JPH05503700A - 改良されたシクロデキストリンに基づくエリスロポイエチンの組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 改良されたシクロデキストリンに基づ（エリスロポイエチンの組成物本発明は、 エリスロポイエチンおよびβ−またはγ−シクロデキストリンヒドロキシアルキ ル誘導体の水溶液からなる非経口的および局所的投与のための新規な製剤学的組 成物に関する。本発明は、また、新規なβ−またはγ−ンクロデキストリンヒド ロキシアルキル誘導体からなる凍結乾燥または噴霧乾燥したエリスロポイエチン 組成物、このような水性、凍結乾燥または噴霧乾燥した組成物を調製する方法、 および同時にエリスロボイエチンを水溶液中で安定化しかつそれが表面に吸着す るのを防止する方法に関する。より詳しくは、前記新規な組成物は、とくに、貧 血の処置のための直接の皮下、鼻または眼の投与に有用である。本発明のそれ以 上の目的において、貧血に悩む哺乳動物に有効エリスロポイエチン量の本発明の 組成物を局所的に投与することによって、前記哺乳動物を処置する新規な方法が 提供される。

エリスロボイエチンは、主として赤色骨髄を刺激することによって、赤血球の質 量の増加を誘発する、循環する糖タンパク質のホルモンである。このホルモンは 微量で存在し、そして大人の腎臓および胎児の肝臓細胞の中のなお同定されない 部位から主として産生される。

数ミクログラムのエリスロボイエチンを、１つまたは多数の投与量で、投与する ことは、終わりの段階の腎臓病の貧血を直すとき有効であることが発見された。

しかしながら、この投与のレベルは厳格に観測すべきである。したがって、エリ スロポイエチンを使用する治療は、微量の外因性ホルモンの正確な投与を可能と する投与の形態を必要とする。

組み換えＤＮＡ技術によるエリスロポイエチンの産生および引き続くこの新しい 因子が自然のホルモンとして有効であることの実Ｅは、種々の治療学的応用にお けるその使用の研究に導いた。しかしながら、エリスロボイエチンは、多数の治 療学的応用の開発を従来妨害した１つの十分な欠点を有する　それは安定でなく 、とくに水溶液の中で安定ではない。非常に低い温度（−８０℃）においてさえ 、活性の実質的な減少を観測することができる。

この活性の減少は、一方において、水溶液中のエリスロポイエチンの劣化のため である。他方において、活性の減少は注射器または容器の壁の内表面上のエリス ロポイエチンの実質的な吸着、次いでこれがそれ以上の劣化を引き起こす結果で ある。

これらの種々の環境下に、水溶液中のエリスロポイエチンが容器の壁の内表面に 吸着するのを防止しかつそれが劣化するのを防止する方法を開発するために、種 々の試みがなされてきている。

欧州特許出願（ＥＰ−Ａ）第１７８５７６号は、なかでもヒト血清アルブミン、 ラン血清アルブミン、レクチン、デキストラン、メチルセルロース、ポリエチレ ングリコール、エチレンオキシドープロピレンオキシドのコポリマーおよび／ま たはポリオキシエチレン水素化ヒマシ油の添加により、ガラスまたはプラスチッ クの容器の内表面の上に、水溶液中のエリスロポイエチンが吸着するのを防止す る方法を教示している。

このような配合におけるエリスロボイエチンの回収は、２０℃において２時間後 、合計７５〜９８％であるが、対照配合物において、わずかに１６％が回収され ることが実証された。しかしながら、出願人自身の経験は、このような配合物の 中にエリスロポイエチンの長期間の機能的安定性を保持することができないこと である。長期間の機能的安定性を得るために、糖タンパク質のポリペプチドの構 造ばかりでなく、かつまた炭水化物の構造は完全に止まらせるべきである。なぜ なら、適切なグリコリル化およびノラン化は生体内のホルモンの機能のために必 須からである。さらに、前述の配合物はある種の被検体において、ことに反復し た注射後に、免疫原性反応を誘発できることを期待することができる。

血液の誘導体、例えば、ヒト血清アルブミンは、また、生命を脅かすウィルスの 感染源であることがある。

欧州特許出願（ＥＰ−Ａ）第１７８６６５号に、凍結乾燥した水性エリスロポイ エチン配合物において有用である安定剤が記載されている。

安定剤として、ポリエチレングリコール、タンパク質、糖、アミノ酸、無機塩、 有機塩および硫黄含有還元剤が述べられている。安定化された配合物中で２５℃ において１週後のエリスロポイエチンの活性はもとの活性の６７〜７３％に減少 するが、安定化されていない配合物中の活性は４６％に減少することが実証され た。また、この場合において、上の安定剤の添加はエリスロポイエチンの長期間 の機能的安定性を保証しないことが発見された。

欧州特許出願（ＥＰ−Ａ）第３０６８２４号は、安定化のための尿素およびアミ ノ酸および吸着を防止するための界面活性剤からなる、安定な凍結乾燥したエリ スロポイエチン配合物を記載している。主要な欠点として、水性の形態で再構成 されたエリスロポイエチン配合物は室温において数カ月の限定された安定性を有 することが、その中で、認められている。したがって、顧客は実際には投与直前 に再び各回凍結乾燥した配合物を再構成しなくてはならない。

ＷＯ−９０１０３７８４号において、β−およびγ−シクロデキストリンの誘導 体、ならびにポリペプチドおよびこのようなシクロデキストリン誘導体からなる 組成物により、ポリペプチド、ことにタンパク質を溶解化および／または安定化 する方法が記載されている。適当なタンパク質の広範なリストの中に、エリスロ ボイエチンが述べられているが、特定の例はエリスロポイエチンからなる組成物 を開示している。適当なシクロデキストリン誘導体の中に、なかでもヒドロキシ プロピルまたはヒドロキシエチルで変性したβ−およびγ−シクロデキストリン が述べられている。アルコキシ単位の平均数／シクロデキストリンはβ−シクロ デキストリンについて約４．７〜７　（Ｍ、Ｓ、　＝０．　６７〜１）およびγ −シクロデキストリンについて約７〜８　（Ｍ、Ｓ、＝０．　８７５〜１）の範 囲である。シクロデキストリン誘導体／ポリペプチドの低い重量／重量比、すな わち、約１１〜約２００　：　１はとくに注目に値する。

本発明の目的は、自己投与を可能として不快をわずかにしかつ局所的刺激を引き 起こさない、経済的、実施可能なかつ安全なエリスロポイエ、チン配合物を調製 することである。この目標を得るための前提条件は、糖タンパク質が長期間にわ たって機能的安定性を保持する、水性エリスロポイエチン配合物の調製である。

このようなエリスロポイエチンの配合物は、好ましくは、それ以上の操作、例え ば、再構成または希釈しないで、直接投与すべきである。

驚くべきことには、前記前提条件は後述する組成物により満足されることが発見 された。

本発明は、β−またはγ−７クロデキストリンのアンヒドログルコース単位のヒ ドロキシ部分の１または２以上が、式％式％（） 式中、 Ａｌｋは直鎖状もしくは分枝鎖状のＣ，−Ｃ６アルカンジイル基であり、ここで 前記基Ａｌｋの１つの水素原子はヒドロキシ基で置換されていてもよく、そして ｒｎＪは１〜５の範囲、とくに１〜５、よりとくに１である、の基で置換されて いる、エリスロポイエチンおよびβ−またはγ−シクロデキストリンの水溶液か らなる製剤学的組成物に関する。アルコキシ単位の平均数／シクロデキストリン 、すなわち、シクロデキストリン上で置換された式（１）のすべての基のｒｎＪ の平均の合計は１より小から約５０．とくに１〜２０、よりとくに１〜１０、ま たは１〜５の範囲であることができる。好ましくはアルコキシ単位の平均数／シ クロデキストリンは２〜４、とくに２．５〜３．５の範囲であり、そして最もと くにβ−シクロデキストリン誘導体において約２．８でありかつγ−シクロデキ ストリン誘導体において約３．２である。

前の定義において、用語ｒｃ、−ｃ、アルカンジイル」は、１〜６個の炭素原子 を有する２価の直鎖状もしくは分枝鎖状の炭化水素基、例えば、１，２−エタン ジイル、１，２−プロパンジイル、１．３−プロパンジイル、１．４−プロパン ジイル、１，５−ペンタンジイル、１，６−ヘキサンジイルおよびそれらの分枝 鎖状の異性体を定義する。β−またはγ−シクロデキストリンのエーテルまたは 混合エーテルは本発明においてとくに実用性をもち、ここで１または２以上のシ クロデキストリンのヒドロキシ基の水素原子はヒドロキシエチル、ヒドロキシプ ロピル、ジヒドロキンプロピルまたはヒドロキシアルキル基により置換されてい る。用語混合エーテルは、少なくとも２つのシクロデキストリンのヒドロキシ基 は異なるヒドロキシアルキル基、例えば、ヒドロキシプロピルまたはヒドロキシ エチルでエーテル化されている、β−またはγ−シクロデキストリン誘導体を意 味する。

平均モル置換度（Ｍ、Ｓ、　）は、アンヒドログルコースの１モル当たりのアル コキシ単位の平均モル数の測度として使用する。本発明による組成物において使 用するシクロデキストリン誘導体において、Ｍ、Ｓ。

は０．１２５〜１０、とくに領　３〜３、または０．　３〜１．５の範囲である 。好ましくは、Ｍ、Ｓ、は約０．３〜約０．８、とくに約０．　３５〜約０，５ の範囲であり、そして最もとくに約０．　４である。平均モル置換は、便利には 、マイナスのモードにおいて急速原子衝突質量スペクトル（Ｆａｓｔ　Ａｔｏｍ 　Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）（ＦＡＢ− ＭＳ）により決定される。

平均置換度（Ｄ、Ｓ、　）は、置換されたヒドロキシルの平均数／アンヒドログ ルコース単位を呼ぶ。本発明による組成物において使用するシクロデキストリン 誘導体において、Ｄ、Ｓ、は０．１２５〜３、とくに０．２〜２または０．２〜 １．５の範囲である。好ましくは、Ｄ、Ｓ。

は約０．　２〜約０．　７、とくに約０．３５〜約０５の範囲であり、そして最 もとくに約０．４である。

よりとくに本発明による組成物において使用するβ−またはγ−シクロデキスト リンヒドロキシアルキル誘導体は部分的に置換されたシクロデキストリン誘導体 であり、ここでアンヒドログルコース単位の異なる位置のヒドロキシル基におけ るアルキル化の平均の程度は３の位置について約Ｏ％〜２０％、２の位！につい て２％〜７０％、そして６の位置について約５％〜９０％である。好ましくは、 非置換のβ−またはγ−シクロデキストリンの量は合計のシクロデキストリン含 量の５％より少なく、とくに１．５％より少ない。

本発明において使用する最も好ましいシクロデキストリン誘導体は、ヒドロキシ プロピル、ヒドロキシエチル、とくに２−ヒドロキシプロピルおよび／または２ −（１−ヒドロキシプロピル）置換基を有する、部分的に置換されたβ−シクロ デキストリンのエーテルまたは混合エーテルである。

本発明において使用する最も好ましいシクロデキストリン誘導体は、０．３５〜 領　５０の範囲のＭ、Ｓ、を有しかつ１．５％より少ない非置換β−シクロデキ ストリンを含有するヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである。

置換シクロデキストリンは、米国特許第３．４５９．７３１号および英国特許出 願第２，１８９，２４５号、それらを調製法について引用によって加える、に記 載されている手順に従い調製することができる。一般に、非置換シクロデキスト リンをエポキシドと、好ましくは高圧力下にかつ高温において、アルカリ性触媒 の存在下に反応させる。

本発明による組成物において使用するシクロデキストリンを記載しそしてシクロ デキストリンの調製、精製および分析のためのガイドを提供する他の参考文献は 、次のものを包含する・　「シクロデキストリンの技術（Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒ ｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）Ｊ、ジョセフ・スゼジトリ（Ｊ６ｚｓｅｆ　５ｚ ｅｊｔｌｉ）ＩＩ、クルワー・アカデミツク・パブリッシャーズ（Ｋｌｗｅｒ　 Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）（１９８８）　、章、製剤における シクロデキストリン（Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｓ　ｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕ ｔｉｃａｌｓ）：「シクロデキストリンの化学（Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｊｎ　Ｃ ｈｅｍｉｓ　ｔ　ｒｙ）　Ｊ　Ｍ、Ｌ、ベンダー（Ｂｅｎｄｅｒ）ら、スブリン ガーーフェルラーグ、ベルリン（１９７８）；　ｒ炭水化物の化学における進歩 （Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） Ｊ、Ｖｏｌ、１２、Ｍ、　Ｌ、ウォルフロム（Ｗｏ　ｌ　ｆ　ｒ　ｏｍ）編、ア カデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（１５７ ）　、章、シャーディンガーデキストリン（Ｓｃｈａｒｄｉｎｇｅｒ　Ｄｅｘｔ ｒｉｎｓ）、デキスター・フレンチ（ＤｅｘｔｅｒＦｒｅｎｃｈ）　、Ｉ）、１ ８９−２６０　：　ｒシクロデキストリンおよびそれらの包接錯体（Ｃｙｃｌｏ ｄｅｘｔｒｉｎｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒＩｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｃｏｍｐｌｅｘｅ ｓ）Ｊ、Ｊ、　スゼジトリ　（Ｓｚｅｊｔｌｉ）編、アカデミアイ・キアド（Ａ ｋａｄｅｍｉａｉ　ＫｉａｄＯ）、ブタペスト、ハンガリー（１９８２）；　Ｌ 　タブシ（Ｔａｂｕｓｈｊ）　、Ａｃｅ、Ｃｈｅｍ、Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１９８ ２．１５、ｐ。

６６−７２；Ｗ、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）、アンゲバンテ・ヘミ−（Ａｎｇｅ ｗａｎｄｔｅ　Ｃｈｅｍｉｅ）　、９２、ｐ、３４３−３６１（１９８１）；Ａ 、Ｐ　クロット（Ｃｒｏｆｔ）およびＲ，Ａ、バートシ（Ｂａｒｔｓｃｈ）、テ トラヘドロン（Ｔｅｔ　ｒａｈｅｄｒｏｎ）、３９、ｐ、１４１７−１４７４　 （１９８３）：イリエ（Ｉｒｉｅ）　ら、ファーマンユティカル・リサーチ（Ｐ ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　、５．７１３−７１６　（ １９８８）；ビタ（Ｐｉｔｈａ）ら、ジャーナル・オフ・ファーマンユティカル （Ｊ、Ｐｈａｒｍ、）呈旦、７３、（１９８６）；ドイツ国公開明細書ＤＥ３１ １８２１８号；ドイツ国公開明細書ＤＥ３３１７０６４号；欧州特許出願（ＥＰ −Ａ）第９４．１５７号；欧州特許出願（ＥＰ−Ａ）第１４９，１９７号；米国 特許第４．６５９．６９６号：および米国特許第４，３８３，９９２号。未反応 のシクロデキストリンが合計のシクロデキストリン含量の５％より小さいシクロ デキストリン混合物を提供する調製および精製方法を記載している参考文献に、 とくに注意を払うべきである。

水溶液中のエリスロポイエチンの安定性は、β−またはγ−シクロデキストリン のレベルが相または最大のレベルとなるまで、その濃度とともに増加する。最終 の組成物において、シクロデキストリンは約２．５〜２０重量％、とくに約５〜 ２０重量％、よりとくに５〜１５重量％、例えば、約１０％を構成し、残部は水 、活性成分および賦形剤である。

とくに、安定な製剤学的組成物は、水、シクロデキストリンおよびエリスロボイ エチンのみから成ることができ、追加の安定剤、例えば、ヒト血清アルブミン、 ウシ血清アルブミン、レクチン、メチルセルロース、ポリエチレングリコール、 硫黄含有還元剤、尿素、アミノ酸および界面活性剤を必要としない。ｐＨ調節剤 、例えば、塩酸、酢酸、クエン酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはこ れらの任意の塩、と（にクエン酸ナトリウムを添加することができる。エリスロ ポイエチンを配合するために適当なｐＨは、６．５〜７，４、とくに６．８〜７ ．　０の範囲である。

注射可能な調製物のために、等張化剤、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム 、ソルビトールの添加は適当である。

微量の重金属イオンはエリスロポイエチンの劣化を触媒するので、適当な錯化剤 、例えば、塩化カルシウム、クエン酸塩、ＥＤＴＡなどの製剤学的に許容されつ る金属イオンの錯化剤を添加することはさらに適当である。例えば、塩化カルシ ウムを約０．０２〜２ｇ／Ｉの濃度で添加することができる。

本発明による組成物は低い毒性を有し、そして刺激性でなく、こうして免疫原性 反応の危険なしに反復した投与の養生法において使用できる注入可能な薬物の調 製を可能とする。好ましい調製物はすぐに使用でき、そして好ましくは皮下にま たは鼻の噴霧剤または点眼剤として投与される。これらの調製物は容易にかつ簡 単な方法で適用することができ、したがって自己投与することができ、これはｇ Ｊ！庭における治療学を可能とする。

さらに、本発明に従い調製された薬物はエリスロポイエチンの好適な薬力学的プ ロフィルを得ること可能とし、少なくとも１日の間に相対的一定の血漿を与え、 それゆえ、ことに皮下に、または鼻の噴霧剤または点眼剤として投与したとき、 すぐれた生理学的応答を提供する。

調製物に適当な防腐剤の添加は、非経口的、ことに局所的（例えば、鼻または眼 の）投与のために安全な多投与配合物の調製を可能とし、このような防腐剤の例 は次の通りである；アルコール、例えば、エタノール、１．３−プロパンジオー ル、ベンジルアルコールまたはそれらの誘導体、フェニルエチルアルコール、フ ェノールまたはフェノール誘導体、例えば、ブチルパラベン、メチルパラベン、 ｍ−クレゾールまたはクロロクレゾール：酸、例えば、安息香酸、ソルビン酸、 クエン酸、プロピオン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ２ナトリウム；り口ルへキシジン ：ヘキサミジンジセチオネート；ヘキセチジン：必要に応じて重亜硫酸ナトリウ ム、またはプロピレングリコールと組み合わせる、好ましさに劣るが第４アンモ ニウム塩、金属化合物、例えば、酸化亜鉛、チオメルサルおよびフェニル水銀塩 、例えば、フェニル水銀アセテートと組み合わせる。

前記多投与の配合物中の防腐剤は、明らかなように、投与のルートと適合するよ うに選択選択される。このような多投与の配合物は、既知の単一投与の配合物を 越えた、経済的かつ実際的な利点を構成する。

本発明の調製物中の製剤学的に活性剤の濃度は、もちろん、選択したエリスロポ イエチンの型、その源、その効能、皮下／静脈内注射によりそのバイオアベイラ ビリティの比較、および配合物の所望の単一投与と組み合わせた投与の所望の類 ｆｆ１＝依存するであろう。好ましくは、本発明の調製物中のエリスロポイエチ ンの濃度は、約１００〜５０，０００国際単位（１，Ｕ、　）　／ｍｌ、と（に 約５００〜２０．０ＯＯ１，Ｕ。

／ｍｌ、よりとくに約２．０００−１０．０００１．Ｕ、　、ことに約４゜００ ０１、Ｕ、である（１１．Ｕ、は８．４ｎｇの組み換えエリスロポイエチンに相 当する）。一般に、有効量は、ことにエリスロボイエチンを皮下投与するとき、 １〜２００１．Ｕ、／ｋｇ体重、より好ましくは２〜１００１．Ｕ、／ｋｇ体重 であろうことが考えられる。さらに、有効量は処置する被検体の種および大きさ 、特定の状態およびそのひどさおよび投与のルートに依存するであろう。いずれ の場合においても、使用すべき投与量は宿主に対して無毒であるべきである。連 続的外来腹膜透析（ＣＡＰＤ）の患者の処置における皮下投与の養生法として、 エリスロポイエチンの投与量は１０〜１２ｇ／ｄｌにヘモグロビンレベルを上げ かつそれを維持するような量であるべきである。

前述のエリスロポイエチン配合物は、精製したエリスロボイエチンをシクロデキ ストリンの水溶液に添加し、そして生ずる溶液をよく混合することによって便利 に調製することができる。さらに、製剤学的成分を、必要に応じて、精製したエ リスロポイエチンの添加の前、間または後に添加することができる。前記調製は 有利には低い温度で、とくに１０℃以下、表現２℃〜８℃の温度において実施す る。

本発明のエリスロボイエチン調製物の調製法の１つの例は、緩衝系、ｐＨ調節剤 、等張化剤などからなるシクロデキストリンの水溶液の中にエリスロポイエチン を溶解または懸濁することからなる。最終組成物において、シクロデキストリン ：エリスロポイエチンのモル比は約５００゜０００　＋　１〜５．０００：１の 範囲であることができる。最終組成物において、約２００，０００：１〜約２０ ．０００：１、とくに約１８０゜０００　：　１〜約３０，０００〜１、よりと くに約１３５，０００：１〜約９０，０００〜１または約８５．０００：１〜約 ６０，０００＋１のヒドロキシプロピル−β−ンシクデキストリン：エリスロポ イエチンのモル比はことに好ましい。本発明の組成物におけるシクロデキストリ ン：エリスロポイエチンの重量／重量比は、約７．５００：１〜約７００．１、 とくに約６，０００・１〜約１．０００：１、よりとくに約４゜５００〜１〜約 ３．０００・１または約２，８００〜約２．０００：１の範囲である。

本発明による水性調製物、および必要に応じて賦形剤は、また、既知の手順に従 い凍結乾燥または噴霧乾燥して、脱水組成物を調製し、これを長期間貯蔵し、そ して投与前に溶解することができる。前記凍結乾燥または噴霧乾燥した配合物に おいて、シクロデキストリン／エリスロポイエチンのモル比および重量／重量比 は前述の水溶液におけるのと同一である。水性シクロデキストリン溶液中で前記 凍結乾燥または噴霧乾燥した配合物を再構成することはある数の場合において便 利であるので、シクロデキストリン／エリスロポイエチンのモル比および重量／ 重量比は、また、前述の水溶液におけるより低（あることができる。このような 凍結乾燥または噴霧乾燥した配合物において、ヒドロキシプロピル−β−シシク デキストリン／エリスロポイエチンのモル比は約２５０．　０００＝１〜約２， ０００：１、ことに約１００．０ＯＣ１１〜約５，０００：１．とくに約５０， ０００：１〜約１０，０００：１の範囲であることができる。

本発明による組成物はいくつかの驚くべき特徴を有する。こうして、シクロデキ ストリンが他の化合物と包接化合物を形成し、これによりこれらの他の化合物の 安定性を増加することがアリール知られているが、包接化合物の形成は疎水性キ ャビティが少な（とも一部分問題の化合物を収容できる場合に主として限定され てきている。また、巨大分子、例えば、エリスロポイエチンがシクロデキストリ ンと錯化しかつシクロデキストリンで有効に安定化されつるという本発明の発見 は予期せざることである。

β−シクロデキストリンおよびγ−シクロデキストリンは容器の壁の表面のエリ スロポイエチンの吸着を防止することができるが、ヒドロキシアルキル化γ−７ クロデキストリン、とくにヒドロキシアルキル化β−シクロデキストリンは糖タ ンパク質のポリペプチドおよび炭水化物の両者の実質的な変更の防止により適当 であり、そしてそれ自体糖タンパク質の長期間の機能的安定性を増加する。

本発明による液体調製物は、非経口的、例えば、皮下投与または局所的投与、例 えば、鼻または眼の投与に適合した任意の投与量小出し装置において使用するこ とができる。この装置は、投与のルートとともにその構成要素の最適な計量の精 度および適合性を確認して構成すべきである。

本発明の他の面において、エリスロボイエチンを有効量のシクロデキストリン誘 導体と配合することによって、同時にエリスロボイエチンを水溶液中で安定化し かつそれが表面へ吸着するのを防止する方法が提供される。本発明の方法に使用 するシクロデキストリン誘導体の性質および量は、とくに前述のエリスロポイエ チンーシクロデキストリン組成物において記載したものである。

本発明のなお他の面において、貧血に悩む哺乳動物に有効エリスロポイエチン量 の本発明の組成物を局所的に投与することによって、前記哺乳動物を処置する方 法が提供される。とくに、前記方法は本発明の水性エリスロポイエチンーシクロ デキストリン組成物を鼻に鼻の噴霧剤としてまたは眼に点眼剤として投与するこ とからなる。

本発明を実施するそれ以上の詳細は次の実施例に記載されている。これらの実施 例は本発明を限定しない。

ａ）エリスロポイエチン４０００１．Ｕ、／ｍｌヒト組み換えエリスロポイエチ ン（ｒ−ＨｕＥＰＯ）　４０００Ｕ塩化ナトリウム　３．５９ｍｇ クエン酸ナトリウム２Ｈ２０５，８ｍｇクエン酸ｌＨ２Ｏ６２μｇ ヒドロキシプロピルーβ−シクロデキストリン　１００ｍｇ（ＭＳ＝０．４） 塩酸（ＩＮ）または　ｐＨ６，９とする量水酸化ナトリウム（ＩＮ） 水　１ｍｌとする量 調製方法 １８リツトルの冷いビオゲン不含水を濾過により滅菌した。それに撹拌しながら ２ｋｇのヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（Ｍ。

Ｓ、＝０．４）　、１１６ｇのクエン酸ナトリウム２Ｈ２０，１，２４ｇのクエ ン酸ｌＨ２Ｏおよび７１．８ｇのクエン酸ナトリウムを添加した。

この溶液を２５℃に冷却し、そしてｐＨをＮａＯＨ（ＩＮ）またはＨＣｌ　（Ｉ Ｎ）の添加によりｐＨ６，９に調節した。この溶液を均質になるまで撹拌しそし て２℃〜８℃に冷却した。

−７０℃〜−８０℃において貯蔵した５００ｍ１の精製したｒ−ＨｕＥＰＯ（１ ６０，０００／ｍ＋）を、２０℃の水浴ノ中ニ沈メルコトニよって液化した。融 解した溶液をクエン酸緩衝溶液に添加し、そして８℃以下の温度において５分間 撹拌する。この溶液を冷いピオゲン不含水で２０リツトルの最終体積に希釈し、 そして無菌の窒素雰囲気下に濾過により滅菌した。最終溶液を無菌の１ｍｌの容 器に充填した。

７　適当な量の成分を使用して、要求される組成の最終溶液を形成することによ って、次の配合物を同様に調製した。

ｂ）エリスロポイエチン２０００１．　Ｕ、　／ｍｌヒトヒト換えエリスロポイ エチン（ｒ−ＨｕＥＰＯ）　２０００Ｕ塩化ナトリウム　３．８４ｍｇ クエン酸ナトリウム２Ｈ２０５，８ｍｇクエン酸Ｉ　Ｈ２Ｏ６２／、ｔｇ ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン　５０ｍｇ（ＭＳ＝０．４） 塩酸（ＩＮ）または　ｐＨ６，９とする量水酸化ナトリウム（ＩＮ） 水　１ｍｇとする量 Ｃ）エリスロポイエチン１０．０００１．Ｕ、／ｍｌヒトヒト換えエリスロポイ エチン（ｒ−ＨｕＥＰＯ）　１０．０ＯＯＵクエン酸ナトリウム２Ｈ２０５，８ ｍｇクエン酸ＩＨ，０６２μｇ ヒドロキシプロピルーβ−シクロデキストリン　２００ｍｇ（ＭＳ＝０．４） 塩酸（ＩＮ）または　ｐＨ６，９とする量水酸化ナトリウム（ＩＮ） 水　１ｍｇとする量 実施例２：点眼剤 ヒト組み換えエリスロボイエチン（ｒ−ＨｕＥＰＯ）　４０００Ｕ塩化ナトリウ ム　３．５９ｍｇ クエン酸ナトリウム２Ｈ２０５，８ｍｇクエン酸ＩＨｚ０　６２μｇ ヒドロキシプロピルーβ−シクロデキストリン　１００ｍｇ（ＭＳ＝領４） 塩酸（ＩＮ）または　ｐＨ６，９とする量水酸化ナトリウム（１Ｎ） 水　１ｍｇとする量 実施例３：点眼剤 ヒト組み換えエリスロポイエチン（ｒ−ＨｕＥＰＯ）　４．０００Ｕ塩化ナトリ ウム　３．５９ｍｇ クエン酸ナトリウム２Ｈ２０５，８ｍｇクエン酸ｌＨ２Ｏ６２１１ｇ チオメサル　０．　２ｍｇ ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン　１００ｍｇ（ＭＳ＝０．４） 塩酸（ＩＮ）または　ｐＨ６，９とする量水酸化ナトリウム（１Ｎ） 水　１ｍｇとする量 Ｂ、生物学的実施例 実施例４・ＥＰＯへの種々のシクロデキストリンの安定化作用イオン交換クロマ トグラフィーおよびポリアクリルアミドゲルの電気泳動の組み合わせを使用して 、ユリスロボイエチンと異なる安定剤との構造的一体性を研究した。異なるシク ロデキストリン誘導体の安定化作用をヒトアルブミンと比較した。本発明に従い 使用したＥＰＯ（エリスロボイエチン）溶液を次のようにして調製した：　１ｍ ｇのＥＰＯ［アムゲン（Ａｍｇｅｎ）　コを２６ｍｇのクエン酸緩衝液（クエン 酸ナトリウム２Ｈ２０：　５．　８０　ｇ、クエン酸Ｈ２０：０．０６２３ｇお よび塩化ナトリウム・５．８４ｇを１００ｍ１の水中に溶解し、そして逆浸透お よび限外濾過により精製した。この緩衝液を０．２２μｍのフィルターにを通し て濾過した）の中に希釈した。ＥＰＯのこの源溶液を上に定義したクエン酸中の ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＭＳ＝０．　４）またはヒドロ キシプロピル−γ−シクロデキストリン（ＭＳ＝０．　４．）の溶液の中に希釈 した。シクロデキストリンの生ずる最終濃度は５および２０％であり、最終ＥＰ Ｏ濃度は３３μｇ／ｍｌであり、４０００　Ｕ／ｍ　Ｉのに等しかった。安定剤 としてヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）との比較のために、シラグ（Ｃｉｌａｇ） （ｏブトＮｏ、８８ＺＯＯ８）から入手した容易に配合されたＥＰＯを使用した 。この材料の組成は次の通りであった：クエン酸ナトリウム２Ｈ２０：　５．８ ｍｇ。

クエン酸・０．０５７ｍｇ、塩化ナトリウム：５，８４ｍｇ、ヒトアルブミン： ２．５ｍｇおよび０．０３３６ｍｇのエリスロポイエチン／１ｍ１の水。対照溶 液は１ｍｇの水中の０．０３３６ｍｇのエリスロポイエチンから成る。異なる溶 液を温度制御した水浴中のガラス容器の中に５７℃において保持した。インキュ ベーション前に精製したＥＰＯのピーク高さを５７℃において１０日および３週 後のピーク高さと比較することによって、ＥＰＯへのシクロデキストリンの安定 化作用をイオン交換クロマトグラフィーにより研究した。

使用したクロマトグラフィーの方法は、次の通りであった：計器　：ＦＰＬＣ［ ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、スウェーデン国つップサラ］ 検出系　：ＵＶ吸収、２８０ｎｍ カラム　：モノ（Ｍｏｎｏ）Ｑ　［ファーマシア（Ｐｈ　ａ　ｒｍａ　ｃ　ｉ　 ａ）、スウェ　−デン国つップサラ］ ５００ｕｌのＥＰＯ含有分画をモノＱカラム（０，５ＫＣ１５ｃｍ）に室温にお いて適用した。緩衝液Ａは２０ミリモルのトリス（ｐＨ８゜０）であり：緩衝液 Ｂは１モルのＮ　ａ、　ＣＩを含有する２０ミリモルのトリス（ｐＨ８，０）で あった。流速は１ｍ１／分であった。段階の塩勾配を使用した。ＥＰＯは約１６ 分後に溶離された（対応するＮａＣ１濃度は１６ミリモルであった）。

この技術は、電気泳動により評伍して、ＥＰＯと血清アルブミンまたはシクロデ キストリンとの完全な分離を示した。ＥＰＯ分画のピーク高さを測定した。１６ ミリモルのＮａＣ１において溶離されたタンパク質分画の純度および均質性は、 ポリアクリルアミドゲルの電気泳動によりコントロールされた。この電気泳動は 次のようにして実施した。

ＥＰＯを含有する分画のアリコートを、試料緩衝液（０，１６７モルのトリス、 ３３％のグリセロール、３．３％のドデシル硫酸ナトリウム、４％のジチオスレ イトール：０．００５％のブロモフェノールブルーｐＨ６，８）と混合すること によって還元し、そして１００℃において５分間インキュベーションした。１５ μｍの試料を１０％のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルのレーン に適用した。電気泳動は、ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌ　ｉ）　、Ｕ、（１９７０） ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２２７．６８０−６８５に記載されている方法に従 い１５０Ｖで９０分間、電気泳動緩衝液（０，３８モルのグリシン／トリスｐＨ ８゜３．０．　１％ｎｏドデシル硫酸ナトリウム）を使用して実施した。次いで 、ゲルをモリッセイ（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ）Ｊ、Ｈ，（１９８１）アナリティカ ル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、１１７．３０７−３ １０に記載されている方法を使用して銀染色した。

電気泳動の実験は、安定剤としてシクロデキストリン誘導体を使用したとき、Ｅ ＰＯ分画が均質性であることを明瞭に示した。安定剤としてヒトアルブミンを使 用したＥＰＯ分画はより高い分子量をもつタンパク質の存在を示し、そしてＥＰ Ｏの百分率は存在する劣化生成物と比較して低かった。

劣化生成物はアルブミンから由来可能性が最も強かった。これは、安定剤として ヒトアルブミンを使用したＥＰＯ分画のピーク高さが開始より３週後により高い 理由を説明することができる。これは、また、イオン交換クロマトグラフィー技 術を電気泳動技術と組み合わせて使用してＥＰＯの安定化を評価しなくてはなら ないことを意味する。

表１に実験結果を要約する。

表１ （＊）ＥＰＯ含量の電気泳動評価に基づく補正前後のヒト血清アルブミンを含有 する配合物のＥＰＯピーク高さ。

実施例５・ＥＰＯへの種々のシクロデキストリン濃度の安定化作用第２実験にお いて、異なるヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン濃度の安定化作用を 同一の方法を使用して研究した。電気泳動の結果は、安定剤としてヒドロキシプ ロピル−β−シクロデキストリンを使用したとき、１６ミリモルのＮａＣ１にお いて溶離される分画は純粋なＥＰＯから成ることを示し、劣化生成物は実証され なかった。安定剤としてヒト血清アルブミンを使用するＥＰＯ分画は、再び、よ り高い分子量の劣化生成物の存在を示した。結果を表２に要約する。

表２ （＊）ＥＰＯ含量の電気泳動評価に基づく補正前後のヒト血清アルブミンを含有 する配合物のＥＰＯビーク高さ。

これらの実験を要約するために、シクロデキストリン誘導体はＥＰＯを劣化から 保護するとわれわれは結論することができる。シクロデキストリンを使用して得 られる保護は、少な（とも使用した実験条件において、ヒト血清アルブミンを使 用して得られた保護よりすぐれる。

実施例６　シクロデキストリンの存在下にプラスチック材料上のＥＰＯの吸着 この研究において使用したＥＰＯ溶液は次のようにして調製した。

１ｍｇのＥＰＯ（アムゲン）を２６ｍ１のクエン酸緩衝液（クエン酸ナトリウム ２ＨｚＯ：　５．　８０　ｇ−クエン酸Ｈ２０：０．０６２３ｇおよび塩化ナト リウム：５．８４ｇを１００ｍ１の水中に溶解し、そして逆浸透および限外濾過 により精製した。この緩衝液を０．２２μｍのフィルターにを通して濾過した） の中に希釈した。ＥＰＯのこの原溶液を上に定義したクエン酸中のヒドロキシプ ロピル−β−シクロデキストリンの溶液の中に希釈した。シクロデキストリンの 生ずる最終濃度は１０または２０％であった。最終ＥＰＯ濃度は３３μｇ／ｍｌ であった。担体としてヒトアルブミンを使用した場合、ＥＰ○シラグ（Ｃｉｌａ ｇ）（ロフトＮｏ、８９１２１／４４３を参照として使用した。

１ｍｌの種々のＥＰＯ溶液を注入セット［トラベノール（Ｔｒａｖｅｎｏ　ｌ） からのユニバーサル（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）セット３１５ＣＯ３３９〕の中に注 入し、そして４℃において一夜放置した。回収後、前述のクロマトグラフィーお よび電気泳動のプロトコルを実施した。１６ミリモルのＮａＣｌにおいて溶離さ れるタンパク質分画を測定した。

表３は結果を要約する。数値は２つの異なる実験から得られた。

すべての試験したすべての試料について、電気泳動の結果は１６ミリモルのＮａ Ｃ１において溶離された分画が純粋なＥＰＯから成ることを示し、劣化生成物を 実証することができなかった。

これらの実験から、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンは、ヒト血清 アルブミンと同様によく、注入セットにおいて使用したプラスチック材料上への ＥＰＯの吸着を防止すると、われわれは結論することができる。

実施例７・エリスロポイエチンのマウスのバイオアッセイ外低酸素の（ｅｘｈｙ ｐｏｘ　ｉ　ｃ）赤血球増加症のマウスのノくイオア・ソセイを使用して、ｒ− ＨｕＥＰＯの生物学的活性を評価する。このアッセイにおいて、マウスを減大気 圧（はぼ０．　４気圧）下に２週間順化させて、自然の生理学的エリスロポイエ チンの産生に応答して赤血球の形成を誘発する。マウスが正常の大気条件に戻る とき、増加した循環赤血球の高い酸素運搬能力はそれ以上のエリスロボイエチン の産生を抑制する。これらの条件下に、動物は赤血球形成のそれ以上の誘発で外 因的に適用されたエリスロボイエチンに対して投与量依存的方法で応答するであ ろう。新しい赤血球の産生を放射性鉄（５９Ｆｅ）の吸収の測定により定量する 。試料のｒ−ＨｕＥＰＯ（ヒト組み換えエリスロボイエチン）試験シクロデキス トリン調製物を使用して得られた投与量一応答曲線を、ｒ−ＨｕＥＰＯの標準と 比較して、試料の活性を決定する。

実施例８．比較研究 健康ボラティアにおいてヒト血清アルブミンを使用する配合物と比較してヒドロ キシプロピル−β−７クロデキストリン配合物中のエリスロポイエチンの皮下投 与後のエリスロポイエチンの生物学的活性を、次の研究において評価した。

年令３０〜４０（メディアン３２）才、体重６９〜８０（メディアン７５）ｋｇ の６人の健康な男性のボラティアに、ランダム化クロスオーバーの設計に従い１ ｍｌのＥＰＯ溶液（４０００１，Ｕ、／ｍｌ）を上腕に皮下投与した。２つの試 験の間に４週の間隔を存在させた。ＥＰＯの２つの配合物は次の通りであった： Ａ：　４０００１．Ｕ、／ｍｌの市販されている溶液［ＥｏｒｅｘＲ。

シラグ（Ｃｉｌａｇ）；ロットＮｏ、８９１２８／３８５）ｒ−ＨｕＥＰＯ４０ ００１，Ｕ。

ヒト血清アルブミン　２．　５ｍｇ 塩化ナトリウム　５．８４ｍｇ クエン酸ナトリウム２Ｈ２０５，８ｍｇクエン酸　０．０５７ｍｇ 注射用の水　１ｍｌとする量 Ｂ：１０％のヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを含有する４０００ １．　Ｕ、　／ｍＨ７）溶液ｒ−ＨｕＥＰ○　４０００１．Ｕ。

塩化ナトリウム　３．５９ｍｇ クエン酸ナトリウム２Ｈ，０５，８ｍｇクエン酸　０．０５７ｍｇ ヒドロキシプロピル−β−シクロ　１００ｍｇデキストリン（Ｍ、Ｓ、　＝０． 　４）注射用の水　１ｍｌとする量 ＥＰＯの決定のための種々の血液試料（４ｍｌ）を投与直前および投与後２．４ ．６．８．１０．１２．２４．３２．４８．５６．７２および９６時間に取り、 そして室温において凝固させた。最初の１２時間の間に、試料を反対の腕から取 った。分離した血清をア・ソセイまで一２０℃において貯蔵した。

ＥＰＯの血漿濃度は、リニゲン・エリスロポイエチン（Ｃｌｉｎｉｇｅｎ　Ｅｒ ｙｔｈｏｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）ＥＩＡキット、９６試験（Ｎｏ、ＡＢＣＯ６０９ ６）　、ユーザーのマニュアルに概説されている手順に従い、投与後９６時間ま で５ｍＵ／ｍ＋の検出限界で酵素イムノアッセイ（Ｅ　Ｉ　Ａ）により測定した 。

次のＥＰＯの薬力学的パラメーターを決定した。

−ビーク血漿濃度（Ｃ，、、：ｍＵ／ｍＩ）−ビーク血漿濃度への時間（Ｔ、ワ ！二時間）−血漿濃度の下の面積一時間の曲線（ＡＵＣｏ−Ｈｂ：ｍＵ・時間／ ｍ１） −市販されている配合物と比較したヒドロキシプロピル−β−ジシクロデキスト リン配合物の相対的生物学的活性、すなわち、ＡＵＣｏ−ｏａｂ比Ｘ１００（Ｆ 、、ｌ：％）２つの配合物の間の上のパラメーターの差は統計学的意味をもたな かった。

Ｓ、Ｃ，投与後のＥＰＯの生物学的活性の比較エリスロポイエチンは市販されて いる配合物（Ｅｐｒｅｘ”）および新しく開発されたヒドロキシプロピル−β− シクロデキストリン配合物の両者の皮下投与後にゆっくり吸収された。両者の配 合物の投与後約１０〜２４時間で、３０ｍＵ／ｍ１程度のピークに近い血漿レベ ルが観測された。ヒドロキシプロピル−β−ンシクデキストリン配合物／市販さ れている配合物の相対的生物学的活性は９６％であった。両者の配合物は吸収の 速度および程度において生物学的に同等であると、結論することができる。

注射部位における刺激を各投与後２．４および２４時間に記録した。

水腫、紅斑、かゆみまたは痛みは研究全期間の間のいずれの時にもボランティア から報告されなかった。したがって、両者の配合物は等しくよく許容される。

血液学および生化学において、臨床的に重要な変化は観測されなかった。ＥＰＯ の皮下投与は血圧または心拍数に影響を及ぼさなかった。

要　約　書 本発明は、エリスロボイエチンおよびβ−またはγ−シクロデキストリンヒドロ キンアルキル誘導体の水溶液からなる非経口的および局所的投与のための新規な 製剤学的組成物に関する。本発明は、また、β−またはγ−シクロデキストリン ヒドロキシアルキル誘導体からなる新規な凍結乾燥または噴霧乾燥したエリスロ ボイエチン組成物、このような水性、凍結乾燥または噴霧乾燥した組成物を調製 する方法、および同時にエリスロポイエチンを水溶液中で安定化しかつそれが表 面に吸着するのを防止する方法に関する。

国際調査報告 １ＡＩｎ”ｍ＠＋ｖｌＡｓｌ’＜ｍ”ｍＰＣＴ／ＥＰ９１１ＯＯＬ７３悄 Ｉｎｌ＃情・１ｍ＋ＩｌＡ軸−ぽ１６内角−（りＰＣτ／ＥＰ９１１００１７３ 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、β−または７−シクロデキストリンのアンヒドログルコース単位のヒドロキ シ部分の１または２以上が、式−Ｏ−［ＡＩｋ−Ｏ−］ｎ−Ｈ（Ｉ） 式中、 ＡＩｋは直鎖状もしくは分枝鎖状のＣ１−Ｃ６アルカンジイル基であり、ここで 前記基Ａｌｋの１つの水素原子はヒドロキシ基で置換されていてもよく、そして ｎは１〜５の範囲である、 の基で置換されている、エリスロポイエチンおよびβ−またはγ−シクロデキス トリンの水溶液からなる製剤学的組成物。 ２、シクロデキストリンがβ−またはγ−シクロデキストリンのエーテルまたは 混合エーテルであり、ここで１または２以上のシクロデキストリンのヒドロキシ 基の水素はヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピルまたはヒドロキシイソブチル 基により置換されている請求の範囲第１項記載の組成物。 ３、平均モル置換度（Ｍ．Ｓ．）が０．３〜０．８の範囲内である請求の範囲第 １項記載の組成物。 ４、シクロデキストリン／エリスロポイエチンの重量／重量比が７５００：１〜 ７００：１である請求の範囲第１項記載の組成物。 ５、シクロデキストリンの濃度が２．５〜２０重量％の範囲内であり、残部が水 、エリスロポイエチンおよび賦形剤である請求の範囲第１〜４項のいずれかに記 載の組成物。 ６、等張化剤をさらに含む請求の範囲第５項記載の注射可能な組成物。 ７、防腐剤さらに含む請求の範囲第５または６項記載の多投与組成物。 ８、鼻の噴霧剤として配合された請求の範囲第７項記載の多投与組成物。 ９、点眼剤として配合された請求の範囲第７項記載の多投与組成物。 １０、エリスロポイエチンをシクロデキストリンの水溶液と緊密に混合し、必要 に応じて前記混合の前、間または後に製剤学的に許容されうる成分を添加するこ とを特徴とする請求の範囲第１〜９項のいずれかに記載の組成物の調製方法。 １１、エリスロポイエチンを、緩衝液系、ｐＨ調節剤および等張化剤からなるシ クロデキストリンの水溶液の中に溶解し、次いでこうして得られる溶液を必要に 応じて凍結乾燥または噴霧乾燥することを特徴とする請求の範囲第１〜９項のい ずれかに記載の組成物の調製方法。 １２、エリスロポイエチンを有効量のβ−またはγ−シクロデキストリンと配合 することからなり、ここで前記シクロデキストリンのアンヒドログルコース単位 のヒドロキシ部分の１または２以上は、式−Ｏ−［Ａｌｋ−Ｏ−］ｎ−Ｈ（Ｉ） 式中、 Ａｌｋは直鎖状もしくは分枝鎖状のＣ１−Ｃ６アルカンジイル基であり、ここで 前記基ＡＩｋの１つの水素原子はヒドロキシ基で置換されていてもよく、そして ｎは１〜５の範囲である、 の基で置換されていることを特徴とする、同時にエリスロポイエチンを水溶液中 で安定化しかつそれが表面に吸着するのを防止する方法。 １３、シクロデキストリンがβ−またはγ−シクロデキストリンのエーテルまた は混合エーテルであり、ここで１または２以上のシクロデキストリンのヒドロキ シ基の水素はヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピルまたはヒドロキシイソブチ ル基により置換されている請求の範囲第１２項記載の方法。 １４、平均モル置換度（Ｍ．Ｓ．）が０．３〜０．８の範囲内である請求の範囲 第１２項記載の方法。 １５、シクロデキストリン／エリスロポイエチンの重量／重量比が７５００：１ 〜７００：１である、請求の範囲第１２項記載の方法。 １６、貧血に悩む哺乳動物に有効エリスロポイエチン量の請求の範囲第１〜９項 のいずれかに記載の組成物を局所的に投与することによって、前記哺乳動物を処 置する方法。