DE60211714T2

DE60211714T2 - Isolierung membrangebundener ligandenspezifischer komplexe

Info

Publication number: DE60211714T2
Application number: DE60211714T
Authority: DE
Inventors: Aya Beverly Hills JAKOBOVITS; M. Pia Encino CHALLITA-EID
Original assignee: Agensys Inc
Current assignee: Agensys Inc
Priority date: 2001-07-27
Filing date: 2002-07-29
Publication date: 2007-05-10
Anticipated expiration: 2022-07-30
Also published as: DE60211714D1; ES2261708T3; CA2454133C; AU2002322776B2; IL160053A0; US6960447B2; WO2003012047A2; US20030036099A1; ATE327256T1; IL160053A; JP2005500359A; EP1419277A4; EP1419277A2; EP1419277B1; US20030040026A1; WO2003012047A3; CA2454133A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Verfahren zum Isolieren von membrangebundenen Komplexen, wobei die Mikroumgebung eines membrangebundenen Proteins, welches von einem spezifischen Liganden gebunden ist, bewahrt wird. Genauer gesagt, betrifft die Erfindung die nicht-destruktive Präparation und Isolierung von membrangebundenen, speziell Zelloberflächen-, Rezeptoren zusammen mit den Molekülen, mit welchen sie assoziiert sind.
Technischer Hintergrund
Eine Vielzahl von Vorgehensweisen für die Isolierung von Proteinen ist verfügbar und wird im Fachgebiet ausgeübt. Für lösliche Proteine, wie diejenigen, welche im Zytoplasma auftreten, ist eine direkte Anwendung dieser Technik möglich, da es nicht notwendig ist, Schritte zum Freimachen dieser Proteine von ihren Umgebungen vorzunehmen. Jedoch haben Proteine oder Lipide, welche membrangebunden sind, eine harschere Behandlung erfordert, um sie aus der Membran freizusetzen. Eine üblicherweise angewandte Technik ist die Solubilisierung unter Verwendung von Detergenzien oder anderen harschen Reagenzien, wie chaotropen Mitteln oder anderen denaturierenden Verbindungen, wie Harnstoff; siehe zum Beispiel Molloy, M. P., et al., Electrophoresis (1998) 19: 837–834; Chevallet, M., et al., Electrophoresis (1998) 19: 1901–1909. Ein Nachteil solcher Verfahren besteht darin, dass das Isolationsverfahren zu weit geht, d. h. das Protein im Wesentlichen als solches gewonnen wird und nicht von den zellulären Membrankomponenten begleitet wird, welche normalerweise mit ihm assoziiert sind und welche häufig entscheidend für seine biologische Funktion sind. Die Aufklärung der biologischen Rolle solcher Proteine erfordert die Kenntnis der Substanzen, welche an der Transduktion von Signalen beteiligt sind, die aus einer Bindung des Proteins an seinen spezifischen Liganden resultieren. Somit wäre es extrem nützlich, diese Membranproteine zusammen mit ihren Begleitsubstanzen zu gewinnen, so dass die Natur dieser Substanzen und die biologische Rolle des Proteins und seiner assoziierten Substanzen bestimmt werden kann. Es ist festzustellen, dass die Begleitsubstanzen selbst mit der Membran assoziiert sein können oder mit dem Rezeptor im Zytoplasma assoziiert sein können.
Ein anderer Nachteil der Verfahren des Stands der Technik besteht darin, dass in manchen Fällen die Membranen ausreichend durch die harschen Reagenzien aufgebrochen werden, so dass kryptische Rezeptoren exponiert werden und zufällig an Liganden von Interesse binden. Daher wird der Fachmann zum Analysieren eines Rezeptors in Bezug auf einen Liganden verleitet, wenn der Rezeptor in Wirklichkeit für die biologische Funktion des fraglichen Liganden irrelevant ist.
Eine Beschreibung eines Verfahrens zum Erhalten von Lektin-Rezeptoren aus Erythrozyten ohne die Verwendung von Detergenzien wurde von Jakobovits, A., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1981) 100: 1484–1490, beschrieben. In diesem Verfahren wurden Erythrozyten mit Neuraminadase und dann mit Lektin-beschichteten, d.h. Erdnuss-Agglutinin-beschichteten, Sepharosekügelchen behandelt, was somit zur Kopplung der Erythrozyten an die Kügelchen über eine Wechselwirkung zwischen Lektin und den entsprechenden Rezeptoren auf der Zelloberfläche führte. Nicht-gebundene Zellen wurden entfernt, und das Pellet von Erythrozyten-bedeckten Kügelchen wurde mit einer Pasteur-Pipette heftig pipettiert. Die Kügelchen wurden dann gewaschen, um jedwede Erythrozyten zu entfernen, welche geschert worden waren, und es wurde festgestellt, dass die meisten Erythrozyten durch Wiederholung dieser Behandlung entfernt werden konnten. Jedwede verbleibenden gebundenen Zellen konnten durch rasches Verwirbeln und anschließendes Waschen entfernt werden. Während die Erythrozyten entfernt wurden, blieben die an Lektin gekoppelten Rezeptoren an die Sepharosekügelchen gebunden. Diese "abgepflückten" Rezeptoren wurden dann von den Kügelchen durch Kochen oder durch kompetitive Elution mit Galactose freigesetzt.
Die Elution der gebundenen Komponenten führte zur Gewinnung der Lektin-bindenden Komponenten, welche als Asialoglycophorine bezeichnet werden. Diese Arbeit zeigte, dass Zellen ohne Zellkerne, bei Behandlung zum Exponieren der relevanten Zucker, über Kohlenhydrate auf ihren Oberflächen an Agglutinine (d. h. Lektine) gebunden werden konnten, und dass die Kohlenhydrat-enthaltenden Einheiten, welche an die Agglutinine gebunden waren, von den Zellmembranen durch mechanische Disruption entfernt werden konnten. Es wurde keine Beschreibung von jedweden nicht-kovalent assoziierten Komponenten, welche zusammen mit den Glycoproteinrezeptoren per se entfernt wurden, angegeben. Ferner gibt es keine Beschreibung von Zellen, welche nicht behandelt worden waren, um die relevanten Zucker zu exponieren, noch gab es einen Vorschlag, andere Liganden als Lektine zu verwenden. Wie nachstehend erwähnt, sind Lektine relativ nicht-spezifisch und werden daher an eine Vielzahl von glycosylierten Proteinen binden, wobei bei einigen davon deren biologische Funktionen hinsichtlich der spezifischen Natur des Lektins irrelevant sind.
Ein weiteres Experiment, worin Lektin-Rezeptoren von Maus-Thymocyten "abgepflückt" wurden, wurde in einem Kapitel beschrieben, welches in einer Doktorarbeit enthalten war, die zur Verleihung eines Doktor-Titels an der Feinberg Graduate School an den Anmelder der vorliegenden Erfindung eingereicht und vom "Scientific Council of the Weizmann Institute of Science" am 6. Juni 1983 zugelassen wurde. In diesem Experiment wurden Thymocyten auf verschiedenen Wegen markiert und mit Lektinderivatisierten Kügelchen, gemäß des oben beschriebenen allgemeinen Vorgehens, behandelt. Dies führte zur Gewinnung eines komplexen Musters von markierten Proteinen, von denen viele Rezeptoren repräsentierten, welche von den verwendeten Lektinen gebundene Zucker einschließen, wodurch ein relatives Fehlen von Spezifität beim Extrahieren relevanter Rezeptoren unter Verwendung von Lektin als einem Bindemittel aufgezeigt wird.
Obgleich eine effektive Bindung von Zellen einfacher durch die Verwendung von Lektinen als mittels der spezifischen Liganden der vorliegenden Erfindung erreicht werden kann, gibt das Resultat keine Information hinsichtlich biologisch relevanter Rezeptoren, und zwar wegen der Nicht-Spezifität der Lektin-Bindung. Manche Lektine erzeugen biologische Antworten, und Lektine sind spezifisch hinsichtlich der Kohlenhydrate, an welche sie binden, aber die individuellen Kohlenhydratziele sind wahllos in Hinsicht auf die Rezeptoren, in welchen sie vorkommen. Daher geht im Hinblick auf individuelle Rezeptoren die Spezifität der Bindung verloren.
Beschreibung der Erfindung
Es ist nun festgestellt worden, dass proteinhaltige Oberflächenrezeptoren, insbesondere in nukleierten Zellen, zusammen mit nicht-kovalent assoziierten komplexierten Komponenten durch spezifische Bindung dieser Rezeptoren an Gegenstück-Liganden und anschließendes Scheren der Masse der Zellen oder der relevanten Membran aus dem Ligand/Rezeptor-Komplex entnommen werden können. Im Allgemeinen kann dieses Verfahren als "Deracination" bzw. Entwurzelung des Rezeptors und seiner Mikroumgebung bezeichnet werden. Falls gewünscht, kann der Rezeptor zusammen mit seinen assoziierten zellulären Komponenten von dem spezifischen Liganden dissoziiert werden, zum Beispiel unter Verwendung von kompetitiver Bindung durch den Rezeptor selbst oder seiner Analoge oder einer Anzahl anderer Techniken.
Die Erfindung sieht ein Verfahren zum raschen und spezifischen Isolieren von membrangebundenen Komponenten wie Zelloberflächenrezeptoren in ihrer nativen Konformation und in ihren nativen Mikroumgebungen unter Bedingungen, bei welchen der Zustand der Komponente oder des Rezeptors bewahrt wird, vor, wodurch Einblicke in die Funktion des Rezeptors gewährt werden, die nicht erhältlich sind, wenn herkömmliche Verfahren zur Isolation eingesetzt werden. Solche herkömmlichen Verfahren beinhalten typischerweise Detergenzien oder chaotrope Mittel, welche die Membran und die zytoplasmatische Umgebung, welche den Rezeptor umgibt, verzerren und/oder zerstören und daher Information in Hinsicht auf die Umgebung und Funktion des Rezeptors selbst verwischen. Das erfindungsgemäße Verfahren liefert somit Information, welche Zelloberflächenziele identifiziert und charakterisiert, die mit Stimuli/Liganden wechselwirken, sowie für die Identifizierung und das Design von Molekülen, welche mit diesen Zielen wechselwirken. Die Identifizierung und das Design von Molekülen, welche mit diesen Zielen wechselwirken, einschließlich Molekülen, welche diese inhibieren, wird durch das Verständnis weiter erhellt, welches durch die Verfahren der Erfindung verfügbar gemacht wird, welche die Funktionsweise und zusätzliche zelluläre Komponenten, die mit den Zielen assoziiert sind, aufklären.
Somit richtet sich die Erfindung in einem Aspekt, auf ein Verfahren zum Isolieren eines membrangebundenen Rezeptors wie einem Zelloberflächenrezeptor, zusammen mit seiner Mikroumgebung, wobei das Verfahren das Vorsehen eines festen Trägers, der an einen Liganden gekoppelt ist, welcher für den gewünschten Rezeptor spezifisch ist, an welchen den Rezeptor tragende Membranen gebunden worden sind durch Assoziation mit dem Liganden unter Bildung eines Ligand/Rezeptor-Komplexes, und danach das Scheren der Zellen aus dem Ligand/Rezeptor-Komplex umfasst. Der "Ligand" kann zum Beispiel ein Hormon oder Wachstumsfaktor sein oder kann ein Antikörper oder ein relevantes Fragment davon sein, solange er spezifisch für das angezielte Protein ist. Der so gewonnene Rezeptor wird mit seiner Mikroumgebung assoziiert bleiben. Die Mikroumgebung kann selbstverständlich eigentlich keinerlei assoziierten zellulären Komponenten einschließen, und der Rezeptor wird allein zurückgewonnen werden. Dies ist ebenfalls eine wertvolle Information in Bezug auf die Natur des Rezeptors. Hieran kann sich wahlweise die Dissoziierung des Ligand/Rezeptor-Komplexes (umfassend den Rezeptor und dessen Mikroumgebung) von dem festen Träger und/oder die Dissoziierung des Liganden von dem Rezeptor/Mikroumgebung, zur Gewinnung des Rezeptors/Mikroumgebung selbst, anschließen. In jedem Fall ist es, wenn die Mikroumgebung mit dem Rezeptor assoziiert bleibt, ein zusätzlicher Schritt, der innerhalb der Erfindung zum Analysieren der Mikroumgebung eingeschlossen werden kann, festzustellen, welche Komponenten selbige enthält, falls überhaupt. Zahlreiche Verfahren sind für eine solche Analyse verfügbar, einschließlich zum Beispiel chromatographische Analyse, Massenspektroskopie, 2-dimensionale Gele und Western-Blots.
In dem Verfahren der Erfindung ist der Ligand spezifisch für den Rezeptor an sich und zeigt keine Kreuzreaktion mit Rezeptoren, welche hinsichtlich der biologischen Aktivität des Zielrezeptors irrelevant sind. Wie hierin nachstehend definiert wird, schließen, in einer Ausführungsform, für Rezeptoren spezifische Liganden für den größten Teil keine Lektine ein. Lektinen fehlt im Allgemeinen die erforderliche Fähigkeit, nur an einzigartige biologisch signifikante Rezeptoren zu binden. Die Lektine sind im Allgemeinen in der Lage, an mit Proteinen assoziierte Kohlenhydrate zu binden, und sind daher kreuzreaktiv mit glycosylierten Proteinen im Allgemeinen. Lektine fallen nur dann in die Definition von "Liganden" hierin, wenn sie ausreichend spezifisch sind, um eine Deracination eines besonderen Rezeptors zu bewirken, im Gegensatz zu ihrem typischen gat tungsspezifischen Verhalten. Im Allgemeinen binden Lektine an höhere Dichten von Rezeptoren auf Zellen im Vergleich zu spezifischeren Liganden, wie Antikörpern. Es sollte bemerkt werden, dass Antikörper oder Fragmente davon, welche als Liganden verwendet werden, zu irgendeiner biologischen Antwort führen können, aber dies an sich nicht müssen; allerdings zielen sie spezifisch auf Rezeptoren ab, deren Liganden eine Antwort hervorrufen.
Ferner können Lektine, um zu binden, eine Vorbehandlung der Oberfläche der Membran erfordern, um die Kohlenhydrateinheiten, die sie binden, zu exponieren. Ein bevorzugtes Verfahren der Erfindung verwendet Membranen, welche nicht irgendeiner Oberflächenbehandlung unterzogen worden sind, welche die auf der Zelloberfläche exponierten Kohlenhydrate modifiziert. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht ein Vorteil darin, dass die Membran in einem realistischeren nativen Zustand verwendet wird. In diesem bevorzugten Verfahren erfolgt keine Oberflächenbehandlung der Membranen vor Kontaktieren derselben mit dem spezifischen Ligand.
In einer bevorzugten Ausführungsform können jedoch Lektine zumindest als Teil des Vorgehens-Schemas verwendet werden. Wo es verstanden wird, dass die Kohlenhydratverteilung in einem besonderen Zelltyp verschieden sein wird, kann es möglich sein, Lektine vorzusehen, welche spezifisch für einen Zelloberflächenrezeptor sind, und in diesem speziellen Fall können solche Lektine als Liganden verwendet werden. Es wird zum Beispiel verstanden, dass mit Tumorzellen assoziierte Rezeptoren verschiedene Glycosylierungsmuster zu denjenigen aufweisen, die mit normalen Zellen assoziiert sind. Wo der Unterschied in der Kohlenhydrat-Assoziation ausreichend ist, um einen jeweiligen Rezeptor zu differenzieren, zum Beispiel auf einer Tumorzelle, kann, selbst wenn eine Zellbehandlung benötigt wird, um das differenzierende Kohlenhydrat zu exponieren, ein für dieses Kohlenhydrat spezifisches Lektin als ein hinreichend spezifischer Ligand verwendet werden.
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die Membranen assoziiert mit oder abgeleitet aus einer nukleierten Zelle oder einer bakteriellen Zelle, vorzugsweise einer nukleierten Zelle. Nukleierte Zellen sind stellvertretend für praktisch alle typischen eukaryotischen Zellen mit Ausnahme von roten Blutkörperchen. Die Membranen auf der Oberfläche von, oder enthalten in, nukleierten Zellen sind inhärent komplexer als diejenigen, welche beispielsweise mit roten Blutkörperchen assoziiert sind. Ferner vollführen nukleierte Zellen komplexere metabolische Funktionen als rote Blutkörperchen und bieten damit ein fruchtbareres Substrat für das Auffinden von Rezeptoren.
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform schließt das Verfahren der Erfindung die oben beschriebenen aktiven Schritte ein, um die Mikroumgebung zu analysieren, in welcher der Rezeptor enthalten ist. Die Mikroumgebung kann in der Membran selbst oder in der näheren Umgebung des Rezeptors im Zytoplasma bestehen. Wie oben angegeben, muss die Mikroumgebung nicht irgendwelche nah assoziierten Komponenten enthalten, und daher wird das Verfahren der Erfindung zur Isolierung des Rezeptors an sich führen.
In einem anderen Aspekt richtet sich die Erfindung auf ein Verfahren zum Erhalten einer Bibliothek von membrangebundenen Rezeptoren, wobei das Verfahren das Bereitstellen von festen Trägern, gekoppelt an eine Vielzahl an Liganden; das Kontaktieren der festen Träger mit einer Probe von Membranen, vorzugsweise aus oder assoziiert mit nukleierten Zellen, unter Bedingungen umfasst, bei welchen Rezeptoren in den Membranen oder auf den Zellen an einen oder mehrere der Liganden auf den festen Trägern gekoppelt sind, so dass ein Ligand einen Komplex mit seinem zugehörigen Rezeptor formt. Die Membranen oder Zellen werden dann von den Ligand/Rezeptor-Komplexen, welche den Rezeptor und die Mikroumgebung umfassen, dissoziiert. Die Membranabgeleiteten Rezeptoren (mit Mikroumgebungen) werden gegebenenfalls, entweder allein oder gemeinsam mit ihren Liganden, von dem festen Träger zurückgewonnen. Der Rezeptor/Mikroumgebung kann dann analysiert werden, um zu bestimmen, welche Komponenten, falls überhaupt, mit dem isolierten Rezeptor assoziiert sind.
In zusätzlichen Aspekten richtet sich die Erfindung auf mit Mikroumgebungen assoziierte isolierte Rezeptoren, hergestellt durch das Verfahren der Erfindung, und dadurch identifizierte neue Rezeptoren. Die gewonnenen Rezeptoren können in Screening-Assays verwendet werden, um Verbindungen zu identifizieren, welche mit ihnen zusammenwirken oder ihnen entgegenwirken. Die gewonnen Rezeptoren können ferner, wenn die Rezeptoren als assoziiert mit unerwünschten oder erkrankten Zellen identifi ziert werden, beim Entwurf von Antikörpern, Pharmazeutika oder Impfstoffen zum Abzielen auf diese Zellen verwendet werden. Die Rezeptoren können sowohl aus normalen als auch aus erkrankten Zellen gewonnen werden.
Die Erfindung schließt auch Rezeptorprofile von Membran- oder Zellproben ein. Wie nachstehend weiter beschrieben wird, kann das Verfahren der Erfindung in einem Hochdurchsatz-System verwendet werden, um Muster von Rezeptoren an der Zelloberfläche, oder enthalten in der Membran, zu bestimmen.
Somit ist ein bedeutender Aspekt der Erfindung das Vermögen, Wechselwirkungen mit Rezeptoren und die mit ihren Funktionen assoziierten zellulären Netzwerke zu charakterisieren.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1 zeigt die Ergebnisse von Flusszytometrie zum Nachweisen von EGFR auf der Oberfläche von A431-Zellen. A431-Zellen wurden mit 1 μg von entweder Kontroll-Maus-IgG oder Anti-EGFR-Maus-IgG2aκ-Antikörper 528 während 30 Minuten bei 4°C gefärbt. Die Zellen wurden dann in PBS + 1% fötalem Rindeserum gewaschen, mit FITC-konjugiertem sekundärem Anti-Maus-Antikörper gefärbt und durch Flusszytometrie analysiert. Die Ergebnisse zeigen eine starke Expression von EGFR auf der Zelloberfläche von A431-Zellen.
Die 2 zeigt Western-Blots von EGFR, der mittels Anti-EGFR-Mab und WGA-Lektin deraciniert wurde. Das 170 kDa große EGFR-Protein wurde ohne Weiteres in den deracinierten Produkten aus A431-Zellen unter Anwendung der Anti-EGFR- und der WGA-beschichteten Kügelchen detektiert.
Die 3 zeigt einen Western-Blot von deraciniertem aktiviertem EGFR und seinen assoziierten Phosphoproteinen, nachgewiesen durch Anti-Phosphotyrosin. Die Bande bei 170 kDa entspricht aktiviertem EGFR. (Die Bande bei 50 kDa entspricht einer Kreuzreaktivität des sekundären Antikörpers mit von den Kügelchen abgelöster Maus- Schwerkette (mlgH) des Maus-528-Antikörpers). Die restlichen Banden repräsentieren assoziierte Proteine.
Die 4A und 4B zeigen Western-Blots von Proteinen, assoziiert mit deraciniertem EGRF, d. h. Vav2 und Grb2. Dies zeigt sowohl EGFR-assoziiertes Vav-2 als auch Grb2 in den 528-Mab-Deracinationsmaterialien. (Die Bande, welche bei einem Molekulargewicht von 50 kDa detektiert wird, entspricht der Kreuzreaktivität des sekundären Antikörpers mit der Maus-Schwerkette (mlgH) des 528-Antikörpers, welche von den Kügelchen abgelöst worden war.)
5 zeigt einen Western-Blot von EGFR-assoziierten Shc-Proteinen, welche mittels Anti-EGFR-528-Mab deraciniert wurden.
Die 6A–6F sind Flusszytometrie-Diagramme, welche die Bindung von Anti-PSCA 1G8-Mab und WGA an die Oberfläche von PC3-Zellen zeigen, welche mit einem PSCA-Expressionssystem transfiziert wurden. Die Zellen wurden mit Kontrollantikörper oder 1 μg von entweder 1G8-Anti-PSCA-Maus-IgG1-Antikörper, gefolgt von FITC-konjugiertem sekundärem Anti-Maus-Antikörper, oder mit FITC-konjugiertem WGA-Lektin 30 Minuten lang bei 4°C gefärbt. Die Zellen wurden dann durch Flusscytometrie analysiert. 1G8-Mab bindet nur an PC3-PSCA-Zellen; WGA-Lektin bindet sowohl an PC3- als auch PC3-PSCA-Zellen.
Die 7A und 7B sind Western-Blots, welche die spezifische Deracinierung von PSCA, aber nicht EGFR, mittels Anti-PSCA-1G8-Mab als Ligand zeigen. WGA vermittelte eine Deracination sowohl von PSCA als auch EGFR aus PC3-PSCA und von EGFR aus PC3-, PC3-PSCA- und A431-Zellen, aber eine Deracination mit 1G8-Anti-PSCA-Mab deracinierte nur PSCA (nicht EGFR) aus PC3-PSCA. (Die bei einem Molekulargewicht von 50 kDa und 25 kDa detektierten Banden entsprechen der Kreuzreaktivität des sekundären Antikörpers mit Maus-Schwerkette (mlgH) und -Leichtkette (mlgL) des 1G8-Antikörpers, welche von den Kügelchen abgelöst wurden.)
Die 8A und 8B sind Western-Blots, welche eine Deracination von PSCA mit WGA-Lektin zeigen. Die Ergebnisse zeigen eine WGA-vermittelte Deracination von PSCA auf PC3-PSCA-Zellen, aber das Deracinat schließt nicht das intrazelluläre Protein Grb2 ein.
Arten zur Ausführung der Erfindung
Die Erfindung stellt erstmalig ein Verfahren bereit, durch das wenigstens drei wichtige Ziele erreicht werden. Zuerst gestattet das Verfahren die Isolation von membrangebundenen Rezeptoren, welche spezifisch an einen Liganden binden, direkt aus intakten Zellen in einer Form, welche ihre nativen Konformationen und assoziierten Einheiten beibehält, wodurch eine außerordentliche Menge an Informationen über die Rezeptoren und die Komponenten, mit denen die Rezeptoren assoziiert sind, und somit die Funktionen und Rollen der gewonnenen Rezeptoren bereitgestellt wird, welche früher nicht zugänglich gewesen ist. Durch Ermittlung der Natur der Einheiten, welche nativ mit den Rezeptoren assoziiert sind, kann die Rolle des Rezeptors in zellulären Pfaden, wie Proliferation, Differenzierung, Überleben, Apoptose, Transformation und dergleichen, bestimmt werden. Sobald solche Rollen bestimmt sind, kann der Rezeptor selbst in dem Entwurf von angemessenen Strategien zum Steuern der relevanten Funktion eingesetzt werden. Zweitens, und verwandt mit dem ersten Ziel, wird die Gewährleistung ermöglicht, dass die gewonnenen Rezeptoren nicht Artefakte des Experiments sind, indem die Verwendung von Mitteln vermieden wird, welche kryptische Moleküle enthüllen würden, die nicht von biologischer Bedeutung sind, aber die zufällig den verwendeten Liganden binden. Zum Dritten bietet das Verfahren der Erfindung ein Hochdurchsatz-System zur raschen Identifizierung von membrangebundenen Rezeptoren durch ein einfaches System zum Rückgewinnen dieser Rezeptoren aus Membranen. Einige identifizierte Rezeptoren können früher unbekannt gewesen sein.
Die Identifizierung und Charakterisierung von Protein-Protein-, Protein-Lipid- oder jeglichem anderen Typ von Wechselwirkung, der von den Rezeptoren aufgezeigt wird, ist bedeutsam bei der Auswertung der biologischen Rolle des Rezeptors und somit der biologischen Rolle von Liganden, an welche er gebunden sein kann.
Wie hierin verwendet, bezieht sich "Rezeptor" auf jedwede Einheit, welche spezifisch an einen zugehörigen Liganden bindet. Typischerweise sind Rezeptoren Proteine und können weiter derivatisiert sein, wie durch Glycosylierung, Phosphorylierung, Lipidierung, Kopplung an zusätzliche Strukturkomponenten und dergleichen, oder nicht. "Rezeptoren" wird hierin als ein generischer Ausdruck verwendet und ist nicht auf Proteine beschränkt, welche notwendigerweise mit einem zellulären Pfad assoziiert sind. Membran-assoziierte Rezeptoren schließen zum Beispiel G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, Zytokinrezeptoren, Ionenkanäle, Opioid-Rezeptoren, Hormonrezeptoren, Retinoidrezeptoren, Steroidrezeptoren, Wachstumsfaktorrezeptoren, Integrine, Immunglobuline, T-Zell-Rezeptoren, MHC-Klasse I und II und, im Allgemeinen, jedwedes membrangebundene Protein, welches eine ausreichende Exposition an der Oberfläche der Membran zum spezifischen Binden an einen Ligand umfasst, ein.
Der "Ligand" kann jegliches zugehörige Bindemittel, verschieden von einem nichtspezifischen Lektin, sein, wobei das Mittel spezifisch für eine membrangebundene Rezeptorkomponente ist, wobei die Komponente charakteristisch für einen oder, in manchen Fällen, mehrere Rezeptoren) ist. (Eine charakteristische Komponente kann mehreren Rezeptoren gemeinsam sein, von denen nicht alle die gleiche biologische Funktion aufweisen müssen, obwohl dies angenommenermaßen der Ausnahmefall ist.) D. h., der Ligand sollte nur mit Rezeptoren wechselwirken, welche er spezifisch, als ein Agonist oder Antagonist, erkennt oder, im Falle von Antikörpern oder ihren Fragmenten oder anderen Nachahmern des nativen Liganden, nur mit dem Rezeptor, welcher von dem nativen Ligand, welcher nachgeahmt wird, aktiviert wird. Im Allgemeinen sind Lektine aus der Definition von Liganden ausgeschlossen, weil sie verhältnismäßig nichtspezifisch sind. Da viele Proteine glycosyliert sind, binden Lektine große Zahlen von Proteinen in nicht-spezifischer Weise. Darüber hinaus kann die Verwendung von Lektinen eine Behandlung der Membranen vor dem Kontakt erfordern, um Kohlenhydratreste, welche, zum Beispiel durch Sialinsäurereste, maskiert sind, zu exponieren. Somit schließt "Ligand", wie hierin definiert, einen Bereich von Substanzen ein, welche hochspezifisch an einen besonderen Rezeptor binden, im Gegensatz zu Lektinen, welche an eine Vielzahl von Rezeptoren binden können. Während Lektine Kohlenhydrate binden, sind nicht alle Proteine, welche Kohlenhydrate binden, Lektine. Zum Beispiel können Antikörper spezifische Kohlenhydrat-Epitope binden.
Der Ligand kann ein Ligand sein, welcher für den Rezeptor nativ ist – zum Beispiel ein Zytokin, welches normalerweise einen Zytokinrezeptor bindet, aber kann auch eine synthetische Verbindung sein, welche für eine spezifische Bindung entworfen ist, einschließlich Antikörpern oder Fragmenten davon. In Hinsicht auf ihre chemische Natur, kann der Ligand ein Protein, ein Lipid, ein Zucker oder ein kleines Molekül sein. Der Ligand kann andere kennzeichnende Merkmale aufweisen, wie das Umfassen einer Immunglobulin-Struktur oder eines Fragments davon, Aktivität als ein Toxin, Enzym, oder eine andere biologische Aktivität.
Mit der Ausnahme von Lektinen, wie oben erwähnt, beziehen sich daher, wie hierin verwendet, "Rezeptor" und "Ligand" einfach auf ein zugehöriges Bindungspaar, wobei der Rezeptor mit einer Membran assoziiert ist, und der Ligand dies typischerweise nicht ist.
"Protein", "Peptid" und "Polypeptid" werden, ungeachtet der Länge der eingeschlossenen Aminosäuresequenz, austauschbar verwendet.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Mikroumgebung" des Rezeptors auf die Moleküle in der unmittelbaren Umgebung des Rezeptors, und mit welchen dieser nicht-kovalent assoziiert ist. Diese Moleküle können an der Transduktion von Signalen aus einer Wechselwirkung des Rezeptors mit seinem Liganden beteiligt sein, oder können Moleküle sein, welche durch Wechselwirkung mit dem Rezeptor aktiviert oder deaktiviert werden. Diese Moleküle können konstitutiv mit dem Rezeptor wechselwirken oder können nur bei dessen Bindung an einen Liganden eine Wechselwirkung aufweisen. Diese Moleküle können in der Membran selbst befindlich sein oder können mit dem Rezeptor im Zytoplasma assoziiert sein. Es ist die Natur dieser Moleküle in der unmittelbaren Mikroumgebung des Rezeptors, welche bedeutende Informationen hinsichtlich der Rolle, des Wirkmechanismus und/oder der Kinetik des Rezeptors in der zellulären Funktion bereitstellt. Diese Auswertung kann ausschlaggebend bei einer Entscheidung sein, ob die Wirkung des Rezeptors agonistisch unterstützt oder ihr entgegengewirkt werden soll, und ob es nützlich ist, Antikörper, Proteine, Zellen, Pharmazeutika oder Impfstoffe zu konstruieren, welche spezifisch mit dem Rezeptor wechselwirken oder eine Immunantwort dagegen hervorrufen. Darüber hinaus wird ein Verständnis der mit dem Rezeptor assoziierten Moleküle beim Entwurf von Screening-Assays zur Identifikation von nützlichen therapeutischen und prophylaktischen Mitteln helfen.
Die als das Ausgangsmaterial in der Erfindung verwendeten Membranen können ihre Assoziation mit ihren Ursprungszellen beibehalten oder davon abgetrennt sein. Zur Verwendung als Ausgangsmaterialien in dem Verfahren der Erfindung, wird es unnötig gewesen sein, die Membranen irgendeiner "Oberflächenbehandlung" zu unterziehen, wie sie beispielsweise abgeschirmte Kohlenhydrate oder kryptische Rezeptoren exponieren würde. Eine "Oberflächenbehandlung" bedeutet eine Behandlung, welche ausgelegt ist, um Bereiche des Rezeptors freizulegen, welche nativ nicht von der Membran präsentiert werden. Solche Oberflächenbehandlungen können zum Beispiel die Behandlung mit Neuraminadase zum Exponieren von Kohlenhydratresten einschließen; eine derartige Beahndlung wäre innerhalb des Kontexts der vorliegenden Erfindung unnötig, da Lektine, wie obenstehend beschrieben, von den Liganden, welche spezifisch Rezeptoren binden, ausgeschlossen sind. Tatsächlich ist einer der Nachteile von Verfahren des Stands der Technik zum Gewinnen von Membran-präsentierten Rezeptoren, dass die Behandlung mit Detergenzien oder anderen harschen Reagenzien kryptische Einheiten exponieren kann, welche den in dem Verfahren verwendeten Liganden binden, wodurch ein Artefakt erzeugt wird, das für die native Funktion des Liganden uncharakteristisch ist. Somit wird eine "Oberflächenbehandlung" vermieden, um zu gewährleisten, dass die Membran nur die Bereiche der Rezeptoren präsentiert, welche im nativen Zustand der Membran präsentiert werden.
Allerdings kann die "Mikroumgebung" tatsächlich frei von jedweden wechselwirkenden Substanzen sein. In diesem Fall wird der Rezeptor in Abwesenheit jedweder assoziierten Materialien isoliert werden, d. h., die Mikroumgebung ist ein Leerraum. Somit sollte "Mikroumgebung" nicht so verstanden werden, dass sie die Gegenwart von zusätzlichen Substanzen unterstellt, wenn der Rezeptor durch das Verfahren der Erfindung gewonnen wird. Wenn der "Rezeptor" in irgendeiner bedeutungsvollen Weise mit zusätzlichen Substanzen nicht-assoziiert ist, wird er an sich isoliert werden, und dies liefert ebenfalls wertvolle Information.
Typischerweise ist die Membran, mit welcher der Rezeptor assoziiert ist, eine Zelloberflächenmembran. Allerdings ist die Erfindung auch auf die Gewinnung von Rezeptoren anwendbar, welche mit anderen zellulären Membranen assoziiert sind, wie Zellkernmembranen, endoplasmatischem Retikulum, Golgi-Apparat, Mitochondrien oder anderen zellulären Organellen. Bei der Anwendung des Verfahrens auf intrazelluläre Rezeptoren werden Zellkerne oder andere Organellen zuerst isoliert und dem Verfahren der Erfindung, anstelle intakter Zellen, unterzogen. Zelloberflächenmembranen können ebenfalls aus den Zellen isoliert werden; allerdings können, im Fall von Zelloberflächenmembranen, auch intakte Zellen verwendet werden.
Jedweder Typ von Zelle oder Gewebe, welcher exponierte Rezeptoren enthält, kann in dem Verfahren der Erfindung verwendet werden. Solche Zellen schließen im Allgemeinen eukaryotische Zellen, wie Hefezellen, Pilzzellen im Allgemeinen, aus Wirbellosen abgeleitete Zellen und Bakterienzellen ein. Allerdings sind die in der Erfindung verwendeten Zellen vorzugsweise nukleierte Zellen und können jedwede Zelle einschließen, welche Rezeptoren an ihrer Oberfläche aufzeigt. Vorzugsweise sind solche Zellen Wirbeltier-Zellen, und am meisten bevorzugt Säugerzellen.
Eine große Vielzahl derartiger Zellen wird angewandt, einschließlich, ohne Einschränkung, Zellen aus Adiposegewebe, areolarem Gewebe, Bindegewebe, elastischem Gewebe, Epithel-, Neural-, Schleimhaut-, Retikulargeweben etc. Die Zellen können aus Verdauungs-, Brust-, Kardiovaskulär-, Kutan-, Endokrin-, Gastrointestinal-, hämatopoetischen, hepatobiliären, lymphoiden, lymphoreticulären, Muskel-, männlichen oder weiblichen Reproduktions-, respiratorischen, skelettalen oder Harnwegs-Geweben sein. Somit können die Zellen hämatopoetische Zellen, einschließlich Lymphozyten verschiedener Typen, Vorläuferzellen, Stammzellen, Makrophagen, Granulocyten umfassen. Die Zellen können Endothelzellen, myeloide Zellen, Tumorzellen, aus verschiedenen Zelllinien abgeleitete Zellen und Zellen, abgeleitet aus einer Vielzahl von Organen, wie Harnblase, Gehirn, Brust, Dickdarm, Herz, Niere, Leber, Lunge, Knochenmark, Eierstock, Pankreas, Prostata, Haut, Magen, Hoden und dergleichen, umfassen. In hohem Maße gewebespezifische Zellen, wie diejenigen, welche abgeleitet sind aus der Retina, Cornea oder der Choroidea, können ebenfalls verwendet werden. Spezialisierte Zellen des Immunsystems, oder mit Tumoren assoziierte Zellen, welche Tumor-assoziierte Antigene an ihren Oberflächen enthalten, können ebenfalls verwendet werden.
Somit sind Rezeptoren, welche mit Membranen assoziiert sind, die in oder auf Tumorzellen enthalten sind, wie diejenigen, abgeleitet aus gutartigen oder bösartigen Tumorzellen von Prostata, Blase, Niere, Dickdarm, Brust, Pankreas, Knochen, Eierstock, Lunge, Gehirn oder nicht-soliden Tumoren, wie Lymphomen und Leukämien, für die Gewinnung und Untersuchung gemäß des Verfahrens der Erfindung verfügbar. Darüber hinaus werden Membranen, abgeleitet aus Zellen, die mit verschiedenen Krankheitszuständen assoziiert sind, einschließlich infizierten Zellen, Zellen, die eine Autoimmunantwort aufzeigen, oder Zellen mit anderen Abnormaliltäten, für die Aufklärung von Pfaden und Rezeptoren, welche für diese Zellen einzigartig sind, verfügbar gemacht.
Ein Vorteil der Erfindung besteht darin, dass eine große Vielzahl an Zelltypen hinsichtlich der präsentierten Typen von Rezeptoren untersucht werden kann, und daher die Rolle dieser Rezeptoren bei der Zelldifferenzierung und beim Wachstum weiter aufgeklärt werden kann. Die Verfahren der Erfindung gestatten auch eine Profilerstellung des Rezeptormusters auf besonderen Typen von Zellen, und eröffnen die Möglichkeit, das Membranrezeptorprofil in Zellen, welche mit besonderen Geweben assoziiert sind, oder an besonderen Stadien der Differenzierung, Alterung, oder welche als abnormal betrachtet werden, wie erkrankte Zellen oder Tumorzellen, zu vergleichen. Als ein Beispiel einer solchen Anwendung können Lektine verwendet werden, um die Rezeptoren, die auf einem besonderen Typ von normalem Gewebe exprimiert werden, zu profilieren, und selbiges dem Rezeptorprofil eines Tumorgewebes vom selben Typ gegenüberzustellen. Daher führt dies zur Identifizierung derjenigen Rezeptoren, welche in den erkrankten Tumorgeweben differenziell exprimiert werden.
In einer Anwendung der Erfindung wird ein Einzelrezeptor zusammen mit seiner Mikroumgebung aus der Zelloberfläche oder einer anderen Zellmembran nach Wahl entfernt. In dieser Ausführungsform wird zuerst ein fester Träger bereitgestellt, an welchen ein Ligand für den gewünschten Rezeptor gebunden wird. Wenn der Rezeptor bekannt ist, kann ein zweckmäßiger Ligand ein Antikörper oder ein Fragment davon, welches für den Rezeptor immunspezifisch ist, sein. Solche Antikörper können durch Immunisierung mit dem zuvor isolierten Rezeptor (wobei eine derartige vorhergehende Isolierung im Allgemeinen die Mikroumgebung des Rezeptors zerstört hat) oder mit Zellen, welche den Rezeptor aufzeigen, unter Anwendung von Standardimmunisierungstechniken oder unter Anwendung von Phagen-Display-Technologie hergestellt werden. Polyklonale Antikörper, welche immunspezifisch für den Rezeptor sind, können dann aus den Seren eines immunisierten Subjektes gewonnen werden, oder monoklonale Antikörper können aus dem Subjekt präpariert werden. Antikörper können auch rekombinant in verschiedenen Formen, wie Einzelkettenantikörper, hergestellt werden. Fragmente der Antikörper, wie Fab, Fab' und F(ab')₂ können ebenfalls verwendet werden. Jedweder Bereich des Antikörpers, der immunspezifisch ist, kann als der Ligand zur Gewinnung des Rezeptors verwendet werden.
Selbst wenn der Rezeptor nicht bekannt ist, können Antikörper hergestellt werden, welche zur Isolierung des früher unbekannten Rezeptors zusammen mit seiner Mikroumgebung führen, welche beliebige Komponenten enthält, die die Mikroumgebung einschließen kann. Beispielsweise können Zellen zur Immunisierung verwendet werden, und monoklonale Antikörper aus dem Subjekt der Immunisierung präpariert und durch Hybridomtechnologie oder unter Anwendung standardmäßiger rekombinanter Techniken, einschließlich Phagen-Display, hergestellt werden. Die individuellen monoklonalen Antikörper können dann als Liganden verwendet werden, um zuvor unbekannte Rezeptoren aus den Zelloberflächen oder aus Membranen, welche aus diesen Zellen abgeleitet worden sind, aufzuspüren.
Zusätzlich zu Antikörpern können Aptamere, welche den Rezeptor spezifisch binden, erhalten werden, wobei Selex^TM-Vorgehensweisen zum Einsatz kommen, wie es im Fachgebiet verstanden wird. Alternativ dazu kann es sich bei dem Liganden um einen Liganden handeln, welcher für den Rezeptor nativ ist, oder es kann sich um einen willkürlich gewählten Liganden handeln, der beispielsweise aus einer kombinatorischen Bibliothek gewonnen wurde, einschließlich Bibliotheken, welche kleine Moleküle, Peptide, Antikörper und dergleichen enthalten.
Der nun gewählte Ligand wird an einen festen Träger gekoppelt, so dass ein Rezeptor, an welchen der Ligand komplexiert wird, gewinnbar ist. Der feste Träger kann in irgend einer zweckdienlichen Form vorliegen, einschließlich beispielsweise Kügelchen, aufgebaut aus Polystyrol, Latex, Sephadex, Polyacrylamid und dergleichen. Ebenfalls anwendbar sind magnetische Kügelchen, Fasern und andere geometrische Konfigurationen. Besonders zweckmäßig sind Mehrfachvertiefungsplatten.
Der Ligand wird durch irgendeine zweckmäßige Methode an den festen Träger gekoppelt, wobei die Bindung ausreichend fest ist, um einem Zerbrechen durch Scherung zu widerstehen. Vorzugsweise, aber nicht notwendig, wird der Ligand kovalent an den Träger gebunden. Abhängig von der Auswahl des Liganden und der chemischen Natur des Trägers, werden Verknüpfungstechniken ausgewählt, um die gewünschte Bindung zu erhalten. Derartige Verknüpfungstechniken schließen beispielsweise Kopplung über CNBr oder Kopplung über Linker, wie diejenigen, welche von Pierce Chemical Co. Rockford, IL, verfügbar sind, ein. Die Kopplung kann durch Peptidverknüpfungen, Disulfidverknüpfungen, Vernetzung über Glutaraldehyd, Biotin/Avidin-Bindung und dergleichen erfolgen. Die Linker können ebenfalls Mittel zum Dissoziieren des Liganden von dem festen Träger einschließen. Zum Beispiel kann der Linker einen photoabspaltbaren Bereich oder einen Bereich einschließen, welcher durch spezifische Enzyme oder in Antwort auf ein vorbestimmtes Reagenz, welches hinsichtlich des Liganden oder des zu gewinnenden Rezeptors harmlos ist, spaltbar ist. Protein A kann ebenfalls verwendet werden, um Antikörper zu binden, gegebenenfalls gefolgt von einer weiteren Verknüpfungs-Vorgehensweise. Die Auswahl von Verknüpfungstechniken wird dem Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sein.
Der feste Träger, welcher mit, vorzugsweise, kovalent gebundenem Ligand ausgestattet worden ist, wird dann mit den Zellen, Geweben oder Membranen, die den gewünschten Rezeptor enthalten, behandelt. Die Membran kann in einer intakten Zelle oder einem Gewebe, einem intakten Zellkern oder Organell eingeschlossen sein oder kann als eine isolierte Membran per se hergestellt werden. Der Liganden-derivatisierte feste Träger wird dann mit der Membran behandelt, welche den Rezeptor enthält, unter Bedingungen, bei welchen ein Komplex zwischen dem Rezeptor und dem gekoppelten Ligand gebildet wird. Diese Bedingungen sind typischerweise physiologische Bedingungen von neutralem pH, Raumtemperatur oder geringfügig höher oder tiefer, und wenn intakte Zellen verwendet werden, vorzugsweise passendem osmotischem Druck. Die Kontakt zeit variiert, kann aber so kurz wie eine Minute oder so lang wie mehrere Stunden oder über Nacht sein. Nachdem ausreichend Zeit verstrichen ist, so dass ein Komplex zwischen Ligand und Rezeptor gebildet wird, wird der feste Träger aus der Probe, welche die Membranen enthält, entfernt, und gegebenenfalls gewaschen, um ungebundene Membran, Zellen oder Organellen zu entfernen. Das Waschen erfolgt im Allgemeinen unter standardmäßiger physiologischer Temperatur und auch pH. Der nun gewonnene feste Träger enthält somit Ligand, komplexiert an Rezeptor, wobei der Rezeptor in der Membran der/des intakten Zelle, Zellkerns oder Membran-Präparation eingebettet bleibt.
Der nächste Schritt besteht darin, den Rezeptor/Ligand-Komplex aus der Membran zu dissoziieren, in welcher sich der Rezeptor befindet. Um diesen Schritt auszuführen, wird eine sanfte Kraft, wie eine Scherkraft, angewandt. Diese Kraft kann in einer Vielzahl von Weisen erhalten werden, einschließlich Verwirbelung, Extrusion, wie durch heftiges wiederholtes Pipettieren, Schütteln, Beschallung unter milden Bedingungen, Rühren oder jedwedes andere Verfahren, um eine sanfte Scherkraft auszuüben. Die Scherung ist derartig, dass der Rezeptor/Ligand-Komplex intakt bleibt, während der Rezeptor, zusammen mit assoziierten Einheiten, vorsichtig aus der Membran entfernt wird, in welcher er sich befunden hat. Der Rezeptor ist daher fortgesetzt mit den Molekülen assoziiert, mit welchen er in situ interagiert. Wenn intakte Zellen oder Gewebe verwendet worden sind, bleiben die Zellen oder Gewebe intakt und lebensfähig. Die Tatsache, dass sie nicht lysiert werden, gestattet die Vermeidung einer Kontamination mit Zelltrümmern, welche aus lysierten Zellen oder Geweben freigesetzt werden. Dieser Schritt kann als "Deracination" bezeichnet werden.
Nachdem der Rezeptor zusammen mit seiner Mikroumgebung derartig aus der Membran entfernt worden ist, können der Rezeptor und seine assoziierten Komponenten, entweder auf dem festen Träger oder nach Entfernen davon, analysiert und identifiziert werden. Das Entfernen des Rezeptors von dem festen Träger kann zum Beispiel bewirkt werden durch kompetitives Dissoziieren des Ligand/Rezeptor-Komplexes, durch Abspaltung des gesamten Ligand/Rezeptor-Komplexes von dem Träger mittels Freigeben des Liganden von dem Träger, oder durch Vorsehen von Dissoziierungsbedingungen, bei welchen der Ligand/Rezeptor-Komplex aufgebrochen wird. Wenn der Ligand zum Beispiel ein Antikörper ist, kann ein Antigen, welches den Antikörper im Wettbewerb mit dem Rezeptor bindet, verwendet werden, um den Rezeptor von der Bindung an den festen Träger hinweg zu kompetieren. Eine solche Dissoziierung kann auch erzielt werden durch Ändern der Bedingungen, so dass der Ligand nicht länger an einen Rezeptor bindet, zum Beispiel durch Veränderung des pH-Wertes. Wenn die Verknüpfung, welche verwendet wurde, um den Liganden an den festen Träger zu koppeln, ausgelegt worden ist, um einen photoabspaltbaren Bereich einzuschließen, kann der gesamte Komplex durch Exposition an eine geeignete Lichtwellenlänge entfernt werden. Wenn die Verknüpfung des Liganden entworfen worden ist, um eine Enzymspaltungsstelle einzuschließen, wird der feste Träger dann mit dem passenden Enzym behandelt. Alternative Wege zum Dissoziieren des Ligand/Rezeptor-Komplexes zum Freisetzen des Rezeptors und seiner Mikroumgebung allein würden, gleichwohl wie kompetitive Bindung, Behandlung mit hohen Temperaturen oder mit Lösungsmitteln oder pH-Bedingungen, welche zur Dissoziierung führen, einschließen. Allerdings wird kompetitive Wechselwirkung bevorzugt, da alternative Verfahren für die Dissoziierung des Komplexes auch den Rezeptor von den Komponenten seiner Mikroumgebung dissoziieren können.
Die weitere Analyse und Identifikation des Rezeptors und seiner assoziierten Komponenten wird dann durch allgemein im Fachgebiet bekannte Methoden durchgeführt. Das Protein kann sequenziert werden, und das Protein, seine posttranskriptionalen Modifizierungen und die begleitenden Materialien der Mikroumgebung können durch chromatographische Verfahren, NMR, Massenspektrometrie, Infrarotspektrometrie und dergleichen analysiert werden. Eine Vielzahl von analytischen Werkzeugen ist heute zum Charakterisieren des Proteins an sich und seiner Mikroumgebung verfügbar. Zweidimensionale Elektrophorese, Western-Blot und Massenspektrometrie, und analytische Methoden, welche Protein-Protein-Wechselwirkungen erkennen, können zum Einsatz kommen; siehe zum Beispiel Rudert, F., et al., Biotechnol. Ann. Rev. (2000) 5: 45–86; Link, A. J., et al., Nature Biotechnol. (1999) 17: 676–682; Neubauer, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94: 385–390.
Skizzenhaft dargestellt, ist eine veranschaulichende Ausführungsform der Erfindung, wie folgend beschaffen: Kügelchen werden mit einem Antikörper beschichtet, der spezi fisch für ein Antigen ist, welches an einer zellulären Oberfläche exprimiert wird. Die Antikörper-beschichteten Kügelchen werden an die Antigen-exprimierenden Zellen exponiert, was zur Bildung von Komplexen zwischen dem Antikörper und den Antigenen an der Zelloberfläche führt. Die Zellen, welche an Kügelchen gebunden sind, werden dann zum Beispiel unter Verwendung von Scherung entfernt, wobei der Antikörper, komplexiert an das Antigen und seine assoziierten Membrankomponenten, welche somit aus den Zellen deraciniert werden, zurückgelassen wird. Die Zellen, welche aus dem Komplex abgeschert werden, sind typischerweise vollständig lebensfähig. Das Antigen mit seinen assoziierten Membrankomponenten wird dann aus dem Antikörper/Antigen-Komplex eluiert und einer Analyse, zum Beispiel durch Massenspektrometrie, unterzogen, um das Antigen und die damit assoziierten Komponenten, wie oben beschrieben, zu identifizieren.
Das Verfahren der Erfindung kann für die Gewinnung und Analyse sowohl bei Rezeptoren, deren Gegenwart bereits im Allgemeinen bekannt war, als auch zur Gewinnung von Rezeptoren, welche davor unidentifiziert waren, angewandt werden. Um unidentifizierte Rezeptoren zu gewinnen, kann der spezifische Ligand willkürlich gewählt werden und kann eine Vielzahl von willkürlich gewählten Rezeptoren umfassen. Zum Beispiel kann es wünschenswert sein, jedweden membraneingebetteten Rezeptor zu gewinnen, welcher mit einem besonderen Steroid oder mit einem besonderen Zytokin oder mit einem besonderen Opioid oder mit einem besonderen Antigen oder Antikörper komplexieren kann.
Alternativ dazu kann es wünschenswert sein, eine Vielzahl von Rezeptoren nichtspezifisch zu gewinnen. Dies kann bewerkstelligt werden unter Anwendung des Verfahrens der Erfindung durch Versehendes Bereichs des Rezeptors, der auf der Membran exponiert ist, mit einem Mitglied eines spezifischen Bindungspaars, wie generischem Biotinylierem der Proteine an der Membranoberfläche und danach Verwenden von Avidin als dem Liganden. Die gewonnenen Rezeptoren werden dann durch Elektrophorese getrennt und wie hierin beschrieben analysiert.
Das Verfahren der Erfindung kann auch an ein Hochdurchsatz-Screening angepasst werden, um die Identifikation von Rezeptoren für eine Vielzahl von Liganden zu gestat ten. Zum Beispiel können getrennte Bereiche eines festen Trägers an eine Vielzahl von Liganden gekoppelt werden, und die Vielzahl von Liganden wird dann mit einer Probe von Membranen interagieren gelassen, welche, wie zuvor, intakte Zellen, intakte Zellkerne, intakte Organellen oder Membranpräparationen per se umfassen kann. Das Rezeptorprofil der Membranpräparation kann dann in Einzelheiten ermittelt werden.
Anfänglich kann das Array von Liganden, welche von der Membranpräparation gebunden werden, durch Markieren der Membranen (oder Zellen oder Zellkerne) und Detektieren des Vorhandenseins von Markierung auf einem festen Träger ermittelt werden. Dies kann zum Beispiel vorgenommen werden durch Verwenden von fluoreszierenden, colorimetrischen, radioaktiven Markierungen oder anderen gut bekannten Techniken, um die Membranen detektierbar zu machen, oder durch sekundäres Markieren der Membranen durch Reaktion mit markierten Reagenz, wie markiertem Antikörper. Das Verfahren der Erfindung zum Gewinnen des Rezeptors, welcher seine Mikroumgebung aus den Membranen enthält, kann dann weiter angewandt werden, um nicht nur das Array von Liganden-bindenden Rezeptoren aufzuklären, sondern auch die Natur der Rolle des präsentierten Rezeptors im Leben der Zelle. Somit können charakteristische Profile für eine Vielzahl von Zellen erhalten werden, und Unterscheidungen zwischen verschiedenen differenzierten Zellen, normalen Zellen, erkrankten Zellen, Tumorzellen und dergleichen können vorgenommen werden.
Eine besonders nützliche Anwendung des Verfahrens der Erfindung ist die Gewinnung und Identifizierung von Peptiden, welche mit der HLA-Klasse-I- und Klasse-II-Präsentation assoziiert sind. In dieser Anwendung werden zugehörige Liganden, wie Antikörper, welche gegen Antigene gerichtet sind, die von spezifischen MHC-Haplotypen codiert werden, an den festen Träger gekoppelt und mit Antigenpräsentierenden Zellen inkubiert. Als ein Ergebnis wird ein Komplex zwischen dem Antigen der MHC-Klasse I oder Klasse II, das ein Peptid trägt, und dem zugehörigen Ligand gebildet. Der Komplex-enthaltende feste Träger wird dann einer mechanischen Disruption unterzogen, um den Komplex von den Zellen zu dissoziieren, wobei der Komplex aus HLA und gebundenem Peptid auf dem Träger zurückgelassen wird; das Peptid kann dann zweckmäßig aus dem Komplex entfernt und analysiert werden. Dieses Verfahren kann auch zum Beispiel auf Tumorzellen angewandt werden, um an der Oberfläche präsentierte Peptide zu identifizieren, welche dann verwendet werden können, um eine cytotoxische T-Zell-Antwort gegen den Tumor hervorzurufen, da Tumorassoziierte Antigene durch MHC restringiert sind.
Andere Anwendungen schließen die Gewinnung von Antigenen, die für besondere Zellen spezifisch sind, wie Prostata-Stammzell-Antigen (PSCA), Prostatamembranspezifisches Antigen (PMSA), verschiedene Lymphozytenmarker, wie CD34, CD8, CD4, CD10 und dergleichen, Immunglobuline, welche für B-Zellen charakteristisch sind, Retinoid-Rezeptoren, Opioid-Rezeptoren, Wachstumsfaktor-Rezeptoren, Ionenkanäle, Integrine und dergleichen, ein.
Somit kann das Verfahren der Erfindung angewandt werden, um zelluläre Komponenten zu identifizieren, welche mit Signaltransduktionswegen assoziiert sind, wie diejenigen, welche mit der EGF-Aktivierung des EGF-Rezeptors assoziiert sind. Antikörper werden verwendet, um den EGF-Rezeptor zusammen mit seiner Mikroumgebung zu erhalten, und die mit dem EGF-Rezeptor assoziierten Komponenten werden analysiert, um sie zu identifizieren und zu charakterisieren.
Die folgenden Beispiele sind zur Veranschaulichung, aber nicht zur Einschränkung der Erfindung beabsichtigt.
Beispiel 1
Deracination von EGF-Rezeptor (EGFR) durch Anti-EGFR-Mab und Weizenkeim-Agglutinin(WGA)-Lektin
Die Deracination von EGFR in seiner nativen Konfiguration direkt aus der Zelloberfläche von menschlichen Tumorzellen wurde erzielt unter Verwendung von Kügelchen, die mit Anti-EGFR-Mab, und, als einer Kontrolle, mit Weizenkeim-Agglutinin(WGA)-Lektin gekoppelt waren. Die Deracination wurde auf den menschlichen epidermoiden Karzinomzellen A431 ausgeführt, welche hohe Spiegel an EGFR exprimieren, in der Größenordnung von 1 × 10⁶ Rezeptoren pro Zelle, wie gezeigt durch Flusszytometrie (1) und durch frühere Untersuchungen (Sato et al., Mol Biol Med (1983) 1: 511–529; Gill et al., J Biol Chem (1984) 259(12): 7755–7760).
Die spezifische Deracination von EGFR erfolgte unter Verwendung des Maus-IgG2aκ-Anti-EGFR-528 Mab (Santa Cruz Biotechnology Inc.), welcher eine Affinität von etwa 1 × 10^–9 M gegenüber EGFR aufzeigte, welcher auf Zellen präsentiert wird. Zum Vergleich wurde auch WGA, ein Lektin, welches an N-Acetylglucosamin-Kohlenhydratreste von Zelloberflächenproteinen einschließlich EGFR bindet (Zeng, et al., Mol Cell Biochem (1995) 142(2): 117), verwendet.
Cyanobromid(CNBr)-aktivierte Sepharose 6 MB (Amersam Pharmacia Biotech)-Kügelchen wurden mit dem Maus-Anti-EGFR-Antikörper 528 (IgG2aκ) gemäß den Anweisungen des Herstellers gekoppelt. Ungefähr 0,1 Gramm entweder 528-beschichtete Kügelchen oder WGA-beschichtete Kügelchen (Amersham Pharmacia Biotech) wurden mit 5 × 10⁶ A431-Tumorzellen inkubiert, mit oder ohne vorherige Stimulation mit 1 μg/ml EGF während 5 Minuten. Nach 15 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurden überschüssige ungebundene Zellen dreimal mit PBS durch Absetzenlassen der Kügelchen und Verwerfen der Zellen im Überstand gewaschen.
An die Kügelchen gebundene Zellen wurden durch 5- bis 6-maliges Pipettieren mit einer Pasteurpipette entfernt. Die Kügelchen wurden sich absetzen gelassen, und die freigegebenen Zellen im Überstand wurden verworfen. Das Vorgehen wurde 4- bis 5-mal wiederholt. Die übrig gebliebenen Zellen, welche an Kügelchen gebunden waren, wurden durch vorsichtige Verwirbelung entfernt. Die entfernten Zellen waren gezeigtermaßen lebensfähig. Die Kügelchen wurden pelletieren gelassen, und der Überstand wurde verworfen.
Die Kügelchen wurden unter Lichtmikroskopie sichtbar gemacht, um die vollständige Entfernung von Zellen zu bestätigen, in Probenpuffer (0,06 M Tris-HCl, pH 6,8, 10% Glycerol, 2% SDS, 5% β-ME, 0,001% Bromphenolblau) resuspendiert, 3 Minuten lang gekocht, und der Überstand wurde auf ein SDS-PAGE-Polyacrylamidgel aufgetragen. Das Gel wurde auf Nitrozellulosemembran überführt und geblottet.
Die Blots wurden gefärbt mit Kaninchen-Anti-EGFR-Antikörper, gefolgt von HRP-konjugiertem Anti-Kaninchen-Antikörper, und unter Anwendung des ECL-Chemo lumineszenz-Kits (Amersham Pharmacia) entwickelt (2). Das 170 kDa große EGFR-Protein wurde ohne weiteres als eine scharte Bande in dem Material, welches aus A431-Zellen unter Anwendung des Anti-EGFR deraciniert worden war, nachgewiesen. In dem Material von WGA-beschichteten Kügelchen waren die Banden diffuser, weil mehr Protein deraciniert wird. Diese Ergebnisse zeigten die erfolgreiche Deracination von EGFR aus A431-Zellen durch den Mab bzw. monoklonalen Antikörper 528. Wie erwartet, wurden ähnliche Spiegel an EGFR-Proteinen aus Zellen deraciniert, welche in Abwesenheit oder Gegenwart von EGF kultiviert worden waren.
Beispiel 2
Deracination von EGFR-assoziierten Proteinen durch Anti-EGFR-Mab und WGA-Lektin
Die Bindung von EGF an seinen Rezeptor, EGFR, löst eine Kaskade von zellulären biochemischen Ereignissen aus, einschließlich der Rezeptor-Tyrosin-Autophosphorylierung sowie der Phosphorylierung von mehreren cytoplasmatischen Molekülen (Pandey of al., PNAS (2000) 97: 179–184). Die EGFR-Autophosphorylierung führt zu dessen Wechselwirkung mit cytoplasmatischen Signalleitungsproteinen, enthaltend src-Homologiedomänen (SH2) und Phosphotyrosin-Wechselwirkungsdomänen (PID), wie Grb2- und Shc-Proteinen (O'Bryan et al., J Biol. Chem (1998) 273(32): 20431). Die Assoziation von Grb2- und Shc-Proteinen mit EGFR wurde durch Fluoreszenzresonanz-Energietransferanalyse (Sorkin et al., Current Biology (2000) 10: 1395), durch Immunpräzipitation (Hashimoto et al., J Bio. Chem (1999) 274(29): 20139–10143; Kimoto et al., Genes Cells (2000) 5: 749–764) und Massenspektrometrie (Pandey et al., PNAS (2000) 97: 179–184) demonstriert. Die Kombination von Immunpräzipitation mit Massenspektrometrie identifizierte, dass ein anderes EGFR-wechselwirkendes Protein, Vav-2, bei EGF-vermittelter Stimulation tyrosinphosphoryliert wird (Pandey et al., PNAS (2000) 97: 179–184).
Um aktivierten EGFR und EGFR-assoziierte Proteine in ihrer nativen Konfiguration zu isolieren, wurde eine Deracination an mit EGF stimulierten A431-Zellen durchgeführt, wobei Anti-EGFR-Mab-beschichtete Kügelchen, wie beschrieben in Beispiel 1, verwendet wurden. Die Deracinationsprodukte wurden auf einem SDS-PAGE-Gel laufen ge lassen, und die Membranen wurden mit Maus-Anti-Phosphotyrosin-Antikörper (Santa Cruz Biotechnology Inc.), gefolgt von HRP-konjugiertem Anti-Maus-Antikörper, gefärbt.
Wie gezeigt in der 3, führte eine Deracination von EGFR durch den 528-Mab aus EGF-aktivierten A431-Zellen zur Isolierung von in hohem Maße tyrosin-phosphoryliertem EGFR, im Vergleich zu den Proben, welche aus unstimulierten Zellen deraciniert wurden, und zu A431-Zelllysat. Der Nachweis einer Niedrigspiegel-EGFR-Phosphorylierung in unstimulierten Zellen bestätigt frühere Veröffentlichungen, welche zeigen, dass Anti-EGFR-528-Mab selbst fähig zum Stimulieren von EGFR-Phosphorylierung und -Aktivierung ist (Gill et al., J Biol Chem (1984) 259: 7755–7760). Die Analyse detektierte auch zusätzliche tyrosinphosphorylierte Proteine mit ungefähren Molekulargewichten von 95, 90, 85, 70, 65 und 60 kDa, von denen die meisten (90, 85, 70, 65 und 60 kDa) signifikant hinsichtlich den Deracinationsprodukten von EGF-stimulierten Zellen, im Vergleich zu den unstimulierten Zellen, angereichert waren. Die meisten dieser tyrosinphosphorylierten Proteine stehen in Übereinstimmung mit denjenigen, von welchen früher mittels Immunpräzipitationsuntersuchungen bestimmt wurde, mit EGFR assoziiert zu sein, einschließlich Grb2, Vav-2 und Shc-Proteinen (25, 110 bzw. 46/52/66 kDa). (Die bei einem Molekulargewicht von ∼ 50 kDa nachgewiesene Bande entspricht Kreuzreaktivität des sekundären Antikörpers mit von den Kügelchen abgelöster Maus-Schwerkette (mlgH) von 528-Mab).
Die weitere Charakterisierung der deracinierten Proben wurde durch Western-Blot-Analyse unter Anwendung von Nachweis-Antikörpern ausgeführt, die spezifisch gegen Vav-2 (4A), Grb2 (4B) und Shc-Proteine (5) waren.
Eine Western-Blot-Analyse von 528-Mab-deracinierten Proben unter Verwendung des Anti-Vav-2-Antikörpers detektierte ohne weiteres Vav-2-Protein (ungefähr 110 kDa), wobei dessen Assoziation mit EGFR sowohl in stimulierten als auch unstimulierten A431-Zellen angezeigt wurde (4A). In ähnlicher Weise wurde auch Grb2-Protein (25 kDa) in den Anti-EGFR-Mab-deracinierten Materialien ohne weiteres nachgewiesen (4B). Es ist zu bemerken, dass die bei einem Molekulargewicht von ∼ 50 kDa detektierte Bande einer Kreuzreaktivität des sekundären Antikörpers mit von den Kügelchen abgelöster Maus-Schwerkette (mlgH) des 528-Antikörpers entspricht.
Die Isolierung von EGFR-assoziiertem Protein Vav-2 und Grb2 sowohl in unstimulierten als auch EGF-stimulierten Zellen könnte erklärt werden durch die Beobachtung, dass Anti-EGFR selbst fähig zur Aktivierung von EGFR ist, was zur Wechselwirkung mit Vav-2 in Abwesenheit von EGF-Stimulation führen kann (Gill et al., J Biol Chem (1984) 259: 7755–7760).
Shc-Proteine können in 3 Isoformen existieren, P46, P52 und P66. Sie sind Adaptor-Proteine, welche gezeigtermaßen mit EGFR assoziieren und eine Stromabwärts-Signalleitung vermitteln, welche zu JNK-Aktivierung führt (Hashimoto et al., J Bio Chem (1999) 274(29): 20139–10143). Die Assoziation von Shc-Proteinen mit EGFR in den deracinierten Proben wurde unter Verwendung von Anti-Shc-Antikörpern untersucht (Santa Cruz Biotechnology Inc.). Die 5 zeigt, dass eine Deracination mit 528-Mab zur Isolierung der 3 Isoformen von Shc führte. Interessanterweise wurden die Isoformen P46 und P66 von Shc bei ähnlichen Spiegeln in den Deracinationsprodukten und Gesamtzelllysat detektiert. Allerdings war das P52-Produkt weniger häufig in den Deracinationsprodukten von unstimulierten Zellen, verglichen zu Gesamtzelllysat, und noch weniger häufig in den stimulierten Zellen, verglichen zu unstimulierten Zellen. Diese Beobachtung legt eine differenzielle Bindung von Shc-Proteinen an den EGFR-Rezeptor im Anschluss an EGF-Stimulation nahe.
Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass die Deracination unter Verwendung eines Rezeptor-spezifischen Mab oder eines Lektins (WGA) zur Isolierung des Rezeptors zusammen mit dessen spezifisch interagierenden Proteinen führt. Die Ligandenspezifische Deracination von EGFR unter Verwendung des 528-Mab führt zur spezifischen Isolierung des EGFR-Rezeptors in seiner nativen Konfiguration, ohne Verwendung von Detergenzien, sowie zu seinen wechselwirkenden Adaptorproteinen.
Beispiel 3
Deracination von PSCA unter Verwendung von Anti-PSCA-Antikörpern und WGA-Lektin
Prostata-Stammzell-Antigen (PSCA) (Reiter et al., PNAS (1998) 95: 1735–1740; Wu et al., Oncogene (2000) 19: 1288–1296) ist immunreaktiv mit 1G8-Mab (Reiter et al., PNAS (1998) 95: 1735–1740). Der 1G8-Mab bindet an den PSCA-Rezeptor mit einer Affinität von ungefähr 1 × 10^–9 M, wohingegen WGA spezifisch an N-Acetylglucosamin-Einheiten von PSCA, sowie derartige Einheiten auf anderen Zelloberflächenmolekülen, wie EGFR, bindet. Die Experimente wurden unter Verwendung der Prostata-Tumorzelllinie PC3 durchgeführt, welche den PSCA-Rezeptor nicht exprimiert, oder mit PC3, stabil transfiziert mit der cDNA, welche PSCA codiert (PC3-PSCA) (Wu et al., Oncogene (2000) 19: 1288–1296).
Die 6 zeigt eine Flusszytometrie von unbehandelten PC3- und PC3-PSCA-Zellen und diesen Zellen, welche mit Antikörper oder Lektin behandelt worden sind. Es wird gezeigt, dass PSCA auf der Oberfläche von PC3-PSCA-Zellen exprimiert wird (6E), aber nicht auf PC3-Zellen (6B), durch Färbung mit 1G8-Mab. Die Bindung von WGA an lösliches PSCA wurde mittels ELISA (Daten nicht gezeigt) verdeutlicht, und die Bindung an sowohl PC3- als auch PC3-PSCA-Zellen wurde durch Flusszytometrie demonstriert (6C und 6F).
Eine Deracination wurde an PC3-, PC3-PSCA- oder den PSCA-negativen A431-Kontrollzellen entweder unter Verwendung von 1G8-Mab- oder WGA-beschichteten Kügelchen durchgeführt, wie beschrieben in Beispiel 1. Die Deracinationsprodukte wurden auf einem SDS-PAGE-Gel laufen gelassen, und die Membranen wurden mit Maus-Anti-PSCA-Antikörper 3C5 (IgG2aκ; Wu et al., Oncogene (2000) 19: 1288–1296), gefolgt von HRP-konjugiertem Anti-Maus-IgG2a-Antikörper, gefärbt und dann unter Verwendung des ECL-Chemolumineszenz-Kits entwickelt. Wie gezeigt in der 7A, wurde das hoch-glycosylierte PSCA-Protein, ähnlich zu demjenigen, das in PC3-PSCA-Lysaten detektiert wurde, lediglich in den Produkten nachgewiesen, welche von PC3-PSCA sowohl durch 1G8-MAb als auch WGA deraciniert wurden, aber nicht von der Elternzelllinie PC3 oder den A431-Zellen.
Die Entwicklung des Blots mit Kaninchen-Anti-EGFR-Antikörper zeigte, dass eine Deracination von EGFR lediglich unter Verwendung von WGA-Lektin-, aber nicht mittels Anti-PSCA-beschichteten Kügelchen nebenbei erhalten wurde (7B). Der höhere Spiegel an EGFR-Protein, welcher aus A431-Zellen im Vergleich zu PC3- und PC3-PSCA-Zellen deraciniert wurde, steht in Übereinstimmung mit den höheren Zelloberflä chenspiegeln von EGFR auf A431-Zellen im Vergleich zu PC3-Zellen. Die Deracination von PSCA, aber nicht EGFR, unter Verwendung des 1G8-Anti-PSCA-Mab demonstriert die Spezifität der Deracination unter Verwendung der Mab-beschichteten Kügelchen und das Fehlen von nicht-spezifischer Kontamination durch zusätzliche Membranproteine, welche nicht mit PSCA assoziiert sind.
Die Ergebnisse einer an PC3- und PC3-PSCA-Zellen durchgeführten Deracination unter Verwendung von WGA-beschichteten Kügelchen sind in den 8A und 8B gezeigt. Western-Blots der Deracinationsprodukte wurden gefärbt, entweder mit Maus-Anti-PSCA-3C5-Mab (8A) oder Kaninchen-Anti-Grb2-Antikörper (8B). PSCA wurde in den Deracinationsprodukten von PC3-PSCA aber nicht PC3 detektiert. Die Entwicklung des Blots mit Anti-Grb2-Antikörper detektierte das cytoplasmatische Protein Grb2 in den Lysaten sowohl von PC3- als auch PC3-PSCA-Zellen, aber nicht in den Produkten, welche von WGA-beschichteten Kügelchen deraciniert worden waren. Dies weist darauf hin, dass, anders als bei EGFR, Grb2 nicht mit PSCA assoziiert ist, einem GPI-verankerten Protein (Reiter et al., PNAS (1998) 95: 1735–40).

Claims

Verfahren zur Isolierung und Charakterisierung eines membrangebundenen Rezeptors zusammen mit dessen Mikroumgebung, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Vorsehen eines Trägermaterials, das an einen Liganden gekoppelt ist, welcher den Rezeptor spezifisch bindet, wobei der Ligand ein von Lektin verschiedenes endogenes Bindemittel ist; (b) Behandeln des Trägermaterials mit einer Probe, umfassend die membrangebundene Rezeptoren umfassenden nukleierten Zellen oder Organellen davon, und wobei Zellen oder Organellen nicht oberflächenbehandelt wurden, wobei ein Komplex zwischen dem membrangebundenen Rezeptor und dem Liganden gebildet wird, wodurch ein den Rezeptor und dessen Mikroumgebung umfassender Ligand/Rezeptor-Komplex erzeugt wird, wobei der Komplex durch den Liganden an ein Trägermateral gekoppelt wird; (c) Trennen des Trägermaterials von dem Rest der Probe; (d) Unterwerfen des abgetrennten Trägermaterals einer Kraft, die zur Dissoziierung des Rezeptors und von dessen Mikroumgebung von der Membran ausreicht, dagegen zum Aufbrechen des Ligand/Rezeptor-Komplexes nicht ausreichend ist; wodurch ein an einen Ligand/Rezeptor gekoppeltes Trägermaterial erhalten wird, wobei der Rezeptor seine Mikroumgebung beibehält, aber von der Membran getrennt wird; (e) Erhalten des isolierten Ligand/Rezeptor-Komplexes durch Entfernen des den Rezeptor und dessen Mikroumgebung umfassenden Ligand/Rezeptor-Komplexes von dem Trägermaterial; und gegebenenfalls (f) Analysieren der Mikroumgebung des Rezeptors.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt (f) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei in Schritt (d) die Zellen inakt bleiben.
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zellen Wirbeltierzellen sind.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Zellen Tumorzellen oder erkrankte Zellen sind.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Zellen hämatopoetische Zellen oder Zellen von Adiposegewebe, areolarem Gewebe, Bindegewebe, elastischem Gewebe, Epithel-, Endothel-, Neural-, Schleim- oder Rektikulargewebe sind.
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Ligand ein Antikörper oder ein immunospezifischer Bereich davon ist.
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Rezeptor ein HLA-Antigen oder ein tumor-assoziiertes Antigen umfasst oder wobei der Rezeptor ein Zytokin-Rezeptor, ein Hormon-Rezeptor, ein Opioid-Rezeptor oder ein Steroid-Rezeptor ist.
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Kraft durch Extrusion, Verwirbelung oder Schütteln oder durch Beschallung ausgeübt wird.
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Trägermaterial Kügelchen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Kügelchen Polyacrylamid-Kügelchen, Polystyrol-Kügelchen, Sephadex-Kügelchen oder Latex-Kügelchen sind.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Trägermaterial eine Mehrfachvertiefungsplatte ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Ligand an das Trägermaterial durch einen Linker, der einen photoabspaltbaren Bereich enthält, gekoppelt ist und das Entfernen durch Exposition des Linkers an Licht bewirkt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Ligand an Trägermaterial durch einen Linker, der einen durch ein Enzym abspaltbaren Bereich enthält, gekoppelt ist und wobei das Entfernen durch Exposition des Linkers an das Enzym bewirkt wird.
Verfahren zur Gewinnung einer Vielzahl an Rezeptoren zusammen mit deren Mikroumgebungen, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Vorsehen einer Vielzahl an Trägermaterialbereichen, die jeweils an einen unterschiedlichen Liganden gekoppelt sind, wobei der Ligand ein von Lektin verschiedenes endogenes Bindemittel ist; (b) Behandeln einer nukleierte Zellen umfassenden Probe, welche mindestens zwei Zellenoberflächenrezeptoren umfassen, wobei die Zellen nicht mit der Vielzahl an Trägermaterialbereichen unter Bedingungen oberflächenbehandelt werden, unter welchen Ligand/Rezeptor-Komplexe zwischen den Liganden und Rezeptoren an den Zelloberflächen gebildet werden; (c) Entfernen der Trägermaterialbereiche von der Probe; (d) Unterwerfen der Trägermaterialbereiche an Kräfte, die zur Entfernung der Rezeptoren und von deren Mikroumgebungen von der Oberfläche der Zellen ausreichen, dagegen nicht zum Aufbrechen der Ligand/Rezeptor-Komplexe ausreichend sind; (e) Erhalten der isolierten Ligand/Rezeptor-Komplexe durch Entfernen der die Rezeptoren und deren Mikroumgebungen umfassenden Ligand/Rezeptor-Komplexe von dem Trägermaterial; und (f) Analysieren der betreffenden Mikroumgebungen von mindestens zwei Rezeptoren.
Verfahren nach Anspruch 15, welches weiterhin das Identifizieren der Rezeptoren einschließt.
Verfahren nach Anspruch 16, umfassend das Identifizieren von Komponenten in der Mikroumgebung.
Verfahren nach Anspruch 16, welches weiterhin das Zusammenstellen der identifizierten Rezeptoren zu einer Profilcharakteristik der Membranprobe einschließt.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 15 bis 18, wobei jeder aus der Vielzahl an Bereichen an einen anderen Liganden gekoppelt wird.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Liganden monoklonale Antikörper sind.