WO2007107320A1 - Verfahren zur bestimmung der therapeutischen wirksamkeit von substanzen - Google Patents

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WO2007107320A1
WO2007107320A1 PCT/EP2007/002418 EP2007002418W WO2007107320A1 WO 2007107320 A1 WO2007107320 A1 WO 2007107320A1 EP 2007002418 W EP2007002418 W EP 2007002418W WO 2007107320 A1 WO2007107320 A1 WO 2007107320A1
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protein
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Harald Gollnik
Bernd Bonnekoh
Raik BÖCKELMANN
Lars Philipsen
Ansgar Josef Pommer
Anja Bastian
Sebastian Bartsch
Yanina Malykh
Mandy KÖNNECKE
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Mpb Meitec Patent- Und Beteilugungsgesellschaft Mbh
Otto-Von-Guericke-Universität Magdeburg
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Definitions

  • the present invention relates to a method for determining the therapeutic efficacy of substances which contain as active ingredient at least one therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide.
  • the present invention relates to a method for determining the therapeutic efficacy of substances containing as active ingredient at least one therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide, the method comprising the steps of: a) providing a cell, blood or tissue sample of human or animal origin or a sample of microbial origin, wherein the cell, blood or tissue sample or microbial sample is in a predefined biological state and for which at least one therapeutically active, biotechnologically generated protein and / or peptide has relevant target structures; b) labeling the at least one therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide while maintaining its in vivo binding properties; c) applying a reagent solution containing the at least one labeled therapeutically active protein and / or peptide to the sample, wherein the
  • Psoriasis is a chronic inflammation of the skin, characterized by abnormal proliferation of the epidermal cells (hyperplasia) and increased cutaneous blood flow and in addition to the involvement of fingernails in some of the patients in addition to a disease of the joints leads so-called psoriatic arthritis.
  • the treatment options depend on the disease being developed in the individual patient and often require a combination of several drugs.
  • physical therapies such as UV irradiation exist at various points preparing preparations ranging from tar or nourishing ointments over the administration of vitamin A or D derivatives (eg Zorac®, Daivonex®) to the administration of hormones.
  • efalizumab (Raptiva®). It is a humanized monoclonal IgG1 antibody directed against the molecule CD11a.
  • CD11a ⁇ -L integrin
  • CD18 ⁇ 2 integrin
  • heterodimeric LFA-1 lymphocyte function-associated antigen-1
  • LFA-I is expressed on lymphocytes, monocytes and neutrophils and plays an important role in cell-cell adhesion processes.
  • efalizumab showed a significant improvement in the disease in 30-40% of patients within 12 weeks in clinical trials, thus offering at least some of the patients a new, promising form of therapy.
  • WO 2005/112568 discloses a method for diagnosing or predicting the response of a patient to treatment with T-cell-reducing medicaments. For example, this method identifies various haplotypes that suggest that treatment with Alefacept (Amevive®) is promising. Alefacept belongs to the group of biologics or biologics and can be used to treat psoriasis.
  • Alefacept belongs to the group of biologics or biologics and can be used to treat psoriasis.
  • a disadvantage of such DNA-based methods is their complexity and the restriction to T cell-associated diseases.
  • biologics do not work the same way in all patients. So far, a prediction of the principal effectiveness for the individual patient is hardly possible and is done according to the trial-and-error principle. Accordingly, it has not been possible in the run-up to a treatment to optimize dose detection and suitable therapy monitoring for the individual case.
  • a method for determining the therapeutic efficacy of substances which contain as active ingredient at least one therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide comprises the following method steps: a) Provision of a cell, blood or tissue sample of human or animal origin or a sample of microbial origin, wherein the cell, blood or tissue sample or microbial sample is in a predefined biological state and for which at least one therapeutically active, biotechnologically generated protein and / or peptide have relevant target structures; b) labeling the at least one therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide while maintaining its in vivo binding properties; c) applying a reagent solution containing the at least one labeled therapeutically active protein and / or peptide to the sample, wherein the application of the reagent solution takes place under predefined application conditions and with predefined concentrations of the labeled therapeutically active and biotechnologically produced protein and / or peptide; d) determination of the binding behavior of the
  • the advantage achievable with the invention consists, inter alia, in the fact that the method according to the invention, based on in-vitro binding studies, provides detailed information about the actual in-vivo action and activity Biologics side effect properties in the organ reference, thereby allowing both the prediction of the efficacy of the drug or biologics in question for the individual patient and targeted therapy management and monitoring with proven efficacy of the drug.
  • the possibility of prediction also advantageously allows pharmacological-pharmaceutical development processes to be significantly shortened. Furthermore, it allows the reduction of animal studies and clinical trials.
  • the application conditions according to method step c) include the variation of carrier solutions, temperature and pressure conditions.
  • At least one of the therapeutically active biotechnologically produced proteins or peptides is selected from the group: efalizumab, alefacept, infliximab, etanercept, basiliximab, daclizumab, muromonab, trastuzumab, ibritumomab, bevacizumab, cetuximab, rituximab, omalizumab, alemtuzumab, adalimumab or polyclonal antibodies.
  • Polyclonal antibodies may be, for example, a horse anti-T cell immune serum or rabbit anti-human T cell immune serum.
  • the labeling according to process step b) is carried out by covalent binding of one or more fluorochromes and / or by covalent binding of one or more biotin molecules and / or by covalent binding of one or more dioxigenin molecules and / or Labeling with a secondarily labeled antibody and / or a radioactive label to the therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide.
  • a fluorochrome used for labeling is, for example, fluorescein isothiocyanate (FITC).
  • the determination of the binding behavior of the therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide at the relevant target structures of the samples according to method step d) comprises the detection of at least one labeling pattern of the labeled protein and / or peptide.
  • the signal strength of the marker pattern is determined and compared with the signal strength of a marker pattern determined under the same experimental conditions of at least one reference sample Reference sample is a cell, blood or tissue sample or sample of microbial origin comparable to the sample tested.
  • the reference sample can thereby be in a biological state comparable to the examined sample or in another biological state which differs from that of the examined samples.
  • the biological conditions include healthy or disease-related conditions of cell, blood or tissue samples or microbial samples.
  • the cell or tissue sample may be a skin tissue affected by psoriasis, an inflammatory skin disease, a skin tumor, an inflammatory tissue or a tumor tissue, and a normal, healthy skin tissue in the reference sample.
  • a kit according to the invention for carrying out the methods described above comprises at least one therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide and at least one marker molecule, wherein the marker molecule does not influence the in vivo binding properties of the protein and / or peptide.
  • the marker molecule may comprise fluorochromes and / or biotin molecules and / or dioxigenin molecules as well as additionally secondary antibodies.
  • the therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide is selected from the following group: efalizumab, alefacept, infliximab, etanercept, basiliximab, daclizumab, muromonab, trastuzumab, ibritumomab, bevacizumab, cetuximab, rituximab, omalizumab, alemtuzumab, adalimumab or polyclonal antibodies .
  • Polyclonal antibodies may be, for example, a horse anti-T cell immune serum or rabbit anti-human T cell immune serum.
  • a biochip is additionally provided for carrying out the methods described above, wherein the biochip is a cell,
  • Origin and the sample is in a predefined biological state and has relevant target structures for at least one therapeutically active biotechnologically produced protein and / or peptide.
  • the therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide is chosen from the following group: efalizumab,
  • Ibritumomab Ibritumomab, bevacizumab, cetuximab, rituximab, omalizumab, alemtuzumab,
  • Adalimumab or polyclonal antibodies may be, for example, a horse anti-T cell immune serum or rabbit anti-human T cell immune serum.
  • the therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide efalizumab and the cell or tissue sample is a skin sample which has been fixed while preserving the relevant target structures.
  • the predefined biological condition of the skin sample is acutely psoriatic.
  • Efalizumab will covalently labeled with fluorescein-5-exuccinimidyl ester, while retaining its in vivo binding properties.
  • the labeled efalizumab is solubilized, with the screening conditions chosen to be as close as possible to the in vivo situation in the organ reference.
  • the in-solution, labeled efalizumab and optionally at least one other in solution against different cell types and / or structural components of the extracellular matrix and / or structures characteristic of cell proliferation, activation and adhesion are characterized , directed marker molecule sequentially applied to the skin sample.
  • the fluorescence labeling pattern is detected.
  • the individual marking patterns are digitized and processed.
  • the digitization and quantification of the detected signals is carried out by a method as described, for example, in EP 1 181 525.
  • phase contrast image is first recorded. This is followed by the automatic detection of the molecular patterns for single and / or multiple epitopes. These images are made accessible by the aforementioned digitization of a computer-aided evaluation.
  • the phase contrast image detected before the acquisition of the fluorescence images is used for the correct, pixel-precise superimposition of the corresponding fluorescence images.
  • the images thus oriented are subjected to background and false exposure correction in a second step and finally freed in a third step from any artifacts and / or defective pixels. This is done by applying a mask operation which marks the erroneous signals as invalid and excludes them from the following evaluation.
  • the digitized, processed images are binarized under the control of a specialist.
  • One pixel represents the topographic micro unit (TMU) at an area of 450x450 nm 2 at 20x optical magnification.
  • TMU topographic micro unit
  • the area of the digitized visual field is below this Conditions maximum 2000 x 2000 pixels.
  • the frequency of occurring pixel signals for the detected combinatorial marker patterns is set in relation to the horizontal width of the skin sample.
  • the vertical gradient of the considered skin sample can be taken into account, which is formed from tissue in the transition, growth and differentiation state.
  • the "pixel events normalized to horizontal skin width" parameter hereinafter referred to as PEN, is obtained.
  • the relevant target structures of the skin sample are mainly in the dermal compartment.
  • the detected, digitized and processed labeling patterns are used to determine the binding behavior of the labeled efalizumab in this compartment.
  • the evaluation of the determined binding behavior with regard to the efficacy of efalizumab in the concrete in vivo organ reference is made by comparing the in vitro identification and quantification data for the determined efalizumab binding structures with the typical identification and quantification data for acute psoriatic skin samples responding to efalizumab ,
  • the range of quantification values delineated with the aid of the further labeling molecules is between 1.1 ⁇ 10 3 PEN for MPO and 115 ⁇ 10 3 PEN for pan-CK and CD 138.
  • Efalizumab binding structures are up to 15 times greater in acute psoriatic skin samples against unaffected skin samples of the patient suffering from acute psoriasis and up to 32 times against healthy skin.
  • the quantitative values are 39.697 ⁇ 10.263 PEN.
  • the presence of efalizumab binding structures with quantitatively increased PEN values compared to healthy skin means that efalizumab is in principle effective for the individual patient and also enables the determination of an optimal, individually adapted dosage via the quantification data.
  • the therapeutically effective, biotechnologically produced protein and / or peptide efalizumab and the cell or tissue sample is a skin sample which has been fixed with preservation of the relevant target structures.
  • the predefined biological condition of the skin sample is a non-affected skin sample of an acute psoriatic patient.
  • an unaffected skin sample of an acutely psoriatic patient with principal efficacy of efalizumab over healthy control skin, there is a quantitative increase of the efalizumab binding structures up to 3-fold with PEN values of 2.598 ⁇ 2.448.
  • the therapeutically effective, biotechnologically produced protein and / or peptide efalizumab and the cell or tissue sample is a skin sample which has been fixed with preservation of the relevant target structures.
  • the predefined biological condition of the skin sample is a healthy skin sample of a non-psoriatic patient.
  • the quantitative determination of efalizumab binding structures in healthy skin yields values of 1.205 ⁇ 873 PEN.
  • the therapeutically effective, biotechnologically produced protein and / or peptide efalizumab and the cell or tissue sample is a skin sample which has been fixed with preservation of the relevant target structures.
  • the predefined biological condition of the skin sample is an acute psoriatic skin sample.
  • the relevant cellular targets are in T lymphocyte subpopulations which are positive for CD3, CD8, CD4, CD45RA, CLA and CD45R0.
  • the TMU-based determination of the localization of efalizumab binding structures leads to colocalization values of up to 84% for CD3 + -, up to 80% for CD8 + -, up to 93% for CD4 + DCD3 + -, up to 54% for CD45RA + , up to 73% for CLA + , and up to 87% for CD45R0 + T lymphocytes.
  • the basic efficacy of efalizumab for the specific patient can be determined by the characteristic of certain T lymphocytes as the target structure of efalizumab during its therapeutic application.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der therapeutischen Wirksamkeit von Substanzen, welche als Wirkstoff mindestens ein therapeutisch wirksames, biotechnologisch erzeugtes Protein und/oder Peptid enthalten. Die Erfindung betrifft weiterhin einen Kit und einen Biochip zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Description

Verfahren zur Bestimmung der therapeutischen Wirksamkeit von Substanzen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der therapeutischen Wirksamkeit von Substanzen, welche als Wirkstoff mindestens ein therapeutisch wirksames, biotechnologisch erzeugtes Protein und/oder Peptid enthalten. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der therapeutischen Wirksamkeit von Substanzen, welche als Wirkstoff mindestens ein therapeutisch wirksames, biotechnologisch erzeugtes Protein und/oder Peptid enthalten, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: a) Bereitstellung einer Zell-, Blut- oder Gewebeprobe menschlichen oder tierischen Ursprungs oder einer Probe mikrobiellen Ursprungs, wobei die Zell-, Blut- oder Gewebeprobe oder mikrobielle Probe in einem vordefinierten biologischen Zustand vorliegt und für das mindestens eine therapeutisch wirksame, biotechnologisch erzeugte Protein und/oder Peptid relevante Zielstrukturen aufweist; b) Markierung des mindestens einen therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids unter Erhaltung seiner In-vivo-Bindungseigenschaften; c) Aufbringen einer das mindestens eine markierte therapeutisch wirksame Protein und/oder Peptid enthaltenden Reagenzlösung auf die Probe, wobei das Aufbringen der Reagenzlösung unter vordefinierten Applikationsbedingungen und mit vordefinierten Konzentrationen des markierten therapeutisch wirksamen und biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids erfolgt; d) Ermittlung des Bindungsverhaltens des therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids an der oder den relevanten Zielstrukturen der Probe; und e) Auswertung des in d) ermittelten Bindungsverhaltens hinsichtlich der Wirksamkeit des mindestens einen therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids in der untersuchten Zell-, Blut- oder Gewebeprobe oder mikrobiellen Probe. Die Erfindung betrifft weiterhin einen Kit und einen Biochip zur Durchfuhrung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Autoimmun-Erkrankungen sind in der Bevölkerung weit verbreitet und manifestieren sich in verschiedensten Formen. In Deutschland leidet etwa 1% der Bevölkerung an der rheumatoiden Arthritis, die damit die häufigste der entzündlich rheumatischen Erkrankungen ist. Weit verbreitet sind auch Erkrankungen der Haut, wie beispielsweise die atopische Dermatitis (Neurodermitis) oder die Psoriasis (Schuppenflechte). Von der Psoriasis betroffen sind etwa 2-3% der mitteleuropäischen Bevölkerung, in den USA sogar 4-5%. Es handelt sich bei der Psoriasis um eine chronische Entzündung der Haut, die sich durch abnorme Proliferation der Epidermis-Zellen (Hyperplasie) und erhöhten kutanen Blutfluss auszeichnet und bei einem Teil der Patienten neben dem Befall von Fingernägeln zusätzlich zu einer Erkrankung der Gelenke führt, der sog. Psoriasis-Arthritis. Die Behandlungsmöglichkeiten hängen von der Ausbildung der Krankheit beim einzelnen Patienten ab und erfordern oft eine Kombination mehrerer Medikamente. Neben physikalischen Therapien wie UV-Bestrahlung existieren an verschiedenen Punkten ansetzende Präparate, die von Teer oder pflegenden Salben über die Gabe von Vitamin A- oder D- Abkömmlingen (z.B. Zorac®, Daivonex®) bis hin zur Verabreichung von Hormonen reichen. Die bei diesen Behandlungen insbesondere bei Langzeitanwendung auftretenden Nebenwirkungen begrenzen oft ihre Anwendbarkeit für den einzelnen Patienten und fuhren zu einer Nachfrage nach alternativen Therapieansätzen. Verschiedene Forschungsergebnisse weisen inzwischen auf eine zentrale Beteiligung von T-Zellen an der Pathophysiologie der Erkrankung hin. Dies führte zur Anwendung so genannter „Biologika" (engl. „Biologics") bei der Behandlung der Psoriasis und anderer Autoimmun- Erkrankungen. Bei den Biologics handelt es sich um eine vergleichsweise neue Klasse von Medikamenten, die hauptsächlich biotechnologisch hergestellte Proteine mit therapeutischer Wirkung beinhalten. Biologics können daher im Organbezug als Antikörper, Liganden oder Rezeptoren fungieren. Ihr großer Vorteil gegenüber den bisherigen Therapieformen besteht in ihrer hochgradig spezifischen Interaktion mit definierten molekularen Zielstrukturen. Dadurch können mit Biologics einerseits Medikamente zur Verfügung gestellt werden, die bei Versagen der übrigen Therapieansätze eine zusätzliche Möglichkeit der Behandlung bieten, andererseits können die bei den sonstigen Therapieformen häufig auftretenden Nebenwirkungen zum großen Teil vermieden werden. Ein unter anderem zur Behandlung von Psoriasis eingesetztes Biologie ist Efalizumab (Raptiva®). Es handelt sich hierbei um einen humanisierten monoklonalen IgGl -Antikörper, der gegen das Molekül CDl Ia gerichtet ist. CDl Ia (α-L Integrin) bildet nach seiner nicht-kovalenten Assoziierung mit CD 18 (ß2 Integrin) das heterodimere LFA-I (Lymphocyte Function-associated Antigen- 1), welches seinerseits CD54 (ICAM-I) bindet. LFA-I wird auf Lymphozyten, Monozyten und Neutrophilen exprimiert und spielt eine wichtige Rolle bei Zell-Zell-Adhäsionsprozessen. Efalizumab zeigte in klinischen Studien bei 30-40% der Patienten innerhalb von 12 Wochen eine deutliche Besserung der Erkrankung und bietet so zumindest einem Teil der Patienten eine neue, vielversprechende Therapieform.
Bekannte Diagnose- und Prädiktionsansätze machen Gebrauch von genetischen Methoden zur Bestimmung bestimmter Polymorphismen im Genom des einzelnen Patienten. Die so ermittelten Resultate können in bestimmten Fällen zur Ableitung der Anfälligkeit dieses Patienten gegenüber der fraglichen Krankheit verwendet werden. Aus der WO 2005/112568 ist ein Verfahren zur Diagnose oder Vorhersage des Ansprechverhaltens eines Patienten auf eine Behandlung mit T- Zellen- vermindernden Medikamenten bekannt. So werden mit Hilfe dieses Verfahrens verschiedene Haplotypen identifiziert, die darauf schließen lassen, dass eine Behandlung mit Alefacept (Amevive®) erfolgversprechend ist. Auch Alefacept gehört zur Gruppe der Biologika bzw. Biologics und kann zur Behandlung der Psoriasis verwendet werden. Nachteilig an derartigen DNA-basierten Verfahren ist jedoch ihre Aufwändigkeit und die Beschränkung auf T-Zellen-assoziierte Krankheiten. Des Weiteren wirken Biologics nicht bei allen Patienten gleich. Bisher ist eine Prädiktion über die prinzipielle Wirksamkeit für den einzelnen Patienten kaum möglich und erfolgt nach dem Trial-and-Error-Prinzip. Dementsprechend ist bisher im Vorfeld einer Behandlung keine für den Einzelfall optimierte Dosis-Ermittlung und geeignete Therapieüberwachung möglich.
Da Biologics als Immunsuppresiva schwerwiegende Nebenwirkungen haben können ist, ist die Entwicklung einer zuverlässigen Prädiktionmethode zur Vermeidung einer unwirksamen therapeutischen Anwendung sehr wichtig.
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der therapeutischen Wirksamkeit von Substanzen, welche als Wirkstoff mindestens ein therapeutisch wirksames, biotechnologisch erzeugtes Protein und/oder Peptid („Biologics") enthalten, bereitzustellen, welches Aussagen über die grundsätzliche Wirksamkeit von einem oder mehreren therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteinen und/oder Peptiden für den individuellen Patienten im Vorfeld der Behandlung erlaubt und/oder mit deren Hilfe sich der Verlauf der therapeutischen Behandlung kontrollieren lässt. Es ist weiterhin Aufgabe der vorliegenden Erfindung einen Kit und einen Biochip zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bereitzustellen.
Gelöst werden diese Aufgaben durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 , einem Kit mit den Merkmalen des Anspruchs 14 und einem Biochip mit den Merkmalen des Anspruchs 17.
Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den jeweiligen Unteransprüchen beschrieben.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung der therapeutischen Wirksamkeit von Substanzen, welche als Wirkstoff mindestens ein therapeutisch wirksames, biotechnologisch erzeugtes Protein und/oder Peptid enthalten, umfasst folgende Verfahrensschritte: a) Bereitstellung einer Zell-, Blut- oder Gewebeprobe menschlichen oder tierischen Ursprungs oder einer Probe mikrobiellen Ursprungs, wobei die Zell-, Blutoder Gewebeprobe oder mikrobielle Probe in einem vordefinierten biologischen Zustand vorliegt und für das mindestens eine therapeutisch wirksame, biotechnologisch erzeugte Protein und/oder Peptid relevante Zielstrukturen aufweist; b) Markierung des mindestens einen therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids unter Erhaltung seiner In-vivo-Bindungseigenschaften; c) Aufbringen einer das mindestens eine markierte therapeutisch wirksame Protein und/oder Peptid enthaltenden Reagenzlösung auf die Probe, wobei das Aufbringen der Reagenzlösung unter vordefinierten Applikationsbedingungen und mit vordefinierten Konzentrationen des markierten therapeutisch wirksamen und biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids erfolgt; d) Ermittlung des Bindungsverhaltens des therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids an der oder den relevanten Zielstrukturen der Probe; und e) Auswertung des in d) ermittelten Bindungsverhaltens hinsichtlich der Wirksamkeit des mindestens einen therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids in der untersuchten Zell-, Blut- oder Gewebeprobe oder mikrobiellen Probe. Der mit der Erfindung erzielbare Vorteil besteht unter anderem darin, dass das erfindungsgemäße Verfahren ausgehend von in-vitro Bindungsstudien detaillierte Erkenntnisse über die tatsächlichen in-vivo Wirkungs- und Nebenwirkungseigenschaften von Biologics im Organbezug liefert und dadurch sowohl die Prädiktion der Wirksamkeit des das oder die fraglichen Biologics enthaltenden Medikaments für den einzelnen Patienten als auch eine gezielte Therapieführung und - Überwachung bei erwiesener Wirksamkeit des Medikaments erlaubt. Durch die Möglichkeit einer Prädiktion lassen sich zudem vorteilhafterweise pharmakologisch- pharmazeutische Ent-wicklungsprozesse signifikant verkürzen. Weiterhin erlaubt es die Verringerung von Tierversuchen und klinischen Studien. Dabei umfassen in einer vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens die Applikationsbedingungen gemäß Verfahrensschritt c) die Variation von Trägerlösungen, Temperatur- und Druckbedingungen. Mindestens eines der therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteine oder Peptide ist gewählt aus der Gruppe: Efalizumab, Alefacept, Infliximab, Etanercept, Basiliximab, Daclizumab, Muromonab, Trastuzumab, Ibritumomab, Bevacizumab, Cetuximab, Rituximab, Omalizumab, Alemtuzumab, Adalimumab oder polyklonale Antikörper. Polyklonale Antikörper können zum Beispiel ein Anti-T-Zell-Immunserum vom Pferd oder ein Antihuman T-Zell-Immunserum vom Kaninchen sein. Durch die Möglichkeit der Prädiktion und Auswahl wirksamer Medikamente im Vorfeld der Behandlung und der genauen Kontrollierbarkeit ihrer therapeutischen Anwendung ergeben sich zudem vorteilhafterweise deutliche Kostensenkungen in diesem Bereich.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Markierung gemäß Verfahrensschritt b) durch kovalente Bindung eines oder mehrerer Fluorochrome und/oder durch kovalente Bindung eines oder mehrerer Biotin-Moleküle und/oder durch kovalente Bindung eines oder mehrerer Dioxigenin-Moleküle und/oder durch Markierung mit einem sekundär markiertem Antikörper und/oder einer radioaktiven Markierung an das therapeutisch wirksame, biotechnologisch erzeugte Protein und/oder Peptid. Ein zur Markierung geeignetes verwendetes Fluorchrom ist zum Beispiel Fluoresceinisothiocyanat (FITC).
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird für den Fall, dass eine direkte Markierung des therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids nicht möglich ist oder zu einer Beeinflussung seiner in-vivo Bindungseigenschaften führt, wird zwischen das mindestens eine therapeutisch wirksame, biotechnologisch hergestellte Protein und/oder Peptid und die mindestens eine Markierung mindestens ein Spacer eingefugt.
In weiteren vorteilhaften Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die Ermittlung des Bindungsverhaltens des therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids an der oder den relevanten Zielstrukturen der Proben gemäß Verfahrensschritt d) die Detektion von mindestens einem Markierungsmuster des markierten Proteins und/oder Peptids umfasst. Dabei wird zur Quantifizierung der Wirksamkeit des mindestens einen an die Zielstruktur bzw. Zielstrukturen gebundenen therapeutisch wirksamen und biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids die Signalstärke des Markierungsmusters ermittelt und mit der Signalstärke eines unter den gleichen Versuchsbedingungen ermittelten Markierungsmusters von mindestens einer Referenzprobe verglichen, wobei die Referenzprobe eine zur untersuchten Probe vergleichbare Zell-, Blut- oder Gewebeprobe oder Probe mikrobiellen Ursprungs ist. Die Referenzprobe kann sich dabei in einem zur untersuchten Probe vergleichbaren biologischen Zustand oder in einem weiteren, sich von dem der untersuchten Proben unterscheidenden biologischen Zustand befinden. So umfassen die biologischen Zustände gesunde oder krankheitsbedingte Zustände von Zell-, Blut- oder Gewebeproben oder mikrobiellen Proben. Beispielhaft kann es sich bei der Zell- oder Gewebeprobe um ein durch Psoriasis, eine entzündliche Hauterkrankung, einen Hauttumor, ein entzündliches Gewebe oder ein Tumorgewebe betroffenes Hautgewebe und bei der Referenzprobe um ein normales, gesundes Hautgewebe handeln.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die relevanten Zielstrukturen der Zell-, Blut- oder Gewebeproben und/oder der
Referenzproben mittels eines automatisierten Verfahrens durch wiederholtes Aufbringen von Referenzlösungen, die jeweils mindestens ein Markiermolekül umfassen, ermittelt.
Nach dem Einwirken einer Referenzlösung wird jeweils mindestens ein
Markierungsmuster automatisch detektiert, wobei die detektierten Markierungsmuster zu einem komplexen molekularen Kombinationsmuster der Zell-, Blut- oder Gewebeproben oder mikrobiellen Proben und/oder der Referenzproben zusammengefasst werden. Ein derartiges Verfahren ist in der EP 0 810 428 oder der DE 197 09 348 beschrieben. Ein erfindungsgemäßer Kit zur Durchfuhrung der im Vorhergehenden beschriebenen Verfahren umfasst mindestens ein therapeutisch wirksames, biotechnologisch hergestelltes Protein und/oder Peptid und mindestens ein Markierungsmolekül, wobei das Markierungsmolekül die In-vivo-Bindungseigenschaften des Proteins und/oder Peptids nicht beeinflusst. Dabei kann das Markierungsmolekül Fluorochrome und/oder Biotin- Moleküle und/oder Dioxigenin-Moleküle sowie zusätzlich sekundäre Antikörper umfassen. Das therapeutisch wirksame, biotechnologisch hergestellte Protein und/oder Peptid ist dabei aus folgender Gruppe gewählt: Efalizumab, Alefacept, Infliximab, Etanercept, Basiliximab, Daclizumab, Muromonab, Trastuzumab, Ibritumomab, Bevacizumab, Cetuximab, Rituximab, Omalizumab, Alemtuzumab, Adalimumab oder polyklonale Antikörper. Polyklonale Antikörper können zum Beispiel ein Anti-T-Zell-Immunserum vom Pferd oder ein Antihuman T-Zell-Immunserum vom Kaninchen sein.
Im Rahmen der Erfindung wird zudem ein Biochip zur Durchführung der im Vorhergehenden beschriebenen Verfahren bereitgestellt, wobei der Biochip eine Zell-,
Blut- oder Gewebeprobe menschlichen, tierischen Ursprungs oder eine Probe mikrobiellen
Ursprungs umfasst und die Probe in einem vordefinierten biologischen Zustand vorliegt und relevante Zielstrukturen für mindestens ein therapeutisch wirksames biotechnologisch erzeugtes Protein und/oder Peptid aufweist. Das therapeutisch wirksame, biotechnologisch hergestellte Protein und/oder Peptid ist dabei aus folgender Gruppe gewählt: Efalizumab,
Alefacept, Infliximab, Etanercept, Basiliximab, Daclizumab, Muromonab, Trastuzumab,
Ibritumomab, Bevacizumab, Cetuximab, Rituximab, Omalizumab, Alemtuzumab,
Adalimumab oder polyklonale Antikörper. Polyklonale Antikörper können zum Beispiel ein Anti-T-Zell-Immunserum vom Pferd oder ein Antihuman T-Zell-Immunserum vom Kaninchen sein.
Weitere Einzelheiten und Anwendungsbereiche ergeben sich aus der folgenden Beschreibung mehrerer Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Verfahrens:
In einer bevorzugten Ausführung ist das therapeutisch wirksame, biotechnologisch erzeugte Protein und/oder Peptid Efalizumab und die Zell- oder Gewebeprobe eine Hautprobe, welche unter Konservierung der relevanten Zielstrukturen fixiert wurde. Der vordefinierte biologische Zustand der Hautprobe ist akut psoriatisch. Efalizumab wird unter Erhaltung seiner in- vivo Bindungseigenschaften kovalent mit Fluorescein-5-ex- succinimidylester markiert. Das markierte Efalizumab wird in Lösung gebracht, wobei die Vεrsuchsbedingungen so gewählt werden, dass sie der in-vivo Situation im Organbezug so weit wie möglich entsprechen. Mittels eines automatisierten Verfahrens wird das in Lösung vorliegende, markierte Efalizumab sowie gegebenenfalls mindestens ein weiteres in Lösung vorliegendes, gegen unterschiedliche Zelltypen und/oder gegen strukturelle Komponenten der extrazellulären Matrix und/oder gegen Strukturen, die für Zeilproliferation, -aktivierung und -adhäsion charakteristisch sind, gerichtetes Markierungsmolekül nacheinander auf die Hautprobe aufgebracht. In jedem Durchgang wird das Fluoreszenz-Markierungsmuster detektiert. Die einzelnen Markierungsmuster werden digitalisiert und prozessiert. Dabei erfolgt die Digitalisierung und Quantifizierung der detektierten Signale durch eine Methode, wie sie zum Beispiel in der EP 1 181 525 beschrieben ist.
Von einer Hautgewebeprobe wird zunächst ein Phasenkontrastbild aufgenommen. Anschließend folgt die automatische Detektion der molekularen Muster für Einzel- und/oder Mehrfachepitope. Diese Bilder werden durch die genannte Digitalisierung einer computergestützten Auswertung zugänglich gemacht. Das vor der Aufnahme der Fluoreszenzbilder detektierte Phasenkontrastbild wird zur korrekten, pixelgenauen Überlagerung der korrespondierenden Fluoreszenzaufnahmen verwendet. Die so ausgerichteten Bilder werden in einem zweiten Schritt einer Hintergrund- und Fehlbelichtungskorrektur unterzogen und schließlich in einem dritten Schritt von eventuell vorhandenen Artefakten und/oder fehlerhaften Pixeln befreit. Dies geschieht durch die Anwendung einer Maskenoperation, welche die fehlerhaften Signale als ungültig markiert und von der folgenden Auswertung ausschließt.
Die digitalisierten, bearbeiteten Bilder werden unter der Kontrolle eines Fachmanns binarisiert. Durch Überlagerung der binarisierten Bilder für jedes der detektierten Epitope erhält man eine Matrix der molekularen Signale, welche binär kodierten, der Boole 'sehen Logik folgenden Vektoren (l=ja/wahr, 0=nein/falsch) für jedes Pixel des digitalisierten visuellen Feldes entsprechen. Ein Pixel stellt bei einer Fläche von 450x450 nm2 bei 20facher optischer Vergrößerung die topographischen Basiseinheit (topographic micro unit - TMU) dar. Die Fläche des digitalisierten visuellen Feldes beträgt unter diesen Bedingungen maximal 2000 x 2000 Pixel. Die Häufigkeit der auftretenden Pixel-Signale für die detektierten kombinatorischen Markierungsmuster wird ins Verhältnis zu der horizontalen Breite der Hautprobe gesetzt. Auf diese Weise kann der vertikale Gradient der betrachteten Hautprobe berücksichtig werden, welcher aus Gewebe im Übergangs-, Wachstums- und Differenzierungzustand gebildet wird. Man erhält als geeignete Kenngröße zur Quantifizierung der Exprimierung und Co-Exprimierung von Epitopen den „pixel events normalized to horizontal skin width"-Parameter, im Folgenden kurz PEN genannt.
Die relevanten Zielstrukturen der Hautprobe liegen hauptsächlich im dermalen Kompartiment. Die detektierten, digitalisierten und prozessierten Markierungsmuster werden zur Ermittlung des Bindungsverhaltens des markierten Efalizumabs in diesem Kompartiment verwendet. Die Auswertung des ermittelten Bindungsverhaltens hinsichtlich der Wirksamkeit von Efalizumab im konkreten in-vivo Organbezug erfolgt durch den Vergleich der in-vitro Identifizierungs- und Quantifizierungsdaten für die ermittelten Efalizumab-Bindungsstrukturen mit den für akut-psoriatische, auf Efalizumab ansprechenden Hautproben typischen Identifizierungs- und Quantifizierungsdaten. Der mit Hilfe der weiteren Markierungsmoleküle abgegrenzte Bereich der Quantifizierungswerte liegt dabei zwischen 1,1 x 103 PEN für MPO und 115 x 103 PEN für pan-CK und CD 138. Efalizumab-Bindungsstrukturen sind bei akut-psoriatischen Hautproben um das bis zu 15fache gegenüber nicht befallenen Hautproben des unter akuter Psoriasis leidenden Patienten und um das bis zu 32fache gegenüber gesunder Haut exprimiert. Die quantitativen Werte liegen bei 39,697 ± 10,263 PEN. Ein Vorliegen von Efalizumab- Bindungsstrukturen mit gegenüber gesunder Haut quantitativ erhöhten PEN-Werten bedeutet die prinzipielle Wirksamkeit von Efalizumab für den individuellen Patienten und ermöglicht über die Quantifizierungsdaten zudem die Ermittlung einer optimalen, individuell angepassten Dosierung.
In einer weiteren Anwendung der Erfindung ist das therapeutisch wirksame, biotechnologisch erzeugte Protein und/oder Peptid Efalizumab und die Zell- oder Gewebeprobe eine Hautprobe, welche unter Konservierung der relevanten Zielstrukturen fixiert wurde. Bei dem vordefinierten biologischen Zustand der Hautprobe handelt es sich um eine nicht befallene Hautprobe eines unter akuter Psoriasis leidenden Patienten. Bei einer nicht befallenen Hautprobe eines akut psoriatischen Patienten findet sich bei prinzipieller Wirksamkeit von Efalizumab gegenüber gesunder Kontrollhaut eine quantitative Erhöhung der Efalizumab-Bindungsstrukturen um das bis zu 3 fache mit PEN- Werten von 2,598 ± 2,448.
In einer weiteren Anwendung der Erfindung ist das therapeutisch wirksame, biotechnologisch erzeugte Protein und/oder Peptid Efalizumab und die Zell- oder Gewebeprobe eine Hautprobe, welche unter Konservierung der relevanten Zielstrukturen fixiert wurde. Bei dem vordefinierten biologischen Zustand der Hautprobe handelt es sich um eine gesunde Hautprobe eines nicht unter Psoriasis leidenden Patienten. Die quantitative Bestimmung von Efalizumab-Bindungsstrukturen in gesunder Haut liefert Werte von 1,205 ± 873 PEN.
In einer weiteren Anwendung der Erfindung ist das therapeutisch wirksame, biotechnologisch erzeugte Protein und/oder Peptid Efalizumab und die Zell- oder Gewebeprobe eine Hautprobe, welche unter Konservierung der relevanten Zielstrukturen fixiert wurde. Bei dem vordefinierten biologischen Zustand der Hautprobe handelt es sich um eine akut psoriatische Hautprobe. Die relevanten zellulären Zielstrukturen liegen in T- Lymphozyten-Subpopulationen, die positiv für CD3, CD8, CD4, CD45RA, CLA und CD45R0 sind. Die TMU-basierte Bestimmung der Lokalisierung von Efalizumab- Bindungsstrukturen führt zu Kolokalisierungs-werten von bis zu 84% bei CD3+-, bis zu 80% bei CD8+-, bis zu 93% bei CD4+DCD3+-, bis zu 54% bei CD45RA+-, bis zu 73% bei CLA+- und bis zu 87% bei CD45R0+-T-Lymphozyten. Auf diese Weise kann über die Eigenschaft bestimmter T-Lymphozyten als Zielstruktur von Efalizumab während dessen therapeutischer Anwendung die grundsätzliche Wirksamkeit von Efalizumab für den konkreten Patienten ermittelt werden.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Bestimmung der therapeutischen Wirksamkeit von Substanzen, welche als Wirkstoff mindestens ein therapeutisch wirksames, biotechnologisch erzeugtes Protein und/oder Peptid enthalten, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren folgende Schritte umfasst:
(a) Bereitstellung einer Zell-, Blut- oder Gewebeprobe menschlichen oder tierischen Ursprungs oder einer Probe mikrobiellen Ursprungs, wobei die Zell-, Blut- oder Gewebeprobe oder mikrobielle Probe in einem vordefinierten biologischen Zustand vorliegt und für das mindestens eine therapeutisch wirksame, biotechnologisch erzeugte Protein und/oder Peptid relevante Zielstrukturen aufweist;
(b) Markierung des mindestens einen therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids unter
Erhaltung seiner In-vivo-Bindungseigenschaften;
(c) Aufbringen einer das mindestens eine markierte therapeutisch wirksame Protein und/oder Peptid enthaltenden Reagenzlösung auf die Probe, wobei das Aufbringen der Reagenzlösung unter vordefinierten Applikationsbedingungen und mit vordefinierten
Konzentrationen des markierten therapeutisch wirksamen und biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids erfolgt;
(d) Ermittlung des Bindungsverhaltens des therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids an der oder den relevanten Zielstrukturen der Probe; und
(e) Auswertung des in 0 ermittelten Bindungsverhaltens hinsichtlich der Wirksamkeit des mindestens einen therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids in der untersuchten Zell-, Blut- oder Gewebeprobe oder mikrobiellen Probe.
2. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eines der therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteine und/oder Peptide Efalizumab, Alefacept, Infliximab, Etanercept, Basiliximab, Daclizumab, Muromonab, Trastuzumab, Ibritumomab, Bevacizumab, Cetuximab, Rituximab, Omalizumab, Alemtuzumab, Adalimumab oder polyklonale Antikörper umfasst.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierung gemäß Verfahrensschritt b) durch kovalente Bindung eines oder mehrerer Fluorochrome und/oder durch kovalente Bindung eines oder mehrerer Biotin-Moleküle und/oder durch kovalente Bindung eines oder mehrerer Dioxigenin-Moleküle und/oder durch Markierung mit einem sekundären markierten
Antikörper und/oder einer radioaktiven Markierung an das therapeutisch wirksame, biotechnologisch erzeugte Protein und/oder Peptid erfolgt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein zur Markierung verwendetes Fluorchrom Fluoresceinisothiocyanat (FITC) umfasst.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen das mindestens eine therapeutisch wirksame, biotechnologisch hergestellte Protein und/oder Peptid und die mindestens eine Markierung mindestens ein Spacer eingefügt ist.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Applikationsbedingungen gemäß Verfahrensschritt c) die Variation von Trägerlösungen, Temperatur- und Druckbedingungen umfasst.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Ermittlung des Bindungsverhaltens des therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids an der oder den relevanten Zielstrukturen der Probe gemäß Verfahrensschritt d) die Detektion von mindestens einem Markierungsmuster des markierten Proteins und/oder Peptids umfasst.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass zur Quantifizierung der Wirksamkeit des mindestens einen an die Zielstruktur bzw. Zielstrukturen gebundenen therapeutisch wirksamen und biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids die Signalstärke des Markierungsmusters ermittelt wird und mit der Signalstärke eines unter den gleichen Versuchsbedingungen ermittelten Markierungsmusters von mindestens einer Referenzprobe verglichen wird, wobei die Referenzprobe eine zur untersuchten Probe vergleichbare Zell-, Blut- oder
Gewebeprobe oder mikrobielle Probe ist.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Referenzprobe in einem zur untersuchten Probe vergleichbaren biologischen Zustand befindet.
10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Referenzprobe in einem weiteren, sich von dem der untersuchten Proben unterscheidenden biologischen Zustand befindet.
1 1. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die biologischen Zustände gesunde oder krankheitsbedingte biologische Zustände von Zell-, Blutoder Gewebeproben oder mikrobiellen Proben darstellen.
12. Verfahren nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Zell- oder Gewebeprobe ein durch Psoriasis, eine entzündliche Hauterkrankung, einen
Hauttumor, ein entzündliches Gewebe oder ein Tumorgewebe betroffenes Hautgewebe und die Referenzprobe ein normales, gesundes Hautgewebe ist.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die relevanten Zielstrukturen der Zell-, Blut- oder Gewebeproben oder Proben mikrobiellen Ursprungs und/oder der Referenzproben mittels eines automatisierten Verfahrens durch wiederholtes Aufbringen von Referenzlösungen, die jeweils mindestens ein Markiermolekül umfassen, ermittelt werden und nach dem Einwirken einer Referenzlösung jeweils mindestens ein Markierungsmuster automatisch detektiert wird, wobei die detektierten Markierungsmuster zu einem komplexen molekularen Kombinationsmuster der Zell-, Blut- oder Gewebeproben und/oder der Referenzproben zusammengefasst werden.
14. Kit zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 umfassend mindestens ein therapeutisch wirksames, biotechnologisch hergestelltes Protein und/oder Peptid und mindestens ein Markierungsmolekül, wobei das Markierungsmolekül die In-vivo-Bindungseigenschaften des Proteins und/oder Peptids nicht beeinflusst.
15. Kit nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Markierungsmolekül Fluorochrome und/oder Biotin-Moleküle und/oder Dioxigenin-Moleküle sowie sekundäre Antikörper umfasst.
16. Kit nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Protein und/oder Peptid Efalizumab, Alefacept, Infliximab, Etanercept, Basiliximab, Daclizumab, Muromonab, Trastuzumab, Ibritumomab, Bevacizumab, Cetuximab, Rituximab, Omalizumab, Alemtuzumab, Adalimumab oder polyklonale Antikörper umfasst.
17. Biochip zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 umfassend eine Zell-, Blut- oder Gewebeprobe menschlichen, tierischen oder eine Probe mikrobiellen Ursprungs, wobei die Probe in einem vordefinierten biologischen Zustand vorliegt und relevante Zielstrukturen für mindestens ein therapeutisch wirksames, biotechnologisch erzeugtes Protein und/oder Peptid aufweist.
18. Biochip nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Protein und/oder Peptid Efalizumab, Alefacept, Infliximab, Etanercept,
Basiliximab, Daclizumab, Muromonab, Trastuzumab, Ibritumomab, Bevacizumab, Cetuximab, Rituximab, Omalizumab, Alemtuzumab, Adalimumab oder polyclonale Antikörper umfasst.
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