternativ zur 2 konstruiert werden. Diese Vorrichtung wird gemäß 2 konstruiert. Die ersten und zweiten gegenüberstellbaren Komponenten 102 und 104 sind festes gebleichtes Sulfit. Die Probenherstellungszone 108 schließt 5 ng/ml Penicillin G (oder ein Äquivalent), gebunden an kolloidales Gold über Antikaninchenimmunoglobulin G ein. Die Probenherstellungszone 108 schließt ebenfalls biotinmarkiertes penicillinbindendes Protein, das mit kolloidalem Gold markiert ist, ein. Diese Reagenzien werden in der Probenherstellungszone, wie vorstehend beschrieben, getrocknet, wobei die Probenherstellungszone Cytoseb (Ahlstrom) ist. Der Absorber 110 ist Ahlstrom 270.
  • Die gegenüberstellbare Komponente 104 weist ein chromatographisches Medium 112 auf, das eine 20 Mikron Nitrocellulose (Scleicher & Schuell) ist. Das chromatographische Medium 112 wird durch eine Lexanstütze unterstützt. Das chromatographische Medium 112 schließt darauf ein: (1) die erste Einfangzone 118 von 7- Aminocephalosporansäure, die an Ziegenimmunoglobulin G konjugiert ist und auf dem chromatographischen Medium immobilisiert ist; (2) eine Nachweiszone 120 von Streptavidin wie in Beispiel 1; und (3) eine Kontrollzone 122, die ebenfalls als Durchflussanzeiger dient, die immobilisiertes Kaninchenimmunoglobulin G ist. Beim Gebrauch wird eine Probe roher Milch auf die Probenherstellungszone 108 gegeben und die Testkarte wird in einen Inkubator wie in Beispiel 1 geschoben. Die Vorrichtung wird anschließend geschlossen und die Ergebnisse werden abgelesen. Wenn die Testlinie weniger intensiv als die Kontrolllinie ist, enthält die Milchprobe weniger als 5 ng an Penicillin G oder ein Äquivalent davon. Ist umgekehrt die Testlinie intensiver als die Kontrolllinie, enthält die Probe mehr als 5 ng Penicillin G. In jedem Fall sollte die Kontrolllinie, die ebenfalls als Durchflussanzeiger dient, ein nachweisbares Signal geben.
  • Beispiel 4
  • Testvorrichtung zum Nachweis von Gentamycin, Sulfamethazin oder Tetracyclin in Milch (alternatives Format)
  • (Prospektives Beispiel)
  • Eine Vorrichtung zum Nachweis von Gentamycin, Sulfamethazin oder Tetracyclin in Milch im alternativen Format wird gemäß Beispiel 3 konstruiert mit der Ausnahme, dass die Probenherstellungszone 108 auf der ersten gegenüberstellbaren Komponente 102 5 ng eines Antibiotikums (oder ein Äquivalent davon) aufweist, das kovalent an Antikaninchenimmunoglobulin G, das an kolloidales Gold gebunden ist, gebunden ist, sowie einen monoklonalen Antikörper gegen das Antigen (siehe Beispiel 2), markiert mit kolloidalem Gold und gebunden an Biotin, aufweist.
  • Die Einfangzone 118 auf dem chromatographischen Medium 112 ist das Antigen, das kovalent an Ziegenimmunoglobulin G gebunden ist. Andere Konstruktionsdetails und die Durchführung des Assays sind wie in Beispiel 3.
  • Vorteile der Erfindung
  • Die chromatographischen Assayvorrichtungen gemäß der vorliegenden Erfindung können halbquantitative Assays für eine große Vielzahl von Antigenen und Haptenen durchführen, während sie eine positive Anzeige der richtigen Durchführung des Assays zur Verfügung stellen.
  • Erfindungsgemäße chromatographische Assayvorrichtungen haben ebenso den Vorteil, dass sie aus gegenüberstellbaren Elementen konstruiert sind. Die Verwendung von gegenüberstellbaren Elementen ermöglicht eine große Einsatzmöglichkeit, da sie die Durchführung von Reaktionen in einer Anzahl verschiedener Sequenzen ermöglicht. Dies ist möglich, da die Verwendung derartiger gegenüberstellbarer Elemente die Zufuhr von Reagenzien an genau definierte Regionen eines Teststreifens oder einer anderen Reaktionskomponente ermöglicht. Die Verwendung von gegenüberstellbaren Elementen sorgt ebenso für eine optimale Leistung mit einem minimalen Verbrauch von Reagenzien und gewährleistet so, dass die Reagenzien nicht verschwendet werden, indem sie in den Totvolumina einer Vorrichtung eingebracht werden. Schließlich liefert die Verwendung der gegenüberstellbaren Komponenten eine optimale Verpackung von möglicherweise kontaminierten Blutproben, wie solche, die das HIV- oder das Hepatitisvirus enthalten.
  • Die Verwendung von gegenüberstellbaren Elementen, die durch direkte manuelle Schließung gegenübergestellt werden können, ermöglicht dem Benutzer, erfindungsgemäße Assays ohne die Verwendung weiterer Flüssigkeiten oder zerbrechlicher Kapseln durchzuführen. Dies ermöglicht die Durchführung von Assays ohne die Zugabe weiterer Flüssigkeit, sobald die Probe oder die Proben auf das chromatographische Medium aufgebracht sind, wodurch eine Verdünnung vermieden und die Empfindlichkeit von Assays, die mit den erfindungsgemäßen Assayvorrichtungen durchgeführt werden, beibehalten wird.
  • Außerdem ermöglichen die chromatographischen erfindungsgemäßen Assayvorrichtungen den schnellen und genauen Nachweis von klinisch wichtigen Analyten. Die Konstruktion der Vorrichtungen gestattet eine gleichmäßigere Aufbringung der Proben auf das chromatographische Medium und verringert die Störungen, die in anderenfalls durch teilchenförmige Partikel oder farbige Proben eingeführt werden können. Die Verwendung kolloidaler Metallmarkierungen in einer resolubilisierbaren Form stellt eine extrem schnelle Kinetik der Markierung bereit und verbessert die Leistungsfähigkeit des Assays.
  • Die Testverfahren unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtungen weisen einen großen dynamischen Bereich auf und sind im Wesentlichen frei von falsch negativen Ergebnissen, die bei anderen Testverfahren bei hohen Konzentrationen des Analyts auftreten können.
  • Obgleich die vorliegende Erfindung in beträchtlichem Detail, in Bezug auf bestimmte bevorzugte Versionen davon, beschrieben wurde, sind andere Versionen und Ausführungsformen möglich. Diese Versionen schließen andere Anordnungen von Zwei-Komponentenvorrichtungen ein, die mittels der grundlegenden Prinzipien, wie sie hier beschrieben sind, funktionieren und kompetitive Immunoassays ausführen. Daher ist der Umfang der Erfindung durch die nachstehenden Ansprüche bestimmt.

Claims (18)

  1. Vorrichtung für einen kompetitiven Immunoassay, umfassend (a) eine erste gegenüberstellbare Komponente (12), einschließend (i) eine Probenherstellungszone (18), die einen markierten spezifischen, an einen ersten Bestandteil eines hilfsweisen spezifischen Bindungspaars konjugierten Bindungspartner für einen Analyt in einer resolubilisierbaren Form einschließt, und (ii) einen Absorber (20) zum Absorbieren von Flüssigkeit darin, getrennt von der Probenherstellungszone auf der ersten gegenüberstellbaren Komponente, und (b) eine zweite gegenüberstellbare Komponente (14), die klappbar an der ersten gegenüberstellbaren Komponente befestigbar ist, einschließend (i) ein erstes chromatographisches Medium (22), das erste und zweite Enden aufweist, und darauf einschließend (A) eine erste, Einfang-, Zone (28) des immobilisierten, an das erste chromatographische Medium gebundenen Analyts oder Analogons davon und (B) eine zweite, Nachweis-, Zone (30) eines immobilisierten Moleküls, das ein zweiter Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars mit einer spezifischen Affinität für den ersten, an das erste chromato graphische Medium gebundenen Bestandteil ist, (ii) ein zweites chromatographisches Medium (32), das ein erstes Ende und ein zweites Ende aufweist, und darauf einschließend eine Vergleichszone, die eine bekannte Menge des auf der Vergleichszone immobilisierten Analyts oder Analogons davon enthält, und (iii) eine Vergleichsmarkierungszone (40) darin einschließend einen markierten spezifischen Bindungspartner des Analyts oder Analogons davon in einer resolubilisierbaren Form in funktionsfähigem Kontakt mit dem zweiten chromatographischen Medium, wobei, wenn die ersten und die zweiten gegenüberstellbaren Komponenten von einer Position, in der sie nicht gegenüberliegend sind, in eine gegenüberliegende Position gebracht werden, die Probenherstellungszone in funktionsfähigen Kontakt mit dem ersten Ende des ersten chromatographischen Mediums kommt, um die Probe und den markierten spezifischen, an den ersten Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars konjugierten Bindungspartner des Analyts auf das erste chromatographische Medium aufzubringen, und der Absorber in funktionsfähigen Kontakt mit dem zweiten Ende des ersten chromatographischen Mediums und dem zweiten Ende des zweiten chromatographischen Mediums kommt, um Flüssigkeit durch das erste und das zweite chromatographische Medium von ihrem ersten Ende zu ihrem zweiten Ende durchzuleiten, so daß die Vorrichtung eine nachweisbare vergleichende Anzeige für die Gegenwart eines Analyts gibt.
  2. Immunoassay-Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Probenherstellungszone in der ersten gegenüberstellbaren Komponente weiter einen zweiten markierten spezifischen Bindungspartner, der an ein Molekül bindet, das im wesentlichen nicht mit dem Analyt kreuzreagiert, in einer resolubilisierbaren Form einschließt, und das erste chromatographische Medium weiter einen Durchflußkontrollanzeiger einschließt, der ein den zweiten markierten spezifischen Bindungspartner bindendes Molekül einschließt, so daß der Durchflußkontrollanzeiger eine positive Anzeige, daß ein Durchfluß durch das erste chromatographische Medium eingetreten ist, gibt.
  3. Immunoassay-Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei der erste Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars Biotin ist.
  4. Immunoassay-Vorrichtung nach Anspruch 3, wobei der zweite Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars Streptavidin ist.
  5. Immunoassay-Vorrichtung nach Anspruch 4, wobei der Analyt, die erste Zone des immobilisierten Analyts oder Analogons davon beziehungsweise der markierte spezifische, an Biotin konjugierte Bindungspartner für den Analyt ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus den folgenden Kombinationen: (a) der Analyt ist ein β-Lactam-Antibiotikum, die erste Zone des immobilisierten Analyts oder Analogons davon ist an Immunoglobulin konjugierte 7-Aminocephalosporansäure und der markierte spezifische, an Biotin konjugierte Bindungspartner für den Analyt ist ein biotinyliertes Penicillin-bindendes Protein; und (b) der Analyt ist ein Antibiotikum, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Gentamycin, Sulfamethazin und Tetracyclin, die erste Zone des immobilisierten Analyts oder Analogons davon ist ein kovalent an Immunoglobulin konjugierter Analyt, und der markierte spezifische, an Biotin konjugierte Bindungspartner für den Analyt ist ein biotinylierter Anti-Analyt-Antikörper.
  6. Testkit für den Nachweis und/oder die Bestimmung eines Analyts, umfassend (a) die Immunoassay-Vorrichtung nach Anspruch 1 und (b) eine Flüssigkeit zum Resolubilisieren des markierten spezifischen Bin dungspartners des Analyts oder Analogons davon in der Vergleichsmarkierungszone, wobei die Vorrichtung und die Resolubilisierungsflüssigkeit in dem Kit in getrennten Behältern verpackt sind.
  7. Vorrichtung für einen kompetitiven Immunoassay, umfassend (a) eine erste gegenüberstellbare Komponente (102), einschließend (i) eine Probenherstellungszone (108), einschließend (A) einen markierten spezifischen, an einen ersten Bestandteil eines hilfsweisen spezifischen Bindungspaars konjugierten Bindungspartner für einen Analyt in einer resolubilisierbaren Form und (B) eine vorbestimmte Menge des Analyts oder eines Analogons davon, der kovalent an einen markierten spezifischen Bindungspartner für ein Molekül, das nicht wesentlich mit dem Analyt kreuzreagiert, gebunden ist, in einer resolubilisierbaren Form, und (ii) einen von der Probenherstellungszone getrennten Absorber (110), und (b) eine zweite gegenüberstellbare Komponente (104), die ein chromatographisches Medium (112) mit einem ersten und zweiten Ende einschließt, das chromatographische Medium darauf in gesonderten, nicht-überlappenden Zonen einschließend (i) eine erste, Einfang-, Zone (118) eines immobilisierten, an das chromatographische Medium gebundenen Analyts oder Analogons davon, (ii) eine zweite, Nachweis-, Zone (120), die ein immobilisiertes Molekül, das ein zweiter Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars mit einer spezifischen Affinität für den ersten, an das chromatographische Medium gebundenen Bestandteil ist, einschließt, und (iii) eine dritte, Kontroll-, Zone (122), die ein immobilisiertes Molekül, das befähigt ist, spezifisch an den markierten spezifischen, an das chromatographische Medium gebundenen Bindungspartner gebunden zu sein und das kovalent an den Analyt oder das Analogon davon konjugiert ist, einschließt, wobei die ersten und zweiten gegenüberstellbaren Komponenten so konfiguriert sind, daß das in eine gegenüberliegende Position Bringen der ersten und zweiten gegenüberstellbaren Komponenten von einer Position, in der sie nicht gegenüberliegend sind, den Absorber veranlaßt, in funktionsfähigen Kontakt mit dem zweiten Ende des chromatographischen Mediums zu kommen und die Probenherstellungszone veranlaßt, in Kontakt mit dem ersten Ende des chromatographischen Mediums zu kommen, so daß die Testprobe, der resolubilisierte markierte spezifische, an den ersten Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars konjugierte Bindungspartner für den Analyt und die vorbestimmte Menge des kovalent an einen markierten spezifischen Bindungspartner gebundenen Analyts oder Analogons davon durch das chromatographische Medium von dem ersten Ende zu dem zweiten Ende fließen, so daß die Vorrichtung eine nachweisbare vergleichende Anzeige für die Gegenwart des Analyts gibt.
  8. Immunoassay-Vorrichtung nach Anspruch 7, wobei der erste Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars Biotin ist.
  9. Immunoassay-Vorrichtung nach Anspruch 8, wobei der zweite Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars Streptavidin ist.
  10. Immunoassay-Vorrichtung nach Anspruch 9, wobei der Analyt, der markierte spezifische, an Biotin konjugierte Bindungspartner für den Analyt, der immobilisierte, an der Einfangzone des chromatographischen Mediums gebundene Analyt oder das Analogon davon, der markierte spezifische Bindungspartner für ein Molekül, das nicht wesentlich mit dem Analyt kreuzreagiert, beziehungsweise das immobilisierte, an der Kontrollzone auf dem chromatographischen Medium gebundene Molekül ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus den folgenden Kombinationen: (a) der Analyt ist ein β-Lactam-Antibiotikum, der markierte spezifische, an Biotin konjugierte Bindungspartner für den Analyt ist ein Penicillin-bindendes Protein, der immobilisierte an der Einfangzone auf dem chromatographischen Medium gebundene Analyt oder das Analogon davon ist kovalent an Immunglobulin G konjugierte 7-Aminocephalosporansäure, der markierte spezifische Bindungspartner für ein Molekül, das nicht wesentlich mit dem Analyt kreuzreagiert, ist ein Anti-Kaninchen-Immunglobulin G-Antikörper und das immobilisierte, an der Kontrollzone auf dem chromatographischen Medium gebundene Molekül ist Kaninchen-Immunglobulin G und (b) der Analyt ist ein Antibiotikum, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Gentamycin, Sulfamethazin und Tetracyclin, der markierte spezifische, an Biotin konjugierte Bindungspartner für den Analyt ist ein Anti-Analyt-Antikörper, der markierte spezifische Bindungspartner für ein Molekül, das nicht wesentlich mit dem Analyt kreuzreagiert, ist Anti-Kaninchen-Immunglobulin G, der immobilisierte, an der Bindungszone auf dem chromatographischen Medium gebundene Analyt oder das Analogon davon ist der kovalent an Immunglobulin G einer Art, anders als die Art anders als Kaninchen, gebundene Analyt, und das an der Kontrollzone gebundene immobilisierte Molekül ist Kaninchen-Immunglobulin G.
  11. Vorrichtung für einen kompetitiven Immunoassay nach Anspruch 1, wobei die Vorrichtung umfaßt: (i) eine Vielzahl von Probenherstellungszonen (208), wobei jede Probenherstellungszone einen markierten spezifischen, an einen ersten Bestandteil eines hilfsweisen spezifischen Bindungspaars konjugierten Bindungspartner für einen Analyt in einer resolubilisierbaren Form einschließt, und (ii) eine Vielzahl von ersten chromatographischen Medien (212), eines für jede Probenherstellungszone, wobei jedes erste chromatographische Medium ein erstes und zweites Ende aufweist und darauf einschließend: (A) eine erste, Einfang-, Zone (218) eines immobilisierten, an das erste chromatographische Medium konjugierten Analyts oder Analogons davon und (B) eine zweite, Nachweis-, Zone (220) eines immobilisierten Moleküls, das ein zweiter Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars mit spezifischer Affinität für den ersten, an das erste chromatographische Medium gebundenen Bestandteil ist, (iii) eine Vielzahl von zweiten chromatographischen Medien (222), eines für jede Probenherstellungszone, wobei jedes zweite chromatographische Medium ein erstes Ende und ein zweites Ende aufweist und darauf eine Vergleichszone einschließt, die eine bekannte Menge eines auf der Vergleichszone immobilisierten Analyts oder Analogons davon enthält, und (iv) eine Vielzahl von Vergleichsmarkierungszonen (230), eine für jedes zweite chromatographische Medium, wobei jede Vergleichsmarkie rungszone darin einen markierten spezifischen Bindungspartner für den Analyt oder ein Analogon davon in einer resolubilisierbaren Form in funktionsfähigem Kontakt mit dem zweiten chromatographischen Medium einschließt, wobei, wenn die ersten und zweiten gegenüberstellbaren Komponenten aus einer Position, in der sie nicht gegenüberliegen, in eine gegenüberliegende Position gebracht werden, die Probenherstellungszonen in funktionsfähigen Kontakt mit dem ersten Ende von jedem ersten chromatographischen Medium kommen, um die Probe und den markierten spezifischen, an einen ersten Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspartners konjugierten Bindungspartner für den Analyt auf jedes erste chromatographische Medium aufzubringen, und der Absorber in funktionsfähigen Kontakt mit dem zweiten Ende von jedem ersten chromatographischen Medium und dem zweiten Ende von jedem zweiten chromatographischen Medium kommt, um Flüssigkeit durch die ersten und zweiten chromatographischen Medien von ihren ersten Enden zu ihren zweiten Enden zu leiten, so daß die Vorrichtung eine nachweisbare vergleichende Anzeige für die Gegenwart eines Analyts in mindestens einem ersten und zweiten chromatographischen Medium gibt.
  12. Immunoassay-Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei die Probenherstellungszonen auf der ersten gegenüberstellbaren Komponente weiter jeweils einen zweiten markierten spezifischen Bindungspartner, der an ein Molekül bindet, das nicht wesentlich mit dem Analyt kreuzreagiert, in einer resolubilisierbaren Form einschließen und jedes erste chromatographische Medium weiter einen Durchflußkontrollanzeiger einschließt, der ein Molekül einschließt, das jeden zweiten markierten spezifischen Bindungspartner bindet, so daß jeder Durchflußkontrollanzeiger eine positive Anzeige gibt, daß durch jedes erste chromatographische Medium ein Durchfluß eingetreten ist.
  13. Immunoassay-Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei der erste Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars Biotin ist.
  14. Immunoassay-Vorrichtung nach Anspruch 13, wobei der zweite Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars Streptavidin ist.
  15. Testkit für den Nachweis und/oder die Bestimmung von mindestens einem Analyt, umfassend (a) eine Immunoassay-Vorrichtung nach Anspruch 12 und (b) eine Flüssigkeit zum Resolubilisieren des markierten spezifischen Bindungspartners des Analyts oder Analogons davon in jeder Vergleichsmarkierungszone, wobei die Vorrichtung und die Resolubilisierungsflüssigkeit in dem Kit in getrennten Behältern verpackt sind.
  16. Vorrichtung für einen kompetitiven Immunoassay nach Anspruch 7, wobei die Vorrichtung umfaßt: (i) eine Vielzahl von Probenherstellungszonen (308), jede Probenherstellungszone einschließend: (A) einen markierten spezifischen, an einen ersten Bestandteil eines hilfsweisen spezifischen Bindungspaars konjugierten Bindungspartner für einen Analyt in einer resolubilisierbaren Form, und (B) eine vorbestimmte Menge eines Analyts oder eines Analogons davon, der kovalent an einen markierten spezifischen Bindungspartner für ein Molekül, das nicht wesentlich mit dem Analyt kreuzreagiert, gebunden ist, in einer resolubilisierbaren Form, und (ii) eine Vielzahl von chromatographischen Medien (312) mit einem ersten und zweiten Ende, wobei jedes chromatographische Medium darauf in gesonderten, nicht-überlappenden Zonen (a) eine Einfangzone (318) (b) eine Nachweiszone (320) und (c) eine Kontrollzone (322) einschließt, wobei die ersten und zweiten gegenüberstellbaren Komponenten so konfiguriert sind, daß das in eine gegenüberliegende Position Bringen der ersten und zweiten gegenüberstellbaren Komponenten von einer Position, in der sie nicht gegenüberliegend sind, den Absorber veranlaßt, in funktionsfähigen Kontakt mit dem zweiten Ende von jedem chromatographischen Medium zu kommen, und die Probenherstellungszonen veranlaßt, in Kontakt mit dem ersten Ende von jedem chromatographischen Medium zu kommen, so daß die Testproben, die resolubilisierten markierten spezifischen, an den ersten Bestandteil beziehungsweise des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars konjugierten Bindungspartner für den Analyt und die vorbestimmten Mengen des kovalent an einen markierten spezifischen Bindungspartner gebundenen Analyts oder Analogons davon durch jedes chromatographische Medium von dem ersten Ende zu dem zweiten Ende fließen, so daß die Vorrichtung eine nachweisbare vergleichende Anzeige für die Gegenwart eines Analyts in mindestens einem ersten und zweiten chromatographischen Medium gibt.
  17. Immunoassay-Vorrichtung nach Anspruch 16, wobei der erste Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars Biotin ist.
  18. Immunoassay-Vorrichtung nach Anspruch 17, wobei der zweite Bestandteil des hilfsweisen spezifischen Bindungspaars Avidin ist.
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