DE102006012613A1 - Verfahren zur Bestimmung der therapeutischen Wirksamkeit von Substanzen - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der therapeutischen Wirksamkeit von Substanzen, welche als Wirkstoff mindestens ein therapeutisch wirksames, biotechnologisch erzeugtes Protein und/oder Peptid enthalten, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: a) Bereitstellung einer Zell-, Blut- oder Gewebeprobe menschlichen oder tierischen Ursprungs oder einer Probe mikrobiellen Ursprungs, wobei die Zell-, Blut- oder Gewebeprobe oder mikrobielle Probe in einem vordefinierten biologischen Zustand vorliegt und für das mindestens eine therapeutisch wirksame, biotechnologisch erzeugte Protein und/oder Peptid relevante Zielstrukturen aufweist; b) Markierung des mindestens einen therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids unter Erhaltung seiner In-vivo-Bindungseigenschaften; c) Aufbringen einer das mindestens eine markierte therapeutisch wirksame Protein und/oder Peptid enthaltenden Reagenzlösung auf die Probe, wobei das Aufbringen der Reagenzlösung unter vordefinierten Applikationsbedingungen und mit vordefinierten Konzentrationen des markierten therapeutisch wirksamen und biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids erfolgt; d) Ermittlung des Bindungsverhaltens des therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids an der oder den relevanten Zielstrukturen der Probe und e) Auswertung des in d) ermittelten Bindungsverhaltens hinsichtlich der Wirksamkeit des mindestens einen ...

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der therapeutischen Wirksamkeit von Substanzen, welche als Wirkstoff mindestens ein therapeutisch wirksames, biotechnologisch erzeugtes Protein und/oder Peptid enthalten. Die Erfindung betrifft weiterhin einen Kit und einen Biochip zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
  • Autoimmun-Erkrankungen sind in der Bevölkerung weit verbreitet und manifestieren sich in verschiedensten Formen. In Deutschland leidet etwa 1 % der Bevölkerung an der rheumatoiden Arthritis, die damit die häufigste der entzündlich rheumatischen Erkrankungen ist. Weit verbreitet sind auch Erkrankungen der Haut, wie beispielsweise die atopische Dermatitis (Neurodermitis) oder die Psoriasis (Schuppenflechte). Von der Psoriasis betroffen sind etwa 2–3% der mitteleuropäischen Bevölkerung, in den USA sogar 4–5%. Es handelt sich bei der Psoriasis um eine chronische Entzündung der Haut, die sich durch abnorme Proliferation der Epidermis-Zellen (Hyperplasie) und erhöhten kutanen Blutfluss auszeichnet und bei einem Teil der Patienten neben dem Befall von Fingernägeln zusätzlich zu einer Erkrankung der Gelenke führt, der sog. Psoriasis-Arthritis. Die Behandlungsmöglichkeiten hängen von der Ausbildung der Krankheit beim einzelnen Patienten ab und erfordern oft eine Kombination mehrerer Medikamente. Neben physikalischen Therapien wie UV-Bestrahlung existieren an verschiedenen Punkten ansetzende Präparate, die von Teer oder pflegenden Salben über die Gabe von Vitamin A- oder D-Abkömmlingen (z.B. Zorac®, Daivonex®) bis hin zur Verabreichung von Hormonen reichen. Die bei diesen Behandlungen insbesondere bei Langzeitanwendung auftretenden Nebenwirkungen begrenzen oft ihre Anwendbarkeit für den einzelnen Patienten und führen zu einer Nachfrage nach alternativen Therapieansätzen. Verschiedene Forschungsergebnisse weisen inzwischen auf eine zentrale Beteiligung von T-Zellen an der Pathophysiologie der Erkrankung hin. Dies führte zur Anwendung so genannter „Biologika" (engl. „Biologics") bei der Behandlung der Psoriasis und anderer Autoimmun-Erkrankungen. Bei den Biologics handelt es sich um eine vergleichsweise neue Klasse von Medikamenten, die hauptsächlich biotechnologisch hergestellte Proteine mit therapeutischer Wirkung beinhalten. Biologics können daher im Organbezug als Antikörper, Liganden oder Rezeptoren fungieren. Ihr großer Vorteil gegenüber den bisherigen Therapieformen besteht in ihrer hochgradig spezifischen Interaktion mit definierten molekularen Zielstrukturen. Dadurch können mit Biologics einerseits Medikamente zur Verfügung gestellt werden, die bei Versagen der übrigen Therapieansätze eine zusätzliche Möglichkeit der Behandlung bieten, andererseits können die bei den sonstigen Therapieformen häufig auftretenden Nebenwirkungen zum großen Teil vermieden werden. Ein unter anderem zur Behandlung von Psoriasis eingesetztes Biologic ist Efalizumab (Raptiva®). Es handelt sich hierbei um einen humanisierten monoklonalen IgG1-Antikörper, der gegen das Molekül CD11a gerichtet ist. CD11a (α-L Integrin) bildet nach seiner nicht-kovalenten Assoziierung mit CD18 (β2 Integrin) das heterodimere LFA-1 (Lymphocyte Function-associated Antigen-1), welches seinerseits CD54 (ICAM-1) bindet. LFA-1 wird auf Lymphozyten, Monozyten und Neutrophilen exprimiert und spielt eine wichtige Rolle bei Zell-Zell-Adhäsionsprozessen. Efalizumab zeigte in klinischen Studien bei 30–40% der Patienten innerhalb von 12 Wochen eine deutliche Besserung der Erkrankung und bietet so zumindest einem Teil der Patienten eine neue, vielversprechende Therapieform.
  • Bekannte Diagnose- und Prädiktionsansätze machen Gebrauch von genetischen Methoden zur Bestimmung bestimmter Polymorphismen im Genom des einzelnen Patienten. Die so ermittelten Resultate können in bestimmten Fällen zur Ableitung der Anfälligkeit dieses Patienten gegenüber der fraglichen Krankheit verwendet werden. Aus der WO 2005/112568 ist ein Verfahren zur Diagnose oder Vorhersage des Ansprechverhaltens eines Patienten auf eine Behandlung mit T-Zellen-vermindernden Medikamenten bekannt. So werden mit Hilfe dieses Verfahrens verschiedene Haplotypen identifiziert, die darauf schließen lassen, dass eine Behandlung mit Alefacept (Amevive®) erfolgversprechend ist. Auch Alefacept gehört zur Gruppe der Biologika bzw. Biologics und kann zur Behandlung der Psoriasis verwendet werden. Nachteilig an derartigen DNA-basierten Verfahren ist jedoch ihre Aufwändigkeit und die Beschränkung auf T-Zellen-assoziierte Krankheiten. Des Weiteren wirken Biologics nicht bei allen Patienten gleich. Bisher ist eine Prädiktion über die prinzipielle Wirksamkeit für den einzelnen Patienten kaum möglich und erfolgt nach dem Trial-and-Error-Prinzip. Dementsprechend ist bisher im Vorfeld einer Behandlung keine für den Einzelfall optimierte Dosis-Ermittlung und geeignete Therapieüberwachung möglich.
  • Da Biologics als Immunsuppresiva schwerwiegende Nebenwirkungen haben können ist, ist die Entwicklung einer zuverlässigen Prädiktionmethode zur Vermeidung einer unwirksamen therapeutischen Anwendung sehr wichtig.
    •
  • Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der therapeutischen Wirksamkeit von Substanzen, welche als Wirkstoff mindestens ein therapeutisch wirksames, biotechnologisch erzeugtes Protein und/oder Peptid („Biologics") enthalten, bereitzustellen, welches Aussagen über die grundsätzliche Wirksamkeit von einem oder mehreren therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteinen und/oder Peptiden für den individuellen Patienten im Vorfeld der Behandlung erlaubt und/oder mit deren Hilfe sich der Verlauf der therapeutischen Behandlung kontrollieren lässt.
  • Es ist weiterhin Aufgabe der vorliegenden Erfindung einen Kit und einen Biochip zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bereitzustellen.
  • Gelöst werden diese Aufgaben durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1, einem Kit mit den Merkmalen des Anspruchs 14 und einem Biochip mit den Merkmalen des Anspruchs 17.
  • Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den jeweiligen Unteransprüchen beschrieben.
  • Ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung der therapeutischen Wirksamkeit von Substanzen, welche als Wirkstoff mindestens ein therapeutisch wirksames, biotechnologisch erzeugtes Protein und/oder Peptid enthalten, umfasst folgende Verfahrensschritte: a) Bereitstellung einer Zell-, Blut- oder Gewebeprobe menschlichen oder tierischen Ursprungs oder einer Probe mikrobiellen Ursprungs, wobei die Zell-, Blut- oder Gewebeprobe oder mikrobielle Probe in einem vordefinierten biologischen Zustand vorliegt und für das mindestens eine therapeutisch wirksame, biotechnologisch erzeugte Protein und/oder Peptid relevante Zielstrukturen aufweist; b) Markierung des mindestens einen therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids unter Erhaltung seiner In-vivo-Bindungseigenschaften; c) Aufbringen einer das mindestens eine markierte therapeutisch wirksame Protein und/oder Peptid enthaltenden Reagenzlösung auf die Probe, wobei das Aufbringen der Reagenzlösung unter vordefinierten Applikationsbedingungen und mit vordefinierten Konzentrationen des markierten therapeutisch wirksamen und biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids erfolgt; d) Ermittlung des Bindungsverhaltens des therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids an der oder den relevanten Zielstrukturen der Probe; und e) Auswertung des in d) ermittelten Bindungsverhaltens hinsichtlich der Wirksamkeit des mindestens einen therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids in der untersuchten Zell-, Blut- oder Gewebeprobe oder mikrobiellen Probe. Der mit der Erfindung erzielbare Vorteil besteht unter anderem darin, dass das erfindungsgemäße Verfahren ausgehend von in-vitro Bindungsstudien detaillierte Erkenntnisse über die tatsächlichen in-vivo Wirkungs- und Nebenwirkungseigenschaften von Biologics im Organbezug liefert und dadurch sowohl die Prädiktion der Wirksamkeit des das oder die fraglichen Biologics enthaltenden Medikaments für den einzelnen Patienten als auch eine gezielte Therapieführung und -überwachung bei erwiesener Wirksamkeit des Medikaments erlaubt. Durch die Möglichkeit einer Prädiktion lassen sich zudem vorteilhafterweise pharmakologisch-pharmazeutische Entwicklungsprozesse signifikant verkürzen. Weiterhin erlaubt es die Verringerung von Tierversuchen und klinischen Studien. Dabei umfassen in einer vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens die Applikationsbedingungen gemäß Verfahrensschritt c) die Variation von Trägerlösungen, Temperatur- und Druckbedingungen. Mindestens eines der therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteine oder Peptide ist gewählt aus der Gruppe: Efalizumab, Alefacept, Infliximab, Etanercept, Basiliximab, Daclizumab, Muromonab, Trastuzumab, Ibritumomab, Bevacizumab, Cetuximab, Rituximab, Omalizumab, Alemtuzumab, Adalimumab oder polyklonale Antikörper. Polyklonale Antikörper können zum Beispiel ein Anti-T-Zell-Immunserum vom Pferd oder ein Antihuman T-Zell-Immunserum vom Kaninchen sein. Durch die Möglichkeit der Prädiktion und Auswahl wirksamer Medikamente im Vorfeld der Behandlung und der genauen Kontrollierbarkeit ihrer therapeutischen Anwendung ergeben sich zudem vorteilhafterweise deutliche Kostensenkungen in diesem Bereich.
  • In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Markierung gemäß Verfahrensschritt b) durch kovalente Bindung eines oder mehrerer Fluorochrome und/oder durch kovalente Bindung eines oder mehrerer Biotin-Moleküle und/oder durch kovalente Bindung eines oder mehrerer Dioxigenin-Moleküle und/oder durch Markierung mit einem sekundär markiertem Antikörper und/oder einer radioaktiven Markierung an das therapeutisch wirksame, biotechnologisch erzeugte Protein und/oder Peptid. Ein zur Markierung geeignetes verwendetes Fluorchrom ist zum Beispiel Fluoresceinisothiocyanat (FITC).
  • In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird für den Fall, dass eine direkte Markierung des therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids nicht möglich ist oder zu einer Beeinflussung seiner in-vivo Bindungseigenschaften führt, wird zwischen das mindestens eine therapeutisch wirksame, biotechnologisch hergestellte Protein und/oder Peptid und die mindestens eine Markierung mindestens ein Spacer eingefügt.
  • In weiteren vorteilhaften Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die Ermittlung des Bindungsverhaltens des therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids an der oder den relevanten Zielstrukturen der Proben gemäß Verfahrensschritt d) die Detektion von mindestens einem Markierungsmuster des markierten Proteins und/oder Peptids umfasst. Dabei wird zur Quantifizierung der Wirksamkeit des mindestens einen an die Zielstruktur bzw. Zielstrukturen gebundenen therapeutisch wirksamen und biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids die Signalstärke des Markierungsmusters ermittelt und mit der Signalstärke eines unter den gleichen Versuchsbedingungen ermittelten Markierungsmusters von mindestens einer Referenzprobe verglichen, wobei die Referenzprobe eine zur untersuchten Probe vergleichbare Zell-, Blut- oder Gewebeprobe oder Probe mikrobiellen Ursprungs ist. Die Referenzprobe kann sich dabei in einem zur untersuchten Probe vergleichbaren biologischen Zustand oder in einem weiteren, sich von dem der untersuchten Proben unterscheidenden biologischen Zustand befinden. So umfassen die biologischen Zustände gesunde oder krankheitsbedingte Zustände von Zell-, Blut- oder Gewebeproben oder mikrobiellen Proben. Beispielhaft kann es sich bei der Zell- oder Gewebeprobe um ein durch Psoriasis, eine entzündliche Hauterkrankung, einen Hauttumor, ein entzündliches Gewebe oder ein Tumorgewebe betroffenes Hautgewebe und bei der Referenzprobe um ein normales, gesundes Hautgewebe handeln.
  • In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die relevanten Zielstrukturen der Zell-, Blut- oder Gewebeproben und/oder der Referenzproben mittels eines automatisierten Verfahrens durch wiederholtes Aufbringen von Referenzlösungen, die jeweils mindestens ein Markiermolekül umfassen, ermittelt. Nach dem Einwirken einer Referenzlösung wird jeweils mindestens ein Markierungsmuster automatisch detektiert, wobei die detektierten Markierungsmuster zu einem komplexen molekularen Kombinationsmuster der Zell-, Blut- oder Gewebeproben oder mikrobiellen Proben und/oder der Referenzproben zusammengefasst werden. Ein derartiges Verfahren ist in der EP 0 810 428 oder der DE 197 09 348 beschrieben.
  • Ein erfindungsgemäßer Kit zur Durchführung der im Vorhergehenden beschriebenen Verfahren umfasst mindestens ein therapeutisch wirksames, biotechnologisch hergestelltes Protein und/oder Peptid und mindestens ein Markierungsmolekül, wobei das Markierungsmolekül die In-vivo-Bindungseigenschaften des Proteins und/oder Peptids nicht beeinflusst. Dabei kann das Markierungsmolekül Fluorochrome und/oder Biotin-Moleküle und/oder Dioxigenin-Moleküle sowie zusätzlich sekundäre Antikörper umfassen. Das therapeutisch wirksame, biotechnologisch hergestellte Protein und/oder Peptid ist dabei aus folgender Gruppe gewählt: Efalizumab, Alefacept, Infliximab, Etanercept, Basiliximab, Daclizumab, Muromonab, Trastuzumab, Ibritumomab, Bevacizumab, Cetuximab, Rituximab, Omalizumab, Alemtuzumab, Adalimumab oder polyklonale Antikörper. Polyklonale Antikörper können zum Beispiel ein Anti-T-Zell-Immunserum vom Pferd oder ein Antihuman T-Zell-Immunserum vom Kaninchen sein.
  • Im Rahmen der Erfindung wird zudem ein Biochip zur Durchführung der im Vorhergehenden beschriebenen Verfahren bereitgestellt, wobei der Biochip eine Zell-, Blut- oder Gewebeprobe menschlichen, tierischen Ursprungs oder eine Probe mikrobiellen Ursprungs umfasst und die Probe in einem vordefinierten biologischen Zustand vorliegt und relevante Zielstrukturen für mindestens ein therapeutisch wirksames biotechnologisch erzeugtes Protein und/oder Peptid aufweist. Das therapeutisch wirksame, biotechnologisch hergestellte Protein und/oder Peptid ist dabei aus folgender Gruppe gewählt: Efalizumab, Alefacept, Infliximab, Etanercept, Basiliximab, Daclizumab, Muromonab, Trastuzumab, Ibritumomab, Bevacizumab, Cetuximab, Rituximab, Omalizumab, Alemtuzumab, Adalimumab oder polyklonale Antikörper. Polyklonale Antikörper können zum Beispiel ein Anti-T-Zell-Immunserum vom Pferd oder ein Antihuman T-Zell-Immunserum vom Kaninchen sein.
    •
  • Weitere Einzelheiten und Anwendungsbereiche ergeben sich aus der folgenden Beschreibung mehrerer Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Verfahrens:
    In einer bevorzugten Ausführung ist das therapeutisch wirksame, biotechnologisch erzeugte Protein und/oder Peptid Efalizumab und die Zell- oder Gewebeprobe eine Hautprobe, welche unter Konservierung der relevanten Zielstrukturen fixiert wurde. Der vordefinierte biologische Zustand der Hautprobe ist akut psoriatisch. Efalizumab wird unter Erhaltung seiner in-vivo Bindungseigenschaften kovalent mit Fluoreszein-5-ex-succinimidylester markiert. Das markierte Efalizumab wird in Lösung gebracht, wobei die Versuchsbedingungen so gewählt werden, dass sie der in-vivo Situation im Organbezug so weit wie möglich entsprechen. Mittels eines automatisierten Verfahrens wird das in Lösung vorliegende, markierte Efalizumab sowie gegebenenfalls mindestens ein weiteres in Lösung vorliegendes, gegen unterschiedliche Zelltypen und/oder gegen strukturelle Komponenten der extrazellulären Matrix und/oder gegen Strukturen, die für Zellproliferation, -aktivierung und -adhäsion charakteristisch sind, gerichtetes Markierungsmolekül nacheinander auf die Hautprobe aufgebracht. In jedem Durchgang wird das Fluoreszenz-Markierungsmuster detektiert. Die einzelnen Markierungsmuster werden digitalisiert und prozessiert. Dabei erfolgt die Digitalisierung und Quantifizierung der detektierten Signale durch eine Methode, wie sie zum Beispiel in der EP 1 181 525 beschrieben ist.
  • Von einer Hautgewebeprobe wird zunächst ein Phasenkontrastbild aufgenommen. Anschließend folgt die automatische Detektion der molekularen Muster für Einzel- und/oder Mehrfachepitope. Diese Bilder werden durch die genannte Digitalisierung einer computergestützten Auswertung zugänglich gemacht. Das vor der Aufnahme der Fluoreszenzbilder detektierte Phasenkontrastbild wird zur korrekten, pixelgenauen Überlagerung der korrespondierenden Fluoreszenzaufnahmen verwendet. Die so ausgerichteten Bilder werden in einem zweiten Schritt einer Hintergrund- und Fehlbelichtungskorrektur unterzogen und schließlich in einem dritten Schritt von eventuell vorhandenen Artefakten und/oder fehlerhaften Pixeln befreit. Dies geschieht durch die Anwendung einer Maskenoperation, welche die fehlerhaften Signale als ungültig markiert und von der folgenden Auswertung ausschließt.
  • Die digitalisierten, bearbeiteten Bilder werden unter der Kontrolle eines Fachmanns binarisiert. Durch Überlagerung der binarisierten Bilder für jedes der detektierten Epitope erhält man eine Matrix der molekularen Signale, welche binär kodierten, der Boole'schen Logik folgenden Vektoren (1 = ja/wahr, 0 = nein/falsch) für jedes Pixel des digitalisierten visuellen Feldes entsprechen. Ein Pixel stellt bei einer Fläche von 450 × 450 nm2 bei 20facher optischer Vergrößerung die topographischen Basiseinheit (topographic micro unit – TMU) dar. Die Fläche des digitalisierten visuellen Feldes beträgt unter diesen Bedingungen maximal 2000 × 2000 Pixel. Die Häufigkeit der auftretenden Pixel-Signale für die detektierten kombinatorischen Markierungsmuster wird ins Verhältnis zu der horizontalen Breite der Hautprobe gesetzt. Auf diese Weise kann der vertikale Gradient der betrachteten Hautprobe berücksichtig werden, welcher aus Gewebe im Übergangs-, Wachstums- und Differenzierungzustand gebildet wird. Man erhält als geeignete Kenngröße zur Quantifizierung der Exprimierung und Co-Exprimierung von Epitopen den „pixel events normalized to horizontal skin width"-Parameter, im Folgenden kurz PEN genannt.
  • Die relevanten Zielstrukturen der Hautprobe liegen hauptsächlich im dermalen Kompartiment. Die detektierten, digitalisierten und prozessierten Markierungsmuster werden zur Ermittlung des Bindungsverhaltens des markierten Efalizumabs in diesem Kompartiment verwendet. Die Auswertung des ermittelten Bindungsverhaltens hinsichtlich der Wirksamkeit von Efalizumab im konkreten in-vivo Organbezug erfolgt durch den Vergleich der in-vitro Identifizierungs- und Quantifizierungsdaten für die ermittelten Efalizumab-Bindungsstrukturen mit den für akut-psoriatische, auf Efalizumab ansprechenden Hautproben typischen Identifizierungs- und Quantifizierungsdaten. Der mit Hilfe der weiteren Markierungsmoleküle abgegrenzte Bereich der Quantifizierungswerte liegt dabei zwischen 1,1 × 103 PEN für MPO und 115 × 103 PEN für pan-CK und CD138. Efalizumab-Bindungsstrukturen sind bei akut-psoriatischen Hautproben um das bis zu 15fache gegenüber nicht befallenen Hautproben des unter akuter Psoriasis leidenden Patienten und um das bis zu 32fache gegenüber gesunder Haut exprimiert. Die quantitativen Werte liegen bei 39,697 ± 10,263 PEN. Ein Vorliegen von Efalizumab-Bindungsstrukturen mit gegenüber gesunder Haut quantitativ erhöhten PEN-Werten bedeutet die prinzipielle Wirksamkeit von Efalizumab für den individuellen Patienten und ermöglicht über die Quantifizierungsdaten zudem die Ermittlung einer optimalen, individuell angepassten Dosierung.
  • In einer weiteren Anwendung der Erfindung ist das therapeutisch wirksame, biotechnologisch erzeugte Protein und/oder Peptid Efalizumab und die Zell- oder Gewebeprobe eine Hautprobe, welche unter Konservierung der relevanten Zielstrukturen fxiert wurde. Bei dem vordefinierten biologischen Zustand der Hautprobe handelt es sich um eine nicht befallene Hautprobe eines unter akuter Psoriasis leider den Patienten. Bei einer nicht befallenen Hautprobe eines akut psoriatischen Patienten findet sich bei prinzipieller Wirksamkeit von Efalizumab gegenüber gesunder Kontrollhaut eine quantitative Erhöhung der Efalizumab-Bindungsstrukturen um das bis zu 3fache mit PEN-Werten von 2,598 ± 2,448.
  • In einer weiteren Anwendung der Erfindung ist das therapeutisch wirksame, biotechnologisch erzeugte Protein und/oder Peptid Efalizumab und die Zell- oder Gewebeprobe eine Hautprobe, welche unter Konservierung der relevanten Zielstrukturen fxiert wurde. Bei dem vordefinierten biologischen Zustand der Hautprobe handelt es sich um eine gesunde Hautprobe eines nicht unter Psoriasis leidenden Patienten. Die quantitative Bestimmung von Efalizumab-Bindungsstrukturen in gesunder Haut liefert Werte von 1,205 ± 873 PEN.
  • In einer weiteren Anwendung der Erfindung ist das therapeutisch wirksame, biotechnologisch erzeugte Protein und/oder Peptid Efalizumab und die Zell- oder Gewebeprobe eine Hautprobe, welche unter Konservierung der relevanten Zielstrukturen fxiert wurde. Bei dem vordefinierten biologischen Zustand der Hautprobe handelt es sich um eine akut psoriatische Hautprobe. Die relevanten zellulären Zielstrukturen liegen in T-Lymphozyten-Subpopulationen, die positiv für CD3, CD8, CD4, CD45RA, CLA und CD45R0 sind. Die TMU-basierte Bestimmung der Lokalisierung von Efalizumab-Bindungsstrukturen führt zu Kolokalisierungs werten von bis zu 84% bei CD3+-, bis zu 80% bei CD8+-, bis zu 93% bei CD4+∩CD3+-, bis zu 54% bei CD45RA+-, bis zu 73% bei CLA+- und bis zu 87% bei CD45R0+-T-Lymphozyten. Auf diese Weise kann über die Eigenschaft bestimmter T-Lymphozyten als Zielstruktur von Efalizumab während dessen therapeutischer Anwendung die grundsätzliche Wirksamkeit von Efalizumab für den konkreten Patienten ermittelt werden.

Claims (18)

  1. Verfahren zur Bestimmung der therapeutischen Wirksamkeit von Substanzen, welche als Wirkstoff mindestens ein therapeutisch wirksames, biotechnologisch erzeugtes Protein und/oder Peptid enthalten, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren folgende Schritte umfasst: a) Bereitstellung einer Zell-, Blut- oder Gewebeprobe menschlichen oder tierischen Ursprungs oder einer Probe mikrobiellen Ursprungs, wobei die Zell-, Blut- oder Gewebeprobe oder mikrobielle Probe in einem vordefinierten biologischen Zustand vorliegt und für das mindestens eine therapeutisch wirksame, biotechnologisch erzeugte Protein und/oder Peptid relevante Zielstrukturen aufweist; b) Markierung des mindestens einen therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids unter Erhaltung seiner Invivo-Bindungseigenschaften; c) Aufbringen einer das mindestens eine markierte therapeutisch wirksame Protein und/oder Peptid enthaltenden Reagenzlösung auf die Probe, wobei das Aufbringen der Reagenzlösung unter vordefinierten Applikationsbedingungen und mit vordefinierten Konzentrationen des markierten therapeutisch wirksamen und biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids erfolgt; d) Ermittlung des Bindungsverhaltens des therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids an der oder den relevanten Zielstrukturen der Probe; und e) Auswertung des in d) ermittelten Bindungsverhaltens hinsichtlich der Wirksamkeit des mindestens einen therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids in der untersuchten Zell-, Blut- oder Gewebeprobe oder mikrobiellen Probe.
  2. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eines der therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteine und/oder Peptide Efalizumab, Alefacept, Infliximab, Etanercept, Basiliximab, Daclizumab, Muromonab, Trastuzumab, Ibritumomab, Bevacizumab, Cetuximab, Rituximab, Omalizumab, Alemtuzumab, Adalimumab oder polyklonale Antikörper umfasst.
  3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierung gemäß Verfahrensschritt b) durch kovalente Bindung eines oder mehrerer Fluorochrome und/oder durch kovalente Bindung eines oder mehrerer Biotin-Moleküle und/oder durch kovalente Bindung eines oder mehrerer Dioxigenin-Moleküle und/oder durch Markierung mit einem sekundären markierten Antikörper und/oder einer radioaktiven Markierung an das therapeutisch wirksame, biotechnologisch erzeugte Protein und/oder Peptid erfolgt.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein zur Markierung verwendetes Fluorchrom Fluoresceinisothiocyanat (FITC) umfasst.
  5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen das mindestens eine therapeutisch wirksame, biotechnologisch hergestellte Protein und/oder Peptid und die mindestens eine Markierung mindestens ein Spacer eingefügt ist.
  6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Applikationsbedingungen gemäß Verfahrensschritt c) die Variation von Trägerlösungen, Temperatur- und Druckbedingungen umfasst.
  7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Ermittlung des Bindungsverhaltens des therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids an der oder den relevanten Zielstrukturen der Probe gemäß Verfahrensschritt d) die Detektion von mindestens einem Markierungsmuster des markierten Proteins und/oder Peptids umfasst.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass zur Quantifizierung der Wirksamkeit des mindestens einen an die Zielstruktur bzw. Zielstrukturen gebundenen therapeutisch wirksamen und biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids die Signalstärke des Markierungsmusters ermittelt wird und mit der Signalstärke eines unter den gleichen Versuchsbedingungen ermittelten Markierungsmusters von mindestens einer Referenzprobe verglichen wird, wobei die Referenzprobe eine zur untersuchten Probe vergleichbare Zell-, Blut- oder Gewebeprobe oder mikrobielle Probe ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Referenzprobe in einem zur untersuchten Probe vergleichbaren biologischen Zustand befindet.
  10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Referenzprobe in einem weiteren, sich von dem der untersuchten Proben unterscheidenden biologischen Zustand befindet.
  11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die biologischen Zustände gesunde oder krankheitsbedingte biologische Zustände von Zell-, Blut- oder Gewebeproben oder mikrobiellen Proben darstellen.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Zell- oder Gewebeprobe ein durch Psoriasis, eine entzündliche Hauterkrankung, einen Hauttumor, ein entzündliches Gewebe oder ein Tumorgewebe betroffenes Hautgewebe und die Referenzprobe ein normales, gesundes Hautgewebe ist.
  13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die relevanten Zielstrukturen der Zell-, Blut- oder Gewebeproben oder Proben mikrobiellen Ursprungs und/oder der Referenzproben mittels eines automatisierten Verfahrens durch wiederholtes Aufbringen von Referenzlösungen, die jeweils mindestens ein Markiermolekül umfassen, ermittelt werden und nach dem Einwirken einer Referenzlösung jeweils mindestens ein Markierungsmuster automatisch detektiert wird, wobei die detektierten Markierungsmuster zu einem komplexen molekularen Kombinationsmuster der Zell-, Blut- oder Gewebeproben und/oder der Referenzproben zusammengefasst werden.
  14. Kit zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 umfassend mindestens ein therapeutisch wirksames, biotechnologisch hergestelltes Protein und/oder Peptid und mindestens ein Markierungsmolekül, wobei das Markierungsmolekül die In-vivo-Bindungseigenschaften des Proteins und/oder Peptids nicht beeinflusst.
  15. Kit nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Markierungsmolekül Fluorochrome und/oder Biotin-Moleküle und/oder Dioxigenin-Moleküle sowie sekundäre Antikörper umfasst.
  16. Kit nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Protein und/oder Peptid Efalizumab, Alefacept, Infliximab, Etanercept, Basiliximab, Daclizumab, Muromonab, Trastuzumab, Ibritumomab, Bevacizumab, Cetuximab, Rituximab, Omalizumab, Alemtuzumab, Adalimumab oder polyklonale Antikörper umfasst.
  17. Biochip zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 umfassend eine Zell-, Blut- oder Gewebeprobe menschlichen, tierischen oder eine Probe mikrobiellen Ursprungs, wobei die Probe in einem vordefinierten biologischen Zustand vorliegt und relevante Zielstrukturen für mindestens ein therapeutisch wirksames, biotechnologisch erzeugtes Protein und/oder Peptid aufweist.
  18. Biochip nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Protein und/oder Peptid Efalizumab, Alefacept, Infliximab, Etanercept, Basiliximab, Daclizumab, Muromonab, Trastuzumab, Ibritumomab, Bevacizumab, Cetuximab, Rituximab, Omalizumab, Alemtuzumab, Adalimumab oder polyclonale Antikörper umfasst.
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