PT1169349E - Composições de gonadotropina de altamente purificada e processo para a sua preparação - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO
COMPOSIÇÕES DE GONADOTROPINA Dl ALTAMENTE PURIFICADA E PROCESSO PARA A SUA PREPARAÇÃO
A presente invenção refere-se a composições de gonadotropina, em particular a composições de FSH (hormona estimuladora de folículo: folitropina) e menotropina, de actividade biológica elevada e a um método para preparar estas composições a partir de urina humana bruta de mulheres em menopausa ou pós-menopausa. A pureza química obtida é superior a 95%, tal como medido por HPLC, enquanto que a actividade biológica específica é superior a 2500 IU/mg de proteína para ambas as hormonas FSH e LH para a composição de menotropina (gonadotropinas menopãusicas humanas; HMG) e superior a 5000 IU/mg de proteína para FSH.
Antecedentes da invenção 0 termo "menotropinas" é aplicado a uma combinação hormonal obtida de urina de mulheres em menopausa e pós-menopausa compreendendo duas hormonas glicoproteicas: hormona estimuladora de folículo e hormona luteinizante. Estas duas hormonas são segregadas pela glândula pituitária e subsequentemente metabolizadas e excretadas na urina.
As menotropinas e folitropina têm sido utilizadas desde há muito tempo no tratamento terapêutico de distúrbios de infertilidade. 1 0 papel da PSH consiste em actuar nos folículos ováricos promovendo o seu rápido crescimento e maturidade com ovulação subsequente ou atresia. A FSH juntamente com a LH também está envolvida na biossíntese de estradiol nos folículos ováricos que estimulou. A teca interna é o sítio principal de biossíntese folicular androgénica que está sob o controlo da LH. Controlado pela FHS, este androgénio é então aromatizado nas células de granulose e excretado para a corrente sanguínea. Assim, a LH é um constituinte necessário, juntamente com a FSH, na estimulação folicular.
As hormonas pituitárias FSH e LH, hormona estimuladora da tiróide (TSH) e a hormona placentar gonadotropina coriônica humana (HCG) estão estreitamente relacionadas, uma vez que todas elas são glicoproteínas tendo na sua estrutura duas subunidades designadas por α e β. Ambas as subunidades estão ligadas por uma interacção não covalente. Estas subunidades não têm nenhuma actividade biológica separadamente. As cadeias-a das quatro hormonas acima referidas são comuns, enquanto que as cadeias-β são diferentes e proporcionam uma actividade biológica característica de cada hormona. No entanto, também são comuns porções importantes da cadeia-β que podem ser particularmente observadas nas cadeias-β de LH e HCG.
As gonadotropinas obtidas a partir de urina humana foram parcialmente purificadas até se obterem características de biossegurança compatíveis com os requisitos de um produto farmacêutico injectável e têm 2 sido comercializadas desde há mais de 30 anos para solucionar problemas de infertilidade; estando na forma de uma preparação farmacêutica de grau injectável, elas estão listadas nas farmacopeias mais importantes do mundo e foram aprovadas para utilização farmacêutica em praticamente todos os paises do mundo. A composição da preparação de folitropina pode ser descrita como se segue:
- hormona estimuladora de folículo: 75 ou 150 unidades internacionais de FSH - excipiente (necessário para o processo de liofilização, geralmente 5-20 mg de lactose) e outras proteínas não activas. A composição da preparação de menotropina pode ser descrita como se segue:
- hormona estimuladora de folículo: 75 ou 150 unidades internacionais de FSH
- hormona luteinizante 75 ou 150 unidades internacionais de LH - excipiente (necessário para o processo de liofilização, geralmente 5-20 mg de lactose) e outras proteínas não activas.
As unidades internacionais de FSH e LH são calculadas medindo as actividades biológicas em ratos em 3 relação a um padrão internacional preparado pelo National Institutes for Biological Standards and Control (NIBSC) dependente da Organização Mundial de Saúde. 0 requisito imposto pelas farmacopeias, tais como a farmacopeia dos Estados Unidos ÍUSP XXIII) ou farmacopeia britânica (BP), em termos da pureza do material de partida necessário para a preparação de menotropinas de grau injectãvel consiste de um material de partida com uma actividade de FSH superior a 40 lU/mg e uma actividade de LH superior a 40 IU/mg. Neste sentido, os materiais de partida utilizados até aqui têm sido obtidos por um processo de fabrico que assegura uma actividade na gama de 70-150 IU FSH/LH por mg, o que é mais do que suficiente para satisfazer os requisitos impostos pelas organizações de saúde, no que se refere à biossegurança e eficácia.
No entanto, os últimos desenvolvimentos em termos de técnicas de purificação e o desenvolvimento de gonadotropinas de origem recombinante influenciaram a necessidade de preparações de gonadotropinas nativas altamente purificadas de origem urinária, sem a presença de proteínas como impurezas.
Recentemente foram descritos alguns processos de purificação de FSH e LH. A EP 0322438B1 e as patentes US equivalentes 5128453; 5767067 e 5840857 referem-se à preparação da hormona estimuladora de folículo com actividade 4 específica elevada de origem urinária. No entanto, estes processos incluem um passo de anticorpos monoclonais específicos. Do ponto de vista de segurança, este facto levanta algumas questões acerca da contaminação do produto com proteínas heterólogas, resíduos de ADN das células hospedeiras e vírus. Embora as validações do processo e teste final possam ajudar a excluir a possibilidade de contaminação potencial, é razoável pensar que um processo que é especialmente concebido para evitar a utilização de reagentes biológicos tenha padrões de segurança mais elevados do que um que inclui este tipo de passo de purificação. 0 pedido de patente W098/20039 descreve uma separação e processo de purificação de FSH e LH que evita a utilização de reagentes biológicos. No entanto, devido à razão FSH:LH muito elevada da matéria-prima utilizada e produtos obtidos, este processo exclui a possibilidade de obter menotropinas, uma preparação que requer uma razão de FSH:LH de aproximadamente 1:1.
Além disso, o W098/20039 não caracteriza as gonadotropinas obtidas como um material bioactivo, que é um aspecto essencial para um produto terapêutico. Este pedido de patente utiliza um método imunorradiométrico para testar a actividade, um método de determinação que levanta questões importantes acerca da sua exactidão.
De facto, é reconhecido desde há muito que a heterogeneidade estrutural de isoformas de FSH e LH tem um impacto importante na actividade biológica e 5 reactividade imunológica de ambas as hormonas [Costagliola et al. J. Endocrinol. Invest. 17, 291 (1994)]. As diferenças observadas nos níveis bio- e imunológicos de FSH e LH sugerem que são reconhecidas entidades estruturais separadas pelos bioensaios versus imunoensaios. Tem sido muito discutido que os imunoensaios não proporcionam de forma consistente uma boa estimativa do nível de gonadotropinas bioactivas e não reflectem necessariamente a actividade biológica [Dahl e Stone, J. Andrology, 13, 11 (1992); Rose et al. Endocrine reviews 21, 5 (2000)].
Por outro lado, os bioensaios são considerados como o teste adequado para definir a actividade hormonal, uma vez que têm em conta dois componentes importantes que estão ausentes noutros métodos: a acção biológica no tecido alvo e a eliminação biológica [Rose et al. Endocrine reviews 21, 5 (2000)]. Este facto torna o bioensaio in vivo indispensável para calibração de preparações terapêuticas [Rose, Clínica Chimica Acta 273, 103 (1998)].
Deve também sublinhar-se que a W098/20039 também não caracteriza as gonadotropinas como uma droga quimicamente pura, uma vez que não é apresentado nenhum método analítico para suportar este facto. A presente invenção apresenta uma caracterização completa das gonadotropinas, não só do ponto de vista da bioactividade, mas também do ponto de vista analítico, ao introduzir um método analítico sensível para testar a 6 pureza. Uma vez que os testes utilizados para estabelecer a actividade de FSH e LH na presente invenção são, em todos os casos, bioensaios in vivo que se provou há muito tempo serem um teste específico robusto para assegurar a bioactividade, a potência da FSH e LH para cada gonadotropina obtida, e também a sua razão, podem ser asseguradas.
Um segundo aspecto a considerar é que a patente acima mencionada (W098/20039) descreve a utilização de uma cromatografia de corante de afinidade para purificar gonadotropinas. Este processo poderia levantar algumas questões acerca da contaminação potencial do produto pela perda de corante. Este tipo de compostos estranhos não é desejável em produtos a ser injectados em humanos [Protein Purification de R.K. Scopes, Springler-Verlag Nova Iorque; 2a Edição, página 156 (1998)]. Uma vez que a presente invenção foi concebida para excluir este tipo de cromatografia, o problema de contaminação do corante é uma questão totalmente posta de lado.
Current menotropins (o produto disponível no mercado) pode ter a desvantagem de potenciais reacções alérgicas locais quando são administradas subcutaneamente, devido à presença de contaminantes proteicos. A presente invenção proporciona um método para a purificação e preparação dos primeiros produtos de gonadotropina altamente purificada disponíveis no mercado. Esta metodologia foi especialmente concebida 7 para evitar a utilização de reagentes biológicos, tais como anticorpos, receptores e outros materiais heterólogos e corantes de cromatografia. Além da questão de segurança, a utilização de passos não específicos durante o isolamento permite obter todas as isoformas que estão presentes no material de partida.
Como extensivamente descrito, a heterogeneidade é de particular importância nas hormonas glicoproteicas. Existem pelo menos 20-30 isoformas diferentes de FSH, LH e TSH (Wide, ActaEndocr., Copenh 109, 181-189, 1985). Estas isoformas diferem no seu peso molecular e carga. Embora as isoformas de hormona glicoproteica variem essencialmente na estrutura de oligossacárido, também poderão estar presentes micro-heterogeneidades resultantes de diferenças na composição de aminoácidos (Costagliola et al., J. Endocrinol. Invest., 17, 291-299,1994; Wilson et al., J. Endocrinol 125, 3-14, 1990). Ê geralmente aceite que o tipo de isoformas diferentes isoladas depende, entre outros factores, das técnicas de isolamento (Cockburn et al., Biologicals 19, 257-264, 1991). A utilização de técnicas altamente discriminantes para o isolamento, tais como anticorpos monoclonais, pode contribuir para seleccionar apenas uma parte das isoformas presentes na fonte de material. Por serem "demasiado específicas", algumas variantes de gonadotropína biologicamente activas poderão não ser reconhecidas pelos anticorpos e poderão ser perdidas (Costagliola et al., J. Endocrinol. Invest. 17, 291-299, 1994). Por outro lado, uma abordagem não selectiva, tal 8 como a descrita nesta patente, pode ser útil para purificar todos os tipos de isoformas presentes na urina. Verificou-se que diferentes isoformas variam em relação à interacção com os receptores de superfície celular e eliminação metabólica (Thotakura et ai., Glycobiology 5, 3-10, 1995) . A estrutura dos oligossacãridos está sob o controlo de vários factores fisiológicos. Do ponto de vista terapêutico, é interessante ter um produto em que todas as isoformas presentes na urina estão disponíveis. Deste modo, os produtos altamente purificados aqui descritos proporcionam os papéis diferenciais das isoformas de gonadotropina que ocorrem naturalmente, na manutenção da função reprodutora.
Deve também sublinhar-se que o presente pedido é a primeira caracterização de uma preparação de menotropinas altamente purificadas que foi confirmada, não só pela sua potência biológica elevada, mas também por métodos de pesquisa relevantes (electroforese PAGE, HPLC, cromatografia de exclusão de tamanhos).
Estando agora disponível num grau purificado e numa grande escala, estas moléculas de FSH e LH que ocorrem naturalmente podem ser investigadas e cuidadosamente analisadas. A estrutura tridimensional das hormonas pode contribuir para uma melhor compreensão do papel dos oligossacãridos. O método para obter as menotropinas actualmente produzidas é bem conhecido. Como indicado em BP 1980, as menotropinas podem ser preparadas a partir de urina de 9 mulheres em pós-menopausa por adsorção em caolino, eluição subsequente com bases e precipitação com 2 volumes de acetona. A fracção necessária é extraída deste precipitado com uma solução de acetato de amónio em etanol a 70% e em seguida precipitada com uma solução de acetato de amónio a 10% em etanol a 90%. O produto de menotropinas é obtido por cromatografia de troca iónica deste precipitado. 0 material de partida, daqui para a frente "material fonte de HMG", que pode ser utilizado na presente invenção para se obterem menotropinas altamente purificadas, constitui a especialidade de menotropinas, como especificado nas farmacopeias (USP XXIII, BP 1993 adenda 1995; EP 1986) ou qualquer outro material estreitamente relacionado com esta especialidade. Assim, deve entender-se que este processo de preparação também é aplicável a outros materiais que não preenchem rigorosamente os requisitos aplicáveis às menotropinas. De facto, obtiveram-se resultados satisfatórios utilizando a fracção C (veja-se a descrição da invenção, exemplo 1 e exemplo 2) que é um material que não preenche o requisito das menotropinas da razão FSH/LH (FSH:LH, 1:1 aproximadamente). Além disso, a presente invenção proporciona um processo para ajustar a razão FSH:LH quando necessário, sendo portanto capaz de proporcionar especialidade de menotropinas altamente purificadas, mesmo quando se utilizam materiais de partida que estão fora da razão FSH:LH correcta. Devido a isso é possível obter um produto constituído por FSH e LH na razão adequada de 1:1 necessária para produzir a preparação 10 farmacêutica, sem ter separado os dois princípios activos durante a purificação, isto é, realizar a co-purificação de ambas as hormonas, de um grau de pureza de aproximadamente 5% no material de partida, para mais de 95% no produto final, com uma potência final 25-35 vezes maior do que a inicial. O grau de purificação tal como obtido pode ser visualizado na Figura 1, que mostra o resultado de uma electroforese em gel de poliacrilamida do produto farmacêutico convencional versus a nova versão purificada obtida da aplicação da presente invenção.
Os passos descritos na presente invenção podem ser utilizados seguindo uma ordem diferente da aqui descrita, o que não implica alterar a filosofia da invenção. Obtiveram-se resultados igualmente satisfatórios inserindo a resina de interacção hidrófoba entre os dois passos de cromatografia de troca iónica descritos mais à frente. A presente invenção também proporciona a preparação de gonadotropinas urinárias separadamente, isto é, FSH e LH. A administração de composições de menotropinas para fins terapêuticos tem sido realizada essencialmente por injecção intramuscular. Esta forma de administração cria um desconforto considerável no paciente e requer do paciente visitas regulares a unidades clínicas, por vezes durante semanas ou meses, a fim de receber o tratamento. 11 A administração subcutânea tornaria a auto-administração possível e iria consequentemente melhorar a cooperação e cumprimento do regime por parte do paciente. A administração subcutânea de gonadotropinas urinárias já foi descrita (Nakamura Y., et al., Fértil Steril 51, 423-429,1989; Engmann L. et al. Fértil Steril. 69, 836-840, 1998). A administração subcutânea de preparações não puras pode ter a desvantagem de alergias locais, devido à presença de impurezas no produto utilizado e resultar consequentemente na suspensão do tratamento. Assim, é útil produzir produtos altamente purificados que possam diminuir a possibilidade destas reacções alérgicas.
Sumário da invenção A presente invenção refere-se a um método para preparar composições de FSH e/ou LH de actividade biológica elevada a partir de urina humana bruta de mulheres em menopausa ou pós-menopausa. A pureza química é superior a 95%, tal como medido por HPLC, enquanto que a actividade biológica específica é superior a 2500 IU/mg de proteína para a FSH e LH para menotropinas e superior a 5000 IU/mg para folitropina. O processo de separação e purificação de gonadotropinas urinárias humanas de actividade biológica e pureza química elevadas a partir de gonadotropinas brutas, incluindo material fonte de HMG, totalmente isentas de materiais contaminantes estranhos derivados da 12 utilização de reagentes biológicos ou corantes cromatográficos, compreende essencialmente os seguintes passos: 1) purificação das referidas gonadotropinas brutas diluídas em acetato de amónio 0,05-0,15 M, pH 5,0-6,0 numa coluna de troca iónica com uma resina catiónica forte do tipo sulfopropilo, eluindo quer FSH, quer LH com soluções de acetato de amónio 0,Q5-0,5M, pH 5,0-7,0; e 2) purificação desta fracção diluída em acetato de amónio 0,01-0,05M, pH 5,0-7,0 numa coluna de troca iónica com uma resina aniónica forte do tipo amónio quaternário, eluindo quer a FSH, quer LH com soluções de acetato de amónio 0,05-0,2 M, pH 5,0-7,0; e 3) purificação de gonadotropinas numa coluna com tuna resina de interacção hidrófoba pela adição sequencial de pelo menos duas das seguintes soluções: a) tampão fosfato de sódio 50-200 mM e sulfato de amónio 0,1-1,2 M, pH 5,0-6,0; b) tampão fosfato de sódio 50-200 mM e sulfato de amónio 0,4-0,6 M; pH 5,0-7,0,- c) tampão fosfato de sódio 50-200 mM (50-70% v/v) e etanol a 96% (50-30% v/v) ou 13 inserindo a resina de interacção hidrófoba entre os dois passos de cromatografia de troca iónica.
As resinas do tipo SP-Sepharose, Q-Sepharose e resinas de interacção hidrófoba podem ser utilizadas nestes passos. Uma resina de interacção hidrófoba preferida é a resina de fenil-Sepharose. O processo da invenção compreende também passos secundários de precipitação, centrifugação, ultrafiltração, diálise, lavagem, secagem in vacuo e arrefecimento. 0 último passo deste processo pode ser selectivamente realizado para se obterem fracções que têm apenas actividades de menotropinas, FSH ou LH.
Uma das principais vantagens do processo da presente invenção é que o processo não inclui reagentes biológicos e substratos e o produto é isento de biomateriais como impurezas. 0 material de partida utilizado na presente invenção para produzir menotropinas altamente purificadas e FSH altamente purificada é essencialmente obtido por um método muito bem conhecido que utiliza caolino para adsorver gonadotropinas da urina menopáusica/pós-menopãusica (BP 1980). Em resumo, a fracção bioactiva é extraída da urina acidificada com caolino, eluída com base e precipitada com 2 volumes de acetona. Em seguida, a fracção bioactiva é extraída deste precipitado com uma solução a 10% p/v de acetato de amónio em etanol (70%) e 14 precipitada com acetato de amónio a 10% em etanol (90%). Faz-se nova purificação por cromatografia de troca iónica. O material purificado obtido por este processo constitui a composição de menotropinas ou alguma outra preparação equivalente, tal como a fracção C.
As menotropinas ou equivalente (Fracção C) são cromatografadas numa coluna de troca iónica forte, sendo a fracção activa eluída com acetato de amónio 0,2-0,5 M, pH 5,0-7,0. Obtém-se um novo precipitado (fracção F) por adição de 4 volumes de etanol. A fracção F é cromatografada numa coluna de troca iónica forte, sendo a fracção activa eluída com um tampão acetato de amónio 0,05-0,2 M, pH 5,0-7,0. A fracção activa é congelada a -75°C (fracção G). A fracção G é analisada por um teste biológico para determinar exactamente o seu teor de FSH e LH. Dependendo da razão encontrada entre ambas as hormonas, faz-se o seguinte passo cromatográfico, sendo possíveis duas alternativas: 1) co-purificação de ambas as hormonas. 2) separação da actividade hormonal que está em excesso, de modo a obter menotropinas com FSH/LH a 1:1. Alternativamente, a separação de ambas FSH e LH proporciona boas actividades separadamente, para fins terapêuticos (FSH limpo e LH limpo).
Uma vez determinados os passos a realizar, a fracção G é dialisada e concentrada de modo a adapta-la às 15 necessidades do passo cromatogrãfico seguinte. A solução resultante é cromatografada numa coluna de interacção hidrófoba, eluindo as fracções activas de acordo com dois processos alternativos, tendo em conta as opções l) e 2) acima. As fracções líquidas que são obtidas (fracções J2, J3, J4) são congeladas a -75°C. Em seguida, estas fracções são descongeladas, dialisadas e concentradas, filtradas através de uma membrana de esterilização e precipitadas adicionando 4 volumes de etanol, obtendo-se um precipitado que é seco in vacuo até à secura (fracção K).
Breve descrição das figuras A Figura 1 representa uma corrida de electroforese do produto convencional (HMG) versus o produto de menotropinas altamente purificadas (fracção KM). A Figura 2 representa uma corrida de PAGE (electroforese em gel de poliacrilamida) de menotropinas altamente purificadas (Fracção Km) corridas em diferentes concentrações, juntamente com padrões de peso molecular. A Figura 3 representa uma corrida de PAGE de uma FSH altamente purificada (fracção KF) em diferentes concentrações, juntamente com padrões de peso molecular. A Figura 4 representa uma corrida de PAGE de 1) Gonal-F (Serono) 1 IU de FSH /μΐ, 2) Metrodine HP (Serono) 3 IU de FSH /μΐ, 3) menotropinas altamente purificadas (Fracção KM) 3,7 IU de FSH /μΐ e 4) padrões 16 de peso molecular (desde o topo) 14.400 D, 20.100 D, 30.000 D, 43.000 D, 67.000 D e 94.000 D. A Figura 5 representa uma focagem isoeléctrica em PhastGel 3-10 corados com prata, em que: a coluna l corresponde a kits de calibração para pi 3-10 largo, a coluna 2 corresponde a um padrão de pi 4,55 (inibidor de tripsina de soja), a coluna 3 corresponde a um padrão de pi 5,85 (anidrase carbónica B de bovino) e as colunas 4, 5 e 6 correspondem a produto de folitropina altamente purificada (KF) (3 lotes de produção diferentes). A Figura 6 representa uma focagem isoeléctrica em PhastGel 3-10 corado com prata, em que a coluna l corresponde aos kits de calibração para pi 3-10 largo e a coluna 2 corresponde ao produto de menotropinas (¾) altamente purificadas. A Figura 7 é o resultado obtido por HPLC com uma amostra de menotropinas altamente purificadas (fracção KM) · A Figura 8 é o resultado obtido por HPLC com uma amostra de FSH altamente purificada (fracção KF) . A Figura 9 é o resultado obtido por HPLC com uma amostra de Gonal-F (Serono) (0 pico no tempo de retenção 11,2 corresponde a um excipiente da preparação farmacêutica) e 17 A Figura 10 é um fluxograraa do processo para obter as gonadotropinas altamente purificadas da presente invenção.
Descrição pormenorizada da invenção a) Fluxograma O fluxograma para obter gonadotropinas altamente purificadas é apresentado na Figura 10. A técnica de elaboração da fracção KM constituída por menotropinas purificadas será descrita a seguir.
b) Preparação da fracção F A fracção F é cromatografada numa coluna cromatográfica contendo 10 litros de resina de troca catiónica forte do tipo sulfopropilo. A fracção C (110-140 g) é dissolvida em 1600-1800 ml de uma solução de acetato de amónio 0,05-0,15 M, pH 5,0-7,0. A coluna é corrida e eluída com a quantidade necessária de solução de acetato de amónio 0,05-0,15 M para perfazer o volume para 20 litros. A eluição é continuada com soluções de acetato de amónio 0,15-0,20 M, pH 5,0-7,0 (20 litros) e acetato de amónio 0,2-0,5 M, pH 5,0-7,0 (20 litros). A fracção activa eluída com a última solução é adicionada com agitação a 4 volumes de etanol a 96% e ácido acético suficiente para se obter um pH da mistura de 5,5-5,7. Forma-se um precipitado, separa-se 18 por centrifugação, lava-se com etanol e seca-se in vacuo até se remover o etanol e a humidade ser inferior a 5% (fracção F).
c) Preparação da fracção G A fracção F é cromatografada numa coluna cromatogrãfica contendo 4 litros de uma resina de troca aniónica forte do tipo amónio quaternário. A fracção F (40-60 g em 650 ml) é dissolvida em solução de acetato de amónio 0,01-0,05 M, pH 5,0-7,0, a coluna é corrida e elulda com a mesma solução para perfazer um volume de 7 litros. A eluição é continuada com 12 litros de acetato de amónio 0,05-0,07 M, pH 5,0-7,0, em seguida com 10 litros de acetato de amónio 0,07-0,2 M, pH 5,0-7,0. A fracção activa eluída com a última solução é submetida a um processo de ultrafiltração utilizando uma membrana de ultrafiltros PM 10 (10000D) (Amicon-Millipore). A solução é concentrada e dialisada contra tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 5,5-5,7 a uma concentração de 2-4 g de proteína em 100-150 ml de tampão. Em seguida é congelada a -75°C (Fracção G).
d) Preparação da fracção J A fracção G é cromatografada numa coluna cromatogrãfica contendo 400 ml de uma resina de interacção hidrófoba (fenil Sepharose HP, Amersham-Pharmacia Biotech). 19
Adiciona-se uma quantidade suficiente de sulfato de amónio à solução da fracção G para obter uma concentração de 0,8-1,2 M. 0 processo cromatográfico a ser realizado irá permitir a co-purificação de FSH e LH ou a separação de ambas as hormonas. A linha de acção dependerá das análises anteriores realizadas com a fracção G (testes biológicos) através das quais se determinou a razão FSH: LH. Uma vez conhecida esta razão, a quantidade de hormona em excesso da razão FSH:LH a 1:1 será removida. d-2) se o produto é equilibrado (FSH:LH a 1:1) a cromatografia da fracção G concentrada e dialisada será realizada como se segue: colocar a solução de fracção G na coluna cromatográfica, 0,8-1,2 M em sulfato de amónio. - eluir com 2 volumes de tampão fosfato de sódio 50-200 mM, sulfato de amónio 0,8-1,2 M, pH 5,0-7,0. - continuar a eluição com 2 volumes de tampão fosfato 50-200 mM (50-70% v/v) e etanol a 96% (50-30% v/v) . A fracção activa eluída com o último tampão (fracção J4) é congelada a -75°C. Esta fracção tem actividade de FSH e LH. 20 d-2) Se a razão FSH:LH da fracção G é diferente de 1:1, a quantidade de hormona em excesso será removida como se segue: - correr uma alíquota da solução da fracção G na coluna cromatográfica, sulfato de amónio 0,8-1,2 M. - eluir com 2 volumes de tampão fosfato de sódio 50-200 mM, sulfato de amónio 0,8 -1,2 M pH 5,0-7,0. - continuar a eluição com 2 volumes de tampão fosfato de sódio 50-200 mM, sulfato de amónio 0,4-0,6 M, pH 5,0-7,0 e por fim com 2 volumes de tampão fosfato 50-200 mM (50-70% v/v) e etanol a 96% (50-30% v/v). A fracção activa eluída com tampão fosfato de sódio 50-200 mM, sulfato de amónio 0,4-0,6 M (fracção J2) é congelada a -75°C. Esta fracção tinha essencialmente actividade de FSH. A fracção activa eluída com tampão fosfato 50-200 mM (50-70% v/v) e etanol a 96% (50-30% v/v) (Fracção J3) é congelada a -75°C. Esta fracção apenas tem actividade de LH.
Preparação da fracção K
As fracçóes J2, J3, J4 são descongeladas, dialisadas e concentradas utilizando ultrafiltração através de uma membrana PM 10 (Ultrafiltros Diaflo, Amicon-Millipore) contra um tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 5,7. 21
Cada solução resultante é filtrada utilizando uma membrana de 0,45 μ nas condições necessárias para se obter um produto estéril e em seguida adicionada a 4 volumes de etanol a 96% e ácido acético suficiente para se obter um pH da mistura de 5,5-5,7. Deixa-se a mistura em repouso durante a noite. O precipitado é separado por centrifugação e seco in vacuo até se remover o etanol e a humidade ser inferior a 5% {fracção K).
As propriedades da fracção K podem variar, dependendo da fracção precipitada ser J2, J3 ou J4. A fracção KM obtida da fracção J4 irá conter unidades aproximadamente equivalentes de FSH e LH. A fracção KF obtida da fracção J2 irá compreender vestígios de FSH e LH. A fracção KL obtida da fracção J3 será constituída por vestígios de LH e FSH.
Exemplos de lotes produzidos pelas técnicas descritas Exemplo 1 1.1 Preparação da fracção F
Dividiram-se 231,2 g da fracção C em duas porções iguais e cromatografou-se em dois processos equivalentes numa coluna cromatográfica, como descrito acima.
Dissolveram-se 115,6 g da fracção C (em cada processo) em 1700 ml de tampão acetato de amónio 0,05 M, pH 5,0. A coluna foi corrida e eluída com mais 18,7 litros do mesmo tampão cromatográfico. A eluição foi 22 continuada com 20 litros de tampão acetato de amónio 0,15 M, pH 5,0 e por fim com 20 litros de tampão acetato de amónio 0,5 M, pH 5,0. A fracção activa obtida eluindo com acetato de amónio 0,5 M (22 litros) foi adicionada com agitação a uma solução de 88 litros de etanol a 96% e 2400 ml de ácido acético. O pH da mistura era 5,7. 0 precipitado obtido foi deixado no frigorífico (2-8°C) durante a noite. O precipitado foi centrifugado, lavado com etanol a 96% e seco in vacuo durante 17 h.
Em cada um dos dois processos equivalentes, obtiveram-se duas fracções F de 20,7 g e 19,5 g, respectivamente.
1.2 Preparação da fracção G
As duas fracções F obtidas no passo acima foram reunidas e cromatografadas em coluna, de acordo com a técnica descrita.
Dissolveram-se 40,2 g da fracção F em 650 ml de tampão acetato de amónio 0,01 M, pH 5,0. A coluna foi corrida com esta solução e eluída com 630 ml do mesmo tampão de diluição. A eluição foi então continuada com 12 litros de acetato de amónio 0,05 M, pH 5,0 e em seguida com 10 litros de acetato de amónio 0,2 M, pH 5,0. A fracção activa (4500 ml) eluída com a última solução foi submetida a um processo de ultrafiltração utilizando uma membrana ultrafiltro Diaflo PM 10 (10000 D) (Amicon-Millípore). A solução é concentrada e dialisada contra fosfato de sódio 50 mM, pH 5,7 para se obter uma 23 concentração de 2-4 g de proteína em 150 ml de tampão. A solução final (400 ml) foi congelada a -75°C. A fracção G foi testada biologicamente em animais, detectando uma potência de FSH de 42.000 IU/ml e uma potência de LH de 33.780 IU/ml. Com este resultado, considerou-se necessário processar uma porção da solução (80 ml) da fracção G sob condições para separar a FSH e LH (fracções J2 e J3, respectivamente. 0 resto (320 ml) foi cromatografado sob condições em que não se separam as duas hormonas (fracção J4). Misturaram-se então alíquotas da fracção J3 e fracção J4 para obter uma razão FSHtLH final de aproximadamente 1:1 (fracção Km).
1.3 Preparação da fracção J i) Preparação de fracções J2 (FSH altamente purificada) e J3 (LH altamente purificada)
Adicionou-se sulfato de amónio a uma alíquota da fracção G (80 ml) até uma concentração de 1 M. Esta solução foi corrida numa coluna cromatográfica de fenil-Sepharose HP e eluída com 2 volumes de tampão fosfato de sódio 50 mM, sulfato de amónio 1 M, pH 5,1. A eluição foi continuada com 2 volumes de tampão fosfato de sódio 50 mM, sulfato de amónio 0,5 M, pH 5,1 e por fim com 2 volumes de tampão fosfato de sódio 50 mM (60% v/v) e etanol a 96% (40% v/v). A fracção activa de FSH eluída com tampão fosfato de sódio 50 mM, sulfato de amónio 0,5 M, pH 5,1 (fracção J2) foi dialisada e concentrada utilizando uma membrana de 24
ultrafiltração PM 10 (Ultrafiltros Diaflo, Amicon-Millipore) contra um tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7.5 e em seguida congelada a -75°C.
A fracção activa de LH eluída com tampão fosfato de sódio 50 mM (60% v/v) e etanol a 96% (40% v/v) (fracção J3) foi dialisada e concentrada utilizando uma membrana de ultrafiltração PM 10 (Ultrafiltros Diaflo, Amicon-Millipore) contra um tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7.5 e em seguida congelada a -75°C. ii) Preparação da fracção J4 (menotropinas altamente purificadas)
Descongelou-se uma segunda alíquota da fracção G (320 ml) e adicionou-se sulfato de amónio até se obter uma concentração de 1M. Esta solução foi corrida numa coluna cromatogrãfica de fenil-Sepharose HP e foi eluída com 2 volumes de tampão fosfato de sódio 50 mM, sulfato de amónio 1 M, pH 5,1. A eluição foi continuada com 2 volumes de fosfato 50 mM (60% v/v) e etanol a 96% (40% v/v) . A fracção eluída com este tampão (fracção J4) foi congelada a -75°C.
1.4 Preparação da fracção K
As fracçóes J3 (40 ml) e J4 (25 ml) foram descongeladas, filtradas através de uma membrana de 0,45 μ nas condições necessárias para se obter um produto estéril (volume final de 100 ml) e em seguida misturadas 25 e agitadas com 4 volumes de etanol a 96% (400 ml) e ácido acético necessário para se obter um pH de 5,5 (1 ml) . A fracção J2 (40 ml) foi descongelada, filtrada através de uma membrana de 0,45 μ nas condições necessárias para se obter um produto estéril (volume final de 60 ml) e em seguida misturada e agitada com 4 volumes de etanol a 96% (400 ml) e ácido acético necessário para se obter um pH de 5,5 (0,5 ml).
Deixaram-se as fracções precipitar no frigorífico durante a noite a 2-8°C. Na manhã seguinte, o precipitado de menotropinas altamente purificadas obtido da fracção J3 e J4 foi separado por centrifugação e seco in vacuo, até se remover o etanol e a humidade ser inferior a 5% (fracção KM, 4,50 g) . O precipitado de FSH altamente purificada obtido da fracção J2 foi separado por centrifugação e seco in vacuo até se remover o etanol e a humidade ser inferior a 5% (fracção KF, 0,55 g) . 1.5 Resultados A análise biológica realizada com as fracções KM (menotropinas altamente purificadas) e KF (FSH altamente purificada) exibiam os seguintes resultados: 26
Fracção Potência de FSH (IU/mg) Actividade específica (IU/mg de proteína) Potência de LH (IU/mg) K„ 2.870 3.700 2.635 KF 6.895 8.900 <1 IU de LH /75 III de FSH
Tabela de rendimento
Fracção IU de FSH IU de LH Rendimento relativo Fase anterior FSH% LH% Rendimento total FSH% LH% C 19.276.000 15.604.000 — — — — p 18.408.000 14.980.000 95,5 96,0 95,5 96,0 G 16.800.000 13.512.000 91,3 90,2 87,2 86,6 KM 12.915.000 11.857.000 76,9 87,8 67,0 76,0 Kp 3.792.000 50.600 22,6 — 19,7 —
Exemplo 2
2.1 Preparação da fracção F
Dividiram-se 250,06 g da fracção C em duas porções iguais e cromatografou-se em dois processos equivalentes numa coluna cromatográfica, como a descrita acima. 27
Dissolveram-se 125,03 g da fracção C (em cada processo) em 1.700 ml de tampão acetato de amónio 0,05 M, pH 5,1. Em seguida, a coluna foi corrida e aluída com mais 18,7 litros do mesmo tampão cromatográfico. A eluição foi continuada com 20 litros de tampão acetato de amónio 0,15 M, pH 5,1 e por fim com 20 litros de tampão acetato de amónio 0,5 M, pH 5,1. A fracção activa obtida por eluição com acetato de amónio 0,5 M (22 litros) foi adicionada sob agitação a 88 litros de etanol a 96% e 2.200 ml de ácido acético. O pH da mistura era de 5,7. Observou-se o aparecimento de um precipitado. A mistura foi deixada no frigorífico a 2-8°C durante a noite. 0 precipitado foi centrifugado, lavado com etanol a 96% e seco ín vacuo durante 22 h.
Em cada processo equivalente, obtiveram-se duas fracções F de 21,57 g e 21,15 g, respectivamente.
2.2 Preparação da fracção G
As duas fracções obtidas na fase anterior foram reunidas e cromatografadas em coluna de acordo com o processo descrito acima.
Dissolveram-se 42,58 g da fracção F em 650 ml de tampão acetato de amónio 0,01 M, pH 5,1. Esta solução foi corrida na coluna e eluída com 6,350 ml do mesmo tampão de dissolução. A eluição foi continuada com 12 litros de acetato de amónio 0,05 M, pH 5,0 e em seguida com 10 litros de acetato de amónio 0,2 M, pH 5. A fracção activa (4.500 ml) eluída com esta última solução foi submetida a 28 um processo de ultrafiltração com uma membrana PM10 (10.000 D) (Ultrafiltros Diaflo, Amicon-Millipore), A solução foi concentrada e dialisada contra um tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 5,7, até se obter uma concentração de 2-4 g de proteína em 150 ml de tampão. O volume final de 500 ml foi congelado a -75°C. A fracção G foi testada biologicamente em animais, apresentando uma potência de FSH de 49.790 IU/ml e uma potência de LH de 39.600 IU/ml, Com esta análise, considerou-se necessário processar uma parte da solução (100 ml) da fracção G sob condições para separar a FSH e LH (fracções J2 e J3, respectivamente) e o resto (400 ml) sob condições de modo a não separar ambas as hormonas (J4) .
Misturaram-se alíquotas da fracção J3 e J4 para se obter uma razão final FSH:LH de aproximadamente 1:1 (Fracção KM) .
2.3 Preparação da fracção J i) Preparação da fracção J2 (FSH altamente purificada) e J3 (LH altamente purificada):
Adicionou-se sulfato de amónio a uma alíquota da Fracção G (100 ml) até se obter uma concentração de 1 M. Esta solução foi corrida na coluna cromatográfica de fenil-Sepharose HP e foi eluída com 2 volumes de tampão fosfato de sódio 50 mM, sulfato de amónio 1 M, pH 5,1. Em seguida, a eluição é continuada com 2 volumes de tampão fosfato de sódio 50 mM, sulfato de amónio 0,5 M, pH 5,1 e 29 por fim com 2 volumes de fosfato de sódio 50 mM (60% v/v) e etanol a 96% (40% v/v). A fracção activa de FSH eluída com tampão fosfato de sódio 50 mM, sulfato de amónio 0,5 M, pH 5,1 (fracção J2) foi dialisada, concentrada utilizando ultrafiltração com uma membrana PM 10 (Ultrafiltros Diaflo, Amicon-
Millipore) contra um tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 5,7 e em seguida congelou-se a -75°C. A fracção activa de LH eluída com tampão fosfato de sódio 50 mM (60% v/v) e etanol a 96% (40% v/v) (fracção J3) foi dialisada, concentrada utilizando ultrafiltração em membrana com uma membrana PM10 (Ultrafiltros Diaflo, Amicon-Millipore) contra um tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 5,7 e foi congelada em seguida a -75°C. ii) Preparação da fracção J4 (menotropinas altamente purificadas):
Adicionou-se sulfato de amónio a uma segunda alíquota da fracção G (400 ml) até se obter uma concentração de 1 Μ. A solução foi corrida numa coluna cromatográfica de fenil-Sepharose HP e foi eluída com 2 volumes de tampão fosfato de sódio 50 mM, sulfato de amónio 1M, pH 5,1. A eluição foi continuada com mais 2 volumes de tampão fosfato 50 mM (60% v/v) e etanol a 96% (40% v/v). A fracção activa eluída com este tampão (fracção J4) foi congelada a -75°C.
2.4 Preparação da fracção K 30
As fracções J3 (50 ml) e J4 (30 ml) foram descongeladas, filtradas através de uma membrana de 0,45 μ nas condições necessárias para se obter um produto estéril (volume final 110 ml) e em seguida foram adicionadas sob agitação a 4 volumes de etanol a 96% (440 ml) e ácido acético suficiente para se obter um pH de 5,5 (1 ml). A fracção J2 (50 ml) foi descongelada, filtrada através de uma membrana de 0,45 μ nas condições necessárias para se obter um produto estéril (volume final 70 ml) e em seguida foi adicionada sob agitação, a 4 volumes de etanol a 96% (280 ml) e ácido acético suficiente para se obter um pH de 5,5 (0,5 ml).
Deixaram-se as fracções precipitar no frigorífico durante a noite a 2-8°C. Na manhã seguinte, o precipitado de menotropinas altamente purificadas obtido a partir das fracções J3 e J4 foi separado por centrifugação e seco in vacuo até se remover o etanol e a humidade ser inferior a 5% (fracção KM, 5,71 g). 0 precipitado de FSH altamente purificada obtido da fracção J2 foi separado por centrifugação, seco in vacuo até se remover o etanol e a humidade ser inferior a 5% (fracção KP, 0,70 g) . 2.5 Resultados 31 A análise biológica realizada com as fracções KM (menotropinas altamente purificadas) e KF (FSH altamente purificada) apresentava os seguintes resultados:
Fracção Potência de FSH (IU/mg) Actividade específica (IU/mg de proteína) Potência de LH (IU/mg) Km 3.344 4.300 3.022 6.500 8.400 <1 IU de LH /75 IU de FSH 2.6 Tabela de rendimento
Fracção IU de FSH IU de LH Rendimento relativo Fase anterior FSH% LH% Rendimento total FSH% LH% C 29.000.000 21.900.000 — — — — F 27.800.000 21.200.000 95,9 96,8 95,9 97,0 G 24.900.000 19.800.000 89,6 93,4 85,9 90,4 K„ 19.094.000 17.255.000 76,7 87,1 65,8 78,8 KF 4.550.000 < 60.600 18,3 — 15,7 —
Também se obtiveram produtos altamente purificados utilizando o processo da presente invenção, começando com materiais menos activos. Neste caso, obteve-se uma FSH de cerca de 5000 IU/mg de proteína e menotropinas com uma 32 potência de cerca de 2500 IU/mg de proteína para ambas, FSH e LH. 2.7 Caracterização dos produtos obtidos
As fracções Km e KF foram caracterizadas pelas seguintes técnicas: 2.7a) electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) 2.7 b) electroforese em gel de poliacrilamida seguida de análise de transferência Western 2.7 c) isoelectrofocagem
2.7 d) cromatografia de exclusão de tamanhos (SEC) em HPLC 2.7 e) medição do teor de proteína 2.7 f) doseamento da potência biológica em animais (anteríormente informado) 2.7 a) Electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE)
As fracções KM e KF foram analisadas por electroforese de acordo com o seguinte procedimento:
Equipamento: sistema de electroforese em gel de poliacrilamida ultrafino, Phastsystem (Amersham Pharmacia Biotech)
Geles: Phast Gel gradiente 8-25 (Amersham Pharmacia
Biotech).
Tampão: tiras de tampão/SDS (Amersham Pharmacia Biotech). 33 Técnica de separação: Ficheiro 110, PhastSystem, SDS-Page Técnica de desenvolvimento: Ficheiro 200, PhastSystem para Coomassíe Brilliant Blue.
Sondas de baixo peso molecular: kit de calibração electroforética contendo 6 proteínas purificadas (Amersham Pharmacia Biotech).
Peso molecular Fosforilase b 94.000 D Albumina 67.000 D Ovalbumina 43.000 D Anidrase carbónica 30.000 D Inibidor de tripsina 20.100 D a-lactalbumina 14.400 D
Cada frasco de kit contém uma mistura liofilizada com aproximadamente 100 μg de cada proteína. Cada frasco foi dissolvido com 100 μΐ de tampão de amostra.
Tampão de amostra
Dissolveram-se 250 mg de SDS e 0,5 ml de β-mercaptoetanol em 10 ml de tampão A.
Tampão A: EDTA 1 mM 372 mg TRIS 10 mM 1,21 mg H20 q.b.p 1.000 ml pH 8,0 34
As amostras foram dissolvidas de modo a que a concentração final fosse de 1.100-1.300 IU de FSH/ml de tampão de amostra.
Tratamento da amostra A amostra foi aquecida a 100°C durante 5 min. Adicionou-se azul de bromofenol até se obter uma concentração de 0,01%.
Após a corrida electroforética e desenvolvimento, os geles foram secos com ar quente.
Resultados obtidos
As corridas de electroforese das fracções Km (Figura N.° 2) e KF (Figura N.° 3) deram como resultado um perfil em que se observa, quase de forma exclusiva, uma única banda desenvolvida com Coomassie Brilliant Blue com uma distância de migração a meio caminho entre os padrões de peso molecular de 20.100 D e 30.000 D, indicando um peso molecular aproximado de 25.000 D.
Amostra Padrão de 20.100 D 0,196 Fracções Km-Kk 0,250 Padrão de 30.000 0,300 35 A atribuição da banda observada na electroforese das fracções KP e Km foi realizada de dois modos: a) por comparação com 2 produtos comerciais contendo FSH como único ingrediente activo: Gonal-F (Serono) contendo FSH de origem recombinante, Metrodine HP (Serono) contendo FSH de origem urinária (veja-se Figura 4). b) por electroforese-transferência Western como indicado em 2.7b). 2.7b) Electroforese em gel de poliacrilaaida seguida de análise de transferência Western
As amostras das fracções KF e KM foram analisadas por transferência Western. Após se realizar um processo de electroforese em poliacrilamida num gradiente semelhante ao descrito em 2.7a), as bandas foram transferidas para um suporte de nitrocelulose e desenvolvidas por acção de anticorpos. Utilizaram-se anticorpos específicos para a cadeia β de FSH e cadeia β de LH e contra a cadeia α de ambas as hormonas. - Técnica: utilizou-se a técnica de transferência N°221 para Phastsystem (Amersham Pharmacia Biotech) utilizando o seguinte tampão de transferência:
Tampão de transferência: Tris 25 mM, Glicina 192 mM, pH 8,3 contendo metanol a 20%.
Membrana: Probind 45, poro de 0,45 jum
Condições de transferência: 25 V, 25 mA, 1W, 45 min. 36
Corado com azul de Coomassie:
Solução de coloração: solução a 0,1% de Phast Gel Blue R em metanol a 30% e ácido acético a 10% em água destilada.
Solução final: misturar 1 parte da solução de coloração com 1 parte de ácido acético a 2 0% em água destilada.
Procedimento: corar a membrana na solução final durante 30 minutos com agitação cuidadosa. Lavar a membrana com solução de metanol:água:ácido acético (30:60:10) duas vezes e em seguida com ácido acético a 20%. - Procedimento de detecção: utilizou-se o método de detecção por estreptavidina-biotina.
Tampão utilizado: PBS (fosfato de sódio 0,01 M, clorato de sódio 0,25 M, pH 7,6) .
Solução de bloqueio: Albumina a 5% em PBS
Solução de lavagem: a) albumina a 5% em PBS, b) PBS.
Solução de anticorpo primário: utilizaram-se os seguintes anticorpos primários. 1) anticorpo monoclonal anti-p-LH (Immunotech) (IgGl-ratinho), N.° de catálogo 0374. 37 2) anticorpo monoclonal anti-p-FSH (Immunotech) (IgGl-ratinho), N.° de catálogo 0373. 3) anticorpo monoclonal contra a subunidade-α de hormonas pituitárias (Immunotech) (IgGl-ratinho) , N.° de catálogo 0375. - Diluição: diluir o anticorpo primário 1:100 - Solução de anticorpo secundário: o anticorpo secundário utilizado era: fragmento F(ab')2 de cabra anti-IgG de ratinho (H+L), (cadeia pesada e cadeia leve) purificado por afinidade conjugado com biotina-SP (Immunotech, N.° de Cat. 0816) diluído 1:500 em PBS. - Solução de estreptavidina conjugada com peroxidase: utilizou-se uma diluição 1:500 em PBS de estreptavidina conjugada com peroxidase (Immunotech, N.° de Cat. 0309). - Solução de desenvolvimento: utilizou-se um kit de substrato conjugado com peroxidase de rábano (Bio Rad, N.° de Cat 170-6431), contendo uma mistura de solução de água oxigenada, 4-cloro-l-naftol e tampão para desenvolver a cor, para preparar 1 litro de solução. - Breve descrição do procedimento: 1) incubar a membrana com solução bloqueadora durante a noite 2) lavar com solução de lavagem a) duas vezes, durante 5 min de cada vez 38 3) incubar com solução de anticorpo primário durante a noite 4) lavar com solução de lavagem a) três vezes, durante 5 minutos de cada vez 5) incubar com anticorpo secundário durante 1 hora 6) lavar com solução de lavagem a) três vezes, durante 5 minutos de cada vez 7) incubar com peroxidase conjugada durante 30 minutos 8) lavar com solução de lavagem a) três vezes, durante 5 minutos de cada vez 9) incubar com solução de desenvolvimento durante 10 minutos 10) parar a reacção
Resultados
Após realizar a electroforese em gel de poliacrilamida das fracções 1¾ e KF, as bandas foram transferidas para membranas de nitrocelulose de acordo com a técnica acima indicada e desenvolvidas. Encontraram-se os seguintes resultados.
Fracção Anticorpo Anticorpo Anticorpo anti-p FSH anti-p LH anti-α LH Km Positivo Positivo Positivo K r Positivo Negativo Positivo
Tendo em conta estes resultados, conclui-se que a banda desenvolvida com azul de Coomassie na electroforese da fracção 1¾ tinha actividade de ambas, FSH e LH. Pelo 39 contrário, a fracção KF apenas reagiu de forma positiva contra o anticorpo específico para FSH e não para LH. Tendo em conta que as cadeias-a de FSH e LH são comuns, ambas as fracções KM e KF apresentavam uma reacção positiva com um anticorpo contra a cadeia-a. 2.7.c) Isoelectrofocagem
As fracções KM (FSH altamente purificada) e KF (FSH altamente purificada) foram analisadas por isoelectrofocagem de acordo com o seguinte procedimento:
Equipamento: sistema de electroforese em gel de poliacrilamida ultrafino, Phastsystem (Amersham Pharmacia Biotech).
Geles: Phast Gel IEF 3-9 (Amersham Pharmacia Biotech) Técnica de separação: Ficheiro 100, Phastsystem Técnica de desenvolvimento: kit prata (Amersham Pharmacia Biotech).
Padrões de PI kit de calibração de IEF; kit 3-10 de pi largo) (Amersham Pharmacia Biotech). Inibidor de tripsina de soja, pi 5,85 (Sigma). Anidrase carbónica de bovino, pi 4 ,55 (Sigma).
Tratamento da amostra
As amostras foram dissolvidas para terem uma concentração de 2,5 mg/ml a 1,25 mg/ml.
Após a corrida de electroforese e desenvolvimento, os geles foram secos com ar quente. 40
Resultados obtidos A distribuição de pi para ambos KP (FSH altamente purificada) e Km (menotropinas altamente purificadas) é apresentada na Figura 5 e Figura 6. A natureza ácida das gonadotropinas é confirmada pelo padrão de IEF. De facto, tal como descrito de forma completa na literatura, as isoformas restringem-se à gama ácida.
2.7d) Cromatografia de exclusão de tamanhos (SEC) em HPLC
Descrição do equipamento: - Aparelho de cromatografia líquida de alta eficiência Shimadzu, LC-10AVP, com um injector manual 7725i, com sensor de posição e loop de 20, 50 ou 200 μΐ, Rheodyne. - Detector espectrofotómetro UV-visível modelo SPD-10AVP, Shimadzu (190-600 nm). - Estação de trabalho para processamento dos dados cromatogrãficos Shimadzu Class-CRIO, programa Class CRIO e módulo CBM-101. - Coluna cromatográfica Bio-Rad.Bio-Sil™ SEC250 (300x7,5 mm) - Fase móvel: tampão acetato de sódio 0,1 M. pH 7,0, desgaseifiçado e filtrado - Fluxo: 1,0 ml/min.
Detecção: UV a 220 nm.
Temperatura da Coluna: temperatura ambiente Volume de injecção: 50 a 200 μΐ. 41
Preparação da amostra: injectar aproximadamente 1 ml da fase móvel no frasco contendo a amostra, agitar até dissolução.
Resultados:
Os seguintes cromatogramas das fracções KM e KF mostravam a presença de apenas um pico a um tempo de retenção de aproximadamente 8,1-8,2 seg. 0 tempo de retenção coincide com um obtido por cromatografia de um produto comercial, Gonal-F (Serono) contendo FSH recombinante (vejam-se as figuras 7, 8 e 9). 2.7e) Doseamento de proteína: Método: 0 método de Lowry [Journal of Biological
Chemistry 193, 265(1951)] com um reagente de Folin-
Ciocalteu e uma curva padrão de albumina.
Resultados: A percentagem de proteína para ambas as fracções KM e KF indicadas nos exemplos 1 e 3 era de aproximadamente 77%. 2.7£) Doseamento da potência biológica em animais
Tal como se referiu anteriormente na secção 2.5, as fracções KM e KF foram analisadas biologicamente em ratos. Métodos:
2.7f.1) Doseamento da potência biológica de FSH 42
Utilizou-se o método de Steelman-Pohley [Steelman, S. L. & Pohley, F. M., Endocrinology 53, 604 (1953)] do aumento do peso dos ovários em ratos fêmea imaturos de 21-24 dias de idade, injectados com três doses de um produto que contém FSH. As doses deverão manter uma razão tal que a diferença entre os logaritmos da dose maior e da dose média seja igual à diferença entre os logaritmos da dose média e da dose menor. Utilizaram-se lotes de animais em que a diferença de peso entre o animal mais pesado e o mais leve não era superior a 10 gramas. Os animais foram injectados subcutaneamente durante três dias com três doses diferentes de amostra dissolvidas em tampão fosfato/albumina e as doses correspondentes de um padrão. No quinto dia, os animais foram sacrificados, os ovários foram extraídos e pesados. Os dados obtidos com amostra foram comparados com os dados obtidos com o padrão e a potência das diferentes amostras foi calculada utilizando o esquema estatístico indicado para a análise de uma amostra contra padrão, num teste de 3x3 (veja-se a análise biológica de USP XXIII).
2.7.f.2) Doseamento da potência biológica de LH
Utilizou-se o método de aumento de peso da vesícula seminal em ratinhos macho de 21-24 dias de idade injectados com três doses de um produto contendo LH. As três doses deverão manter uma razão tal que a diferença entre os logaritmos da dose maior e a dose média seja igual à diferença entre os logaritmos da dose média e da dose menor. Utilizaram-se lotes de animais em que a 43 diferença de peso entre o animal mais pesado e o mais leve não era superior a 10 gramas. Os animais foram injectados subcutaneamente durante quatro dias com três doses diferentes da amostra dissolvida em tampão fosfato/albumina e as doses correspondentes de um padrão. No quinto dia, os animais foram sacrificados, as vesículas seminais foram extraídas e pesadas. Os dados obtidos com amostra foram comparados com os dados obtidos com o padrão e a potência das diferentes amostras foi calculada utilizando o esquema estatístico indicado para a análise de uma amostra contra padrão, num teste de 3x3 (veja-se a análise biológica de USP XXIII). 0 padrão utilizado era uma amostra de menotropinas calibrada contra o 3 o padrão internacional de FSH e LH urinária preparado pelo NIBSC (National
Institute of Biological Standards and Control - Grã-Bretanha) dependente da OMS (Organização mundial de saúde).
Lisboa 0 5 JUH. III? 44
Claims (9)
- REIVINDICAÇÕES 1. Processo de purificação de gonadotropinas urinárias humanas com actividade biológica e pureza química elevadas, totalmente isentas de materiais contaminantes derivados da utilização de reagentes biológicos ou corantes cromatográficos, a partir de gonadotropinas brutas, compreendendo os seguintes passos 1) purificação das referidas gonadotropinas brutas diluídas em acetato de amónio 0,05-1,5 M, pH 5,0-6,0 numa coluna de troca iónica com uma resina catiónica forte do tipo sulfopropilo, eluindo quer a FSH, quer a LH com soluções de acetato de amónio 0,05-0,5 M, pH 5,0-7,0;e 2) purificação desta fracção diluída em acetato de amónio 0,01-0,05 M, pH 5,0-7,0 numa coluna de troca iónica, com uma resina aniónica forte do tipo amónio quaternário, eluindo quer a FSH, quer a LH com soluções de acetato de amónio 0,05-0,2 M, pH 5,0-7,0; e 3) purificação de gonadotropinas numa coluna com uma resina de interacção hidrófoba, por adição sequencial de pelo menos duas das seguintes soluções: a) tampão fosfato de sódio 50-200 mM e sulfato de amónio 0,8-1,2 M, pH 5,0- 6,0; 1 b) tampão fosfato de sódio 50-200 M e sulfato de amónio 0,4-0,6 M; pH 5, Ον, 0; c) tampão fosfato de sódio 50-200 mM (50- 70% v/v) e etanol a 96% (50-30% v/v) ou inserindo a resina de interacção hidrófoba entre os dois passos de cromatografia de troca iónica.
- 2. Processo de purificação de acordo com a reivindicação 1, em que a resina catiónica forte no passo 1) é uma resina de SP-Sepharose.
- 3. Processo de purificação de acordo com a reivindicação 1, em que a resina aniónica forte no passo 2) é uma resina de Q-Spharose.
- 4. Processo de purificação de acordo com a reivindicação 1, em que a resina de interacção hidrófoba no passo 3) é uma resina de fenil-Sepharose.
- 5. Processo de purificação de acordo com a reivindicação 1, em que a gonadotropina FSH é eluída com solução b; e a gonadotropina LH é eluída com solução c, na sequência de adição a, b c no passo 3.
- 6. Processo de purificação de acordo com a reivindicação 1, em que se a razão de gonadotropinas FSH:LH é aproximadamente semelhante a 1:1 as 2 gonadotropinas são eluídas com a solução c numa sequência de adição ordenada a, c no passo 3.
- 7. Processo de purificação de acordo com a reivindicação 1, em que se a razão de gonadotropinas é diferente de 1:1, o processo compreende também a adição da gonadotropina FSH eluída com solução b, ou a adição de gonadotropina LH eluída com solução c, numa sequência de adição ordenada a, b, c no passo 3, até uma razão de 1:1.
- 8. Processo de purificação de acordo com a reivindicação 1, em que a referida gonadotropina bruta ê obtida da urina de mulheres em menopausa e/ou pós-menopausa.
- 9. Processo de purificação de acordo com a reivindicação 1, em que a referida gonadotropina bruta tem uma actividade de FSH superior a 40 IU/mg e uma actividade de LH superior a 40 IU/mg. Lisboa 0 5 JUN. 200? 3
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