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Atherosklerose
ist eine bedeutende Todesursache in allen westlichen Gesellschaften.
Hohe Cholesterinspiegel im Blutserum gehen mit einem erhöhten cardiovaskulären Risikofaktor
einher (Marmot, M., 1988, Atherosclerosis Reviews, 18: 95-108; WHO
Monica Project, 1988, World Health Statistics Quarterly, 41: 115-138).
Jedoch scheinen oxidierte Sterole (Cholesterol ist ein Sterol) und
nicht Cholesterol per se die wahren Stoffe zu sein, die atherosklerotische
Läsionen
induzieren. Niedrige Spiegel von Antioxidantien, insbesondere Vitamin
E und B-Carotin werden ebenso mit einem erhöhten Risiko von Herz-Kreislauf-Erkrankungen in Zusammenhang
gebracht (Diplock, A.T., 1994, Mol. Asp. Med., 115: 295-376). Diese
Tatsachen legen eine Rolle der Oxidation von Lipiden bei der Krankheitsentwicklung
der Atherosklerose nahe.
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Zirkulierendes
Cholesterol ist hauptsächlich in
Apoprotein B – basiertem
Low Density Lipoprotein (LDL) enthalten – ein sphärisches Partikel, enthaltend
ungefähr
1500 Cholesterolestermoleküle,
die von einer Lage von 800 Phosphorlipidmolekülen, 500 Cholesterolmolekülen und
zumindest einem 550 kDa Molekül
des Apoproteins B100 (Apo B) (1) umgeben
sind. Erhöhte
Blutspiegel von LDL korrelieren stark mit beschleunigter Atherosklerose.
Atherosklerose ist gekennzeichnet durch Verdickung und Degeneration
der arteriellen Intima, wobei die Pathogenese in zwei definierter
Stadien gegliedert ist – ein
erstes Stadium, in dem Schaumzellen enthaltende Fettfasern in der
Intima gebildet werden und ein zweites Stadium, in dem fibröse Plaques
in der Arterie gebildet werden.
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Schaumzellen
werden von Makrophagen gebildet, wenn oxidiertes LDL von Makrophagen über einen
Scavenger-Rezeptor
durch Endozytose aufgenommen wird. Dies lässt die Zelle irrtümlicherweise glauben,
dass sie zu wenig Cholesterol aufgenommen hat, was zur Folge hat,
dass das Cholesterol in die Zelle über die Hochaffinitäts-LDL-Rezeptoren
(die vornehmlich den Apo-B-Teil von LDL erkennen) auf unkontrollierte
Weise eintritt (Steinberg, D. et al., 1989, N. Eng. J. Med., 320
(14): 915-924; Goldstein, J.L. et al., 1979, Prox. Natl. Acad. Sci.
USA, 76 (1): 333-337) anstelle des gewöhnlicherweise präzise kontrollierten
Aufnahmewegs. Diese Sättigung
des Makrophagen mit Cholesterol führt zu einer morphologisch
bedingten Veränderung
in eine Schaumzelle.
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Die
Oxidation von LDL führt
zu einer kovalenten Bindung des Oxidationsprodukts der Fettsäuren von
LDL an Aminosäurereste
der LDL-Proteine, inklusive Tryptophan, Arginin, Histidin und Lysin,
was auch zur Neutralisation der positiven Ladungen auf den Aminosäuren führt (Esterbauer,
H. et al., 1987, J. Lipid, Res., 28: 495-509; Chen. Q. et al., 1992,
Biochem. J., 288: 249-254). Spezielle Modifikationsprodukte der
Fettsäuren
beinhalten Malondialdehyd (MDA) (gebildet durch die Degradierung
von Lipidperoxiden) und 4-Hydroxynonenal. Eine Modifikation von
LDL kann auf ähnliche
Art und Weise durch Glykierung von Apo B (z.B. bei schlecht kontrollierter
Diabetes) oder durch direkte Oxidationsvorgänge erhalten werden. Tryptophan
kann auch modifiziert werden, um N-Formylkynurenin und Bityrosin
zu erhalten.
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Die
vorliegenden Erfinder haben nun Peptidfragmente des Apoproteins
B 100-Teils von LDL identifiziert, die oxidiert sind und Epitope
ausbilden, die verhindern, dass oxidiertes LDL von einem Scavenger-Rezeptor aufgenommen
wird, wodurch die Aufnahme von LDL durch den Hochaffinitäts-LDL-Rezeptor
verhindert wird.
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Erfindungsgemäß wird ein
Molekül
bereitgestellt, das aus der Sequenz ALQYLKEGTTR (SEQ ID NO: 1) besteht,
wobei Lysin 5 mit MDA konjugiert ist, und das die Aufnahme von LDL
oder einer partiell abgeänderten
Form davon durch den hochaffinen LDL-Rezeptor inhibiert. Die Sequenz
besteht aus den Resten 3349 bis 3359 des Apoproteins B 100 (volle
Apoprotein-B-Sequenz – Knolt,
T.J. et al., 1986, Nature, 734-738), wobei Lysin 5 dem Rest 3353
entspricht.
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Erfindungsgemäß wird ebenso
ein Molekül bereitgestellt,
das aus der Sequenz RLTRKRGLKLA (SEQ ID NO: 2) besteht, wobei Lysin
5 mit MDA konjugiert ist, und das die Aufnahme von LDL oder einer partiell
modifizierten Form davon durch den hochaffinen LDL-Rezeptor inhibiert.
Die Sequenz besteht aus den Resten 3359 bis 3369 des Apoproteins
B 100, wobei Lysin 5 dem Rest 3363 entspricht.
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Ebenso
wird erfindungsgemäß ein Molekül bereitgestellt,
das aus der Sequenz von ALSLSNKFVEG (SEQ ID NO: 3) besteht, wobei
Lysin 7 mit MDA konjugiert ist, und das die Aufnahme von LDL oder
einer partiell modifizierten Form davon durch den hochaffinen LDL-Rezeptor inhibiert.
Die Sequenz besteht aus den Resten 3371 bis 3381 des Apoproteins
B 100, wobei Lysin 7 dem Rest 3377 entspricht.
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Modifizierungen
von LDL können
z.B. die Konjugation mit MDA, die Glykierung oder die Konjugation
mit Hydroxyalkenalen, wie z.B. 4-Hydroxynonenal, sein.
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Erfindungsgemäße Moleküle können als
Immunogene, z.B. zur Produktion von Antikörpern (oder Antigen-Binde-Fragmenten davon)
gegen sie (Harlow, E. und Lane, D., „Antibodies – A Laboratory
Manual", Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, New York, 1988) verwendet
werden. Die Bezeichnung „Antikörper" beschreibt jede
Spezies, die Antigene binden kann, z.B. ein Antigen-bindendes Antikörperfragment.
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Die
erfindungsgemäßen Moleküle können bei
einem Verfahren zur Behandlung oder Diagnose des menschlichen oder
tierischen Körpers
verwendet werden. Insbesondere können
sie zur Behandlung und Diagnose von Atherosklerose verwendet werden.
Die Behandlung schließt
natürlich
sowohl die prophylaktische als auch die therapeutische Behandlung
ein.
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Erfindungsgemäß wird ebenso
die Verwendung eines erfindungsgemäßen Moleküls zur Herstellung eines Arz neimittels
zur Inhibierung der Aufnahme von LDL oder einer partiell modifizierten
Form davon durch den hochaffinen LDL-Rezeptor bereitgestellt. Ebenso
wird eine Methode zur Herstellung dieses Medikaments bereitgestellt,
umfassend die Verwendung eines erfindungsgemäßen Moleküls.
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Methoden
zur Herstellung sind wohlbekannt. Zum Beispiel kann ein erfindungsgemäßes Molekül mit einem
pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel
oder sonstigem Bestandteil versehen werden (Remington's Pharmaceutical
Sciences and Pharmacopeia, 1984, Mack Publishing Company, Easton,
PA, USA), um ein fertiges Präparat
zur beispielsweise intravenösen
Injektion zu erhalten. Ebenso kann die zu verabreichende Dosis auf einfache
Art und Weise durch Standard-in-vitro/in-vivo-Dosis-Resonanz-Experimente
ermittelt werden. Kultursysteme für Makrophagen sind wohl bekannt und
können
leicht in solchen Experimenten verwendet werden.
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Erfindungsgemäß wird ebenso
die Verwendung eines Antikörpers,
der spezifisch an Moleküle der
vorliegenden Erfindung bindet, zur Herstellung eines Medikaments
zum Inhibieren der Aufnahme von LDL oder einer partiell modifizierten
Form davon durch den hochaffinen LDL-Rezeptor, bereitgestellt. Ebenso
wird eine Methode zur Herstellung desselben Medikaments bereitgestellt,
umfassend die Verwendung des Antikörpers, der spezifisch an die
erfindungsgemäßen Moleküle bindet.
Eine spezielle Verwendung des Antikörpers liegt in der Behandlung oder
Diagnose von Atherosklerose, wobei die Behandlung sowohl die prophylaktische
als auch die therapeutische Behandlung umfasst.
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Erfindungsgemäß wird ebenso
die Verwendung eines er findungsgemäßen Moleküls in einem diagnostischen
Testverfahren auf einen Antikörper, der
spezifisch gegen oxidiertes LDL ist, bereitgestellt, das die Aufnahme
von LDL oder einer partiell modifizierten Form davon durch den hochaffinen
LDL-Rezeptor, bewirken wird.
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Erfindungsgemäß wird ebenso
ein diagnostisches Testverfahren auf einen Antikörper, der spezifisch gegen
oxidiertes LDL ist, bereitgestellt, das die Aufnahme von LDL oder
einer partiell modifizierten Form davon durch den hochaffinen LDL-Rezeptor, bewirken
wird, das die folgenden Schritte umfasst:
- i)
Reaktion eines erfindungsgemäßen Moleküls mit einer
Probe;
- ii) Nachweisen einer Antikörper-Antigen-Bindungsreaktion;
und
- iii) Korrelieren des Nachweises der Antikörper-Antigen-Bindungsreaktion mit der Anwesenheit
eines Antikörpers,
der spezifisch gegen oxidiertes LDL ist und die Aufnahme von LDL
oder einer teilweise modifizierten Form durch den hochaffinen LDL-Rezeptor
bewirken wird.
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Ebenso
ist hiermit ein diagnostisches Testverfahren auf modifiziertes oder
konjugiertes LDL oder Peptide davon, die nicht vom hochaffinen LDL-Rezeptor
aufgenommen werden, offenbart, wobei die folgenden Schritte umfasst
sind:
- i) Reaktion eines Antikörpers oder
eines Antigen-Binde-Fragments,
das spezifisch auf einem erfindungsgemäßen Molekül ist, mit einer Probe;
- ii) Detektion der Antikörper-Antigen-Bindereaktion;
und
- iii) Korrelieren des Nachweises der Antikörper-Antigen-Bindereaktion mit der Anwesenheit
von oxidiertem oder konjugiertem LDL oder Peptide desselben, die
nicht von dem hochaffinen LDL-Rezeptor
aufgenommen werden.
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Die
Probe kann eine Plasmaprobe eines Patienten sein.
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Das
Plasma kann Antigene enthalten, die verschiedene Typen der Oxidation
und Konjugation repräsentieren.
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Erfindungsgemäße Moleküle sowie
Antikörper,
die spezifisch an diese Moleküle
binden, können zur
quantitativen Standardisierung der Ergebnisse, die aus solchen diagnostischen
Tests erhalten werden, oder als Reagenzien in diesen Tests verwendet werden.
Sie können
therapeutische Nützlichkeit
als Antagonisten aufweisen und die Schaumzellen-Bildung verhindern.
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Die
diagnostischen Testmethoden beinhalten ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay), z.B. Antigen Capture ELISA oder Competitive ELISA, Immunoturbidimetrie
oder Dip-Stick Assays (WO 88/08534).
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Um
auf spezifische Bedingungen und Ursachen der Oxidation von LDL hin
zu untersuchen (z.B. Oxidation verursacht durch Hyperglykämie, Hypercholesterolaemie,
systemische Lupuserythematose (SLE) oder angeborenen Bedingungen),
können
erfindungsgemäße Moleküle, die
z.B. durch Glykierung oder Konjugierung mit MDA modifiziert wurden,
wie auch als auf diese Moleküle
spezifische Antikörper auf
geeignete Art und Weise verwendet werden.
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Erfindungsgemäß wird ebenso
ein diagnostisches Testkit zur Durchführung eines erfindungsgemäßen dia gnostischen
Testverfahrens bereitgestellt. Solch ein Kit kann Anweisungen zu
dessen Verwendung (z.B. zur Durchführung eines geeigneten Diagnoseverfahrens
gemäß vorliegender
Erfindung) beinhalten.
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Die
Erfindung wird anhand der folgenden Beschreibung näher erläutert, wobei
auf die verschiedenen Figuren der begleitenden Bezeichnungen Bezug genommen
wird, die beispielhaft die Methoden zur Detektion von oxidierten
oder konjugierten LDL und von Peptiden desselben aufzeigen. In den
Figuren zeigen
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1 eine
schematische Repräsentation
eines LDL-Partikels
und eines Apo-B-Epitops. Der Ort des Apo-B-Fragments, der für die LDL-Anbindung an den
hochaffinen LDL-Rezeptor verantwortlich ist, ist als Aminosäurereste
3441 bis 3569, die durch den monoklonalen Antikörper Mb47 (Knolt, T.J. et al., supra)
definiert sind, dargestellt. Mb47 blockiert die Anbindung von LDL
an den hochaffinen LDL-Rezeptor. T2T3 weist auf die Abgrenzung von thrombolytischen
Peptiden hin;
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2 den
allgemeinen Mechanismus der Modifikation von LDL durch Glykierung
und Konjugierung mit MDA. Erhöhte
Aktivität
freier Radikale, die durch nicht-enzymische
Glykosylierung, dem Polyol-Weg, verursacht wird, verringerte Antioxidanz-Reserven
und aktivierte Neutrophile usw., bedingen, dass Lipidperoxide, Lipidperoxidradikale,
Lipidalkoxylradikale und Aldehyde natives LDL in oxidiertes LDL überführen, was
zu endothelialem Schaden und Schädigung
der glatten Muskelzellen führt.
Glykiertes LDL führt
zu erhöhter
Aggregation von Blutplättchen,
erhöhter
kovalenter Bindung an vaskuläre
Matrixproteine und endothelialem Schaden;
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3 die
Konjugation von MDA mit Lysin; und
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4 ein Vergleich des Peptids ALQYKLEGTTR
(SEQ ID NO: 1) vor (a) und nach (b) Konjugation mit MDA. Die x-Achse
zeigt das Verhältnis von
Masse zu Ladung; die y-Achse zeigt die relative Häufigkeit.
Die bezeichneten Peaks liegen bei (4a) 1355,09
und 1425,43 und (4b) bei 1483,16, 1504,31 und
1609,16 auf der x-Achse.
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Die
Peptidsequenz ALQYKLEGTTR (SEQ ID NO: 1) wurde durch Standardmethoden
synthetisiert und mit MDA konjugiert. 4 zeigt
das Resultat eines Massenspektrums des Peptids vor und nach der
Konjugation. Die Molekulargewichte der Produkte sind mit dem Peak
1 (4b), das ein mit einem einzelnen Molekül MDA konjugiertes
Produkt ist und Peak 2 (4b), das
ein mit einer dimetrischen Form von MDA konjugiertes Produkt ist,
konsistent.
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Antigen Capture ELISA
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Ein
gegen ein Antigen spezifischer Antikörper wird auf eine ELISA-Platte
aufgetragen und zur Erfassung von Antigenen aus dem Patientenplasma verwendet – entweder
wird das Gesamtplasma oder LDL-Fraktionen verwendet. Die Anbindung
wird dann über
einen zweiten Antikörper,
der spezifisch gegen das Antigen ist, gefolgt von einem Enzym-konjugierten
Anti-Immunoglobulin zur kolorimetrischen Detektion detektiert.
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Kompetitiver ELISA
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Eine
ELISA-Platte wird entweder mit einem MDA-konjugierten ALQYKLEGTTR (SEQ ID NO:
1) Peptid oder mit oxidiertem oder konjugiertem LDL oder Peptide
desselben, die nicht von dem hochaffinen LDL-Rezeptor aufgenommen
werden, beschichtet. Verschiedene Verdün nungen des Patientenserums
(z.B. können
das Gesamtplasma oder LDL-Fraktionen zugegeben werden) werden zusammen
mit dem Antikörper
in feststehender Verdünnung
zugegeben. Die Anbindung des Antikörpers an das aufgetragene Antigen
wird über
ein Enzym-konjugiertes Anti-Immunoglobulin detektiert, wobei das Ausmaß der Anbindung
reduziert wird, während
die Konzentration des Antigens im Plasma ansteigt. Die Ergebnisse
werden durch Anfertigung einer Standardkurve unter Verwendung von
MDA-konjugiertem ALQYKLEGTTR (SEQ ID NO: 1) Peptiden standardisiert.
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Immunoturbidimetrie
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Latexkügelchen
werden mit einem Antikörper,
der spezifisch auf MDA-konjugierte ALQYKLEGTTR (SEQ ID NO: 1) Peptide
reagiert, beschichtet und die Kügelchen
mit Patientensera vermischt. Die Aggregation der Kügelchen,
die auf die Vernetzung der Antikörper
in Gegenwart des spezifischen Antigens zurückzuführen ist, wird in Autoanalysatoren
unter Verwendung von Immunoturbidimetriedetektionssystemen bestimmt.
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Die
oben beschriebenen Prozeduren werden in der Diagnose verwendet,
z.B. bei ELISA, Immunoturbidimetrie oder Prüfstäbchen und Testkits.