JPWO2003006052A1 - 徐放性注射剤用組成物およびその製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、生理活性蛋白質を生体内分解性高分子物質に封入させた徐放性注射剤用組成物およびその製造方法に関する。さらに詳しくは、生体内分解性高分子物質のマトリックス中に、生理活性蛋白質と糖類とからなる粒子径10μm以下の粒子が90%以上を占める噴霧乾燥微粉末が、均一に分散された生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物に関する。
背景技術
生理活性蛋白質のヒトへの投与は、幅広く行われているが、一般的に蛋白質は経口吸収性が低く、生体内での消失も速やかであるために、注射剤として頻回投与されているのが現状である。このような状況下生体内分解性高分子物質中に生理活性蛋白質を封入してマイクロスフェアーとする徐放化技術は、頻回投与の回避および治療効果の増強という観点から強く望まれている。また蛋白質は、熱、溶媒等により変性を受けることから、製造面での取扱いの困難さが指摘され、その回避方法が望まれている。しかし生理活性蛋白質を安定的に、かつ高い封入率でマイクロスフェアー中に封入し、さらに溶出試験開始後初期の急激な生理活性蛋白質の放出(以下初期バーストという)をおこさず、生産性、実施可能性を備えた徐放性マイクロスフェアーの技術は、これまでになかった。
生理活性蛋白質の生理活性を低下させないために、塩化メチレン等の有機溶媒による変性を回避する目的で、水溶性である蛋白質を粉末化して活性を保持しようとする試みが行われている。例えば特開平11−322631号公報には、生理活性ポリペプチド水溶液に水混和性の有機溶媒及び/又はアンモニウム塩等の揮発性の塩類を添加し、凍結乾燥することでポリペプチドを粉末化し、ポリペプチドの製剤中への安定的な封入を達成し、その封入率、徐放性を改善した生理活性ポリペプチドの徐放性製剤が開示されている。さらに特開平11−302156号公報には、ポリペプチドおよびポリエチレングリコールの混合水溶液を凍結乾燥し、ポリペプチドは溶解しえないが、ポリエチレングリコールと生体内分解性高分子物質が溶解する溶媒を用いることで、回収率が高く、変性を伴なわずに高純度のポリペプチド微粒子を調製し、その微粒子をマイクロスフェアー中に封入することが開示されている。これらの技術は、マイクロスフェアー調製の前段階での、ポリペプチドの微粒子化のための凍結乾燥技術に関するもので、噴霧乾燥の技術に関するものではない。
マイクロスフェアー調製の前段階で噴霧乾燥を用いた技術としては、特開平4−36233号公報に開示されたものがある。当該技術は、ポリペプチドとゼラチン等の水溶性高分子との混合水溶液を噴霧乾燥、微小球化し、さらに生体内分解性高分子溶液で被覆することで、薬物の取り込み率を高め、初期バーストを抑制し、長期間の徐放性を達成した方法に関するものである。しかしながら、この方法においては、用いる水溶性高分子に依存して噴霧乾燥時の温度が高温になる場合があり、ポリペプチドの失活を招きかねないことが懸念される。
これまでマイクロスフェアー調製の前段階、その後の調製段階において、生理活性の保持と同時に初期放出制御、生理活性蛋白質の高い封入率、さらには長期にわたる持続的な放出性、生産性、実施可能性すべての点において充分な効果を示す技術は知られておらず、これらすべてを満足させるために更なる改善の余地が残されている。
したがって本発明の目的は、生理活性蛋白質の生理活性を保持した状態で噴霧乾燥により微粉末化し、高い封入率で生体内分解性高分子物質に内包させ、且つその際にも生理活性蛋白質の生理活性を保持し、更には初期放出の抑制と長期にわたる持続的な放出性を達成した生産性の高い、実施可能性を有した生理活性蛋白質含有徐放性注射製剤を提供することにある。
発明の開示
このような状況下、本発明者らは生理活性蛋白質の噴霧乾燥による微粉末化を種々検討したところ、糖類、特にマンニトールまたは2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを担体として用いると生理活性蛋白質の変性をさせることなく、噴霧乾燥が可能であり、良好な粒子径を持つ微粉末が得られること、さらに得られた生理活性蛋白質の微粉末を、生体内分解性高分子物質からなる徐放基剤に油類中で内包させる方法を採用した際には、その生理活性は全く失われず、高い封入率、初期放出の抑制および長期にわたる持続的な薬物放出が達成されることを見出し本発明を完成するに至った。
本発明によれば、糖類を用いることで乾燥温度を高温とすることなく噴霧乾燥が可能となり、熱による生理活性蛋白質の変性や失活を回避し、粒子径を制御した蛋白質微粉末を調製することが極めて容易となる。また、生理活性を保持し、粒子径が充分に制御された蛋白質微粉末を用いることで、マイクロスフェアーに内包の生理活性蛋白質の生理活性を保持し、またマイクロスフェアーへの高い封入率、初期放出の抑制を達成することが可能となる。
すなわち本発明は、
1.生体内分解性高分子物質のマトリックス中に、粒子径10μm以下の粒子が90%以上を占める生理活性蛋白質と糖類とからなる噴霧乾燥微粉末が、均一に分散された生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
2.粒子径6μm以下の噴霧乾燥微粉末の占める割合を、50%以上とした上記1に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
3.糖類がマンニトールおよび/またはシクロデキストリン類である上記2に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
4.シクロデキストリン類が2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである上記3に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
5.生体内分解性高分子物質が乳酸−グリコール酸の共重合体である上記4に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
6.生理活性蛋白質がインターフェロン類である上記5に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
7.インターフェロン類がインターフェロン−α−Con1である上記6に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
8.組成物がマイクロスフェアーである上記7に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
9.マイクロスフェアーの平均粒子径を約20−約250μmとした上記8に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
10.糖類に対する生理活性蛋白質の含有量が、約0.01−約80%(w/w)である上記9に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
11.生体内分解性高分子物質に対する噴霧乾燥微粉末の濃度が約0.01−約20%(w/w)である上記9に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
12.生理活性蛋白質と糖類とを実質的な組成成分とし、かつ粒子径10μm以下の粒子が90%以上を占める噴霧乾燥微粉末を、生体内分解性高分子物質の有機溶媒溶液に分散させた後、該有機溶媒を油類中で除去してなる生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
13.粒子径6μm以下の噴霧乾燥微粉末の占める割合を、50%以上とした上記12に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
14.糖類がマンニトールおよび/またはシクロデキストリン類である上記13に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
15.シクロデキストリン類が2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである上記14に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
16.生体内分解性高分子物質が乳酸−グリコール酸の共重合体である上記15に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
17.生理活性蛋白質がインターフェロン類である上記16記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
18.インターフェロン類がインターフェロン−α−Con1である上記17記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
19.油類がシリコン油、大豆油、ゴマ油、綿実油、鉱物油である上記18に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
20.油類がシリコン油である上記19に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
21.組成物がマイクロスフェアーである上記20に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
22.マイクロスフェアーの平均粒子径を約20−約250μmとした上記21に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
23.糖類に対する生理活性蛋白質の含有量が、約0.01−約80%(w/w)である上記9に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
24.生体内分解性高分子物質に対する噴霧乾燥微粉末の濃度が10%(w/w)以下である上記22に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
25.生理活性蛋白質と糖類とを実質的な組成成分とし、かつ粒子径10μm以下の粒子が90%以上を占める噴霧乾燥微粉末を、生体内分解性高分子物質の有機溶媒溶液に分散させた後、該有機溶媒を油類中で除去してなる生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法、
26.粒子径6μm以下の噴霧乾燥微粉末の占める割合を、50%以上とした上記25に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法、
27.糖類がマンニトールおよび/またはシクロデキストリン類である上記26に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法、
28.シクロデキストリン類が2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである上記27に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法、
29.生体内分解性高分子物質が乳酸−グリコール酸の共重合体である上記28に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法、
30.生理活性蛋白質がインターフェロン類である上記29に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法、
31.インターフェロン類がインターフェロン−α−Con1である上記30記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法、
32.油類がシリコン油、大豆油、ゴマ油、綿実油、鉱物油である上記31に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法、
33.油類がシリコン油である上記32に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法、
34.組成物がマイクロスフェアーである上記33に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法、
35.マイクロスフェアーの平均粒子径を約20−約250μmとした上記34に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法、
36.生体内分解性高分子物質に対する噴霧乾燥微粉末の濃度が10%(w/w)以下である上記35に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物、
37.糖類に対する生理活性蛋白質の含有量が、約0.01−約80%(w/w)である上記9に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法、
に関する。
本発明でいう「マトリックス」とは、生体内分解性高分子の網目構造を示す。また「均一に分散された」とは生体内分解性高分子の網目構造中に生理活性蛋白質と糖類とからなる噴霧乾燥粉末が充分に分散されている状態を意味し、本発明組成物の放出を後述する放出試験法にて測定し、初期バーストを起こさない時、生理活性蛋白質が「均一に分散された」ことを間接的に知ることができる。
また本発明における「噴霧乾燥微粉末の粒子径」測定の意義は、生体内分解性高分子物質への内包が容易となり、初期放出の抑制と高い封入率を達成することが可能になるための粒子径を把握することであり、具体的には粒子径10μm以下のものが90%以上が好ましく、さらには、粒子径6μm以下のものが50%以上であることが好ましい範囲である。このように粒子径の揃った微粉末を用いることで、以降の生体内分解性高分子物質への噴霧乾燥微粉末、すなわち生理活性蛋白質の内包が容易となり、初期放出の抑制と高い封入率を達成することが可能になる。
本発明でいう「マイクロスフェアー」とは、粒子径が数十μmから数百μmの球形粒子を意味し、具体的には約10μmから約300μmの球形粒子を意味し、好ましくは約20μmから約250μmを意味する。
本発明でいう「生理活性蛋白質と糖類とを実質的な組成成分とし」とは、生理活性蛋白質と糖類とを主成分としているが、本発明の効果を損なわない範囲内において、他の賦形剤等の成分を含んでも良いことを意味する。また本発明でいう生理活性蛋白質の「生理活性の保持」とは具体的に、例えば下記に示す生理活性試験法で、生理活性蛋白質の力価を測定するとき、標品に対する試料の力価が約70−約125%、好ましくは約80−約115%であることを意味する。
さらに本発明の生理活性蛋白質を封入した徐放性注射剤用組成物において「初期放出の抑制」および「持続的な放出」とは、下記に示す放出試験法を行うとき、「初期放出の抑制」に関しては試験開始後3時間で約10%以下であることを示し、「持続的な放出」に関しては、「徐放性」をも意味し、具体的には試験開始後1日乃至1ヶ月間程度、薬物の放出が続くことを意味する。
さらにまた本発明でいう生理活性蛋白質の「高い封入率」とは、例えば下記に示す封入率の測定法で測定したとき、約70%以上、好ましくは約75%以上、更に好ましくは約80%以上の封入率を示すことを意味する。
また噴霧乾燥時の乾燥温度の「高温とすることなく」とは、例えばスプレードライヤーを機器として選択した際の送風出口温度の低い温度範囲を意味し、具体的には約0℃から約80℃、好ましくは約10℃から約60℃、更に好ましくは約20℃から約60℃を意味する。
本発明で用いられる生理活性蛋白質としては、医薬活性成分として用いられる蛋白質であれば特に限定されない。かかる医薬活性成分としては、サイトカイン、成長因子、造血因子、ペプチドホルモン、酵素等が挙げられる。
具体的にサイトカインとしては、インターフェロン類(α型、β型、γ型等)、インターロイキン類(IL−1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23等)、腫瘍壊死因子(TNF)等、成長因子としては、骨形成因子(BMP−1、2、3、4等)、神経成長因子(NGF−1、2等)、神経栄養因子(NTF)、上皮細胞成長因子(EGF)、インスリン様成長因子(IGF−1、2、3等)、線維芽細胞増殖因子(aFGF、bFGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、軟骨由来因子(CDF)、トランスフォーミング成長因子(TGF−α、−β等)等が挙げられる。
また造血因子としては、コロニー刺激因子類(G−、M−、GM−CSF等)、トロンボポエチン(TPO)、エリスロポエチン(EPO)、血小板増殖刺激因子等、ペプチドホルモンとしては、成長ホルモン(GH)、成長ホルモン放出因子(GRF)、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、卵胞刺激ホルモン(FSH)、黄体形成ホルモン(LH)、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)、メラノサイト刺激ホルモン(MSH)、インスリン、グルカゴン、プロラクチン、カルシトニン、ナトリウム利尿ペプチド等、酵素としては、組織プラスミノーゲンアクチベータ(tPA)、ウロキナーゼ(UK)、スーパーオキシドディスムターゼ(SOD)、アスパラギナーゼ、カリクレイン、ストレプトキナーゼ、プロテインC、メタロプロテアーゼ類、第VIIIおよびIX因子、プルオキシダーゼ等が挙げられる。
本発明に好ましい生理活性蛋白質としては、インターフェロン類、骨形成因子、成長ホルモンであり、更に好ましくは、インターフェロン類、成長ホルモンであり、最も好ましくはインターフェロン類である。インターフェロン類には天然型、遺伝子組換え型の両者が含まれる。またその中でも遺伝子組換え型のインターフェロン−α−Con1が特に好ましい。これら生理活性蛋白質は、1種または2種以上を組み合わせて用いても良い。また蛋白質ではない薬物、例えば抗ウイルス剤等との組み合わせも可能である。
また本発明における生理活性蛋白質としては、分子量約1,000−200,000のものが用いられ、好ましくは約5,000−70,000のものである。これらの生理活性蛋白質は、天然由来あるいは遺伝子組み換え技術等によって得られた改変体であってもよく、それらの修飾体(例えばポリエチレングリコールなどによる化学修飾体)であってもよい。またこれらは単量体として用いても、ホモまたはヘテロの多量体として用いてもよい。
本発明における糖類としては、環状及び(直鎖及び分岐鎖)の単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、あるいはそれらの誘導体(糖アルコール等も含む)等が挙げられ、その内、糖アルコールまたは環状オリゴ糖が好ましく、更にマンニトールまたはシクロデキストリン類(α型、β型、γ型、2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン等)が好ましく、最も好ましくはマンニトールおよび2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンが挙げられる。またこれらの糖類は1種または2種以上を組み合わせて用いても良い。
本発明における生体内分解性高分子物質とは、生体適合性を有するとともに、生理活性を持たず生体内で分解、消失する高分子を意味し、製薬学的に許容されるものであれば特に制限されない。例えばα−ヒドロキシカルボン酸類(乳酸、グリコール酸等)、ヒドロキシジカルボン酸類(リンゴ酸等)、ヒドロキシトリカルボン酸類(クエン酸等)等のホモポリマーまたはコポリマー等が挙げられ、ポリ乳酸、乳酸グリコール酸共重合体が好ましく、乳酸グリコール酸共重合体が特に好ましい。また、これらの生体内分解性高分子物質は、1種または2種以上を組み合わせて用いても良い。
噴霧乾燥微粉末は実質的に生理活性蛋白質と糖類からなり、糖類に対する生理活性蛋白質の含有量は、約0.01−約80%(w/w)の範囲が好ましく、さらに約2−約50%(w/w)、最も好ましくは約5−約20%(w/w)である。活性蛋白質の含有量がこれらの範囲より低くなると、実質的な生理活性を示さなくなってしまい、これらの範囲より高くなると、糖類の安定性への寄与が得られなくなってしまう。
生体内分解性高分子物質に対する噴霧乾燥微粉末の含有量は、生理活性蛋白質の薬理効果および放出時間によって異なるが、約0.01−約20%(w/w)の範囲であり、好ましくは約0.1−約10%(w/w)である。これらの範囲より低い場合には、放出時間が著しく遅くなってしまい、これら範囲より高い場合には、放出時間が早まる可能性がある。
本発明の噴霧乾燥微粉末は、例えば生理活性蛋白質と糖類の混合水溶液をノズルを用いて噴霧乾燥器の乾燥室内に噴霧し、水を揮発させることにより得ることができる。噴霧乾燥器の例としては、スプレードライヤーが挙げられる。噴霧乾燥時に使用するノズルとしては、例えば二流体ノズル、圧力ノズル、回転ディスク型等があり、生理活性蛋白質、糖類の選択に応じていずれも使用が可能である。
混合水溶液の調製の際は、生理活性蛋白質の水溶液に水溶性低分子物質を溶解させてもよいし、生理活性蛋白質水溶液と水溶性低分子物質の水溶液を混合させてもよい。また本発明の効果を損なわない範囲において、必要に応じて塩酸、水酸化ナトリウム等のpH調整剤、塩化ナトリウム等の浸透圧調整剤を添加してもよい。この際、混合水溶液における生理活性蛋白質の濃度は、生理活性蛋白質が溶解する範囲であれば特に限定されないが、約0.1−約20mg/mlであり、好ましくは約1−約10mg/ml、さらに好ましくは約1−約8mg/mlである。また混合水溶液における糖類の濃度は、糖類が溶解し、さらに生理活性蛋白質が沈殿しない範囲であれば特に限定されないが、約1−約150mg/mlであり、好ましくは約10−約100mg/ml、さらに好ましくは約20−約70mg/mlである。
噴霧乾燥の際の噴霧乾燥室の送風室の送風入り口温度は、約20−約150℃の範囲であり、好ましくは約40−約120℃、さらに好ましくは約50−約100℃である。また、送風出口温度は、約0−約80℃の範囲であり、好ましくは約10−約80℃であり、さらに好ましくは約20−約60℃である。
生理活性蛋白質と糖類との噴霧乾燥微粉末を生体内分解性高分子物質に分散させる方法としては、噴霧乾燥微粉末と生体内分解性高分子物質の混合物に有機溶媒を添加させて生体内分解性高分子物質を溶解させて噴霧乾燥微粉末を分散させる方法、生体内分解性高分子物質の有機溶媒溶液に噴霧乾燥微粉末を分散させる方法、噴霧乾燥微粉末の有機溶媒分散液に生体内分解性高分子物質を溶解させる方法、噴霧乾燥微粉末の有機溶媒分散液と生体内分解性高分子物質の有機溶媒溶液を混合させる方法、のいずれの方法をも選択することができる。噴霧乾燥微粉末を生体内分解性高分子物質の有機溶媒溶液に分散させる際に、均一性を増すためにボルテックスミキサー、ホモジナイズ、超音波等の処理を行ってもよい。有機溶媒中の生体内分解性高分子物質の濃度は、約10−約500mg/mlが好ましく、約50−約250mg/mlがより好ましい。
本発明で使用する有機溶媒としては、噴霧乾燥微粉末を溶解せずに生体内分解性高分子物質を溶解する揮発性のものであれば特に制限されない。有機溶媒の具体例としては、アセトニトリル、塩化メチレン、クロロホルム、酢酸エチル、トルエン等が挙げられ、これらのうちアセトニトリル、塩化メチレンが好ましい。これらの有機溶媒は2種類以上を混合して用いてもよい。
また、必要に応じ、本発明の効果を損なわない範囲において賦形剤等が添加されていてもよい。賦形剤としては、製薬学的に許容される塩類、界面活性剤、糖類、アミノ酸類、有機酸、その他水溶性物質等が挙げられ、その配合量は、生体内分解性高分子物質重量に対し、約0.1−約20%(w/w)であり、好ましくは約1−約10%(w/w)である。これらの賦形剤は1種または2種類以上を添加することができる。
上記賦形剤のうち有機溶媒に溶解しないものは粉末として添加されるが、その際の賦形剤の平均粒子径は20μm以下が好ましく、10μm以下がさらに好ましい。
具体的な塩類としては、L−グルタミン酸カリウム、L−グルタミン酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、カプリル酸ナトリウム、カルバゾクロムスルホン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸マグネシウム、メタスルホ安息香酸ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化アルミニウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等が挙げられ、糖類としては、D−ソルビトール、D−マンニトール、イノシトール、キシリトール、デキストラン、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース等が挙げられ、アミノ酸類としては、メチオニン、アスパラギン酸、アラニン、アルギニン、グリシン、システイン、タウリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、グルタミン酸、リジン等が挙げられ、その他水溶性物質としては、アスコルビン酸、人血清アルブミン、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ゼラチン、ゼラチン加水分解物、ヘパリンナトリウム等が挙げられる。
また有機溶媒に溶解する賦形剤として、界面活性剤、有機酸類等を添加することもできる。具体的な界面活性剤としては、セスキオレイン酸ソルビタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン(160)ポリオキシプロピレン(30)グリコール、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油50、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、ポリソルベート20、ポリソルベート80、マクロゴール400、マクロゴール4000、マクロゴール600等が挙げられ、有機酸類としては、オレイン酸、チオグリコール酸、乳酸等が挙げられる。
有機溶媒中の生体内分解性高分子物質を固化させる方法としては、例えば生体内分解性高分子物質の有機溶媒溶液を油類に加え、乳化することによりO/O型エマルションを調製し、得られたエマルションを液中乾燥する方法が挙げられる。油類としては、噴霧乾燥微粉末および生体内分解性高分子物質を溶解せず、生体内分解性高分子物質を溶解させる有機溶媒と混合しない油類であれば特に制限されないが、例えば、シリコン油、大豆油、ゴマ油、綿実油、鉱物油等が好ましく、その中でもシリコン油、鉱物油はより好ましく、特にシリコン油は最も好ましい。これらは2種類以上混合して用いても良い。
また油類の体積は、生体内分解性高分子物質の有機溶媒溶液体積の1−1000倍程度とすることが好ましく、特に10−500倍程度が好ましい。
油類中で有機溶媒を除去することで、生体内分解性高分子物質への内包が容易となり、高い封入率を達成するという利点を有する。
さらに油類には凝集防止剤を添加することもできる。凝集防止剤は油類中でのマイクロスフェアーの凝集を抑制するものであれば特に制限されないが、セスキオレイン酸ソルビタンが好ましい。
乳化操作時には、プロペラ式攪拌機、タービン型乳化機、超音波分散装置、高圧乳化機等適切な機器を用いることができる。
液中乾燥は、減圧法等の常法により実施することができ、例えばプロペラ式攪拌機でエマルションを約10−約1000rpmで攪拌しながら約0.1−約50mm/Hgとして有機溶媒の留去を行い、温度は0−約25℃とし、約10−約20℃とすることがより好ましい。0.1−20μmのメッシュサイズのメッシュで油類を除去する。油類の除去の際に油類と混合する溶媒を添加することにより効率的に油類を除去することができる。例えばイソプロピルアルコール、エタノール等の添加である。また、必要であれば、さらに1mmHg以下に減圧することにより有機溶媒を留去してもよい。温度は0−約30℃とすることが好ましく、約15−約25℃とすることがさらに好ましい。有機溶媒を完全に留去するためには、約24−約60時間の減圧処理が好ましく、約36−約48時間がより好ましい処理時間である。油類の除去は、油類が溶解し、生体内分解性高分子物質が溶解しない溶媒を添加することによっても実施することができる。具体的には、n−ヘキサン、イソプロピルアルコール、エタノール、メタノール等の添加である。
必要であれば、1mmHg以下に約1−約2時間減圧することにより油類が溶解し、生体内分解性高分子物質が溶解しない溶媒の除去を実施する。このようにして得られたマイクロスフェアーを100−500μmのメッシュサイズのメッシュ、好ましくは150−300μmのメッシュサイズのメッシュで篩過することにより粒子径の整ったマイクロスフェアーを得ることができる。また、必要であればこのようにして得られたマイクロスフェアーを加温することによりマイクロスフェアー中に残留した有機溶媒をさらに除去することができる。加温は減圧下で行っても良い。これら一連の操作を行うことで、平均粒子径約20μm−約250μmの注射剤に適したマイクロスフェアーを得ることが可能である。
次に本発明の徐放性注射用組成物の製造法を説明する。
本発明組成物を製造するには、生理活性蛋白質水溶液と糖類水溶液を混合し、スプレードライヤーを用いて噴霧乾燥微粉末を得る。別に生体内分解性高分子物質(例えば乳酸グリコール酸共重合体(PLGA))を適切な有機溶媒(例えばアセトニトリル)にて溶解後生理活性蛋白質/糖類噴霧乾燥微粉末を添加し、ポリトロンにて分散させる。噴霧乾燥微粉末分散生体内分解性高分子物質溶液を油中(例えばシリコン油)に投入し、400回転で攪拌し、30分間10mmHg以下で溶媒を留去する。イソプロピルアルコール等を添加し、メッシュサイズ20μmのふるいにてマイクロスフェアーを回収後、0.1mmHg以下で適切な時間処理する。ヘキサン洗浄にて油を除去した後、0.1mmHg以下で1時間処理することによりヘキサンを除去する。メッシュサイズ250μmのふるい下のマイクロスフェアーを回収し、本発明組成物を得る。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これにより本発明の範囲が限定されるものではない。
[粒子径測定法]
噴霧乾燥微粉末にアセトニトリルを添加し、ポリトロン(KINEMATICA GmbH)にて10,000回転、1分間処理することにより分散させた。分散液の一部あるいは全部をレーザー回折/散乱式粒度分布測定装置(HORIBA、LA−910)にて測定した。
[生理活性試験法]
噴霧乾燥粉末中の活性測定のための試料調製法
噴霧乾燥微粉末を7%(w/v)ウシ血清アルブミンを含有する1/30Mリン酸緩衝液pH7.0に溶解後、0.22μmのフィルター(MILLEX−GV:MILLIPORE)にてろ過した。蛍光分光器(F−4500:日立)にて蛍光強度(励起波長495nm、蛍光波長517nm)を測定することによりFITC標識インターフェロン−α−Con1の濃度を算出し、試料溶液とした。
マイクロスフェアー中の活性測定のための試料調製法
噴霧乾燥微粉末を含有するマイクロスフェアーにアセトンを添加することによりPLGAを溶解させ、遠心処理(2,000rpm、10分間)後、上清を除去した。この操作を4回繰り返すことにより噴霧乾燥微粉末を回収した。回収された噴霧乾燥微粉末は上記の方法により試料溶液とした。
力価測定法
インターフェロン−α−Con1の力価は、抗ウィルス活性を測定することにより実施した(参考文献:蛋白質・核酸・酵素、別冊25、355−363、1981年)。細胞は、ヒト羊膜由来株細胞(FL細胞、ATCC番号 CCL−62(国立予防衛生研究所より分与された株又は同等品)およびシンドビスウィルス(国立予防衛生研究所より分与された株)を用いて行った。
[放出試験法]
フルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識インターフェロン−α−Con1含有PLGAマイクロスフェアー50mgに1/30Mリン酸緩衝液(pH7.0)10mlを添加し、60ストローク/min、37℃の水浴中でインキュベートした。所定時間後、上清の一部に等量の5%(w/v)ドデシル硫酸ナトリウムを含有する0.1N水酸化ナトリウムを添加後、蛍光分光器(F−4500:日立)にて蛍光強度(励起波長495nm、蛍光波長517nm)を測定することによりインターフェロン−α−Con1の放出量を算出した。
[封入率の測定法]
FITC標識インターフェロン−α−Con1含有PLGAマイクロスフェアー20mgにジメチルスルホキシド10mlを添加して溶解させた。5%(w/v)ドデシル硫酸ナトリウムを含有する0.1N水酸化ナトリウム10mlを添加後、蛍光分光器(F−4500:日立)にて蛍光強度(励起波長495nm、蛍光波長517nm)を測定することによりインターフェロン−α−Con1の封入率を算出した。
実施例1
[インターフェロン−α−Con1のFITC標識化]
インターフェロン−α−Con1水溶液(19mg/ml)40mlにpH9.5の炭酸緩衝液150mlを添加し、0.1N水酸化ナトリウム水溶液にてpH9.5に調製し、氷冷した。フルオレセインイソチオシアネート25mgを炭酸緩衝液に溶解後、氷冷したインターフェロン−α−Con1水溶液に添加し、所定時間攪拌した。1N塩酸を添加してpH7.0に調整後、Sephadex G−25を用いたゲル濾過によりFITC標識インターフェロン−α−Con1を精製した。インターフェロン−α−Con1 1分子当たりに標識されたFITC分子数は約0.2であった。
[フルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識インターフェロン−α−Con1/マンニトール噴霧乾燥微粉末の製造]
FITC標識インターフェロン−α−Con1水溶液とマンニトール水溶液を混合し、最終濃度がFITC標識インターフェロン−α−Con1 5mg/ml、マンニトール50mg/mlとなるように調整した。噴霧乾燥条件は送風入り口温度95−105℃、液体供給速度6g/min、噴霧圧2kg/cm2、結果として送風出口温度35−45℃となった。回収した粉末はシリカゲルとともに密閉容器中にて保存した。噴霧乾燥微粉末の粒子径を測定したところ、平均粒子径4.7μm、10μm以下の粒子が占める割合は98.1%であった。
[FITC標識インターフェロン−α−Con1/マンニトール噴霧乾燥微粉末封入PLGAマイクロスフェアーの製造]
PLGA500mgをアセトニトリル2.5mlにて溶解後FITC標識インターフェロン−α−Con1/マンニトール噴霧乾燥微粉末10mgを添加し、ポリトロンにて10,000回転、1分間処理することにより分散させた。噴霧乾燥微粉末分散ポリマー溶液をシリコンオイル500ml中に投入し、400回転で攪拌し、30分間10mmHg以下でアセトニトリルを留去した。イソプロピルアルコール500mlを添加し、メッシュサイズ20μmのふるいにてマイクロスフェアーを回収後、0.1mmHg以下で36時間処理した。ヘキサン洗浄にてシリコンオイルを除去した後、0.1mmHg以下で1時間処理することによりヘキサンを除去した。メッシュサイズ250μmのふるい下のマイクロスフェアーを回収し、本発明生理活性蛋白質含有徐放性注射用組成物を得た。
実験例1
実施例1で調製したマイクロスフェアー中へのFITC標識インターフェロン−α−Con1/マンニトール噴霧乾燥微粉末封入率は、上記封入率測定法により算出したところ90%であった。またマイクロスフェアーからのFITC標識インターフェロン−α−Con1の放出性を上記放出試験法により測定したところ、初期3時間までの放出性は5%以下であった。また、放出は1ヶ月以上にわたり持続した。
したがって本発明のマンニトールを担体とした噴霧乾燥微粉末を用い、本発明の製造方法により調製したマイクロスフェアーにおいては、生理活性蛋白質が効率よく封入され、初期放出が抑制され、かつ長期にわたる持続的な放出性を達成したことが確認された。
実施例2
[FITC標識インターフェロン−α−Con1/2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン噴霧乾燥微粉末の製造]
FITC標識インターフェロン−α−Con1水溶液と2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン水溶液を混合し、最終濃度がFITC標識インターフェロン−α−Con1 5mg/ml、2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン50mg/mlとなるように調整した。噴霧乾燥条件は送風入り口温度95−105℃、液体供給速度6g/min、噴霧圧2kg/cm2、結果として送風出口温度35−45℃となった。回収した粉末はシリカゲルとともに密閉容器中にて保存した。噴霧乾燥微粉末の粒子径を測定したところ、平均粒子径4.0μm、10μm以下の粒子が占める割合は99.4%であった。
[FITC標識インターフェロン−α−Con1/2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン噴霧乾燥微粉末封入PLGAマイクロスフェアーの製造]
PLGA500mgをアセトニトリル2.5mlにて溶解後FITC標識インターフェロン−α−Con1/2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン噴霧乾燥微粉末10mgを添加し、ポリトロンにて10,000回転、1分間処理することにより分散させた。噴霧乾燥微粉末分散ポリマー溶液をシリコンオイル500ml中に投入し、400回転で攪拌し、30分間10mmHg以下でアセトニトリルを留去した。イソプロピルアルコール500mlを添加し、メッシュサイズ20μmのふるいにてマイクロスフェアーを回収後、0.1mmHg以下で36時間処理した。ヘキサン洗浄にてシリコンオイルを除去した後、0.1mmHg以下で1時間処理することによりヘキサンを除去した。メッシュサイズ250μmのふるい下のマイクロスフェアーを回収し、本発明生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物を得た。
実験例2
実施例1で調製したPLGAマイクロスフェアー中へのFITC標識インターフェロン−α−Con1/2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン噴霧乾燥微粉末封入率を上記封入率測定法で測定したところ85%であった。またPLGAマイクロスフェアーをpH7.0のリン酸緩衝液に浸せきさせた際のFITC標識インターフェロン−α−Con1の放出性を上記放出試験法により測定したところ、初期3時間までの放出性は10%以下であった。また、放出性は3週間以上にわたり持続した。
したがって本発明の2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを担体とした噴霧乾燥微粉末を用い、本発明の製造方法により調製したマイクロスフェアーにおいて、生理活性蛋白質が効率よく封入され、初期放出が抑制され、かつ長期にわたる持続的な放出性を達成したことが確認された。
実施例3
インターフェロン−α−Con1水溶液とマンニトール水溶液を混合し、最終濃度がインターフェロン−α−Con1 0.5mg/ml、マンニトール50mg/mlとなるように調整した。噴霧乾燥条件は送風入り口温度45−55℃、液体供給速度3g/min、噴霧圧2kg/cm2、送風出口温度は23−28℃であった。回収したインターフェロン−α−Con1/マンニトール噴霧乾燥微粉末を用いて、実施例1と同様の製造方法にてインターフェロン−α−Con1含有PLGAマイクロスフェアーを調製した。
実験例3
[インターフェロン−α−Con1含有PLGAマイクロスフェアー製造工程中のインターフェロン−α−Con1の安定性]
実施例3に示したインターフェロン−α−Con1/マンニトール噴霧乾燥微粉末を封入したPLGAマイクロスフェアーを用い、インターフェロン−α−Con1の製造工程中における安定性を評価した。FL細胞とシンドビスウイルスを用いた抗ウイルス活性測定を行った。インターフェロン−α−Con1溶液の活性値と比較した際の、PLGAマイクロスフェアーに封入されたインターフェロン−α−Con1の活性は、103.5%であり、製造工程中に失活せずに安定性を保持していることが確認された。
比較例1
[コンセンサスインターフェロン/ポリエチレングリコール4000噴霧乾燥微粉末の製造]
コンセンサスインターフェロン水溶液とポリエチレングリコール4000水溶液を混合し、最終濃度がコンセンサスインターフェロン0.2mg/ml、ポリエチレングリコール4000 20mg/mlとなるように調整した。噴霧乾燥条件は送風入り口温度47−52℃、液体供給速度3g/min、噴霧圧2kg/cm2、結果として送風出口温度26−31℃となった。回収した粉末はシリカゲルとともに密閉容器中にて保存した。
[コンセンサスインターフェロン含有PLGAマイクロスフェアー製造工程中のコンセンサスインターフェロンの安定性]
コンセンサスインターフェロン/ポリエチレングリコール4000噴霧乾燥微粉末の製造工程中における安定性を評価するために、FL細胞とシンドビスウイルスを用いた抗ウイルス活性測定を行った。コンセンサスインターフェロン溶液の活性値と比較した際のコンセンサスインターフェロン/マンニトール噴霧乾燥微粉末の活性は、31.2%を示し、製造工程中に失活していることが確認された。よって実施例との比較により、糖類によって製造工程中のコンセンサスインターフェロンの失活が回避されていることが確認された。
比較例2
[FITC標識コンセンサスインターフェロン/マンニトール凍結乾燥粉末の製造]
FITC標識コンセンサスインターフェロン水溶液とマンニトール水溶液を混合し、最終濃度がFITC標識コンセンサスインターフェロン3.9mg/ml、マンニトール50mg/mlとなるように調整し凍結乾燥した。凍結乾燥粉末の粒子径を測定したところ、平均粒子径69.3μm、10μm以下の粒子が占める割合は3.3%であった。
[FITC標識コンセンサスインターフェロン/マンニトール凍結乾燥粉末封入PLGAマイクロスフェアーの製造]
PLGA500mgをアセトニトリル2.5mlにて溶解後FITC標識コンセンサスインターフェロン/マンニトール凍結乾燥粉末10mgを添加し、ポリトロンにて10,000回転、1分間処理することにより分散させた。凍結乾燥微粉末分散ポリマー溶液をシリコンオイル500ml中に投入し、400回転で攪拌し、30分間10mmHg以下でアセトニトリルを留去した。イソプロピルアルコール500mlを添加し、メッシュサイズ20μmのふるいにてマイクロスフェアーを回収後、0.1mmHg以下で36時間処理した。ヘキサン洗浄にてシリコンオイルを除去した後、0.1mmHg以下で1時間処理することによりヘキサンを除去した。メッシュサイズ250μmのふるい下のマイクロスフェアーを回収し、本発明生理活性蛋白質含有徐放性注射用組成物を得た。
[FITC標識コンセンサスインターフェロン/マンニトール凍結乾燥粉末封入PLGAマイクロスフェアーからの初期放出性評価]
マイクロスフェアー中へのFITC標識コンセンサスインターフェロン/マンニトール凍結乾燥微粉末封入率は、上記封入率測定法により算出したところ122%であった。またマイクロスフェアーからのFITC標識コンセンサスインターフェロンの放出性を上記放出試験法により測定したところ、初期3時間までの放出性は68%であった。
したがって本発明の噴霧乾燥微粉末を用いた生理活性蛋白質含有徐放性注射用組成物においては、生理活性蛋白質が効率よく封入され、初期放出が抑制され、かつ長期にわたる持続的な放出性を達成したのみならず、生理活性蛋白質の生理活性も保持していることが確認された。更に噴霧乾燥微粉末の粒子径が10μm以下のものが90%以上であれば、封入率、初期放出ともに良好なマイクロスフェアーが得られることが示された。
実施例4
[BMP−2実験方法]
噴霧乾燥微粉末中の活性測定のための試料調製法
噴霧乾燥微粉末を希釈用緩衝液(0.01% Tween80 グリシン緩衝液pH4.5で溶解し,マイクロローリー法を用いてBMP−2濃度を測定した.希釈用緩衝液で調製したBMP−2溶解液から10%ウシ胎児血清含有ダルベッコ改変MEM培地(pH7.4)を用いてBMP−2濃度が約0.488−1380ng/mLになるように希釈系列を作成し試料溶液とした.
マイクロスフェアー中の活性測定のための試料調製法
噴霧乾燥微粉末を含有するマイクロスフェアーにアセトンを添加することによりPLGAを溶解させ、遠心処理(2000rpm、10分間)後上清を除去した。この操作を4回繰り返すことにより噴霧乾燥微粉末を回収した。
回収された噴霧乾燥微粉末は上記と同様の方法により試料溶液とした。
力価測定法
BMP−2の力価はBMP−2濃度依存的に亢進する細胞のアルカリフォスファターゼ活性を測定した(参考文献:Endocrinology 130巻、1992年 1318−1324ページ)。細胞は骨髄ストローマ細胞であるW20細胞(Genetics Institute,Inc.(現Wyeth社)より分与された細胞株)を用いた。
[BMP−2/マンニトール噴霧乾燥微粉末の製造]
BMP−2水溶液とマンニトール水溶液を混合し、最終濃度がBMP−20.5mg/ml、マンニトール50mg/mlとなるように調整した。噴霧乾燥条件は送風入り口温度48−53℃、液体供給速度3g/min、噴霧圧2kg/cm2、結果として送風出口温度26−31℃となった。回収した粉末はシリカゲルとともに密閉容器中にて保存した。噴霧乾燥微粉末の粒子径を測定したところ、平均粒子径4.9μm、10μm以下の粒子が占める割合は97.9%であった。
実施例5
[BMP−2/マンニトール/Tween80噴霧乾燥微粉末の製造]
BMP−2水溶液とマンニトール/Tween80水溶液を混合し、最終濃度がBMP−2 0.5mg/ml、マンニトール50mg/ml、Tween80 1mg/mlとなるように調整した。噴霧乾燥条件は送風入り口温度48−53℃、液体供給速度3g/min、噴霧圧2kg/cm2、結果として送風出口温度27−32℃となった。回収した粉末はシリカゲルとともに密閉容器中にて保存した。噴霧乾燥微粉末の粒子径を測定したところ、平均粒子径6.2μm、10μm以下の粒子が占める割合は90.2%であった。
実施例6
[BMP−2/マンニトール/グリシン噴霧乾燥微粉末の製造]
BMP−2水溶液とマンニトール/グリシン水溶液を混合し、最終濃度がBMP−2 0.5mg/ml、マンニトール45mg/ml、グリシン5mg/mlとなるように調整した。噴霧乾燥条件は送風入り口温度48−53℃、液体供給速度3g/min、噴霧圧2kg/cm2、結果として送風出口温度26−31℃となった。回収した粉末はシリカゲルとともに密閉容器中にて保存した。噴霧乾燥微粉末の粒子径を測定したところ、平均粒子径4.6μm、10μm以下の粒子が占める割合は98.3%であった。
実施例7
[BMP−2/2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン噴霧乾燥微粉末の製造]
BMP−2水溶液と2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン水溶液を混合し、最終濃度がBMP−2 0.5mg/ml、2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン50mg/mlとなるように調整した。噴霧乾燥条件は送風入り口温度48−53℃、液体供給速度3g/min、噴霧圧2kg/cm2、結果として送風出口温度26−31℃となった。回収した粉末はシリカゲルとともに密閉容器中にて保存した。噴霧乾燥微粉末の粒子径を測定したところ、平均粒子径4.7μm、10μm以下の粒子が占める割合は98.3%であった。
実施例8
[BMP−2/2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン/Tween80噴霧乾燥微粉末の製造]
BMP−2水溶液と2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン水溶液を混合し、BMP−2の最終濃度が、0.5mg/mL、2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンが50mg/mL、Tween80が1mg/mLとなるように調整した。噴霧乾燥条件は送風入り口温度47−52℃、液体供給速度3g/min、噴霧圧2kg/cm2、結果として送風出口温度26−31℃となった。回収した粉末はシリカゲルとともに密閉容器中にて保存した。噴霧乾燥微粉末の粒子径を測定したところ、平均粒子径6.3μm、10μm以下の粒子が占める割合は90.1%であった。
実施例9
[BMP−2/2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン/グリシン噴霧乾燥微粉末の製造]
BMP−2水溶液と2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン/グリシン水溶液を混合し、BMP−2の最終濃度が、0.5mg/mL、2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンが45mg/mL、グリシンが5mg/mLとなるように調整した。噴霧乾燥条件は送風入り口温度48−53℃、液体供給速度3g/min、噴霧圧2kg/cm2、結果として送風出口温度25−30℃となった。回収した粉末はシリカゲルとともに密閉容器中にて保存した。噴霧乾燥微粉末の粒子径を測定したところ、平均粒子径5.8μm、10μm以下の粒子が占める割合は97.2%であった。
実施例10
[BMP−2含有噴霧乾燥微粉末封入PLGAマイクロスフェアーの製造]
PLGA500mgをアセトニトリル2.5mlにて溶解後BMP−2/2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン噴霧乾燥微粉末10mgを添加し、ポリトロンにて10,000回転、1分間処理することにより分散させた。噴霧乾燥微粉末分散ポリマー溶液をシリコンオイル500ml中に投入し、400回転で攪拌し、30分間10mmHg以下でアセトニトリルを留去した。イソプロピルアルコール500mlを添加し、メッシュサイズ20μmのふるいにてマイクロスフェアーを回収後、0.1mmHg以下で36時間処理した。ヘキサン洗浄にてシリコンオイルを除去した後、0.1mmHg以下で1時間処理することによりヘキサンを除去した。メッシュサイズ250μmのふるい下のマイクロスフェアーを回収し、本発明生理活性蛋白質含有徐放性注射用組成物を得た。
実験例4
[BMP−2含有噴霧乾燥微粉末及びPLGAマイクロスフェアー中のBMP−2の安定性]
BMP−2含有噴霧乾燥微粉末及びPLGAマイクロスフェアーに封入されたBMP−2の製造工程中における安定性を評価するために、W20細胞を用いた活性測定を行った。BMP−2溶液の活性値と比較した際の、BMP−2−マンニトール噴霧乾燥微粉末およびBMP−2−2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン噴霧乾燥微粉末を用いた、PLGAマイクロスフェアー封入BMP−2の活性は、それぞれ105.7%、103.9%と高い活性を保持し、製造工程中に失活せずに安定性を保持していることが確認された。
実施例11
[塩化リゾチーム実験方法]
噴霧乾燥微粉末中の活性測定のための試料調製法
噴霧乾燥微粉末を精製水で溶解し、マイクロローリー法を用いて塩化リゾチーム濃度を測定した、pH6.2リン酸緩衝液を用いてタンパク濃度が1μg/mLになるように希釈し試料溶液とした.
マイクロスフェアー中の活性測定のための試料調製法
噴霧乾燥微粉末を含有するマイクロスフェアーにアセトンを添加することによりPLGAを溶解させ、遠心処理(2000rpm,10分間)後上清を除去した。この操作を4回繰り返すことにより噴霧乾燥微粉末を回収した。
回収された噴霧乾燥微粉末は上記の方法により試料溶液とした。
力価測定
塩化リゾチームの力価は塩化リゾチームの濃度依存的に更新する基質溶解性を指標に測定した(参考文献:日本薬局方外医薬品規格,1997,P352−353).基質はMicrococcus lysodeikticusの乾燥菌体を用いた.
[塩化リゾチーム/マンニトール噴霧乾燥微粉末の製造]
塩化リゾチーム水溶液とマンニトール水溶液を混合し、最終濃度が塩化リゾチーム5mg/ml、マンニトール50mg/mlとなるように調整した。噴霧乾燥条件は送風入り口温度48−53℃、液体供給速度3g/min、噴霧圧2kg/cm2、結果として送風出口温度24−30℃となった。回収した粉末はシリカゲルとともに密閉容器中にて保存した。噴霧乾燥微粉末の粒子径を測定したところ、平均粒子径4.9μm、10μm以下の粒子が占める割合は96.6%であった。
実施例12
[塩化リゾチーム/2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン噴霧乾燥微粉末の製造]
塩化リゾチーム水溶液と2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン水溶液を混合し、最終濃度が塩化リゾチーム10mg/mL、マンニトール50mg/mLとなるように調整した。噴霧乾燥条件は送風入り口温度49−50℃、液体供給速度3g/min、噴霧圧2kg/cm2、結果として送風出口温度27−29℃となった。回収した粉末はシリカゲルとともに密閉容器中にて保存した。噴霧乾燥微粉末の粒子径を測定したところ、平均粒子径5.8μm、10μm以下の粒子が占める割合は90.9%であった。
[塩化リゾチーム含有噴霧乾燥微粉末封入PLGAマイクロスフェアーの製造]
PLGA500mgをアセトニトリル2.5mLにて溶解後塩化リゾチーム含有噴霧乾燥微粉末10mgを添加し、ポリトロンにて10,000回転、1分間処理することにより分散させた。噴霧乾燥微粉末分散ポリマー溶液をシリコンオイル500mL中に投入し、400回転で攪拌し、30分間10mmHg以下でアセトニトリルを留去した。イソプロピルアルコール500mLを添加し、メッシュサイズ20μmのふるいにてマイクロスフェアーを回収後、0.1mmHg以下で36時間処理した。ヘキサン洗浄にてシリコンオイルを除去した後、0.1mmHg以下で1時間処理することによりヘキサンを除去した。メッシュサイズ250μmのふるい下のマイクロスフェアーを回収し、生理活性蛋白質含有徐放性注射用組成物を得た。
実験例5
[塩化リゾチーム含有PLGAマイクロスフェアー製造工程中の塩化リゾチームの安定性]
塩化リゾチーム溶液、塩化リゾチーム含有噴霧乾燥微粉末、PLGAマイクロスフェアーに封入された塩化リゾチームの製造工程中における安定性を評価するために、Micrococcus lysodeikticusの乾燥菌体を用いた活性測定を行った。塩化リゾチーム溶液の活性値と比較した際の塩化リゾチーム/マンニトール噴霧乾燥微粉末を用いたPLGAマイクロスフェアー中の塩化リゾチームの活性値は、90.1%であり、塩化リゾチーム/2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン噴霧乾燥微粉末を用いたPLGAマイクロスフェアー中の塩化リゾチームの活性は92.6%であった。いずれも90%を下回らない活性を示し、製造工程中に失活せずに安定性を保持していることが確認された。
産業上の利用可能性
本発明によれば、糖類を用いることで高温にすることなく噴霧乾燥が可能となり、熱による生理活性蛋白質の変性や失活を回避し、粒子径を制御した蛋白質微粉末を調製することが極めて容易となる。また、生理活性を保持し、粒子径が充分に制御された蛋白質微粉末を用いることで、生体内分解性高分子溶液中への均一な分散が可能となり、内包の生理活性蛋白質の生理活性を保持し、またマイクロスフェアーへの高い封入率、初期放出の抑制を達成することが可能となる。
よって本発明は、噴霧乾燥微粉末を高い封入率で徐放性マイクロスフェアー中に封入することを可能とするとともに、マイクロスフェアーからの初期放出の抑制および持続的な放出性を達成することを可能とし、一般的に生理活性の保持が製剤化の過程で困難とされる生理活性蛋白質の生産性の高い徐放性注射用組成物の提供を可能にしたものである。
Claims (37)
- 生体内分解性高分子物質のマトリックス中に、粒子径10μm以下の粒子が90%以上を占める生理活性蛋白質と糖類とからなる噴霧乾燥微粉末が、均一に分散された生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
- 粒子径6μm以下の噴霧乾燥微粉末の占める割合を、50%以上とした請求項1記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
- 糖類がマンニトールおよび/またはシクロデキストリン類である請求項2に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
- シクロデキストリン類が2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである請求項3に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
- 生体内分解性高分子物質が乳酸−グリコール酸の共重合体である請求項4に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
- 生理活性蛋白質がインターフェロン類である請求項5記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
- インターフェロン類がインターフェロン−α−Con1である請求項6記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
- 組成物がマイクロスフェアーである請求項7に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
- マイクロスフェアーの平均粒子径を約20−約250μmとした請求項8に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
- 糖類に対する生理活性蛋白質の含有量が、約0.01−約80%(w/w)である請求項9に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
- 生体内分解性高分子物質に対する噴霧乾燥微粉末の濃度が約0.01−約20%(w/w)である請求項9に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
- 生理活性蛋白質と糖類とを実質的な組成成分とし、かつ粒子径10μm以下の粒子が90%以上を占める噴霧乾燥微粉末を、生体内分解性高分子物質の有機溶媒溶液に分散させた後、該有機溶媒を油類中で除去してなる生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
- 粒子径6μm以下の噴霧乾燥微粉末の占める割合を、50%以上とした請求項12に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
- 糖類がマンニトールおよび/またはシクロデキストリン類である請求項13に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
- シクロデキストリン類が2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである請求項14に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
- 生体内分解性高分子物質が乳酸−グリコール酸の共重合体である請求項15に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
- 生理活性蛋白質がインターフェロン類である請求項16記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
- インターフェロン類がインターフェロン−α−Con1である請求項17記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
- 油類がシリコン油、大豆油、ゴマ油、綿実油、鉱物油である請求項18に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
- 油類がシリコン油である請求項19に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
- 組成物がマイクロスフェアーである請求項20に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
- マイクロスフェアーの平均粒子径を約20−約250μmとした請求項21に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
- 糖類に対する生理活性蛋白質の含有量が、約0.01−約80%(w/w)である請求項9に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
- 生体内分解性高分子物質に対する噴霧乾燥微粉末の濃度が10%(w/w)以下である請求項22に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物。
- 生理活性蛋白質と糖類とを実質的な組成成分とし、かつ粒子径10μm以下の粒子が90%以上を占める噴霧乾燥微粉末を、生体内分解性高分子物質の有機溶媒溶液に分散させた後、該有機溶媒を油類中で除去してなる生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法。
- 粒子径6μm以下の噴霧乾燥微粉末の占める割合を、50%以上とした請求項25に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法。
- 糖類がマンニトールおよび/またはシクロデキストリン類である請求項26に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法。
- シクロデキストリン類が2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである請求項27に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法。
- 生体内分解性高分子物質が乳酸−グリコール酸の共重合体である請求項28に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法。
- 生理活性蛋白質がインターフェロン類である請求項29に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法。
- インターフェロン類がインターフェロン−α−Con1である請求項30記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法。
- 油類がシリコン油、大豆油、ゴマ油、綿実油、鉱物油である請求項31に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法。
- 油類がシリコン油である請求項32に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法。
- 組成物がマイクロスフェアーである請求項33に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法。
- マイクロスフェアーの平均粒子径を約20−約250μmとした請求項34に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法。
- 生体内分解性高分子物質に対する噴霧乾燥微粉末の濃度が10%(w/w)以下である請求項35に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法。
- 糖類に対する生理活性蛋白質の含有量が、約0.01−約80%(w/w)である請求項9に記載の生理活性蛋白質含有徐放性注射剤用組成物の製造方法。
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