PT96593B - Processo para a preparacao de uma composicao de ciclo-dextrina melhorada baseada em eritropoietina - Google Patents
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Description
DA
PATENTE DE INVENÇÃO
N.° 96 593
REQUERENTE: JANSSEN PHARMACEUTICA N.V., belga, com sede em Turnhoutseweg 30, B-2340 Beerse, Bélgica.
EPÍGRAFE: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO
DE CICLO-DEXTRINA MELHORADA BASEADA EM ERITROPOIETINA.
INVENTORES: Frank Jozef Konings, Marcus Joannes Maria
Noppe e Jean Louis Mesens.
Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.
Inglaterra, 29 de Janeiro de 1990, sob o ns 90.01.987.8.
INPI. MOO. 113 R F 18732
Descrição referente à patente de in venção de JANSSEN PHARMACEUTICA N. V., belga, industrial e comercial, com sede em Turnhoutseweg 30, B-2340 Beerse, Bélgica, (inventores: Frank Jozef Konings, Marcus Joannes Maria Noppe e Jean Louis Mesens, residentes na Bélgica), para: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO DE CICLO-DEXTRINA MELHORADA BASEADA EM ERITROPOIETINA».
DESCRIÇÃO
A presente invenção refere-se a uma nova composição farmacêutica para administração parentérica e local que inclui uma solução aquosa de eritropoietina e derivados hidroxi-alquilo de β ou Τ'-ciclo-dextrina. A presente invenção refere-se, também, a novas composições liofilizadas ou secas por aspersão de eritropoietina que incluem um derivado hidroxi-alquilo de β ou Τ'-ciclo-dextrina, a um processo para a preparação de tais composições liofilizadas ou secas por aspersão e a um método para, simul taneamente, estabilizar a eritropoietina numa solução aquosa e para evitar que seja absorvida pelas superfícies. Mais particularmente, a referida nova composição é adequada para administração directa subcutânea, nasal ou ocular de eritropoietina. num outro aspecto da presente invenção proporC.R.
ciona-se um novo método de tratamento de mamíferos que sofrem de anemia, por administração local, aos referidos mamíferos, de uma quantidade eritropoietica eficaz das presentes composições.
A eritropoietina é uma hormona glico-proteína circulante que induz um aumento na massa de glóbulos vermelhos, principalmente por estimulação da medula eritróide. A hormona está presente em quantidades vestígio e é, principalmente, produzida a partir de sítios ainda não identificados no rim dos adultos e nas células do fígado de fetos.
Verificou-se que a administração de alguns microgramas de eritropoietina numa dose ou em doses múltiplas, é eficaz na correcção da anemia de doenças renais em fase terminal. Este nível de dosagem deve contudo ser estritamente observado. Uma terapia com eritropoietina necessita assim de uma forma de dosagem que permita uma administração correcta de quantidades vestígio da hormona hexogena.
A produção de eritropoietina por tecnologia de DNA recombinante e a subsequente demonstração de que este novo agente é tão eficaz como a hormona nactiva levou ao estudo da sua utilização em várias aplicações terapêuticas. Contudo, a eritropoietina possui um inconveniente significativo que impediu o desenvolvimento de várias aplicações terapêuticas: não é estável, particularmente não é estável numa solução aquosa. Mesmo a temperaturas muito bai xas (-802C) pode observar-se um decréscimo essencial da actividade.
Este decréscimo de actividade é, por um lado, devido a degradação da eritropoietina numa solução aquosa. Por outro lado, o decréscimo na actividade re sulta da absorção substancial da eritropoietina na superfície inferior das paredes da seringa ou do recipiente o que, por seu turno, provoca degradação posterior.
Nestas circunstâncias têm-se feito várias tentativas para desenvolver um método para evitar que a eritropoietina em solução aquosa seja absorvida na su-
perfície interior das paredes do recipiente e para evitar a sua degradação.
A P.P.E. - 178576 preceitua um método de prevenção da absorção da eritropoietina numa solução aquosa, na superfície interior de um recipiente de vidro ou de plástico, por adição de -inter alia- albumina de soro humano, albumina de soro bovino, lecitina, dextranos, metilcelulose, poli-etileno-glicois, copolímeros de óxido de etileno - óxido de propileno e/ou óleo de rícino hidrogenado poli-oxi-etileno. Verificou-se que a recuperação de eritropoietina numa tal formulação totalizava 75 a 98% depois de duas horas a 20QC, enquanto que na formulação de controle apenas se recuperavam 16%. Contudo os requerentes sabem que não se pode manter a estabilidade funcional de longo prazo da eritropoitina em tais formulações. Para se obter uma estabilidade funcional de longo prazo não deve permanecer intacta apenas a estrutura poli-peptídia mas também a estrutura carbo-hidrato da glico-proteina, assim como se demonstrou que a glicolização e a sialiação adequadas, são essenciais para a função da hormona in vivo. Além disso pode esperar-se que as formulações anteriores possam elicitar reacções imunogénicas em determinados indivíduos, especialmente, depois de injecções repetidas. Os derivados de sangue, tais como, albumina de soro humano podem também ser fonte de infecções virais que poem em risco de vida.
No P.P.E. 178665 são descritos esta bilizadores que são adequados nas formulações secas por congelação e aquosas de eritropoietina. Os agentes estabilizantes que são referidos são polietileno-glicóis, proteínas, açucares, amino-ácidos, sais inorgânicos, sais orgânicos e agentes redutores contendo enxofre. Demonstrou-se que depois de uma semana, a actividade da eritropoietina, nas formulações estabilizadas a 25sc, diminuia a 67-73% da sua actividade original enquanto que a actividade na formulação não estabilizada diminuía de 46%. Támbém neste caso, verificou-se que a adição dos estabilizadores anteriores não garante uma estabilidade funcional de longo prazo da eritropoietina.
A P.P.E.- 306824 descreve formulações de eritropoietina estáveis secas por congelação que incluem ureia e amino-ácidos para estabilização e agentes tensio-activos para evitar a absorção. Como um inconveniente principal admite-se aqui as formulações de eritropoietina reconstituídas, na forma aquosa, possuem uma estabilidade limitada de alguns meses à temperatura ambiente. Assim, o consumidor é praticamente obrigado a reconstituir a formulação seca por congelação sempre antes de cada administração.
Na WO-90/03784 é descrito um método para solubilização e/ ou estabilização de poli-peptídios, especialmente proteínas, por intermédio de derivados de β e T-ciclo-dextrinas, assim como, composições incluindo um poli-peptídio e tais derivados de ciclo dextrina. Na lista longa de proteínas adequadas a eritropoietina é referida mas não é descrito qualquer exemplo específico de uma composição incorporando eritropoietina. Entre os derivados de ciclo-dextrina adequados são referidos β e 7-ciclo-dextrinas modificadas com - inter alia - hidróxi-propilo ou hidróxi-etilo. O número médio de unidades alcoxi por ciclo-dextrina, aparentemente, está compreendido entre aproximadamente 4,7 e 7 para a β-ciclo-dextrina (M.S. = 0,67 a 1) e entre, aproximadamente, 7 e 8 para as ^-ciclo-dextrinas (M.S. = 0,875 a 1). Particularmente notória é a baixa proporção, em peso, entre o derivado de ciclo-dextrina e o poli-peptídio, nomeadamente, de aproximadamente 1:1 a aprox imadamente 2 00:1.
O objectivo da presente invenção é preparar uma formulação de eritropoietina económica utilizável e segura que permita a auto administração que origine pequeno desconforto e sem originar qualquer irritação local. Um pré-requisito para se obter este objectivo é a preparação de uma solução aquosa de eritropoietina na qual a glico-proteína retém a sua estabilidade funcional durante um longo período de tempo. Tais formulações de eritropoietina devem ser administradas directamente sem qualquer manipulação posterior, tal como, reconstituição ou diluição.
que a referida pré-condição é cumprida pelas composições descritas adiante.
A presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica para administração parentérica ou local que incluí uma solução aquosa de eritropoietina e β ou Y-ciclo-dextrina em que um ou vários dos radicais hidroxi das unidades anidro-glicose da ciclo-dextrina foram substituídos por um radical de fórmula,
-O-[Alk-O-]n-H em que
ALK representa um radical alcano-(C^-Cg-di-ilo de cadeia linear ou ramificada em que, opcionalmente, um átomo de hidrogénio do referido radical ALK pode ser substituído por um grupo hidroxi; e n está compreendido entre 1 e 5, em particular, entre 1 e 3 e, mais particularmente, representa 1.
O número médio de unidades alcoxi por ciclo-dextrina, isto é, a soma média de n de todos os radicais de fórmula (I) substituídos na ciclo dextrina pode variar de menos do que 1 a aproximadamente 50, em particular, de 1 a 20, mais em particular, de 1 a 50, ou de 1 a 5.
De preferência, o número médio de unidades alcoxi por ciclo-dextrina está compreendido entre 1 e 4, em particular, entre 2,5 e 3,5 e, mais particularmente, é aproximadamente 3,8 em derivados de β-ciclo-dextrina e aproximadamente 3,2 em derivados F -ciclo-dex trina.
Nas definições anteriores o termo alcano(C1-C6-di-ilodefine radicais hidrocarbonetos bivalen tes de cadeia linear ou ramificada contendo de um a seis átomos de carbono, tais como, por exemplo, 1,2-etano-di-ilo, 1,2-propano-di-ilo, 1,3-propano-di-ilo, 1,4-butano-di-ilo,
1,5-pentano-di-ilo, 1,6-hexano-di-ilo e os seus isoméros ramificados. De particular utilidade, nesta invenção,são os
estéres de β ou > -ciclo-dextrina ou éteres mistos em que o átomo de hidrogénio de um ou vários grupos hidróxi da ciclo-dextrina são substituídos por um grupo hidróxi-etilo, hidro xi-propilo, di-hidroxi-propilo ou hidroxi-isobutilo. O termo éter misto significa derivados de β ou Y -ciclo-dextrina em que pelo menos, dois grupos hidróxi de ciclo-dextrina são eterifiçados com diferentes grupos hidroxi-alquilo, tais como, por exemplo, hidroxi-propilo e hidroxi-étilo.
A substituição molar média (M.S.) é utilizada, como uma medida do número médio de moles de unidades alcoxi por mole de anidro-glicose. Nos derivados de ciclo-dextrina para utilização nas composições, de acordo com a presente invenção, a M.S. está compreendida entre apro ximadamente 0,125 e 10, em particular, entre 0,3 e 3, ou, entre o, 3 e 1,5- De preferência a M.S. está compreendida entre aproximadamente 0,3 e aproximadamente 0,8, em particular, entre aproximadamente 0,35 e aproximadamente 0,5 e, mais particularmente, é de aproximadamente 0,4. A substituição molar média é convenientemente determinada por Fast Atom Bombardment Mass Spectroscopy (FAB-MS) no modo negativo.
O grau de substituição médio (D.S.) refere-se ao número médio de grupos hidroxilo substituídos por unidades de anidro-glicose. Nos derivados de ciclo-dextrina para utilização nas composições de acordo com a presente invenção, o D.S. estã compreendido entre 0,125 e 3, em particular, entre 0,2 e 2 ou entre 0,2 e 1,5. De preferên cia o D.S. está compreendido entre aproximadamente 0,2 e aproximadamente 0,7, em particular, entre aproximadamente 0,35 e aproximadamente 0,5 e, mais particularmente é de apro ximadamente 0,4.
Os derivados hidróxi-alquilo de β ou Y -ciclo-dextrina mais particulares para utilização nas composições de acordo com a presente invenção são derivados da ciclo dextrina parcialmente substituídos em que o grau médio de alquilação nos grupos hidroxilo de diferentes posições das unidades anidro glicose é de aproximadamente 0% a 20% para a posição 3, de 2% a 70% para a posição 2 e de aproximadamente 5% a 90% para a posição 6. De preferência, a quantidade de B ou 7^ -ciclo-dextrinas não substituídas e inferior a 5% do conteúdo total de ciclo-dextrinas e, em par ticular, inferior a 1,5%.
Os derivados de ciclo-dextrina mais preferidos para utilização na presente invenção são os éteres os éteres mistos de B-ciclo-dextrina parcialmente substi tuídos possuindo substituintes hidróxi-propilo, hidroxi-etilo e, em particular 2-hidróxipropilo e/ou 2-(1-hidróxi-propilo).
O derivado ciclo-dextrina mais preferido para utilização nas composições da presente invenção é hidróxi-propil-B-ciclo-dextrina possuindo uma M.S. compreendida entre aproximadamente 0,35 e 0,50 e contendo menos do que 1,5% de β-ciclo-dextrina não substituída.
As ciclo-dextrinas não substituídas podem preparar-se de acordo com os procedimentos descritos na patente norte-americana 3,459,731 e no pedido de patente britânico 2189-245 que são incorporados como referência para os processos de preparação. Em geral, as ciclo-dextrinas não substituídas reagem como um epóxido, de preferência, sob pressão super-atmosférica e a uma temperatura elevada, na presença de um catalisador alcalino.
Outras referências descrevendo ciclo-dextrinas para utilização nas composições de acordo com a presente invenção, e que proporcionam um guia para a preparação, purificação e análise das ciclo dextrinas incluem:
Ciclodextrin Technology por József Szejtli, Kluwer Academic Publishers (1988) no capítulo Ciclodextrinas in Pharmaceuticals;
Ciclodextrin Chemistry par M.L. Bender et al ., Springer-Verlag, Berlim (1978);
Advances in Carbohydrate Chemistry, vol 12 Ed. par
M.L. Wolfrom, Academic Press, New York (157) no capítulo The Schardinger, Dextrins by Dexter French nas págs. 189 a 260;
Ciclodextrins and their Inclusions Complexes par J. Szejtli, Akademiai Kiado, Budapest, Hungary (1982) ;
I. Tabushi in Acc. Chem Research, 1982, 15,p 66-72;
W. Sanger, Angewandte Chemie, 92,p. 343-361 (1981) ;
A.P.Croft and R.A.Bartsch in Tetrahedron, .39,p. (1417 -1474 (1983);
Irie et al. Pharmaceutical Research, 5, p. 713-716, (1988) ;
Pitha et al. Int. J.Pharm. 29, 73, (1986);
German Offenlegungsschrift DE 3118218;
German Offenlegungsschrift DE 3317064;
EP-A-149, 197;
patente norte americana 4,659,696; e patente norte americana 4,383,992.
Deve dar-se particular atenção a estas referências que descrevem os métodos de preparação e purificação que proporcionam misturas de ciclo-dextrinas em que a quantidade de ciclo-dextrina não reagida é inferior a 5% do conteúdo total de ciclo-dextrina.
A estabilidade da eritropoietina em solução aquosa aumenta com o aumento da concentração de β ou F -ciclo-dextrina até à sua fase de nível máximo. Nas composições finais, a ciclo-dextrina constitui entre aproximadamente 2,5 e 20% em peso, em particular entre aproximadamente 5 e 20%, mais em particular entre 5 e 15%, por exemplo, aproximadamente 10%, sendo o remanescente água, o ingrediente activo e alguns excipientes.
Em particular, as composições farmacêuticas estáveis podem consistir em água, ciclo-dextrina e eritropoietina apenas, sem a necessidade de estabilizadores adicionais tais como, albumina de soro humano, albumina de soro de bovino, lecitina , metil-celulose, poli-etileno-glicol, agentes redutores contendo enxofre, ureia, amino-ácidos e agentes tensio-activos. Pode adicionar-se um
agente para ajustar o pH, por exemplo, ácido clorídrico, ácido acético, ácido cítrico, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou um sal de qualquer destes, em particular, citrato de sódio. 0 pH apropriado para formular a eritropoietina varia de 6,5 a 7,4, em particular, de 6,8 a 7,0. Para a preparação de uma composição injectável é apropriado adicionar um agente de isotonização, por exemplo, cloreto de sódio, cloreto de potássio, sorbitol.
Uma vez que quantidades vestígio de iões de metais pesados catalisam a degradação de eritropoietina, pode ser apropriado adicionar um agente complexante adequado, tal como, cloreto de cálcio, citrato, EDTA e agentes de complexação de iões metálicos farmaceuticamente aceitáveis semelhantes. Por exemplo, pode adicionar-se cloreto de cálcio, numa concentração de aproximadamente 0,02 a 2 g /litro.
As preparações preferidas de acordo com a presente invenção possuem baixa toxicidade, e não são irritantes, permitindo assim o fabrico de um medicamento injectável que pode ser utilizado com segurança em regime de doses repetidas sem o risco de reacções imunogénicas.
As preparações preferidas são prepa rações prontas para utilização e são, de preferência, utilizadas por via subcutânea ou com uma aspersão nasal ou como gotas para os olhos. Estas preparações podem aplicar-se de uma forma fácil e simples e podem assim ser auto administradas, o que permite a terapia em casa.
Além disso, os medicamentos prepara dos de acordo com esta invenção permitem a obtenção de um perfil farmaco-cinético favorável de eritropoietinna, o gue proporciona um nível de plasma relativamente constante durante pelo menos um dia e, assim, proporciona uma boa resposta fisiológica, especialmente,quando administrada por via subcutânea ou como aspersão nasal ou gotas para os olhos.
A adição de um conservante adequado às preparações, tais como, alcoóis, por exemplo, étanol, 1,2 -propano-diol, alcoól benzílico ou seus derivados, alcoól fenil-etílico, fenol ou derivados de fenol, tais como, o bu-
til-parabeno, metil-parabeno, M-cresol ou cloro-cresol; ácidos, por exemplo, ácido benzóico, ácido sórbico, ácido cítrico, propionato de sódio, EDTA de di-sódio; clor-hexidina; di-isetionato de hexamidina; hexetidina; opcionalmente em combinação, com bi-sulfito de sódio, ou com propileno-glicol ou, menos preferivelmente, com sais de amónio quaternário, compostos metálicos, tais como, óxido de zinco, tio-mersal e sais de fenil-mercúrio, por exemplo, acetato de fenil-mercúrio permitem preparar formulações multi-dose segu ras de eritropoietina, para administração parentérica e, especialmente, para administração local (por exemplo, nasal ou ocular). O conservante, nas referidas formulações multidose, é, obviamente, escolhido de forma a que seja compatível com a via de administração. Uma tal formulação mui tidose constitui uma vantagem económica e prática relativamente às formulações de doses únicas conhecidas na especialidade.
A concentração do agente farmaceuticamente activo nas preparações desta invenção varia, naturalmente com o tipo de eritropoietina escolhido, com a sua fonte, a sua eficácia, a comparação da sua bio-disponibilidade por injecção subcutânea verso injecção intravenosa e da frequência desejada de administração combinada com a dosagem única desejada da formulação. De preferência a concentração de eritropoietina, na preparação desta invenção, pode estar compreendida entre aproximadamente 10000 a 50000 unidades internacionais (I.U.) por ml, particularmente, entre aproximadamente 500 e 20000 I.U. por ml, mais particularmente, entre aproximadamente 2 000 I.U. e 10000 I.U. e em especial, aproximadamente 4000 I.U. (1 I.U. corresponde a
8,4 ng de eritropoietina recombinante). Em geral é contemplado que uma quantidade eficaz varia de 1 a 200 I.U./kg de peso do corpo e mais preferivelmente, de 2 a 100 I.U./kg de peso de corpo, especialmente, quando a administração de eritropoietina é feita por via subcutânea. A quantidade eficaz depende, ainda, da espécie e tamanho do indivíduo a ser tratado, do estado particular e da sua gravidade e da via de administração. Em qualquer caso a dose a utilizar
deve ser não tóxica para o hospedeiro. Como um regime de dosagem subcutâneo, no tratamento de pacientes com diálise peritoneal ambulatória contínua (CAPD) a quantidade de eritropoietina administrada deve ser tal que aumente e mantenha os níveis de hemoglobina a 10-12 g/dl.
As formulações de eritropoietina atrás descritas podem, convenientemente, preparar-se por adição de eritropoietina em massa purificada a uma solução aquosa de ciclo-dextrina e por mistura da solução resultante. Podem adicionar-se outros ingredientes farmacêuticos, conforme desejado, antes, durante ou depois da adição da eri tropoietina em massa purificada. A referida preparação efectua-se, com vantagem, a uma temperatura baixa, em particular, inferior a 10sc e, especialmente, compreendida entre 2SC e 8SC.
Uma forma exemplar de preparação das preparações de eritropoietina invenção consiste na disso lução ou suspensão de eritropoietina numa solução aquosa de ciclo-dextrina incluindo um sistema tampão, um agente de ajustamento do pH, um agente de isotonização e/ou análogos. Na composição final, a razão molar de ciclo-dextrina: eritropoietina pode estar compreendida entre aproximadamente 500 000:1 a 5000:1.
Especialmente preferida, nas composições finais, a uma razão molar de hidroxi propil-B-ciclo-dextrina: eritropoietina compreendida entre aproximadamente 2000:1 e aproximadamente 20000:1, em particular, entre aproximadamente 130000:1 e aproximadamente 3000:1, mais particularmente, entre aproximadamente 135000:1 e aproximadamente 90000:1 ou entre aproximadamente 85.000:1 e aproximadamente 60000:1. A proporção peso em peso, entre a ciclo-dextrina e a eritropoietina, nas composições presentes, varia entre aproximadamente 7500:1 e aproximadamente 700:1, em particular, entre aproximadamente 6000:1 e aproximadamente 1000:1, mais particularmente, entre aproximadamente 4500:1 e aproximadamente 3000:1 ou entre aproximadamente 2800:1 e aproximadamente 2000:1.
As preparações aquosas de acordo com esta invenção, e um excipiente se necessário, podem também ser secas por congelação ou secas por aspersão, seguindo os procedimentos conhecidos na especialidade para proporcionar, uma composição desidratada que pode ser armazenada durante um longo período de tempo e dissolvida antes da administração. Nas referidas formulações secas por congelação ou secas por aspersão a razão molar e a razão, peso em peso, entre a ciclo-dextrina e a eritropoietina podem ser as mesmas das anteriormente referidas soluções aquosas. Como é conveniente em muitos casos para reconstituir as formulações secas por congelação ou secas por aspersão numa solução aquosa de ciclo-dextrina, a razão molar e a razão, peso em peso, entre a ciclo-dextrina e a eritropoietina podem também ser inferiores às atrás referidas para as soluções aquosas. Em tais formulações secas por aspersão ou secas por congelação a razão molar de hidróxi-propil-B-ciclo-dextrina e eritropoietina pode estar compreendida entre aproximadamente 250000:1 e aproximadamente 2000:1 especialmente entre aproximadamente 100000:1 e aproximadamente 5000:1, em particular, entre aproximadamente 50000:1 e aproximadamente 10000:1.
As composições de acordo com a presente invenção possuem vários aspectos surpreendentes que não podiam ser previstos com base nos conhecimentos convencionais. Assim, embora fosse já conhecido que as ciclo-dextrinas formam compostos de inclusão com outros compostos e que aumentam assim a estabilidade destes últimos compostos, a formação de compostos de inclusão tem sido principalmente limitada a situações em que a cavidade hidrofóbica se pode acomodar, pelo menos, em parte no composto hospedeiro.
Verificou-se, além disso, que enquanto que a β-ciclo-dextnna e a ι -ciclo-dextrina podem evi tar a absorção de eritropoietina na superfície das paredes do recipiente, a /-ciclo-dextrina hidróxido-alquilada e, em particular, a β-ciclo dextrina hidróxi-alquilada são mais adequadas para evitar alterações essenciais da estrutura do polipeptídio e do carbo-hidrato da glico-proteína e, assim, aumentar a estabilidade funcional de longo prazo da glicoproteína.
As preparações líquidas de acordo com esta invenção podem utilizar-se em qualquer dispositivo de libertação de dosagem, adaptado para administração parentérica, por exemplo, subcutânea ou administração local, por exemplo, administração nasal ou ocular.
dispositivo deve ser construído tendo em vista a determinação correcta da medição óptima e a compatibilidade dos elementos construtivos com a via de admi. nistração.
Num outro aspecto da presente inven ção proporciona-se um método para, simultaneamente, estabiljl zar eritropoietina numa solução aquosa e evitar que seja absorvida pelas superfícies, por formulação da referida eritropoietina com uma quantidade eficaz de um derivado de ciclo-dextrina. A natureza e a quntidade eficaz do derivado de ciclo-dextrina, para utilização no método presente, em particular, são as descritas nas composições de eritropoietina anteriores.
Ainda num outro aspecto da presente invenção proporciona-se um outro método de tratamento de mamíferos que sofrem de anemia, por administração local aos referidos mamíferos de uma quantidade eritropoiética eficaz das presentes composições. Em particular o da eferido método consiste na administração das presentes composições aquosas de eritropoietina-ciclo-dextrina ao nariz, como uma aspersão nasal, ou aos olhos como gotas para olhos.
Mais pormenores da prática desta in venção são fornecidos por intermédio dos exemplos seguintes, que, contudo, não foram feitos de forma a imporem qualquer limitação ao âmbito da presente invenção.
Exemplos de Composição
Exemplo 1: Solução Injectável
a) Eritropoietina 4000 I.U./ml
| Eritropoietina Humana Recombinante (r-HuEPO) | 4000 | U | |
| Cloreto de Sódio | 3,59 | mg | |
| Citrato de Sódio 2 aq | 5,8 | mg | |
| Ácido cítrico 1 aq | 62 | Mg | |
| Hidroxipropil-B-ciclodextrina(MS = 0,4) | 100 | mg | |
| Ácido clorídrico(IN) ou | q.b. | até | pH 6,9 |
| Hidróxido de sódio(IN) | |||
| Água | q.b. | até | 1 ml |
MÉTODO DE PREPARAÇÃO
Esterilizaram-se 18 litros de água fria livre de pirogénio, por filtração. Adicionaram-se, com agitação,2kg de hidróxi-propil-B-ciclo-dextrina (M.S. =0,4), 116g. de citrato de sódio 2.aq, l,24g. de ácido cítrico laq. e 71,8g. de cloreto de sódio.
Arrefeceu-se a solução a 25δΟ e ajustou-se o pH a um pH de 6,9, por adição de NaOH(lN) ou HC1(1N). Agitou-se a solução até ficar homogénea e arrefeceu-se a uma temperatura compreendida entre 2SC e 82C.
Liquefizeram-se 500ml de r-HuEPO pu rificado (160000 I.U./ml) armazenados de -70SC a -80sc, por imersão num banho de água a 20sc. Adicionou-se à solução congelada, solução tampão de ácido cítrico e agitou-se durante cinco minutos a uma temperatura inferior a 82C. Diluiu-se esta solução com água fria livre de pirogénio até um volume final de 20 litros e esterilizou-se por filtração sob atmosfera de azoto estéril. Deitou-se a solução final em recipientes estéreis de lml.
Prepararam-se as formulações seguin tes da mesma forma, utilizando quantidades adequadas dos ingredientes, para se obter uma solução final com a composição necessária.
b) Eritropoietina 2000 I.U./ml
Eritropoietina Humana Recombinante (r-HuEPO) 2000 U
Cloreto de Sódio 5,84 mg
| Citrato de Sódio 2 aq Ácido cítrico 1 aq | 5,8 62 50 q.b. q.b. | mg mg até pH 6,9 | |||
| Hidroxipropil-B-ciclodextrina(MS = Ácido clorídrico(IN) ou Hidróxido de sódio(IN) Água | 0,4) | ||||
| até | 1 ml | ||||
| c) Eritropoietina 10000 I.U./ml | |||||
| Eritropoietina Humana Recombinante | (r-HuEPO) | 10 000 U | |||
| Citrato de Sódio 2 aq | 5,8 | mg | |||
| Ácido cítrico 1 aq | 62 | Mg | |||
| Hidroxipropil-B-ciclodextrina(MS = | 0,4) | 200 | mg | ||
| Ácido clorídrico(IN) ou | q.b. | até | pH | 6,9 | |
| Hidróxido de sódio(IN) | |||||
| Água | q.b. | até | 1 ml | ||
| EXEMPLO 2: Gotas de olhos | |||||
| Eritropoietina Humana Recombinante | (r-HuEPO) | 4000 U | |||
| Cloreto de Sódio | 3,59 | mg | |||
| Citrato de Sódio 2 aq | 5,8 | mg | |||
| Ácido cítrico 1 aq | 62 | Mg | |||
| Fenil-Mercúrico-Acetato | 0,02 | mg | |||
| Hidroxipropil-B-ciclodextrina(MS = | 0,4) | 100 | mg | ||
| Ácido clorídrico(IN) ou | q.b. | até | PH | 6,9 |
Hidróxido de sódio(IN)
Água q.b. até 1 ml
EXEMPLO 3: Aspersão Nasal
ES*
| Eritropoietina Humana Recombinante | (r-HuEPO) | 4000 | U | |
| Cloreto de Sódio | 3,59 | mg | ||
| Citrato de Sódio 2 aq | 5,8 | mg | ||
| Ácido cítrico 1 aq | 62 | μ<3 | ||
| Tiomersal | 0,02 | mg | ||
| Hidroxipropil-B-ciclodextrina(MS = | 0,4) | 100 | mg | |
| Ácido clorídrico(IN) ou | g. b. | até | pH 6,9 | |
| Hidróxido de sódio(IN) | ||||
| Água | q. b. | até | 1 ml | |
| B.EXEMPLOS BIOLÓGICOS | ||||
| EXEMPLOS 4: EFEITO ESTABILIZANTE | DE VÁRIAS | CICLO-DEXTRINAS |
EM EPO
Investigou-se a integridade estrutu ral de eritropoietina com diferentes estabilizadores, utilizando uma combinação de cromatografia de permuta iónica e electroforese de gel de poli-acrilamida. Comparou-se o efeito estabilizante de diferentes derivados de ciclo-dextrina com albumina humana. As soluções de EPO(eritropoietina) utilizadas de acordo com a presente invenção prepararam-se como se segue:
diluiu-se 1 mg. de EPO (Amgen) em 2,6 ml de tampão, ácido cítrico (citrato de sódio.2H2O:5,80g. ácido cítrico .H2O:O,O623g, e cloreto de sódio : 5,84g em 1000 ml de água e purificou-se por osmose inversa e ultra-filtração. Filtrou-se o tampão através de um filtro de 0,22 μια). Diluiu-se esta solução de EPO numa solução de hidróxi-pro. . . . . rpil-B-ciclo-dextrina (M.S. =0,4) ou hidróxi-propil- I -ciclo-dextrina (M.S. =0,4) no tampão de ácido cítrico atrás definido. A concentração final resultante das ciclo-dextrinas era de 5 e 20%, a concentração de EPO final era de 33μg/ml, equivalente a 4000 U/ml. Para comparação com albumina de soro humano (HSA) como um estabilizador, utilizou-se EPO rapidamente formulada obtida de Cilag(lote Ns. 88Z008). A composição deste material era: citrato de sódio.2H20:5,8mg., ácido cítrico : 0,057mg, cloreto de sódio : 5,84mg,albumina humana : 2,5 mg e 0,0336 mg de eritropoietina em 1 ml de água.
A solução do controlo consistia de 0,0336 mg de eritropoietina em 1 ml de ãgua.
Mantiveram-se as diferentes soluções em recipientes de vidro a 57sc, num banho de água de temperatura controlada. Investigou-se o efeito estabilizante das ciclo-dextrinas em EPO, por cromatografia de permuta iónica, por comparação da altura do pico do EPO purificado antes da incubação com a altura do pico, depois de 10 dias e depois de três semanas a 57sc. 0 método cromatográfico utilizado foi como se segue:
Instrumento :FPLC(Pharmacia, Uppsala, Suécia)
Sistema de Detecção :Adsorção UV 280 nm
Coluna :Mono Q (Pharmacia, Uppsala,
Suécia)
Aplicaram-se fracções de 500 μΐ contendo EPO a uma coluna Mono Q (0,5 x 5 cm) à temperatura ambiente. 0 tampão A era 20mM Tris (pH 8,0); o tampão B era 20mM Tris (pH 8,0) contendo NaCl 1M. O caudal era de lml/minuto. Utilizou-se um gradiente do sal. Eluíu-se o EPO depois de aproximadamente seis minutos, (a concentração correspondente do NaCl foi de 16mM).
Esta técnica mostrou uma separação completa de EPO da albumina do soro ou da ciclo-dextrina como verificado por electroforese.
Mediu-se a altura do pico da fracção de EPO. Controlou-se a pureza e homogeneidade das fraç ções de proteína diluídas a 16mMde NaCl por meio de electroforese de gel poli-acrilamida. Efectuou-se a electroforese como se segue:
Reduziu-se uma mistura da fracção contendo EPO, por mistura com um tampão amostra (0,167 M Tris, 33% de glicerol, 3,3% de dodecil-sulfato de sódio, 4% de ditiotreitol:0,005% de bromo-fenol azul, pH 6,8) e incubou-se a 100SC, durante 15 minutos.
Aplicaram-se 15 μΐ da amostra ao gel de poli-acrilamida dodecil-sulfato de sódio a 10%. Efeç tuou-se a electroforese utilizando um tampão de electroforese (glicina 0,38 Μ/Tris pH 8,3 dodecil sulfato de sódio a 0,1%) durante 90 minutos a 150 V de acordo com o método descrito em Laemmli; U, (1970) Nature (London)227, 680-685.
Coloriu-se, depois, o gel com prata utilizando o método descrito em Morrisey J.H., (1981) Anal. Biochem. 117, 307-310. A experiência electroforética mostrou, claramente, que a fracção de EPO era homogénea quando se utilizavam derivados de ciclo-dextrina como estabilizadores. A fracção EPO utilizando albumina humana como estabilizador mostrou a presença de proteínas com peso molecular mais elevado e a percentagem de EPO era baixa em comparação com os produtos de degradação presentes.
Os produtos de degradação eram provavelmente originados pela albumina. Isto pode explicar o facto do pico da fracção de EPO com albumina humana como estabilizador ser mais alto, depois de três semanas do que no início. Isto também implica que a técnica cromatografica permutadora de iões tem de ser utilizada em combinação com a técnica electroforética para se avaliar a estabilização da EPO.
O quadro 1 resume os resultados da experiência.
QUADRO 1
| Protecção utilizada | Altura do pico de EPO (cm) antes da i ncubação | Altura do pico de EPO (cm) depois de 10 dias | Remanescente EPO (%) | Altura do pico EPO (cm) depois de 20 dias | EPO Remanes- cemte (%) |
| Controlo | 11,9 | 6,0 | 50 % | 2,9 | 24 % |
| HSA 0,25 % | 10,6 | 6.4/5,1 (*) | 48 % | 10,7/3,2 (*) | 30 % |
| HP-B-CD 5 % | 11.5 | 5,4 | 47 % | 6,3 | 55 % |
| HP-B-CO 20 % | 11,5 | 13,4 | 100 % | 7,1 | 62 % |
| HP-jf-CD 5 % | 11.2 | 5,1 | 46 % | 3,2 | 29 % |
| HP-)f-CD 20% | 12.5 | 9.7 | 78 % | 4.5 | 36 % |
(*> As alturas dos picos de EPO das formulações contendo albumina de soro humano antes e depois de corrigidas, com base na avaliação electroforética do conteúdo em EPO.
EXEMPLO 5:
EFEITOS ESTABILIZANTES DE VÁRIAS CONCENTRAÇÕES
DE CICLO-DEXTRINA EM EPO
Numa segunda experiência, investigou-se o efeito estabilizante de diferentes concentrações de hidróxi-propil-B-ciclo-dextrina utilizando a mesma metodologia. Os resultados electroforéticos mostraram que, quando se utilizou hidróxi-propil-B-ciclo-dextrina como estabilizador, a fracção eluida a NaCl 16mM consistia de EPO pura, sem produtos de degradação A fracção EPO utilizando albumina de soro humano como estabilizador mostrou, de novo, a presença de produtos de degradação de peso molecular mais elevado. Os resultados estão resumidos no quadro 2.
QUADRO 2
| Protecção utί i zada | Altura do pico de EPO (cm) antes de i ncubação | Altura do pico de EPO (cm) depois de 7 dias | Remanescente EPO (%) | Altura do pico de EPO (cm) depois de 18 dias | EPO Remanes- cente (%) |
| Controlo | 11,1 | 3,3 | 30 % | 4,2 | 38 % |
| HSA | 10,5 | 9,5/3,8 (*) | 36 % | 9,0/0,5 (*) | 5 % |
| HP-B-CD 5 % | 12,8 | 6,4 | 50 % | 5,5 | 43 % |
| HP-B-CD 10 % | 12,1 | 6,9 | 57 % | 6,8 | 56 % |
| HP-B-CD 15 % | 12,7 | 6,8 | 54 % | 6,4 | 50 % |
| HP-B-CD 20 % | 11,4 | 7,0 | 61 % | 4,8 | 42 % |
(*) As alturas do pico de EPO das formulações contendo albumina de soro humano antes e depois de correcção com base na avaliação electroforética no conteúdo em EPO.
Resumindo estas experiências, pode concluir-se que os derivados de ciclo-dextrina protegem a EPO da degradação. A protecção obtida com ciclo-dextrinas foi melhor do que a obtida com albumina de soro humano, pelo menos, nas condições experimentais utilizadas .
EXEMPLO 6: ABSORÇÃO DE EPO EM MATERIAL PLÁSTICO NA PRESENÇA DE CICLO-DEXTRINAS
A solução de EPO utilizada neste estudo preparou-se como se segue:
Diluiu-se lmg de EPO (Amgen) em 2,6 ml de tampão ãcido cítri. co (citrato de sódio.21^0:5,80, ácido cítrico. 1^0:0,0623g ecloreto de sódio: 5,84g em 1000 ml de água purificada por osmose inversa e ultra-filtração. Filtrou-se o tampão através de um filtro de 0,22 μια). Diluiu-se esta solução de EPO numa solução de hidróxi-propil-B-ciclodextrina no tampão ácido cítrico atrás definido. A concentração final de hidróxi-propil-B-ciclo-dextrina era de 10 ou 20%. A concentração final de EPO era de 33 Mg/ml. Quando se se utiliza a albumina humana como veículo,utiliza-se a EPO Cilag lote Ns 89121/443 como referência.
Injectou-se 1 ml das várias soluções de EPO num conjunto de infusão (Universal set 315 00339 de Travenol) e deixou-se repousar durante a noite a 4SC. De pois de recuperação realizaram-se os protocolos cromatogrãficos e electroforéticos como atrás descritos. Mediu-se a altura do pico da fracção de proteína eluida a NaCl 16 mM.
quadro 3 resume os resultados. Os números são os resultados obtidos em duas experiências diferentes.
QUADRO 3
| Protecção utilizada | Altura do pico de EPO | Altura do pico de EPO | EPO não | adsorvida | ||
| (cm) antes | da | (cm) depois | da | (%) | ||
| adsorção | adsorção | |||||
| Experiência | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 |
| Controlo | 9,6 | 9.2 | 3.5 | 4,0 | 36,5 % | 43,5 % |
| HSA | 9,8 | 5,7 | 8,4 | 5.3 | 85,7 % | 93,0 % |
| HP-B-CD 10 % | 11,4 | 13,4 | 11,3 | 10,2 | 99,1 % | 76,1 % |
| HP-B-CD 20 % | 12,9 | 10,4 | 12,4 | 11,2 | 96,1 % | 107,6 % |
Para todas as amostras ensaiadas, os resultados electroforéticos demonstraram que a fracção eluída a NaCl 16 mM consistia de EPO pura, não se monstrando qualquer produto de degradação.
Destas experiências pode concluir-se que a hidróxi-propil-B-ciclo-dextrina evita a absorção de EPO no material plástico utilizado nos conjuntos de infusão assim como a albumina de soro humano.
EXEMPLO 7: BIO-ENSAIO DE ERITROPOIETINA EM RATOS
Utilizou-se o bio-ensaio de ex-hipó xico-policitémico em ratos para verificar a actividade biológica de r-HuEPO. Neste ensaio aclimataram-se os ratos a pressão atmosférica reduzida (0,4 atm aproximadamente) durante duas semanas para induzir a formulação de glóbulos vermelhos, em resposta a produção de eritropoietina fisiológica natural. Quando os ratos voltaram as condições atmos féricas normais, a elevada capacidade de transporte de oxigénio resultante do aumento dos glóbulos vermelhos circulantes suprimiu qualquer produção de eritropoietina endógena. Sob estas condições, o animal responde com mais indução de formação de glóbulos vermelhos à eritropoietina aplicada exogenamente, de uma forma dependente da dose. A quantificação da produção de novos glóbulos vermelhos efectua-se por medição da absorção de ferro radioactivo (59Fe). Comparam-se as curvas de dose-resposta obtidas com a amostra r-HuEPO (eritropoietina recombinante humana) das preparações de ciclo-dextrina de ensaio com a r-HuEPO padrão, para determinar a actividade da amostra.
EXEMPLO 8: ESTUDO COMPARATIVO
Avaliou-se a bio-disponibilidade de eritropoietina depois de administração subcutânea de eritropoietina numa formulação de hidróxi-propil-B-ciclo-dextrina, em comparação com formulações utilizando a albumina de soro humano, em voluntários saudáveis, no estudo seguinte.
A seis voluntários machos saudáveis com idades compreendidas entre 30 e 40 (média 32) anos e pe24
sos de corpo compreendidos entre 69 e 80 (média 75) kilos, administrou-se, subcutâneamente, no braço superior, 1 ml de uma solução EPO (4000 I.U./ml), de acordo com um projecto transversal aleatório. Ocorreu um intervalo de quatro semanas entre os dois ensaios. As duas formulações de EPO eram:
A: uma solução vendida com 4000 I.U./ml(Eprex Cilag;
Lote NS 89128/385)
| r-HuEPO | 4 000 | I.U. |
| Albumina de soro humano | 2,5 | mg |
| Cloreto de sódio | 5,84 | mg |
| Citrato de sódio 2 H2O | 5,8 | mg |
| Ácido cítrico | 0,057 | mg |
| Água para injecção | 1 | ml |
| uma solução com 4000 I.U./ml contendo | 10% de ] | hidróxi |
| propil-fi-ciclodextrina | ||
| r-HuEP | 4 000 | I.U. |
| Cloreto de sódio | 3,59 | mg |
| Citrato de sódio 2 H20 | 5,8 | mg |
| Ácido cítrico | 0,057 | mg |
| Hidróxi-propil-e-ciclodextrina (M.S.=0,4) | 100 | ml |
| Água para injecção | 1 | ml |
Tomaram-se amostras de sangue venoso (4ml) para a determinação de EPO, imediatamente antes, e 2,4,8,10,12,24,32,48,56,72 e 96 horas depois da administração e permitiu-se a coagulação à temperatura ambiente. Durante as primeiras 48 horas tiraram-se amostras do braço oposto. Armazenaram-se os soros separados, a menos 20sc até serem ensaiados. Mediram-se as concentrações de plasma de EPO por um imuno-ensaio de enzima (EIA) com um limite de detecção de 5mU/ml até um máximo de 96 horas depois da administração, de acordo com o procedimento descrito em Clini25
gen Eritropoietin EIA Kit, 96 Tests (Ns ABC06096), Manual do utilizador.
Determinaram-se os seguintes parâmetros fármaco-cinéticos de EPO.
concentração do plásma máxima (Cmax: mU/ml) tempo para a concentração máxima de plasma (Tmax:h) área sob a curva tempo-concentração (AUCO-96h:mU. h/ml) bio-disponibilidade relativa da formulação hidróxi-propil-B-ciclo-dextrina comparada com a da formulação vendida, isto é, razão AUCO-96h x 100(Frel- :1%).
As diferenças dos valores dos parâmetros anteriores entre as duas formulações não possuíam qualquer significado estatístico.
Bio-disponibilidade Comparativa de EPO depois de administração S.C.
| Parâmetro | A(Eprex ®;Cilag) | B(10% HP-B-CD) |
| T max:h | 16,3 ± 8,5 | 19,7 ± 11,0 |
| p max:mU/ml | 33,4 ± 7,5 | 30,8 ± 9,9 |
| AUC0_96h;mUh/,ml | 1864 ± 548 | 1753 ± 428 |
| Frel, % | 96,4 ± 14,5 |
A eritropoietina lentamente absorvi da, depois da administração subcutânea da formulação vendida (Eprex ^5) ) e da formulação desenvolvida, de novo, hidróxi-propil-B-ciclo-dextrina.
Aproximadamente 10 a 24 horas depois da administração das formulações, observaram-se níveis no plasma próximo do máximo, da ordem de 30mU/ml. A bio-dis ponibilidade relativa da formulação de hidróxi-propil-β-ciclo-dextrina para a formulação vendida foi de 96%. Pode concluir-se que as duas formulações são bio-equivalentes em velocidade e extensão de absorção.
Verificou-se irritação nos sítios de injecção antes e 2,4 e 24 horas depois de cada administração. Não se verificou qualquer edema, eritema, comichão ou dor em qualquer um dos voluntários, em qualquer altura durante o estudo total.
As duas formulações são assim igual.
mente bem toleradas.
Não se observaram mudanças químicas importantes na bioquímica do soro. A administração sub-cutânea de EPO não influenciou a tensão arterial ou o ritmo cardíaco.
Claims (9)
1. Composição farmacêutica que compreende uma solução aquosa de eritropoietina e hidroxipropil-p-ciclodextrina, caracterizada pelo facto de a substituição molar (S.M.) média estar compreendida no intervalo entre 0,35 e 0,5 e pelo facto de a proporção em peso entre a ciclodextrina e a eritropoietina estar compreendida entre 7500:1 e 700:1.
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de a concentração de ciclodextrina estar compreendida no intervalo entre 2,5% e 20% em peso, sendo a parte restante constituída por água, eritropoietina e quaisquer excipientes.
3. Composição injectâvel de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo facto de compreender também um agente que confere isotonia.
4. Composição de doses múltiplas de acordo com uma qualquer das reivindicações 2 ou 3, caracterizada pelo facto de compreender também um agente conservante.
5. Composição de doses múltiplas de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo facto de ser formulada sob a forma de um vaporizador nasal.
6. Composição de doses múltiplas de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo facto de ser formulada sob a forma de gotas oftálmicas.
7. Processo para a preparação de uma composição de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo facto de se misturar muito bem a eritropoietina com uma solução aquosa de ciclodextrina e de se adicionar facultativamente outros ingredientes aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, sendo a adição efectuada antes, durante ou após a operação de mistura.
8. Processo para a preparação de uma composição de acordo com uma qualquer das reivindicações la 6, caracterizado pelo facto de se dissolver a eritropoietina numa solução aquosa de ciclodextrina que contém um sistema tampão, um agente para ajustar o pH e um agente que confere isotonia, sendo depois a solução assim obtida facultativamente liofilizada ou seca em aspersão.
9. Método para estabilizar a eritropoietina numa solução aquosa e simultaneamente evitar que seja adsorvida nas superfícies, formulando a referida eritropoietina com uma quantidade eficaz de hidroxipropil-p-ciclodextrina, caracterizado pelo facto de a substituição molar (S.M.) média estar compreendida no intervalo entre 0,35 e 0,5 e pelo facto de a proporção em peso entre a ciclodextrina e a eritropoietina estar compreendida entre 7500:1 e 700:1.
A requerente reivindica a prioridade do pedido de patente britânico apresentado em 29 de Janeiro de 1990, sob o n° 90.01.987.8
Lisboa, 29 de Março de 2001 (9 ASÇNTE OFICIAL DA PROPRJEDADE INDUSTRIAL
RESUMO
PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO TRINA MELHORADA BASEADA EM
DE UMA COMPOSIÇÃO DE ERITROPOIETINA
CICLO-DEX-
A invenção refere-se a um processo para a preparação de uma composição farmacêutica compreenden do uma solução aquosa de eritropoietina e B- ou Ϋ ciclodextrina em que um ou mais dos radicais hidróxi das unidades anidroglucose da ciclodextrina foram substituídas por um radical de fórmula
-O-[Alk-O-]n-H (I) em que
Alk representa um radical alcanoilo (C-j^-Cg) de cadeia linear ou ramificada em que opcionalmente um átomo de hidrogénio do referido Alk pde ser substituído por um grupo hidroxi; e n representa um número de 1 a 5, que, compreende misturar-se intimamente uma solução aquosa de ciclodextrina com entropoietina, numa proporção em peso compreendida entre 7.500:1 e 700:1 com adição opcional prévia, durante ou após a mistura de ingredientes farmacêuticamente aceitáveis adicionais.
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