WO2002073209A2 - Verfahren zur identifikation von immunreaktiven epitopen auf proteinen - Google Patents

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Definitions

  • the immune system is an integral evolutionary component of the origin and development of animal life.
  • the immune system of higher organisms has three essential tasks
  • Antibodies play an important role in this complex interplay between organism and immune system. Their function goes beyond mere attachment to their target and assisting in target destruction. They are involved in the regulation of all important immunological processes in the organism, in the cooperation of humoral and cellular immune reactions.
  • Autoantibodies-associated autoimmune diseases have a certain special status.
  • Autoantibodies are ligands with pathological properties with regard to their targets - endogenous structures in the tissue, on cells etc. - because they induce the destruction of the tissue / organ or lead to the dysfunction of cells etc.
  • they mark it as an epitope. Knowing the structure of epitopes - eg the respective amino acid sequence - is of fundamental importance for future medicine or the prevention and treatment of diseases.
  • An antibody binding epitope can then serve as a starting point or target for various therapeutically oriented product developments.
  • Antibodies are among the best-studied structures of the immune system. Although important functions have been known for many years, if not decades, new functions are still being discovered or the importance of antibodies is being recognized more and more. This applies less generally than in the context of defined so-called targets and diseases, in which these targets or the antibodies have a pathogenetic meaning. Antibodies regularly mark a target by binding to their epitope. Binding can initiate a number of subsequent immunological reactions. This includes e.g. B. complement activation, which generally leads to local target destruction, a local inflammatory response and cytokine release. Interaction with certain cellular surface molecules (Fc receptors) initiates cellular activation processes, which in turn intervene in immune regulation. This often results in further follow-up reactions.
  • Fc receptors cellular surface molecules
  • Antibodies can contribute to the development of diseases in a variety of ways (autoimmune diseases, chronic inflammation) or to fight the disease (infections, cancer) and support the body's immune system.
  • the recognition of the binding sites of antibodies at the molecular level of organism's own structures is synonymous with the identification of a peptide epitope. If defined amino acid sequences, the location of which is known in the respective proteome / protein, are offered to the antibodies as a binding region and bind antibodies to certain peptide epitopes, medically valuable targets can be identified.
  • the target / peptide epitope is, after assured specificity and in the context of the respective disease, the starting molecule - both as a peptide itself and in transcribed form (DNA / RNA) - for a number of medically useful uses, e.g. can be used for ligand development to eliminate pathological antibodies from body fluids, especially the bloodstream, or to induce therapeutic antibodies.
  • Autoantibodies can be understood as a failure of the humoral immune defense (natural autoantibodles are excluded from this view). The immune system has failed in the sense of alien self-recognition or has been outwitted.
  • DCM Dilatative cardiomyopathy
  • Antibodies are the material expression of a specific humoral immune response with which the organism pursues the goal of eliminating an antigen or an agent or a cancer cell. If there is no self-therapeutic success despite these efforts of the immune system, it may mean that the organism's immunoreactive capacity is too low.
  • target / epitope-specific antibodies can be added directly to the organism to help them fight the agent / pathogen etc.
  • Another therapeutic option is the specific enhancement of the body's immune system by administering immunogenic peptide epitopes or their transcribed form (DNA / RNA).
  • US-A-5,553,325 describes peptides or peptide libraries which are used as randomized or focused peptide families to investigate the interaction of such peptides with substances of interest.
  • these include antibodies, receptors, toxins, active parts of proteins.
  • the peptides described are soluble and have a length of 3 to 8 amino acids.
  • US-A-4,906,564 describes the identification of surface antigens in determinants of intact pathogens, the identification of the antigenic components being carried out by antibodies. Immune complexes are analyzed that can arise from the reaction of immunoglobulins directed against malaria pathogens and as yet undefined Plasmodium antigens.
  • An object of the present invention relates to the identification and provision of antibody-binding epitopes of proteins of human or microbial origin and creates a prerequisite for the development of new substances which can be used to treat autoimmune diseases, cancer or infectious diseases.
  • This object is achieved according to the invention by a method for identifying immunoreactive epitopes on proteins from human cells, tissues, organs and from microorganisms which are associated with diseases such as autoimmune diseases, cancerous diseases or infections, samples a) of patients with these diseases being processed to obtain fractions in which Fa'b 'antibody fragments and / or antigen-recognizing immunoglobulin fragments are enriched or isolated, b) the fractions enriched or isolated in step (a) are brought into contact with peptides which have at least twelve amino acids and are immobilized on a support and are obtained by fragmentation from proteins or proteomes, c) in an assay in which Peptides with more than twelve amino acids
  • Antibody fragments and / or antigen-recognizing fragments are provided.
  • Immunoglobulin fragments are checked, whereupon d) in the case of interactions between the Fa'b 'antibody fragments and / or antigen-recognizing immunoglobulin fragments and the peptide having at least twelve amino acids, the peptide having at least twelve amino acids can be recognized as an immunoreactive epitope and, if necessary, further analyzed ,
  • the method according to the invention allows the identification of immunoreactive epitopes in a simple manner.
  • An identified epitope on a human protein to which autoantibodies / antibodies bind has the potential to be an agent that can be used for medical purposes.
  • the following possible uses of an antibody binding epitope identified by the method according to the invention result: 1 for specific immunoglobulin adsorption for the removal of epitope-specific autoantibodies,
  • Points. 1st-3rd and 7. apply more with regard to autoimmune diseases, points 4.-6. apply more to cancer and infectious diseases. Point 7 applies to all epitopes and antibodies.
  • the method according to the invention can be used in particular in high-throughput screening with which
  • Antibody-binding epitopes that are specifically identified for cancer,
  • Antibody-binding epitopes from microorganisms are identified.
  • immunoglobulins namely Fa'b 'antibody fragments and / or antigen-recognizing immunoglobulin fragments, which are obtained with peptides which have more than twelve amino acids, preferably obtained from human proteomes or microbial, can be isolated Proteomes.
  • the proteins / proteomes were fragmented into peptides with at least twelve amino acids and bound on a solid phase. It is also possible that To synthesize peptides directly on a solid phase, the amino acid sequences used being derived from proteins / proteomes.
  • immunoglobulin subclasses e.g. immunoglobulin Gl - G4, IgM, IgA
  • immunoglobulin fragments recognizing antigens
  • animal immunoglobulins in the form described above after immunization with human proteins recombinant proteins Peptides, organ extracts, tissues or microorganisms possible to identify immunoreactive peptide epitopes with the resulting immunoglobulins or fragments.
  • linear or cyclized amino acid chains of human or microbial protein molecules in a chain length of at least twelve amino acids, preferably overlapping in their sequence, e.g. used in steps of two.
  • the solid-phase-fixed peptides are incubated, for. B. as peptide spots on chips or other suitable carriers with an antibody-containing reaction solution (containing the patient / test subject immunoglobulins or immunoglobulin fragments, for example in a suitable buffer solution or protein solution.
  • an antibody-containing reaction solution containing the patient / test subject immunoglobulins or immunoglobulin fragments, for example in a suitable buffer solution or protein solution.
  • the Fa'b 'antibody fragments or antigen bind recognizing immunoglobulin fragments the surfaces on which the ready-to-bind peptides are contained.
  • the detection of the Fa'b 'antibody fragments or the antigen-recognizing immunoglobulin fragments on a peptide is carried out using fluorescence, luminescence, colorimetric, densidomentric, laser-optical or other physical methods customary in antibody diagnostics. For. Carrying out the methods for detecting an interaction between the immunoreactive epitopes to be identified are the Fa'b 'antibody fragments or antigen-recognizing immunoglobulin fragments, for. B. marked with dyes. Fluorescein isothiocyanate (FITC) is particularly suitable for labeling. Further possibilities for labeling antibodies or antibody fragments are known to the person skilled in the art.
  • FITC Fluorescein isothiocyanate
  • fluorescent dyes such as phycoerythrin or the streptavidin ligand biotin.
  • Luminescent markers such as luminol or the coupling of the immunoglobulins or immunoglobulin fragments to marker enzymes such as alkaline phosphatase or metal ions are also possible.
  • Another embodiment relates to another detection of the bound antibodies or Fa'b 'antibody fragments or immunoglobulin fragments recognizing antigen on the peptide.
  • Biotin synthesized can be seen from the amount of bound streptavidin molecules, which are fluorescence-labeled or otherwise equipped with a marker molecule, whether the Fa'b 'antibody fragments or antigen-recognizing immunoglobulin fragments have previously bound to a peptide.
  • the Fa'b 'antibody fragments or immunoglobulin fragments recognizing antigen to marker molecules there is also the possibility of direct detection of the binding of immunoglobulin or immunoglobulin fragments to the peptides.
  • the use of certain laser-optical light signals allows direct measurement.
  • the protein ligating to the peptides is detected by measuring the change in the vibrational properties of the light.
  • the immunoreactive epitope specifically reacts with a polypeptide, antibody, autoantibody, Fa'b 'antibody fragments or other antigen-recognizing immunoglobulin fragments.
  • the immunoreactive epitope is in particular a component of a structurally and functionally characterized protein such as, for example, plasma proteins, cell-bound receptor molecules (e.g. ⁇ 1 adrenergic
  • Receptor neuroreceptors, hormone receptors, immune receptors
  • intracellular or extracellular enzymes e.g. DNAse, trypsinogen, plasminogen
  • extra- or intracellular matrix proteins e.g. collagens, fibrinogen, hyaluronic acid, cytokeratins.
  • the immunoreactive epitope is contained in proteomes and derived from protein, proteome or genome databases, synthesized and / or isolated from biological or recombinant material.
  • the peptides are advantageously applied directly to solid matrices, e.g. Chips, synthesized. However, they can also be obtained by fragmentation of native proteins and protein-containing materials and then immobilized.
  • the amino acid sequences can be generated from the genome and protein databases which are generally or commercially available or are analyzed after antibody binding.
  • Another possibility for generating the proteins with the corresponding amino acid sequences, which are to serve as epitopes, consists in the subsequent analysis of epitopes after they have bound an antibody or an antibody fragment in the screening
  • the assay used in the method according to the invention is advantageously designed as a binding and incubation assay.
  • Incubation of the Fa'b 'antibody fragments or antigen-recognizing immunoglobulin fragments from patient or test material can be carried out directly on the peptides on the matrices. After a certain exposure time, all excess proteins are removed by washing. If it is directly labeled Fa'b 'antibody fragments or immunoglobulin fragments recognizing antigen, e.g. B. by fluorescent molecules, can then be analyzed directly with a suitable measuring system (fluorescence measuring device with micrometer-precise positioning of the laser beam and the photocell).
  • a suitable measuring system fluorescence measuring device with micrometer-precise positioning of the laser beam and the photocell.
  • the Fa'b 'antibody fragments or antigen-recognizing immunoglobulin fragments can be incubated in a purified form in combination with defined serum proteins or else returned in serum samples, preferably into those from which they originate.
  • a secondary detection system e.g. B. highly specific antibodies which recognize the human Fa'b 'antibody fragments or antigen-recognizing immunoglobulin fragments and are themselves fluorescence-labeled. The detection takes place in the manner described above.
  • Another possibility for detection is to use enzyme-labeled immunoglobulins or secondary, enzyme-conjugated antibodies. After appropriate incubation and the usual washing steps to remove unbound proteins, these are incubated with a suitable substrate, which leads to a locally recognizable color reaction after a certain exposure time. This color reaction corresponds to a defined amount of the bound antibody in a certain concentration range.
  • a suitable substrate which leads to a locally recognizable color reaction after a certain exposure time. This color reaction corresponds to a defined amount of the bound antibody in a certain concentration range.
  • competitive binding assays can also be used for evaluation.
  • the patient immunoglobulin (originating from patients with clearly defined clinical images) can be marked directly. Then it is mixed with test person immunoglobulin and in this form it is incubated with the peptide spots and, if necessary, bound.
  • this test variant it is possible with this test variant to carry out the incubation steps sequentially, ie firstly unspecifically saturating the peptide spots on the matrices with test subject immunoglobulin, in order to then incubate the patient material with the peptide epitopes in a subsequent incubation step.
  • This method is advantageous if the respective proteomes, which come from organs, have been broken down into peptide epitopes, have a high background, ie a large amount of natural autoantibodies, and this could interfere with the actual measurement result.
  • the interaction of peptide epitope with polypeptides is detected in particular by marked polypeptides and / or fractions which contain the binding polypeptides by measurable properties, in particular spectroscopic properties of the polypeptides or fractions.
  • the polypeptides can also be characterized by screening for molecular weights or molecular binding forces.
  • the samples which are used as samples according to the invention preferably originate from patients, according to step (a) of the method according to the invention. It is also possible to use autologous pooled samples.
  • the screening is also suitable for the identification of antibody-binding epitopes, cancer-relevant antigens / epitopes and the epitopes of microbial, in particular pathological, pathogens. Blood / serum samples from corresponding diseased individuals are also processed for this and immunoglobulin fragments recognizing the Fa'b 'antibody fragments or antigen are used for binding to the peptide epitopes.
  • the method is also suitable for the identification of pathologically relevant epitopes in diseases such as Alzheimer's, Chronique Fatigue Syndrome (CFS) or Parkinson's disease by using appropriate patient samples.
  • CFS Chronique Fatigue Syndrome
  • Examples of diseases in which the patient's serum is of particular interest for epitope screening are diabetes mellitus, psoriasis, neurodermatitis, dilated cardiomyopathy, myocarditis, patients with high blood pressure, rheumatoid arthritis, ankylosing spondylitis, multiple sclerosis, thyroid disorders, hearing loss, hearing loss, hearing loss, hearing loss Ulcerative colitis, Crohn's disease, Alzheimer's, Chronique Fatigue Syndrome (CFS, AIDS).
  • Fa'b 'antibody fragments or antigen-recognizing immunoglobulin fragments or their antigen-binding fragments from body fluids, preferably serum samples, can also be used in the case of cancer to identify specific, disease-associated peptide epitopes.
  • melanoma include head neck cancer, melanoma, kidney or liver cancer, breast cancer, colon cancer, lung cancer, ovarian cancer, brain tumors, pancreatic cancer and various leukemias.
  • patient materials containing immunoglobulin are of interest (for example liquor, sputum, faeces, lymph fluid, synovial fluid, ascites).
  • the patient material which contains immunoglobulins or is used to obtain immunoglobulins advantageously comes from patients in whom the disease was only recently recognized.
  • the use of patient material that comes from patients who have been treated with medication, in particular immunosuppressively, is less favorable.
  • immunoglobulin-containing material from patients with microbial infections is also suitable for epitope screening. However, this will not
  • Structures / proteomes of the affected microorganisms are used.
  • An example of this is the detection of the antibody-binding peptide epitopes from e.g. B.
  • Virus proteins in AIDS or hepatitis B and hepatitis C are broken down into peptides, these are synthesized on a solid matrix and then processed with the processed immunoglobulins or immunoglobulin fractions of
  • the peptides prepared and presented in step (b) of the method according to the invention are brought into contact by incubation with samples from patients used in step (a) of the method according to the invention. It is used to ensure the specificity of the antibody-epitope binding reactions if the antibody / serum samples from preferably at least three patients of a defined disease group are examined in comparison with the samples from five and more healthy people. This is a preferred part of the screening.
  • the specificity of the binding of antibodies etc. to a peptide epitope is exploited using a mathematical data analysis of the usual statistical methods / software, the optical or other signals being processed as measured values.
  • the data analysis takes into account the structure of the test to ensure the specificity of the detected epitope-antibody binding.
  • a cornerstone of the system is the comparison of the bound amount of Fa'b 'antibody fragments or immunoglobulin fragments recognizing antigen to an epitope from a group of healthy subjects with those who suffer from a clearly diagnosed disease. The difference from the binding profile of a number of presented epitopes then leads to the recognition of the immunoreactive epitopes which are specific for a disease.
  • amino acid chains can serve as starting molecules for further target characterization and the possible uses of the identified epitope according to the invention.
  • the cleaning of the patient's antibody by using the identified peptide epitope via suitable cleaning columns, in which the peptide is bound to a solid phase in larger quantities, is then advantageous for the search strategy.
  • the corresponding specific antibodies remain bound to the epitope and can be isolated in a subsequent incubation step.
  • the identified epitope can be used to immunize animals or immunocompetent cells in vitro to generate monoclonal antibodies, which are then another tool for characterizing the epitope as a peptide / amino acid sequence and the epitope in its native environment, that is to say in the protein or proteome. are.
  • the peptide epitope determined and defined after the tests carried out and in the proof of specificity is then the starting molecule for the product developments described at the beginning.
  • Another preferred method uses fluorescent-labeled or otherwise labeled Fa'b 'antibody fragments or antigen-recognizing
  • the peptide epitopes are incubated beforehand with native, unlabelled Fa'b 'antibody fragments or immunoglobulin fragments of healthy persons which recognize antigen. After unbound antibodies have been washed out, the incubation step with the labeled patient antibodies takes place under similar conditions with regard to protein concentration, pH and buffer content.
  • the fluorescence-labeled Fa'b 'antibody fragments or antigen-recognizing immunoglobulin fragments etc. can only occupy free epitope binding sites.
  • the peptide epitopes identified by the measurement signal have thus been identified as specifically and therapeutically relevant.

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Abstract

Verfahren zur Identifikation von immunreaktiven Epitopen auf Proteinen von humanen Zellen, Geweben, Organen und von Mikrooganismen, die mit Erkrankungen wie Autoimmunerkrankungen, Krebserkrankungen oder Infektionen in Zusammenhang stehen, wobei Proben a) von Patienten mit diesen Erkrankungen aufgearbeitet werden, um Fraktionen zu erhalten, in denen Fa'b'-Antikörperfragmente und/oder Antigen erkennende Immunglobulinfragmente angereichert oder isoliert vorliegen, b) die im Schritt (a) angereicherten oder isolierten Fraktionen mit Peptiden, die mindestens zwölf Aminosäuren aufweisen und an einem Träger immobilisiert sind, in Kontakt gebracht werden, die durch Fragmentierung aus Proteinen oder Proteomen gewonnen werden, c) in einem Assay, bei dem Peptide mit mehr als zwölf Aminosäuren an Festphasen gebunden auf Wechselwirkung mit Fa'b'-Antikörperfragmenten und/oder Antigen erkennenden Immunglobulinfragmenten geprüft werden, woraufhin d) sich bei Wechselwirkungen zwischen den Fa'b'-Antikörperfragmenten und/oder Antigen erkennenden Immunglobulinfragmenten und dem mindestens zwölf Aminosäuren aufweisenden Peptid, das mindestens zwölf Aminosäuren aufweisende Peptid als immunreaktives Epitop zu erkennen gibt und ggf. weiter analysiert wird.

Description

Verfahren zur Identifikation von immunreaktiven Epitopen auf Proteinen und Verwendung der Epitope zu prophylaktischen und therapeutischen Zwecken
Verfahren zur Identifikation von immunreaktiven Epitopen auf Proteinen von humanen Zellen, Geweben, Organen und Mikrooganismen, die mit
Autoimmunerkrankungen, Krebserkrankungen und Infektionen in Zusammenhang stehen sowie die Verwendung der identifizierten Epitope
Das Immunsystem ist ein integraler evolutionärer Bestandteil der Entstehung und Entwicklung tierischen Lebens. Drei wesentliche Aufgaben hat das Immunsystem höherer Lebewesen zu erfüllen
• die Bekämpfung von Mikroorganismen
• die Aufrechterhaltung der Tumorsurveillance, d.h. die permanente Beseitigung von entstehenden Tumorzellen
• die Organisation der Gewebsregeneration. Krankheiten sind auf verschiedenste Weise mit dem Immunsystem verbunden. Es existiert praktisch keine Krankheit ohne Beteiligung des Immunsystems, dies sowohl hinsichtlich ihrer Entstehung als auch ihrer Überwindung.
Eine wichtige Funktion in diesem komplexen Zusammenspiel von Organismus und Immunsystem nehmen dabei Antikörper ein. Ihre Funktion geht über die einer bloßen Bindung an ihr Target und Mithilfe bei der Targetzerstörung hinaus. Sie sind an der Regulation aller wichtigen immunologischen Prozesse im Organismus, an der Kooperation von humoralen und zellulären Immunreaktionen beteiligt.
Eine gewisse Sonderstellung haben Autoantikörper assoziierte Autoimmun- krankheiten. Autoantikörper sind im Hinblick auf ihre Targets - körpereigene Strukturen im Gewebe, auf Zellen usw. - Liganden mit pathologischen Eigenschaften, da sie die Zerstörung des Gewebes/Organs induzieren bzw. zur Dysfunktion von Zellen usw. führen. Gleichzeitig markieren sie durch ihre Bindung an die körpereigenen Strukturen diese als ein Epitop. Die Kenntnis der Struktur von Epitopen - z.B. die jeweilige Aminosäuresequenz - hat für die zukünftige Medizin bzw. die Verhütung und Behandlung von Krankheiten grundlegende Bedeutung. Ein Antikörper bindendes Epitop kann dann als Ausgangspunkt oder Target für verschiedene therapeutisch orientierte Produktentwicklungen dienen.
Antikörper im Immunsystem
Antikörper gehören zu den am besten untersuchten Strukturen des Immunsystems. Obwohl wichtige Funktionen schon seit vielen Jahren, wenn nicht Jahrzehnten, bekannt sind, werden immer noch neue Funktionen entdeckt bzw. wird die Bedeutung von Antikörpern immer mehr erkannt. Dies gilt weniger allgemein als vielmehr im Kontext zu definierten sogenannten Targets und Krankheiten, bei denen diesen Targets bzw. den Antikörpern eine pathogenetische Bedeutung zukommt. Antikörper markieren durch ihre Bindung an ihr Epitop regelmäßig ein Target. Die Bindung kann eine Reihe von immunologischen Folgereaktionen einleiten. Hierzu gehört z. B. die Komplementaktivierung, welche im allgemeinen zu einer lokalen Targetzerstörung, einer lokalen Entzündungsreaktion und Zytokinausschüttung führt. Über die Interaktion mit bestimmten zellulären Oberflächenmolekülen (Fc-Rezeptoren) werden zelluläre Aktivierungsprozesse eingeleitet, die ihrerseits in die Immunregulation eingreifen. Daraus resultieren häufig weitere Folgereaktion.
Antikörper können auf vielfältige Weise bei der Entstehung von Krankheiten mitwirken (Autoimmunkrankheiten, chronische Entzündungen) oder bei der Bekämpfung einer Krankheit (Infektionen, Krebs) das körpereigene Immunsystem unterstützen.
Der Nachweis eines Antikörpers bei einer Krankheit sagt zunächst nichts über seinen funktionalen Stellenwert aus. Man gewinnt allerdings zunehmend tieferes Verständnis über die Funktion von Antikörpern bei der Pathogenese bestimmter Erkrankungen. Ein Beispiel für die pathologischen Funktionen von Autoantikörpern über die Targetzerstörung und Entzündung hinaus sind die gegen ein Peptidepitop des Angiotensinrezeptors gerichteten Autoantikörper, die für eine bestimmte Form des Bluthochdrucks bei Schwangeren (Präeklampsie) verantwortlich gemacht werden (Wallukat et al., 1999).
Die protektive, antitumorale Wirkung von epitopspezifischen Antikörpern wurde für das Coloncarcinom gezeigt (Riethmüller et al, 1998). Antikörper und ihre Bindungsepitope haben aus medizinischer Sicht ein (immun)therapeutisches Potential das, präventiv oder therapeutisch genutzt werden kann.
Die Erkennung der Bindungsorte von Antikörpern auf molekularer Ebene organismuseigener Strukturen ist in diesem Sinne gleichbedeutend mit der Identifikation eines Peptidepitops. Werden definierte Aminosäuresequenzen, deren Lokalisation im jeweiligen Proteom/ Protein bekannt ist, den Antikörpern als Bindungsregion angeboten und binden an bestimmten Peptidepitopen Antikörper, können damit medizinisch wertvolle Targets identifiziert werden.
Das Target/Peptidepitop ist nach gesicherter Spezifität und im Kontext mit der jeweiligen Krankheit Ausgangsmolekül - sowohl als Peptid selbst als auch in transkribierter Form (DNA/RNA) - für eine Reihe von medizinisch nützlichen Verwendungen, z.B. für die Ligandenentwicklung zur Elimination pathologischer Antikörper aus Körperflüssigkeiten, insbesondere dem Blutkreislauf, oder zur Induktion therapeutischer Antikörper, einsetzbar.
Autoantikörper und Krankheiten
Es existieren mehrere hundert Erkrankungen, die wiederum mit weit über 1000 verschiedenen Autoantikörper-Typen assoziiert sind. Beim Menschen sind eine Reihe von Autoimmunerkrankungen bekannt, bei denen Autoantikörper nachgewiesene pathologische Funktionen haben. Die molekulare Ursache für ihre Entstehung ist allerdings fast immer unbekannt. Bisher hat die Bestimmung von Autoantikörpern vor allem diagnostischen, in einigen Fällen auch prognostischen Wert. Autoantikörper werden derzeit fast ausschließlich in diesem Sinne genutzt.
Autoantikörper können als eine Fehlleistung der humoralen Immunabwehr verstanden werden (ausgeklammert bleiben bei dieser Betrachtung die natural autoantibodles). Das Immunsystem hat im Sinne der Fremd-Selbst-Erkennung versagt, oder es ist überlistet worden.
Das Spektrum der Autoantikörper ist bei den verschiedenen Autoimmunkrankheiten sehr unterschiedlich. Allen gemeinsam ist die Bindung an körpereigene Gewebe, Zellen, Moleküle. Das klinische Bild einer jeweiligen Autoimmunerkrankung entsteht dann - vereinfacht gesagt - in Abhängigkeit von den jeweiligen Antikörper-Targetorten im Körper. Die Folge seiner Bindung sind überschießende immunologische inflammatorische Reaktionen, die chronisch oder auch schubhaft sein können. Oft führen diese autoaggressiven Reaktionen zu Organzerstörung und Funktionsverlust (z.B. Rheumatoide Arthritis, Diabetes oder Multiple Sklerose).
Als Therapie erfolgt für nahezu alle Autoimmunkrankheiten immer noch die Gabe von immunsuppressiven Mitteln. Ziel dieser Therapie ist die Unterdrückung der Antikörperproduktion. Diese Therapien sind zumindest lindernd, aber zu einem nicht geringen Teil unwirksam. Sie haben auch keinen Anspruch auf Kausalität, da durch diese Medikamente die Produktion aller Immunglobuline supprimiert wird.
Ein zukunftsweisender, neuer therapeutischer Ansatz ist die Behandlung von Autoimmunkrankheiten mit definierten pathologischen Autoantikörpern durch spezifische Immunglobulinadsorption, wie er seit kurzem experimentell verfolgt wird. Als Modellfall dient dabei die Dilatative Cardiomyopathie (DCM). Diese schwere Herzerkrankung ist in den meisten Fällen mit dem Auftreten von Autoantikörpern gegen den ßl-adrenergen Rezeptor von Herzmuskelzellen assoziiert, die in einem Zusammenhang mit der Krankheitsentstehung zu stehen scheinen. Werden die Immunglobuline - und somit auch die pathologischen Autoantikörper - von Patienten mit DCM entfernt, verbessert sich die Herzleistung der Patienten und das klinische Bild. Offensichtlich bringt die Entfernung von Antikörpern bei Autoimmunkrankheiten, also die Immunadsorption, einen therapeutischen Nutzen mit sich (Müller, J. et al 2000).
Therapeutische Antikörper und Krankheiten
Antikörper sind der materielle Ausdruck einer spezifischen humoralen Immunreaktion, mit der der Organsimus das Ziel verfolgt, ein Antigen oder ein Agens oder eine Krebszelle zu beseitigen. Wenn es trotz dieser Anstrengungen des Immunsystems nicht zu einem selbst-therapeutischen Erfolg kommt, kann das bedeuten, dass die immunreaktive Kapazität des Organismus zu niedrig ist.
In solchen Fällen können target/epitopspezifische Antikörper dem Organsimus direkt zugeführt werden, um ihn bei der Bekämpfung des Agens/Erregers etc. zu unterstützen. Eine andere therapeutische Möglichkeit ist die spezifische Verstärkung der körpereigenen Immunabwehr durch Gabe von immunogenen Peptidepitopen oder deren transkribierte Form (DNA/RNA).
US-A-5,553,325 beschreibt Peptide bzw. Peptidbibliotheken, die als randomesierte oder fokussierte Peptidfamilien verwenden zur Untersuchung der Wechselwirkung solcher Peptide mit Substanzen von Interesse. Dazu gehören im Einzelnen Antikörper, Rezeptoren, Toxine, aktive Teile von Proteinen. Die beschriebenen Peptide sind löslich und besitzen eine Länge von 3 bis 8 Aminosäuren. US-A-4,906,564 beschreibt die Identifizierung von Oberflächenantigenen in Determinanten von intakten Pathogenen, wobei die Identifikation der antigenen Komponenten durch Antikörper erfolgt. Es werden Immunkomplexe analysiert, die durch die Reaktion von gegen Malariaerreger gerichteten Immunglobulinen und noch nicht definierten Plasmodium-Antigenen entstehen können. Nach üblichen Auftrennungsschritten und biochemisch-analytischen Verfahren werden dann unter bestimmten Bedingungen Antigene aus dem Immunkomplex isoliert und deren Struktur bestimmt. Gevorkian, G. et al. offenbaren in "Immunology Letters 49 (1996) p. 185-189" die Untersuchung von sequenziellen synthetischen Peptiden auf Antikörper-Bindung. Die Antikörper stammen aus antigenen Strukturen von Taenia crassiceps. Blüthner, M. et al. offenbaren in "Autoimmunity, 29 (1999), p. 33 - 42" die Untersuchung von Serumproben von Patienten mit primärer biliärer Zirrhose. Diese Patienten haben Autoantikörper gegen ein Kernprotein (splOO, PBC, Autoantigen). Auch hier wird ein Autoantikörper durch Affinitätschromatographie über sein Target gereinigt.
Targets/Epitope für Antikörper/Autoantikörper und Antikörper selbst als therapeutische Mittel
Autoantikörper richten sich speziell gegen fast alle Proteine oder auch an andere Bestandteile des menschlichen Körpers. Weitestgehend unbekannt sind hingegen die genauen Bindungsorte, d. h. die (auto)antikörper-bindenden Epitope, auf den Proteinen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung betrifft die Identifikation und Bereitstellung von Antikörper bindenden Epitopen von Proteinen humaner bzw. mikrobieller Herkunft und schafft eine Voraussetzung für die Entwicklung neuer Stoffe, die zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten, Krebs bzw. Infektionskrankheiten dienen können.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Identifikation von immunreaktiven Epitopen auf Proteinen von humanen Zellen, Geweben, Organen und von Mikrooganismen, die mit Erkrankungen wie Autoimmunerkrankungen, Krebserkrankungen oder Infektionen in Zusammenhang stehen, wobei Proben a) von Patienten mit diesen Erkrankungen aufgearbeitet werden, um Fraktionen zu erhalten, in denen Fa'b'-Antikörperfragmente und/oder Antigen erkennende Immunglobulinfragmente angereichert oder isoliert vorliegen, b) die im Schritt (a) angereicherten oder isolierten Fraktionen mit Peptiden, die mindestens zwölf Aminosäuren aufweisen und an einem Träger immobilisiert sind, in Kontakt gebracht werden, die durch Fragmentierung aus Proteinen oder Proteomen gewonnen werden, c) in einem Assay, bei dem Peptide mit mehr als zwölf Aminosäuren an
Festphasen gebunden auf Wechselwirkung mit Fa'b'-
Antikorperfragmenten und/oder Antigen erkennenden
Immunglobulinfragmenten geprüft werden, woraufhin d) sich bei Wechselwirkungen zwischen den Fa'b'-Antikörperfragmenten und/oder Antigen erkennenden Immunglobulinfragmenten und dem mindestens zwölf Aminosäuren aufweisenden Peptid, das mindestens zwölf Aminosäuren aufweisende Peptid als immunreaktives Epitop zu erkennen gibt und ggf. weiter analysiert wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt in einfacher Weise die Identifizierung von immunreaktiven Epitopen. Ein identifiziertes Epitop auf einem menschlichen Protein, an welches Autoantikörper/Antikörper binden, hat das Potential zu einem Mittel, welches medizinisch nutzbringend eingesetzt werden kann. Es ergeben sich folgende Verwendungsmöglichkeiten eines mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens identifizierten Antikörper bindenden Epitops: 1 zur spezifischen Immunglobulinadsorption zur Entfernung epitopspezifischer Autoantikörper,
2 als DNA/RNA zur Induktion einer spezifischen Immunsuppression der epitopspezifischen Autoantikörper mittels transienter Gentherapie,
3 als Peptid oder DNA/RNA-Fragment aus Lymphozyten zu diagnostischen Zwecken zum Nachweis von Autoantikörpern oder deren spezifische
Codierung, 4 Nutzung des identifizierten Epitops als Antigen für Herstellung therapeutischer Antikörper, d.h. Produktion und Verwendung der epitopspezifischen Antikörper
5 als Vaccine (als Peptid oder als DNA) zur Antikörperinduktion im Sinne einer aktiven Immunisierung,
6 als DNA/RNA zur Induktion einer spezifisch verstärkten Immunantwort mittels transienter Gentherapie,
7 als Target für ein Wirkstoffscreening a) das Identifizierte Epitop (als Peptid oder DNA/RNA) b) die epitopspezifischen, identifizierten Antikörper c) a) in Kombination mit b)
Die Punkte. 1.-3. und 7. gelten eher in Bezug auf Autoimmunkrankheiten, die Punkte 4.-6. gelten eher in Bezug auf Krebs und Infektionskrankheiten. Pkt. 7 gilt übergreifend für alle Epitope bzw. Antikörper. Das erfindungsgemäße Verfahren lässt sich insbesondere im Hochdurchsatzscreening einsetzen, mit dem
• Autoantikörper bindende Peptidepitope, spezifisch für Autoimmunkrankheiten identifiziert werden,
• Antikörper bindende Epitope, spezifisch für Krebserkrankungen identifiziert werden,
• Antikörper bindende Epitope von Mikrorganismen identifiziert werden.
Dabei können aus Blutproben oder anderen antikörperhaltigen Körperflüssigkeiten von Patienten mit klar diagnostizierten Krankheiten Immunglobuline, nämlich Fa'b'-Antikörperfragmenten und/oder Antigen erkennende Immunglobulinfragmente isoliert werden, welche mit Peptiden, die mehr als zwölf Aminosäuren aufweisen, vorzugsweise erhalten aus humanen Proteomen oder mikrobiellen Proteomen, in Reaktion gebracht werden. Die Proteine/Proteome wurden dabei in Peptide mit mindestens zwölf Aminosäuren fragmentiert und auf einer Festphase gebunden. Es ist ebenfalls möglich, die Peptide direkt auf einer Festphase zu synthetisieren, wobei sich die verwendeten Aminosäuresequenzen aus Proteinen/Proteomen ableiten.
Prinzipiell ist auch die Verwendung von antikörperhaltigen Körperflüssigkeiten, die Verwendung von isolierten Immunglobulinsubklassen (z. B. Immunglobulin Gl - G4, IgM,IgA) von Antigen erkennenden Immunglobulinfragmenten oder die Verwendung von tierischen Immunglobulinen in oben beschriebener Form nach Immunisierung mit humanen Proteinen rekombinanten Proteinen, Peptiden, Organextrakten, Geweben oder Mikroorgansimen möglich, um mit den entstehenden Immunglobulinen bzw. Fragmenten immunreaktive Peptidepitope zu identifizieren.
Erfindungsgemäß werden lineare oder zyklisierte Aminosäureketten von menschlichen oder mikrobiellen Eiweißmolekülen, in einer Kettenlänge von mindestens zwölf Aminosäuren, vorzugsweise in ihrer Sequenz überlappend, z.B. in Zweierschritten, eingesetzt. Es erfolgt die Inkubation der festphasenfixierten Peptide z. B. als Peptidspots an Chips oder anderen geeigneten Trägern mit einer antikörperhaltigen Reaktionslösung (enthaltend die Patienten/Probandenimmunglobuline oder Immunglobulinfragmente, z. B. in einer geeigneten Pufferlösung oder Eiweißlösung. Während der Inkubationszeit binden die Fa'b'- Antikörperfragmente oder Antigen erkennende Immunglobulinfragmente an die Oberflächen, auf denen die bindungsbereiten Peptide enthalten sind.
Der Nachweis der Fa'b'-Antikörperfragmente oder der Antigen erkennenden Immunglobulinfragmente an ein Peptid erfolgt dabei mit in der Antikörperdiagnostik gebräuchlichen Fluoreszenz, Lumineszenz, colorimetrischen, densidomentrischen, laseroptischen oder anderen physikalischen Verfahren. Zur . Durchführung der Verfahren zum Nachweis einer Wechselwirkung zwischen den zu identifizierenden immunreaktiven Epitopen werden die Fa'b'-Antikörperfragmente oder Antigen erkennende Immunglobulinfragmente z. B. mit Farbstoffen markiert. Zur Markierung kommt insbesondere Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) in Frage. Weitere Möglichkeiten zur Markierung von Antikörpern oder Antikörperfragmenten sind dem Fachmann bekannt. Beispiele hierfür sind andere Fluoreszenzfarbstoffe wie Phycoerythrin oder der Streptavidinligand Biotin. Auch Lumineszenzmarker wie Luminol oder die Kopplung der Immunglobuline oder Immunglobulinfragmente an Markerenzyme wie alkalische Phosphatase oder Metallionen ist möglich.
Eine weitere Ausführungsform betrifft eine andere Detektion der gebundenen Antikörper oder Fa'b'-Antikörperfragmente oder Antigen erkennende Immunglobulinfragmente an das Peptid. Werden die Peptide als Spots gemeinsam mit z. B. Biotin synthetisiert, lässt sich über die Menge gebundener Streptavidinmoleküle, welche fluoreszenzmarkiert oder anderweitig mit einem Markermolekül ausgestattet sind, erkennen, ob die Fa'b'-Antikörperfragmente oder Antigen erkennende Immunglobulinfragmente zuvor an ein Peptid gebunden haben. Neben der Kopplung der Fa'b'-Antikörperfragmente oder Antigen erkennende Immunglobulinfragmente mit Markermolekülen besteht auch die Möglichkeit eines direkten Nachweises der Bindung von Immunglobulin oder Immunglobulinfragmenten an die Peptide. So gestattet die Verwendung bestimmter laseroptischer Lichtsignale die direkte Messung. Hierbei erfolgt der Nachweis der Proteinligandierung an die Peptide durch Messung der Änderung von Schwingungeigenschaften des Lichtes.
Da parallel eine Vielzahl, mehrere tausend Peptidepitope auf ihre Antikörperbindung geprüft werden, erfolgt die Datenerfassung und -analyse vorzugsweise durch die Verwendung von Computern mit geeigneter Software. Typischerweise reagiert das immunreaktive Epitop spezifisch mit einem Polypeptid, Antikörper, Autoantikörper, Fa'b'-Antikörperfragmenten oder andere Antigen erkennenden Immunglobulinfragmenten.
Erfindungsgemäß ist das immunreaktive Epitop insbesondere Bestandteil eines strukturell und funktioneil charakterisierten Proteins wie beispielsweise Plasmaproteinen, zellgebundenen Rezeptormolekülen (z.B. ßl adrenerger
Rezeptor, Neurorezeptoren, Hormonrezeptoren, Immunrezeptoren) intrazellulären oder extrazellulären Enzymen (z.B. DNAse, Trypsinogen, Plasminogen) extra- oder intrazellulären Matrixproteinen (z.B. Collagene, Fibrinogen, Hyaluronsäure, Cytokeratine .
Erfindungsgemäß ist das immunreaktive Epitop in Proteomen enthalten und aus Protein-, Proteom oder Genomdatenbanken abgeleitet, synthetisiert und/oder aus biologischem oder rekombinantem Material isoliert worden. Die Peptide werden dabei vorteilhaft direkt auf festen Matrices, z.B. Chips, synthetisiert. Sie können aber auch durch Fragmentierung von nativen Proteinen und proteinhaltigen Materialien erhalten und dann immobilisiert werden. Die Aminosäuresequenzen können dabei aus den allgemein oder kommerziell zur Verfügung stehenden Genom- und Proteindatenbänken generiert werden bzw. werden nach Antikörperbindung analysiert.
Eine andere Möglichkeit zur Generierung der Proteine mit den entsprechenden Aminosäuresequenzen, welche als Epitope dienen sollen, besteht in der nachträglichen Analyse von Epitopen, nachdem sie im Screening einen Antikörper oder ein Antikörperfragment gebunden haben
Vorteilhafterweise wird der im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Assay als Bindungs- und Inkubationsassay ausgestaltet. Dabei kann die Inkubation der Fa'b'-Antikörperfragmente oder Antigen erkennende Immunglobulinfragmente aus Patienten- oder Probandenmaterial direkt auf den die als Spots sich darstellenden Peptiden auf den Matrices erfolgen. Nach einer bestimmten Einwirkzeit werden alle überschüssigen Proteine durch Waschung entfernt. Falls es sich um direkt markierte Fa'b'- Antikörperfragmente oder Antigen erkennende Immunglobulinfragmente handelt, z. B. durch Fluoreszenzmoleküle, kann anschließend direkt mit einem geeigneten Meßsystem (Fluoreszenzmessgerät mit mikrometergenauer Positionierung des Laserstrahls und der Fotozelle) analysiert werden. Es können hierzu die Fa'b'-Antikörperfragmente oder Antigen erkennende Immunglobulinfragmente in gereinigter Form in Kombination mit definierten Serumproteinen oder aber zurückgeführt in Serumproben, vorzugsweise in die, aus der sie entstammen, inkubiert werden. Eine andere Möglichkeit besteht in der Verwendung eines sekundären Detektionssystems, z. B. hochspezifische Antikörper, welche die humanen Fa'b'- Antikörperfragmente oder Antigen erkennende Immunglobulinfragmente erkennen und ihrerseits fluoreszenzmarkiert sind. Dabei erfolgt die Detektion in wie vorstehend beschriebener Weise.
Eine weitere Möglichkeit besteht zur Detektion in der Verwendung von enzymmarkierten Immunglobulinen oder sekundären, enzymkonjugierten Antikörpern. Diese werden nach entsprechender Inkubation und den üblichen Waschschritten zur Entfernung nicht gebundener Proteine mit einem geeigneten Substrat inkubiert, welche nach einer bestimmten Einwirkzeit zu einer lokal erkenntlichen Farbreaktion führt. Diese Farbreaktion entspricht in einem bestimmten Konzentrationsbereich einer definierten Menge des gebundenen Antikörpers. Mittels geeigneter Auswertungsverfahren läßt sich damit die Bindung des Immunglobulins der Fa'b'-Antikörperfragmente oder Antigen erkennende Immunglobulinfragmente an den jeweiligen Peptidepitop, welches als Spot vorgelegt wurde nachweisen.
Neben nicht kompetitiven Bindungsassays können auch kompetitive Bindungsassays zur Auswertung herangezogen werden. Hierbei kann das Patientenimmunglobulin (stammend aus Patienten mit klar definierten klinischen Bildern) direkt markiert werden. Anschließend wird es mit Probandenimmunglobulin gemischt und in dieser Form mit den Peptidspots in Inkubation und ggf. zur Bindung gebracht.
Prinzipiell ist es bei dieser Testvariante möglich, die Inkubationsschritte sequenziell durchzuführen, d. h. zunächst die Peptidspots auf den Matrices mit Probandenimmunglobulin unspezifisch abzusättigen, um dann in einem nachfolgenden Inkubationsschritt das Patientenmaterial mit den Peptid Epitopen zu inkubieren. Diese Methode ist dann vorteilhaft, wenn bei den jeweiligen Proteomen, welche aus Organen stammend, in Peptidepitope zerlegt worden sind, ein hoher Background, d. h. eine große Menge an natürlichen Autoantikörpern vorliegt und dies mit dem eigentlichen Messergebnis interferieren könnte. Erfindungsgemäß wird die Wechselwirkung von Peptidepitop mit Polypeptiden insbesondere durch markierte Polypeptide und/oder Fraktionen, die die bindenden Polypeptide enthalten, durch messbare Eigenschaften, insbesondere spektroskopische Eigenschaften der Polypeptide oder Fraktionen detektiert. Die Polypeptide können erfindungsgemäß auch durch Screening nach Molekulargewichten oder molekularen Bindungskräften, charakterisiert werden.
Vorzugsweise stammen die Proben, die erflndungsgemäß als Proben eingesetzt werden, von Patienten, gemäß Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens. Möglich ist auch die Verwendung autologer gepoolter Proben. Das Screening ist auch geeignet zur Identifikation Antikörperbindender Epitope, krebsrelevanter Antigene/Epitope sowie der Epitope von mikrobiellen, insbesondere pathologischen Erregern. Auch hierfür werden Blut/Serumproben von entsprechenden erkrankten Individuen aufgearbeitet und die Fa'b'- Antikörperfragmente oder Antigen erkennende Immunglobulinfragmente zur Bindung an die Peptidepitope eingesetzt. Auch für die Identifikation pathologisch relevanter Epitope bei Krankheiten wie Alzheimer, Chronique Fatigue Syndrom (CFS), oder Morbus Parkinson ist das Verfahren durch die Verwendung von entsprechenden Patientenproben erfindungsgemäß geeignet.
Beispiele für Krankheiten, bei denen das Patientenserum von besonderem Interesse für ein Epitopscreening ist, sind Diabetes mellitus, Psoriasis, Neurodermitis, Dilatative Cardiomyopathie, Myocarditis, Patienten mit Bluthochdruck, Rheumatoide Arthritis, Morbus Bechterew, Multiple Sklerose, Schilddrüsenerkrankungen, Gehörverlust, Hörsturz, Tinnitus, Colitis ulcerosa, Morbus Crohn, Alzheimer, Chronique Fatigue Syndrom (CFS, AIDS). Auch bei Krebserkrankungen können Fa'b'-Antikörperfragmente oder Antigen erkennende Immunglobulinfragmente oder deren antigenbindende Fragmente aus Körperflüssigkeiten, vorzugsweise Serumproben, zur Identifikation von spezifischen, krankheitsassoziierten Peptidepitopen herangezogen werden. Zu diesen gehören Head Neck Cancer, Melanome, Nieren- oder Lebercarcinom, Mammacarcinom, Darmkrebs, Lungencarcinom, Ovarialcarcinom, Hirntumoren, Pankreascarcinom und verschiedene Leukämien. Von Interesse sind neben Blutserum andere immunglobulinhaltige Patientenmaterialien (beispielsweise Liquor, Sputum, Faeces, Lymphflüssigkeit, Synovialflüssigkeit, Aszites).
Das Patientenmaterial welches Immunglobuline enthält bzw. zur Gewinnung von Immunglobulinen benutzt wird, stammt vorteilhafterweise von Patienten, bei denen die Erkrankung erst vor kurzer Zeit erkannt wurde. Weniger günstig ist die Verwendung von Patientenmaterial, welches aus Patienten die medikamentös, insbesondere Immunsupressiv behandelt worden sind, stammt.
Das immunglobulinhaltige Material von Patienten mit mikrobiellen Infektionen ist ebenfalls geeignet zum Epitopscreening. Hierbei werden allerdings nicht
Peptidepitope aus humanen Proteom, sondern solche aus den
Strukturen/Proteomen der betroffenen Mikroorganismen eingesetzt. Ein Beispiel hierfür ist das Erfassen der Antikörper bindenden Peptidepitope von z. B.
Virusproteinen bei AIDS oder Hepatitis B und Hepatitis C. Die bereits bekannten Aminosäuresequenzen verschiedener Virusbausteine werden erfindungsgemäß in Peptide zerlegt, diese auf eine Festmatrix synthetisiert und anschließend mit den aufgearbeiteten Immunglobulinen oder Immunglobulinfraktionen von
Patienten, die nachgewiesenermaßen dies Infektionskrankheit haben, inkubiert.
Daraus schließen sich die folgenden Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens an.
Vorzugsweise werden erflndungsgemäß die im Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens aufbereiteten und dargebotenen Peptide durch Inkubation mit Proben von Patienten, die im Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt werden, in Kontakt gebracht. Zur Sicherung der Spezifität der Antikörper-Epitop-Bindungsreaktionen dient, wenn die Antikörper/Serumproben von vorzugsweise mindestens drei Patienten einer definierten Krankheitsgruppe vergleichend mit den Proben von fünf und mehr gesunden Personen untersucht werden. Diese Vorgehensweise ist ein bevorzugter Bestandteil des Screenings. Die Spezifität der Bindung von Antikörpern etc. an ein Peptidepitop wird durch eine mathematische Datenanalyse unter Nutzung der üblichen statistischen Verfahren/Software ermittelt, wobei die optischen oder anderen Signale als Messwerte verarbeitet werden.
Je nach Durchführung des Screenings hat die statistische Auswertung zu erfolgen. Die Datenanalyse berücksichtigt somit den Aufbau des Tests, um die Spezifität der nachgewiesenen Epitop-Antikörperbindung zu sichern. Ein Grundpfeiler des Systems ist dabei der Vergleich der gebundenen Menge Fa'b'- Antikörperfragmente oder Antigen erkennende Immunglobulinfragmente an ein Epitop von einem Kollektiv gesunder Probanden mit denen, welche an einer klar diagnostizierten Krankheit leiden. Die Differenz aus dem Bindungsprofil einer Anzahl von vorgelegten Epitopen führt dann zur Erkennung der immunreaktiven Epitope, welche spezifisch für eine Krankheit sind.
Diese Aminosäureketten können als Ausgangsmoleküle für eine weitere Targetcharakterisierung und der erfindungsgemäßen Verwendungsmöglichkeiten des identifizierten Epitops dienen. Vorteilhaft für die Suchstrategie ist anschließend die Reinigung des Patientenantikörpers durch Verwendung des identifizierten Peptidepitops über geeignete Reinigungssäulen, bei denen das Peptid in größeren Mengen an einer Festphase gebunden ist.
Wird nunmehr Patientenmaterial darüber geleitet, bleiben die entsprechenden spezifischen Antikörper an dem Epitop gebunden und können in einen nachfolgenden Inkubationsschritt isoliert werden. Des weiteren kann das identifizierte Epitop benutzt werden zur Immunisierung von Tieren oder immunkompetenten Zellen in vitro zur Generierung von monoklonalen Antikörpern, die dann ein weiteres Werkzeug zur Charakterisierung des Epitops als Peptid/Aminosäuresequenz sowie des Epitops in seinem nativen Milieu, also im Protein oder Proteom, sind. Das nach den erfolgten Prüfungen und im Spezifitätsnachweis bestimmte und definierte Peptidepitop ist dann das Ausgangsmolekül für die Produktentwicklungen, die eingangs beschrieben worden sind.
Ein anderes, bevorzugtes Verfahren verwendet fluoreszenzmarkierte oder anderweitig markierte Fa'b'-Antikörperfragmente oder Antigen erkennende
Immunglobulinfragmente, isoliert von Patienten mit Krankheiten. Erflndungsgemäß wird bei dieser Screeninvariante zuvor eine Inkubation der Peptidepitope mit nativen, unmarkierten Fa'b'-Antikörperfragmente oder Antigen erkennende Immunglobulinfragmente gesunder Personen vorgenommen. Nach Auswaschung nicht gebundener Antikörper erfolgt der Inkubationsschritt mit den markierten Patientenantikörper unter ähnlichen Bedingungen bezüglich Proteinkonzentration, pH und Pufferanteil. Die fluoreszenzmarkierten Fa'b'- Antikörperfragmente oder Antigen erkennende Immunglobulinfragmente etc. können nur freie Epitopbindungsplätze besetzen. Die durch das Mess-Signal kenntlich gemachten Peptidepitope sind damit als spezifisch und therapeutisch relevant identifiziert worden.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Identifikation von immunreaktiven Epitopen auf Proteinen von humanen Zellen, Geweben, Organen und von Mikrooganismen, die mit Erkrankungen wie Autoimmunerkrankungen, Krebserkrankungen oder
Infektionen in Zusammenhang stehen, wobei Proben a) von Patienten mit diesen Erkrankungen aufgearbeitet werden, um Fraktionen zu erhalten, in denen Fa'b'-Antikörperfragmente und/oder Antigen erkennende Immunglobulinfragmente angereichert oder isoliert vorliegen, b) die im Schritt (a) angereicherten oder isolierten Fraktionen mit Peptiden, die mindestens zwölf Aminosäuren aufweisen und an einem Träger immobilisiert sind, in Kontakt gebracht werden, die durch Fragmentierung aus Proteinen oder Proteomen gewonnen werden, c) in einem Assay, bei dem Peptide mit mehr als zwölf Aminosäuren an
Festphasen gebunden auf Wechselwirkung mit Fa'b'-
Antikörperfragmenten und/oder Antigen erkennenden
Immunglobulinfragmenten geprüft werden, woraufhin d) sich bei Wechselwirkungen zwischen den Fa'b'-Antikörperfragmenten und/oder Antigen erkennenden Immunglobulinfragmenten und dem mindestens zwölf Aminosäuren aufweisenden Peptid, das mindestens zwölf Aminosäuren aufweisende Peptid als immunreaktives Epitop zu erkennen gibt und ggf. weiter analysiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das immunreaktive Epitop ein funktionales Protein ist, enthalten z. B. in einem Rezeptor, Enzym, einem intra- oder extrazellulären Protein, einem Matrixprotein oder Plasmaprotein.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und/oder2, wobei das Peptidepitop aus Informationen aus entnommenen Protein-, Gen- oder Proteomdatenbanken abgeleitet und synthetisiert und/oder aus biologischem Material isoliert worden ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Wechselwirkung durch markierte Fa'b'-Antikörperfragmente und/oder markierte Antigen erkennende Immunglobulinfragmente und/oder Fraktionen, die die Fa'b'- Antikörperfragmente und/oder Antigen erkennende Immunglobulinfragmente enthalten, oder die Wechselwirkung durch messbare Eigenschaften, insbesondere spektroskopische Eigenschaften der Fa'b'-Antikörperfragmente und/oder Antigen erkennende Immunglobulinfragmente oder Fraktionen enthaltend diese detektiert wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Fa'b'- Antikörperfragmente und/oder Antigen erkennenden
Immunglobulinfragmente etc. durch Screening nach Molekulargewichten, z.B. durch massenspektroskopische Methoden als bindend identifiziert werden.
6 . Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Fa'b'- Antikörperfragmente und/oder Antigen erkennende
Immunglobulinfragmente von Patienten, die im Schritt (a) des Anspruchs 1 eingesetzt werden, einzelne oder gepoolte Proben insbesondere aus Serum von Patienten, gesunden Kontrollpersonen oder tierischen Organismen stammen.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die im Schritt (b) des Anspruchs 1 eingesetzten Peptide vor der Inkubation mit Proben von Patienten, die im Schritt (a) des Anspruchs 1 eingesetzt werden, mit Proben von gesunden Personen in Kontakt gebracht werden.
8 . Verwendung eines Proteins oder einer Peptidverbindung erhältlich nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7 • zur spezifischen Immunglobulinadsorption zur Entfernung epitopspezifischer Autoantikörper,
• als Peptid oder transkripiert als Oligonukleotid zu diagnostischen
Zwecken zum Nachweis von Antikörpern oder dessen genetische spezifische Information
• als Antigen für Herstellung therapeutischer Antikörper, insbesondere Herstellung epitopspezifischen Antikörper in vitro oder in vivo mittels Zellen bzw. normaler oder transgener Vertrebraten, • als Vaccine (als Peptid oder als DNA/RNA) zur Antikörperinduktion in vivo zur aktiven Immunisierung,
• als Target für ein Wirkstoffscreening a) des gemäß der Ansprüche 1-7 identifizierten Epitops als Peptid oder transkripiert als DNA/RNA b) der epitopspezifischen, identifizierten Antikörper.
9. Verwendung eines Oligo- oder Polynukleotids, erhältlich durch Umschreiben der Aminosäuresequenzen der Proteine oder Peptide erhältlich nach einem Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7 in die kodierende Nucleinsäure, als DNA/RNA zur Induktion einer spezifischen Immunsuppression epitopspezifischer
Autoantikörper mittels transienter Gentherapie oder als DNA/RNA zur Induktion einer spezifisch verstärkten Immunantwort mittels transienter Gentherapie und/oder als Target für ein Wirkstoffscreening des identifizierten Epitops als DNA/RNA.
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