DE60034117T2

DE60034117T2 - Verfahren zur herstelllung von gonadotropin-zusammensetzungen

Info

Publication number: DE60034117T2
Application number: DE60034117T
Authority: DE
Inventors: Claudio Fernando Wolfenson Band; Liliana Ester Balanian; Jose Felipe Groisman; Erundina Marta Fasanella
Original assignee: Instituto Massone SA
Current assignee: Instituto Massone SA
Priority date: 1999-04-16
Filing date: 2000-04-14
Publication date: 2007-12-13
Anticipated expiration: 2020-04-15
Also published as: BR0010677A; ES2284494T3; DE60034117D1; DK1169349T3; EP1169349A2; ATE358139T1; BR0010677B1; BRPI0010677B8; PT1169349E; AU779005B2; JP4574865B2; EP1169349B1; WO2000063248A2; CA2370225A1; WO2000063248A3; CA2370225C; CY1107666T1; AU4549100A; MXPA01010522A; JP2002542260A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Gonadotropinzusammensetzungen, insbesondere FSH (follikelstimulierendes Hormon: Follitropin)- und Menotropinzusammensetzungen hoher biologischer Aktivität und ein Verfahren zur Herstellung dieser Zusammensetzungen aus humanem Harnrohstoff menopausaler oder postmenopausaler Frauen. Die erhaltene chemische Reinheit ist größer als 95% nach der Messung durch HPLC, während die spezifische biologische Aktivität größer als 2500 IU/mg Protein für sowohl FSH- als auch LH-Hormone für die Menotropinzusammensetzung (humane Menopausengonadotropine, HMG) und mehr als 5000 IU/mg Protein für FSH beträgt.
Hintergrund der Erfindung
Der Ausdruck "Menotropine" wird für eine Hormonkombination verwendet, die aus dem Harn von menopausalen und postmenopausalen Frauen erhalten wird, die zwei Glykoproteinhormone: follikelstimulierendes Hormon und luteinisierendes Hormon umfasst. Diese zwei Hormone werden von der Hypophyse sezerniert und anschließend metabolisiert und im Harn ausgeschieden.
Menotropine und Follitropin werden seit langem bei der therapeutischen Behandlung von Fruchtbarkeitsstörungen verwendet.
Die Rolle von FSH besteht in der Wirkung auf die Ovarialfollikel, der Förderung von deren schnellem Wachstum und Reifung mit anschließender Ovulation oder Atresie. FSH ist zusammen mit LH auch an der Biosynthese von Östradiol in den Ovarialfollikeln, die es stimuliert hat, beteiligt. Die innere Theca ist der Hauptort der Follikelbiosynthese von Androgen, die unter der Kontrolle von LH steht. Unter der Kontrolle von FSH wird dieses Androgen dann in den Granulosazellen aromatisiert und in den Blutstrom ausgeschieden. Daher ist LH zusammen mit FSH ein wichtiger Bestandteil bei der Follikelstimulation.
Die Hypophysenhormone FSH und LH, Thyrotropin (TSH) und das Plazentahormon humanes Choriongonadotropin (HCG) sind nahe verwandt, da alle derselben Glykoproteine sind, die in deren Struktur zwei als α und β bezeichnete Untereinheiten aufweisen. Beide Untereinheiten sind durch nichtkovalente Interaktion gebunden. Diese Untereinheiten besitzen getrennt keine biologische Aktivität. Die α-Ketten der vier oben genannten Hormone sind gleich, während die β-Ketten verschieden sind und eine für jedes Hormon charakteristische biologische Aktivität verleihen. Jedoch sind wichtige Teile der β-Kette ebenfalls gleich, was insbesondere bei β-Ketten von LH und HCG beobachtet werden kann.
Gonadotropine, die aus humanem Harn erhalten wurden, wurden partiell gereinigt, bis sie Eigenschaften der biologischen Sicherheit erreichten, die mit den Anforderungen für ein injizierbares pharmazeutisches Produkt kompatibel sind, und sie werden seit mehr als 30 Jahren zur Lösung von Unfruchtbarkeitsproblemen kommerziell verwertet; wobei sie in der Form einer injizierbaren pharmazeutischen Zubereitung in den wichigsten Pharmakopoeias auf der Welt aufgelistet und zur pharmazeutischen Verwendung in praktisch allen Ländern auf der ganzen Welt zugelassen sind.
Die Zusammensetzung der Follitropinzubereitung kann wie im folgenden beschrieben werden:

– Follikelstimulierendes Hormon: 75 oder 150 internationale Einheiten FSH
– Streckmittel (für den Lyophilisierungsprozess erforderlich, allgemein 5–20 mg Lactose) und andere nichtaktive Proteine.

Die Zusammensetzung der Menotropinzubereitungen kann wie im folgenden beschrieben werden:

– Follikelstimulierendes Hormon: 75 oder 150 internationale Einheiten FSH
– Luteinisierendes Hormon: 75 oder 150 internationale Einheiten LH
– Streckmittel (für den Lyophilisierungsprozess erforderlich, allgemein 5-20 mg Lactose) und andere nichtaktive Proteine.

Die internationalen Einheiten von FSH und LH werden durch Ermittlung der biologischen Aktivitäten in Ratten in Bezug auf einen internationalen Standard, der durch das National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC), das von der World Health Organization abhängt, hergestellt wurde, berechnet.
Die Anforderung, die von Pharmakopoeias wie der United States Pharmacopoeia (USP XXIII) oder der British Pharmacopoeia (BP) in Bezug auf die Reinheit des Ausgangsmaterials, das für die Herstellung injizierbarer Menotropine erforderlich ist, gestellt wird, besteht in einem Ausgangsmaterial mit einer FSH-Aktivität von größer als 40 IU/mg und einer LH-Aktivität von größer als 40 IU/mg. Im Hinblick darauf wurden die Ausgangsmaterialien, die bisher verwendet wurden, durch ein Herstellungsverfahren erhalten, das eine Aktivität im Bereich von 70-150 IU FSH/LH pro mg sicherstellt, was mehr als genug ist, um die durch die Gesundheitsorganisationen gestellten Anforderungen, sofern die biologische Sicherheit und Wirksamkeit betroffen sind, zu erfüllen.
Jedoch beeinflussten die jüngsten Entwicklungen in Bezug auf Reinigungstechniken und die Entwicklung von Gonadotropinen gentechnischer Herkunft den Bedarf an Zubereitungen von hoch gereinigten nativen Gonadotropinen der Herkunft aus Harn ohne das Vorhandensein verunreinigender Proteine.
FSH- und LH-Reinigungsverfahren wurden in der Vergangenheit beschrieben.
EP 0 322 348 B1 und die äquivalenten US-Patente 5 128 453, 5 767 067 und 5 840 857 betreffen die Herstellung von follikelstimulierendem Hormon mit hoher spezifischer Aktivität der Herkunft aus Harn. Jedoch umfassen diese Verfahren eine Stufe mit spezifischen monoklonalen Antikörpern. Vom Standpunkt der Sicherheit her wirft diese Tatsache Probleme in Bezug auf die Kontamination des Produkts mit heterologen Proteinen, DNA-Resten aus der Wirtszelle und Viren auf. Obwohl Verfahrensvalidierungen und Endtests dazu beitragen können, die Möglichkeit einer potentiellen Kontamination auszuschließen, ist die Beurteilung, dass ein Verfahren, das speziell gestaltet ist, um die Verwendung biologischer Reagentien zu vermeiden, höhere Sicherheitsstandards aufweist als eines, das diese Art einer Reinigungsstufe umfasst, begründet.
Die Patentanmeldung WO 98/20039 beschreibt ein Trennungs- und Reinigungsverfahren von FSH und LH, das die Verwendung biologischer Reagentien vermeidet. Jedoch schließt dieses Verfahren aufgrund des sehr hohen FSH:LH-Verhältnisses des verwendeten Ausgangsmaterials und der erhaltenen Produkte die Möglichkeit aus, Menotropine zu erhalten, eine Zubereitung, die ein FSH:LH-Verhältnis von etwa 1:1 erfordert.
Darüber hinaus fehlt der WO 98/20039 eine Charakterisierung der erhaltenen Gonadotropine als biologisch aktives Mate rial, was ein wesentlicher Punkt für ein therapeutisches Produkt ist. Diese Patentanmeldung verwendet ein immunradiometrisches Verfahren zum Testen der Aktivität, ein Bestimmungsverfahren, das große Probleme in Bezug auf dessen Genauigkeit aufwirft.
Tatsächlich ist seit langem bekannt, dass die Strukturheterogenität von FSH- und LH-Isoformen große Auswirkung auf die biologische Aktivität und immunologische Reaktivität beider Hormone hat [Costagliola et al., J. Endocrinol. Invest. 17, 201 (1994)]. Beobachtete Unterschiede der Bio- und Immunqualitäten von FSH und LH legen nahe, dass getrennte Struktureinheiten von den Bioassays gegenüber dem Immunoassay erkannt werden. Es wurde sorgfältig diskutiert, dass Immunoassays nicht konsistent eine gute Abschätzung des Bioaktivitätsniveaus von Gonadotropinen ergeben und nicht zwangsläufig die biologische Aktivität widerspiegeln [Dahl und Stone, J. Andrology, 13, 11 (1992); Rose et al., Endocrine Reviews, 21, 5 (2000)].
Andererseits werden Bioassays als geeigneter Test zur Feststellung der Hormonaktivität betrachtet, da sie zwei wichtige Komponenten berücksichtigen, die in anderen Methoden nicht vorhanden sind: die biologische Wirkung am Zielgewebe und die biologische Clearance [Rose et al., Endocrine Reviews, 21, 5 (2000)]. Diese Tatsache macht den In-vivo-Bioassay obligatorisch zur Eichung von Therapeutikazubereitungen [Rose, Clinica Chimica Acta 273, 103 (1998)].
Es muss auch unterstrichen werden, dass der WO 98/20039 eine Charakterisierung der Gonadotropine als chemisch reiner Arzneistoff fehlt, da kein Analyseverfahren zur Stützung dieser Tatsache präsentiert wird.
Die vorliegende Erfindung präsentiert eine vollständige Charakterisierung der Gonadotropine nicht nur durch den Umfang der biologischen Aktivität, sondern auch vom analytischen Standpunkt durch Einführen eines empfindlichen Analyseverfahrens zum Testen der Reinheit. Da die zur Feststellung der FSH- und LH-Aktivität in der vorliegenden Erfindung verwendeten Assays in allen Fällen In-vivo-Bioassays sind, für die seit langem erwiesen ist, dass sie ein robuster spezifischer Test zur Sicherstellung von biologischer Aktivität sind, kann die Wirksamkeit des FSH und des LH für die jeweiligen erhaltenen Gonadotropine und auch deren Verhältnis sicher festgestellt werden.
Ein zweiter zu berücksichtigender Punkt besteht darin, dass das oben genannte Patent (WO 98/20039) die Verwendung von Affinitätsfarbstoffchromatographie zur Reinigung von Gonadotropinen beschreibt. Dieses Verfahren könnte Probleme im Hinblick auf eine potentielle Kontamination des Produkts durch das Austreten des Farbstoffs ergeben. Diese Art von Fremdverbindungen ist bei in Menschen zu injizierenden Produkten nicht erwünscht [Protein Purification von R. K. Scopes, Springer-Verlag, New York Inc; 2. Auflage, Seite 156 (1998)]. Da die vorliegende Erfindung so gestaltet wurde, dass dieser Chromatographietyp ausgeschlossen ist, ist das Farbstoffkontaminationsproblem ein vollständig vermiedenes Problem.
Derzeitige Menotropine (das kommerziell erhältliche Produkt) können an dem Nachteil potentieller lokaler allergischer Reaktionen, wenn sie subkutan verabreicht werden, aufgrund des Vorhandenseins von Proteinkontaminationsstoffen leiden.
Diese Erfindung stellt ein Verfahren zur Reinigung und Zubereitung der ersten, kommerziell erhältlichen Gonadotropinprodukte hoher Reinheit bereit. Diese Methodik wurde speziell so gestaltet, dass die Verwendung biologischer Reagentien, wie Antikörper, Rezeptoren und andere heterologe Materialien, und von Chromatographiefarbstoffen vermieden wird. Neben dem Sicherheitsaspekt ermöglicht die Verwendung nichtspezifischer Stufen während der Isolierung die Gewinnung aller Isoformen, die in dem Ausgangsmaterial vorhanden sind.
Wie ausführlich beschrieben wurde, ist die Heterogenität bei den Glykoproteinhormonen von spezieller Bedeutung. Mindestens 20-30 verschiedene Isoformen von FSH, LH und TSH existieren (Wide, Acta Endocr., Copenh 109, 181-189, 1985). Diese Isoformen unterscheiden sich im Hinblick auf deren Molekulargewicht und Ladung. Obwohl Glykoproteinhormonisoformen hauptsächlich im Hinblick auf die Oligosaccharidstruktur variieren, können Mikroheterogenitäten auch durch Unterschiede in der Aminosäurezusammensetzung vorhanden sein (Costagliola et al., J. Endocrinol. Invest., 17, 291-299, 1994; Wilson et al., J. Endocrinol 125, 3-14, 1990).
Es ist allgemein akzeptiert, dass der Typ von isolierten verschiedenen Isoformen unter anderen Faktoren von der Isolierungstechnik abhängt (Cockburn et al., Biologicals 19, 257-264, 1991). Die Verwendung stark unterscheidender Techniken zur Isolierung, beispielsweise monoklonale Antikörper, kann zur Selektion von nur einem Teil der in der Materialquelle vorhandenen Isoformen beitragen. Da sie "zu spezifisch" sind, können einige biologisch aktive Gonadotropinvarianten durch die Antikörper nicht erkannt werden und verloren gehen (Costagliola et al., J. Endocrinol. Invest., 17, 291-299, 1994). Andererseits kann ein nichtselektiver Ansatz, beispielsweise der in diesem Patent beschriebene, zur Reinigung von allen, im Harn vorhandenen Arten von Isoformen verwendbar sein. Es wurde gezeigt, dass verschiedene Isoformen in Bezug auf die Interaktion mit den Zelloberflä chenrezeptoren und die Stoffwechselclearance variieren (Thotakura et al., Glycobiology 5, 3-10, 1995). Die Oligosaccharidstruktur steht unter der Kontrolle verschiedener physiologischer Faktoren. Vom therapeutischen Standpunkt aus ist es interessant, ein Produkt zu erhalten, in dem alle im Harn vorhandenen Isoformen verfügbar sind. Auf diese Weise ergeben die hier beschriebenen hoch gereinigten Produkte die verschiedenen Rollen von natürlich vorkommenden Gonadotropinisoformen bei der Aufrechterhaltung der Reproduktionsfunktion.
Es muss auch unterstrichen werden, dass die vorliegende Anmeldung die erste Charakterisierung einer hoch gereinigten Zubereitung von Menotropinen ist, die nicht nur durch deren hohe biologische Wirksamkeit, sondern auch durch relevante Screeningverfahren (PAGE-Elektrophorese, HPLC, Größenausschlusschromatographie) festgestellt wurde.
Nachdem diese natürlich vorkommenden FSH- und LH-Moleküle in einer gereinigten Qualität und in einem großen Maßstab verfügbar sind, können sie dann untersucht und sorgfältig analysiert werden. Die dreidimensionale Struktur der Hormone kann zu einem besseren Verständnis der Rolle der Oligosaccharide beitragen.
Das Verfahren zur Gewinnung von derzeit produzierten Menotropinen ist bekannt. Wie in BP 1980 angegeben ist, können Menotropine aus dem Harn von postmenopausalen Frauen durch Kaolinadsorption, anschließende Alkalielution und Fällung mit 2 Volumina Aceton präpariert werden. Die erforderliche Fraktion wird aus dieser Fällung mit einer Ammoniumacetatlösung in 70% Ethanol extrahiert und dann mit einer 10%-igen Ammoniumacetatlösung in 90%-igem Ethanol ausgefällt. Das Menotropinprodukt wird durch Ionenaustauschchromatographie dieser Fällung erhalten.
Das Ausgangsmaterial, ab jetzt das "HMG-Quellenmaterial", das in der vorliegenden Erfindung zur Gewinnung hoch gereinigter Menotropine verwendet werden kann, bildet die Menotropinspezialität nach der Spezifikation in den Pharmakopoeias (USP XXIII, BP 1993 Addendum 1995, EP 1986) oder ein beliebiges anderes Material, das eng mit dieser Spezialität in Verbindung steht. Daher ist selbstverständlich, dass dieses Zubereitungsverfahren auch für andere Materialien, die nicht streng die für Menotropine anwendbaren Anforderungen erfüllen, verwendbar ist. Tatsächlich wurden zufriedenstellende Ergebnisse unter Verwendung der Fraktionen C (siehe Beschreibung der Erfindung, Beispiel 1 und Beispiel 2), die ein Material ist, das die Anforderung des FSH:LH-Verhältnisses der Menotropine (FSH:LH etwa 1:1) nicht erfüllt, erhalten. Darüber hinaus liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Einstellung des FSH:LH-Verhältnisses, wenn dies nötig ist, weshalb sie daher eine Spezialität hoch gereinigter Menotropine auch bei Verwendung von Ausgangsmaterialien, die außerhalb des korrekten FSH:LH-Verhältnisses sind, ergeben kann. Dank dessen ist es möglich, ein Produkt zu erhalten, das aus FSH und LH in dem passenden Verhältnis 1:1, das zur Herstellung der pharmazeutischen Zubereitung notwendig ist, besteht, ohne die beiden aktiven Prinzipien während der Reinigung zu trennen. Das heißt, es kann eine gleichzeitige Reinigung beider Hormone von einem Reinheitsgrad von etwa 5% im Ausgangsmaterial zu mehr als 95% im Endprodukt mit einer 25-35fach größeren Endwirksamkeit als die ursprüngliche erhalten werden. Der Reinigungsgrad, der erhalten wird, kann durch 1 sichtbar gemacht werden, die das Ergebnis einer Polyacrylamidgelelektrophorese des herkömmlichen pharmazeutischen Produkts gegenüber der neuen gereinigten Version, die durch Anwendung der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, zeigt.
Die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Stufen können nach einer von der hierin beschriebenen verschiedenen Reihenfolge verwendet werden, wobei dies kein Variieren der Philosophie der Erfindung impliziert. In gleicher Weise zufriedenstellende Ergebnisse wurden durch Einschieben des Harzes mit hydrophober Interaktion zwischen den zwei Ionenaustauschchromatographiestufen, die später beschrieben sind, erhalten.
Diese Erfindung stellt auch die getrennte Zubereitung von Harn-Gonadotropinen, d.h. FSH und LH, bereit.
Die Verabreichung von Zusammensetzungen von Menotropinen für therapeutische Zwecke wird hauptsächlich durch intramuskuläre Injektion durchgeführt. Diese Verabreichungsform erzeugt beim Patienten beträchtliche Beschwerden und erfordert regelmäßige Besuche eines Patienten in Klinikeinheiten, manchmal über Wochen oder Monate, um die Behandlung zu erhalten.
Eine subkutane Verabreichung ermöglicht eine Selbstverabreichung und infolgedessen eine Verbesserung der Patientenkooperation und -compliance.
Die subkutane Verabreichung von Harn-Gonadotropinen wurde bereits beschrieben (Y. Nakamura et al., Fertil Steril 51, 423-429, 1989; L. Engmann et al., Fertil Steril. 69, 836-840, 1998).
Die subkutane Verabreichung unreiner Zubereitungen kann an dem Nachteil lokaler Allergien aufgrund des Vorhandenseins von Verunreinigung in dem verwendeten Produkt leiden und folglich zu einer Beendigung der Behandlung führen. Daher ist es sinnvoll, Produkte hoher Reinheit zu produzieren, die die Möglichkeit dieser allergischen Reaktionen verringern können.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Zubereitung von FSH- und/oder LH-Zusammensetzungen hoher biologischer Aktivität aus humanem Harnrohstoff menopausaler oder postmenopausaler Frauen. Die chemische Reinheit ist nach der Messung durch HPLC größer als 95%, während die spezifische biologische Aktivität mehr als 2500 IU/mg Protein für das FSH und LH für Menotropine und mehr als 5000 IU/mg für Follitropin beträgt.
Die Zusammensetzungen, die nach dem Verfahrensgegenstand der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, können umfassen: ein beliebiges herkömmliches Streckmittel, wie Hexosen, Mannit und Gemische derselben, ein Stabilisierungsmittel, das aus der Gruppe von Albumin, Detergentien und Gemischen derselben ausgewählt ist.
Die erhaltenen injizierbaren Zusammensetzungen sind im wesentlichen frei von kontaminierenden Stoffen und können für subkutane Verabreichung angepasst werden.
Die Follitropin- und/oder Menotropinzusammensetzungen, die gemäß dem Verfahrensgegenstand der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, können zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung hoher biologischer Aktivität und chemischer Reinheit, die einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst oder auch nicht, verwendet werden.
Das Trennungs- und Reinigungsverfahren für humane Harn-Gonadotropine hoher biologischer Aktivität und chemischer Reinheit, die absolut frei von fremden kontaminierenden Materialien, die von der Verwendung von biologischen Reagentien oder Chromatographiefarbstoffen stammen, sind, ausgehend von einem Rohstoff von Gonadotropinen, die HMG-Quellenmaterial umfassen, umfasst hauptsächlich die folgenden Stufen:

(1) Reinigung der rohen Gonadotropine, die in 0,05-0,15 M Ammoniumacetat, pH 5,0-6,0, verdünnt sind, in einer Ionenaustauschsäule mit einem starken kationischen Harz des Sulfopropyltyps unter Elution von sowohl FSH als auch LH mit Lösungen von 0,05-0,5 M Ammoniumacetat, pH 5,0-7,0; und
(2) Reinigung dieser Fraktion, die in 0,01-0,05 M Ammoniumacetat, pH 5,0-7,0, verdünnt ist, in einer Ionenaustauschsäule mit einem starken anionischen Harz des quaternären Ammoniumtyps unter Elution von sowohl FSH als auch LH mit Lösungen von 0,05-0,2 M Ammoniumacetat, pH 5,0-7,0; und
(3) Reinigung von Gonadotropinen in einer Säule mit einem Harz mit hydrophober Wechselwirkung durch aufeinanderfolgende Zugabe von mindestens zwei der folgenden Lösungen:
a) Puffer aus 50-200 mM Natriumphosphat und 0,8-1,2 M Ammoniumsulfat, pH 5,0-6,0;
b) Puffer aus 50-200 mM Natriumphosphat und 0,4-0,6 M Ammoniumsulfat, pH 5,0-7,0;
c) Puffer aus 50-200 mM Natriumphosphat (50-70% (V/V)) und 96%-igem Ethanol (50-30% (V/V)),

Harze des Typs SP-Sepharose, Q-Sepharose und Harze mit hydrophober Interaktion können in diesen Stufen verwendet werden. Ein bevorzugtes Harz mit hydrophober Interaktion ist ein Phenyl-Sepharose-Harz.
Das Verfahren der Erfindung umfasst ferner sekundäre Stufen der Fällung, Zentrifugation, Ultrafiltration, Dialyse, des Waschens, Trocknens unter Vakuum und Kühlens. Die letzte Stufe dieses Verfahrens kann selektiv so durchgeführt werden, dass Fraktionen erhalten werden, die nur Menotropine, FSH- oder LH-Aktivitäten aufweisen.
Einer der Hauptvorteile des Verfahrens der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass das Verfahren keine biologischen Reagentien und Substrate umfasst und dass das Produkt frei von verunreinigenden Biomaterialien ist.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Ausgangsmaterial zur Produktion von hoch gereinigten Menotropinen und hoch gereinigtem FSH wird im wesentlichen durch ein sehr gut bekanntes Verfahren erhalten, das Kaolin zur Adsorption von Gonadotropinen aus dem menopausalen/postmenopausalen Harn verwendet (BP 1980). Kurz gesagt wird die biologisch aktive Fraktion aus dem angesäuerten Harn mit Kaolin extrahiert, mit Alkali eluiert und mit 2 Volumina Aceton ausgefällt. Dann wird die biologisch aktive Fraktion aus dieser Fällung mit einer 10%-igen (Gew/V) Lösung von Ammoniumacetat in Ethanol (70%) extrahiert und mit 10% Ammoniumacetat in Ethanol (90%) ausgefällt. Eine weitere Reinigung erfolgt durch Ionenaustauschchromatographie. Das durch dieses Verfahren erhaltene gereinigte Material bildet die Zusammensetzung von Menotropinen oder eine andere äquivalente Zubereitung, wie die Fraktion C.
Menotropine oder ein Äquivalent (Fraktion C) wird auf einer starken kationischen Austauschsäule chromatographiert, wobei die aktive Fraktion mit einem 0,2-0,5 M Ammoniumacetatpuffer, pH 5,0-7,0, eluiert wird. Eine neue Fällung wird durch Zugabe von 4 Volumina Ethanol erhalten (Fraktion F). Die Fraktion F wird auf einer starken anionischen Austauschsäule chromatographiert, wobei die aktive Fraktion mit einem 0,05-0,2 M Ammoniumacetatpuffer, pH 5,0-7,0, elu iert wird. Die aktive Fraktion wird bei -75°C eingefroren (Fraktion G).
Die Fraktion G wird durch einen biologischen Assay analysiert, um deren FSH- und LH-Gehalt genau zu bestimmen. In Abhängigkeit von dem zwischen den beiden Hormonen gefundenen Verhältnis wird die folgende Chromatographiestufe durchgeführt, wobei zwei Alternativen möglich sind:

1) eine Co-Reinigung beider Hormone;
2) eine Abtrennung der Hormonaktivität, die im Überschuss vorhanden ist, so dass Menotropine mit 1:1 FSH/LH erhalten werden. Alternativ ergibt die Abtrennung von sowohl FSH als auch LH beide Aktivitäten getrennt für therapeutische Zwecke (pures FSH und pures LH).

Sobald die durchzuführenden Stufen bestimmt sind, wird die Fraktion G dialysiert und so eingeengt, dass sie für die Notwendigkeiten der folgenden Chromatographiestufe angepasst ist. Die gebildete Lösung wird auf einer Säule mit hydrophober Interaktion chromatographiert, wobei die aktiven Fraktionen nach zwei alternativen Verfahren unter Berücksichtigung der obigen Optionen 1) und 2) eluiert werden. Die flüssigen Fraktionen, die erhalten werden, (Fraktion J2, J3, J4) werden bei -75°C eingefroren. Später werden diese Fraktionen aufgetaut, dialysiert und eingeengt, über eine Sterilisierungsmembran filtriert und durch Zugabe von 4 Volumina Ethanol ausgefällt, wobei eine Fällung erhalten wird, die unter Vakuum bis zur Trockne getrocknet wird (Fraktion K).
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt einen Elektrophoreseversuch des herkömmlichen Produkts (HMG) gegenüber dem neuen hoch gereinigten Menotropineprodukt (Fraktion KM) dar.
2 stellt einen PAGE(Polyacrylamidgelelektrophorese)-Versuch von hoch gereinigten Menotropinen (Fraktion K_M), der in verschiedenen Konzentrationen durchgeführt wurde, zusammen mit den Molekulargewichtsstandards dar.
3 stellt einen PAGE-Versuch eines hoch gereinigten FSH (Fraktion K_F) in verschiedenen Konzentrationen zusammen mit den Molekulargewichtsstandards dar.
4 stellt einen PAGE-Versuch von 1) Gonal-F (Serono) 1 FSH IU/μl, 2) Metrodine HP (Serono) 3 FSH IU/μl), 3) hoch gereinigten Menotropinen (Fraktion KM 3,7 FSH IU/μl) und 4) Molekulargewichtsstandards (von oben) 14 400 D, 20 100 D, 30 000 D, 43 000 D, 67 000 D und 94 000 D dar.
5 stellt eine isoelektrische Fokussierung auf durch Silber angefärbten 3-10 PhastGels dar, wobei Spur 1 den Calibration Kits for Broad 3-10 pI entspricht, Spur 2 einem pI-4,55-Standard (Sojabohne-Trypsin-Inhibitor) entspricht, Spur 3 einem pI-5,85-Standard (Rinder-Carboanhydrase B) entspricht und die Spuren 4, 5 und 6 hoch gereinigtem Follitropin(K_F)-Produkt (drei verschiedene Produktionschargen) entsprechen.
6 stellt eine isoelektrische Fokussierung auf durch Silber angefärbten 3-10 PhastGels dar, wobei Spur 1 den Calibration Kits for Broad 3-10 pI entspricht und Spur 2 hoch gereinigtem Menotropine(K_M)-Produkt entspricht.
7 ist das Ergebnis, das durch HPLC mit einer Probe von hoch gereinigten Menotropinen (Fraktion K_M) erhalten wurde.
8 ist das Ergebnis, das durch HPLC mit einer Probe von hoch gereinigtem FSH (Fraktion K_F) erhalten wurde.
9 ist das Ergebnis, das durch HPLC mit einer Probe von Gonal-F (Serono) erhalten wurde (Der Peak bei der Retentionszeit 11,2 entspricht einem Streckmittel der pharmazeutischen Zubereitung) und
10 ist ein Verfahrensfließdiagramm zur Gewinnung der hoch gereinigten Gonadotropine der vorliegenden Erfindung.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
a) Fließdiagramm
Das Fließdiagramm zur Gewinnung von hoch gereinigten Gonadotropinen ist in 10 angegeben.
Die Erarbeitungstechnik der Fraktion K_M, die gereinigte Menotropine darstellt, wird im folgenden beschrieben.
b) Zubereitung der Fraktion F
Die Fraktion C wird auf einer Chromatographiesäule, die 10 1 eines starken kationischen Austauschharzes des Sulfopropyltyps enthält, chromatographiert.
Die Fraktion C (110-140 g) wird in 1600-1800 ml einer 0,05-0,15 M Ammoniumacetatlösung, pH 5,0-7,0, gelöst. Die Säule wird gefahren und mit der notwendigen Menge einer 0,05-0,15 Ammoniumacetatlösung, um das Volumen auf 20 l zu bringen, eluiert. Die Elution wird mit Lösungen von 0,15-0,20 M Ammoniumacetat, pH 5,0-7,0 (20 l), und 0,2-0,5 M Ammoniumacetat, pH 5,0-7,0 (20 l), fortgesetzt. Die mit der letzteren Lösung eluierte aktive Fraktion wird unter Rühren zu 4 Volumina von 96%-igem Ethanol und ausreichend Essigsäure, um einen pH-Wert des Gemischs von 5,5-5,7 zu erreichen, gege ben. Ein Niederschlag wird gebildet, durch Zentrifugation abgetrennt, mit Ethanol gewaschen und unter Vakuum getrocknet, bis Ethanol entfernt ist und die Feuchtigkeit weniger als 5% beträgt (Fraktion F).
c) Zubereitung der Fraktion G
Die Fraktion F wird auf einer Chromatographiesäule, die 4 l eines starken anionischen Austauschharzes des quaternären Ammoniumtyps enthält, chromatographiert.
Die Fraktion F (40-60 g in 650 ml) wird in 0,01-0,5 M Ammoniumacetatlösung, pH-Wert 5,0-7,0, gelöst, die Säule wird gefahren und mit der gleichen Lösung, um das Volumen auf 7 l zu bringen, eluiert. Die Elution wird mit 12 l 0,05-0,07 M Ammoniumacetat, pH 5,0-7,0, dann mit 10 l 0,07-0,2 M Ammoniumacetat, pH 5,0-7,0, fortgesetzt. Die mit der letzteren Lösung eluierte aktive Fraktion wird einem Ultrafiltrationsverfahren unter Verwendung einer PM 10 (10 000 D) Ultrafilters (Amicon-Millipore)-Membran unterzogen. Die Lösung wird eingeengt und gegen einen 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 5,50-5,7, bis zu einer Konzentration von 2-4 g Protein in 100-150 ml Puffer konzentriert und dialysiert. Sie wird dann bei -75°C eingefroren (Fraktion G).
d) Zubereitung der Fraktion J
Die Fraktion G wird auf einer Chromatographiesäule, die 400 ml eines Harzes mit hydrophober Interaktion (Phenyl Sepharose HP, Amersham-Pharmacia Biotech) enthält, chromatographiert. Eine ausreichende Menge Ammoniumsulfat wird zu der Lösung der Fraktion G gegeben, um eine Konzentration von 0,8-1,2 M zu erhalten.
Das durchzuführende chromatographische Verfahren ermöglicht die Co-Reinigung von FSH und LH oder die Abtrennung von beiden Hormonen. Der Aktionsablauf hängt von den früheren Analysen ab, die mit der Fraktion G durchgeführt wurden (biologische Assays), wodurch das FSH:LH-Verhältnis bestimmt wurde. Sobald dieses Verhältnis bekannt ist, wird der Überschuss des Hormons, der in einem Überschuss zu einem 1:1-Verhältnis von FSH:LH vorhanden ist, entfernt.
d-1) Wenn das Produkt ausbalanciert ist (1:1 FSH:LH), wird die Chromatographie der konzentrierten und dialysierten Fraktion G wie im folgenden durchgeführt:

– Platzieren der Lösung der Fraktion G in der Chromatographiesäule, 0,8-1,2 M in Ammoniumsulfat;
– Eluieren mit 2 Volumina 50-200 mM Natriumphosphatpuffer, 0,8-1,2 M Ammoniumsulfat, pH 5,0-7,0;
– Fortsetzen der Elution mit 2 Volumina 50-200 mM Phosphatpuffer (50-70% (V/V)) und 96% Ethanol (50-30% (V/V)).

Die mit dem letzteren Puffer eluierte aktive Fraktion (Fraktion J4) wird bei -75°C eingefroren. Diese Fraktion weist FSH- und LH-Aktivität auf.
d-2) Wenn das FSH:LH-Verhältnis der Fraktion G von 1:1 verschieden ist, wird der Überschuss des Hormons im Überschuss wie im folgenden angegeben entfernt:

– Platzieren eines Aliquots der Lösung von Fraktion G in der Chromatographiesäule, 0,8-1,2 M in Ammoniumsulfat;
– Elution mit 2 Volumina 50-200 mM Natriumphosphatpuffer, 0,8-1,2 M Ammoniumsulfat, pH 5,0-7,0;
– Fortsetzen der Elution mit 2 Volumina 50-200 mM Natriumphosphatpuffer, 0,4-0,6 M Ammoniumsulfat, pH-Wert 5,0-7,0 und schließlich mit 2 Volumina 50-200 mM Phosphatpuffer (50-70% (V/V)) und 96% Ethanol (50-30% (V/V)).

Die mit 50-200 mM Natriumphosphatpuffer, 0,4-0,6 M Ammoniumsulfat eluierte aktive Fraktion (Fraktion J2) wird bei -75°C eingefroren. Diese Fraktion weist hauptsächlich FSH-Aktivität auf.
Die mit 50-200 mM Phosphatpuffer (50-70% (V/V)) und 96% Ethanol (50-30% (V/V)) eluierte aktive Fraktion (Fraktion J3) wird bei -75°C eingefroren. Diese Fraktion weist nur LH-Aktivität auf.
Zubereitung der Fraktion K
Die Fraktionen J2, J3, J4 werden aufgetaut und unter Verwendung von Ultrafiltration durch eine PM 10 (Diaflo Ultrafilters, Amicon-Millipore)-Membran gegen einen 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 5,7, dialysiert und konzentriert.
Jede erhaltene Lösung wird unter Verwendung einer 0,45-μm-Membran unter den notwendigen Bedingungen, um ein steriles Produkt zu erhalten, filtriert und dann zu 4 Volumina von 96%-igem Ethanol und ausreichend Essigsäure, um einen pH-Wert des Gemischs von 5,5-5,7 zu erhalten, gegeben. Das Gemisch wird über Nacht stehengelassen. Der Niederschlag wird durch Zentrifugation abgetrennt und unter Vakuum getrocknet, bis Ethanol entfernt ist und die Feuchtigkeit weniger als 5% beträgt (Fraktion K).
Die Eigenschaften der Fraktion K können in Abhängigkeit von der ausgefällten Fraktion, die J2, J3 oder J4 ist, variieren. Die aus der Fraktion J4 erhaltene Fraktion K_M enthält etwa äquivalente Einheiten von FSH und LH. Die aus der Fraktion J2 erhaltene Fraktion K_F besteht aus FSH und LH-Spuren. Die aus der Fraktion J3 erhaltene Fraktion K_L besteht aus LH und FSH-Spuren.
Beispiele für durch die beschriebenen Techniken produzierte Chargen
Beispiel 1
1.1 Herstellung der Fraktion F
231,2 g der Fraktion C wurden in zwei gleiche Portionen geteilt und in zwei äquivalenten Verfahren auf einer Chromatographiesäule wie oben beschrieben chromatographiert.
115,6 g der Fraktion C (in jedem Verfahren) wurden in 1700 ml 0,05 M Ammoniumacetatpuffer, pH 5,0, gelöst. Die Säule wurde gefahren und mit weiteren 18,7 l des gleichen Chromatographiepuffers eluiert. Die Elution wurde mit 20 l 0,15 M Ammoniumacetatpuffer, pH 5,0, und schließlich mit 20 l 0,5 M Ammoniumacetatpuffer, pH 5,0, fortgesetzt. Die aktive Fraktion, die durch Elution mit 0,5 M Ammoniumacetat (22 l) erhalten wurde, wurde unter Rühren zu einer Lösung von 88 l 96%-igem Ethanol und 2400 ml Essigsäure gegeben. Der pH-Wert des Gemischs betrug 5,7. Der erhaltene Niederschlag wurde über Nacht im Kühlschrank (2-8°C) stehengelassen. Der Niederschlag wurde zentrifugiert, mit 96%-igem Ethanol gewaschen und unter Vakuum 17 h getrocknet.
Bei jedem der zwei äquivalenten Verfahren wurden zwei Fraktionen F von 20,7 g bzw. 19,5 g erhalten.
1.2 Herstellung der Fraktion G
Die in der obigen Stufe erhaltenen zwei Fraktionen F wurde zusammengebracht und auf einer Säule entsprechend der beschriebenen Technik chromatographiert.
40,2 g der Fraktion F wurden in 650 ml 0,01 M Ammoniumacetatpuffer, pH 5,0, gelöst. Die Säule wurde mit dieser Lösung gefahren und mit 6350 ml des gleichen Verdünnungspuffers eluiert. Die Elution wurde dann mit 12 l 0,05 M Ammoniumacetat, pH 5,0, und dann mit 10 l 0,2 M Ammoniumacetat, pH 5,0, fortgesetzt. Die aktive Fraktion (4500 ml), die mit der letzteren Lösung eluiert wurde, wurde einem Ultrafiltrationsverfahren unter Verwendung einer PM 10 (10 000 D) Diaflo Ultrafilters (Amicon-Millipore)-Membran unterzogen. Die Lösung wird gegen 50 mM Natriumphosphat, pH 5,7, konzentriert und dialysiert, um eine Konzentration von 2-4 g Protein in 150 ml Puffer zu erhalten. Die Endlösung (400 ml) wurde bei -75°C eingefroren.
Die Fraktion G wurde in Tieren biologisch getestet, wobei eine FSH-Wirkung von 42 000 IU/ml und eine LH-Wirkung von 33 780 IU/ml detektiert wurden. Mit diesem Ergebnis wurde es als notwendig erachtet, einen Teil der Lösung (80 ml) der Fraktion G unter Bedingungen zur Abtrennung von FSH und LH (Fraktionen J2 bzw. J3) weiterzuverarbeiten. Der Rest (320 ml) wurde unter Bedingungen, dass beide Hormone nicht getrennt wurden, chromatographiert (Fraktion J4). Aliquots der Fraktion J3 und der Fraktion J4 wurden dann gemischt, um ein FSH:LH-Endverhältnis von etwa 1:1 zu erhalten (Fraktion KM).
1.3 Herstellung der Fraktion J
i) Herstellung der Fraktionen J2 (hoch gereinigtes FSH) und J3 (hoch gereinigtes LH):
Ammoniumsulfat wurde zu einem Aliquot der Fraktion G (80 ml) bis zu einer Konzentration von 1 M gegeben. Diese Lösung wurde in einer Phenyl-Sepharose-HP-Chromatographiesäule gefahren und mit 2 Volumina Puffer, 50 mM Natriumphosphat, 1 M Ammoniumsulfat, pH 5,1, eluiert. Die Elution wurde mit 2 Volumina Puffer, 50 mM Natriumphosphat, 0,5 M Ammoniumsulfat, pH 5,1, und schließlich mit 2 Volumina 50 mM Natriumphosphatpuffer (60% (V/V)) und 96% Ethanol (40% (V/V)) fortgesetzt.
Die FSH-aktive Fraktion, die mit Puffer, 50 mM Natriumphosphat, 0,5 M Ammoniumsulfat, pH 5,1, eluiert wurde (Fraktion J2), wurde unter Verwendung von PM 10-Membran-Ultrafiltration (Diaflo Ultrafilters, Amicon-Millipore) gegen einen 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 5,7, dialysiert und konzentriert und dann bei -75°C eingefroren.
Die LH-aktive Fraktion, die mit 50 mM Natriumphosphatpuffer (60% (V/V)) und 96%-igem Ethanol (40% (V/V)) eluiert wurde, (Fraktion J3) wurde unter Verwendung von PM 10-Membran-Ultrafiltration (Diaflo Ultrafilters, Amicon-Millipore) gegen einen 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 5,7, dialysiert und konzentriert und dann bei -75°C eingefroren.
ii) Herstellung der Fraktion J4 (hoch gereinigte Menotropine)
Ein zweites Aliquot der Fraktion G (320 ml) wurde aufgetaut und Ammoniumsulfat wurde zugegeben, bis eine Konzentration von 1 M erhalten wurde. Diese Lösung wurde in einer Phenyl-Sepharose-HP-Chromatographiesäule gefahren und mit 2 Volumina Puffer, 50 mM Natriumphosphat, 1 M Ammoniumsulfat, pH 5,1, eluiert. Die Elution wurde mit 2 Volumina 50 mM Phosphat (60% (V/V)) und 96%-igem Ethanol (40% (V/V)) fortgesetzt. Die mit diesem Puffer eluierte Fraktion (Fraktion J4) wurde bei -75°C eingefroren.
1.4 Herstellung der Fraktion K
Die Fraktionen J3 (40 ml) und J4 (25 ml) wurden aufgetaut, über eine 0,45-μm-Membran unter zur Gewinnung eines steri len Produkts notwendigen Bedingungen filtriert (Endvolumen 100 ml) und dann mit 4 Volumina 96%-igem Ethanol (400 ml) und Essigsäure, die zum Erreichen eines pH-Werts von 5,5 notwendig ist, (1 ml) gemischt und gerührt.
Die Fraktion J2 (40 ml) wurde aufgetaut, über eine 0,45-μm-Membran unter zur Gewinnung eines sterilen Produkts notwendigen Bedingungen filtriert (Endvolumen 60 ml) und dann mit 4 Volumina 96%-igem Ethanol (400 ml) und Essigsäure, die zum Erreichen eines pH-Werts von 5,5 notwendig ist, (0,5 ml) gemischt und gerührt.
Die Fraktionen wurden über Nacht bei 2-8°C im Kühlschrank ausfallen gelassen. Am nächsten Morgen wurde der Niederschlag hoch gereinigter Menotropine, der aus der Fraktion J3 und J4 erhalten wurde, durch Zentrifugation abgetrennt und unter Vakuum getrocknet, bis Ethanol entfernt war und die Feuchtigkeit weniger als 5% betrug (Fraktion K_M, 4,50 g).
Der aus der J2-Fraktion erhaltene Niederschlag von hoch gereinigtem FSH wurde durch Zentrifugation abgetrennt und unter Vakuum getrocknet, bis Ethanol entfernt war und die Feuchtigkeit weniger als 5% betrug (Fraktion K_F, 0,55 g).
1.5 Ergebnisse
Die biologische Analyse, die mit den Fraktionen K_M (hoch gereinigte Menotropine) und K_F (hoch gereinigtes FSH) durchgeführt wurde, zeigte die folgenden Ergebnisse:
Ausbeutetabelle
Beispiel 2
2.1 Herstellung der Fraktion F
250,06 g der Fraktion C wurden in zwei gleiche Portionen geteilt und in zwei äquivalenten Verfahren auf einer Chromatographiesäule wie oben beschrieben chromatographiert.
123,03 g der Fraktion C (in jedem Verfahren) wurden in 1700 ml 0,05 M Ammoniumacetatpuffer, pH 5,1, gelöst. Die Säule wurde gefahren und mit weiteren 18,7 l des gleichen Chromatographiepuffers eluiert. Die Elution wurde mit 20 l 0,15 M Ammoniumacetatpuffer, pH 5,1, und schließlich mit 20 l 0,5 M Ammoniumacetatpuffer, pH 5,1, fortgesetzt. Die aktive Fraktion, die durch Elution mit 0,5 M Ammoniumacetat (22 l) erhalten wurde, wurde unter Rühren zu einer Lösung von 88 l 96%-igem Ethanol und 2200 ml Essigsäure gegeben. Der pH-Wert des Gemischs betrug 5,7. Das Auftreten eines Niederschlags wurde beobachtet. Das Gemisch wurde über Nacht bei 2-8°C im Kühlschrank stehengelassen. Der Niederschlag wurde zentrifugiert, mit 96%-igem Ethanol gewaschen und unter Vakuum 22 h getrocknet.
Bei jedem der zwei äquivalenten Verfahren wurden zwei Fraktionen F von 21,57 g bzw. 21,15 g erhalten.
2.2 Herstellung der Fraktion G
Die in der obigen Stufe erhaltenen zwei Fraktionen F wurde zusammengebracht und auf einer Säule entsprechend dem oben beschriebenen Verfahren chromatographiert.
42,58 g der Fraktion F wurden in 650 ml 0,01 M Ammoniumacetatpuffer, pH 5,1, gelöst. Die Säule wurde mit dieser Lösung gefahren und mit 6350 ml der gleichen Pufferlösung eluiert. Die Elution wurde mit 12 l 0,05 M Ammoniumacetat, pH 5,0, und dann mit 10 l 0,2 M Ammoniumacetat, pH 5, fortgesetzt. Die aktive Fraktion (4500 ml), die mit dieser letzteren Lösung eluiert wurde, wurde einem Ultrafiltrationsverfahren mit einer PM 10 (10 000 D) (Diaflo Ultrafilters, Amicon-Millipore)-Membran unterzogen. Die Lösung wurde gegen 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 5,7, konzentriert und dialysiert, bis eine Konzentration von 2-4 g Protein in 150 ml Puffer erhalten wurde. Das Endvolumen von 500 ml wurde bei -75°C eingefroren.
Die Fraktion G wurde in Tieren biologisch getestet, wobei eine FSH-Wirkung von 49 790 IU/ml und eine LH-Wirkung von 39 600 IU/ml detektiert wurden. Mit dieser Analyse wurde es als notwendig erachtet, einen Teil der Lösung (100 ml) der Fraktion G unter Bedingungen zur Abtrennung von FSH und LH (Fraktionen J2 bzw. J3) und den Rest (400 ml) unter Bedingungen, dass beide Hormone nicht getrennt wurden, (J4) weiterzuverarbeiten.
Aliquots der Fraktion J3 und der Fraktion J4 wurden dann gemischt, um ein FSH:LH-Endverhältnis von etwa 1:1 zu erhalten (Fraktion K_M).
2.3 Herstellung der Fraktion J
i) Herstellung der Fraktionen J2 (hoch gereinigtes FSH) und J3 (hoch gereinigtes LH):
Ammoniumsulfat wurde zu einem Aliquot der Fraktion G (80 ml) bis zu einer Konzentration von 1 M gegeben. Diese Lösung wurde in der Phenyl-Sepharose-HP-Chromatographiesäule gefahren und mit 2 Volumina Puffer, 50 mM Natriumphosphat, 1 M Ammoniumsulfat, pH 5,1, eluiert. Die Elution wurde dann mit 2 Volumina Puffer, 50 mM Natriumphosphat, 0,5 M Ammoniumsulfat, pH 5,1, und schließlich mit 2 Volumina 50 mM Natriumphosphat (60% (V/V)) und 96% Ethanol (40% (V/V)) fortgesetzt.
Die FSH-aktive Fraktion, die mit Puffer, 50 mM Natriumphosphat, 0,5 M Ammoniumsulfat, pH 5,1, eluiert wurde (Fraktion J2), wurde unter Verwendung von Membran-Ultrafiltration mit einer PM-10-Membran (Diaflo Ultrafilters, Amicon-Millipore) gegen einen 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 5,7, dialysiert und konzentriert und dann bei -75°C eingefroren.
Die LH-aktive Fraktion, die mit 50 mM Natriumphosphatpuffer (60% (V/V)) und 96%-igem Ethanol (40% (V/V)) eluiert wurde, (Fraktion J3) wurde unter Verwendung von Membran-Ultrafiltration mit einer PM-10-Membran (Diaflo Ultrafilters, Amicon-Millipore) gegen einen 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 5,7, dialysiert und konzentriert und dann bei -75°C eingefroren.
ii) Herstellung der Fraktion J4 (hoch gereinigte Menotropine)
Zu einem zweiten Aliquot der Fraktion G (400 ml) wurde Ammoniumsulfat zugegeben, bis eine Konzentration von 1 M erhalten wurde. Diese Lösung wurde in einer Phenyl-Sepharose-HP-Chromatographiesäule gefahren und mit 2 Volumina Puffer, 50 mM Natriumphosphat, 1 M Ammoniumsulfat, pH 5,1, eluiert. Die Elution wurde mit 2 weiteren Volumina von 50 mM Phosphatpuffer (60% (V/V)) und 96%-igem Ethanol (40 (V/V)) fortgesetzt. Die mit diesem Puffer eluierte Fraktion (Fraktion J4) wurde bei -75°C eingefroren.
2.4 Herstellung der Fraktion K
Die Fraktionen J3 (50 ml) und J4 (30 ml) wurden aufgetaut, über eine 0,45-μm-Membran unter zur Gewinnung eines sterilen Produkts notwendigen Bedingungen filtriert (Endvolumen 110 ml) und dann unter Rühren zu 4 Volumina 96%-igem Ethanol (440 ml) und ausreichend Essigsäure zum Erreichen eines pH-Werts von 5,5 (1 ml) gegeben.
Die Fraktion J2 (50 ml) wurde aufgetaut, über eine 0,45-μm-Membran unter zur Gewinnung eines sterilen Produkts notwendigen Bedingungen filtriert (Endvolumen 70 ml) und dann unter Rühren zu 4 Volumina 96%-igem Ethanol (280 ml) und ausreichend Essigsäure zum Erreichen eines pH-Werts von 5,5 (0,5 ml) gegeben.
Die Fraktionen wurden über Nacht bei 2-8°C im Kühlschrank ausfallen gelassen. Am nächsten Morgen wurde der Niederschlag hoch gereinigter Menotropine, der aus den Fraktionen J3 und J4 erhalten wurde, durch Zentrifugation abgetrennt und unter Vakuum getrocknet, bis Ethanol entfernt war und die Feuchtigkeit weniger als 5% betrug (Fraktion K_M, 5,71 g).
Der aus der J2-Fraktion erhaltene Niederschlag von hoch gereinigtem FSH wurde durch Zentrifugation abgetrennt und unter Vakuum getrocknet, bis Ethanol entfernt war und die Feuchtigkeit weniger als 5% betrug (Fraktion K_F, 0,70 g).
2.5 Ergebnisse
Die biologische Analyse, die mit den Fraktionen K_M (hoch gereinigte Menotropine) und K_F (hoch gereinigtes FSH) durchgeführt wurde, zeigte die folgenden Ergebnisse:
2.6 Ausbeutetabelle
Hoch gereinigte Produkte wurden auch unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ausgehend von weniger aktiven Materialien erhalten. In diesem Fall wurde ein FSH von etwa 5 000 IU/mg Protein und Menotropine einer Wirkung von etwa 2 500 IU/mg Protein für sowohl FSH als auch LH erhalten.
2.7 Charakterisierung der erhaltenen Produkte
Die Fraktionen K_M und K_F wurden durch die folgenden Techniken charakterisiert:

2.7.a) Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE)
2.7.b) Polyacrylamidgelelektrophorese und anschließend Western-Blot-Analyse
2.7.c) Isoelektrofokussierung
2.7.d) Größenausschlusschromatographie (SEC) in HPLC
2.7.e) Proteingehaltsermittlung
2.7.f) Biologische Wirksamkeitsdosierung in tierischen Lebewesen (Vorinformation)

2.7.a) Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE)
Die Fraktionen K_M und K_F wurden durch Elektrophorese nach dem folgenden Verfahren analysiert:

Einrichtung: Ultrathin Polyacrylamid Gel Electrophoresis System, PhastSystem (Amersham Pharmacia Biotech).
Gele: Phast Gel Gradient 8-25 (Amersham Pharmacia Biotech).
Puffer: Pufferstreifen/SDS (Amersham Pharmacia Biotech).
Trennungstechnik: File 110, PhastSystem, SDS-Page
Entwicklungstechnik: File 200, PhastSystem für Coomassie Brilliant Blue.
Sonden für niedriges Molekulargewicht: Electrophoretic Calibration Kit, das 6 gereinigte Proteine enthält (Amersham Pharmacia Biotech).

Jede Kitampulle enthält ein lyophilisiertes Gemisch mit etwa 100 μg der einzelnen Proteine. Jede Ampulle wurde in 100 μl Probenpuffer gelöst.
Probenpuffer:
250 mg SDS und 0,5 ml β-Mercaptoethanol wurden in 10 ml Puffer A gelöst.
Die Proben wurden so gelöst, dass die Endkonzentration 1100-1300 FSH IU/ml Probenpuffer betrug.
Probenbehandlung
Die Probe wurde 5 min bei 100°C erhitzt. Bromphenolblau wurde zugegeben, bis eine Konzentration von 0,01% erhalten wurde.
Nach der Elektrophoresedurchführung und der Entwicklung wurden die Gele mit Heißluft getrocknet.
Erhaltene Ergebnisse
Die Elektrophoresedurchführungen der Fraktionen K_M (2) und K_F (3) ergaben als Ergebnis ein Profil, wobei in fast ausschließlicher Weise ein mit Brilliant Coomassie Blue entwickeltes einziges Band mit einer Migrationsstrecke in der Mitte zwischen den Molekulargewichtsstandards 20 100 D und 30 000 D beobachtet wurde, was ein näherungsweises Molekulargewicht von 25 000 D anzeigt.

Probe Rf

Std. 20 100 D 0,196

Fraktionen K_M-K_F 0,250

Std. 30 000 0,300
Die Zuordnung der beobachteten Bande bei der Elektrophorese der Fraktionen K_F und K_M wurde auf zwei Weisen durchgeführt:

a) durch Vergleich mit 2 Handelsprodukten, die FSH als einzigen Wirkstoff enthalten: Gonal-F (Serono), das FSH gentechnischer Herkunft enthält, Metrodine HP (Serono), das aus Harn stammendes FSH enthält (siehe 4).
b) durch Elektrophorese-Western-Blot wie in 2.7.b) angegeben.

2.7.b) Polyacrylamidgelelektrophorese und anschließend Western-Blot-Analyse
Die Proben der Fraktionen K_M und K_F wurden durch Western-Blot analysiert. Nach der Durchführung eines Polyacrylamidelektrophoreseverfahrens in einem dem oben in 2.7.a) beschriebenen ähnlichen Gradienten wurden die Banden auf einen Nitrocelluloseträger überführt und durch Antikörperwirkung entwickelt. Spezifische Antikörper für Kette-β-FSH, Kette-β-LH und gegen die Kette α beider Hormone wurden verwendet.

– Technik: Die Transfertechnik Nr. 221 wurde für das PhastSystem (Amersham Pharmacia Biotech) unter Verwendung des im folgenden angegebenen Transferpuffers verwendet: Transferpuffer: Tris 25 mM, Glycin 192 mM, pH 8,3, der 20% Methanol enthält. Membran: Probind 45, 0,45-μm-Poren Transferbedingungen: 25 V, 25 mA, 1 W, 45 min Angefärbt mit Coomassie Blue: Färbungslösung: 0,1%-ige Lösung von Phast Gel Blue R in Methanol 30% und Essigsäure 10% in destilliertem Wasser. Endlösung: Mischung von 1 Teil der Färbungslösung mit 1 Teil Essigsäure 20% in destilliertem Wasser. Verfahren: Färbung der Membran in der Endlösung während 30 min unter leichtem Rühren. Waschen der Membran zweimal mit einer Lösung von Methanol:Wasser:Essigsäure (30:60:10) und dann mit Essigsäure 20%.
– Detektionsverfahren: Das Detektionsverfahren durch Streptavidin/Biotin wurde verwendet. Verwendeter Puffer: PBS (Natriumphosphat 0,01 M, Natriumchlorid 0,25 M, pH 7,6). Blockierungslösung: Albumin 5% in PBS. Waschlösung: a) Albumin 5% in PBS, b) PBS.
– Primäre Antikörperlösung: Die folgenden primären Antikörper wurden verwendet.
1) monoklonaler Anti-β-LH-Antikörper (Immunotech) (Ige1-Mäuse), Katalognr. 0374.
2) monoklonaler Anti-β-FSH-Antikörper (Immunotech) (Ige1-Mäuse), Katalognr. 0373.
3) monoklonaler Antikörper gegen die α-Untereinheit von Hypophysenhormonen (Immunotech) (IgG1-Mäuse), Katalognr. 0375.
– Verdünnung: Verdünnen des primären Antikörpers 1:100.
– Sekundäre Antikörperlösung: Der verwendete sekundäre Antikörper war: Biotin-SP-conjugated AffiniPure F(ab')₂ Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) (schwere Kette und leichte Kette) (Immunotech, Katalognr. 0816) 1:500 in PBS verdünnt.
– Lösung von peroxidasekonjugiertem Streptavidin: Eine 1:500-Verdünnung von Peroxidase-conjugated Streptavidine (Immunotech, Katalognr. 0309) in PBS wurde verwendet.
– Entwicklungslösung: Horseradish Peroxidase conjugate substrate kit (Bio Rad, Katalognr. 170-6431), das ein Lösungsgemisch von oxygeniertem Wasser, 4-Chlor-1-naphtol und Puffer zur Entwicklung der Farbe enthielt, wurde zur Herstellung von 1 l Lösung verwendet.
– Kurze Beschreibung des Verfahrens:
1) Inkubieren der Membran mit Blockierungslösung über Nacht.
2) Waschen mit der Waschlösung a) zweimal während jeweils 5 min.
3) Inkubieren mit primärer Antikörperlösung über Nacht.
4) Waschen mit der Waschlösung a) dreimal während jeweils 5 min.
5) Inkubieren mit sekundärem Antikörper während 1 h.
6) Waschen mit der Waschlösung a) dreimal während jeweils 5 min.
7) Inkubieren mit konjugierter Peroxidase während 30 min.
8) Waschen mit der Waschlösung a) dreimal während jeweils 5 min.
9) Inkubieren mit Entwicklungslösung während 10 min.
10) Stoppen der Reaktion.

Ergebnisse
Nach Durchführung der Polyacrylamidgelelektrophorese der Fraktionen K_M und K_F wurden die Banden nach der oben angegebenen Technik auf Nitrocellulosemembranen übertragen und entwickelt. Die folgenden Ergebnisse wurden ermittelt.
Im Hinblick auf diese Ergebnisse wird gefolgert, dass die Bande, die mit Coomassie Blue bei der Elektrophorese der Fraktion K_M entwickelt wurde, sowohl FSH- als auch LH-Aktivitäten aufwies. Statt dessen reagierte die Fraktion K_F nur positiv auf den spezifischen Antikörper für FSH und nicht für LH. Da bekannt ist, dass die α-Kette von FSH und LH gleich ist, zeigten beide Fraktionen K_M und K_F eine positive Reaktion mit einem Antikörper gegen die α-Kette.
2.7.c) Isoelektrofokussierung
Die Fraktionen K_M (hoch gereinigtes FSH) und K_F (hoch gereinigtes FSH) wurden durch Isoelektrofokussierung nach dem folgenden Verfahren analysiert:

Einrichtung: Ultrathin Polyacrylamid Gel Electrophoresis System, PhastSysetm (Amersham Pharmacia Biotech).
Gele: Phast Gel IEF 3-9 (Amersham Pharmacia Biotech).
Trennungstechnik: File 100, PhastSystem.
Entwicklungstechnik: Silver Kit (Amersham Pharmacia Biotech).
PI-Standards: IEF Calibration Kit; Broad pI Kit 3-10 (Amersham Pharmacia Biotech). Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor, pI 5,85 (Sigma). Rinder-Carboanhydrase, pI 4,55 (Sigma).

Probenbehandlung
Die Proben wurden so gelöst, dass sie eine Konzentration von 2,5 mg/ml bis 1,25 mg/ml aufwiesen.
Nach der Elektrophoresedurchführung und der Entwicklung wurden die Gele mit Heißluft getrocknet.
Erhaltene Ergebnisse
Die pI-Verteilung für sowohl K_F (hoch gereinigtes FSH) als auch K_M (hoch gereinigte Menotropine) sind in 5 und 6 angegeben. Die saure Natur der Gonadotropine wird durch das IEF-Muster bestätigt. Tatsächlich sind, wie in der Literatur vollständig beschrieben wird, Isoformen auf den sauren Bereich beschränkt.
2.7.d) Größenausschlusschromatographie (SEC) in HPLC
Beschreibung der Einrichtung:

– Hochleistungsflüssigchromatograph von Shimadzu, LC-10AVP, mit manueller Injektionsvorrichtung 7725i, mit Positionssensor und Schleife von 20, 50 oder 200 μl, Rheodyne.
– UV-visible Spectrophotometer detector, Modell SPD-10AVP, Shimadzu (190-600 nm).
– Arbeitsplatz zur Verarbeitung chromatographischer Daten Shimadzu Class-CR 10, Program Class CR 10 und Modul CBM-101.
– Chromatographiesäule Bio-Rad, Bio-Sil^TM SEC250 (300 × 7,5 mm )
– Mobile Phase: Natriumacetat 0,1 M Puffer, pH 7,0, entgast und filtriert
– Durchfluss: 1,0 ml/min. Detektion: UV bei 220 nm. Säulentemperatur: Raumtemperatur Injektionsvolumen: 50 bis 200 μl. Probenvorbereitung: Injektion von etwa 1 ml der mobilen Phase in die die Probe enthaltende Ampulle, Rühren bis zur Auflösung.

Ergebnisse:
Die im folgenden angegebenen Chromatogramme der Fraktionen K_M und K_F zeigten das Vorhandensein von nur einem Peak mit einer Retentionszeit von etwa 8,1-8,2 s. Die Retentionszeit fällt mit der durch Chromatographie eines kommerziellen Produkts, Gonal-F (Serono), das rekombinantes FSH enthält, erhaltenen zusammen. (Siehe die 7, 8 und 9)
2.7.e) Proteindosierung

Verfahren: Verfahren nach Lowry [Journal of Biological Chemistry 193, 265 (1951)] mit einem Folin-Ciocalteu-Reagens und einer Standardkurve für Albumin.
Ergebnisse: Der Proteinprozentgehalt für die beiden, in den Beispielen 1 und 2 angegebenen Fraktionen K_M und K_F betrug etwa 77%.

2.7.f) Biologische Wirksamkeitsdosierung in Tieren
Wie in Abschnitt 2.5 zuvor berichtet wurde, wurden die Fraktionen K_M und K_F in Ratten biologisch analysiert.
Verfahren:
2.7.f.1) Biologische Wirksamkeitsdosierung von FSH
Das Steelman-Pohley-Verfahren [S. L. Steelman & F. M. Pohley, Endocrinology 64, 604 (1953)] der Eierstockge wichtszunahme wurde bei unreifen, 21-24 Tage alten weiblichen Ratten, die drei Dosen eines FSH enthaltenden Produkts injiziert erhielten, verwendet. Die Dosen sollten ein derartiges Verhältnis einhalten, dass die Differenz zwischen den Logarithmen der größeren Dosis und der mittleren Dosis gleich der Differenz zwischen den Logarithmen der mittleren Dosis und der kleineren Dosis ist. Tierlose wurden verwendet, bei denen die Gewichtsdifferenz zwischen dem schwersten und dem leichtesten Tier nicht mehr als 10 g betrug. Die Tiere erhielten subkutan während drei Tagen drei verschiedene Dosen der Probe, die in Phosphat/Albumin-Puffer gelöst war, und entsprechende Dosen eines Standards injiziert. Am fünften Tag wurden die Tiere getötet, die Eierstöcke extrahiert und gewogen. Die mit einer Probe erhaltenen Daten wurden mit den mit dem Standard erhaltenen Daten verglichen und die Wirksamkeit der verschiedenen Proben wurde unter Verwendung des für die Analyse einer Probe gegenüber einem Standard in einem 3×3-Test angegebenen statistischen Schema berechnet (siehe biologische Analyse von USP XXIII).
2.7.f.2) Biologische Wirksamkeitsdosierung von LH
Das Verfahren der Gewichtszunahme der Bläschendrüse bei unreifen, 21-24 Tage alten männlichen Ratten, die drei Dosen eines LH enthaltenden Produkts injiziert erhielten, wurde verwendet. Die drei Dosen sollten ein derartiges Verhältnis einhalten, dass die Differenz zwischen den Logarithmen der größeren Dosis und der mittleren Dosis gleich der Differenz zwischen den Logarithmen der mittleren Dosis und der kleineren Dosis ist. Tierlose wurden verwendet, bei denen die Gewichtsdifferenz zwischen dem schwersten und dem leichtesten Tier nicht mehr als 10 g betrug. Die Tiere erhielten subkutan während drei Tagen drei verschiedene Dosen der Probe, die in Phosphat/Albumin-Puffer gelöst war, und entsprechende Dosen eines Standards injiziert. Am fünften Tag wurden die Tiere getötet, die Bläschendrüsen extrahiert und gewogen. Die mit einer Probe erhaltenen Daten wurden mit den mit dem Standard erhaltenen Daten verglichen und die Wirksamkeit der verschiedenen Proben wurde unter Verwendung des für die Analyse einer Probe gegenüber einem Standard in einem 3×3-Test angegebenen statistischen Schema berechnet (siehe biologische Analyse von USP XXIII).
Der verwendete Standard war eine Probe von Menotropinen, die gegenüber dem 3. internationalen Standard von Harn-FSH und -LH, der durch das NIBSC (National Institute for Biological Standards and Control – Great Britain) in Abhängigkeit von der WHO (World Health Organization) erstellt wurde, geeicht war.
Beispiel 3: Pharmazeutische Zubereitungen, die nach dem Verfahrensgegenstand der Erfindung erhalten wurden
Hoch gereinigte injizierbare Menotropinrezeptur:
Streckmittel, die in der Zusammensetzung verwendet werden können, sind Lactose, Mannit und Gemische derselben. Andere herkömmliche Streckmittel können ebenfalls verwendet werden.
In der vorliegenden Erfindung wurde Lactose als Streckmittel in der injizierbaren Zubereitung verwendet.
Der pH-Wert der Zubereitung kann auf einen Wert im Bereich von 6,0-7,0 durch Zugabe von Säuren oder Basen (Phosphorsäure oder andere und/oder Natriumphosphat oder andere) werden.
3-ml-Borosilicatglasampullen des Typs I mit Brombutylstopfen werden als Behälter verwendet.
Zubereitung einer Charge von 5000 Ampullen
Die berechnete Menge von Menotropinen hoher Reinheit (mit 10% Überschuss) wird in 500 ml Wasser zu Injektionszwecken gelöst. Andererseits werden 100 g Lactose in 4 l Wasser zu Injektionszwecken gelöst. Beide Lösungen werden gemischt, der pH-Wert wird, falls nötig, durch die Zugabe einer Säure oder Base eingestellt, die gebildete Lösung wird auf 5000 ml aufgefüllt und durch Filtration durch eine 0,2-μm-Membran sterilisiert. Die Ampullen werden mit der zubereiteten Lösung (1 ml) gefüllt und in einen sterilen Gefriertrockner bei einer Temperatur von -40°C über mindestens 8 h geladen. Die Gefriertrocknung beginnt durch Erhitzen mit 3°C/h bis zu einer Temperatur von +30°C, die bis zum Ende des Zyklus beibehalten wird.
Das vorliegende Beispiel wird in ähnlicher Weise zur Zubereitung von hoch gereinigtem Follitropin angewandt.

Claims

Reinigungsverfahren für humane Harn-Gonadotropine hoher biologischer Aktivität und chemischer Reinheit, die absolut frei von fremden kontaminierenden Materialien, die von der Verwendung von biologischen Reagentien oder Chromatographiefarbstoffen stammten, sind, ausgehend von einem Rohstoff von Gonadotropinen, das die folgenden Stufen umfasst: (1) Reinigung der rohen Gonadotropine, die in 0,05-0,15 M Ammoniumacetat, pH 5,0-6,0, verdünnt sind, in einer Ionenaustauschsäule mit einem starken kationischen Harz des Sulfopropyltyps unter Elution von sowohl FSH als auch LH mit Lösungen von 0,05-0,5 M Ammoniumacetat, pH 5,0-7,0; und (2) Reinigung dieser Fraktion, die in 0,01-0,05 M Ammoniumacetat, pH 5,0-7,0, verdünnt ist, in einer Ionenaustauschsäule mit einem starken anionischen Harz des quaternären Ammoniumtyps unter Elution von sowohl FSH als auch LH mit Lösungen von 0,05-0,2 M Ammoniumacetat, pH 5,0-7,0; und (3) Reinigung von Gonadotropinen in einer Säule mit einem Harz mit hydrophober Wechselwirkung durch aufeinanderfolgende Zugabe von mindestens zwei der folgenden Lösungen: a) Puffer aus 50-200 mM Natriumphosphat und 0,8-1,2 M Ammoniumsulfat, pH 5,0-6,0; b) Puffer aus 50-200 mM Natriumphosphat und 0,4-0,6 M Ammoniumsulfat, pH 5,0-7,0; c) Puffer aus 50-200 mM Natriumphosphat (50-70% (V/V)) und 96%-igem Ethanol (50-30% (V/V)), oder Einschieben des Harzes mit hydrophober Wechselwirkung zwischen die zwei Ionenaustauschchromatographiestufen.
Reinigungsverfahren nach Anspruch 1, wobei das starke kationische Harz in Stufe 1) ein SP-Sepharoseharz ist.
Reinigungsverfahren nach Anspruch 1, wobei das starke anionische Harz in Stufe 2) ein Q-Sepharoseharz ist.
Reinigungsverfahren nach Anspruch 1, wobei das Harz mit hydrophober Wechselwirkung in Stufe 3) ein Phenyl-Sepharoseharz ist.
Reinigungsverfahren nach Anspruch 1, wobei in der Zugabesequenz a, b, c in Stufe 3 das FSH-Gonadotropin mit Lösung b eluiert wird und das LH-Gonadotropin mit Lösung c eluiert wird.
Reinigungsverfahren nach Anspruch 1, wobei, wenn das Gonadotropinverhältnis FSH:LH in etwa ähnlich zu 1:1 ist, in der planmäßigen Zugabesequenz a, c in Stufe 3 die Gonadotropine mit Lösung c eluiert werden.
Reingungsverfahren nach Anspruch 1, wobei, wenn das Gonadotropinverhältnis FSH:LH von 1:1 verschieden ist, das Verfahren in einer planmäßigen Zugabesequenz a, b, c in Stufe 3 ferner die Zugabe von mit der Lösung b eluiertem Gonadotropin FSH oder mit der Lösung c eluiertem Gonadotropin LH bis zum Verhältnis 1:1 umfasst.
Reinigungsverfahren nach Anspruch 1, wobei der Rohstoff von Gonadotropinen aus Harn von menopausalen und/oder postmenopausalen Frauen erhalten wird.
Reinigungsverfahren nach Anspruch 1, wobei der Roh stoff von Gonadotropinen eine FSH-Aktivität von größer als 40 IU/mg und eine LH-Aktivität von größer als 40 IU/mg aufweist.