DE102019132865A1 - Verfahren und vorrichtung für die analyse von gewebeproben - Google Patents

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Abstract

[121] Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen zum Analysieren des Phänotyps und/oder Genotyps von Zellen, die aus Gewebeproben erhalten wurden. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Analyse der Antwort von Zellen wie erhalten, wenn sie einer Arzneimittelverbindung oder Kombinationen davon ausgesetzt werden. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung bieten den besonderen Vorteil, zeiteffektiv und zur Automatisierung geeignet zu sein.

Description

  • BEREICH DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen zum Analysieren des Phänotyps und/oder Genotyps von Zellen, die aus Gewebeproben erhalten wurden. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Analyse der Antwort von Zellen wie erhalten, wenn sie einer Arzneimittelverbindung oder Kombinationen davon ausgesetzt werden. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung bieten den besonderen Vorteil, zeiteffektiv und zur Automatisierung geeignet zu sein.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Im Allgemeinen werden Arzneimittel, die zu therapeutischen Zwecken entwickelt werden, in einem herkömmlichen Screeningsystem auf ihre Wirksamkeit untersucht, wobei Arzneimittel aus einer Bibliothek in einem geeigneten zellbasierten Assay getestet werden. Üblicherweise werden die Lebensfähigkeit der Zellen und / oder die Zytotoxizität des Wirkstoffkandidaten untersucht. Dieser Ansatz wird häufig mit einem sogenannten Hochdurchsatz durchgeführt, es besteht jedoch immer noch ein hohes Risiko, dass Arzneimittel, die in einem solchen Ansatz als vielversprechend identifiziert wurden, später in den nachfolgenden klinischen Tests enttäuschen.
  • Darüber hinaus hat sich herausgestellt, dass in bestimmten Indikationsfeldern zunehmend Wirkstoffkombinationen verwendet werden, z.B. um die Entwicklung von Resistenzen zu vermeiden oder um synergistische Effekte auszunutzen
  • Bisher wurden fast keine systematischen Ansätze zum Screening potenzieller Wirkstoffkombinationen in einem frühen Stadium offenbart. Herkömmlicherweise werden Wirkstoffe von Ärzten empirisch kombiniert und an Patienten getestet. Es fehlt jedoch ein systematischer Ansatz, um die kombinatorischen Wirkungen einer solchen Wirkstoffkombination wirklich zu untersuchen. Dies bedeutet, dass ein großes Potenzial für eine vielversprechende Wirkstoffkombination besteht, dieses den Patienten jedoch mangels systematischer Untersuchung nie sehen wird.
  • Sobrino et al. (in: 3D microtumors in vitro supported by perfused vascular networks, Scientific Reports volume 6, Article number: 31589 (2016)) offenbaren, dass ein wachsendes Interesse an der Entwicklung mikrophysiologischer Systeme besteht, die zur Modellierung von sowohl normalen als auch pathologischen menschlichen Organen in vitro verwendet werden können. Dieser „Organ-on-Chips“-Ansatz zielt darauf ab, wichtige strukturelle und physiologische Eigenschaften des Zielgewebes zu erfassen. Sie beschreiben in vitro vaskularisierte Mikrotumore (VMTs). Diese „Tumor-on-a-Chip“-Plattform umfasst menschliche Tumor- und Stromazellen, die in einer extrazellulären 3D-Matrix wachsen und deren Überleben von der Nährstoffabgabe durch lebende, perfundierte Mikrogefäße abhängt. Sowohl Darm- als auch Brustkrebszellen wachsen in der Plattform kräftig und sprechen auf Standardtherapien an, wobei sie ein verringertes Wachstum und/oder eine verringerte Regression zeigen. Es können auch vaskuläre Targeting-Wirkstoffe mit unterschiedlichen Wirkmechanismen unterschieden werden, und sie fanden heraus, dass Medikamente, die nur auf VEGFRs (Apatinib und Vandetanib) abzielen, nicht wirksam sind, während Medikamente, die auf VEGFRs, PDGFR und Tie2 abzielen (Linifanib und Cabozantinib), das Gefäßsystem zurückbilden. Tumore in der VMT zeigen eine starke metabolische Heterogenität, wenn sie unter Verwendung von NADH Fluorescent Lifetime Imaging Microscopy abgebildet werden, und im Vergleich zu ihrem umgebenden Stroma zeigen viele ein höheres freies/gebundenes NADH-Verhältnis, was mit ihrer bekannten Präferenz für aerobe Glykolyse übereinstimmt. Die VMT-Plattform wird als einzigartiges Modell für die Untersuchung von vaskularisierten soliden Tumoren in vitro beschrieben.
  • Benton et al. (in: In Vitro Microtumors Provide a Physiologically Predictive Tool for Breast Cancer Therapeutic Screening, Plos One, April 9, 2015, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0123312) offenbaren ein In-vitro-Mikrotumormodell unter Verwendung einer Tumor-ausgerichteten ECM, eines Tumor-ausgerichteten Mediums, MCF-7- und MDA-MB-231-Brustkrebs-Sphäroiden, Endothelzellen der menschlichen Nabelschnurvene und menschlichen Stromazellen, um die Gewebearchitektur und die chemische Umgebung und die zelluläre Organisation eines wachsenden und eindringenden Tumors nachzubilden. Sie untersuchten den Mikrotumor auf Zellproliferation und Invasion in einer tumor-ausgerichteten extrazellulären Matrix, die Kollagenablagerung, Säuregehalt, Glukoseentzug und Hypoxie zeigte.
  • Außerdem muss die Vorhersagbarkeit von Experimenten im Frühstadium für die zukünftige In-vivo-Situation verbessert werden, um das Risiko eines Versagens von Wirkstoffkombinationen zu verringern, die sich in der Präklinik als vielversprechend erwiesen haben.
  • Somit ist es eine Aufgabe der Erfindung, neue und verbesserte Verfahren und Vorrichtungen bereitzustellen, um den Phänotyp und/oder Genotyp von Zellen zu analysieren, die aus Gewebeproben erhalten wurden, wenn diese Zellen gegenüber Wirkstoffen oder Wirkstoffkombinationen ausgesetzt werden, insbesondere um patientenspezifische Behandlungsansätze zu Rationalisieren und diese effektiver zu machen.
  • BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Screening von Wirkstoffen oder Kombinationen davon, insbesondere patientenspezifischen Wirkstoffen oder Kombinationen davon, zu therapeutischen Zwecken. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung das Screening von Wirkstoffen oder Kombinationen, die therapeutisch bei der Behandlung und/oder Prävention verwendet werden können, und für die Verlangsamung des Fortschreitens des neoplastischen oder tumorösen Zellwachstums bei einem Individuum, das diese Behandlung benötigt.
  • In einem ersten Aspekt löst die vorliegende Erfindung die obige Aufgabe durch zur Verfügung stellen eines Verfahrens, insbesondere ein automatisiertes Verfahren, zur Identifizierung einer/s Patienten-spezifischen, insbesondere personalisierten, Wirkstoffes oder Wirkstoffkombination, wobei der Patient an einer neoplastischen Erkrankung oder Tumor leidet oder diese diagnostiziert wurde, wobei das Verfahren umfasst a) Dissoziieren der Zellen einer Patienten-abgeleiteten Gewebeprobe, um dissoziierte Zellen zu erhalten, b) Erzeugen eines Arrays an 3D Mikrogeweben, wie zum Beispiel Mikrotumoren, basierend auf den dissoziierten Zellen von Schritt a), c) In Kontakt bringen des Arrays der 3D Mikrogewebe mit mindestens zwei Wirkstoffen und/oder Kombinationen davon, d) Bestimmen eines Effekts der Wirkstoffe und/oder Kombinationen davon auf den Array der 3D Mikrogewebe, und e) Identifizieren eines Patient-spezifischen Wirkstoffes oder einer Wirkstoffkombination basierend auf dem Effekt wie bestimmt.
  • Die vorliegende Erfindung analysiert Gewebebiopsieproben eines Patienten oder einer vorausgewählten Gruppe von Patienten, die an einer neoplastischen Krankheit oder einem Tumor leiden oder bei denen eine entsprechende Diagnose gestellt wurde. Diese Probe wird verwendet, um 3D-Mikrogewebe zu erzeugen, insbesondere sogenannte „Mikrotumore“, die dann zum Testen auf wirksame und optimal patientenspezifische wirksame therapeutische Wirkstoffe oder Wirkstoffkombinationen zur Behandlung und/oder Vorbeugung der neoplastischen Erkrankung oder verwendet werden. Die Verfahren und Systeme ermöglichen eine schnelle Analyse und Suche nach Wirkstoffen und insbesondere ein Screening auf Wirkstoffe und Wirkstoffkombinationen, die für den tatsächlichen Patienten und/oder eine bestimmte Patientengruppe wirksam sind. Die Verfahren und das System haben ferner den Vorteil, die tatsächliche Situation in vivo genau nachzuahmen, z.B. durch Hinzufügen von Zellen, um eine Mikrotumorumgebung zu schaffen, die mit regulären Screening-Methoden unter Verwendung von Screenings auf Einzelzellbasis nicht erreicht werden kann. In einem Aspekt, wie nachstehend erläutert, kann das Verfahren zusätzlich zu der vom Patienten stammenden Probe von der Analyse einer sogenannten Teilprobe „begleitet“ werden, und diese Teilprobe mindestens einer molekularen Profilbildung, histologischen Analyse und histochemischen Analyse unterzogen werden, wie hier weiter erläutert.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung soll ein 3D-Mikrogewebe ein in vitro erzeugtes Zellaggregat bezeichnen, das Zellen nach Wunsch umfasst. Folglich bedeutet ein Mikrotumor ein 3D-Mikrogewebe, das zumindest teilweise aus ausgewählten Krebszellen erzeugt wird, die aus einer Zelllinie oder einer neoplastischen Probe wie einem Tumor stammen (siehe, zum Beispiel, Rimann et al., An in vitro osteosarcoma 3D microtissue model for drug development, Volume 189, 10 November 2014, Pages 129-135). Diese zwei Begriffe werden hier austauschbar verwendet.
  • m Rahmen der vorliegenden Erfindung ist ein „Array“ ein Set von getrennten 3D Mikrogeweben die getestet/analysiert werden, wie zum Beispiel, 3D Mikrotumore in einer multi-Well-Platte. Ein Array sind mindestens 2 oder mehr, oder 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr, 12, 48, 96, 128, 384 oder mehr, oder sogar 200, 300, 400, oder mehr 3D Mikrotumore/Mikrogewebe.
  • Bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der Erfindung das weiter den Schritt von Auswählen des Patient-spezifischen Wirkstoffes oder Wirkstoffkombination wie identifiziert umfasst, d.h. Isolieren eines bestimmten Sets von Wirkstoffen als Patientenspezifisch, ob als Datensatz oder sogar durch ein physisches zur Verfügung stellen eines Patienten-spezifischen Cocktails von Wirkstoffen.
  • Ein anderer Aspekt betrifft dann ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten, der an einer neoplastischen Erkrankung oder Tumor leidet oder diese diagnostiziert wurde, umfassend Durchführen des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung, und dem Schritt von geeignetem Behandeln des Patient mit einem/r Patienten-spezifischen, insbesondere personalisierten, Wirkstoff oder Wirkstoffkombinationen wie identifiziert.
  • Bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das Verfahren eine Empfehlung im Hinblick auf einen geeigneten Patienten- oder Patientengruppe-spezifischen Wirkstoff oder Wirkstoffkombination zur Verfügung stellt, um den Patienten effektiver zu behandeln, der an einer neoplastischen Erkrankung oder Tumor leidet oder bei dem diese diagnostiziert wurde.
  • In einem bevorzugten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei Dissoziieren der Gewebeprobe umfasst i) falls erforderlich, Zerteilen der Gewebeprobe in kleinere Stücke umfassend Zellen, zum Beispiel Zerteilen der Gewebeprobe und/oder Passieren der Probe durch ein (Mikro-)Sieb, ii) Behandeln der Gewebeprobe mit einer Lösung umfassend mindestens ein Enzym , das in der Lage ist, Zellen in der Gewebeprobe zu dissoziieren, bevorzugt mindestens ein Enzym ausgewählt aus einer Protease, einer Collagenase, Trypsin, Elastase, Hyaluronidase, Papain, Chymotrypsin, Desoxyribonuklease I, und neutrale Protease (Dispase), wobei ein Überstand umfassend dissoziierte Zellen produziert wird, und ii) Entfernen des Überstands umfassend die dissoziierten Zellen, und geeignetes Sammeln der Zellen, wobei Schritte (ii) und (iii) mindestens einmal wiederholt werden. Dieser Schritt kann voll automatisiert werden.
  • In einem anderen Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung wird vor Schritt (ii) die Gewebeprobe mit Ultraschall beschallt, zum Beispiel gepulsten Ultraschall. Dieser Schritt wird durchgeführt, um die Hämolyse zu induzieren, wobei die Energie des Ultraschalls auf einen geeigneten Spiegel so eingestellt wird, um nicht eine substantielle Menge der zu analysierenden Zellen zu zerstören und/oder zu beschädigen, zum Beispiel auf ungefähr 1 MHz, 0,5-5, und bevorzugt 2 Wcm-2, d.h. milder als für die Präparation von DNA oder RNA aus eine Zellprobe. Der Hämolyseschritt unter der Verwendung von Beschallung dauert optimal ungefähr fünf Minuten und richtet sich gegen Zellen, die nicht in die Gewebeumgebung eingebettet vorliegen.
  • Weiter bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei Schritt b) ein Hinzufügen oder Entfernen von Stromazellen, stromalen Fibroblasten, Endothelzellen und Immunzellen zu den dissoziierten Zellen umfasst. Das Hinzufügen oder Entfernen von Zellen hilft bei der Kontrolle der Mikrogewebeumgebung. Besonders bevorzugt ist die Zugabe von Immunzellen, von denen bekannt ist, dass sie mit Tumoren und Zellen im Tumor interagieren und/oder in vivo in Tumoren eindringen, z.B. sogenannte tumorinfiltrierende Immunzellen. Beispiele sind PBMCs, Lymphozyten, rekombinante T-Zellen und dergleichen. Diese Settings und Strategien sind für Tests und Tests im Rahmen der Krebsimmuntherapie von besonderem Vorteil und können darüber hinaus die Zugabe anderer Faktoren wie Zytokine usw. zur Mikrogewebeumgebung umfassen. Sowohl Zellen als auch Faktoren können auch nach der Bildung der/des Mikrogewebe hinzugefügt werden.
  • Dieser Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Tatsache, dass es derzeit keine automatisierten und standardisierten Funktionstestverfahren auf dem Markt gibt, die das Patientenergebnis bei Verwendung von Immunmodulatoren wie CheckpointInhibitoren (z. B. PD1, PD-L1, CTL-4 usw.) bei der Krebsbehandlung vorhersagen. Die Bewertung der klinischen Wirksamkeit dieser Wirkstoffklasse ist besonders schwierig, da die aktuellen Kriterien für die Bewertung der Reaktion bei soliden Tumoren (RECIST) nicht angewendet werden können, da die erste Reaktion auf diese Wirkstoffe üblicherweise eine Tumoranschwellung ist. Das vorläufige Testen dieser Wirkstoffe in einer Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung (insbesondere in einer POC-Vorrichtung) verringert die Unsicherheiten über das therapeutische Ergebnis und ermöglicht somit eine bessere Anpassung der spezifischen Therapie an den Patienten.
  • Um die Wirksamkeit des Immunmodulators zu bewerten, benötigt das Testsystem der vorliegenden Erfindung mindestens zwei Komponenten: (i) Krebszellen und (ii) Immunzellen. Die hier beschriebene Technologie ist auch geeignet, um zusätzliche Zelltypen zu integrieren und hinzuzufügen, die für immunonkologische Testsysteme erforderlich sind, wie z.B. mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs), die entweder frisch vom Patienten isoliert sind oder aus kryokonservierten Proben stammen. Die Skalierbarkeit der Technologie ermöglicht es auch, Effektorzellen (z.B. T-Zellen) und ihre Anzahl (Verhältnisse) in Bezug auf die Anzahl der Krebszellen zu testen, um die Wirksamkeit der jeweiligen Therapie/Therapiekombinationen zu erkennen und sogar zu klassifizieren.
  • Bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei in Schritt b) für jedes 3D Mikrogewebe eine vorbestimmte Zahl an Zellen zur Verfügung gestellt wird, wie zum Beispiel ungefähr 500, ungefähr 1000, ungefähr 2000, ungefähr 5000 oder ungefähr 10000 Zellen, insbesondere lebensfähige Zellen. Dies kann ferner das geeignete Zählen der Zellen vor der Erzeugung der Mikrogewebe umfassen, vorzugsweise unter Verwendung einer geeigneten automatisierten Zellzähleinheit (z.B. von Logos Biosystems, Südkorea).
  • In einem anderen Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung werden in Schritt b) die 3D Mikrogewebe in mindestens einem System ausgewählt aus Hanging Drop-System, und b) einem Multiwell-System, bevorzugt umfassend Ultra Low Adherence (ULA) Wells erzeugt.
  • Bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Erzeugung der 3D Mikrogewebe nicht die Verwendung einer löslichen Basalmembran-Präparation, wie Matrigel® erfordert. Dies hat den Vorteil, dass das gesamte Verfahren bei Temperaturen von oberhalb 4°C, wie zum Beispiel bei Raumtemperatur, durchgeführt werden kann.
  • Bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Erzeugung der 3D Mikrogewebe ein Self-Assembly der Zellen wie umfasst in den dissoziierten Zellen umfasst.
  • Weiter bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Erzeugung der 3D Mikrogewebe eine Reifezeit von ungefähr 6 Stunden bis 7 Tagen, bevorzugt ungefähr 1 bis 6 Tagen, weiter bevorzugt ungefähr 2 bis 5 Tagen umfasst.
  • Weiter bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei 3D Mikrogewebe wie erzeugt eine Größe von ungefähr 350 µm +/- 100 µm aufweisen. Erwünscht und bevorzugt ist eine Größe die für eine korrekte Analyse geeignet ist, insbesondere für die optischen Analyseverfahren wie hier beschrieben.
  • In einem anderen Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung, umfasst das in Kontakt bringen in Schritt c) ein kontinuierliches Aussetzen gegenüber den mindestens zwei Wirkstoffen und/oder Kombinationen davon, und/oder einen Zyklus eines Aussetzens gegenüber und anschließendem Entfernen der mindestens zwei Wirkstoffe und/oder Kombinationen davon, optional für mindestens einen, bevorzugt zwei und mehr Zyklen.
  • In einem anderen Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung sind die Wirkstoffe oder Kombinationen mit denen die 3D Mikrogewebe in Schritt c) in Kontakt gebracht werden ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus zytotoxischen, zytostatischen und/oder chemotherapeutische Mittel, abgezielte Wirkstoffe, immuntherapeutische Mittel und/oder Kombinationen davon. Beispiele für zytotoxische, zytostatische und/oder chemotherapeutische Mittel sind Anastrozol, Azathioprin, Bcg, Bicalutamid, Chloramphenicol, Ciclosporin, Cidofovir, Kohleteer enthaltende Produkte, Colchicin, Danazol, Diethylstilbestrol, Dinoproston, Dithranol enthaltende Produkte, Dutasterid, Estradiol, Exemestan, Finasterid, Flutamid, Ganciclovir, Gonadotrophin, chorionisch, Goserelin, Interferon enthaltende Produkte (einschließlich Peg-Interferon), Leflunomid, Letrozole, Leuprorelinacetat, Medroxyprogesteron, Megestrol, Menotropine, Mifepriston, Mycophenolatmofetil, Nafarelin, Oestrogen enthaltende Produkte, Oxytocin (einschließlich Syntocinon und Syntometrin), Podophyllin, Progesteron enthaltende Produkte, Raloxifen, Ribavirin, Sirolimus, Streptozocin, Tacrolimus, Tamoxifen, Testosteron, Thalidomid, Toremifen, Trifluridin, Triptorelin, Valganciclovir, und Zidovudin. Abgezielte Wirkstoffe sind Medikamente deren Konzentration sich in einigen Teilen des Körper relativ zu anderen anreichert, wie zum Beispiel Antikörper. Beispiele sind in Hirnkrebs: Bevacizumab, Everolimus; Brustkrebsr: Bevacizumab, Everolimus, Lapatinib, Pertuzumab, Trastuzumab und seine Antikörper-Wirkstoff-Konjugate; in Darmkrebs: Aflibercept, Bevacizumab, Cetuximab, Panitumumab, Regorafenib und Dermatofibrosarcoma protuberans: Imatinib. Immuntherapeutische Mittel werden in der Immuntherapie verwendet, die eine Form der Krebsbehandlung ist, welche die Kraft des Immunsystems des Körpers ausnutzt, um Krebs vorzubeugen, zu kontrollieren und zu eliminieren. Beispiele sind monoklonale Antikörper um Krebs zu behandeln, CAR T-Zelltherapie, Immun-Checkpointinhibitoren um Krebs zu behandeln, Krebsvakzine, immunmodulierende Wirkstoffe (IMiDs) und Zytokine.
  • In einem anderen Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Bestimmen des Effekts in Schritt d) ausgewählt aus einer Größenbestimmung des 3D Mikrogewebes, Quantifizierung von interner Reportergen-Expression in dem 3D Mikrogewebe, Bestimmen des intrazellulären ATP Gehalts in dem 3D Mikrogewebe, und Bestimmen von vorbestimmten Biomarkern in dem 3D Mikrogewebe.
  • In noch einem anderen Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die Größenbestimmung des 3D Mikrogewebes mindestens einen Parameter ausgewählt aus Durchmesser, Umfang, Volumen und Bereich des optischen Querschnitts.
  • In noch einem anderen Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die Größenbestimmung des 3D Mikrogewebes die Verwendung eines optischen Verfahrens, wie zum Beispiel die Verwendung einer bildgebenden Vorrichtung. Insbesondere brauchbar ist hochauflösende Scanning Elektronenmikroskopie (HR-SEM).
  • In noch einem anderen Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren weiter die Analyse von Wachstumskinetiken der Zellen und Mikrogewebe. Wachstumskinetiken sind eine autokatalytische Reaktion die annimmt, dass die Wachstumsrate direkt proportional zu der Konzentration an Zellen ist. Die Konzentration an Zellen kann durch direkte und indirekte Methoden gemessen werden, die dem Fachmann bekannt sind und in der Literatur beschrieben sind (z.B. Zellzahl wie oben).
  • In einem anderen Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Patienten-abgeleitete Gewebeprobe ausgewählt aus einer Teilprobe abgeleitet von einer primären Gewebeprobe, einer primären Tumorprobe, und einer metastatischen Probe.
  • Bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die die Gewebeprobe durch ein Verfahren umfassend Kernbiopsie, Tumorresektion, flüssige Biopsie und/oder Nadelaspiration erhalten wurde, sowie anderen Biopsien, Chirurgie und Lavage. Die Gewebeprobe kann erhalten werden von einem Tumor ausgewählt aus der Gruppe von bestätigten oder vermuteten neoplastischen oder kanzerösen Geweben umfassend neoplastisches Lebergewebe, neoplastisches Nierengewebe, neoplastisches Hautgewebe, neoplastisches Prostatagewebe, neoplastisches Brustgewebe, neoplastisches Ovargewebe, neoplastisches Hirngewebe, usw., insbesondere von neoplastischem Lebergewebe, insbesondere von einem primären oder einem metastatischen Lebertumor.
  • Bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Gewebeprobe und/oder die dissoziierten Zellen vor der Erzeugung der 3D Mikrogewebe gefroren und wieder aufgetaut werden.
  • In einem anderen Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren ein zur Verfügung stellen einer primären Gewebeprobe, Erhalten einer Teilprobe zusätzlich zu der Patienten-abgeleiteten Probe und Unterziehen der Teilprobe mindestens einem von molekularem Profiling, histologischer Analyse und histochemischer Analyse. In diesem Aspekt kann parallel zu den 3D Mikrogeweben zusätzliche Patienten- oder Tumor-spezifische Information gesammelt werden durch „Splitting“ des Materials zu Beginn der Analyse, wie zum Beispiel Patientenanamnese, Vererbungsinformation im Hinblick auf den Patienten und genomische Information für den Patienten.
  • In noch einem anderen Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren weiter den Schritt von Erzeugen einer Datenbank umfassend Information wie erzeugt basierend auf den Schritten a) bis e) und/oder umfassend Information im Hinblick auf den Patienten-spezifischen Effekt und/oder die Wirksamkeit eines Wirkstoffes oder Wirkstoffkombination für die Behandlung einer bestimmten neoplastischen Erkrankung oder Tumors. Bevorzugt umfasst dies ein Hinzufügen von zusätzlichen Daten in die Datenbank ausgewählt aus i) Daten über das molekulare Profil der Gewebeprobe, ii) Ergebnisse einer histologischen Analyse der Gewebeprobe, iii) Ergebnisse einer histochemischen Analyse der Gewebeprobe, iv) Patientenanamnese, z.B. ausgewählt aus der Gruppe umfassend Überprüfung/Bestimmung von vitalen Funktionen, Patientengeschichte, Rauchgewohnheiten, sportlichen Aktivitäten, Hormonspiegel, frühere oder jetzige Medikationen, usw., v) Vererbungsinformation im Hinblick auf den Patienten und vi) genomische Information für den Patienten.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft dann ein Verfahren zur Stratifizierung eines Patienten im Hinblick auf eine Behandlung mit einem Patienten-spezifischen Wirkstoff oder Wirkstoffkombination, umfassend ein Durchführen des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung wie oben, und weiter umfassend eine Stratifizierung des Patienten basierend auf dem Patienten-spezifischen Wirkstoff oder Wirkstoffkombination wie identifiziert, bevorzugt in verschiedene Patienten- und/oder Behandlungsgruppen.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft dann ein Verfahren zur Identifizierung von nachteiligen Effekten, die mit einer Behandlung mit einem Patienten-spezifischen Wirkstoff oder Wirkstoffkombination in einem Patienten assoziiert sind, umfassend ein Durchführen des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung wie oben, und weiter umfassend den Schritt von Testen und Analysieren den Patienten-spezifischen Wirkstoff oder Wirkstoffkombination auf nachteilige Effekte in dem Patienten. Ein nachteiliger Effekt in der Form einer „adverse drug reaction“ (ADR) ist eine anzunehmende schädliche oder unangenehme Reaktion, die sich aus einer Intervention ergibt, die mit der Verwendung eines medizinischen Products (Wirkstoff) zusammenhängt, die eine Gefährdung durch eine zukünftige Verabreichung vorhersagt und eine Vorbeugung oder spezifische Behandlung oder Veränderung des Dosierungsschemas oder ein Absetzen des Produkts erforderlich macht (siehe, zum Beispiel, Edwards und Aronson, The Lancet, 356, 1255-1259).
  • Ein anderer wichtiger Aspekt der Erfindung betrifft dann Vorrichtungen, die geeignet sind für und dazu angepasst sind, das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung durchzuführen. Besonders bevorzugte Ausführungsformen von Systemen der vorliegenden Erfindung werden in den Figuren und Beispielen hier beschrieben.
  • Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein System zur Identifizierung einer/s Patienten-spezifischen, insbesondere personalisierten, Wirkstoffes oder Wirkstoffkombination, wobei der Patient an einer neoplastischen Erkrankung oder Tumor leidet oder diese diagnostiziert wurde, das System umfassend a) eine Gewebeprobe dissoziierende Einheit zur Dissoziierung einer Patienten-abgeleiteten Gewebeprobe um dissoziierte Zellen zu erhalten, b) eine Einheit zur Herstellung eines Arrays von 3D Mikrogeweben, wie zum Beispiel Mikrotumoren, basierend auf den dissoziierten Zellen von Schritt a), c) eine Wirkstoff-Testeinheit zum in Kontakt bringen des Arrays der 3D Mikrogewebe mit mindestens zwei Wirkstoffen und/oder Kombinationen davon, d) eine erste Analyseeinheit zur Bestimmung eines Effekts der Wirkstoffe und/oder Kombinationen davon auf den Array der 3D Mikrogewebe, und e) eine zweite Analyseeinheit zur Identifizierung eines Patienten-spezifischen Wirkstoffes oder einer Wirkstoffkombination basierend auf dem Effekt wie bestimmt. Optional kann das System weiter eine Berichtseinheit umfassen, die Information übe die Ergebnisse anzeigt, lagert, speichert.
  • Bevorzugt ist ein System gemäß der vorliegenden Erfindung, weiter umfassend eine Einheit zur Selektion des Patient-spezifischen Wirkstoffes oder der Wirkstoffkombination wie identifiziert.
  • Bevorzugt ist ein System gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Gewebeprobe dissoziierende Einheit mindestens eines umfasst von i) einer pipettierenden Einheit, ii) einem Enzymreservoir, iii) einem Reservoir für Zellkulturmedien, iv) einem Reservoir für Waschlösungen, v) gegebenenfalls, eine Ultraschallvorrichtung, und vi) eine Zentrifugeneinheit.
  • Bevorzugt ist ein System gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Einheit zur Herstellung eines Arrays von 3D Mikrogeweben, wie zum Beispiel Mikrotumoren, basierend auf den dissoziierten Zellen mindestens eines umfasst von i) einer pipettierenden Einheit, ii) einer Zellen zählenden Einheit, und, iii) einem Handhaber für Mikrotiterplatten.
  • Bevorzugt ist ein System gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Wirkstoff testende Einheit mindestens eines umfasst von i) einem Handhaber für Mikrotiterplatten, ii) einer pipettierenden Einheit, iii) einem Reservoir für Zellkulturmedien, iv) einem Array an Reservoirs umfassend mindestens zwei verschiedene Wirkstoffe oder Kombinationen davon, und iv) einer Inkubatoreinheit.
  • Weiter bevorzugt ist ein System gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die erste und/oder zweite Analyseeinheit umfasst i) einen Handhaber für Mikrotiterplatten, und/oder ii) ein bildgebendes System umfassend ein Mikroskop und eine Kamera, und optional einen HR-Scanner.
  • Weiter bevorzugt ist ein System gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Einheit zur Selektion des Patient-spezifischen Wirkstoffes oder der Wirkstoffkombination wie identifiziert eine Computer-Datenbank umfasst, umfassend Patientendaten und Daten über den Effekt der Wirkstoffe und/oder Kombinationen davon auf den Array der 3D Mikrogewebe.
  • Noch weiter bevorzugt ist ein System gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei sich die Gewebeprobe dissoziierende Einheit und die Einheit zur Herstellung eines Arrays von 3D Mikrogeweben die gleiche pipettierende Einheit teilen. Dies stellt ein besonders kompaktes System zur Verfügung.
  • Noch weiter bevorzugt ist ein System gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei sich die Wirkstoff-Testeinheit und die erste Analyseeinheit denselben Handhaber für Mikrotiterplatten teilen. Dies stellt ein besonders kompaktes System zur Verfügung.
  • Ein besonders wichtiger Aspekt des Systems gemäß der vorliegenden Erfindung ist Automatisierung, was schnelle und reproduzierbare Ergebnisse zur Verfügung stellt. Bevorzugt ist daher ein System gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei mindestens eine Einheit davon, und bevorzugt im wesentlichen alle Einheiten davon, in einer automatisierten Weise funktionieren.
  • Noch weiter bevorzugt ist ein System gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Gewebeprobe dissoziierende Einheit und die Einheit zur Herstellung eines Arrays von 3D Mikrogeweben in demselben Gehäuse angeordnet sind. Dies stellt ein besonders kompaktes System zur Verfügung.
  • Noch weiter bevorzugt ist ein System gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Wirkstoff-Testeinheit und die erste Analyseeinheit in demselben Gehäuse angeordnet sind. Dies stellt ein besonders kompaktes System zur Verfügung.
  • Noch weiter bevorzugt ist ein System gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die zwei Gehäuse miteinander verbunden sind um ein diskretes System zu bilden. Bevorzugt beinhaltet dies, dass die Gehäuse in ein gemeinsames System miteinander verbunden sind.
  • In einem anderen Aspekt des Systems gemäß der vorliegenden Erfindung, kann das System als Ganzes oder in Teilen davon sterilisiert werden und/oder umfasst Mittel zur Etablierung und/oder Beibehaltung von sterilen Bedingungen, wie zum Beispiel sterilisiert durch UV Bestrahlung, Ozonbehandlung, Bestrahlung, und/oder schließt Sektionen mit laminarem Fluss ein, usw.
  • In einem anderen wichtigen Aspekt des Systems gemäß der vorliegenden Erfindung, kann das System vertikal angeordnet werden, entweder als Ganzes oder in Teilen davon. Dies stellt ein besonders kompaktes System zur Verfügung, was besonders in einem „point of care“-Aufbau geeignet ist.
  • Ein anderer wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann die Verwendung des Systems gemäß der vorliegenden Erfindung in einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung. Diese Verwendungen betreffen Identifizierung einer/s Patienten-spezifischen, insbesondere personalisierten, Wirkstoffes oder Wirkstoffkombination, wobei der Patient an einer neoplastischen Erkrankung oder Tumor leidet oder diese diagnostiziert wurde; Auswählen eines Patienten-spezifischen Wirkstoffes oder Wirkstoffkombination wie identifiziert; Stratifizierung eines Patienten im Hinblick auf eine Behandlung mit einem Patienten-spezifischen Wirkstoff oder Wirkstoffkombination; Identifizierung von nachteiligen Effekten, die mit einer Behandlung mit einem Patienten-spezifischen Wirkstoff oder Wirkstoffkombination in einem Patienten assoziiert sind; und Verfahren zur Behandlung.
  • Ein anderer wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten, der an einer neoplastischen Erkrankung oder Tumor leidet oder diese diagnostiziert wurde, umfassend Durchführen des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung wie hier beschrieben, und Behandeln des Patient mit einem/r Patienten-spezifischen, insbesondere personalisierten, Wirkstoff oder Wirkstoffkombinationen wie identifiziert.
  • Das Verfahren kann weiterhin ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung berücksichtigen, wobei das Verfahren eine Empfehlung im Hinblick auf einen geeigneten Patienten- oder Patientengruppe-spezifischen Wirkstoff oder Wirkstoffkombination zur Verfügung stellt, um den Patienten effektiver zu behandeln. der an einer neoplastischen Erkrankung oder Tumor leidet oder bei dem diese diagnostiziert wurde. Das Verfahren umfasst weiter den Schritt von Erzeugen einer Datenbank umfassend Information wie erzeugt basierend auf den Schritten a) bis e) und/oder umfassend Information im Hinblick auf den Patienten-spezifischen Effekt und/oder die Wirksamkeit eines Wirkstoffes oder Wirkstoffkombination für die Behandlung einer bestimmten neoplastischen Erkrankung oder Tumors. Bevorzugt umfasst dies ein Hinzufügen von zusätzlichen Daten in die Datenbank ausgewählt aus i) Daten über das molekulare Profil der Gewebeprobe, ii) Ergebnisse einer histologischen Analyse der Gewebeprobe, iii) Ergebnisse einer histochemischen Analyse der Gewebeprobe, iv) Patientenanamnese, z.B. ausgewählt aus der Gruppe umfassend Überprüfung/Bestimmung von vitalen Funktionen, Patientengeschichte, Rauchgewohnheiten, sportlichen Aktivitäten, Hormonspiegel, frühere oder jetzige Medikationen, usw., v) Vererbungsinformation im Hinblick auf den Patienten und vi) genomische Information für den Patienten.
  • Das Verfahren kann weiterhin ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zur Stratifizierung eines Patienten im Hinblick auf eine Behandlung mit einem Patienten-spezifischen Wirkstoff oder Wirkstoffkombination berücksichtigen, umfassend ein Durchführen des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung wie oben, und weiter umfassend eine Stratifizierung des Patienten basierend auf dem Patienten-spezifischen Wirkstoff oder Wirkstoffkombination wie identifiziert, bevorzugt in verschiedene Patienten- und/oder Behandlungsgruppen, und/oder ein Verfahren zur Identifizierung von nachteiligen Effekten, die mit einer Behandlung mit einem Patienten-spezifischen Wirkstoff oder Wirkstoffkombination in einem Patienten assoziiert sind, umfassend ein Durchführen des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung wie oben, und weiter umfassend den Schritt von Testen und Analysieren den Patienten-spezifischen Wirkstoff oder Wirkstoffkombination auf nachteilige Effekte in dem Patienten.
  • Die Ausdrücke „der (vorliegenden) Erfindung“, „in Übereinstimmung mit der Erfindung“, „gemäß der Erfindung“ und ähnliche wie hier verwendet, sind dazu vorgesehen sich auf alle Aspekte und Ausführungsformen der hier beschriebenen und/oder beanspruchten Erfindung zu beziehen.
  • Die Ausdrücke „ungefähr“ und „approximativ“ bedeutet ein Genauigkeitsintervall, das der Fachmann verstehen wird, um die technische Wirkung des fraglichen Merkmals weiterhin sicherzustellen. Der Ausdruck zeigt typischerweise eine Abweichung vom angegebenen Zahlenwert um ± 20%, ± 15%, ± 10% und beispielsweise ± 5% an. Wie der Durchschnittsfachmann erkennen wird, hängt die spezifische solche Abweichung für einen numerischen Wert für einen gegebenen technischen Effekt von der Art des technischen Effekts ab. Beispielsweise kann ein natürlicher oder biologischer technischer Effekt im Allgemeinen eine größere solche Abweichung aufweisen als ein künstlicher oder technisierter technischer Effekt. Wie der Durchschnittsfachmann erkennen wird, hängt die spezifische solche Abweichung für einen numerischen Wert für einen gegebenen technischen Effekt von der Art des technischen Effekts ab. Beispielsweise kann ein natürlicher oder biologischer technischer Effekt im Allgemeinen eine größere solche Abweichung aufweisen als ein künstlicher oder technisierter technischer Effekt. Wenn ein unbestimmter oder bestimmter Artikel verwendet wird wenn auf ein einzelnes Substantiv Bezug genommen wird, z.B. „ein“, „eine“, oder „der/die/das“, dies schließt einen Plural dieses Substantivs ein, sofern nicht ausdrücklich etwas anderes angegeben ist.
  • Es versteht sich, dass die Anwendung der Lehren der vorliegenden Erfindung auf ein spezifisches Problem oder eine spezifische Umgebung und die Einbeziehung von Variationen der vorliegenden Erfindung oder zusätzlicher Merkmale dazu (wie weitere Aspekte und Ausführungsformen) innerhalb der Fähigkeiten eines Durchschnittsfachmanns im Lichte der hierin enthaltenen Lehren liegen.
  • Sofern der Kontext nichts anderes vorschreibt, sind die Beschreibungen und Definitionen der oben dargelegten Merkmale nicht auf einen bestimmten Aspekt oder eine bestimmte Ausführungsform der Erfindung beschränkt und gelten gleichermaßen für alle beschriebenen Aspekte und Ausführungsformen.
  • Alle hier zitierten Referenzen, Patente und Veröffentlichungen werden hiermit in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen
  • Wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck „Probe“ eine klinische Probe, die von einem Patienten erhältlich ist, bei dem der Verdacht auf eine neoplastische Erkrankung besteht, z.B. einem Tumor/Krebs, oder einem Patienten mit bestätigter neoplastischer Erkrankung, z. B. einem Tumor/Krebs. Die Probe kann durch jede bekannte Art von Biopsie erhalten werden, z. B. Nadelbiopsie, Flüssigkeitsbiopsie, Kernbiopsie, Tumorresektion, Nadelaspiration, chirurgische Entfernung von festem neoplastischem Gewebe, wie im Fachgebiet bekannt.
  • Wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck „Behandlung“ jede Art von therapeutischer Intervention, einschließlich Heilung einer Krankheit, Linderung einer Krankheit, Verbesserung der Krankheit, Verlangsamung des Fortschreitens einer Krankheit und dergleichen, sowie die Linderung oder Verbesserung oder Unterdrückung von Krankheitssymptomen wie Schmerzen und dergleichen, insbesondere denjenigen, die mit neoplastischen Krankheiten/Krebs assoziiert sind.
  • Wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck „Prävention“ jede Art von Intervention, die geeignet ist, die Entwicklung einer Krankheit, insbesondere einer neoplastischen Krankheit, zu verhindern, oder die in der Lage ist eine Krankheit oder Krankheitssymptome zu verlangsamen oder die Verschlechterung zu hemmen, insbesondere neoplastische Erkrankungen/Krebs.
  • Wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck „neoplastisch“ jedes Wachstum von Gewebe, das die Wachstumskontrolle verloren hat, einschließlich soliden oder flüssigen Tumoren, Warzen, metastatischem Wachstum, usw.
  • Wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck „Tumor“ benignes oder malignes Gewebe in einem bestimmten Organsystem oder Gewebe, beispielsweise Leber, Niere, Gehirn, Brust, Prostata, Haut, usw.
  • Wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck „Mikroplatte“ jede Anordnung mehrerer Vertiefungen, die als Reaktionsgefäße oder Kulturgefäße verwendet werden können, beispielsweise Platten mit 24 Vertiefungen, Platten mit 48 Vertiefungen, Platten mit 96 Vertiefungen, Platten mit 384 Vertiefungen usw., etc., wie in der Technik bekannt. Es wird auch in Betracht gezogen, einzelne Gefäße zu verwenden und anzuordnen, die nicht notwendigerweise als Platte angeordnet sein müssen, sondern auch informell angeordnete Streifen einzelner Gefäße usw. sein können.
  • Wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck „Beschallung“ die Behandlung eines Gewebes oder von Zellen mit Ultraschall, um dadurch die Integrität bestimmter Zielstrukturen wie roter Blutkörperchen in einem als Hämolyse bezeichneten Prozess zu zerstören. Dies ermöglicht die Entnahme von Hämoglobin aus der Gewebeprobe, was die Analyse der erhaltenen Zellen stören kann, insbesondere die optische Analyse von Zellen aufgrund einer Interferenz des Hämoglobins mit den Nachweismitteln. Die Hämolyse kann auch durch Inkubation von Gewebe in Lösungen mit sehr hoher oder sehr niedriger Osmolalität erreicht werden, die das Platzen oder Schrumpfen der roten Blutkörperchen induziert, durch Behandlung mit bestimmten hämolytischen Enzymen, usw.
  • Wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck „Patient“ einen menschlichen oder nichtmenschlichen Patienten. Der nichtmenschliche Patient kann vorzugsweise ein Säugetier sein, beispielsweise ein Pferd, ein Hund, eine Katze usw., bei denen eine neoplastische Störung/Krebs diagnostiziert wurde oder vermutet wird.
  • Wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck „Wirkstoff‟ ein aktives Mittel, ein kleines Molekül oder ein biotechnologisch hergestelltes Molekül oder eine Kombination von Molekülen, Nukleinsäurekonstrukt(e), z.B. einen Vektor für die Gentherapie, dessen Wirkung in vitro unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren und Mittel getestet werden soll.
  • Wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck „Stratifizierung“ den Prozess, bei dem eine bestimmte Person/ein bestimmter Patient in eine Gruppe eingeteilt wird, die auf eine bestimmte Weise behandelt werden soll.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck „nachteiliger Effekt“ im vorliegenden Zusammenhang jede unerwünschte Nebenwirkung, die mit der Exposition eines hierin definierten Mikrogewebes gegenüber einer bestimmten Verbindung oder einem bestimmten Arzneimittel oder einer Kombination davon verbunden ist und unter anderem umfassen kann, die Förderung des Zellwachstums, Resistenzentwicklung gegen ein bestimmtes Arzneimittel, Verlust der Expression der MHC-Expression, Oberflächenexpression und/oder die Sekretion von Faktoren, die das Immunsystem herunterregulieren usw., die alle darauf hinweisen, dass die Probe-abgeleiteten Zellen von der Exposition einer bestimmten Verbindung weniger betroffen zu sein scheinen/gegen diese resistent zu werden.
  • Die erfindungsgemäßen Elemente werden hier beschrieben. Diese Elemente sind mit spezifischen Ausführungsformen aufgeführt, es versteht sich jedoch, dass sie auf irgendeine Weise und in beliebiger Anzahl kombiniert werden können, um zusätzliche Ausführungsformen zu erzeugen. Die verschieden beschriebenen Beispiele und bevorzugten Ausführungsformen sollten nicht so ausgelegt werden, dass sie die vorliegende Erfindung auf die explizit beschriebenen Ausführungsformen beschränken. Die Beschreibung sollte so verstanden werden, dass sie Ausführungsformen stützt und umfasst, die zwei oder mehr der explizit beschriebenen Ausführungsformen kombinieren oder die eine oder mehrere der explizit beschriebenen Ausführungsformen mit einer beliebigen Anzahl der offenbarten und/oder bevorzugten Elemente kombinieren. Darüber hinaus sollten alle Permutationen und Kombinationen aller in dieser Anmeldung beschriebenen Elemente in der Beschreibung der vorliegenden Anmeldung als offenbart betrachtet werden, sofern der Kontext nichts anderes angibt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die folgenden Gegenstände.
    • Gegenstand 1. Ein bevorzugt automatisiertes Verfahren zur Identifizierung einer/s Patienten-spezifischen, insbesondere personalisierten, Wirkstoffes oder Wirkstoffkombination, wobei der Patient an einer neoplastischen Erkrankung oder Tumor leidet oder diese diagnostiziert wurde, wobei das Verfahren umfasst a) Dissoziieren der Zellen einer Patienten-abgeleiteten Gewebeprobe, um dissoziierte Zellen zu erhalten, b) Erzeugen eines Arrays an 3D Mikrogeweben, wie zum Beispiel Mikrotumoren, basierend auf den dissoziierten Zellen von Schritt a), c) In Kontakt bringen des Arrays der 3D Mikrogewebe mit mindestens zwei Wirkstoffen und/oder Kombinationen davon, d) Bestimmen eines Effekts der Wirkstoffe und/oder Kombinationen davon auf den Array der 3D Mikrogewebe, und e) Identifizieren eines Patienten-spezifischen Wirkstoffes oder einer Wirkstoffkombination basierend auf dem Effekt wie bestimmt.
    • Gegenstand 2. Verfahren nach Gegenstand 1, weiter umfassend den Schritt von Auswählen des Patient-spezifischen Wirkstoffes oder Wirkstoffkombination wie identifiziert.
    • Gegenstand 3. Verfahren nach Gegenstand 1 oder 2, wobei Dissoziieren der Gewebeprobe umfasst
      • i) falls erforderlich, Zerteilen der Gewebeprobe in kleinere Stücke umfassend Zellen,
      • ii) Behandeln der Gewebeprobe mit einer Lösung umfassend mindestens ein Enzym, das in der Lage ist, Zellen in der Gewebeprobe zu dissoziieren, bevorzugt mindestens ein Enzym ausgewählt aus einer Protease, einer Collagenase, Trypsin, Elastase, Hyaluronidase, Papain, Chymotrypsin, Desoxyribonuklease I, und neutrale Protease (Dispase), wobei ein Überstand umfassend dissoziierte Zellen produziert wird, und
      • ii) Entfernen des Überstands umfassend die dissoziierten Zellen, und geeignetes Sammeln der Zellen,
      wobei Schritte (ii) und (iii) mindestens einmal wiederholt werden.
    • Gegenstand 4. Verfahren nach Gegenstand 3, wobei vor Schritt (ii) die Gewebeprobe mit Ultraschall beschallt wird, wobei die Energie des Ultraschalls auf einen geeigneten Spiegel so eingestellt wird, um nicht eine substantielle Menge der Zellen zu zerstören.
    • Gegenstand 5. Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 4, wobei Schritt b) ein Hinzufügen oder Entfernen von Stromazellen, stromalen Fibroblasten, Endothelzellen und Immunzellen zu den dissoziierten Zellen umfasst.
    • Gegenstand 6. Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 5, wobei in Schritt b) für jedes 3D Mikrogewebe eine vorbestimmte Zahl an Zellen zur Verfügung gestellt wird, wie zum Beispiel zwischen 500 und 10000 lebensfähigen Zellen.
    • Gegenstand 7. Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 6, wobei in Schritt b) die 3D Mikrogewebe in mindestens einem System ausgewählt aus Hanging Drop-System, und b) einem Multiwell-System, bevorzugt umfassend Ultra Low Adherence (ULA) Wells erzeugt werden.
    • Gegenstand 8. Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 7, wobei die Erzeugung der 3D Mikrogewebe nicht die Verwendung einer löslichen Basalmembran-Präparation, wie Matrigel® erfordert.
    • Gegenstand 9. Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 8, wobei die Erzeugung der 3D Mikrogewebe ein Self-Assembly der Zellen wie umfasst in den dissoziierten Zellen umfasst.
    • Gegenstand 10. Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 9, wobei die Erzeugung der 3D Mikrogewebe eine Reifezeit von ungefähr 6 Stunden bis 7 Tagen, bevorzugt ungefähr 1 bis 6 Tagen, weiter bevorzugt ungefähr 2 bis 5 Tagen umfasst.
    • Gegenstand 11. Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 10, wobei die 3D Mikrogewebe wie erzeugt eine Größe von 350 µm +/- 100 µm aufweisen.
    • Gegenstand 12. Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 11, wobei das in Kontakt bringen in Schritt c) ein kontinuierliches Aussetzen gegenüber den mindestens zwei Wirkstoffen und/oder Kombinationen davon, und/oder an Aussetzen gegenüber und anschließendes Entfernen der mindestens zwei Wirkstoffe und/oder Kombinationen davon umfasst.
    • Gegenstand 13. Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 12, wobei die Wirkstoffe die mit den 3D Mikrogeweben in Kontakt gebracht werden ausgewählt sind aus zytotoxischen Mitteln, zytostatischen Mitteln, chemotherapeutischen Mitteln, gerichteten Wirkstoffen, immuntherapeutischen Mitteln und Kombinationen davon.
    • Gegenstand 14. Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 13, wobei das Bestimmen des Effekts in Schritt d) ausgewählt ist aus einer Größenbestimmung des 3D Mikrogewebes, Quantifizierung von interner Reportergen-Expression in dem 3D Mikrogewebe, Bestimmen des intrazellulären ATP Gehalts in dem 3D Mikrogewebe, und Bestimmen von vorbestimmten Biomarkern in dem 3D Mikrogewebe.
    • Gegenstand 15. Verfahren nach Gegenstand 14, wobei die Größenbestimmung des 3D Mikrogewebe mindestens einen Parameter ausgewählt aus Durchmesser, Umfang, Volumen und Bereich des optischen Querschnitts umfasst.
    • Gegenstand 16. Verfahren nach Gegenstand 14 oder 15, wobei die Größenbestimmung des 3D Mikrogewebes die Verwendung einer bildgebenden Vorrichtung umfasst.
    • Gegenstand 17. Verfahren nach einem der Gegenstände 14 bis 16, weiter umfassend die Analyse von Wachstumskinetiken.
    • Gegenstand 18. Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 17, wobei die Patienten-abgeleitete Gewebeprobe ausgewählt ist aus einer Teilprobe abgeleitet von einer primären Gewebeprobe, einer primären Tumorprobe, und einer metastatischen Probe.
    • Gegenstand 19. Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 18, wobei die Gewebeprobe durch ein Verfahren umfassend Kernbiopsie, Tumorresektion, flüssiger Biopsie und/oder Nadelaspiration erhalten wurde.
    • Gegenstand 20. Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 18, wobei die Gewebeprobe und/oder die dissoziierten Zellen vor der Erzeugung der 3D Mikrogewebe gefroren und wieder aufgetaut werden.
    • Gegenstand 21. Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 20, umfassend ein zur Verfügung stellen einer primären Gewebeprobe, erhalten einer Teilprobe zusätzlich zu der Patienten-abgeleiteten Probe und Unterziehen der Teilprobe mindestens einem von molekulares Profiling, histologischer Analyse und histochemischer Analyse.
    • Gegenstand 22. Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 21, weiter umfassend den Schritt von Erzeugen einer Datenbank umfassend Information wie erzeugt basierend auf den Schritten a) bis e) und/oder umfassend Information im Hinblick auf den Patientenspezifischen Effekt und/oder die Wirksamkeit eines Wirkstoffes oder Wirkstoffkombination für die Behandlung einer bestimmten neoplastischen Erkrankung oder Tumors.
    • Gegenstand 23. Verfahren nach Gegenstand 22, umfassend ein Hinzufügen von zusätzlichen Daten in die Datenbank ausgewählt aus i) Daten über das molekulare Profil der Gewebeprobe, ii) Ergebnisse einer histologischen Analyse der Gewebeprobe, iii) Ergebnisse einer histochemischen Analyse der Gewebeprobe, iv) Patientenanamnese, v) Vererbungsinformation im Hinblick auf den Patienten und vi) genomische Information für den Patienten.
    • Gegenstand 24. Verfahren zur Stratifizierung eines Patienten im Hinblick auf eine Behandlung mit einem Patienten-spezifischen Wirkstoff oder Wirkstoffkombination, umfassend ein Durchführen des Verfahrens nach einem der Gegenstände 1 bis 23, und weiter umfassend eine Stratifizierung des Patienten basierend auf dem Patientenspezifischen Wirkstoff oder Wirkstoffkombination wie identifiziert.
    • Gegenstand 25. Verfahren zur Identifizierung von nachteiligen Effekten, die mit einer Behandlung mit einem Patienten-spezifischen Wirkstoff oder Wirkstoffkombination in einem Patienten assoziiert sind, umfassend ein Durchführen des Verfahrens nach einem der Gegenstände 1 bis 23, und weiter umfassend den Schritt von Testen und Analysieren den Patienten-spezifischen Wirkstoff oder Wirkstoffkombination auf nachteilige Effekte in dem Patienten.
    • Gegenstand 26. System zur Identifizierung einer/s Patienten-spezifischen, insbesondere personalisierten, Wirkstoffes oder Wirkstoffkombination, wobei der Patient an einer neoplastischen Erkrankung oder Tumor leidet oder diese diagnostiziert wurde, das System umfassend a) eine Gewebeprobe dissoziierende Einheit zur Dissoziierung einer Patienten-abgeleiteten Gewebeprobe um dissoziierte Zellen zu erhalten, b) eine Einheit zur Herstellung eines Arrays von 3D Mikrogeweben, wie zum Beispiel Mikrotumoren, basierend auf den dissoziierten Zellen von Schritt a), c) eine Wirkstoff-Testeinheit zum in Kontakt bringen des Arrays der 3D Mikrogewebe mit mindestens zwei Wirkstoffen und/oder Kombinationen davon, d) eine erste Analyseeinheit zur Bestimmung eines Effekts der Wirkstoffe und/oder Kombinationen davon auf den Array der 3D Mikrogewebe, und e) eine zweite Analyseeinheit zur Identifizierung eines Patientenspezifischen Wirkstoffes oder einer Wirkstoffkombination basierend auf dem Effekt wie bestimmt.
    • Gegenstand 27. System nach Gegenstand 26, weiter umfassend eine Einheit zur Selektion des Patient-spezifischen Wirkstoffes oder der Wirkstoffkombination wie identifiziert.
    • Gegenstand 28. System nach Gegenstand 26 oder 27, wobei die Gewebeprobe dissoziierende Einheit mindestens eines umfasst von i) einer pipettierenden Einheit, ii) einem Enzymreservoir, iii) einem Reservoir für Zellkulturmedien, iv) einem Reservoir für Waschlösungen, v) gegebenenfalls, einer Ultraschallvorrichtung, und vi) einer Zentrifugeneinhei t.
    • Gegenstand 29. System nach einem der Gegenstände 26 bis 28, wobei die Einheit zur Herstellung eines Arrays von 3D Mikrogeweben, wie zum Beispiel Mikrotumoren, basierend auf den dissoziierten Zellen mindestens eines umfasst von i) einer pipettierenden Einheit, ii) einer Zellen zählenden Einheit, und, iii) einem Handhaber für Mikrotiterplatten.
    • Gegenstand 30. System nach einem der Gegenstände 26 bis 30, wobei die Wirkstoff testende Einheit mindestens eines umfasst von i) einem Handhaber für Mikrotiterplatten, ii) einer pipettierenden Einheit, iii) einem Reservoir für Zellkulturmedien, iv) einem Array an Reservoirs umfassend mindestens zwei verschiedene Wirkstoffe oder Kombinationen davon, und iv) einer Inkubatoreinheit.
    • Gegenstand 31. System nach einem der Gegenstände 26 bis 30, wobei die erste und/oder zweite Analyseeinheit umfasst i) einen Handhaber für Mikrotiterplatten, und/oder ii) ein bildgebendes System umfassend ein Mikroskop und eine Kamera, und optional einen HR-Scanner.
    • Gegenstand 32. System nach einem der Gegenstände 27 bis 31, wobei die Einheit zur Selektion des Patient-spezifischen Wirkstoffes oder der Wirkstoffkombination wie identifiziert eine Computer-Datenbank umfasst, umfassend Patientendaten und Daten über den Effekt der Wirkstoffe und/oder Kombinationen davon auf den Array der 3D Mikrogewebe.
    • Gegenstand 33. System nach einem der Gegenstände 26 bis 32 wobei sich die Gewebeprobe dissoziierende Einheit und die Einheit zur Herstellung eines Arrays von 3D Mikrogeweben die gleiche pipettierende Einheit teilen.
    • Gegenstand 34. System nach einem der Gegenstände 26 bis 33, wobei sich die Wirkstoff-Testeinheit und die erste Analyseeinheit denselben Handhaber für Mikrotiterplatten teilen.
    • Gegenstand 35. System nach einem der Gegenstände 26 bis 34, wobei mindestens eine Einheit davon, und bevorzugt im wesentlichen alle Einheiten davon, in einer automatisierten Weise funktionieren.
    • Gegenstand 36. System nach einem der Gegenstände 26 bis 35, wobei die Gewebeprobe dissoziierende Einheit und die Einheit zur Herstellung eines Arrays von 3D Mikrogeweben in demselben Gehäuse angeordnet sind.
    • Gegenstand 37. System nach einem der Gegenstände 26 bis 36, wobei die Wirkstoff-Testeinheit und die erste Analyseeinheit in demselben Gehäuse angeordnet sind.
    • Gegenstand 38. System nach Gegenstand 37, wobei die zwei Gehäuse miteinander verbunden sind um ein diskretes System zu bilden.
    • Gegenstand 39. System nach einem der Gegenstände 26 bis 38, wobei das System als Ganzes oder in Teilen davon sterilisiert werden kann.
    • Gegenstand 40. System nach einem der Gegenstände 26 bis 39, wobei das System Mittel zur Etablierung und/oder Beibehaltung von sterilen Bedingungen umfasst.
    • Gegenstand 41. System nach einem der Gegenstände 26 bis 40, wobei das System zumindest teilweise vertikal angeordnet ist.
    • Gegenstand 42. Verwendung des Systems nach einem der Gegenstände 26 bis 41 in einem Verfahren nach einem der Gegenstände 1 bis 25, insbesondere zur Testung der Effekte von Immuntherapie auf Krebs in einem Patienten.
    • Gegenstand 43. Verfahren zur Behandlung eines Patienten, der an einer neoplastischen Erkrankung oder Tumor leidet oder diese diagnostiziert wurde, umfassend Durchführen des Verfahrens nach einem der Gegenstände 1 bis 25, und Behandeln des Patient mit einem/r Patienten-spezifischen, insbesondere personalisierten, Wirkstoff oder Wirkstoffkombinationen wie identifiziert.
  • 1 verdeutlicht den allgemeinen Arbeitsablauf einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens. Eine Tumorgewebeprobe (1) wird aus einem Patienten erhalten, beispielsweise durch Operation, Kernbiopsie, Kleinnadelaspiration, Kernbiopsie, Tumorresektion, Flüssigkeitsbiopsie und/oder Nadelaspiration. Die Gewebeprobe wird entweder nur durch enzymatischen Abbau oder mit Hilfe von Ultraschallprotokollen zu einer Einzelzelllösung (2) weiterverarbeitet. Die resultierende Einzelzellsuspension wird zur Herstellung von Mikrotumoren in einer nicht anhaftenden Multi-Well-Platte (3) verwendet Nach der Reifung werden die Gewebe für eine begrenzte Zeit mit den für sie interessanten Arzneimitteln behandelt und die daraus resultierenden Auswirkungen auf das Mikrotumorwachstum durch geeignete unterbrechungsfreie Technologien im Laufe der Zeit beobachtet (4). Da der Test die Mikrotumore nicht zerstört, können zusätzliche Tests an den behandelten Mikrotumoren durchgeführt werden, um die Wirksamkeit von Arzneimitteln zu überprüfen (4.1). Die patientenspezifische Wachstumskinetik als Reaktion auf verschiedene Behandlungen wird in eine zentrale Datenbank für die Reaktion auf Wirkstoffe (5) übertragen, um die Ergebnisse zu analysieren und sie in einen breiteren Patientenkontext zu stellen. Nach der Datenanalyse werden die Testergebnisse (6) an die jeweilige Einrichtung übermittelt.
  • 2 zeigt die Anordnung einer bevorzugten Mikrogewebe-Produktionseinheit (System) gemäß der Erfindung - Ausführungsform ohne Beschallung. Das System besteht aus zwei Einheiten, der automatisierten Produktionseinheit und der Wirkstoffprofilbildungseinheit. In einer Ausführungsform besteht die Mikrogewebe/Mikrotumor-Produktionseinheit aus einer vollständig geschlossenen (im Gehäuse eingeschlossenen) und sterilen Umgebung, die eine Ladeöffnung (1) zum Laden der Biopsien sowie der Verdauungsenzyme (z.B. Kollagenase, Trypsin, Elastase, Hyaluronidase, Papain, Chymotrypsin, Desoxyribonuclease I, Neutrale Protease (Dispase), Kulturmedium und gegebenenfalls unterstützende Zellen (Immunzellen, Stromazellen, Stromafibroblasten, Endothelzellen) für den automatisierten Produktionsprozess enthält. Enzyme und Medium werden in der 4° C-Zone (2) gelagert. Flüssigkeiten werden mit einem zentralisierten automatisierten Flüssigkeitshandhabungssystem (5) verarbeitet, wie zum Beispiel (i) Ausblasen von Medium oder Enzymlösungen, (ii) Zugabe aus frischem Medium oder (iii) Zugabe zusätzlicher Stützzellen. Zusätzlich zur 4°C-Zone gibt es eine 37°C-Zone (6) für den enzymatischen Verdau der Gewebeproben. (9) bezeichnet den Platzbedarf für Verbrauchsmaterialien wie Multi-Well-Platten und Zentrifugenröhrchen. Um die Zellennummer für die In-Process-Berechnung der erforderlichen Zellmenge pro Well zu bestimmen, ist in die Vorrichtung (4) ein Zellzähler mit einem Speicherplatz für die erforderlichen Verbrauchsmaterialien (8) integriert. Mit der Zellsuspension gefüllte Multi-Well-Platten werden in einen Inkubator (3) gegeben, der 37°C und 5-10% CO2-Umgebung aufrechterhält. Ein Roboterarm (7) ist zentral positioniert, um alle Betriebseinheiten innerhalb des Geräts zu bedienen. Das gesamte Gerät wird über eine digitale Schnittstelle (10) gesteuert, um die einzelnen Protokolle auszuführen und die Produktionsdaten zur Bewertung der Qualitätskontrolle an ein externes Datenspeichergerät zu übertragen. Das rechnergesteuerte Gerät ermöglicht es, abhängig vom verarbeiteten Gewebetyp verschiedene Produktionsprotokolle auszuführen und die Anzahl lebensfähiger Zellen zu maximieren. In 2B sind drei verschiedene Isolierungsverfahren beispielhaft dargestellt, die auf der Vorrichtung (i) einer mehrstufigen sequentiellen Inkubation mit einem einzelnen Enzym [A] mit einer festen Konzentration verarbeitet werden können. Nach jedem Verdauungsschritt wird die Zellsuspension in eine Stopplösung überführt und der Gewebeprobe frisches Enzym zugesetzt. (ii) eine mehrstufige sequentielle Inkubation mit einem einzelnen Enzym, jedoch mit steigenden Konzentrationen oder (iii) Anwenden verschiedener Enzyme.
  • 3 zeigt die Anordnung einer bevorzugten Mikrogewebe-Produktionseinheit (System) gemäß der Erfindung ähnlich 2 - Ausführungsform mit Beschallung. Das System besteht aus zwei Einheiten, der automatisierten Produktionseinheit und der Wirkstoffprofilbildungseinheit. In einer Ausführungsform besteht die Mikrotumorproduktionseinheit aus einer vollständig eingeschlossenen (im Gehäuse untergebrachten) und sterilen Umgebung die eine Ladeöffnung (1) zum Laden der Biopsien sowie der Verdauungsenzyme (wie oben), des Kulturmediums und gegebenenfalls unterstützender Zellen (wie oben) für den automatisierten Produktionsprozess umfasst. Enzyme und Medium werden in der 4°C-Zone (2) gelagert. Flüssigkeiten werden mit einem zentralisierten automatisierten Flüssigkeitshandhabungssystem (5) verarbeitet, wie (i) Ausblasen von Medium oder Enzymlösungen, (ii) Zugabe von frischem Medium oder (iii) Zugabe von zusätzlichen Zellen (wieder wie oben). Zusätzlich zur 4°C-Zone gibt es eine 37°C-Zone (6) für den enzymatischen Verdau der Gewebeproben. Die 37°C-Zone ist ferner mit einem Ultraschallsystem (11) ausgestattet, um den Zellisolierungsprozess weiter zu erleichtern (Effizienz steigern und Prozesszeit verkürzen). (9) bezeichnet den Platzbedarf für Verbrauchsmaterialien wie Multi-Well-Platten und Zentrifugenröhrchen. Um die Zellennummer für die In-Process-Berechnung der erforderlichen Zellmenge pro Well zu bestimmen, ist in die Vorrichtung (4) ein Zellzähler mit einem Speicherplatz für die erforderlichen Verbrauchsmaterialien (8) integriert. Mit der Zellsuspension gefüllte Multi-Well-Platten werden in einen Inkubator (3) gegeben, der 37°C und 5-10% CO2-Umgebung aufrechterhält. Ein Roboterarm (7) ist zentral positioniert, um alle Betriebseinheiten innerhalb des Geräts zu bedienen. Das rechnergesteuerte Gerät ermöglicht es, abhängig vom verarbeiteten Gewebetyp verschiedene Produktionsprotokolle auszuführen und die Anzahl lebensfähiger Zellen zu maximieren. In 3B sind drei verschiedene Isolierungsverfahren beispielhaft dargestellt, die auf der Vorrichtung zusätzlich zu verschiedenen enzymatischen Profilen mit einem Beschallungssystem verarbeitet werden können.
  • 4 zeigt die Anordnung einer anderen bevorzugten Mikrogewebe-Produktionseinheit (System) gemäß der Erfindung - Ausführungsform mit Beschallung. In dieser Ausführungsform besteht die Mikrogewebe-Wirkstoffprofilbildungseinheit aus einer vollständig eingeschlossenen (im Gehäuse untergebrachten) und sterilen Umgebung die eine Ladeöffnung (1) zum Laden der Mikro-Well-Platte enthaltend Mikrotumore sowie Krebs-Typ spezifisches Erhaltungsmedium, eine vorgefertigte Wirkstoffmatrix und gegebenenfalls zusätzliche für die Testung erforderliche Zellen. Wirkstoffe, Medium und Zellen werden in der 4°C Zone (2) gelagert. Flüssigkeiten werden mit einem zentralisierten automatisierten Flüssigkeitshandhabungssystem (5) verarbeitet, wie (i) Transferieren der Wirkstoffe von der Matrix zu den Mikrotumoren, (ii) Entfernen der Wirkstoffe, (iii) Mediumwechsel oder (iv) Zugabe von ergänzenden Zellen. Multi-Well-Platten gefüllt mit der Zellsuspension werden in einen Inkubator (3) gegeben, der 37°C und 5-10% CO2-Umgebung aufrechterhält. Die Nachweisvorrichtung (4) nimmt die Mikroplatte auf, um Behandlungs-spezifische Wachstumskinetiken zu erzeugen. Ein Roboterarm (7) ist zentral positioniert, um alle Betriebseinheiten innerhalb des Geräts zu bedienen. Rohdaten werden in eine zentralisierte Datenbank zur Analyse transferiert..
  • 5 zeigt die Anordnung eines Mikrogewebe-Produktionssystems gemäß der Erfindung, kombiniert mit einer Wirkstoffprofilbildungseinheit. Die Vorrichtung besteht aus den beiden Einheiten der automatisierten Produktion und der Wirkstoffprofilbildungseinheit. In einer Ausführungsform besteht die Mikrogewebe-Wirkstoffprofilbildungseinheit aus einer vollständig eingeschlossenen (im Gehäuse untergebrachten) und sterilen Umgebung die eine Ladeöffnung (1) zum Laden der Biopsien sowie der Verdauungsenzyme (wie oben), Kulturmedium, Wirkstoffe und gegebenenfalls unterstützende Zellen (wie oben) für den automatisierten Produktions- und Wirkstofftestungsprozess. Enzyme, Wirkstoffe und Medium werden in der 4°C Zone (2) gelagert. Flüssigkeiten werden mit einem zentralisierten automatisierten Flüssigkeitshandhabungssystem (5) verarbeitet, wie (i) Ausblasen von Medium oder Enzymlösungen, (ii) Zugabe von frischem Medium, (iii) Zugabe von Wirkstoff und Entfernung oder (iv) Zugabe von zusätzlichen Zellen. Zusätzlich zur 4°C-Zone gibt es eine 37°C-Zone (6) für den enzymatischen Verdau der Gewebeproben. (9) bezeichnet den Platzbedarf für Verbrauchsmaterialien wie Multi-Well-Platten und Zentrifugenröhrchen. Um die Zellennummer für die In-Process-Berechnung der erforderlichen Zellmenge pro Well zu bestimmen, ist in die Vorrichtung (4) ein Zellzähler mit einem Speicherplatz für die erforderlichen Verbrauchsmaterialien (8) integriert. Mit der Zellsuspension gefüllte Multi-Well-Platten werden in einen Inkubator (3) gegeben, der 37°C und 5-10% CO2-Umgebung aufrechterhält. Ein Roboterarm (7) ist zentral positioniert, um alle Betriebseinheiten innerhalb des Geräts zu bedienen. Die gesamte Vorrichtung wird über eine digitale Schnittstelle (10) kontrolliert, um die einzelnen Protokolle abzuarbeiten und die Produktionsdaten zu einer externen Datenspeichervorrichtung zur Ermittlung der Qualitätskontrolle und Datenanalyse zu transferieren.
  • 6 zeigt die Anordnung einer bevorzugten Ausführungsform des Systems gemäß der vorliegenden Erfindung in einer vertikalen Anordnung. In einer Ausführungsform werden die individuellen Arbeitseinheiten und Phasen in einer vertikalen Anordnung organisiert, um den erforderlichen Flächenverbrauch der Vorrichtung zu minimieren. Innerhalb dieser Ausführungsform kann die Flüssigkeits-Handhabungsabteilung an der Oberseite der Vorrichtung (1) lokalisiert sein, gefolgt von der Nachweisabteilung im mittleren Sektor (2). Die Inkubationseinheit kann am Boden der Vorrichtung (3) lokalisiert sein. Alle Abschnitte werden mit einem automatisierten Roboterarm (4) betrieben.
  • 7 zeigt einen schematischen beispielhaften Arbeitsablauf für die Testung von Chemotherapeutika gemäß der vorliegenden Erfindung. Hier basiert der Arbeitsablauf um automatisch Chemotherapeutika zu testen auf Wachstumskinetiken eines Tumors.
  • 8 zeigt einen schematischen beispielhaften Arbeitsablauf für die Testung von immunmodulatorischen Wirkstoffen. Ähnlich zu 7 basiert der beispielhafte Arbeitsablauf, um automatisch immunmodulatorische Wirkstoffe zu testen, auf Wachstumskinetiken eines Tumors.
  • 9 zeigt Bilder von NSCLC Mikrotumorbildung vier Tage nach Gewebedissoziierung von 4 einzelnen NSCLC (#001 bis #004) und 1 Pankreaskrebs-Patienten (PC #004). Drei repräsentative Mikrogewebe pro Patient sind gezeigt. Balken ist 250 µm.
  • 10 zeigt die Produktions-Robustness und Größenverteilung von Mikrotumoren wie erzeugt von primärem Tumorgewebe von nicht-kleinen Zellen Lungenkrebspatienten. 5ooo Zellen wurden in jede Well einer 96-nicht-adhäsiven Well-Platte angesät und für 4 Tage (Beispiel 2) inkubiert.
  • BEISPIELE
  • Bestimmte Aspekte und Ausführungsformen der Erfindung werden nun beispielhaft und unter Bezugnahme auf die hierin dargestellte Beschreibung, Figuren und Tabellen veranschaulicht. Solche Beispiele der Verfahren, Verwendungen und anderen Aspekte der vorliegenden Erfindung sind nur beispielhaft und sollten nicht dazu dienen, den Umfang der vorliegenden Erfindung nur auf solche repräsentative. Beispiele zu beschränken.
  • Beispiel 1
  • Gewebeerzeugung und Testung
  • Eine von einem Patienten erhaltene Gewebebiopsieprobe wird in ein geeignetes Medium gegeben, nämlich eine Transportlösung, die Antibiotika umfasst. Optional kann eine hypotonische Lösung zur weiteren Verarbeitung hinzugefügt werden. Das Gewebebiopsie-Probenmaterial wird bei etwa 4°C versandt. Für eine 100 mg Gewebebiopsieprobe wird ein Volumen von 1,5 ml Transportmedium verwendet, das die Gewebeprobe umfasst.
  • In Schritt 2 wird für eine Hämolyse zur Lyse roter Blutkörperchen die Gewebeprobe einer Ultraschallbehandlung unter Verwendung eines handelsüblichen Ultraschallgeräts bei etwa 1 MHz, 2 Wcm-2 für 5 Minuten unterzogen. Es wird darauf geachtet, ein Erhitzen der Gewebeprobe zu vermeiden, um die Unversehrtheit der Zellen im Wesentlichen aufrechtzuerhalten. Die Temperatur wird bei etwa 4°C gehalten. Der Hämolyseschritt unter Verwendung der Ultraschallbehandlung dauert etwa fünf Minuten und zielt auf Zellen ab, die nicht in die Gewebeumgebung eingebettet sind.
  • Nach der Ultraschallbehandlung wird das Medium entfernt und durch ein Medium zur Gewebedissoziation ersetzt (Schritt 3). Hierzu werden ein oder mehrere lytische geeignete Enzyme in einem geeigneten Puffersystem für mehrere Zyklen verwendet, beispielsweise 4 Zyklen, jeweils für etwa 10 bis 15 Minuten. Die Anzahl und Länge der Zyklen kann an den Fortschritt der Gewebeverdauung angepasst werden, indem beispielsweise zuerst starke und danach ansteigende mildere Bedingungen verwendet werden. Die Gewebedissoziation findet in einem Volumen von etwa 1 ml bei einer Temperatur von etwa 37°C und etwa 60 Minuten statt.
  • Anschließend wird der Lyse-Lösung eine Stopp-Lösung (STOP) (6 ml) zugesetzt, die Pferdeserum und solubilisiertes Kollagen enthält, um die enzymatische Aktivität zu stoppen. Das Endvolumen dieser Reaktionsmischung beträgt 10 ml, und die Lösung wird bei 4°C gehalten. Die erhaltenen Zellen werden gewaschen, um Zelltrümmer durch mittels Schwerkraft erzwungene Sedimentation von Zellen für 10 Minuten in 2 × 5 ml in Produktionsmedium (DMEM + 10% FCS) zu entfernen. Während die Zelltrümmer in der Lösung schwimmen, sedimentieren die Zellen auf den Boden des Röhrchens. Anschließend werden große Gewebetrümmer entfernt, indem 5 ml der Lösung, die die Zellen umfasst, durch einen Filter mit einer Porengröße von 200 µm und weitere Zugabe von 5 ml Produktionsmedium filtriert werden. Der gesamte Schritt dauert ca. 10 Minuten.
  • So erhaltene Zellen werden auf eine Mikrotiterplatte übertragen, beispielsweise eine mit Produktionsmedium vorbeladene 384-Well-Platte, und anschließend bei einer Temperatur von etwa 37°C inkubiert. In jeder Vertiefung der Multiwell-Platte werden 25 µl der Zellsuspension, die Tumorzellen umfasst, zu 50 µl Produktionsmedium hinzugefügt, das zuvor in die Vertiefungen der Multiwell-Platte gefüllt wurde. Zusätzlich werden 25 µl einer Lösung, die Stützzellen umfasst, zu jeder Vertiefung gegeben. Gemäß der vorliegenden Erfindung beträgt die geschätzte Prozesszeit dieses Verfahrens etwa 2 bis 3 Stunden.
  • Gemäß einer ersten Option wird die so erhaltene Platte zur Gewebereifung (Erzeugung von Mikrogewebe) direkt in eine sogenannte Profilbildungsvorrichtung (Einheit) übertragen. Als Vorteil davon wird das technische Setup nicht zwischen einer Ersteller- und einer Profilbildungseinheit dupliziert. Dies verzögert jedoch einen schnellen Wirkstofftest der Profilbildungseinheit, da die Räume mit Platten blockiert sind, die noch 2 bis 5 Tage reifen müssen.
  • In einer zweiten Option wird eine separate Gewebereifung innerhalb einer sogenannten Erzeugungseinheit durchgeführt. Dies erfordert einen zusätzlichen Inkubator und eine zusätzliche Bildgebungskapazität, hat jedoch keinen Einfluss auf den Durchsatz der Profilereinheit, die zum Testen anderer Gewebe verwendet werden kann.
  • Für die Charakterisierung (Profilbildung) der kultivierten Zellen in Gegenwart eines Wirkstoffes oder von Wirkstoffkombinationen (Arbeitsablauf am ersten Tag nach dem Laden der Platte: Dosierung des Wirkstoffes) werden ungefähr 50 Minuten berechnet, wobei eine Platte mit 384 Vertiefungen vorgefertigt wird -beladen mit gereiften Mikrogeweben in Schritt 1 (falls nicht im Gerät gereift).
  • In Schritt 2 wird die Platte unter Verwendung einer automatisierten Robotervorrichtung, wie beispielsweise eines KUKA LBR Med-Leichtgewichtsroboters, zu einem Inkubator bewegt.
  • In Schritt 3 wird die Platte dann in einen Inkubator gegeben, dann wird die Platte zu einer Bildeinheit bewegt (Schritt 4), und (Schritt 5) wird die 384-Well-Platte in einem Lesegerät bildanalysiert, beispielsweise einem QC-Imager für 10 Minuten.
  • Dann wird in Schritt 6 die Platte zu einer Flüssigkeitshandhabungseinheit/- station bewegt, und in Schritt 7 wird das Medium ausgetauscht und die Verbindung/Kombination in Kontakt gebracht/dosiert. Der Mediumwechsel dauert etwa 10 Minuten, und pro 384-Well-Platte sind etwa 30 ml erforderlich.
  • In Schritt 8 wird die Platte erneut zum Abbildungssystem bewegt und in Schritt 9 wird die Platte 30 Minuten lang in einem HD-Bildgebungssystem mit 384 Vertiefungen ausgelesen.
  • Schließlich wird in Schritt 10 die Platte zurück zur Inkubatoreinheit bewegt und die Mikrogewebezellen werden mit dem Wirkstoff oder der Kombination (in diesem Fall) 8 Stunden lang inkubiert.
  • Am ersten Tag nach dem Laden der Platte wird der Wirkstoff in einem Prozess entfernt, der etwa 60 Minuten dauert. In Schritt 11 wird nach acht Stunden Wirkstoffinkubation der Mikrogewebe die Platte dann von der Inkubatoreinheit entfernt. In Schritt 12 wird die Platte zu einem Imager bewegt (QC bei Gewebebildung). In Schritt 13 wird die 384-Well-Platte 30 Minuten lang einer HD-Bildgebung unterzogen. Anschließend wird in Schritt 14 die Platte zu einer Flüssigkeitshandhabungsstation bewegt. In Schritt 15 wird das Medium zweimal in einem Zeitraum von etwa 20 Minuten ausgetauscht, und die untersuchte Verbindung oder Kombination wird erneut dosiert und in die 384-Well-Platte gefüllt. In diesem Schritt sind insgesamt 60 ml Medium plus Verbindung(en) erforderlich.
  • In Schritt 16 wird die Platte zum Bildgebungssystem bewegt und in Schritt 17 10 Minuten lang einer QC-Bildgebung unterzogen. Danach wird die Platte in Schritt 18 erneut zur Inkubatoreinheit bewegt (Schritt 19) und für 24 Stunden inkubiert, bevor der nächste Zyklus beginnt.
  • Am zweiten Tag des Bestimmungsschritts wird das Mikrogewebe einer Größenprofilbildung unterzogen, die etwa 35 Minuten dauert. In Schritt 1 wird die Platte von der Inkubatoreinheit entfernt und in Schritt 2 zur Bildeinheit bewegt, wo sie in Schritt 3 30 Minuten lang einer HD-Bildgebung unterzogen wird. Danach wird in Schritt 4 die Platte zurück zu und dann in die Inkubatoreinheit bewegt (Schritt 5).
  • Als optische Ausleseoptionen kann die Größe als primäre Auslesung verwendet werden, und mehrere Parameter können als sekundäre Optionen ausgewählt werden, wie beispielsweise mindestens ein Parameter ausgewählt aus Durchmesser, Umfang, Volumen und Fläche des optischen Querschnitts.
  • Beispiel 2
  • Verfahren um NSCLC Patienten-abgeleitete Mikrotumore (PMTs) herzustellen
  • Die Tumorgewebeprobe wurde durch Entfernen von Fettgewebe vorbereitet. Die Zielgewebegröße lag bei etwa 0,2 bis 0,4 cm3. Zum Versand wurde das Tumorgewebe in ein Röhrchen gegeben, das Transportmedium enthielt (z.B. Dulbeco's modifiziertes Eagle-Medium, ergänzt mit geeigneten Antibiotika). Vor der weiteren Verwendung wurde der Tumor dreimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gespült, die mit geeigneten Antibiotika ergänzt war. Nach Entfernen des PBS wurde in DMEM gelöste Liberase (0,04-0,08 mg/ml) zugegeben und 15 min bei 37°C inkubiert. Der Enzymüberstand wurde in ein mit STOP-Lösung (DMEM + 40% FCS) vorbefülltes Röhrchen überführt. Dann wurde eine enzymatische Lösung (Liberase) zugegeben und die Inkubation und der Transfer wiederholt. Der Rest der Gewebeprobe wurde verworfen und nur die Zellen in der STOP-Lösung wurden verwendet. Diese wurden auf einem 200 µm-Zellsieb bewegt, um größere nicht-dissoziierte Gewebefragmente zu entfernen. Nach 5-minütiger Sedimentation der Zellen im Filtrat wurde der Überstand vorsichtig entfernt und Produktionsmedium (DMEM + 10% FCS) zugegeben. Dann werden die Zellen unter Verwendung eines Mikroskops visuell gezählt.
  • Zur Erzeugung von Mikrotumoren wird die Zellsuspension auf eine Endkonzentration von 6 × 104 Zellen pro ml verdünnt und 75 µl (d.h. etwa 4500 Zellen) in eine nicht-adhäsive Platte mit 96 oder 384 Vertiefungen gegeben. Die Platte wird dann inkubiert, um Gewebe zu bilden, vorzugsweise 2 bis 5 Tage. Aus drei einzelnen Produktionsläufen ergab sich eine konstante Größe von durchschnittlich 260 µm und eine Erfolgsquote von über 90% (10).
  • Beispiel 3
  • Kompetitives Beispiel - Produktionszeit
  • Patient-abgeleitete Organoide vs Patient-abgeleitete Mikrotumor-Produktion
  • Ein wichtiger Parameter für den routinemäßigen klinischen Einsatz von Technologien, die Informationen über ein therapeutisches Ergebnis liefern, das in die Entscheidungsfindung einbezogen werden soll, ist die Zeit bis zur Verfügbarkeit der Informationen. Patienten-eigene Mikrotumore (PMTs) werden ohne Zwischenschritte in der Zellkultur hergestellt und sind innerhalb von 4 Tagen nach Entnahme von Tumorproben für Wirkstofftests bereit (siehe 9).
  • Im Gegensatz zu den eigenen Mikrotumoren des Patienten, wie sie gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, erfordern Organoide intermediäre Zellkulturprozesse wie die Expansion von LGRF5+ -Tumorstammzellen und den Entzug von LGR5+-Stammzellen aus gesundem Gewebe, bevor sie in die Arzneimitteltests aufgenommen werden. Jüngsten Veröffentlichungen zufolge konnte der Zeitaufwand für die Herstellung einer ausreichenden Anzahl von Organoiden von bis zu 3 Monaten auf 1 Monat reduziert werden. Dies ist jedoch immer noch deutlich länger als bei PMTs. Ein weiteres Problem besteht darin, dass die Zeit zum Testen der Bereitschaft der Organoide sehr heterogen ist, was es schwierig macht, den Prozess in einen routinemäßigen und standardisierten automatisierten Testprozess zu integrieren.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • Sobrino et al. (in: 3D microtumors in vitro supported by perfused vascular networks, Scientific Reports volume 6, Article number: 31589 (2016)) [0005]
    • Rimann et al., An in vitro osteosarcoma 3D microtissue model for drug development, Volume 189, 10 November 2014, Pages 129-135 [0012]
    • Edwards und Aronson, The Lancet, 356, 1255-1259 [0040]

Claims (15)

  1. Ein bevorzugt automatisiertes Verfahren zur Identifizierung einer/s Patientenspezifischen, insbesondere personalisierten, Wirkstoffes oder Wirkstoffkombination, wobei der Patient an einer neoplastischen Erkrankung oder Tumor leidet oder diese diagnostiziert wurde, wobei das Verfahren umfasst a) Dissoziieren der Zellen einer Patienten-abgeleiteten Gewebeprobe, um dissoziierte Zellen zu erhalten, b) Erzeugen eines Arrays an 3D Mikrogeweben, wie zum Beispiel Mikrotumoren, basierend auf den dissoziierten Zellen von Schritt a), c) In Kontakt bringen des Arrays der 3D Mikrogewebe mit mindestens zwei Wirkstoffen und/oder Kombinationen davon, d) Bestimmen eines Effekts der Wirkstoffe und/oder Kombinationen davon auf den Array der 3D Mikrogewebe, und e) Identifizieren eines Patient-spezifischen Wirkstoffes oder einer Wirkstoffkombination basierend auf dem Effekt wie bestimmt, und optional, weiter umfassend den Schritt von Auswählen des Patient-spezifischen Wirkstoffes oder Wirkstoffkombination wie identifiziert.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Dissoziieren der Gewebeprobe umfasst i) falls erforderlich, Zerteilen der Gewebeprobe in kleinere Stücke umfassend Zellen, ii) Behandeln der Gewebeprobe mit einer Lösung umfassend mindestens ein Enzym, das in der Lage ist, Zellen in der Gewebeprobe zu dissoziieren, bevorzugt mindestens ein Enzym ausgewählt aus einer Protease, einer Collagenase, Trypsin, Elastase, Hyaluronidase, Papain, Chymotrypsin, Desoxyribonuklease I, und neutrale Protease (Dispase), wobei ein Überstand umfassend dissoziierte Zellen produziert wird, und ii) Entfernen des Überstands umfassend die dissoziierten Zellen, und geeignetes Sammeln der Zellen, wobei Schritte (ii) und (iii) mindestens einmal wiederholt werden, wobei bevorzugt vor Schritt (ii) die Gewebeprobe mit Ultraschall beschallt wird, wobei die Energie des Ultraschalls auf einen geeigneten Spiegel so eingestellt wird, um nicht eine substantielle Menge der Zellen zu zerstören.
  3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei Schritt b) ein Hinzufügen oder Entfernen von Stromazellen, stromalen Fibroblasten, Endothelzellen und Immunzellen zu den dissoziierten Zellen umfasst, und/oder wobei in Schritt b) für jedes 3D Mikrogewebe eine vorbestimmte Zahl an Zellen zur Verfügung gestellt wird, wie zum Beispiel zwischen 500 und 10000 lebensfähigen Zellen, und/oder wobei in Schritt b) die 3D Mikrogewebe in mindestens einem System ausgewählt aus Hanging Drop-System, und b) einem Multiwell-System, bevorzugt umfassend Ultra Low Adherence (ULA) Wells erzeugt werden.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Erzeugung der 3D Mikrogewebe nicht die Verwendung einer löslichen Basalmembran-Präparation, wie Matrigel® erfordert, und/oder wobei die Erzeugung der 3D Mikrogewebe ein Self-Assembly der Zellen wie umfasst in den dissoziierten Zellen umfasst, und/oder wobei die Erzeugung der 3D Mikrogewebe eine Reifezeit von ungefähr 6 Stunden bis 7 Tagen, bevorzugt ungefähr 1 bis 6 Tagen, weiter bevorzugt ungefähr 2 bis 5 Tagen umfasst, und/oder wobei die 3D Mikrogewebe wie erzeugt eine Größe von 350 µm +/- 100 µm aufweisen.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das in Kontakt bringen in Schritt c) ein kontinuierliches Aussetzen gegenüber den mindestens zwei Wirkstoffen und/oder Kombinationen davon, und/oder ein Aussetzen gegenüber und anschließendes Entfernen der mindestens zwei Wirkstoffe und/oder Kombinationen davon umfasst.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Bestimmen des Effekts in Schritt d) ausgewählt ist aus einer Größenbestimmung des 3D Mikrogewebes, Quantifizierung von interner Reportergen-Expression in dem 3D Mikrogewebe, Bestimmen des intrazellulären ATP Gehalts in dem 3D Mikrogewebe, und Bestimmen von vorbestimmten Biomarkern in dem 3D Mikrogewebe, wobei bevorzugt die Größenbestimmung des 3D Mikrogewebes mindestens einen Parameter ausgewählt aus Durchmesser, Umfang, Volumen und Bereich des optischen Querschnitts umfasst, und wobei bevorzugt die Größenbestimmung des 3D Mikrogewebes die Verwendung einer bildgebenden Vorrichtung umfasst, und optional weiter die Analyse von Wachstumskinetiken umfasst.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Patienten-abgeleitete Gewebeprobe ausgewählt ist aus einer Teilprobe abgeleitet von einer primären Gewebeprobe, einer primären Tumorprobe, und einer metastatischen Probe, und wobei bevorzugt die Gewebeprobe durch ein Verfahren umfassend Kernbiopsie, Tumorresektion, flüssige Biopsie und/oder Nadelaspiration erhalten wurde, und/oder wobei die Gewebeprobe und/oder die dissoziierten Zellen vor der Erzeugung der 3D Mikrogewebe gefroren und wieder aufgetaut werden.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend ein zur Verfügung stellen einer primären Gewebeprobe, Erhalten einer Teilprobe zusätzlich zu der Patienten-abgeleiteten Probe und Unterziehen der Teilprobe mindestens einem von molekularem Profiling, histologischer Analyse und histochemischer Analyse.
  9. Verfahren zur Stratifizierung eines Patienten im Hinblick auf eine Behandlung mit einem Patienten-spezifischen Wirkstoff oder Wirkstoffkombination, umfassend ein Durchführen des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8, und weiter umfassend eine Stratifizierung des Patienten basierend auf dem Patientenspezifischen Wirkstoff oder Wirkstoffkombination wie identifiziert.
  10. Verfahren zur Identifizierung von nachteiligen Effekten, die mit einer Behandlung mit einem Patienten-spezifischen Wirkstoff oder Wirkstoffkombination in einem Patienten assoziiert sind, umfassend ein Durchführen des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8, und weiter umfassend den Schritt von Testen und Analysieren den Patienten-spezifischen Wirkstoff oder Wirkstoffkombination auf nachteilige Effekte in dem Patienten.
  11. System zur Identifizierung einer/s Patienten-spezifischen, insbesondere personalisierten, Wirkstoffes oder Wirkstoffkombination, wobei der Patient an einer neoplastischen Erkrankung oder Tumor leidet oder diese diagnostiziert wurde, das System umfassend a) eine Gewebeprobe dissoziierende Einheit zur Dissoziierung einer Patienten-abgeleiteten Gewebeprobe um dissoziierte Zellen zu erhalten, b) eine Einheit zur Herstellung eines Arrays von 3D Mikrogeweben, wie zum Beispiel Mikrotumoren, basierend auf den dissoziierten Zellen von Schritt a), c) eine Wirkstoff-Testeinheit zum in Kontakt bringen des Arrays der 3D Mikrogewebe mit mindestens zwei Wirkstoffen und/oder Kombinationen davon, d) eine erste Analyseeinheit zur Bestimmung eines Effekts der Wirkstoffe und/oder Kombinationen davon auf den Array der 3D Mikrogewebe, und e) eine zweite Analyseeinheit zur Identifizierung eines Patienten-spezifischen Wirkstoffes oder einer Wirkstoffkombination basierend auf dem Effekt wie bestimmt, und optional weiter umfassend eine Einheit zur Selektion des Patient-spezifischen Wirkstoffes oder der Wirkstoffkombination wie identifiziert.
  12. System nach Anspruch 11, wobei die Gewebeprobe dissoziierende Einheit mindestens eines umfasst von i) einer pipettierenden Einheit, ii) einem Enzymreservoir, iii) einem Reservoir für Zellkulturmedien, iv) einem Reservoir für Waschlösungen, v) gegebenenfalls, eine Ultraschallvorrichtung, und vi) eine Zentrifugeneinheit, und/oder wobei die Einheit zur Herstellung eines Arrays von 3D Mikrogeweben, wie zum Beispiel Mikrotumoren, basierend auf den dissoziierten Zellen mindestens eines umfasst von i) einer pipettierenden Einheit, ii) einer Zellen zählenden Einheit, und, iii) einem Handhaber für Mikrotiterplatten, und/oder wobei die Wirkstoff testende Einheit mindestens eines umfasst von i) einem Handhaber für Mikrotiterplatten, ii) einer pipettierenden Einheit, iii) einem Reservoir für Zellkulturmedien, iv) einem Array an Reservoirs umfassend mindestens zwei verschiedene Wirkstoffe oder Kombinationen davon, und iv) einer Inkubatoreinheit, und/oder wobei die erste und/oder zweite Analyseeinheit umfasst i) einen Handhaber für Mikrotiterplatten, und/oder ii) ein bildgebendes System umfassend ein Mikroskop und eine Kamera, und optional einen HR-Scanner.
  13. System nach den Ansprüchen 11 oder 12, wobei sich die Gewebeprobe dissoziierende Einheit und die Einheit zur Herstellung eines Arrays von 3D Mikrogeweben die gleiche pipettierende Einheit teilen und/oder wobei sich die Wirkstoff-Testeinheit und die erste Analyseeinheit denselben Handhaber für Mikrotiterplatten teilen.
  14. System nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei die Gewebeprobe dissoziierende Einheit und die Einheit zur Herstellung eines Arrays von 3D Mikrogeweben in demselben Gehäuse angeordnet sind, und/oder wobei die Wirkstoff-Testeinheit und die erste Analyseeinheit in demselben Gehäuse angeordnet sind, und bevorzugt wobei die zwei Gehäuse miteinander verbunden sind um ein diskretes System zu bilden und/oder wobei das System zumindest teilweise vertikal angeordnet ist.
  15. System nach einem der Ansprüche 11 bis 14, wobei das System als Ganzes oder in Teilen davon sterilisiert werden kann, und/oder wobei das System Mittel zur Etablierung und/oder Beibehaltung von sterilen Bedingungen umfasst.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113774106B (zh) * 2021-04-27 2023-08-15 上海益诺思生物技术股份有限公司 一种利用3d肝细胞体外微核细胞组学检测遗传毒性的方法
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CN116622801A (zh) * 2023-07-24 2023-08-22 安泰康生物技术(北京)有限公司 一种患者来源超微组织培养药物敏感性检测方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012154350A1 (en) * 2011-04-08 2012-11-15 Falcon Genomics, Inc. Systems and methods for individualized functional genomic profiliing related to cancer cell growth

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2090324A1 (de) * 2008-02-14 2009-08-19 Roche Diagnostics GmbH Transfercontainer für pharmazeutische Behältnisse

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012154350A1 (en) * 2011-04-08 2012-11-15 Falcon Genomics, Inc. Systems and methods for individualized functional genomic profiliing related to cancer cell growth

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GILBERT, A. [u.a.]: Combinatorial Drug Testing in 3D Microtumors Derived from GBM Patient-Derived Xenografts Reveals Cytotoxic Synergy in Pharmacokinomics-informed Pathway Interactions. Sci. Rep. (2018) 8 (1) 8412, Druckseiten 1-12 *

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