PT751959E

PT751959E - Polipeptidos modificados com actividade biologica aumentada

Info

Publication number: PT751959E
Application number: PT95912917T
Authority: PT
Inventors: Arthur J Sytokowski
Original assignee: Beth Israel Hospital
Priority date: 1994-03-22
Filing date: 1995-03-15
Publication date: 2000-06-30
Also published as: DE69514342T2; ES2143620T3; EP0751959A1; US5580853A; GR3033146T3; EP0751959B1; WO1995025746A1; DE69514342D1; DK0751959T3; ATE188486T1

Description

DESCRIÇÃO “POLIPÉTIDOS MODIFICADOS COM A CTIVIDADE BIOLÓGICA AUMENTADA " Antecedentes A modificação de polipéptidos que ocorrem naturalmente os quais têm valor terapêutico é ensaiada com frequência num esforço para aumentar a sua actividade biológica. Vários métodos têm sido empregues pjara aumentar a actividade biológica das proteínas terapêuticas. Estes métodos focam-se com frequência no aumento do tamanho dos agentes terapêuticos. Por exemplo, o tamanho de uma proteína pode ser aumentado através da conjugação química com um reagente tal como polietileno glicol (PEG) (Knusli, C. e outros, Brit. J. Haematol. 82:654-663 (1992)). Este procedimento, também conhecido como “PEGlação”, tem sido referido com vários agentes proteicos, primeiro como um meio para reduzir a antigenicidade, mas também como uma maneira para aumentar a actividade biológica.

Outro método para aumentar o tamanho das proteínas é através de reticulação química com outra proteína. Por exemplo, para aumentar a antigenicidade de uma proteína, os agentes de reticulação química são usados para conjugar a proteína imunogénica com uma molécula transportadora tal como imunoglobulina ou albumina do soro.

No entanto, a conjugação de compostos químicos ou moléculas inertes com um polipéptido resulta com frequência numa diminuição significativa da totalidade da actividade biológica seleccionada do polipéptido (Knusli, C., e outros, Brit. J. Haematol., 82 : 654-663 (1992)). Estas conjugações devem ser designadas de tal modo que o polipéptido modificado resultante permanece terapêuticamente eficaz e retém as propriedades biológicas desejadas do polipéptido tipo bruto não modificado (isto é, ocorrem naturalmente) (Satake, R. e outros; Biochem. Biophys. Acta. 1038 : 125-129 (1990)). A eritropoietina (EPO) é uma glicoproteína hormonal relacionada com o crescimento e desenvolvimento de células sanguíneas vermelhas maduras a partir de células percursoras dos eritrocitos. E um aminoácido com 166 polipéptidos que existe naturalmente como um monómero. (Lin, F - K, e outros. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82 : 7580-7584 (1985)). Várias formas de anemia, incluindo aquelas associadas a folha renal, infecção por HIV, perda de sangue e doença crónica podem ser tratadas com este factor de crescimento hematopoietico. A eritropoietina é normalmente administrada por injecção intravenosa ou sub-cutânea três vezes por semana a uma dose aproximadamente de 25 - 1 OOU/Kg. Apesar de bastante eficaz, esta forma de terapia é muito cara. Estima-se que para o tratamento de pacientes dialisados crónicos seja na ordem de $8 000 - $10 000 por paciente por ano.

Outro problema encontrado na prática da medicina quando se usa fármacos injectáveis é a frequência com que essas injecções devem ser feitas com o objectivo de manter o \ nível terapêutico do composto em circulação. Por exemplo, a eritropoietina tem um tempo de meia-vida no plasma relativamente curto (Spivak, J. L., e Hogans, B. B., Blood, 73 : 90 (1989); McMahon, F. G„ e outros, Blood, 76 : 1718 (1990), consequentemeiite, os níveis terapêuticos no plasma são rapidamente perdidos, e têm que ser feitas administrações intravenosas repetidas. Uma via de administração alternativa é a injecção sub-cutânea. Esta via oferece absorção mais lenta a partir do local de administração, causando assim um efeito de libertação prolongado. No entanto, são alcançados níveis píasmáticos significativamente baixos e, assim, uma frequência similar de injecção, tal como é requerido com a administração intravenosa, tem de ser usada para obter um efeito terapêutico comparável. A Protein Science (1993), 2, 1441-1451 revela a eritropoietina recombinate humana (xHuEPO) : reticulações com esteres di-succinimidil e identificação dos domínios da interface na EPO: Vários grupos amino da eritropoietina recombinante humana são selectivamente reticulados por reticuladores específicos incluindo di-succinimidil suberato ou di-tiobis (succinimidil propionato). Reticulações intra-moleculares são obtidas sem alteração significante na conformação da proteína usando concentrações apropriadas (0,2 mM) dos reticuladores, os quais possuem um comprimento de 11 - 12 Ã de um separador entre dois grupos reactivos. Os péptidos reticulados intramolecularmente obtidos sugerem que vários grupos amino na eritropoietina (EPO) estão em posições a uma

distância próxima de 12 Â no estado de solução. Esta interface de grupos amino Lis 20 - Lis 154, Lis 45 - Lis 140, Lis 52 - Lis 154, Lis 52 - Lis 140 e Ala 1 - Lis 116. A comparação dos resultados da reticulação entre EPO não glicosilada e a EPO gíicosilada sugere que ambas as proteínas permanecem altamente similares comparando a conformação da proteína. Estes resultados adaptam-se a um modelo estrutural semelhante ao da hormona de crescimento humano, na qual quatro feixes a- helicoidais e um longo estiramento da estrutura em faixa-β são envolvidos na proteína activa. O Pierce, Handbook e General Catalogue, 1989, pp. 286-311 revela um número de reagentes de reticulação.

Resumo da invenção A presente invenção diz respeito a polipéptidos modificados com actividade biológica aumentada, e métodos para fazer estes polipéptidos modificados. Actividade biológica aumentada é aqui definida como um tempo de meia-vida no plasma prolongado (isto é, um tempo de meia-vida em circulação mais longo em comparação com o polipéptido que ocorre natural mente), ou maior potência (isto é, requer uma quantidade mais pequena em relação ao polipéptido que ocorre naturalmente para alcançar um nível especifico de actividade biológica). Actividade biológica aumentada pode também incluir uma combinação deis actividades descritas acima, por exemplo um polipéptido modificado com maior potência que também exibe um tempo de meia vida em circulação prolongado. Em qualquer, dos casos, devido ao facto dos polipéptidos terem actividade biológica aumentada, a frequência com a qual têm de ser administrados é reduzida, ou a quantidade administrada para alceinçar uma dose eficaz é reduzida. Em qualquer caso, será necessário, uma quantidade reduzida de polipéptido modificado no decurso do tratamento do que a quantidade necessária se for usado polipéptido não modificado.

Os polipéptidos abrangidos pela presente invenção incluem, por exemplo, factores de crescimento hematopoieticos tais como factores de estimulação da colónia (por exemplo, G-CSF e GM-CSF), as interleucinas (por exemplo , IL-2 e IL-3), hormonas tais como factor de crescimento do fibroblasto básico e glicoproteínas tal como a hormona humana de estimulação dos folículos.

Mais especificamente, a presente invenção diz respeito à eritropoietina modificada com actividade biológica aumentada, como definido acima. A eritropoietina modificada da presente invenção compreende eritropoietina do tipo bruto que foi modificada com um reagente de reticulação heterobifuncional. Um reagente de reticulação heterobifuncional é aqui definido como um reagente com dois grupos reactivos que são capazes de reagir com e formar ligações, ou pontes, entre as cadeias laterais de certos aminoácidos, entre aminoácidos e grupos ácido carboxílicos, ou através de metades de carbohidratos. Em particular, os reagentes de reticulação heterobifuncional usados na presente invenção contêm quer um grupo de ligação di-sulfito clivável ou um grupo maleimida. A presente invenção também diz respeito à eritropoietina multimérica compreendendo dois, ou mais, molecular de eritropoietina ligadas umas às outras covalentemente por uma, ou mais, ligações tio-éter. Estes multimeros de eritropoietina também exibem actividade biológica aumentada. A presente invenção diz respeito além disso a métodos para a produção de polipéptidos de eritropoietina modificados com a actividade biológica aumentada aqui descrita, e o método para a sua utilização. A modificação da eritropoietina tipo bruto com um reagente de reticulação heterobifuncional contendo um grupo de ligação di-sulfito clivável resultou numa eritropoietina modificada com potência aumentada em comparação com a eritropoietina tipo bruto não modificada. De modo importante, o grupo de ligação di-sulfito pode ser reduzido a um grupo sulfidril livre. A disponibilidade de um grupo sulfidril livre no polipéptido de eritropoietina permitiu posterior modificação da eritropoietina para produzir eritropoietina multimérica com um tempo de meia-vida em circulação prolongado em comparação com a eritropoietina tipo bruto. A produção de eritropoietina multimérica foi alcançada por um método de reticular quimicamente dois, ou mais, polipéptidos de eritropoietina modificada. Resumindo, o método é como se segue.

Um primeiro derivado de eritropoietina foi produzido pela reacção de eritropoietina tipo bruto com um reagente de reticulação heterobifuncional contendo um grupo de ligação di-sulfito clivável. A ligação di-sulfito foi reduzida para produzir eritropoietina contendo um grupo sulfidril livre. Um segundo derivado da eritropoietina foi produzida pela reacção da eritropoietina tipo bruto com um reagente de reticulação 5*. heterobifuncional contendo um grupo maleimida. O primeiro e segundo derivado da eritropoietina reagiram em conjunto, formando por isso pelo menos uma ligação tio-éter entre os grupos sulfidril e maleimida, formando assim um homodimero ou um homotrimero da eritropoietina. Surpreendentemente, estas moléculas multiméricas de eritropoietina exibem actividade biológica comparável com a eritropoietina tipo bruto. Mais importante, os dimeros de eritropoietina mostraram um tempo de meia vida em circulação in vivo significativamente prolongado, em comparação com a eritropoietina tipo bruto.

Assim, como um resultado do trabalho aqui apresentado, a eritropoietina foi agora modificada para produzir composições de eritropoietina que exibem potência biológica aumentada relativamente à eritropoietina tipo bruto. Com frequência a eritropoietina modificada da presente invenção pode ser dimerizada e trimerizada com outras moléculas de eritropoietina modificada, para produzir moléculas de eritropoietina multimérica com tempos prolongados de meia-vida em circulação in vivo.

Breve descrição das Figuras Figura 1 A mostra a estrutura química da SPDP Figura 1 B mostra a estrutura química da LC-SPDP Figura 1C mostra a estrutura química da sulfo-LC-SPDP Figura 2 mostra a estrutura química da SMCC

Figura 3 é um histograma representando a actividade biológica das fracções contendo homotrimeros, homodimeros, e monómeros de eritropoietina colectada após cromatografia liquida de alta pressão (HPLC).

Figura 4 é uma representação gráfica dos resultados de um bio-ensaio demonstrando o aumento do tempo de meia-vida in vivo do dimero e do monómero da eritropoietina.

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção diz respeito a polipéptidos modificados com actividade biológica aumentada, e métodos para a produção e utilização desses polipéptidos modificados. Polipéptidos aceitáveis para modificação pelos métodos aqui descritos são polipéptidos, preferencialmente polipéptidos monoméricos, que não contêm quaisquer grupos sulfidril 6 \JL>OÍ livres polipéptidos de interesse especial são aqueles polipéptidos que interagem com um receptor celular para iniciar eventos de sinalização celular, por exemplo, insulina e eritropoietina. Os polipéptidos abrangidos pela presente invenção são normalmente utilizados como agentes terapêuticos injectáveis. Se são usados polipéptidos com actividade biológica aumentada como agentes terapêuticos injectáveis, a frequência de administração destes polipéptidos pode ser reduzida.

Como aqui descrito, estes polipéptidos podem ser modificados para aumentar a sua actividade biológica relativamente à actividade biológica dos polipéptidos que ocorrem naturalmente. Actividade biológica aumentada é aqui definida como um tempo de meia--vida no plasma prolongado (isto é, um tempo de meia-vida em circulação mais longo em comparação com o polipéptido que ocorre naturalmente), ou maior potência (isto é, requer uma quantidade mais pequena em relação ao polipéptido que ocorre naturalmente para alcançar um nível especifico de actividade biológica). Actividade biológica aumentada, como aqui utilizado, pode também incluir-se uma combinação das actividades descritas acima. Por exemplo, um polipéptido modificado com elevada potência pode também exibir um tempo de meia vida em circulação prolongado. Em qualquer caso, devido ao facto dos polipéptidos aqui descritos terem actividade biológica aumentada, a frequência cóm a qual têm que ser administrados pode ser reduzida.

Os polipéptidos abrangidos pela presente invenção são modificados com um reagente de reticulação heterobifuncional. O reagente de reticulação heterobifuncional pode ser ligado a uma ou mais amina ou aminas primária(s) dentro do polipéptido. Por exemplo, o reagente de reticulação heterobifuncional pode ser ligado ao resíduo de aminoácido, lisina ou à terminação alfa amina da eritropoietina. Altemativamente, para glicoproteínas o reagente de reticulação heterobifuncional pode ser ligado a uma, ou mais metade ou metades carbohidratos, numa cadeia de oligossacaridos no polipéptido. O reagente de reticulação heterobifuncional é geralmente seleccionado de um grupo de reagentes de reticulação contendo quer um grupo de ligação di-sulfito clivável ou um grupo maleimida. A adição de um grupo de ligação di-sulfito a um polipéptido também permite a designação de uma estratégia de reticulação para produzir polipéptidos multiméricos. A ligação di-sulfito pode ser clivada por reacção com um agente de redução conhecido, por exemplo, ditiotreitol (DTT) que reduz a ligação di-sulfito no reagente de reticulação para produzir um derivado polipéptido modificado contendo um grupo sulfidril livre (SH).

Um segundo derivado polipéptido, capaz de reagir com um grupo sulfidril livre, é então produzido ligando ura reagente de reticulação heterobifuncional contendo um grupo maleimida ao polipéptido que ocorre naturalmente. Novamente, o reagente de reticulação pode ser ligado a aminas primárias ou metades carbohidratos no polipéptido. 0 derivado de polipéptido resultante contendo um grupo maleimida reagiu com o derivado polipéptido contendo um grupo sulfidril reactivo resultando numa molécula de polipéptido multimérica ligada covalentemente em conjunto com pelo menos uma ligação tio-éter formada entre o grupo SH e o grupo maleimida. A eritropoietina é uma hormona glicoproteica envolvida no crescimento e desenvolvimento das células sanguíneas vermelhas maduras das células percursoras dos eritrocitos , é um polipéptido glicosilado particularmente aceitável para modificação utilizando os métodos aqui descritos. A eritropoietina é produzida no rim em resposta à hipoxia (por exemplo, perda de células vermelhas sanguíneas devido a anemia) e regula o crescimento as células vermelhas do sangue e a diferenciação através da interacção com o seu receptor celular cognato. A eritropoietina do tipo bruto é aqui definida para incluir a eritropoietina recombinante humana (Powell, J. S., e outros; Proc. Natl. Acad· Sei. USA, 83: 6465-6469 (1986)), ou eritropoietina que ocorre naturalmente que tem sido purificada a partir do sangue (Miyake, T. e outros J. Biol. Chem., 252 : 5558-5564 (1977)) a plasma de carneiro (Goldwasser, E. e outros. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 68: 697-698 (1971)). A eritropoietina é um polipéptido de 166 aminoácidos que existe naturalmente como um monómero . (Lin, F - K, e outros. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82 : 7580-7584 (1985)). A estrutura secundária previsível da eritropoietina foi apresentada (McDonald, J. D., e outros Mol. Cell. Brol, 6 : 842-848 (1986)).

Foi notado que a partir da estrutura da eritropoietina tipo bruto o polipéptido não contém quaisquer grupos sulfidril (SH) livres (reactivos). (Boissel, J - P., e outros , J. Bio. Chem. 268 : 15983-15993 (1993)). Os grupos SH livres são úteis para a preparação de proteínas conjugadas, tal como anti-corpos marcados radioactivamente (Patente dos Estados Unidos n 0 4 659 839), ou por outro lado modificando quimicamente o 8

polipéptido resultando numa actividade biológica alterada do polipéptido. Um grupo sulfídril livre pode também desempenhar um papel na ligação de um polipéptido ao seu receptor celular. Por exemplo, o polipéptido hormonal, insulina, é ligada covalentemente ao seu receptor celular através de um mecanismo de troca de di-sulfito (Clark, S. e Harrison, L. C., J. Biol. Chem., 258 : 11434-11437 (1983) Clark, S. e Harrison, L. C., J, Biol. Chem., 257 : 12239-12344 (1982)). Assim, um grupo sulfídril livre pode ser critico para a actividade biológica do polipéptido. Assim sendo, foi inventado um esquema para modificar a eritropoietina tipo bruto para ligar um grupo sulfídril livre.

Numa forma de realização da presente invenção, a eritropoietina tipo bruto foi quimicamente. modificada pela ligação covalente de um reagente de reticulação heterobifuncional contendo um grupo de ligação di-sulfito clivável. 0 reagente de reticulação foi ligado a uma amina primária no polipéptido da eritropoietina. A ligação de um reagente de reticulação heterobifuncional à eritropoietina tipo bruto resultou em eritropoietina com potência relativa aumentada em comparação com eritropoietina não modificada.

Especificamente, foram usados três reagentes de reticulação heterobifuncionais diferentes para produzir eritropoietina modificada com actividade biológica aumentada. Estes reagentes de reticulação foram ligados a uma, ou mais, amina ou aminas primárias na eritropoietina tipo bruto. Os reagentes de reticulação foram N-succinidimil 3-(2--piridilditio) propionato (SPDP), N-succinimidil 3(2-piridilditio) propionato de cadeia longa (LC-SPDP), em que o comprimento da cadeia de SPDP é aumentada com grupos metil adicionais, e N-succinimidil 3(2-piridilditio) propionato sulfonatado de cadeia longa (sulfo-LC-SPDP) em que LC-SPDP é sulfonatado . SPDP (Figura 1 A), LC-SPDP (Figura 1 B) e sulfo-LC-SPDP (figura 1 C) são agentes de reticulação disponível comercialmente (Pierce Chemical Co., Rockford I 11). O SPDP, LC-SPDP e o sulfo--LC-SPDP todos contêm um grupo N-hidroxi succinimidil para reagir com os grupos amina livres. Além disso, estes reagentes contêm todos um grupo de ligação di-sulfito que pode ser posteriormente modificado para formar um grupo sulfídril reactivo.

Outro reagente de reticulação heterobifuncional que pode ser usado para modificar a eritropoietina tipo bruto é um reagente especifico carbohidrato que se liga a metades 9

carbohidratos dos polipéptidos glicosilados. Este reagente de reticulação, 3-(2--piridilditio) propionil hidrazida (PDPH), contem um carbohidrato oxidado especifico da hidrazida e contém também um grupo de ligação di-sulfito clivável. A eritropoietina tipo bruto foi modificada com reagentes de reticulação heterobifuncionais SPDP, LC-SPDP, e sulfo-LC-SPDP como descrito em detalhe no Exemplo 1. Em resumo, a eritropoietina foi incubada na presença de concentrações especificas do reagente químico N-succinimidi.l 3-(2-piridilditio) propionato (SPDP) de modo a alcançar diferentes razões molares de SPDP : EPO na solução. A eritropoietina tipo bruto não modificada e eritropoietina. modificada com SPDP (SPDP-EPO) foram bio-ensaiadas de acordo com o método de Krystal, (Krystal, G, Exp. Hematol, 11 : 649 -660 (1983)), que mede o efeito da eritropoietina na eritropoiese nas células intactas do baço de rato. Os resultados, apresentados na Tabela 1, demonstram que a SPDP-EPO exibiu uma actividade biológica aumentada em comparação com o controlo de eritropoietina tipo bruto. TABELA 1

ACTIVIDADE ESPECIFICA DA ERITROPOIETINA MODIFICADA COM SPDP MISTURA DE REACÇÃO SPDP/EPO, MOL/MOL ACTIVIDADE ESPECIFICA U/mcg 0 : 1 200 ± 30 1 : 1 174 ±20 3 : 1 340 ± 30 A eritropoietina modificada com sulfo-LC-SPDP (suIfo-LC-SPDP-EPO), que tem a vantagem de ter solubilidade aumentada em soluções aquosas, foi também preparada como descrito no Exemplo 1. A incubação da eritropoietina na presença de sulfo-LC--SPDP a diferentes razões molares, seguida por diálise e ensaio biológico revelou que a modificação de eritropoietina por sulfo-LC-SPDP resultou num aumento de 530 % na potência sobre a actividade da eritropoietina tipo bruto como mostra a Tabela 2. Assim, a actividade especifica da eritropoietina foi aumentada de 170 U/mcg da eritropoietina tipo bruto para 900 U/mcg para. a eritropoietina modificada preparado na presença do décuplo molar de excesso de sulfo-LC-SPDP. TABELA 2

ACTIVIDADE ESPECIFICA DA ERITROPOIETINA MODIFICADA COM SULFO--LC-SPDP MISTURA DE REACÇÃO SULFO-LC- ACTIVIDADE ESPECIFICA SPDP/EPO, mols/mol μ/mcg Experiência # 1 0 : 1 170 ±20 5:1 220 ± 30 10:1 900 ± 70 30: 1 600 ± 50 50: 1 250 ±30 100 : 1 350 ±40 Experiência # 2 0 : 1 200± 30 1 : 1 200 ± 40 2 : 1 370 ± 40 3:1 350 ±40 6 : 1 380 ±40 7 : 1 560 ± 50 10: Γ 900 ± 60 η A LC-SPDP ΕΡΟ foi também preparado como descrito no Exemplo 1. Apesar da actividade biológica deste derivado não ter sido avaliado, é razoável acreditar-se que a eritropoietina modificada com LC-SPDP também exibirá actividade biológica aumentada devido à sua relação estrutural próxima do SPDP e sulfo-LC-SPDP.

Os derivados da eritropoietina quimicamente modificada descritos acima, que continham um grupo de ligação di-sulfito clivável, permitiram a definição de uma estratégia para a eritropoietina reticulada para formar dimeros EPO-EPO e trimeros EPO-EPO-EPO com actividade biológica aumentada. Estes homodimeros (EPO-EPO) e homotrimeros (EPO-EPO-EPO) são proteínas de eritropoietina de “longa actividade” (também aqui referidas como LA-EPOs). Isto é, estes derivados multiméricos da eritropoietina exibem um tempo de meia vida em circulação prolongada em comparação com a eritropoietina não modificada. O método de preparação da eritropoietina multimérica com actividade biológica aumentada é descrito em detalhe no exemplo 2. Apesar da eritropoietina ser usada como o exemplo especifico,' entende-se que o método aqui descrito pode ser usado para produzir multimeros (isto é, um polipéptido reticulado covalentemente com um, ou mais, polipéptidos idênticos) de qualquer polipéptido aceitável.

Em resumo, o primeiro derivado da eritropoietina foi preparado como descrito no /

Exemplo 1, pela reaçção da eritropoietina com o composto N-succinimidil 3-(2--piridilditio) propionato (SPDP) para formar SPDP-EPO. Esta reacção introduziu um grupo de ligação di-sulfito externo na molécula de eritropoietina. Para formar um grupo sulfidril livre (ou reactivo), SPDP-EPO pode ser exposto a um agente redutor conhecido, daqueles peritos na técnica, para reduzir os grupos de ligação di-sulfito. Como descrito no Exemplo 2, SPDP-EPO foi exposto ao ditiotreitol (DTT), que reduz a ligação di-sulfito na meta de SPDP para produzir uma molécula de eritropoietina contendo grupos SH livres, também aqui referida como SH-EPO.

Um segundo derivado da eritropoietina foi produzido por reacção da eritropoietina com succinimidil 4-(N-maleimidametil) ciclohexano-l-carboxilato, também conhecido como SMCC (figura 2) para formar SMCC-EPO. Este reagente tem um grupo N-hidroxi succinimidil (NHS) numa extremidade e um grupo maleimida na outra. O grupo NHS do SMCC reage com os grupos amina livres na eritropoietina resultando na formação de

SMCC-EPO. O grupo maleimida do SMCC, agora indicando o exterior do derivado SMCC-EPO, reage com os grupos sulfidril livre encontrado na SH-EPO. Por conseguinte, quando SH-EPO e SMCC-EPO são misturados em conjunto na solução os grupos reactivos combinados resultam na formação de um dimero EPO-EPO, (isto é, um SH-EPO com um SMCC-EPO) ou trimero EPO-EPO-EPO (isto é, um SMCC-EPO com dois SH-EPOs, ou dois SMCC-EPOs com um SH-EPO) nas quais os polipéptidos de eritropoietina modificada são ligados covalentemente por pelo menos uma ligação tio-éter (por exemplo, uma ligação tio-éter na EPO dimerizada e duas ligações tio-éter na EPO trimerizada). É interessante notar que a SMCC-EPO, quando testada no bio--ensaio de Krystal, não exibiu qualquer actividade biológica aumentada em comparação com a eritropoietina não modificada.

Altemativamente, pode ser usado um reagente de reticulação heterobifuncional o qual contem um grupo maleimida para se ligar às metades carbohidratos tais como o ácido 4--(4-N-maleimidafenil) butirico hidrazida-HCl (MPBH) e 4-(N-maleimidametil) c iclohexano-1 -carboxil-hidrazida-HCl. O primeiro e segundo derivados da eritropoietina reagiram em conjunto como descrito em detalhe no Exemplo 2. A reacção resultou na formação da eritropoietina multimérica, bem como os derivados da eritropoietina monomérica que não reagiram, os quais podem ser separados por cromatografia liquida de alta pressão (HPLC), como descrito no Exemplo 2. Os dimeros de eritropoietina compreendem dois polipéptidos de eritropoietina ligados por uma ou mais ligações tio-éter. Os trimeros de eritropoietina compreendem três polipéptidos de eritropoietina, também ligados por ligações tio-éter. O trimero pode compreender dois polipéptidos de eritropoietina, contendo cada um, um grupo sulfidril que é ligado a um terceiro polipéptido de eritropoietina contendo dois ou mais grupos maleimida. Alternativamente, o trimero de eritropoietina pode compreender um. polipéptido de eritropoietina contendo dois, ou mais, grupos sulfidril livres que são ligados a dois polipéptidos de eritropoietina, contendo cada um, um grupo maleimida. A presença de EPO, de dimeros EPO-EPO e trimeros EPO-EPO-EPO foi confirmada por análise de mancha Western usando anti-corpos específicos para a eritropoietina como descrito em Sytkowisky, A . J., e Fisher, J. W., J. Biol.Chem., 260 : 14 727-14 731 (1985).

Apesar da eritropoietina monomérica ter mantido a sua actividade biológica, os dimeros e trimeros de eritropoietina preparados sob as condições descritas no Exemplo 2, com SH-EPO, não exibiu actividade biológica quando testado no bio-ensaio de Krystal. Consequentemente, foi designado um segundo protocolo de reticulação no qual um segundo tipo de derivado SH-EPO foi preparado usando sulfo-LC-SPDP. Este agente funciona de modo similar ao SPDP como descrito acima, no entanto, contem um braço separador com vários angstrons de comprimento (por exemplo, onde o número de grupos CH, na porção linear da molécula é aumentado) resultando na separação física aumentada das espécies ligadas às suas extremidades reactivas. Em particular, a sulfo--LC-SPDP contem cinco grupos metil dentro da cadeia linear da molécula, e é também sulfatada para aumentar a sua solubilidade aquosa. A eritropoietina multimérica produzida usando sulfo-LC-SPDP-EPO (SH-LC-EPO) como o primeiro derivado da eritropoietina foi preparada, e separada por HPLC como descrito em detalhe no Exemplo 2. As fracções de HPLC contendo os trimeros, dimeros e monómeros foram testadas no bio-ensaio de Krystal para actividade biológica.

De modo, importante, todas estas três espécies, monómeros, dimeros e trimeros exibiram actividade biológica no ensaio de Krystal. (ver figura 3). O tempo de meia vida em circulação in vivo dos homodimeros da eritropoietina foi determinado como descrito em detalhe no Exemplo 4. A eritropoietina monomérica e dimérica foi injectada em coelhos, e amostras de sangue foram analisadas aos 5 minutos e 2, 4, 6, 9 e 24 horas após injecção. Como se mostra na Figura 4, a actividade biológica da eritropoietina dimerizada, foi medida no ensaio de Krystal, continuou evidente 24 horas após a injecção inicial, enquanto que a actividade biológica da eritropoietina monomérica decaiu significativamente mais cedo. Assim, o tempo de meia-vida em circulação da eritropoietina dimerizada foi mais que três vezes mais longo que a eritropoietina tipo bruto. O tempo de meia-vida prolongado em circulação do dimero EPO pode ser devido ao seu tamanho aumentado em relação à eritropoietina monomérica, o qual impedirá a sua excreção do corpo através do rim. Apesar dos trimeros de eritropoietina não terem sido ensaiados nesta altura, é razoável prever que um homotrimero EPO exibirá um tempo de meia-vida em circulação similar ou até mais longo que os homodimeros porque um trimero tem um tamanho ainda maior que um dimero. Estes dimeros e trimeros de eritropoietina são também aqui referidos como eritropoietinas de longa-acção (LA-EPOs).

Assim, como um resultado do trabalho aqui descrito, polipéptidos de eritropoiètina modificada os quais exibem actividade biológica aumentada são produzidos. A eritropoietina modificada com um reagente de reticulação heterobifuncional contendo um grupo de ligação di-sulfito clivável exibiu um aumento de 530 % na actividade biológica em comparação com a eritropoietina tipo bruto. Este aumento na actividade biológica indica que uma quantidade eficaz de eritropoietina modificada é substancialmente menor que uma quantidade eficaz comparável de eritropoietina tipo bruto. A quantidade eficaz de eritropoietina modificada é aqui definida como a quantidade de eritropoietina requerida para ter uma resposta eritropiética, como indicado pelo crescimento e/ou diferenciação aumentada das células percursoras eritrociticas. Por exemplo, se a dose eficaz normal de eritropoietina usada terapêuticamente é de 25 U/Kg, então uma dose eficaz de eritropoietina modificada pode razoavelmente ser tão baixa como 5,0 U/Kg para alcançar o mesmo efeito. Alternativamente, a quantidade eficaz da eritropoietina multimérica aqui descrito, com um tempo de meia-vida em circulação prolongado, requererá uma administração menos frequente que uma quantidade equivalente da eritropoietina tipo bruto. Por exemplo, se uma dose eficaz de eritropoietina é normalmente administrada 3 vezes por semana, a eritropoietina multimérica com actividade biológica aumentada necessitará apenas de ser administrada uma vez por semana.

Em qualquer dos casos, uma quantidade mais reduzida de eritropoietina modificada com um reagente de reticulação heterobifuncional ou eritropoietina multimérica, será necessária durante o decurso do tratamento do que a que é necessária se for utilizada a eritropoietina tipo bruto. A eritropoietina modificada com actividade biológica aumentada aqui descrita pode ser usada em vez da eritropoietina tipo bruto sempre que é necessário um tratamento com eritropoietina. Por exemplo, a eritropoietina modificada pode ser usada para o tratamento de um indivíduo com anemia associada à insuficiência renal, doença crónica, infecção por HIV, perda de sangue ou cancro. A eritropoietina é geralmente administrada aos humanos. O tratamento eficaz com eritropoietina requer a manutenção do nível terapêutico no sangue. Isto pode ser feito por administração continua, isto é, por injecções intravenosas contínuas, por injecções intravenosas descontínuas, ou por injecções subcutâneas. A eritropoietina modificada desta invenção pode ser empregue na administração com excipientes convencionais, isto é, substancias transportadoras orgânicas ou inorgânicas farmacêuticamente aceitáveis para administração parentérica que não reajam com derivados activos.

Transportadores farmacêuticamente aceitáveis incluem, mas não se limitam a, água, soluções salinas, álcoois, goma arábica, óleos vegetais, álcoois benzílicos, polietileno glicois, gelatina, carbohidratos tais como lactose, amilose ou amido, estearato de magnésio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, óleo perfumado, esteres de ácidos gordos, hidroximetil-celulose, polivinil pirrolidona, etc. Para aplicação parentérica, são particularmente aceitáveis os injectáveis, as soluções estéreis, preferencialmente soluções oleosas ou aquosas, bem como suspensões, emulsões, ou implantes, incluindo supositórios.

Será apreciado que as quantidades actuais preferidas de composto activo num caso especifico variará de acordo com o composto especifico a ser utilizado, as composições particulares formuladas, o modo de aplicação, o local particular de aplicação, e o organismo a ser tratado. As dosagens para um dado recipiente serão determinadas com base nas características individuais, tal como tamanho corporal, peso, idade e o tipo e severidade de condições a serem tratados.

Além disso, a eritropoietina modificada da presente invenção, com actividade biológica aumentada, pode ser usada em qualquer aplicação in vitro em vez da eritropoietina tipo bruto. Por exemplo, pode ser usada a eritropoietina modificada em estudos de actividade do receptor da eritropoietina. Será de novo verificado que a quantidade de eritropoietina modificada com actividade biológica aumentada necessária para alcançar os resultados desejados (por exemplo hemoglobinização aumentada de células percursoras de células vermelhas do sangue) será substancialmente menor que a quantidade de eritropoietina tipo bruto necessária para alcançar os mesmos resultados desejados. A presente invenção será agora ilustrada pelos seguintes exemplos, que não se tenciona serem de qualquer modo limitativos.

Exemplo 1: Derivado SPDP-EPO com elevada Potência

Três reagentes de reticulação heterobifuncionais diferentes contendo grupos de ligação di-sulfito cliváveis foram usados para produzir derivados de eritropoietina com actividade biológica aumentada. Estes agentes são N-succinimidil 3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), N-succinimidil 3-(2-piridilditio) propionato, em que o comprimento da cadeia de SPDP é aumentada com grupos metil adicionais (LC-SPDP) e N--succinimidil 3-(2-piridilditio) propionato de cadeia longa “sulfonatado” (sulfo-LC--SPDP). Os polipéptidos de eritropoietina modificada foram preparados como se segue. A eritropoietina recombinante humana foi produzida por expressão do gene da eritropoietina humana nas células BHK firmemente transferidas (rim de hamster bebé) (Powell, J. S. e outros Proc. Nat. Sei. Acad. USA, 83 : 6465-6469 (1986) e foi purificada usando técnicas laboratoriais padrão. A proteína purificada foi então incubada na presença de concentrações específicas do reagente químico N-succinimidil 3-(2--piridilditio) propionato (SPDP), dissolvido em dimetil sulfóxido, de modo a alcançar razões molares de 0 : 1, 1 : 1 e 3 : 1 (SPDP : EPO) em solução. Após incubação durante a noite à temperatura ambiente, as soluções foram dializadas contra fosfatos em tampão salino para remover SPDP que não reagiu. A actividade biológica das amostras de -eritropoietina tipo bruto e eritropoietina modificada (SPDP-EPO) foi avaliada de acordo com o método de Krystal (Krystal, G., Exp. Hematol., 11 : 649-660 (1983)). Em resumo, o bio-ensaio de Krystal mediu o efeito da eritropoietina em células intactas do baço de rato. Os ratos são tratados com fenilhidrazina para estimular a produção de células percursoras das células vermelhas do sangue no baço. Após o tratamento, os baços são removidos, as células de baço intactas são cuidadosamente isoladas e incubadas com várias quantidades de eritropoietina tipo bruto ou de eritropoietina modificada aqui descrita. Após incubação durante toda a noite, é adicionada timidina 3H e é medida a sua incorporação no ADN celular. A quantidade de incorporação de timidina 3H é indicadora da produção de eritropoietina estimulada pela eritropoietina de células vermelhas do sangue através da interaeção da eritropoietina com o seu receptor celular. Os resultados demonstraram que o SPDP-EPO exibiu uma actividade biológica aumentada em relação à eritropoietina tipo bruto, e que este aumento na actividade foi proporcional à razão molar da SPDP : EPO na mistura da reacção.

\JU

Além disso, a eritropoietina tipo bruto foi modificada usando sulfo-LC-SPDP, composto que tem a vantagem de Ter a solubilidade aumentada em soluções aquosas. A incubação da eritropoietina na presença de sulfo-LC-SPDP nas razões molares previamente descritas seguidas por diálise e ensaio biológico revelou que a modificação sulfo-LC-SPDP da eritropoietina resultou num aumento na potência de aproximadamente 530 %. A actividade especifica da eritropoietina foi aumentada de 170 U/mcg para o material não derivado na presença do décuplo molar de excesso de sulfo-LC-SPDP.

Exemplo 2 : Derivados de Longa Acção da Eritropoietina Multimérica Para preparar o primeiro derivado SH-EPO, 50 pg de eritropoietina humana obtida como descrito no Exemplo 1, foram incubadas na presença quíntuplo molar de excesso de N-succinimidil 3-(2-piridilditio) propionato (SPDP) obtido a partir da Pierce Chemical Company. Após incubação à temperatura ambiente por sessenta horas, a solução foi dializada contra fosfato em tampão salino. A eritropoietina modificada foi então exposta a 1 mM DTT para reduzir a ligação di-sulfito em SPDP resultando num, ou mais, grupo(s) sulfidril livres na molécula de eritropoietina. O segundo derivado de eritropoietina SMCC-EPO, foi preparado como se segue. Uma segunda porção dé"'50 pg de eritropoietina humana foi incubada na presença do quíntuplo .molar de èxcesso de succinimidil 4-(N-maleimidametil) ciclohexano-1--carboxilato (SMCC). Após umas sessenta horas de incubação à temperatura ambiente, a solução foi dializada contra fosfato em tampão salino. A SH-EPO e SMCC-EPO foram misturadas em conjunto com fosfato em tampão salino (20 mM fosfato de sódio, 150 mM cloreto de sódio, pH 7,4) à temperatura ambiente por 90 minutos, e dializado contra PBS. A mistura foi então sujeita a cromatografia de HPLC de exclusão por tamanho em 250TSK, em PBS, à temperatura ambiente, a 1 ml/min. Os polipéptidos foram sujeitos a electroforese em gel de poliacrilamida SDS, transferência electroforética para nitro-celulose, e marcação Western usando anti-corpos anti-eritropoietina de acordo com Sytkowski, A . J. e Fisher, J. W., J. Biol. Chem., 260 : 14 727-14 731 (1985). Os resultados demonstraram que o protocolo teve sucesso na formação de duas espécies de peso molecular elevado da eritropoietina correspondendo a dimeros e trimeros de eritropoietina. No entanto, quando do ensaio no bio-ensaio Krystal, os dimeros e trimeros de eritropoietina produzidos com SPDP-SH-EPO não exibiram qualquer actividade biológica.

Assim, o protocolo foi revisto para usar LC-SPDP-EPO como primeiro derivado, 50 pg de eritropoietina recombinante humana foi incubada na presença do triplo molar de excesso de LC-SPDP por sessenta horas à temperatura ambiente. O material foi então dializado e tratado com 1 mM DTT resultando em SH-LC-EPO. SMCC-EPO foi preparado como descrito acima.

Estas duas espécies foram misturadas em conjunto na solução e a mistura foi sujeita a exclusão de tamanho por HPLC em TSK 3 000 SW. Três espécies de proteína de eritropoietina foram detectadas com tempos de eluição de 10.2, 9.1, e 7.2 minutos respectivamente. O tempo de eluição de 10.2 minutos era conhecido de experiências anteriores como aquele do monómero de eritropoietina tipo bruto. Por conseguinte, os tempos de eluição mais rápidos de 9.1 e 7.2 minutos correspondem a dimeros e trimeros, respectivamente. As fracções contendo os dimeros e os trimeros de eritropoietina foram colectados e ensaiados no bio-ensaio de Krystal. De modo importante, como demonstrado na Figura 3, aquando do teste do bio-ensaio de Krystal, os homodimeros e homotrimeros da eritropoietina exibiram actividade biológica.

Exemplo 3 : Testes In Vivo dos Derivados de Eritropoietina Multimérica Um grupo de coelhos brancos da Nova Zelândia foi injectado por via intravenosa quer com eritropoietina monomérica tipo bruto ou com LA-EPO dimerizada a 0,4 mg/ml em PBS. Foram obtidas amostras de sangue a 5 minutos e 2, 4, 6, 9 e 24 horas e foi medida a eritropoietina circulante pelo ensaio biológico de Krystal in vitro.

Os resultados demonstrados na Figura 4 indicam que o tempo de meia vida in vivo para a eritropoietina monomérica tipo bruto foi aproximadamente sete horas, como esperado a partir de relatórios publicadas anteriormente. O tempo de meia vida in vivo da LA--EPO foi no entanto, prolongado por um período para além de vinte e quatro horas de experiência como demonstrado na Figura 4.

Equivalentes

Os peritos na arte reconhecerão, ou serão capazes de se certificar não usando mais que experiências de rotina, muitos equivalentes para formas de realização especificas da invenção aqui descritas especificamente.

Lisboa, 0 4A8R. 2000 v.a_«.Í

Maria Silviná Ferreira

Agente Oficial do Propriedade Industrial R. Castilho. 201-3° E — 1070 USBOA Telefs. 3851339 - 3854613

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição de eritropoietina monomérica biologicamente activa compreendendo uma molécula de eritropoietina e um reagente de reticulação heterobifuncional ligado à molécula de eritropoietina, em que o agente de reticulação heterobifuncional contém: a) um grupo de ligação di-suifito clivável; b) um grupo sulfidril livre; ou c) um grupo maleimida.
2. Uma composição de eritropoietina da reivindicação 1 em que quer a) O reagente de reticulação heterobifuncional está ligado a uma, ou mais, amina ou aminas primárias na molécula de eritropoietina ou; b) A eritropoietina é eritropoietina glicosilada e o reagente de reticulação heterobifuncional é ligado a um, ou mais, metade ou metades de carbohidratos na eritropoietina glicosilada.
3. Uma composição de eritropoietina biologicamente activa compreendendo dois ou mais polipéptidos de eritropoietina ligados covalentemente por pelo menos uma ligação tio-éter, tendo cada polipéptido um reagente de ligação contendo dois, ou mais, grupos sulfidril livres ligados ao polipéptido e o segundo e terceiro polipéptido da eritropoietina compreendem polipéptidos da eritropoietina com um reagente de reticulação, heterobifuncional contendo um grupo maleimida ligado a cada polipéptido, e as ligações tio-éter formadas entre os grupos sulfidril livres do primeiro polipéptido da eritropoietina e o grupo maleimida do segundo e terceiro polipéptido da eripopoietina.
4. Uma composição de eritropoietina biologicamente activa de acordo com a reivindicação 3, em que a composição compreende um homodimero compreendendo dois polipéptidos da eritropoietina ligados covalentemente por pelo menos uma ligação tio-éter, em que o primeiro polipéptido da eritropoietina compreende um polipéptido da eritropoietina com um reagente de reticulação heterobifuncional contendo um grupo sulfidril livre ligado ao polipéptido da eritropoietina e o segundo polipéptido da eritropoietina compreende um polipéptido da eritropoietina com um reagente de reticulação heterobifuncional contendo um grupo maleimida ligado ao polipéptido da eritropoietina, e a ligação tio-éter formada entre o grupo sulfidril livre e o grupo maleimida dd segundo polipéptido da eritropoietina.
5. Uma composição, de eritropoietina biologicamente activa de acordo com a reivindicação 3, em que a composição compreende um homotrimero compreendendo três polipéptidos da eritropoietina ligados covalentemente por ligações tio-éter, em que o primeiro e segundo polipéptido da eritropoietina compreendem polipéptidos da eritropoietina com um reagente de reticulação heterobifuncional contendo um grupo sulfidril livre ligado a cada polipéptido e o terceiro polipéptido da eritropoietina compreende um polipéptido da eritropoietina com um reagente de reticulação heterobifuncional contendo dois ou mais grupos maleimida ligados ao polipéptido, e as ligações tio-éter formam-se entre o grupo sulfidril livre do primeiro ou segundo polipéptidos da eritropoietina e os grupos maleimida do terceiro polipéptido da eritropoietina.
6. Uma composição de eritropoietina biologicamente activa de acordo com a reivindicação 3, em que a composição compreende um homotrimero compreendendo três polipéptidos da eritropoietina ligados covalentemente por ligações tio-éter, em que o primeiro polipéptido da eritropoietina compreende um polipéptido da eritropoietina com um reagente de reticulação heterobifuncional contendo dois ou mais grupos sulfidril livres ligado ao polipéptido da eritropoietina e o segundo e terceiro polipéptidos da eritropoietina compreendem polipéptidos da eritropoietina com um reagente de reticulação heterobifuncional contendo um grupo maleimida ligado a cada polipéptido, e as ligações tio-éter formam-se entre os grupos sulfidril livres do primeiro polipéptido da eritropoietina e o grupo maleimida do segundo e terceiro polipéptidos da eritropoietina.
7. Uma homodimero da eritropoietina da reivindicação 4 em que a) Os reagentes de reticulação heterobifuncionais estão ligados a uma, ou mais, amina ou aminas primárias nos polipéptidos de eritropoietina ou; b) os reagentes de reticulação heterobifuncionais são ligados a'uma, ou mais, metade ou metades de carbohidratos dos polipéptidos da eritropoietina.
8. Uma eritropoietina biologicamente activa de acordo com qualquer das reivindicações precedentes em que o, ou cada, reagente de reticulação heterobifuncional é seleccionado a partir de um grupo constituído por: ~ a) Reagentes contendo um grupo de ligação di-sulfito clivável seleccionado do N--succinimidil 3 -(2-piridilditio) propionato, succinimidil 6-[3-(2-piridilditio) propionamida] hexanoato; sulfossuccinimidil 6-[3-(2-piridilditio) propionamido] hexanoato, e 3-(2-piridilditio) propionil hidrazida; b) É um reagente contendo um grupo sulfídril livre sendo N-succinimidil 3(2--piridilditio) propionato; c) Um reagente contendo um grupo maleimida seleccionado do sulfossuccinimidil 4-(N-maleimidametil) ciclohexano-l-carboxilato; ácido 4-(4-N-maleimidafenil) butirico hidrazida - HC1 (MPBH), 4-(N-maleimidametil) ciclohexano-l-carboxil--hidrazida-HCl; e succinimidil 4-(N-maleidometil) ciclohexano-1- carboxilato.
9. Um método de preparação de uma composição de eritropoietina modificada biologicamente activa compreendendo dois ou mais polipéptidos de eritropoietina ligados covalentemente por pelo menos uma ligação tio-éter, compreendendo os passos constituídos por: a) Preparação de um primeiro derivado de eritropoietina pela reacção da eritropoietina com· um reagente de reticulação heterobifuncional contendo um grupo de ligação di-sulfito clivável sob condições suficientes para o grupo, de ligação di--sulfito clivável na eritropoietina, produzindo consequentemente um primeiro derivado da eritropoietina contendo um ligação di-sulfito clivável. b) Clivagem do grupo de ligação di-sulfíto contido no primeiro derivado da eritropoietina, produzindo consequentemente um primeiro derivado da - eritropoietina contendo um grupo sulfidril livre; c) Preparação de um segundo derivado da eritropoietina pela reacção da eritropoietina com um reagente de reticulação heterobifuncional contendo um grupo maleimida, sob condições suficientes para introduzir o grupo maleimida na eritropoietina. produzindo, consequentemente um segundo derivado da eritropoietina contendo um grupo maleimida; e d) Reacção do primeiro derivado da eritropoietina contendo um grupo sulfidril livre com o segundo derivado da eritropoietina. contendo um grupo maleimida, sob condições suficientes para formar uma ligação tio-éter entre o grupo sulfidril livre e o grupo maleimida resultando na reticulação dos derivados de eritropoietina, produzindo consequentemente eritropoietina modificada compreendendo pelo menos um primeiro e o segundo derivado da eritropoietina.
10. Um método da reivindicação 9 em que os reagentes de reticulação heterobifuncional do passo a) e passo b) reagem com uma, ou mais, amina ou aminas primárias ha dita composição de eritropoietina, e por exemplo i) o reagente de reticulação heterobifuncional do passo a) é seleccionado do grupo constituído por : N-succinimidil 3-(2-piridilditio) propionato, succinimidil 6-[3-(2--piridilditio) propionamido] hexanoato; sulfossuccinimidil 6-[3-(2-piridilditio) propionamido] hexanoato; ou ii) o reagente de reticulação do passo b) é sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidametiI) ciclohexano-l-earboxilato.
11. Um método da reivindicação 9 em que a dita composição de eritropoietina é glicosilada e os reagentes de reticulação heterobifuncionais do passo a) e passo b) reagem com uma, ou mais, metade ou metades carbohidrato na eritropoietina glicosilada, e por exemplo i) o reagente de reticulação heterobifuncional clivável do passo a) é 3-(2--piridilditio) propionil hidrazina; ou 5

ii) o reagente de reticulação heterobifuncional do passo b) é seleccionado do grupo constituído por : ácido 4-(4-maleimidafenil) butirico hidrazina - HC1.
12. Uma composição de eritropoietina biologicamente activa compreendendo duas ou mais moléculas de eritropoietina ligadas covalentemente por pelo menos uma ligação tio-éter produzível ou produzida pelo método de qualquer uma das reivindicações de 9 a 11.
13. Uma composição farmacêutica contendo uma quantidade eficaz de um transportador farmacêuticamente aceitável e uma composição de eritropoietina biologicamente activa compreendendo quer: a) duas ou mais moléculas de eritropoietina, ditas moléculas ligadas covalentemente por pelo menos uma ligação tio-éter, ou b) uma composição de eritropoietina de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8.
14. Uma composição de eritropoietina biologicamente activa como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 8 e 13 para uso em terapêutica.
15. Uma composição de eritropoietina. biologicamente activa de acordo com a reivindicação 14 para o tratamento da anemia.
16. Uso de uma composição de eritropoietina biologicamente activa de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8 e l-> para a fabricação de um medicamento para o tratamento da anemia. r u ο 4ABK, 2UU0 Lisboa,

Maria Silvina Ferreira Age.ile Oficial de Propriedade Industrial fi. Castilho, 201-3° E — 1070 LÍS30A Telels. 3851339-38546 13