-
Die
vorliegende Erfindung betrifft Gonadotropinzusammensetzungen, insbesondere
FSH (follikelstimulierendes Hormon: Follitropin)- und Menotropinzusammensetzungen
hoher biologischer Aktivität
und ein Verfahren zur Herstellung dieser Zusammensetzungen aus humanem
Harnrohstoff menopausaler oder postmenopausaler Frauen. Die erhaltene
chemische Reinheit ist größer als
95% nach der Messung durch HPLC, während die spezifische biologische
Aktivität
größer als
2500 IU/mg Protein für
sowohl FSH- als auch LH-Hormone für die Menotropinzusammensetzung
(humane Menopausengonadotropine, HMG) und mehr als 5000 IU/mg Protein
für FSH
beträgt.
-
Hintergrund der Erfindung
-
Der
Ausdruck "Menotropine" wird für eine Hormonkombination
verwendet, die aus dem Harn von menopausalen und postmenopausalen
Frauen erhalten wird, die zwei Glykoproteinhormone: follikelstimulierendes
Hormon und luteinisierendes Hormon umfasst. Diese zwei Hormone werden
von der Hypophyse sezerniert und anschließend metabolisiert und im Harn
ausgeschieden.
-
Menotropine
und Follitropin werden seit langem bei der therapeutischen Behandlung
von Fruchtbarkeitsstörungen
verwendet.
-
Die
Rolle von FSH besteht in der Wirkung auf die Ovarialfollikel, der
Förderung
von deren schnellem Wachstum und Reifung mit anschließender Ovulation
oder Atresie. FSH ist zusammen mit LH auch an der Biosynthese von Östradiol
in den Ovarialfollikeln, die es stimuliert hat, beteiligt. Die innere
Theca ist der Hauptort der Follikelbiosynthese von Androgen, die
unter der Kontrolle von LH steht. Unter der Kontrolle von FSH wird dieses
Androgen dann in den Granulosazellen aromatisiert und in den Blutstrom
ausgeschieden. Daher ist LH zusammen mit FSH ein wichtiger Bestandteil
bei der Follikelstimulation.
-
Die
Hypophysenhormone FSH und LH, Thyrotropin (TSH) und das Plazentahormon
humanes Choriongonadotropin (HCG) sind nahe verwandt, da alle derselben
Glykoproteine sind, die in deren Struktur zwei als α und β bezeichnete
Untereinheiten aufweisen. Beide Untereinheiten sind durch nichtkovalente
Interaktion gebunden. Diese Untereinheiten besitzen getrennt keine
biologische Aktivität.
Die α-Ketten
der vier oben genannten Hormone sind gleich, während die β-Ketten verschieden sind und
eine für
jedes Hormon charakteristische biologische Aktivität verleihen.
Jedoch sind wichtige Teile der β-Kette
ebenfalls gleich, was insbesondere bei β-Ketten von LH und HCG beobachtet werden
kann.
-
Gonadotropine,
die aus humanem Harn erhalten wurden, wurden partiell gereinigt,
bis sie Eigenschaften der biologischen Sicherheit erreichten, die
mit den Anforderungen für
ein injizierbares pharmazeutisches Produkt kompatibel sind, und
sie werden seit mehr als 30 Jahren zur Lösung von Unfruchtbarkeitsproblemen kommerziell
verwertet; wobei sie in der Form einer injizierbaren pharmazeutischen
Zubereitung in den wichigsten Pharmakopoeias auf der Welt aufgelistet
und zur pharmazeutischen Verwendung in praktisch allen Ländern auf
der ganzen Welt zugelassen sind.
-
Die
Zusammensetzung der Follitropinzubereitung kann wie im folgenden
beschrieben werden:
- – Follikelstimulierendes Hormon:
75 oder 150 internationale Einheiten FSH
- – Streckmittel
(für den
Lyophilisierungsprozess erforderlich, allgemein 5–20 mg Lactose)
und andere nichtaktive Proteine.
-
Die
Zusammensetzung der Menotropinzubereitungen kann wie im folgenden
beschrieben werden:
- – Follikelstimulierendes Hormon:
75 oder 150 internationale Einheiten FSH
- – Luteinisierendes
Hormon: 75 oder 150 internationale Einheiten LH
- – Streckmittel
(für den
Lyophilisierungsprozess erforderlich, allgemein 5-20 mg Lactose)
und andere nichtaktive Proteine.
-
Die
internationalen Einheiten von FSH und LH werden durch Ermittlung
der biologischen Aktivitäten
in Ratten in Bezug auf einen internationalen Standard, der durch
das National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC),
das von der World Health Organization abhängt, hergestellt wurde, berechnet.
-
Die
Anforderung, die von Pharmakopoeias wie der United States Pharmacopoeia
(USP XXIII) oder der British Pharmacopoeia (BP) in Bezug auf die
Reinheit des Ausgangsmaterials, das für die Herstellung injizierbarer
Menotropine erforderlich ist, gestellt wird, besteht in einem Ausgangsmaterial
mit einer FSH-Aktivität
von größer als
40 IU/mg und einer LH-Aktivität
von größer als
40 IU/mg. Im Hinblick darauf wurden die Ausgangsmaterialien, die
bisher verwendet wurden, durch ein Herstellungsverfahren erhalten,
das eine Aktivität
im Bereich von 70-150 IU FSH/LH pro mg sicherstellt, was mehr als
genug ist, um die durch die Gesundheitsorganisationen gestellten
Anforderungen, sofern die biologische Sicherheit und Wirksamkeit
betroffen sind, zu erfüllen.
-
Jedoch
beeinflussten die jüngsten
Entwicklungen in Bezug auf Reinigungstechniken und die Entwicklung
von Gonadotropinen gentechnischer Herkunft den Bedarf an Zubereitungen
von hoch gereinigten nativen Gonadotropinen der Herkunft aus Harn
ohne das Vorhandensein verunreinigender Proteine.
-
FSH-
und LH-Reinigungsverfahren wurden in der Vergangenheit beschrieben.
-
EP 0 322 348 B1 und
die äquivalenten
US-Patente 5 128 453, 5 767 067 und 5 840 857 betreffen die Herstellung
von follikelstimulierendem Hormon mit hoher spezifischer Aktivität der Herkunft
aus Harn. Jedoch umfassen diese Verfahren eine Stufe mit spezifischen
monoklonalen Antikörpern.
Vom Standpunkt der Sicherheit her wirft diese Tatsache Probleme
in Bezug auf die Kontamination des Produkts mit heterologen Proteinen, DNA-Resten
aus der Wirtszelle und Viren auf. Obwohl Verfahrensvalidierungen
und Endtests dazu beitragen können,
die Möglichkeit
einer potentiellen Kontamination auszuschließen, ist die Beurteilung, dass
ein Verfahren, das speziell gestaltet ist, um die Verwendung biologischer
Reagentien zu vermeiden, höhere
Sicherheitsstandards aufweist als eines, das diese Art einer Reinigungsstufe
umfasst, begründet.
-
Die
Patentanmeldung WO 98/20039 beschreibt ein Trennungs- und Reinigungsverfahren
von FSH und LH, das die Verwendung biologischer Reagentien vermeidet.
Jedoch schließt
dieses Verfahren aufgrund des sehr hohen FSH:LH-Verhältnisses
des verwendeten Ausgangsmaterials und der erhaltenen Produkte die Möglichkeit
aus, Menotropine zu erhalten, eine Zubereitung, die ein FSH:LH-Verhältnis von
etwa 1:1 erfordert.
-
Darüber hinaus
fehlt der WO 98/20039 eine Charakterisierung der erhaltenen Gonadotropine
als biologisch aktives Mate rial, was ein wesentlicher Punkt für ein therapeutisches
Produkt ist. Diese Patentanmeldung verwendet ein immunradiometrisches
Verfahren zum Testen der Aktivität,
ein Bestimmungsverfahren, das große Probleme in Bezug auf dessen
Genauigkeit aufwirft.
-
Tatsächlich ist
seit langem bekannt, dass die Strukturheterogenität von FSH-
und LH-Isoformen große Auswirkung
auf die biologische Aktivität
und immunologische Reaktivität
beider Hormone hat [Costagliola et al., J. Endocrinol. Invest. 17,
201 (1994)]. Beobachtete Unterschiede der Bio- und Immunqualitäten von FSH und LH legen nahe,
dass getrennte Struktureinheiten von den Bioassays gegenüber dem
Immunoassay erkannt werden. Es wurde sorgfältig diskutiert, dass Immunoassays
nicht konsistent eine gute Abschätzung
des Bioaktivitätsniveaus
von Gonadotropinen ergeben und nicht zwangsläufig die biologische Aktivität widerspiegeln
[Dahl und Stone, J. Andrology, 13, 11 (1992); Rose et al., Endocrine
Reviews, 21, 5 (2000)].
-
Andererseits
werden Bioassays als geeigneter Test zur Feststellung der Hormonaktivität betrachtet, da
sie zwei wichtige Komponenten berücksichtigen, die in anderen
Methoden nicht vorhanden sind: die biologische Wirkung am Zielgewebe
und die biologische Clearance [Rose et al., Endocrine Reviews, 21,
5 (2000)]. Diese Tatsache macht den In-vivo-Bioassay obligatorisch
zur Eichung von Therapeutikazubereitungen [Rose, Clinica Chimica
Acta 273, 103 (1998)].
-
Es
muss auch unterstrichen werden, dass der WO 98/20039 eine Charakterisierung
der Gonadotropine als chemisch reiner Arzneistoff fehlt, da kein
Analyseverfahren zur Stützung
dieser Tatsache präsentiert wird.
-
Die
vorliegende Erfindung präsentiert
eine vollständige Charakterisierung
der Gonadotropine nicht nur durch den Umfang der biologischen Aktivität, sondern
auch vom analytischen Standpunkt durch Einführen eines empfindlichen Analyseverfahrens
zum Testen der Reinheit. Da die zur Feststellung der FSH- und LH-Aktivität in der
vorliegenden Erfindung verwendeten Assays in allen Fällen In-vivo-Bioassays
sind, für
die seit langem erwiesen ist, dass sie ein robuster spezifischer
Test zur Sicherstellung von biologischer Aktivität sind, kann die Wirksamkeit
des FSH und des LH für
die jeweiligen erhaltenen Gonadotropine und auch deren Verhältnis sicher
festgestellt werden.
-
Ein
zweiter zu berücksichtigender
Punkt besteht darin, dass das oben genannte Patent (WO 98/20039)
die Verwendung von Affinitätsfarbstoffchromatographie
zur Reinigung von Gonadotropinen beschreibt. Dieses Verfahren könnte Probleme
im Hinblick auf eine potentielle Kontamination des Produkts durch das
Austreten des Farbstoffs ergeben. Diese Art von Fremdverbindungen
ist bei in Menschen zu injizierenden Produkten nicht erwünscht [Protein
Purification von R. K. Scopes, Springer-Verlag, New York Inc; 2.
Auflage, Seite 156 (1998)]. Da die vorliegende Erfindung so gestaltet
wurde, dass dieser Chromatographietyp ausgeschlossen ist, ist das
Farbstoffkontaminationsproblem ein vollständig vermiedenes Problem.
-
Derzeitige
Menotropine (das kommerziell erhältliche
Produkt) können
an dem Nachteil potentieller lokaler allergischer Reaktionen, wenn
sie subkutan verabreicht werden, aufgrund des Vorhandenseins von
Proteinkontaminationsstoffen leiden.
-
Diese
Erfindung stellt ein Verfahren zur Reinigung und Zubereitung der
ersten, kommerziell erhältlichen
Gonadotropinprodukte hoher Reinheit bereit. Diese Methodik wurde speziell
so gestaltet, dass die Verwendung biologischer Reagentien, wie Antikörper, Rezeptoren
und andere heterologe Materialien, und von Chromatographiefarbstoffen
vermieden wird. Neben dem Sicherheitsaspekt ermöglicht die Verwendung nichtspezifischer
Stufen während
der Isolierung die Gewinnung aller Isoformen, die in dem Ausgangsmaterial vorhanden
sind.
-
Wie
ausführlich
beschrieben wurde, ist die Heterogenität bei den Glykoproteinhormonen
von spezieller Bedeutung. Mindestens 20-30 verschiedene Isoformen
von FSH, LH und TSH existieren (Wide, Acta Endocr., Copenh 109,
181-189, 1985). Diese Isoformen unterscheiden sich im Hinblick auf
deren Molekulargewicht und Ladung. Obwohl Glykoproteinhormonisoformen
hauptsächlich
im Hinblick auf die Oligosaccharidstruktur variieren, können Mikroheterogenitäten auch
durch Unterschiede in der Aminosäurezusammensetzung
vorhanden sein (Costagliola et al., J. Endocrinol. Invest., 17,
291-299, 1994; Wilson
et al., J. Endocrinol 125, 3-14, 1990).
-
Es
ist allgemein akzeptiert, dass der Typ von isolierten verschiedenen
Isoformen unter anderen Faktoren von der Isolierungstechnik abhängt (Cockburn
et al., Biologicals 19, 257-264, 1991). Die Verwendung stark unterscheidender
Techniken zur Isolierung, beispielsweise monoklonale Antikörper, kann
zur Selektion von nur einem Teil der in der Materialquelle vorhandenen
Isoformen beitragen. Da sie "zu
spezifisch" sind,
können
einige biologisch aktive Gonadotropinvarianten durch die Antikörper nicht
erkannt werden und verloren gehen (Costagliola et al., J. Endocrinol.
Invest., 17, 291-299, 1994). Andererseits kann ein nichtselektiver
Ansatz, beispielsweise der in diesem Patent beschriebene, zur Reinigung
von allen, im Harn vorhandenen Arten von Isoformen verwendbar sein.
Es wurde gezeigt, dass verschiedene Isoformen in Bezug auf die Interaktion
mit den Zelloberflä chenrezeptoren
und die Stoffwechselclearance variieren (Thotakura et al., Glycobiology
5, 3-10, 1995). Die Oligosaccharidstruktur steht unter der Kontrolle
verschiedener physiologischer Faktoren. Vom therapeutischen Standpunkt
aus ist es interessant, ein Produkt zu erhalten, in dem alle im
Harn vorhandenen Isoformen verfügbar
sind. Auf diese Weise ergeben die hier beschriebenen hoch gereinigten
Produkte die verschiedenen Rollen von natürlich vorkommenden Gonadotropinisoformen
bei der Aufrechterhaltung der Reproduktionsfunktion.
-
Es
muss auch unterstrichen werden, dass die vorliegende Anmeldung die
erste Charakterisierung einer hoch gereinigten Zubereitung von Menotropinen
ist, die nicht nur durch deren hohe biologische Wirksamkeit, sondern
auch durch relevante Screeningverfahren (PAGE-Elektrophorese, HPLC,
Größenausschlusschromatographie)
festgestellt wurde.
-
Nachdem
diese natürlich
vorkommenden FSH- und LH-Moleküle
in einer gereinigten Qualität
und in einem großen
Maßstab
verfügbar
sind, können
sie dann untersucht und sorgfältig
analysiert werden. Die dreidimensionale Struktur der Hormone kann
zu einem besseren Verständnis
der Rolle der Oligosaccharide beitragen.
-
Das
Verfahren zur Gewinnung von derzeit produzierten Menotropinen ist
bekannt. Wie in BP 1980 angegeben ist, können Menotropine aus dem Harn
von postmenopausalen Frauen durch Kaolinadsorption, anschließende Alkalielution
und Fällung
mit 2 Volumina Aceton präpariert
werden. Die erforderliche Fraktion wird aus dieser Fällung mit
einer Ammoniumacetatlösung
in 70% Ethanol extrahiert und dann mit einer 10%-igen Ammoniumacetatlösung in 90%-igem Ethanol ausgefällt. Das
Menotropinprodukt wird durch Ionenaustauschchromatographie dieser
Fällung
erhalten.
-
Das
Ausgangsmaterial, ab jetzt das "HMG-Quellenmaterial", das in der vorliegenden
Erfindung zur Gewinnung hoch gereinigter Menotropine verwendet werden
kann, bildet die Menotropinspezialität nach der Spezifikation in
den Pharmakopoeias (USP XXIII, BP 1993 Addendum 1995, EP 1986) oder
ein beliebiges anderes Material, das eng mit dieser Spezialität in Verbindung
steht. Daher ist selbstverständlich,
dass dieses Zubereitungsverfahren auch für andere Materialien, die nicht
streng die für
Menotropine anwendbaren Anforderungen erfüllen, verwendbar ist. Tatsächlich wurden
zufriedenstellende Ergebnisse unter Verwendung der Fraktionen C
(siehe Beschreibung der Erfindung, Beispiel 1 und Beispiel 2), die
ein Material ist, das die Anforderung des FSH:LH-Verhältnisses
der Menotropine (FSH:LH etwa 1:1) nicht erfüllt, erhalten. Darüber hinaus liefert
die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Einstellung des FSH:LH-Verhältnisses,
wenn dies nötig
ist, weshalb sie daher eine Spezialität hoch gereinigter Menotropine
auch bei Verwendung von Ausgangsmaterialien, die außerhalb
des korrekten FSH:LH-Verhältnisses
sind, ergeben kann. Dank dessen ist es möglich, ein Produkt zu erhalten,
das aus FSH und LH in dem passenden Verhältnis 1:1, das zur Herstellung
der pharmazeutischen Zubereitung notwendig ist, besteht, ohne die
beiden aktiven Prinzipien während
der Reinigung zu trennen. Das heißt, es kann eine gleichzeitige
Reinigung beider Hormone von einem Reinheitsgrad von etwa 5% im
Ausgangsmaterial zu mehr als 95% im Endprodukt mit einer 25-35fach
größeren Endwirksamkeit
als die ursprüngliche
erhalten werden. Der Reinigungsgrad, der erhalten wird, kann durch 1 sichtbar
gemacht werden, die das Ergebnis einer Polyacrylamidgelelektrophorese
des herkömmlichen
pharmazeutischen Produkts gegenüber
der neuen gereinigten Version, die durch Anwendung der vorliegenden
Erfindung erhalten wurde, zeigt.
-
Die
in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Stufen können nach
einer von der hierin beschriebenen verschiedenen Reihenfolge verwendet
werden, wobei dies kein Variieren der Philosophie der Erfindung impliziert.
In gleicher Weise zufriedenstellende Ergebnisse wurden durch Einschieben
des Harzes mit hydrophober Interaktion zwischen den zwei Ionenaustauschchromatographiestufen,
die später
beschrieben sind, erhalten.
-
Diese
Erfindung stellt auch die getrennte Zubereitung von Harn-Gonadotropinen,
d.h. FSH und LH, bereit.
-
Die
Verabreichung von Zusammensetzungen von Menotropinen für therapeutische
Zwecke wird hauptsächlich
durch intramuskuläre
Injektion durchgeführt.
Diese Verabreichungsform erzeugt beim Patienten beträchtliche
Beschwerden und erfordert regelmäßige Besuche
eines Patienten in Klinikeinheiten, manchmal über Wochen oder Monate, um
die Behandlung zu erhalten.
-
Eine
subkutane Verabreichung ermöglicht
eine Selbstverabreichung und infolgedessen eine Verbesserung der
Patientenkooperation und -compliance.
-
Die
subkutane Verabreichung von Harn-Gonadotropinen wurde bereits beschrieben
(Y. Nakamura et al., Fertil Steril 51, 423-429, 1989; L. Engmann
et al., Fertil Steril. 69, 836-840,
1998).
-
Die
subkutane Verabreichung unreiner Zubereitungen kann an dem Nachteil
lokaler Allergien aufgrund des Vorhandenseins von Verunreinigung
in dem verwendeten Produkt leiden und folglich zu einer Beendigung der
Behandlung führen.
Daher ist es sinnvoll, Produkte hoher Reinheit zu produzieren, die
die Möglichkeit
dieser allergischen Reaktionen verringern können.
-
Zusammenfassung der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Zubereitung von
FSH- und/oder LH-Zusammensetzungen hoher biologischer Aktivität aus humanem
Harnrohstoff menopausaler oder postmenopausaler Frauen. Die chemische
Reinheit ist nach der Messung durch HPLC größer als 95%, während die
spezifische biologische Aktivität
mehr als 2500 IU/mg Protein für
das FSH und LH für
Menotropine und mehr als 5000 IU/mg für Follitropin beträgt.
-
Die
Zusammensetzungen, die nach dem Verfahrensgegenstand der vorliegenden
Erfindung erhalten wurden, können
umfassen: ein beliebiges herkömmliches
Streckmittel, wie Hexosen, Mannit und Gemische derselben, ein Stabilisierungsmittel,
das aus der Gruppe von Albumin, Detergentien und Gemischen derselben ausgewählt ist.
-
Die
erhaltenen injizierbaren Zusammensetzungen sind im wesentlichen
frei von kontaminierenden Stoffen und können für subkutane Verabreichung angepasst
werden.
-
Die
Follitropin- und/oder Menotropinzusammensetzungen, die gemäß dem Verfahrensgegenstand
der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, können zur Herstellung einer
pharmazeutischen Zubereitung hoher biologischer Aktivität und chemischer
Reinheit, die einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst
oder auch nicht, verwendet werden.
-
Das
Trennungs- und Reinigungsverfahren für humane Harn-Gonadotropine hoher
biologischer Aktivität
und chemischer Reinheit, die absolut frei von fremden kontaminierenden
Materialien, die von der Verwendung von biologischen Reagentien
oder Chromatographiefarbstoffen stammen, sind, ausgehend von einem Rohstoff
von Gonadotropinen, die HMG-Quellenmaterial
umfassen, umfasst hauptsächlich
die folgenden Stufen:
- (1) Reinigung der rohen
Gonadotropine, die in 0,05-0,15 M Ammoniumacetat, pH 5,0-6,0, verdünnt sind,
in einer Ionenaustauschsäule
mit einem starken kationischen Harz des Sulfopropyltyps unter Elution
von sowohl FSH als auch LH mit Lösungen
von 0,05-0,5 M Ammoniumacetat, pH 5,0-7,0; und
- (2) Reinigung dieser Fraktion, die in 0,01-0,05 M Ammoniumacetat,
pH 5,0-7,0, verdünnt
ist, in einer Ionenaustauschsäule
mit einem starken anionischen Harz des quaternären Ammoniumtyps unter Elution
von sowohl FSH als auch LH mit Lösungen
von 0,05-0,2 M Ammoniumacetat, pH 5,0-7,0; und
- (3) Reinigung von Gonadotropinen in einer Säule mit einem Harz mit hydrophober
Wechselwirkung durch aufeinanderfolgende Zugabe von mindestens zwei
der folgenden Lösungen:
- a) Puffer aus 50-200 mM Natriumphosphat und 0,8-1,2 M Ammoniumsulfat,
pH 5,0-6,0;
- b) Puffer aus 50-200 mM Natriumphosphat und 0,4-0,6 M Ammoniumsulfat,
pH 5,0-7,0;
- c) Puffer aus 50-200 mM Natriumphosphat (50-70% (V/V)) und 96%-igem
Ethanol (50-30% (V/V)),
oder Einschieben des Harzes mit
hydrophober Interaktion zwischen die zwei Ionenaustauschchromatographiestufen.
-
Harze
des Typs SP-Sepharose, Q-Sepharose und Harze mit hydrophober Interaktion
können
in diesen Stufen verwendet werden. Ein bevorzugtes Harz mit hydrophober
Interaktion ist ein Phenyl-Sepharose-Harz.
-
Das
Verfahren der Erfindung umfasst ferner sekundäre Stufen der Fällung, Zentrifugation,
Ultrafiltration, Dialyse, des Waschens, Trocknens unter Vakuum und
Kühlens.
Die letzte Stufe dieses Verfahrens kann selektiv so durchgeführt werden,
dass Fraktionen erhalten werden, die nur Menotropine, FSH- oder
LH-Aktivitäten
aufweisen.
-
Einer
der Hauptvorteile des Verfahrens der vorliegenden Erfindung besteht
darin, dass das Verfahren keine biologischen Reagentien und Substrate
umfasst und dass das Produkt frei von verunreinigenden Biomaterialien
ist.
-
Das
in der vorliegenden Erfindung verwendete Ausgangsmaterial zur Produktion
von hoch gereinigten Menotropinen und hoch gereinigtem FSH wird
im wesentlichen durch ein sehr gut bekanntes Verfahren erhalten,
das Kaolin zur Adsorption von Gonadotropinen aus dem menopausalen/postmenopausalen
Harn verwendet (BP 1980). Kurz gesagt wird die biologisch aktive
Fraktion aus dem angesäuerten
Harn mit Kaolin extrahiert, mit Alkali eluiert und mit 2 Volumina
Aceton ausgefällt.
Dann wird die biologisch aktive Fraktion aus dieser Fällung mit
einer 10%-igen (Gew/V) Lösung
von Ammoniumacetat in Ethanol (70%) extrahiert und mit 10% Ammoniumacetat
in Ethanol (90%) ausgefällt.
Eine weitere Reinigung erfolgt durch Ionenaustauschchromatographie.
Das durch dieses Verfahren erhaltene gereinigte Material bildet
die Zusammensetzung von Menotropinen oder eine andere äquivalente
Zubereitung, wie die Fraktion C.
-
Menotropine
oder ein Äquivalent
(Fraktion C) wird auf einer starken kationischen Austauschsäule chromatographiert,
wobei die aktive Fraktion mit einem 0,2-0,5 M Ammoniumacetatpuffer,
pH 5,0-7,0, eluiert wird. Eine neue Fällung wird durch Zugabe von
4 Volumina Ethanol erhalten (Fraktion F). Die Fraktion F wird auf
einer starken anionischen Austauschsäule chromatographiert, wobei
die aktive Fraktion mit einem 0,05-0,2 M Ammoniumacetatpuffer, pH
5,0-7,0, elu iert wird. Die aktive Fraktion wird bei -75°C eingefroren
(Fraktion G).
-
Die
Fraktion G wird durch einen biologischen Assay analysiert, um deren
FSH- und LH-Gehalt genau zu bestimmen. In Abhängigkeit von dem zwischen den
beiden Hormonen gefundenen Verhältnis
wird die folgende Chromatographiestufe durchgeführt, wobei zwei Alternativen
möglich
sind:
-
- 1) eine Co-Reinigung beider Hormone;
- 2) eine Abtrennung der Hormonaktivität, die im Überschuss vorhanden ist, so
dass Menotropine mit 1:1 FSH/LH erhalten werden. Alternativ ergibt
die Abtrennung von sowohl FSH als auch LH beide Aktivitäten getrennt
für therapeutische
Zwecke (pures FSH und pures LH).
-
Sobald
die durchzuführenden
Stufen bestimmt sind, wird die Fraktion G dialysiert und so eingeengt, dass
sie für
die Notwendigkeiten der folgenden Chromatographiestufe angepasst
ist. Die gebildete Lösung wird
auf einer Säule
mit hydrophober Interaktion chromatographiert, wobei die aktiven
Fraktionen nach zwei alternativen Verfahren unter Berücksichtigung
der obigen Optionen 1) und 2) eluiert werden. Die flüssigen Fraktionen,
die erhalten werden, (Fraktion J2, J3, J4) werden bei -75°C eingefroren.
Später
werden diese Fraktionen aufgetaut, dialysiert und eingeengt, über eine
Sterilisierungsmembran filtriert und durch Zugabe von 4 Volumina
Ethanol ausgefällt,
wobei eine Fällung
erhalten wird, die unter Vakuum bis zur Trockne getrocknet wird
(Fraktion K).
-
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
-
1 stellt
einen Elektrophoreseversuch des herkömmlichen Produkts (HMG) gegenüber dem
neuen hoch gereinigten Menotropineprodukt (Fraktion KM) dar.
-
2 stellt
einen PAGE(Polyacrylamidgelelektrophorese)-Versuch von hoch gereinigten Menotropinen
(Fraktion KM), der in verschiedenen Konzentrationen
durchgeführt
wurde, zusammen mit den Molekulargewichtsstandards dar.
-
3 stellt
einen PAGE-Versuch eines hoch gereinigten FSH (Fraktion KF) in verschiedenen Konzentrationen zusammen
mit den Molekulargewichtsstandards dar.
-
4 stellt
einen PAGE-Versuch von 1) Gonal-F (Serono) 1 FSH IU/μl, 2) Metrodine
HP (Serono) 3 FSH IU/μl),
3) hoch gereinigten Menotropinen (Fraktion KM 3,7 FSH IU/μl) und 4)
Molekulargewichtsstandards (von oben) 14 400 D, 20 100 D, 30 000
D, 43 000 D, 67 000 D und 94 000 D dar.
-
5 stellt
eine isoelektrische Fokussierung auf durch Silber angefärbten 3-10
PhastGels dar, wobei Spur 1 den Calibration Kits for Broad 3-10
pI entspricht, Spur 2 einem pI-4,55-Standard (Sojabohne-Trypsin-Inhibitor)
entspricht, Spur 3 einem pI-5,85-Standard (Rinder-Carboanhydrase
B) entspricht und die Spuren 4, 5 und 6 hoch gereinigtem Follitropin(KF)-Produkt (drei verschiedene Produktionschargen)
entsprechen.
-
6 stellt
eine isoelektrische Fokussierung auf durch Silber angefärbten 3-10
PhastGels dar, wobei Spur 1 den Calibration Kits for Broad 3-10
pI entspricht und Spur 2 hoch gereinigtem Menotropine(KM)-Produkt entspricht.
-
7 ist
das Ergebnis, das durch HPLC mit einer Probe von hoch gereinigten
Menotropinen (Fraktion KM) erhalten wurde.
-
8 ist
das Ergebnis, das durch HPLC mit einer Probe von hoch gereinigtem
FSH (Fraktion KF) erhalten wurde.
-
9 ist
das Ergebnis, das durch HPLC mit einer Probe von Gonal-F (Serono)
erhalten wurde (Der Peak bei der Retentionszeit 11,2 entspricht
einem Streckmittel der pharmazeutischen Zubereitung) und
-
10 ist
ein Verfahrensfließdiagramm
zur Gewinnung der hoch gereinigten Gonadotropine der vorliegenden
Erfindung.
-
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
-
a) Fließdiagramm
-
Das
Fließdiagramm
zur Gewinnung von hoch gereinigten Gonadotropinen ist in 10 angegeben.
-
Die
Erarbeitungstechnik der Fraktion KM, die
gereinigte Menotropine darstellt, wird im folgenden beschrieben.
-
b) Zubereitung der Fraktion F
-
Die
Fraktion C wird auf einer Chromatographiesäule, die 10 1 eines starken
kationischen Austauschharzes des Sulfopropyltyps enthält, chromatographiert.
-
Die
Fraktion C (110-140 g) wird in 1600-1800 ml einer 0,05-0,15 M Ammoniumacetatlösung, pH 5,0-7,0,
gelöst.
Die Säule
wird gefahren und mit der notwendigen Menge einer 0,05-0,15 Ammoniumacetatlösung, um
das Volumen auf 20 l zu bringen, eluiert. Die Elution wird mit Lösungen von
0,15-0,20 M Ammoniumacetat, pH 5,0-7,0 (20 l), und 0,2-0,5 M Ammoniumacetat,
pH 5,0-7,0 (20 l), fortgesetzt. Die mit der letzteren Lösung eluierte
aktive Fraktion wird unter Rühren
zu 4 Volumina von 96%-igem Ethanol und ausreichend Essigsäure, um
einen pH-Wert des Gemischs von 5,5-5,7 zu erreichen, gege ben. Ein
Niederschlag wird gebildet, durch Zentrifugation abgetrennt, mit
Ethanol gewaschen und unter Vakuum getrocknet, bis Ethanol entfernt
ist und die Feuchtigkeit weniger als 5% beträgt (Fraktion F).
-
c) Zubereitung der Fraktion G
-
Die
Fraktion F wird auf einer Chromatographiesäule, die 4 l eines starken
anionischen Austauschharzes des quaternären Ammoniumtyps enthält, chromatographiert.
-
Die
Fraktion F (40-60 g in 650 ml) wird in 0,01-0,5 M Ammoniumacetatlösung, pH-Wert
5,0-7,0, gelöst, die
Säule wird
gefahren und mit der gleichen Lösung,
um das Volumen auf 7 l zu bringen, eluiert. Die Elution wird mit
12 l 0,05-0,07 M Ammoniumacetat, pH 5,0-7,0, dann mit 10 l 0,07-0,2
M Ammoniumacetat, pH 5,0-7,0, fortgesetzt. Die mit der letzteren
Lösung
eluierte aktive Fraktion wird einem Ultrafiltrationsverfahren unter
Verwendung einer PM 10 (10 000 D) Ultrafilters (Amicon-Millipore)-Membran
unterzogen. Die Lösung
wird eingeengt und gegen einen 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 5,50-5,7,
bis zu einer Konzentration von 2-4 g Protein in 100-150 ml Puffer
konzentriert und dialysiert. Sie wird dann bei -75°C eingefroren
(Fraktion G).
-
d) Zubereitung der Fraktion J
-
Die
Fraktion G wird auf einer Chromatographiesäule, die 400 ml eines Harzes
mit hydrophober Interaktion (Phenyl Sepharose HP, Amersham-Pharmacia
Biotech) enthält,
chromatographiert. Eine ausreichende Menge Ammoniumsulfat wird zu
der Lösung
der Fraktion G gegeben, um eine Konzentration von 0,8-1,2 M zu erhalten.
-
Das
durchzuführende
chromatographische Verfahren ermöglicht die
Co-Reinigung von FSH und LH oder die Abtrennung von beiden Hormonen.
Der Aktionsablauf hängt
von den früheren
Analysen ab, die mit der Fraktion G durchgeführt wurden (biologische Assays),
wodurch das FSH:LH-Verhältnis
bestimmt wurde. Sobald dieses Verhältnis bekannt ist, wird der Überschuss
des Hormons, der in einem Überschuss
zu einem 1:1-Verhältnis
von FSH:LH vorhanden ist, entfernt.
-
d-1)
Wenn das Produkt ausbalanciert ist (1:1 FSH:LH), wird die Chromatographie
der konzentrierten und dialysierten Fraktion G wie im folgenden
durchgeführt:
- – Platzieren
der Lösung
der Fraktion G in der Chromatographiesäule, 0,8-1,2 M in Ammoniumsulfat;
- – Eluieren
mit 2 Volumina 50-200 mM Natriumphosphatpuffer, 0,8-1,2 M Ammoniumsulfat,
pH 5,0-7,0;
- – Fortsetzen
der Elution mit 2 Volumina 50-200 mM Phosphatpuffer (50-70% (V/V))
und 96% Ethanol (50-30% (V/V)).
-
Die
mit dem letzteren Puffer eluierte aktive Fraktion (Fraktion J4)
wird bei -75°C
eingefroren. Diese Fraktion weist FSH- und LH-Aktivität auf.
-
d-2)
Wenn das FSH:LH-Verhältnis
der Fraktion G von 1:1 verschieden ist, wird der Überschuss
des Hormons im Überschuss
wie im folgenden angegeben entfernt:
- – Platzieren
eines Aliquots der Lösung
von Fraktion G in der Chromatographiesäule, 0,8-1,2 M in Ammoniumsulfat;
- – Elution
mit 2 Volumina 50-200 mM Natriumphosphatpuffer, 0,8-1,2 M Ammoniumsulfat,
pH 5,0-7,0;
- – Fortsetzen
der Elution mit 2 Volumina 50-200 mM Natriumphosphatpuffer, 0,4-0,6
M Ammoniumsulfat, pH-Wert 5,0-7,0 und schließlich mit 2 Volumina 50-200
mM Phosphatpuffer (50-70% (V/V)) und 96% Ethanol (50-30% (V/V)).
-
Die
mit 50-200 mM Natriumphosphatpuffer, 0,4-0,6 M Ammoniumsulfat eluierte
aktive Fraktion (Fraktion J2) wird bei -75°C eingefroren. Diese Fraktion
weist hauptsächlich
FSH-Aktivität auf.
-
Die
mit 50-200 mM Phosphatpuffer (50-70% (V/V)) und 96% Ethanol (50-30%
(V/V)) eluierte aktive Fraktion (Fraktion J3) wird bei -75°C eingefroren.
Diese Fraktion weist nur LH-Aktivität auf.
-
Zubereitung der Fraktion K
-
Die
Fraktionen J2, J3, J4 werden aufgetaut und unter Verwendung von
Ultrafiltration durch eine PM 10 (Diaflo Ultrafilters, Amicon-Millipore)-Membran
gegen einen 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 5,7, dialysiert und
konzentriert.
-
Jede
erhaltene Lösung
wird unter Verwendung einer 0,45-μm-Membran unter den
notwendigen Bedingungen, um ein steriles Produkt zu erhalten, filtriert
und dann zu 4 Volumina von 96%-igem Ethanol und ausreichend Essigsäure, um
einen pH-Wert des
Gemischs von 5,5-5,7 zu erhalten, gegeben. Das Gemisch wird über Nacht
stehengelassen. Der Niederschlag wird durch Zentrifugation abgetrennt
und unter Vakuum getrocknet, bis Ethanol entfernt ist und die Feuchtigkeit
weniger als 5% beträgt
(Fraktion K).
-
Die
Eigenschaften der Fraktion K können
in Abhängigkeit
von der ausgefällten
Fraktion, die J2, J3 oder J4 ist, variieren. Die aus der Fraktion
J4 erhaltene Fraktion KM enthält etwa äquivalente
Einheiten von FSH und LH. Die aus der Fraktion J2 erhaltene Fraktion
KF besteht aus FSH und LH-Spuren. Die aus der
Fraktion J3 erhaltene Fraktion KL besteht
aus LH und FSH-Spuren.
-
Beispiele für durch die beschriebenen Techniken
produzierte Chargen
-
Beispiel 1
-
1.1 Herstellung der Fraktion F
-
231,2
g der Fraktion C wurden in zwei gleiche Portionen geteilt und in
zwei äquivalenten
Verfahren auf einer Chromatographiesäule wie oben beschrieben chromatographiert.
-
115,6
g der Fraktion C (in jedem Verfahren) wurden in 1700 ml 0,05 M Ammoniumacetatpuffer,
pH 5,0, gelöst.
Die Säule
wurde gefahren und mit weiteren 18,7 l des gleichen Chromatographiepuffers
eluiert. Die Elution wurde mit 20 l 0,15 M Ammoniumacetatpuffer,
pH 5,0, und schließlich
mit 20 l 0,5 M Ammoniumacetatpuffer, pH 5,0, fortgesetzt. Die aktive
Fraktion, die durch Elution mit 0,5 M Ammoniumacetat (22 l) erhalten
wurde, wurde unter Rühren
zu einer Lösung
von 88 l 96%-igem Ethanol und 2400 ml Essigsäure gegeben. Der pH-Wert des Gemischs
betrug 5,7. Der erhaltene Niederschlag wurde über Nacht im Kühlschrank
(2-8°C)
stehengelassen. Der Niederschlag wurde zentrifugiert, mit 96%-igem
Ethanol gewaschen und unter Vakuum 17 h getrocknet.
-
Bei
jedem der zwei äquivalenten
Verfahren wurden zwei Fraktionen F von 20,7 g bzw. 19,5 g erhalten.
-
1.2 Herstellung der Fraktion G
-
Die
in der obigen Stufe erhaltenen zwei Fraktionen F wurde zusammengebracht
und auf einer Säule entsprechend
der beschriebenen Technik chromatographiert.
-
40,2
g der Fraktion F wurden in 650 ml 0,01 M Ammoniumacetatpuffer, pH
5,0, gelöst.
Die Säule
wurde mit dieser Lösung
gefahren und mit 6350 ml des gleichen Verdünnungspuffers eluiert. Die
Elution wurde dann mit 12 l 0,05 M Ammoniumacetat, pH 5,0, und dann
mit 10 l 0,2 M Ammoniumacetat, pH 5,0, fortgesetzt. Die aktive Fraktion
(4500 ml), die mit der letzteren Lösung eluiert wurde, wurde einem
Ultrafiltrationsverfahren unter Verwendung einer PM 10 (10 000 D)
Diaflo Ultrafilters (Amicon-Millipore)-Membran unterzogen. Die Lösung wird
gegen 50 mM Natriumphosphat, pH 5,7, konzentriert und dialysiert,
um eine Konzentration von 2-4 g Protein in 150 ml Puffer zu erhalten.
Die Endlösung
(400 ml) wurde bei -75°C
eingefroren.
-
Die
Fraktion G wurde in Tieren biologisch getestet, wobei eine FSH-Wirkung
von 42 000 IU/ml und eine LH-Wirkung von 33 780 IU/ml detektiert
wurden. Mit diesem Ergebnis wurde es als notwendig erachtet, einen Teil
der Lösung
(80 ml) der Fraktion G unter Bedingungen zur Abtrennung von FSH
und LH (Fraktionen J2 bzw. J3) weiterzuverarbeiten. Der Rest (320
ml) wurde unter Bedingungen, dass beide Hormone nicht getrennt wurden,
chromatographiert (Fraktion J4). Aliquots der Fraktion J3 und der
Fraktion J4 wurden dann gemischt, um ein FSH:LH-Endverhältnis von
etwa 1:1 zu erhalten (Fraktion KM).
-
1.3 Herstellung der Fraktion J
-
i) Herstellung der Fraktionen J2 (hoch
gereinigtes FSH) und J3 (hoch gereinigtes LH):
-
Ammoniumsulfat
wurde zu einem Aliquot der Fraktion G (80 ml) bis zu einer Konzentration
von 1 M gegeben. Diese Lösung
wurde in einer Phenyl-Sepharose-HP-Chromatographiesäule gefahren
und mit 2 Volumina Puffer, 50 mM Natriumphosphat, 1 M Ammoniumsulfat,
pH 5,1, eluiert. Die Elution wurde mit 2 Volumina Puffer, 50 mM
Natriumphosphat, 0,5 M Ammoniumsulfat, pH 5,1, und schließlich mit
2 Volumina 50 mM Natriumphosphatpuffer (60% (V/V)) und 96% Ethanol
(40% (V/V)) fortgesetzt.
-
Die
FSH-aktive Fraktion, die mit Puffer, 50 mM Natriumphosphat, 0,5
M Ammoniumsulfat, pH 5,1, eluiert wurde (Fraktion J2), wurde unter
Verwendung von PM 10-Membran-Ultrafiltration (Diaflo Ultrafilters,
Amicon-Millipore) gegen einen 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 5,7,
dialysiert und konzentriert und dann bei -75°C eingefroren.
-
Die
LH-aktive Fraktion, die mit 50 mM Natriumphosphatpuffer (60% (V/V))
und 96%-igem Ethanol (40% (V/V)) eluiert wurde, (Fraktion J3) wurde
unter Verwendung von PM 10-Membran-Ultrafiltration
(Diaflo Ultrafilters, Amicon-Millipore)
gegen einen 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 5,7, dialysiert und
konzentriert und dann bei -75°C
eingefroren.
-
ii) Herstellung der Fraktion J4 (hoch
gereinigte Menotropine)
-
Ein
zweites Aliquot der Fraktion G (320 ml) wurde aufgetaut und Ammoniumsulfat
wurde zugegeben, bis eine Konzentration von 1 M erhalten wurde.
Diese Lösung
wurde in einer Phenyl-Sepharose-HP-Chromatographiesäule gefahren
und mit 2 Volumina Puffer, 50 mM Natriumphosphat, 1 M Ammoniumsulfat,
pH 5,1, eluiert. Die Elution wurde mit 2 Volumina 50 mM Phosphat
(60% (V/V)) und 96%-igem Ethanol (40% (V/V)) fortgesetzt. Die mit
diesem Puffer eluierte Fraktion (Fraktion J4) wurde bei -75°C eingefroren.
-
1.4 Herstellung der Fraktion K
-
Die
Fraktionen J3 (40 ml) und J4 (25 ml) wurden aufgetaut, über eine
0,45-μm-Membran
unter zur Gewinnung eines steri len Produkts notwendigen Bedingungen
filtriert (Endvolumen 100 ml) und dann mit 4 Volumina 96%-igem Ethanol
(400 ml) und Essigsäure,
die zum Erreichen eines pH-Werts von 5,5 notwendig ist, (1 ml) gemischt
und gerührt.
-
Die
Fraktion J2 (40 ml) wurde aufgetaut, über eine 0,45-μm-Membran unter zur
Gewinnung eines sterilen Produkts notwendigen Bedingungen filtriert
(Endvolumen 60 ml) und dann mit 4 Volumina 96%-igem Ethanol (400
ml) und Essigsäure,
die zum Erreichen eines pH-Werts von 5,5 notwendig ist, (0,5 ml)
gemischt und gerührt.
-
Die
Fraktionen wurden über
Nacht bei 2-8°C
im Kühlschrank
ausfallen gelassen. Am nächsten
Morgen wurde der Niederschlag hoch gereinigter Menotropine, der
aus der Fraktion J3 und J4 erhalten wurde, durch Zentrifugation
abgetrennt und unter Vakuum getrocknet, bis Ethanol entfernt war
und die Feuchtigkeit weniger als 5% betrug (Fraktion KM,
4,50 g).
-
Der
aus der J2-Fraktion erhaltene Niederschlag von hoch gereinigtem
FSH wurde durch Zentrifugation abgetrennt und unter Vakuum getrocknet,
bis Ethanol entfernt war und die Feuchtigkeit weniger als 5% betrug (Fraktion
KF, 0,55 g).
-
1.5 Ergebnisse
-
Die
biologische Analyse, die mit den Fraktionen K
M (hoch
gereinigte Menotropine) und K
F (hoch gereinigtes
FSH) durchgeführt
wurde, zeigte die folgenden Ergebnisse:
Ausbeutetabelle
-
Beispiel 2
-
2.1 Herstellung der Fraktion F
-
250,06
g der Fraktion C wurden in zwei gleiche Portionen geteilt und in
zwei äquivalenten
Verfahren auf einer Chromatographiesäule wie oben beschrieben chromatographiert.
-
123,03
g der Fraktion C (in jedem Verfahren) wurden in 1700 ml 0,05 M Ammoniumacetatpuffer,
pH 5,1, gelöst.
Die Säule
wurde gefahren und mit weiteren 18,7 l des gleichen Chromatographiepuffers
eluiert. Die Elution wurde mit 20 l 0,15 M Ammoniumacetatpuffer,
pH 5,1, und schließlich
mit 20 l 0,5 M Ammoniumacetatpuffer, pH 5,1, fortgesetzt. Die aktive
Fraktion, die durch Elution mit 0,5 M Ammoniumacetat (22 l) erhalten wurde,
wurde unter Rühren
zu einer Lösung
von 88 l 96%-igem Ethanol und 2200 ml Essigsäure gegeben. Der pH-Wert des Gemischs
betrug 5,7. Das Auftreten eines Niederschlags wurde beobachtet.
Das Gemisch wurde über
Nacht bei 2-8°C
im Kühlschrank
stehengelassen. Der Niederschlag wurde zentrifugiert, mit 96%-igem Ethanol
gewaschen und unter Vakuum 22 h getrocknet.
-
Bei
jedem der zwei äquivalenten
Verfahren wurden zwei Fraktionen F von 21,57 g bzw. 21,15 g erhalten.
-
2.2 Herstellung der Fraktion G
-
Die
in der obigen Stufe erhaltenen zwei Fraktionen F wurde zusammengebracht
und auf einer Säule entsprechend
dem oben beschriebenen Verfahren chromatographiert.
-
42,58
g der Fraktion F wurden in 650 ml 0,01 M Ammoniumacetatpuffer, pH
5,1, gelöst.
Die Säule
wurde mit dieser Lösung
gefahren und mit 6350 ml der gleichen Pufferlösung eluiert. Die Elution wurde
mit 12 l 0,05 M Ammoniumacetat, pH 5,0, und dann mit 10 l 0,2 M
Ammoniumacetat, pH 5, fortgesetzt. Die aktive Fraktion (4500 ml),
die mit dieser letzteren Lösung
eluiert wurde, wurde einem Ultrafiltrationsverfahren mit einer PM 10
(10 000 D) (Diaflo Ultrafilters, Amicon-Millipore)-Membran unterzogen.
Die Lösung
wurde gegen 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 5,7, konzentriert und
dialysiert, bis eine Konzentration von 2-4 g Protein in 150 ml Puffer
erhalten wurde. Das Endvolumen von 500 ml wurde bei -75°C eingefroren.
-
Die
Fraktion G wurde in Tieren biologisch getestet, wobei eine FSH-Wirkung
von 49 790 IU/ml und eine LH-Wirkung von 39 600 IU/ml detektiert
wurden. Mit dieser Analyse wurde es als notwendig erachtet, einen Teil
der Lösung
(100 ml) der Fraktion G unter Bedingungen zur Abtrennung von FSH
und LH (Fraktionen J2 bzw. J3) und den Rest (400 ml) unter Bedingungen,
dass beide Hormone nicht getrennt wurden, (J4) weiterzuverarbeiten.
-
Aliquots
der Fraktion J3 und der Fraktion J4 wurden dann gemischt, um ein
FSH:LH-Endverhältnis
von etwa 1:1 zu erhalten (Fraktion KM).
-
2.3 Herstellung der Fraktion J
-
i) Herstellung der Fraktionen J2 (hoch
gereinigtes FSH) und J3 (hoch gereinigtes LH):
-
Ammoniumsulfat
wurde zu einem Aliquot der Fraktion G (80 ml) bis zu einer Konzentration
von 1 M gegeben. Diese Lösung
wurde in der Phenyl-Sepharose-HP-Chromatographiesäule gefahren
und mit 2 Volumina Puffer, 50 mM Natriumphosphat, 1 M Ammoniumsulfat,
pH 5,1, eluiert. Die Elution wurde dann mit 2 Volumina Puffer, 50
mM Natriumphosphat, 0,5 M Ammoniumsulfat, pH 5,1, und schließlich mit
2 Volumina 50 mM Natriumphosphat (60% (V/V)) und 96% Ethanol (40%
(V/V)) fortgesetzt.
-
Die
FSH-aktive Fraktion, die mit Puffer, 50 mM Natriumphosphat, 0,5
M Ammoniumsulfat, pH 5,1, eluiert wurde (Fraktion J2), wurde unter
Verwendung von Membran-Ultrafiltration mit einer PM-10-Membran (Diaflo
Ultrafilters, Amicon-Millipore) gegen einen 50 mM Natriumphosphatpuffer,
pH 5,7, dialysiert und konzentriert und dann bei -75°C eingefroren.
-
Die
LH-aktive Fraktion, die mit 50 mM Natriumphosphatpuffer (60% (V/V))
und 96%-igem Ethanol (40% (V/V)) eluiert wurde, (Fraktion J3) wurde
unter Verwendung von Membran-Ultrafiltration
mit einer PM-10-Membran (Diaflo Ultrafilters, Amicon-Millipore)
gegen einen 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 5,7, dialysiert und
konzentriert und dann bei -75°C
eingefroren.
-
ii) Herstellung der Fraktion J4 (hoch
gereinigte Menotropine)
-
Zu
einem zweiten Aliquot der Fraktion G (400 ml) wurde Ammoniumsulfat
zugegeben, bis eine Konzentration von 1 M erhalten wurde. Diese
Lösung
wurde in einer Phenyl-Sepharose-HP-Chromatographiesäule gefahren
und mit 2 Volumina Puffer, 50 mM Natriumphosphat, 1 M Ammoniumsulfat,
pH 5,1, eluiert. Die Elution wurde mit 2 weiteren Volumina von 50
mM Phosphatpuffer (60% (V/V)) und 96%-igem Ethanol (40 (V/V)) fortgesetzt.
Die mit diesem Puffer eluierte Fraktion (Fraktion J4) wurde bei
-75°C eingefroren.
-
2.4 Herstellung der Fraktion K
-
Die
Fraktionen J3 (50 ml) und J4 (30 ml) wurden aufgetaut, über eine
0,45-μm-Membran
unter zur Gewinnung eines sterilen Produkts notwendigen Bedingungen
filtriert (Endvolumen 110 ml) und dann unter Rühren zu 4 Volumina 96%-igem
Ethanol (440 ml) und ausreichend Essigsäure zum Erreichen eines pH-Werts
von 5,5 (1 ml) gegeben.
-
Die
Fraktion J2 (50 ml) wurde aufgetaut, über eine 0,45-μm-Membran unter zur
Gewinnung eines sterilen Produkts notwendigen Bedingungen filtriert
(Endvolumen 70 ml) und dann unter Rühren zu 4 Volumina 96%-igem
Ethanol (280 ml) und ausreichend Essigsäure zum Erreichen eines pH-Werts
von 5,5 (0,5 ml) gegeben.
-
Die
Fraktionen wurden über
Nacht bei 2-8°C
im Kühlschrank
ausfallen gelassen. Am nächsten
Morgen wurde der Niederschlag hoch gereinigter Menotropine, der
aus den Fraktionen J3 und J4 erhalten wurde, durch Zentrifugation
abgetrennt und unter Vakuum getrocknet, bis Ethanol entfernt war
und die Feuchtigkeit weniger als 5% betrug (Fraktion KM,
5,71 g).
-
Der
aus der J2-Fraktion erhaltene Niederschlag von hoch gereinigtem
FSH wurde durch Zentrifugation abgetrennt und unter Vakuum getrocknet,
bis Ethanol entfernt war und die Feuchtigkeit weniger als 5% betrug (Fraktion
KF, 0,70 g).
-
2.5 Ergebnisse
-
Die
biologische Analyse, die mit den Fraktionen K
M (hoch
gereinigte Menotropine) und K
F (hoch gereinigtes
FSH) durchgeführt
wurde, zeigte die folgenden Ergebnisse:
2.6
Ausbeutetabelle
-
Hoch
gereinigte Produkte wurden auch unter Verwendung des Verfahrens
der vorliegenden Erfindung ausgehend von weniger aktiven Materialien
erhalten. In diesem Fall wurde ein FSH von etwa 5 000 IU/mg Protein
und Menotropine einer Wirkung von etwa 2 500 IU/mg Protein für sowohl
FSH als auch LH erhalten.
-
2.7 Charakterisierung der erhaltenen Produkte
-
Die
Fraktionen KM und KF wurden
durch die folgenden Techniken charakterisiert:
- 2.7.a)
Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE)
- 2.7.b) Polyacrylamidgelelektrophorese und anschließend Western-Blot-Analyse
- 2.7.c) Isoelektrofokussierung
- 2.7.d) Größenausschlusschromatographie
(SEC) in HPLC
- 2.7.e) Proteingehaltsermittlung
- 2.7.f) Biologische Wirksamkeitsdosierung in tierischen Lebewesen
(Vorinformation)
-
2.7.a) Polyacrylamidgelelektrophorese
(PAGE)
-
Die
Fraktionen KM und KF wurden
durch Elektrophorese nach dem folgenden Verfahren analysiert:
- Einrichtung:
Ultrathin Polyacrylamid Gel Electrophoresis System, PhastSystem
(Amersham Pharmacia Biotech).
- Gele: Phast Gel Gradient 8-25 (Amersham Pharmacia Biotech).
- Puffer: Pufferstreifen/SDS (Amersham Pharmacia Biotech).
- Trennungstechnik: File 110, PhastSystem, SDS-Page
- Entwicklungstechnik: File 200, PhastSystem für Coomassie Brilliant Blue.
- Sonden für
niedriges Molekulargewicht: Electrophoretic Calibration Kit, das
6 gereinigte Proteine enthält (Amersham
Pharmacia Biotech).
-
-
Jede
Kitampulle enthält
ein lyophilisiertes Gemisch mit etwa 100 μg der einzelnen Proteine. Jede
Ampulle wurde in 100 μl
Probenpuffer gelöst.
-
Probenpuffer:
-
250
mg SDS und 0,5 ml β-Mercaptoethanol
wurden in 10 ml Puffer A gelöst.
-
-
Die
Proben wurden so gelöst,
dass die Endkonzentration 1100-1300 FSH IU/ml Probenpuffer betrug.
-
Probenbehandlung
-
Die
Probe wurde 5 min bei 100°C
erhitzt. Bromphenolblau wurde zugegeben, bis eine Konzentration von
0,01% erhalten wurde.
-
Nach
der Elektrophoresedurchführung
und der Entwicklung wurden die Gele mit Heißluft getrocknet.
-
Erhaltene Ergebnisse
-
Die
Elektrophoresedurchführungen
der Fraktionen K
M (
2) und K
F (
3) ergaben
als Ergebnis ein Profil, wobei in fast ausschließlicher Weise ein mit Brilliant
Coomassie Blue entwickeltes einziges Band mit einer Migrationsstrecke
in der Mitte zwischen den Molekulargewichtsstandards 20 100 D und
30 000 D beobachtet wurde, was ein näherungsweises Molekulargewicht
von 25 000 D anzeigt.
Probe | Rf |
Std.
20 100 D | 0,196 |
Fraktionen
KM-KF | 0,250 |
Std.
30 000 | 0,300 |
-
Die
Zuordnung der beobachteten Bande bei der Elektrophorese der Fraktionen
KF und KM wurde
auf zwei Weisen durchgeführt:
- a) durch Vergleich mit 2 Handelsprodukten,
die FSH als einzigen Wirkstoff enthalten: Gonal-F (Serono), das FSH
gentechnischer Herkunft enthält,
Metrodine HP (Serono), das aus Harn stammendes FSH enthält (siehe 4).
- b) durch Elektrophorese-Western-Blot wie in 2.7.b) angegeben.
-
2.7.b) Polyacrylamidgelelektrophorese
und anschließend
Western-Blot-Analyse
-
Die
Proben der Fraktionen KM und KF wurden
durch Western-Blot
analysiert. Nach der Durchführung eines
Polyacrylamidelektrophoreseverfahrens in einem dem oben in 2.7.a)
beschriebenen ähnlichen
Gradienten wurden die Banden auf einen Nitrocelluloseträger überführt und
durch Antikörperwirkung
entwickelt. Spezifische Antikörper
für Kette-β-FSH, Kette-β-LH und gegen
die Kette α beider
Hormone wurden verwendet.
- – Technik: Die Transfertechnik
Nr. 221 wurde für
das PhastSystem (Amersham Pharmacia Biotech) unter Verwendung des
im folgenden angegebenen Transferpuffers verwendet:
Transferpuffer:
Tris 25 mM, Glycin 192 mM, pH 8,3, der 20% Methanol enthält.
Membran:
Probind 45, 0,45-μm-Poren
Transferbedingungen:
25 V, 25 mA, 1 W, 45 min
Angefärbt mit Coomassie Blue:
Färbungslösung: 0,1%-ige
Lösung
von Phast Gel Blue R in Methanol 30% und Essigsäure 10% in destilliertem Wasser.
Endlösung: Mischung
von 1 Teil der Färbungslösung mit
1 Teil Essigsäure
20% in destilliertem Wasser.
Verfahren: Färbung der Membran in der Endlösung während 30
min unter leichtem Rühren.
Waschen der Membran zweimal mit einer Lösung von Methanol:Wasser:Essigsäure (30:60:10)
und dann mit Essigsäure 20%.
- – Detektionsverfahren:
Das Detektionsverfahren durch Streptavidin/Biotin wurde verwendet.
Verwendeter
Puffer: PBS (Natriumphosphat 0,01 M, Natriumchlorid 0,25 M, pH 7,6).
Blockierungslösung: Albumin
5% in PBS.
Waschlösung:
a) Albumin 5% in PBS, b) PBS.
- – Primäre Antikörperlösung: Die
folgenden primären
Antikörper
wurden verwendet.
- 1) monoklonaler Anti-β-LH-Antikörper (Immunotech)
(Ige1-Mäuse), Katalognr.
0374.
- 2) monoklonaler Anti-β-FSH-Antikörper (Immunotech)
(Ige1-Mäuse), Katalognr.
0373.
- 3) monoklonaler Antikörper
gegen die α-Untereinheit
von Hypophysenhormonen (Immunotech) (IgG1-Mäuse), Katalognr. 0375.
- – Verdünnung: Verdünnen des
primären
Antikörpers
1:100.
- – Sekundäre Antikörperlösung: Der
verwendete sekundäre
Antikörper
war: Biotin-SP-conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment
Goat Anti-Mouse IgG (H+L) (schwere Kette und leichte Kette) (Immunotech,
Katalognr. 0816) 1:500 in PBS verdünnt.
- – Lösung von
peroxidasekonjugiertem Streptavidin: Eine 1:500-Verdünnung von
Peroxidase-conjugated Streptavidine (Immunotech, Katalognr. 0309)
in PBS wurde verwendet.
- – Entwicklungslösung: Horseradish
Peroxidase conjugate substrate kit (Bio Rad, Katalognr. 170-6431),
das ein Lösungsgemisch
von oxygeniertem Wasser, 4-Chlor-1-naphtol und Puffer zur Entwicklung
der Farbe enthielt, wurde zur Herstellung von 1 l Lösung verwendet.
- – Kurze
Beschreibung des Verfahrens:
- 1) Inkubieren der Membran mit Blockierungslösung über Nacht.
- 2) Waschen mit der Waschlösung
a) zweimal während
jeweils 5 min.
- 3) Inkubieren mit primärer
Antikörperlösung über Nacht.
- 4) Waschen mit der Waschlösung
a) dreimal während
jeweils 5 min.
- 5) Inkubieren mit sekundärem
Antikörper
während
1 h.
- 6) Waschen mit der Waschlösung
a) dreimal während
jeweils 5 min.
- 7) Inkubieren mit konjugierter Peroxidase während 30 min.
- 8) Waschen mit der Waschlösung
a) dreimal während
jeweils 5 min.
- 9) Inkubieren mit Entwicklungslösung während 10 min.
- 10) Stoppen der Reaktion.
-
Ergebnisse
-
Nach
Durchführung
der Polyacrylamidgelelektrophorese der Fraktionen KM und
KF wurden die Banden nach der oben angegebenen
Technik auf Nitrocellulosemembranen übertragen und entwickelt. Die
folgenden Ergebnisse wurden ermittelt.
-
-
Im
Hinblick auf diese Ergebnisse wird gefolgert, dass die Bande, die
mit Coomassie Blue bei der Elektrophorese der Fraktion KM entwickelt wurde, sowohl FSH- als auch
LH-Aktivitäten aufwies.
Statt dessen reagierte die Fraktion KF nur
positiv auf den spezifischen Antikörper für FSH und nicht für LH. Da
bekannt ist, dass die α-Kette
von FSH und LH gleich ist, zeigten beide Fraktionen KM und
KF eine positive Reaktion mit einem Antikörper gegen
die α-Kette.
-
2.7.c) Isoelektrofokussierung
-
Die
Fraktionen KM (hoch gereinigtes FSH) und
KF (hoch gereinigtes FSH) wurden durch Isoelektrofokussierung
nach dem folgenden Verfahren analysiert:
- Einrichtung: Ultrathin
Polyacrylamid Gel Electrophoresis System, PhastSysetm (Amersham
Pharmacia Biotech).
- Gele: Phast Gel IEF 3-9 (Amersham Pharmacia Biotech).
- Trennungstechnik: File 100, PhastSystem.
- Entwicklungstechnik: Silver Kit (Amersham Pharmacia Biotech).
- PI-Standards: IEF Calibration Kit; Broad pI Kit 3-10 (Amersham
Pharmacia Biotech). Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor, pI 5,85 (Sigma).
Rinder-Carboanhydrase, pI 4,55 (Sigma).
-
Probenbehandlung
-
Die
Proben wurden so gelöst,
dass sie eine Konzentration von 2,5 mg/ml bis 1,25 mg/ml aufwiesen.
-
Nach
der Elektrophoresedurchführung
und der Entwicklung wurden die Gele mit Heißluft getrocknet.
-
Erhaltene Ergebnisse
-
Die
pI-Verteilung für
sowohl KF (hoch gereinigtes FSH) als auch
KM (hoch gereinigte Menotropine) sind in 5 und 6 angegeben.
Die saure Natur der Gonadotropine wird durch das IEF-Muster bestätigt. Tatsächlich sind,
wie in der Literatur vollständig
beschrieben wird, Isoformen auf den sauren Bereich beschränkt.
-
2.7.d) Größenausschlusschromatographie
(SEC) in HPLC
-
Beschreibung der Einrichtung:
-
- – Hochleistungsflüssigchromatograph
von Shimadzu, LC-10AVP,
mit manueller Injektionsvorrichtung 7725i, mit Positionssensor und
Schleife von 20, 50 oder 200 μl,
Rheodyne.
- – UV-visible
Spectrophotometer detector, Modell SPD-10AVP, Shimadzu (190-600 nm).
- – Arbeitsplatz
zur Verarbeitung chromatographischer Daten Shimadzu Class-CR 10,
Program Class CR 10 und Modul CBM-101.
- – Chromatographiesäule Bio-Rad,
Bio-SilTM SEC250 (300 × 7,5 mm )
- – Mobile
Phase: Natriumacetat 0,1 M Puffer, pH 7,0, entgast und filtriert
- – Durchfluss:
1,0 ml/min.
Detektion: UV bei 220 nm.
Säulentemperatur:
Raumtemperatur
Injektionsvolumen: 50 bis 200 μl.
Probenvorbereitung:
Injektion von etwa 1 ml der mobilen Phase in die die Probe enthaltende
Ampulle, Rühren
bis zur Auflösung.
-
Ergebnisse:
-
Die
im folgenden angegebenen Chromatogramme der Fraktionen KM und KF zeigten
das Vorhandensein von nur einem Peak mit einer Retentionszeit von
etwa 8,1-8,2 s. Die Retentionszeit fällt mit der durch Chromatographie
eines kommerziellen Produkts, Gonal-F (Serono), das rekombinantes
FSH enthält,
erhaltenen zusammen. (Siehe die 7, 8 und 9)
-
2.7.e) Proteindosierung
-
- Verfahren: Verfahren nach Lowry [Journal of Biological Chemistry
193, 265 (1951)] mit einem Folin-Ciocalteu-Reagens und einer Standardkurve für Albumin.
- Ergebnisse: Der Proteinprozentgehalt für die beiden, in den Beispielen
1 und 2 angegebenen Fraktionen KM und KF betrug etwa 77%.
-
2.7.f) Biologische Wirksamkeitsdosierung
in Tieren
-
Wie
in Abschnitt 2.5 zuvor berichtet wurde, wurden die Fraktionen KM und KF in Ratten
biologisch analysiert.
-
Verfahren:
-
2.7.f.1) Biologische Wirksamkeitsdosierung
von FSH
-
Das
Steelman-Pohley-Verfahren [S. L. Steelman & F. M. Pohley, Endocrinology 64,
604 (1953)] der Eierstockge wichtszunahme wurde bei unreifen, 21-24
Tage alten weiblichen Ratten, die drei Dosen eines FSH enthaltenden
Produkts injiziert erhielten, verwendet. Die Dosen sollten ein derartiges
Verhältnis
einhalten, dass die Differenz zwischen den Logarithmen der größeren Dosis
und der mittleren Dosis gleich der Differenz zwischen den Logarithmen
der mittleren Dosis und der kleineren Dosis ist. Tierlose wurden
verwendet, bei denen die Gewichtsdifferenz zwischen dem schwersten
und dem leichtesten Tier nicht mehr als 10 g betrug. Die Tiere erhielten
subkutan während
drei Tagen drei verschiedene Dosen der Probe, die in Phosphat/Albumin-Puffer
gelöst
war, und entsprechende Dosen eines Standards injiziert. Am fünften Tag
wurden die Tiere getötet,
die Eierstöcke
extrahiert und gewogen. Die mit einer Probe erhaltenen Daten wurden
mit den mit dem Standard erhaltenen Daten verglichen und die Wirksamkeit
der verschiedenen Proben wurde unter Verwendung des für die Analyse
einer Probe gegenüber
einem Standard in einem 3×3-Test
angegebenen statistischen Schema berechnet (siehe biologische Analyse
von USP XXIII).
-
2.7.f.2) Biologische Wirksamkeitsdosierung
von LH
-
Das
Verfahren der Gewichtszunahme der Bläschendrüse bei unreifen, 21-24 Tage
alten männlichen Ratten,
die drei Dosen eines LH enthaltenden Produkts injiziert erhielten,
wurde verwendet. Die drei Dosen sollten ein derartiges Verhältnis einhalten,
dass die Differenz zwischen den Logarithmen der größeren Dosis und
der mittleren Dosis gleich der Differenz zwischen den Logarithmen
der mittleren Dosis und der kleineren Dosis ist. Tierlose wurden
verwendet, bei denen die Gewichtsdifferenz zwischen dem schwersten
und dem leichtesten Tier nicht mehr als 10 g betrug. Die Tiere erhielten
subkutan während
drei Tagen drei verschiedene Dosen der Probe, die in Phosphat/Albumin-Puffer
gelöst
war, und entsprechende Dosen eines Standards injiziert. Am fünften Tag
wurden die Tiere getötet,
die Bläschendrüsen extrahiert
und gewogen. Die mit einer Probe erhaltenen Daten wurden mit den
mit dem Standard erhaltenen Daten verglichen und die Wirksamkeit
der verschiedenen Proben wurde unter Verwendung des für die Analyse
einer Probe gegenüber
einem Standard in einem 3×3-Test
angegebenen statistischen Schema berechnet (siehe biologische Analyse
von USP XXIII).
-
Der
verwendete Standard war eine Probe von Menotropinen, die gegenüber dem
3. internationalen Standard von Harn-FSH und -LH, der durch das
NIBSC (National Institute for Biological Standards and Control – Great
Britain) in Abhängigkeit
von der WHO (World Health Organization) erstellt wurde, geeicht
war.
-
Beispiel 3: Pharmazeutische Zubereitungen,
die nach dem Verfahrensgegenstand der Erfindung erhalten wurden
-
Hoch
gereinigte injizierbare Menotropinrezeptur:
Streckmittel, die
in der Zusammensetzung verwendet werden können, sind Lactose, Mannit
und Gemische derselben. Andere herkömmliche Streckmittel können ebenfalls
verwendet werden.
-
In
der vorliegenden Erfindung wurde Lactose als Streckmittel in der
injizierbaren Zubereitung verwendet.
-
Der
pH-Wert der Zubereitung kann auf einen Wert im Bereich von 6,0-7,0
durch Zugabe von Säuren oder
Basen (Phosphorsäure
oder andere und/oder Natriumphosphat oder andere) werden.
-
3-ml-Borosilicatglasampullen
des Typs I mit Brombutylstopfen werden als Behälter verwendet.
-
Zubereitung einer Charge von 5000 Ampullen
-
Die
berechnete Menge von Menotropinen hoher Reinheit (mit 10% Überschuss)
wird in 500 ml Wasser zu Injektionszwecken gelöst. Andererseits werden 100
g Lactose in 4 l Wasser zu Injektionszwecken gelöst. Beide Lösungen werden gemischt, der
pH-Wert wird, falls nötig,
durch die Zugabe einer Säure
oder Base eingestellt, die gebildete Lösung wird auf 5000 ml aufgefüllt und
durch Filtration durch eine 0,2-μm-Membran
sterilisiert. Die Ampullen werden mit der zubereiteten Lösung (1
ml) gefüllt
und in einen sterilen Gefriertrockner bei einer Temperatur von -40°C über mindestens
8 h geladen. Die Gefriertrocknung beginnt durch Erhitzen mit 3°C/h bis zu
einer Temperatur von +30°C,
die bis zum Ende des Zyklus beibehalten wird.
-
Das
vorliegende Beispiel wird in ähnlicher
Weise zur Zubereitung von hoch gereinigtem Follitropin angewandt.