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Auf den biologisch aktiven Bereich des ACTH-Moleküls gerichteter.
Antikörper für einen Radioimmunoassay und Verfahren zu seiner Herstellung Unter
der Bezeichnung "Hormone" werden organische Regulationssubstanzen zusammengefaßt,
deren Bildungsstätten bestimmte Organe, sowie Zellen und Gewebe sein können. Die
hormonbildenden Organe werden unter dem Begriff endokrines System zusammengefaßt.
Die gebildeten Hormone werden in glandotrope und direkt effektorisch wirkende Hormone
eingeteilt. Die glandotropen Hormone zeichnen sich durch die Stimulation der Biosynthese
effektorischer Hormone aus. Adrenocorticotropin, Corticotropin oder kurz ACTH genannt,
gehört
zu den glandotropen Hormonen einerseits, indem es die Biosynthese
der Nebennierenrindenhormone der Zona fasciculata stimuliert, andererseits besitzt
es direkt effektorische Wirkungen auf das Fettgewebe.
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Die Hormone der Adenohypophyse unterliegen dem Einfluß des Hypothalamus.
Dieser umgrenzt ein kleines Gebiet des Dienzephalon und wird durch die großen sensorischen
Systeme des Gehirns beeinflußt, wobei auch Thalamus und Großhirnrinde eine Rolle
spielen. Bereits in den Jahren 1937 und 1949 wurden Neurohormone des Hypothalamus
postuliert. Sie werden als Releasing-Hormone bezeichnet und konnten als Oligopeptide
isoliert werden. Sie stimulieren spezifisch Inhibition und Sekretion der adenohypophysären
Hormone.
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Die Regulation der Releasing-Hormone, der glandotropen Hormone und
der peripheren effektorischen Hormone ist durch den feedback Mechanismus gesichert.
Ein "short feedback" regelt zwischen Hypothalamus und Adenohypophyse, über einen
"long feedback" ist ein weiterer Rückkopplungsmechanismus, ermöglicht durch die
Konzentration der effektorischen Hormone, eingeschaltet.
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Durch die Isolierung vonOCACTH aus Schafshypophysen erfolgte die einleitende
Phase zur Aufklärung der Aminosäuresequenz von Adrenocorticotropin. Beweis eines
basischen Molekülcharakters brachten elektrophoretische Untersuchungen. Auch die
Struktur von ß - Schweine - Corticotropin konnte geklärt werden. Ebenso gelang die
Synthese von Human-ACTH und eine Korrektur des Moleküls in den Positionen 25,26,27
und 30.
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Alle diese Gegebenheiten ließen das Adrenocorticotropin in einen N-terminalen
biologisch aktiven Teil mit den Positionen 1 - 24 und einen speziesabhängigen immunologischen
C-terminalen Teil mit den Sequenzen 25 - 39 koordinieren. Nur das Segment 25 - 33
ist speziesvariabel.
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Nachstehende Abbildung zeigt die Adrenocorticotropinen Horrnone vom
Schwein, Hammel, Rind und Mensch.
| NH2 |
| Alc Gly Glu Ala Glu Asp Ser Ala Glu ACTH vom Hammel |
| 25 26 27 28 29 30 31 32 33 |
| NH2 |
| Asp Gly Glu Ala Glu Asp Ser Ala Glu ACTH vom Rind |
| 25 26 27 28 29 30 31 32 33 |
| NH2 |
| Asp Gly Ala Glu Asp Glu Ser Ala Glu ACTH vom Menschen |
| 25 26 27 28 29 30 31 32 33 |
In den frühen fünfziger Jahren wurde der Metabolismus von 131 J - Insulin in Diabetikern
studiert, wobei die einschneidende Entdeckung gemacht wurde, daß alle insulinbehandelten
Diabetiker insulin-bindende Antikörper besaßen. Die Existenz verschiedener Affin
itäts grade von Gammaglobulinen konnte bereits
nachgewiesen werden.
Die damalige Erkenntnis, daß bei konstanter Antikörperkonzentration die Bindung
von markiertem Insulin eine quantitative Funktion der Insulinmenge sei und daß das
markierte Hormon von unmarkiertem verdrängt werden kann, bildete die Grundlage für
den Radioimmunoassay. Quantitative Studien der Kinetik gaben wichtige Anhaltspunkte
für die Energieforderung der Antigen -Antikörper - Reaktion bei Messung von Hormonen
im Radioimmunoassay.
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Der erste Radioimmunoassay für ACTH wurde unter Verwendung der Doppelantikörpertechnik
entwickelt, der noch vervollständigt werden konnte. Die zweite Methode war die,
das Hormon aus dem Plasma vor Ausführung der Assays zu extrahieren: Alle bekannten
Methoden beanspruchen Antikörper von hoher Affinität und weitgehender Spezifität
für den biologisch aktiven Teil des Moleküls.
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Der Radioimmuno-Assay für Protein- und Polypeptidhormone basiert nicht
auf der Isotopenverdünnungstechnik, da diese zumindest identisches markiertes und
unmarkiertes Hormon voraussetzt und dies für den Radioimmunoassay nicht erforderlich
ist. Identität wird nur im immunologischen Verhalten von unmarkiertem Hormon, gebraucht
als Standard, und dem unbekannten Hormon der Probe postuliert. Treffender ist die
Bezeichnung der competetiven Protein-Hemmungs-Reaktion, d.h. unmarkiertes Antigen
konkurriert mit markiertem Antigen um Bindungsstellen am Antikörper und vermindert
damit die Bindung des markierten Antigens.
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Dabei ist: Ag = freies markiertes Antigen Ab = spezifischer Antikörper
Ag = unmarkiertes Antigen in Standardlösung oder unbekannter Probe + Ag - Ab = markierter
Antigen - Antikörper - Komplex Ag - Ab = unmarkierter Antigen - Antikörper - Komplex
Die theoretische Grundlage für diese reversible Reaktion liefert das Massenwirkungsgesetz:
Bei dieser chemischen Reaktion liefern alle Reaktionsteilnehmer ihren Anteil zu
der als Reaktionsarbeit bezeichneten Differenz der freien Enthalpie - G, die über
^ G = - RT ln K mit der Gleichgewiehtskonstanten verbunden ist, eine Funktion von
Temperatur und Druck bzw. Konzentration darstellt und den Reaktionsablauf entscheidet.
Gleichzeitig liefert die freie Enthalpie ein Maß für das chemische Potential und
die Affinität der Reaktion.
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Die Reaktionsarbeitet spaltet in eine Standard- und Restreaktionsarbeit
auf nach # G = - Go + RT # v ln a,
wobei v die stöchiometrischen
Äquivalenzzahlen und a die Aktivität bedeuten. Die Aktivität kennzeichnet das Produkt
aus Molenbruch und Aktivitätskoeffizient, so daß nach obiger Gleichung eine starke
Abhängigkeit der Restreaktionsarbeit, die den Wert von K bestimmt, von Konzentration
und Art sämtlicher Komponenten der Reaktionsmischung besteht.
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Das hervorstechendste Merkmal des Radioimmunoassays für ACTH liefert
die hohe Empfindlichkeit und Spezifität bei Messung des niedrigen Hormonniveaus.
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Die molekularen Konzentrationen des zirkulierenden adrenocorticotropen
Hormons, sie liegen bei 10 13 sind so niedrig, daß sie einer Messung mit den allgemeinen
Bioassays schwer zugänglich sind. Zudem konnten Routineuntersuchungen durch die
komplizierte zeitraubende Handhabung - alle Bioassays benötigen hypophysektomierte
Ratten - und die erforderlichen großen Blutmengen kaum durchgeführt werden.
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Aufgabe der Erfindung ist es daher, Antikörper von hoher Affinität
und spezieller Spezifität für den biologisch aktiven, obgleich äußerst schwachen
immunogenen Teil des ACTH-Moleküls zu erhalten. Dies ist die obligate Voraussetzung
um mit Hilfe eines Radioimmunoassays für ACTH in vivo exakte hormonale Regulationsversuche
betreiben zu können, die somit nicht möglich waren.
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Zur Lösung dieser Aufgabe wird gemäß der Erfindung ein Verfahren zur
Herstellung eines auf den biologisch aktiven Bereich des ACTH Moleküls gerichteten
Antikörper für einen Radioimmunoassay vorgeschlagen, das erfindungsgemäß darin besteht,
daß man ACTH in Gelatinelösung löst, hierauf die Lösung im Verhältnis 1:1 mit Freund'
s completen Adjuvants durch Schütteln in einer ersten Phase
und
durch wiederholtes Aufziehen und Ausspritzen mittels einer Spritze und Kanüle in
einer zweiten Phase emulgiert, hierauf das Emulgat iJI Meerschweinchen injiziert,
diesen Blut abnimmt, dieses zum Gerinnen in Zentrifugengläser beläßt, den erhaltenen
Blutkuchen in einer Kühlzentrifuge zentrifugiert, das das Antigen enthaltende Serum
abpipettiert und bei -20°C einfriert.
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Des weiteren betrifft die Erfindung einen auf den biologisch aktiven
Bereich des ACTH - Moleküls gerichteten Antikörper für einen Radioiij unoassay,
wobei dieser Antikörper dadurch erhältlich ist, daß man ACTH in Gelatinelösung löst,
hierauf die Lösung im Verhältnis 1:1 mit Freund s completen Adjuvants durch Schütteln
in einer ersten Phase und durch wiederholtes Aufziehen und Ausspritzen mittels einer
Spritze und-Kanüle in einer zweiten Phase emulgiert, hierauf das Emulgat in Meerschweinchen
injiziert, diesen Blut abnimmt, dieses zum Gerinnen in Zentrifugengläsern beläßt,
den erhaltenen Blutkuchen in einer Kühlzentrifuge zentrifugiert, das das Antigen
enthaltende Serum abpipettiert und bei -20OC einfriert. Darüberhinaus umfaßt die
Erfindung die Verbindung eines durch Lösung von ACTH in einer Gelatinelösung, durch
anschließendes Emulgieren dieser Lösung im Verhältnis 1:1 mit Freund' s completen
Adjuvants durch Schütteln in einer ersten Phase und durch wiederholtes Aufziehen
und Ausspritzen mittels einer Spritze und Kanüle in einer zweiten Phase, durch Injizierung
des Emulgats in Meerschweinchen, durch Abnahme von Blut, Gerinnung des Blutes in
einem Zentrifugenglas, durch zentrifugieren des Blutkuchens in einer Kühlzentrifuge
und durch anschließendes Abpipettieren und Einfrieren des Serums bei -200C erhaltenen
auf den biologisch aktiven Bereich des ACTH-Moleküls gerichteten Antikörpers für
einen Radioimmunoassay.
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Das erfindungsgemäße Verfahren wird anhand der nachstehenden Beispiele
erläutert: Beispiel 1 Bereitung des Antigens: 80 I.E. ACTH, durch kurzes Schütteln
auf dem Whirlmix in in physiologischer Kochsalzlösung gelöste ein ml Gelatinelösung,
enthaltend 260 mg Gelatine /ml, gelöst, wurden in dem Verhältnis 1:1 mit 1 ml Freund's
completem Adjuvants emulgiert. Dies gelang in der Weise, daß in der ersten Phase
etwa zwei Minuten geschüttelt, in der zweiten Phase mit Hilfe einer 2 ml sterilen
Spritze und 0, 80 x 38 mm Kanüle durch wiederholtes Aufziehen und Ausspritzen so
lange emulgiert wurde, bis das Emulgat eine steife Konsistenz annahm.
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Mit dieser Methode konnte das schwach immunogene ACTH mit Hilfe nichtkovalenter
Bindungskräfte an die sonst nicht immunogene Gelatine gebunden werden. Als solche
wären Ionenbindungen zwischen Carboxylgruppen und protonierten Aminogruppen zu nennen,
zumal das ACTH keine definierte Sekundärstruktur besitzt und reichlich basische
(Lysin, Arginin) und einige saure (Glutaminsäure, Asparaginsäure) Aminosäurerest
vorhanden sind, die einen gleichartigen Bindungspartner in dem Gelatine-Molekül
finden können. Aber auch an apolare Bindungen und Wasserstoffbrückenbindungen wäre
zu denken.
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Beispiel 2 Immunisierungstechnik: 24 Meerschweinchen unterschiedlicher
Abstammung standen zur Verfügung. Eine wichtige Voraussetzung dabei war, daß der
Bedarf an Vitamin C, einem essentiellen Vitamin für Meerschweinchen,
mit
der Nahrung gedeckt, bzw. zugeführt werden konnte. Mit einer modifizierten Einwegspritze
mußte ihnen deshalb etwa 10 mg Vitamin C, gelöst in Leitungswasser, bei Vitamin
C armen Futterverhältnissen täglich eingeflößt werden.
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Die Immunisierungsdosis von 25 I.E. ACTH pro Tier (= 0, 65 ml Antigen
- Emulgat) war intracutan bis subcutan, verteilt zu kleinsten Portionen auf 5 -
8 Injektionsstellen, in die nicht gespannten Hautfalten der Vorder- und Hinterextremitätenansätze
injiziert worden (sterile Einwegspritzen 0, 55 x 25 mm Kanülen), Eine intramuskuläre
Injektion von 0, 7 - 0, 75 ml Metopiron (= 70 - 75 mg Metopiron - Ditartrat) in
den Oberschenkel der Hinterextremitäten zur Ausschaltung der 11 ß - Hydroxylase,
schloß sich an.
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Immunisierungsplan
| 1. 2. 3. 3. 4. 6. 7. e. |
| Tier- |
| gruppe Imm. Imm. Imm. Imm. Imm. Imm. Imm. Imm. |
| I 30.10. 26.11. 27.12. 22.1. 24.2. 23.3. 16.4. 15.6. |
| 72 72 72 73 73 73 73 73 |
| Nr. 392 |
Beispiel 3 Gewinnung des Antigen enthaltenden Antiserums: Blutprobeentnahme
sowie das Ausbluten geschah durch Herzpunktion unter Äthernarkose. Nach ausreichender
Narkotisierung, das Tier war in leichter Seitenlage fixiert, folgte die Punktion
durch Einstich unter dem Sternum, in einem spitzen Winkel von kaudal her, mit einer
0, 90 x 38 mm Kanüle und steriler Einwegspritze. Das Blut, in silikonisierten Zentrifu
gen gläsern aufgefangen, zum Gerinnen zwei Stunden bei Raumtemperatur belassen,
kam nach Loslösung des Blutkuchens von der Gefäßwand zur vollständigen Retraktion
in den Kühlraum.
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In einer Kühlzentrifuge inußte bei 1000 x g und 4°C zentrifugiert,
das Serum mit Pasteurpipetten abpipettiert, jeweils 0,5 bis 1 ml in vorbereitete
Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt und sofort bei -20°C eingefroren werden.
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Zeitplan der Blutentnahme Blutproben: 8 - 10 Tage nach der 3. und
5. Immunisierung Ausbluten: 10 Tage nach der 7. Immunisierung.
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Tier 392 12 Tage nach der 8. Immunisierung.
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Beispiel 4 Auswertung der Antiseren - Titerbestimmung: Die Auswertung
der Antiseren auf Brauchbarkeit im Radioimmunoassay begann mit der Titerbestimmung.
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Der erste Schritt bestand in der Feststellung des Mindesttiter, da
nur Seren, die bei einer Endverdünnung von 1:1000 fähig sind mindestens 40% des
markierten ACTH zu binden, verwertbar sind. Ausgangswert war eine 1:100 Verdünnung
(10 jul Antiserum, 0, 990 ml Veronal-Puffer, 0, 02 M, Ph 8,6 + 0,3 % BSA), unentbehrlich
für jedes Serum, Aufbewahrung bei 4°C im Kühlraum in Reaktionsgefäßen.
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Die Mindesttiterbestimmung bei einer 1:1000 Verdünnung mußte im Eisbad
auf folgende Art vorgenommen werden: Der Reihe nach wurde in P olyäthylenreagenzröhrchen
einpipettiert: 0> 25 ml 1:100 Verdünnung 2, 2 ml VMAT - Puffer 50 pl Tracer (10
pg 125-J-ACTH/50 p1 VMAT-Puffer, (hergestellt in Anlehnung an OLIVER) Es folgte
das Verschließen der Röhrchen mit Parafilm leichtes Schütteln für 20 Sekunden auf
dem Whirlmix und Inkubation bei 40C, einmal für 3 und einmal für 5 Tage, um das
Optimum der Gleichgewichtseinstellung zu finden.
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Die erste Beurteilung über die Quantität der Antiseren vermittelte
bereits die Mindesttiterbestimmung bei einer 1: 1000 Verdünnung.
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In Abbildung 1 sind die Ergebnisse zusammengestellt und bringen eine
Übersicht der unterschiedlichen genetischen Faktoren für jedes Tier. Einzelne Tiere
waren imstande, sofort eine große Anzahl von Antikörpern zu produzieren, während
bei anderen die Quantität erst durch wiederholte Injektionen stimuliert wurde.
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Abbildung 2 und 3 zeigen eine Auswahl von Verdünnungskurven mit teils
ähnlichem Verlauf. Es sind die Verdünnungskurven von Seren nach der 5. und 7. Immunisierung
als Vergleich gegenübergestellt.
Die Steilheit der Kurven kennzeichnet
die Heterogenität der Antiserum, d.h. die Anzahl der in ihrem Energiezustand und
somit Affinitätszustand differierenden Antikörper. Je flacher sie verläuft, um so
größer ist die Heterogenität, je steiler, um so eher die Aussicht, ein geringes
Energiespektrum bzw. Affinitätsspektrum vorzufinden.
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Anhand dieser Kurven konnte der Arbeitstiter ermittelt werden. Er
lag bei der Verdünnung, die einen B/T x 100 Verhältnis von etwa 38 zeigte, wobei
B = durch Antikörper gebundene Radioaktivität und T = t otale Radioaktivität ist.
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An erster Stelle steht dabei die Empfindlichkeit, d. h. die Fähigkeit
des unmarkierten Hormons bei der Konkurrenz um Bindunsstellen das markierte Hormon
zu verdrängen, und drückt sich im Abfall B/T x 100 Verhältnis aus. Da gerade bei
Peptid-Hormonen durch die Jodierung Verschiebungen in den Elektronendichten der
Partialstrukturen einer antigenen Determinante, die den größten Anteil der Gesamtbindungsenergie
liefert, auftreten können, erscheinen somit zwei Affinitäten und in diesem Zusammenhang
auch zwei Gleichgewichtskonstanten. Ist die Affinität zum markierten Hormon durch
die Jodierung erhöht worden, ist eine Messung des unmarkierten Hormons nicht möglich.
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Beispiel 5 Trennung des gebundenen 125-J-ACTH vom freien 125-J-ACTH:
Nach Beendigung der Inkubation muß das an Antikörper gebundene 125-J-ACTH von dem
freien 125-J-ACTH abgetrennt werden.
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Die ermittelten optimalen Trennungsbedingungen verlangten die Durchführung
bei 4°C im Kühlraum. Zu dem Inkubationsvolumen von 2, 5 ml wurden 50 mg Talcum hinzugefügt,
der Inhalt auf dem Whirlmix innerhalb 20 Sekunden mit großer Geschwindigkeit geschüttelt
und bei 2376 x g zentrifugiert.
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Der Überstand enthielt das an Antikörper gebundene 125-J-ACTH, das
freie 125-J-ACTH war am Talcum adsorbiert.
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Auf das Abdekantieren des Überstandes in ein Zählröhrchen folgte das
Zählen der Impulse von beiden Fraktionen. Die Zählzeit betrug 3 x 4 Minuten.
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Beispiel 6 Messung der Empfindlichkeit: Die Empfindlichkeit des Antiserums
wurde durch die Verdrängung des Anfangs-B/T-Verhältnisses bei Hinzufügen von 5 pg
und 50 pg unmarkiertem synth. ß 1 - 39 ACTH besti mmt und ist ein Maß für die Affinität
des Antikörpers zum unmarkierten Hormon.
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Methodisch war dafür die Ausführung von Verdünnungsreihen erforderlich.
Zur Auffüllung auf das Endvolumen von 2, 5 ml wurden jetzt aber nur 445 pl bzw.
400 pl VMAT - Puffer benötigt, da vor Hinzufügen von 50 pl Tracer noch 5 kl (5 pg
Hornion) bzw. 50 ul (50 pg Hormon) unmarkierte ACTH-Verdünnungslösung hinzupipettiert
werden mußten. Als notwendig erwies sich das Variieren der Inkubationszeit: Sie
betrug 6 Tage um das eingestellte Gleichgewicht zu festigen.
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Beispiel 7 Ermittlung der Spezifität der Antikörper: Die Ermittlung
der Spezifität ist eine unumgängliche Prüfung des Antiserums auf seine Brauchbarkeit
im Radioimmunoassay.
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Methodisch wurde dabei das Anfangs-B/T-Verhältnis bestimmt und die
Verdrängung dieses Verhältnisses durch Hinzufügen variabler Quantitäten von ACTH
- Fragmenten bzw. von-ACTH verschiedener Herkunft gemessen. Zur Verfügung standen:
natürliches Schweine-ACTH synth. ß 1 - 39 ACTH vom Schwein synth. ß 1 - 24 ACTH
synth. ß 1 -16 ACTH
Für jedes Hormon mußten Spezifitätskurven im
Doppel für das jeweilige Antiserum aufgestellt werden. Als Basis-Arbeitsplan diente
die hier dargelegte Tabelle Arbeitsplan:
| nmark. VMAT- 125-J-ACTH Antis. |
| ormon Puffer verdg. |
| µg = 1 µl] [µl] [10 pg = 50µl] [ml] |
| 0,1 450 5041 2,0 |
| 5811 445 50µl 2,0 |
| 10µl 440 50>i1 2,0 |
| 20µl 430 50µl 2,0 |
| 30µl 420 50µl 2,0 |
| 50µl 400 50µl 2,0 |
| 100µl 350 50µl 2,0 |
| 200µl 250 50µl 2,0 |
| 450µl 0 50µl 2,0 |
Grundsätzlich vollzog sich die Bereitung der Hormonverdünnung von 1 m µ g/ml VMAT-Puffer
vor Beginn der Test-Ausführung. Die Begründung dafür lag in der Beobachtung von
Denaturierungserscheinungen, die nach dem Auftauen der eingefrorenen Lösungen auftraten,
falls diese 2- Mercaptoäthanol enthielten. Dieser Befund gab auch Veranlassung dazu,
die Tracer-Verdünnung von 10 pg 125-J-ACTH/50 µ 1 VMAT/Puffer erst kurz vor Verwendung
herzustellen.
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Die Reihenfolge der Einpipettierungen in die Polyäthylenröhrchen variierte:
| A. unmark. Hormon B. Antiserum - Verdg. |
| VMAT-Puffer VMAT-Puffer |
| Tracar unmark. Hormon |
| Antiserum-Verdg. Tracer |
Günstiger erschien das Hinzufügen des Tracers als Abschluß der
Pipettierungen, um eine Kontaminierung der andern Pipetten zu vermeiden. Die Arbeitstemperatur
betrug 40C. Zwei Kontrollröhrchen, ohne Antiserum, waren für die Berechnung der
verbleibenden Radioaktivität im Überstand angesetzt worden.
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Die Röhrchen wurden mit Parafilm verschlossen, leicht der Inhalt für
20 Sekunden geschüttelt und für 6 Tage bei 4°C inkubiert.
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Die Trennung der gebundenen 125-J-ACTH-Fraktion von der ungebundenen
Fraktion konnte auf die gleiche Weise, wie zuvor beschrieben, mit 50 mg Talcum erreicht
werden.
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Nachdem die Impuls zahlen der einzelnen Fraktionen gemessen waren
und das ermittelte B/T-Verhältnis vorlag, konnten die Spezifitätsloirven in einem
Koordinatensystem dargestellt werden. Die Ordinate verkörpert die B/T x 100 -Verhältnisse
in steigenden Werten, auf der Abzisse sind die unmarkierten Hormonkonzentrationen
in pg/ml von 0 - 360 pg eingezeichnet.
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Beispiel 8 Auswertung der Markierungsqualität: Ein weiteres Problem
tritt dadurch auf, daß durch die Markierungsqualität tinters chiedliche Bindungsaffinitäten
der Antikörper zum markierten Antigen in Erscheinung treten. In Abbildung 4 sind
diese Faktoren aufgezeichnet, einmal in Verbindung mit der Anfertigung von Verdünnungskurven,
zum anderen bei der Ausführung von Spt zifitäts-Standardkurven.
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Es muß aber auch vermerkt werden, daß diese Tendenz für jedes Serum
eigenen selektiven Charakter besitzt. Da nur zwei Tyrosinreste für die Jodierung
zur Verfügung stehen, liegt die Vermutung nahe, daß durch diesen Effekt die determinante
Gruppe des 125-J-ACTH in der Nähe des markierten Tyrosins zu suchen wäre.
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Abbildung 4: A Antiserum C 356 in VMAT-Puffer Tracer: 4 pg 125-J-ACTH
Verdünnungskurve in Abhängigkeit von der Qualität der Markierung B Antiserum C 356
1:128.000, Endvolumen 2,5 ml VMAT-Puffer mit 100 K.I.E. Trasylol /ml 5 Tage Inkubation
bei 40C Tracer: 5 pg 125-J-ACTH (2.Markierung) Prüfung der Spezifität Beispiel 9
Spezifität der Antikörper: Aus der Einleitung geht bereits die Bedeutung der Spezifität
der Antikörper für bestimmte determinante Gruppen hervor zumal für den Radioimmunoassay
vorrangig eine Spezifität für den biologisch aktiven Teil benötigt wird.
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Mit Hilfe von ACTH-Fragmenten ließ sich die Spezifität der gewonnenen
Antiseren messen. Die nachfolgenden Abbildungen 5 und 6 veranschaulichen Spezifitäts-
und Standardkurven.
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Eindeutig zeigen diese Ergebnisse eine dominierende Spezifität der
Antikörper für den biologisch aktiven Teil des Hormons> d.h. für 1 - 24 ACTH.
Das Hexadecapeptid wurde dagegen nur geringfügig erkannt. Die Affinität für ACTH
ist durch einen ähnlichen Kurvenverlauf wie für 1 - 24 ACTH gekennzeichnet. In Abhängigkeit
von der Markierungsqualität variiert die Bindung bereitschaft zu synth. 1 - 39 ACTII.
Jedes Antiserum zeigt darin eine charakteristische Individual ität. Untersuchungen
zur Spezifität bei linearen Polypeptiden ergaben, daß Aminogruppen
für
die Spezifität von Bedeutung seien. Diese bieten sich in den Sequenzen 15,16,17,18
und 21 reichlich an und könnten auch mit der Größe des Bindungsbereiches am Antikörper
übereinstimmen, der einem Tetra- bis Pentapeptid entsprechen soll.
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Entsprechend dem Inkubationsmilieu mit VMAT-Puffer (100 K. I. E. Trasylol/ml)
ergaben sich für Antiserum B 396 bei einer Endverdünnung von 1: 20. 000 die Gleichgewichtskonstanten:
für synth. ß 1 - 24 ACTH, Ciba: K # 5,34 x 1012 L/Mol für synth. ß 1 - 39 ACTH,
Ciba: K # 5,4 x 1011 L/Mo Für ein Inkubationsmilieu mit 400 K. I. E. Trasylol/ml
konnten folgende variierende Affinitäten ermittelt werden: synth. ß 1 - 24 ACTH
K # 1,48 x 1011 L/Mol synth. ß l - 39 ACTH K # 1,55 x 1010 L/Mol "Schering" ACTH
K # 2,26 x 1011 L/Mol Die K - Werte errechneten sich mittels Umformung der Ableitung
für Empfindlichkeit (Yalow und Berson 1972) aus: # b = - 4 K ^ CH3 27
Voraussetzung
für die Durchführung eines Radioimmunoassay ist ein Antikörper von hoher Affinität
für das zu des sende Hormon. Da für ACTII die biologischen und immunologischen Aktivitäten
in vollständig konträren Sektionen des Moleküls liegen, zudem mit starken Degradationserscheinungen
im Plasma zu rechnen ist, besteht für eine exakte Messung des Hormons die Dringlichkeit
einer Spezifität des Antikörpers für eine, zur biologischen Antwort unerläßlichen
determinanten Gruppe des Moleküls. Die divergierenden Konzentrationsangaben der
Literatur für ACTH im Plasma mögen deshalb in erster Linie durch variierende Spezifität
der zur Verfügung stehenden Antikörper verursacht sein.
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Das vorliegende Immunisierungsresultat von spezifischen Antikörpern
für den biologisch aktiven Teil des ACTH läßt erkennen, daß bei der Antigenbereitung
den Wechselwirkungskräften zwischen dem C-terminalen Abschnitt des Moleküls u. der
Gelatine, mittels stärkerer Bindungsaffinitäten, der Vorzug gegeben wurde.
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Infolgedessen war die Immunogenität nur in der N-terminalen 1 - 24
Sektion disponiert.
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Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist die sekundäre Erhöhung der
immunologischen Eigenschaften des biologisch aktiven Teils des ACTH-Moleküls innerhalb
der Antigenbereitung möglich. Spezifitätsprüfungen zeigen, daß die erhaltenen Antikörper
eine spezielle Spezifität für die biologisch aktive 1 - 24 Sektion des Moleküls
und zudem eine hohe Affinität besitzen. Die Gleichgewichtskonstante der Reaktion
Antikörper - 1 - 24 ACTH liegt 12 12 bei K k 5, 34 x 10 L/Mol, optimale Milieubedingungen
vorausgesetzt. Meßversuche zur Reproduzierbarkeit des Radioimmunoassay zeigten eine
Meßempfindlichkeit von 1 pg ACTH/ml, entsprechend 3,3 x 10-16 Mol ß - 1 - 24 ACTH.
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- Patentansprüche -