BRPI0514408B1 - preparação liquida de peptídeo fisiologicamente ativo - Google Patents

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Masaru Matsumoto
Masako Matsumoto
Takeshi Hanada
Naomi Wakabayashi
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Kenji Kangawa
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Abstract

PREPARAÇÃO LÍQUIDA DE PEPTÍDEO FISIOLOGICAMENTE ATIVO. Uma preparação líquida eficaz consegue grande biodisponibilidade (BA) de peptídeos ou proteínas fisiologicamente ativos, inclusive grelinas, que são administrados como drogas. Também é fornecida um método para aumentar a BA de peptídeos ou proteínas fisiologicamente ativos, inclusive grelinas, que são injetados em soluções aquosas por via subcutânea. A preparação liquida contém: um peptídeo ou proteína fisiologicamente ativo, tal coma grelinas, como ingrediente ativo; uma solução ácida incluindo um ou uma combinação de dois ou mais selecionadas do grupo que consiste em ácido acético, ácido láctico, ácido fosfórico, glicina, ácido cítrico, ácido clorídrico, ácido propiônico, ácido butírico, ácido benzóico e sais dos mesmos: um álcool; um liquido orgânico polar incluindo um ou uma combinação de dois ou mais selecionados do grupo que consiste em N-metil-2-pirrolidona, dimetilfomiamida, dimetil sulfóxido e metilparabeno.

Description

CAMPO TÉCNICO
[001] A presente invenção refere-se a uma preparação líquida de um peptídeo fisiologicamente ativo ou de uma proteína fisiologicamente ativa com biodisponibilidade aumentada, bem como a um método para aumentar a biodisponibilidade de um peptídeo fisiologicamente ativo ou de uma proteína fisiologicamente ativa.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] Preparações farmacêuticas de uma variedade de peptídeos fisiologicamente ativos ou de proteínas fisiologicamente ativas estão atualmente disponíveis no mercado. Entre estes peptídeos fisiologicamente ativos ou proteínas fisiologicamente ativas estão a insulina, hormônios de crescimento, peptídeo natriurético atrial, calcitonina, análogos de LHRH, hormônio paratireóideo e derivados do hormônio adrenocorticotrópico. Como estes compostos são desativados no trato gastrointestinal pela ação de proteases, eles raramente são administrados em preparações orais; a maioria deles é formulada como preparações parenterais tais como injeções para uso clínico.
[003] Tratamento contínuo e prolongado de doenças por injeção requer que pacientes visitem um hospital ou clínica para receber o tratamento e representam um fardo significativo para os pacientes. Portanto, são desejadas injeções subcutâneas que os pacientes possam administrar sozinhos. As drogas administradas por injeção subcutânea, no entanto, são decompostas por proteases durante o processo de absorção subcutânea e sua biodisponibilidade geralmente fica menor que aquela obtida por injeção intravenosa.
[004] Para compensar a baixa biodisponibilidade das drogas, as injeções subcutâneas atualmente usadas contêm doses aumentadas de drogas ou requerem administração freqüente em comparação com a administração intravenosa. Por conseguinte, as injeções subcutâneas ainda continuam estressantes para os pacientes. Conforme aqui usado, o termo "disponibilidade biológica (BA)" refere-se a quanto da droga administrada alcança a circulação sangüínea (também chamada de grau de biodisponibilidade (EBA)).
[005] Grelina, um secretagogo de hormônio de crescimento (GHS) endógeno que se liga ao receptor de secretagogo de hormônio de crescimento (GHS-R), é um peptídeo fisiologicamente ativo isolado pela primeira vez do estômago de rato em 1999 (Documento Não-Patentário 1). Grelinas com estruturas primárias semelhantes foram posteriormente isoladas de, ou sugeridas por análise de cDNA presentes em, outros vertebrados, incluem o homem, camundongo, porco, galinha, enguia, vaca, cavalo, carneiro, rã, truta e cachorro. Suas estruturas primárias são mostradas na Tabela 1. A grelina também foi isolada de gatos e cães. (Tabela 1)
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(Na Tabela 1, os resíduos de aminoácido estão indicados por códigos de uma letra do IUPAC/IUC.)
[006] A grelina endógena encontrada nesses animais é um peptídeo que tem uma estrutura modificada hidrófoba única em que o resíduo serina (S) ou treonina (T) na posição 3 é acilada com um ácido graxo tal como ácido octanóico e ácido decanóico. A grelina se liga ao receptor de secretagogo de hormônio de crescimento para aumentar o nível intracelular de íons de cálcio. Estudos revelaram que a grelina é um secretagogo de hormônio de crescimento potente que modula a secreção do hormônio de crescimento. Portanto, os papéis fisiológicos e as potenciais aplicações farmacêuticas da grelina atraíram um interesse significativo (Documento de Patente 1). Na presente invenção, todos os tipos grelinas naturais são coletivamente chamados de "grelina".
[007] Derivados ou análogos de grelina obtidos por deleção ou substituição parcial de grelina animal natural também vem chamando bastante atenção como tratamento para várias doenças (Documento de Patente 3).
[008] Nos derivados de grelina, a estrutura modificada hidrófoba não contém um grupo octanoil (C8) como na grelina natural, mas uma estrutura modificada diferente, tal como aquela contendo um ácido graxo tendo 2 a 20, de preferência cerca de 4 a 12 átomos de carbono, incluindo, por exemplo, um grupo hexenil (C6), um grupo decanoil (C10) e um grupo dodecanoil (C12), que contendo um ácido graxo ramificado ou derivados insaturados do mesmo, que contendo um anel aromático, tal como um grupo fenilpropionila, e que contendo uma estrutura principal adamantano. Embora a estrutura modificada hidrófoba da grelina animal natural seja ligado à estrutura principal peptídica via uma ligação éster, esta ligação pode ser oferecida por uma ligação éster, éter, tioéter, amida ou dissulfeto em derivados de grelina (Documento de Patente 1).
[009] Apesar das grandes expectativas para aplicação de grelinas compreendendo grelina, derivados de grelina e análogos de grelina em produtos farmacêuticos, ainda não criada nenhuma composição farmacêutica viável e principalmente a farmacocinética dos compostos continua desconhecida.
[0010] Quanto às composições farmacêuticas usando grelinas, o Documento de Patente 2 descreve o efeito do pH sobre soluções aquosas de grelinas, assim como um método para prevenir a decomposição da estrutura modificada hidrófoba de grelinas. Segundo o Documento de Patente 2, as grelinas são estáveis em uma solução aquosa em uma faixa de pH de 2 a 7. O pH da solução pode ser ajustado por ajustadores de pH tampões. O tampão é usado para minimizar a alteração de pH da solução aquosa durante o armazenamento. Entre os tampões que estão descritos no Documento de Patente 2 estão tampão de glicina-ácido clorídrico, tampão de ácido acético, tampão de ácido cítrico, tampão de ácido láctico, tampão de ácido fosfórico, tampão de ácido cítrico-ácido fosfórico, tampão de ácido fosfórico-ácido acético- ácido bórico e tampão de ácido ftálico (Documento de Patente 2, pág. 11, linhas 5-14).
[0011] Nos exemplos descritos no Documento de Patente 2, a estabilidade da grelina é testada no tampão de McIlvaine (uma mistura de ácido cítrico aquoso e uma solução aquosa de fosfato ácido dissódico), tampão de Britton-Robinson (uma mistura de ácido fosfórico aquoso/ácido acético/ácido bórico e uma solução aquosa de hidróxido de sódio), tampão de ácido cítrico, tampão de glicina-ácido clorídrico e tampão de ácido acético. Embora o Documento de Patente 2 descreva que a estabilidade de grelinas em cada solução foi assegurada mantendo-se o pH da solução em uma faixa de 2 a 7, não há qualquer menção sobre a cinética do composto quando ele é administrado aos pacientes.
[0012] Na criação de composições farmacêuticas contendo um peptídeo ou uma proteína, é importante assegurar a estabilidade do peptídeo ou da proteína antes da administração uma vez que peptídeos e proteínas geralmente são instáveis em soluções aquosas. É, no entanto, mais importante criar uma preparação que possa provocar eficazmente a atividade do composto administrado.
[0013] Documento de Patente 1: Publicação de Patente Internacional No WO 01/07475
[0014] Documento de Patente 2: Publicação de Patente Internacional No WO 03/097083
[0015] Documento de Patente 3: Tradução japonesa publicada do pedido PCT No 2004-514651
[0016] Documento de Patente 4: Publicação de Patente Japonesa No Sho 63-40166
[0017] Documento de Patente 5: Patente Japonesa N° 2643426
[0018] Documento de Patente 6: Tradução japonesa publicada do pedido PCT N° 2004-522803
[0019] Documento de Patente 7: Publicação de Patente Japonesa N° Hei 2-19092
[0020] Documento de Patente 8: Publicação de Patente Japonesa N° 5-24129
[0021] Documento de Patente 9: Patente Japonesa N° 3120987
[0022] Documento Não-Patentário 1: Kojima et al., Nature, vol. 402, páginas. 656-660, 1999
[0023] Documento Não-Patentário 2: Tokihiro et al., J. Pharm. Pharmacol., vol. 52, páginas 911-917, 2000
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO PROBLEMAS A SEREM RESOLVIDOS PELA INVENÇÃO
[0024] Um peptídeo fisiologicamente ativo, grelinas são suscetíveis à digestão por proteases e portanto de preferência administrado por vias parenterais, em particular, por injeção. Mesmo quando grelinas são administradas por injeção, na administração subcutânea ainda é necessária garantir que a grelina injetada seja absorvida do local de injeção e alcance a circulação sangüínea. No entanto, em geral, a baixa BA de peptídeos injetados por via subcutânea dificulta a criação de injeções eficazes.
[0025] Atualmente estão sendo conduzidos estudos para determinar doses eficazes de grelina para obter um efeito farmacológico particular de acordo com a relação entre a quantidade administrada de drogas e o efeito farmacológico obtido como um índice. É necessário controlar o nível de drogas no sangue, assim como estabelecer uma tecnologia de preparação para aumentar a absorção da droga, para administração eficaz e segura de drogas.
[0026] Sabe-se que a BA de peptídeos injetados por via subcutânea geralmente é de cerca de 20% a 40%, que é menor que a BA de outras drogas. Examina-se a BA de grelina injetada por via subcutânea em ratos e macacos e verifica-se que BA de grelina foi significativamente menor que aquela de outros peptídeos injetados por via subcutânea: no máximo 5% em ratos e no máximo 3% em macacos. Nenhum estudo anterior relatou este fato.
[0027] Possíveis fatores para a mudança na taxa de BA de uma dada droga são a eficiência e a taxa de transferência da droga do local de aplicação para o sangue periférico vizinho. Estes fatores são dependentes de propriedades da droga e do local de aplicação, incluindo peso molecular, pKa e solubilidade em gordura e outras propriedades físico-químicas que determinam a difusibilidade da droga em líquidos e tecidos corporais e a permeabilidade da droga através de membranas biológicas, bem como a morfologia histológica e as propriedades fisiológicas do local de aplicação.
[0028] Uma BA baixa de uma dada droga deve ser compensada aumentando-se a dose e a freqüência de administração para atingir o nível plasmático eficaz da droga. Como isto representa um fardo significativo para os pacientes, é necessária uma tecnologia de preparação que aumente a BA da droga.
[0029] Por conseguinte, constitui um objetivo da presente invenção garantir uma alta BA de peptídeos ou proteínas fisiologicamente ativas, inclusive grelinas, estas são administradas como drogas, e oferecer uma preparação líquida eficaz dos peptídeos ou proteínas. Constitui um outro objetivo da invenção oferecer um método para aumentar a BA de peptídeos ou proteínas fisiologicamente ativas, inclusive grelinas, estas são injetadas por via subcutânea em soluções aquosas.
MEIOS PARA RESOLVER OS PROBLEMAS
[0030] Na tentativa de atingir esses objetivos, os presentes inventores examinaram o nível de grelinas no sangue depois de administração por injeção.
[0031] Especificamente, administra-se grelina junto com diferentes agentes auxiliares usados em injeções e monitora-se sua BA. Os agentes auxiliares usados incluíam manitol como agente isotônico, uréia como agente solubilizante e um tampão de acetato de sódio (pH 4,0). Estes agentes foram misturados com grelina e injetados por via subcutânea em ratos. Aconteceu que o tampão de acetato de sódio (pH 4,0) aumentou significativamente a BA em 35,3%. Não se observou qualquer aumento significativo na BA para os outros agentes testados: o maior aumento foi de 3,4% pela uréia.
[0032] Então administra-se grelina com soluções ácidas diferentes e monitoramos sua BA. Como resultado, a BA aumentou para cada solução testada.
[0033] Demonstra-se assim que a BA de grelina pode ser significativamente aumentada por injeção da mesma por via subcutânea com uma solução ácida.
[0034] Também demonstra-se que a BA de grelina pode ser controlada variando-se o tipo, a concentração e o pH da solução ácida. Também descobriu-se que a BA de grelina pode ser melhorada em um grau diferente dependendo do tipo de solução ácida. Isto sugere que fatores diferentes do tipo e do pH da preparação de grelina ou da solução de grelina estão envolvidos na melhora da BA de grelina.
[0035] Também descobriu-se que a BA de grelina é significativamente melhorada por injeção da mesma por via subcutânea com um líquido orgânico polar.
[0036] Também descobriu-se que o aumento na BA de grelina é mais significativo quando a grelina é administrada com a solução ácida e o líquido orgânico polar juntos do quando ela administrada com apenas um dos dois.
[0037] Também descobriu-se que a BA de grelina é significativamente aumentada por injeção da mesma por via subcutânea com a solução ácida e um açúcar, ou com o líquido orgânico polar e um açúcar.
[0038] Também descobriu-se que o poder da solução ácida e/ou do líquido orgânico polar e/ou do açúcar para aumentar a BA é observado não apenas com grelina, mas também com outros peptídeos ou proteínas fisiologicamente ativas para uso como drogas.
[0039] Por conseguinte, modalidades específicas da presente invenção compreendem o seguinte: (1) uma preparação líquida contendo um peptídeo fisiologicamente ativo ou uma proteína fisiologicamente ativa como ingrediente ativo em combinação com uma solução ácida; (2) a preparação líquida de acordo com o item (1) acima, onde a solução ácida compreende um ou uma combinação de dois ou mais selecionados do grupo que consiste em ácido acético, ácido láctico, ácido fosfórico, glicina, ácido cítrico, ácido clorídrico, ácido propiônico, ácido butírico, ácido benzóico e sais dos mesmos; (3) a preparação líquida de acordo com o item (1) acima, onde a solução ácida compreende um ou uma combinação de dois ou mais selecionados do grupo que consiste em ácido acético, ácido láctico, ácido propiônico, ácido butírico e/ou ácido fosfórico, e sais dos mesmos; (4) a preparação líquida de acordo com o item (1) ou (2) acima, tendo um pH na faixa de 3,0 a 7,0; (5) a preparação líquida de acordo com qualquer um dos itens (1) a (3) acima, onde a concentração da solução ácida varia de 1 a 1000 mM; (6) a preparação líquida de acordo com qualquer um dos itens (1) a (3) acima, onde a concentração da solução ácida varia de 10 a 500 mM; e (7) a preparação líquida de acordo com qualquer um dos itens (1) a (6) acima, onde a solução ácida é um tampão ácido tendo um pH na faixa de 3,0 a 7,0.
[0040] Outras modalidades da presente invenção compreendem o seguinte: (8) uma preparação líquida compreendendo um peptídeo fisiologicamente ativo ou uma proteína fisiologicamente ativa como ingrediente ativo em combinação com um líquido orgânico polar; (9) a preparação líquida de acordo com qualquer dos itens (1) a (7) acima, contendo um peptídeo fisiologicamente ativo ou uma proteína fisiologicamente ativa como ingrediente ativo em combinação com um líquido orgânico polar; (10) a preparação líquida de acordo com o item (8) ou (9) acima, onde o líquido orgânico polar é um ou uma combinação de dois ou mais selecionados do grupo que consiste em um álcool e/ou N-metil- 2-pirrolidona, dimetilformamida, dimetil sulfóxido e metilparabeno; (11) a preparação líquida de acordo com o item (8) ou (9) acima, onde o líquido orgânico polar é um ou uma combinação de dois ou mais selecionados do grupo que consiste em um álcool benzílico, etanol, fenol, terc-butanol, clorobutanol, N-metil-2-pirrolidona, dimetilformamida e dimetil sulfóxido; (12) a preparação líquida de acordo com qualquer um dos itens (8) a (11) acima, onde a concentração do líquido orgânico polar varia de 0,001 a 80% (p/v); (13) a preparação líquida de acordo com qualquer um dos itens (8) a (11) acima, onde a concentração do líquido orgânico polar varia de 0,1 a 10% (w/v); (14) a preparação líquida de acordo com qualquer um dos itens (1) a (7) acima, contendo ainda um açúcar. (15) a preparação líquida de acordo com qualquer um dos itens (8) a (12) acima, contendo ainda um açúcar; (16) a preparação líquida de acordo com qualquer um dos itens (1) a (7) acima, contendo ainda um líquido orgânico polar e um açúcar; (17) a preparação líquida de acordo com qualquer um dos itens (14) a (16) acima, onde o açúcar é um ou uma combinação de dois ou mais selecionados do grupo que consiste em manitol, sacarose, glicose e ciclodextrina; (18) a preparação líquida de acordo com qualquer um dos itens (14) a (17) acima, onde o açúcar é ciclodextrina; e (19) a preparação líquida de acordo com qualquer um dos itens (14) a (17) acima, onde a concentração do açúcar varia de 0,1 a 20% (p/v).
[0041] Modalidades mais específicas da presente invenção compreendem o seguinte: (20) a preparação líquida de acordo com qualquer um dos itens (1) a (19) acima, onde o peptídeo fisiologicamente ativo ou a proteína fisiologicamente ativa é um selecionado do grupo que consiste em grelinas, peptídeo-1 semelhante ao glicogênio humano (hGLP-1), peptídeo natriurético atrial humano (hANP), adrenomedulina humana, hormônio paratireóideo humano (hPTH(1-34)) e insulina humana; (21) a preparação líquida de acordo com qualquer um dos itens (1) a (19) acima, onde o peptídeo fisiologicamente ativo ou a proteína fisiologicamente ativa é uma das grelinas; (22) a preparação líquida de acordo com qualquer um dos itens (1) a (19) acima, onde a uma das grelinas é grelina; (23) a preparação líquida de acordo com qualquer um dos itens (1) a (19) acima, onde a grelina é grelina humana; (24) a preparação líquida de acordo com qualquer um dos itens (1) a (19) acima, onde a concentração das grelinas varia de 0,03 nmol/ml a 15 mmol/ml. (25) a preparação líquida de acordo com qualquer um dos itens (1) a (24) acima, para uso como injeção; e (26) a preparação líquida de acordo com o item (25), para uso como injeção subcutânea ou injeção intramuscular.
[0042] Modalidades ainda mais específicas da presente invenção compreendem o seguinte: (27) uma preparação líquida, compreendendo: grelinas como ingrediente ativo; uma solução ácida compreendendo um ou uma combinação de dois ou mais selecionados do grupo que consiste em ácido acético, ácido láctico, ácido propiônico, ácido butírico e/ou ácido fosfórico; e um líquido orgânico polar compreendendo um ou uma combinação de dois ou mais selecionados do grupo que consiste em álcool benzílico, etanol, fenol, terc-butanol, N-metil-2-pirrolidona, dimetilformamida e dimetil sulfóxido, onde a preparação líquida tem um pH na faixa de 3,0 a 7,0; e (28) um método para aumentar a biodisponibilidade de grelinas, compreendendo adicionar uma solução ácida e um líquido orgânico polar a uma solução aquosa de grelinas. Efeito da Invenção
[0043] De acordo com a presente invenção, é oferecida uma preparação líquida eficaz que alcança alta biodisponibilidade (BA) de peptídeos ou proteínas fisiologicamente ativas, inclusive grelinas, estes são administrados como drogas.
[0044] Também é oferecido um método para aumentar a BA de peptídeos ou proteínas fisiologicamente ativas, inclusive grelinas, estes são injetados em soluções aquosas por via subcutânea.
[0045] Portanto, a presente invenção torna possível manter o nível sangüíneo de peptídeos ou proteínas fisiologicamente ativas, inclusive grelinas, que são injetados por via subcutânea: até o momento, era considerado difícil manter níveis plasmáticos terapeuticamente eficazes de peptídeos e proteínas injetados por via subcutânea. A presente invenção por conseguinte é de grande importância médica.
MELHOR MODO PARA REALIZAR A INVENÇÃO
[0046] A preparação líquida da presente invenção contendo como ingrediente ativo um peptídeo ou proteína fisiologicamente ativa, tal como grelinas, será agora descrita detalhadamente, assim como o método para aumentar a BA de um peptídeo ou proteína fisiologicamente ativa.
[0047] Grelinas para uso na presente invenção são secretagogos de hormônios de crescimento (GHS) endógenos. Eles são peptídeos que agem para aumentar o nível intracelular de íons de cálcio e para induzir a secreção de hormônio de crescimento. O termo "grelinas" conforme aqui usado abrange todos os derivados de grelina que resultam de inserção, deleção, substituição e/ou adição na seqüência de aminoácidos do esqueleto peptídico de grelina que ocorre naturalmente em animais e que possuem atividades fisiológicas equivalentes à da grelina natural.
[0048] A grelina natural para uso na presente invenção é de preferência uma grelina natural derivada de homem, rato, porco, galinha, enguia, vaca, cavalo, carneiro, rã, truta e cachorro. Derivados de grelina adequados para uso na presente invenção incluem aqueles nos quais o resíduo serina na posição não é acilado com um grupo octanoil, mas com um ácido graxo tendo 4 a 12 átomos de carbono, ou des-octanoil grelina que não tem a modificação octanoil no resíduo serina na posição 3.
[0049] A grelina humana é de preferência usada quando a preparação líquida é destinada à administração a pacientes humanos.
[0050] As grelinas podem ser oferecidas na forma de um peptídeo livre ou de um sal. Grelinas na forma de peptídeo livre e na forma de sal podem ser convertidas na outra forma por técnicas comuns. O peptídeo livre pode ser convertido em um sal farmaceuticamente aceitável por reação do mesmo com um ácido inorgânico ou com um ácido orgânico. Exemplos do sal farmaceuticamente aceitável incluem sais formados com ácidos inorgânicos tais como carbonatos, bicarbonatos, cloridratos, sulfatos, nitratos e boratos, e sais formados com ácidos orgânicos, tais como succinatos, acetatos, propionatos e trifluoracetatos.
[0051] O peptídeo também pode formar sais com bases inorgânicas incluindo metais alcalinos tais como sódio e potássio e metais alcalino- terrosos tais como cálcio e magnésio, ou com bases orgânicas incluindo aminas orgânicas tal como trietilamina, e aminoácidos básicos tal como arginina. O peptídeo também pode formar um complexo metálico (tal como complexo de cobre e complexo de zinco).
[0052] As grelinas para uso na presente invenção podem ser de qualquer origem: ela pode ser isolada de matérias-primas naturais, ou podem ser obtidas por técnicas comuns tais como síntese química, semi-síntese química, recombinação genética ou combinações destas técnicas. Alternativamente, elas podem ser extraídas de organismos vivos. Um exemplo de tal técnica está descrito no Documento de Patente 1.
[0053] Grelinas podem ser usadas na preparação líquida da presente invenção em qualquer concentração adequada para uso em produtos farmacêuticos. Especificamente, a concentração mais baixa de grelinas é definida como a concentração na qual elas podem fornecer o efeito desejado como produtos farmacêuticos ao passo que a concentração mais alta é definida como a concentração na qual elas podem se dissolver completamente em uma solução aquosa. A concentração de grelinas na preparação líquida está de preferência na faixa comumente usada de cerca de 0,03 nmol/ml a cerca de 15 mmol/ml, e mais preferivelmente na faixa de cerca de 0,03 nmol/ml a cerca de 6 μmol/ml.
[0054] A solução ácida para uso na preparação líquida da presente invenção é uma solução de um composto contendo carboxila. Exemplos das soluções ácidas incluem ácido acético, ácido láctico, ácido cítrico, ácido clorídrico, ácido propiônico, ácido butírico, ácido benzóico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido bórico, ácido carbônico, ácido bicarbônico, ácido glicônico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido maléico, ácido metanossulfônico, ácido málico, ácido trifluoracético e sais dos mesmos. A solução ácida pode conter um ou uma combinação de dois ou mais selecionados do grupo que consiste nos sais desses ácidos. De preferência, a solução ácida contém um ou uma combinação de dois ou mais selecionados do grupo que consiste em ácido acético, ácido láctico, ácido fosfórico, glicina, ácido cítrico, ácido clorídrico, ácido propiônico, ácido butírico, ácido benzóico e sais dos mesmos. Mais preferivelmente, a solução ácida contém um ou uma combinação de dois ou mais selecionados do grupo que consiste em ácido acético, ácido láctico, ácido propiônico, ácido butírico e/ou ácido fosfórico, e sais dos mesmos.
[0055] A concentração da solução ácida pode ser qualquer concentração que possa aumentar a BA de grelina: ela está de preferência na faixa de 1 mM a 1000 mM e mais preferivelmente na faixa de 10 mM a 500 mM.
[0056] É preferível que a alteração no pH da solução aquosa seja mantida a menor possível para garantir a estabilidade de grelinas durante o armazenamento. Para tanto, pode-se usar um tampão. O tampão de preferência tem um pH na faixa de 3,0 a 7,0. Embora o pH da preparação fique estabilizado depois da adição do tampão, o pH pode variar em cerca de 0,1 a cerca de 0,2 devido à concentração do tampão usado ou em condições específicas. Tal variação está abrangida pela presente invenção.
[0057] Exemplos específicos do tampão para uso na presente invenção incluem tampão de ácido acético (incluindo tampão de acetato de sódio e tampão de amônio), tampão de ácido láctico, tampão de ácido fosfórico (incluindo tampão de fosfato de sódio), tampão de cloridrato de glicina, tampão de ácido cítrico (incluindo tampão de citrato de sódio), tampão de ácido cítrico-ácido fosfórico (incluindo tampão de Mcilvaine), tampão de ácido fosfórico-ácido acético-ácido bórico (incluindo tampão de Britton-Robinson), tampão de ácido ftálico e tampão de ácido propiônico. Estes tampões podem ser usados individualmente ou em combinação. Tampão de ácido acético, tampão de ácido butírico, tampão de ácido propiônico, tampão de ácido láctico e/ou tampão de fosfórico são particularmente adequados para uso na presente invenção.
[0058] A preparação líquida de preferência tem um pH na faixa de 3,0 a 7,0 e mais preferivelmente na faixa de 4,0 a 7,0. Embora a preparação líquida com um pH menor que 3,0 possa aumentar a BA de grelina, ela causar dor especialmente quando usada como injeção e é indesejável.
[0059] Além do tampão acima descrito, um ajustador de pH pode ser usado para ajustar o pH da preparação líquida da presente invenção. Exemplos do ajustador de pH incluem ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido bórico, ácido carbônico, ácido bicarbônico, ácido glicônico, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, amônia aquosa, ácido cítrico, monoetanolamina, ácido láctico, ácido acético, ácido succínico, ácido fumárico, ácido maléico, ácido fosfórico, ácido metanossulfônico, ácido málico, ácido propiônico, ácido trifluoracético e sais dos mesmos.
[0060] Além do ajustador de pH, um líquido orgânico polar pode ser usado na presente invenção. A adição do líquido orgânico polar serve para aumentar a BA da grelina injetada por via subcutânea mais do que seria possível com a solução ácida isolada. Descobriu-se que a adição de um líquido orgânico polar, tal como um álcool, à preparação líquida da presente invenção pode aumentar a BA de grelina ou modular o padrão de absorção de grelina.
[0061] Injeções devem ser estéreis. Um conservante ou um esterilizante pode ser adicionado a uma injeção especialmente quando a injeção é usada em usos múltiplos. Exemplos do aditivo usado com esta finalidade incluem álcool benzílico, clorobutanol, fenol e paraoxibenzoatos.
[0062] Como a administração de injeções geralmente é acompanhada de dor, uma injeção pode conter um aliviador de dor para aliviar a dor. Exemplos do aditivo usado com esta finalidade incluem álcool benzílico, clorobutanol, fenol e anestésicos locais tais como procaína e xilocaína.
[0063] O Documento de Patente 4 descreve uma injeção que contém, além de um ingrediente ativo, álcool benzílico ou seu análogo como aliviador de dor, e ciclodextrina. Álcool benzílico é usado para reduzir a dor associada com injeção. Álcool benzílico ou seu análogo é usado para prevenir a hemólise causada pelo álcool benzílico.
[0064] Álcoois são frequentemente usados como preservativos, esterilizantes ou aliviadores de dor. Os presentes inventores descobriram que álcoois e outros líquidos orgânicos polares intensificam o poder da solução ácida de aumentar a BA de grelina na preparação líquida. Nenhum estudo anterior relatou este fenômeno único.
[0065] Exemplos do álcool para uso na presente invenção incluem álcool benzílico, clorobutanol, fenol, metanol, etanol, propanol, butanol, isopropanol, 2-butanol, isobutanol, cresol, m-cresol, clorocresol, paraoxibenzoatos (tais como metilparabeno e etilparabeno), inositol, propileno glicol, butileno glicol, cetanol, álcool estearílico, hexildecanol, hexanotriol, álcool beenílico, álcool laurílico, álcool de lanolina, glicerol (glicerina), etileno glicol, dietileno glicol, éter monobutílico de dietileno glicol, éter monometílico de dietileno glicol, mentol, borneol, maltol, etilmaltol, eugenol, geraniol, timol, diisopropanolamina, dietanolamina e trometamol. Álcool benzílico, etanol, fenol, terc-butanol e clorobutanol são particularmente adequados para uso na presente invenção.
[0066] À parte de álcoois, certos líquidos orgânicos polares, tais como N-metil-2-pirrolidona, dimetilformamida, dimetil sulfóxido e metilparabeno, também servem para aumentar a BA de grelina.
[0067] Esses líquidos orgânicos polares podem ser usados individualmente ou em combinação. O líquido orgânico polar pode ser usado em qualquer quantidade proporcione seu efeito desejado e que não cause quaisquer problemas durante a produção e armazenamento prolongado das drogas da presente invenção. A quantidade do líquido orgânico polar é tal que a preparação líquida seja transformada em uma solução para administração, a concentração do líquido orgânico polar na solução está tipicamente na faixa de 0,001 a 80% (p/v) e de preferência na faixa de 0,1 a 20% (p/v).
[0068] Outros aditivos também podem ser adicionados à preparação líquida da presente invenção dependendo da finalidade desejada. Entre estes aditivos estão agentes isotônicos, tal como cloreto de sódio e manitol, estabilizantes, tal como benzoato de sódio, antioxidantes, tal como bissulfito de sódio, pirossulfito de sódio e ácido ascórbico, e aliviadores de dor, tal como cloridrato de lidocaína e cloridrato de meprilcaína.
[0069] Como descrito, a presente invenção oferece uma preparação líquida que contém como ingrediente ativo um peptídeo ou proteína fisiologicamente ativa, inclusive grelinas, e que garante alta BA. Aditivos podem ser adicionados à preparação líquida para proporcionar as propriedades requeridas para cada preparação. Por exemplo, certos aditivos são adicionados a injeções para proporcionar pressão osmótica ótima, solubilidade ótima, pouca irritação, alto efeito esterilizante e prevenção de adsorção.
[0070] A preparação líquida de acordo com a presente invenção é destinada à administração parenteral. Especificamente, ela destina-se à administração por injeção, infusão e nasal. Embora a presente invenção possa ser aplicada a diferentes tipos de injeção, que incluem injeção intravenosa, injeção subcutânea, injeção intracutânea, injeção intramuscular e infusão por gotejamento intravenoso, o aumento na BA é mais significativo na injeção subcutânea e na injeção intramuscular.
[0071] A preparação líquida da presente invenção pode ser produzida por processos comumente usados na produção de produtos farmacêuticos. Em um processo exemplificativo, um produto liofilizado de um peptídeo ou proteína fisiologicamente ativa, inclusive grelinas, é dissolvido em água purificada para formar uma solução de droga. Enquanto isso, um tampão e outros aditivos são dissolvidos em água purificada para formar uma solução de aditivo. A solução de droga e a solução de aditivo são misturadas e a mistura é processada conforme necessário (por exemplo, esterilização e filtração. A mistura processada é vedada em ampolas ou frascos para obter um produto acabado de preparação de grelina.
[0072] Injeções são geralmente oferecidas na forma de uma preparação que é transformada em uma solução para uso. Este tipo de preparação é desejável quando é difícil manter a estabilidade dos ingredientes ativos na forma de uma solução. A presente invenção também abrange a preparação dissolvida para uso que pode ser transformada em uma preparação líquida contendo como ingrediente ativo um peptídeo ou proteína fisiologicamente ativa, inclusive grelinas. A preparação dissolvida para uso pode ser produzida por um dos dois procedimentos: os aditivos acima descritos são apropriadamente selecionados e adicionados em quantidades desejadas a um produto de grelina sólido, tal como grelina em pó, para formar uma composição sólida, ou os aditivos acima descritos são apropriadamente selecionados e adicionados em quantidades desejadas a uma solução aquosa de grelinas para formar uma composição líquida, que por sua vez é secada para fazer uma composição sólida. Para uso, estas composições sólidas são dissolvidas em um solvente tal como água para formar uma preparação líquida. Solventes diferentes de água, tal como etanol e 2-propanol, também podem ser usados em quantidades farmaceuticamente aceitáveis.
[0073] Um açúcar também pode ser adicionado à preparação da presente invenção quando o peptídeo ou proteína fisiologicamente ativa, inclusive grelinas, é fornecido na forma de uma composição sólida. Descobriu-se que, quando usado junto com a solução ácida e/ou o líquido orgânico polar, o açúcar serve para aumentar ainda mais a BA do peptídeo ou proteína fisiologicamente ativa, inclusive grelinas.
[0074] Exemplos do açúcar para uso na presente invenção incluem monossacarídeos, tal como manitol, glicose, frutose, inositol, sorbitol e xilitol; dissacarídeos, tal como açúcar branco (sacarose), lactose, maltose e trealose; polissacarídeos, tal como amido, dextrana, pululana, ácido algínico, ácido hialurônico, ácido péctico, ácido fítico, fitina, quitina e quitosano; dextrinas, tal como α-ciclodextrina, β-ciclodextrina, y- ciclodextrina, dextrina, amido hidroxipropílico e amido hidroxietílico; e celuloses, tal como metil celulose, etil celulose, hidroxietil celulose, hidroxipropil celulose, hidroxipropilmetil celulose e carboximetil celulose sódica. Estes açúcares podem ser usados isoladamente ou em combinação.
[0075] Destes açúcares, manitol, sacarose, glicose e ciclodextrina são particularmente preferidos para uso na presente invenção com ciclodextrina sendo a mais preferida.
[0076] Foi relatado que, de diferentes ciclodextrinas, derivados de sulfobutil éter β-ciclodextrina (β-CyDs) agem para aumentar a BA de insulina injetada por via subcutânea em ratos (Documento Não- Patentário 2).
[0077] Bem se sabe que quando adicionadas a produtos farmacêuticos, as ciclodextrinas melhoram a solubilidade compostos menos solúveis em água e a estabilidade ao armazenamento dos produtos farmacêuticos.
[0078] O Documento de Patente 6 descreve uma preparação contendo um interferon polipeptídeo e sulfoalquil éter ciclodextrina. Nesta preparação, o derivado de sulfoalquil éter ciclodextrina serve como estabilizante da composição e ajuda a manter a atividade biológica do interferon polipeptídeo.
[0079] O Documento de Patente 7 descreve uma preparação nasal contendo um polipeptídeo fisiologicamente ativo e ciclodextrina ao passo que o Documento de Patente 8 descreve uma preparação vaginal contendo um polipeptídeo fisiologicamente ativo e ciclodextrina. A preparação nasal e a preparação vaginal são, cada uma, desenvolvidas como preparação não injetável que facilita a absorção de mucosa do polipeptídeo fisiologicamente ativo, que do contrário seria hidrolisado pelas enzimas presentes no lúmen ou parede gastrointestinal. Nestas preparações, a ciclodextrina age para facilitar a absorção de polipeptídeos fisiologicamente ativos.
[0080] O Documento de Patente 9 descreve um método para solubilizar e estabilizar interferon e outras proteínas com a ajuda de β- e y-ciclodextrinas. No entanto, nenhuma dessas literaturas sugere ou descreve como aumentar a BA de peptídeos ou proteínas fisiologicamente ativas injetados por via subcutânea.
[0081] Esses açúcares podem ser usados isoladamente ou em combinação. O açúcar pode ser usado em qualquer quantidade que proporcione seu efeito desejado, que não cause problemas durante a produção e o armazenamento prolongado da droga, e que ofereça à preparação líquida uma viscosidade apropriada que não cause problemas durante a produção e administração da preparação líquida. Por exemplo, a quantidade de açúcar é tal que a preparação líquida em transformada em uma solução para administração, a concentração do açúcar na solução está na faixa de 0,1 a 20% (p/v).
[0082] Como mencionado, a presente invenção demonstra que a adição de uma solução ácida, um líquido orgânico polar ou um açúcar a uma preparação líquida contendo um peptídeo ou proteína fisiologicamente ativa pode aumentar significativamente a BA do peptídeo ou proteína mesmo quando a preparação é injetada por via subcutânea. Exemplos do peptídeo ou proteína fisiologicamente ativa para uso na presente invenção incluem grelina e derivados e análogos da mesma, peptídeo-1 semelhante ao glicogênio humano (hGLP-1), peptídeo natriurético atrial humano (hANP), adrenomedulina humana, hormônio paratireóideo humano (hPTH(1-34)) e insulina humana. A presente invenção oferece uma nova maneira de administrar por via subcutânea peptídeos ou proteínas fisiologicamente ativas, tais como grelinas, que de outra forma não podem ser administradas por via subcutânea para atingir níveis plasmáticos farmaceuticamente eficazes. EXEMPLOS
[0083] A presente invenção será agora descrita em maiores detalhes com referência aos exemplos, que não se destinam a limitar o escopo da invenção de forma alguma.
[0084] As abreviações usadas nos exemplos a seguir têm os significados descritos abaixo. A menos que de outro modo especificado, os seguintes métodos e instrumentos foram usados nos testes. [Instrumentos usados] (A) Medição do pH
[0085] Instrumento: medidor de pH F-22 CASTANY LAB, Horiba Ltd. (B) Radioimunoensaio (RIA)
[0086] Instrumento: contador y COBRA-II, Packard Instruments Co., Ltd. (C) Ensaio imunossolvente ligado à enzima (ELISA)
[0087] Instrumento: Leitora de microplaca, Molecular Devices Corp. Exemplo Comparativo 1: Preparação de preparações contendo grelina humana (1)
[0088] Grelina humana foi dissolvida em uma solução aquosa de manitol a 5% (p/v), em solução salina fisiológica ou em uma solução aquosa de sacarose a 10% (p/v) em diferentes concentrações como mostrado na Tabela 2 abaixo para fazer as Preparações N° 1 a 5 e N° 34 e 35. (Tabela 2)
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Exemplo 1: Preparação de preparações contendo grelina humana (2)
[0089] Os seguintes tampões foram preparados da maneira descrita abaixo: tampão de acetato de sódio 0,5 M, tampão de acetato de amônio 0,5 M, tampão de ácido acético 0,5 M, tampão de fosfato de sódio 0,5 M, tampão de ácido cítrico 0,5 M, tampão de cloridrato de glicina 0,5 M, tampão de ácido láctico 1 M, tampão de ácido propiônico 0,06 M e tampão de ácido n-butírico 0,06 M. O pH de cada tampão está mostrado entre parênteses. (1) tampão de acetato de sódio 0,5 M (pH 7,0)
[0090] Água purificada foi adicionada a 8,20 g de acetato de sódio (PM = 82,03) até dar um volume de 100 ml. A esta solução, ácido clorídrico 1 M foi adicionado para dar um pH de 7,0. Água purificada foi ainda adicionada para dar um volume final de 200 ml. (2) tampão de acetato de sódio 0,5 M (pH 4,0)
[0091] Água purificada foi adicionada a 8,20 g de acetato de sódio (PM = 82,03) até dar um volume de 100 ml. A esta solução, ácido clorídrico 1 M foi adicionado para dar um pH de 4,0. Água purificada foi ainda adicionada para dar um volume final de 200 ml. (3) tampão de acetato de sódio 0,5 M (pH 5,0)
[0092] Água purificada foi adicionada a 8,20 g de acetato de sódio (PM = 82,03) até dar um volume de 100 ml. A esta solução, ácido clorídrico 1 M foi adicionado para dar um pH de 5,0. Água purificada foi ainda adicionada para dar um volume final de 200 ml. (4) tampão de acetato de sódio 0,5 M (pH 6,0)
[0093] Água purificada foi adicionada a 8,20 g de acetato de sódio (PM = 82,03) até dar um volume de 100 ml. A esta solução, ácido clorídrico 1 M foi adicionado para dar um pH de 6,0. Água purificada foi ainda adicionada para dar um volume final de 200 ml. (5) tampão de acetato de amônio 0,5 M (pH 4,0)
[0094] Água purificada foi adicionada a 7,71 g de acetato de amônio (PM = 77,08) até dar um volume de 100 ml. A esta solução, ácido clorídrico 1 M foi adicionado para dar um pH de 4,0. Água purificada foi ainda adicionada para dar um volume final de 200 ml. (6) tampão de ácido acético 0,5 M (pH 4,0)
[0095] Água purificada foi adicionada a 6,01 g de ácido acético (PM = 60,05) até dar um volume de 100 ml. A esta solução, hidróxido de sódio foi adicionado para dar um pH de 4,0. Água purificada foi ainda adicionada para dar um volume final de 200 ml. (7) tampão de fosfato de sódio 0,5 M (pH 4,0)
[0096] Água purificada foi adicionada a 15,60 g de fosfato diácido de sódio dihidratado (PM = 156,01) até dar um volume de 100 ml. A esta solução, ácido clorídrico 1 M foi adicionado para dar um pH de 4,0. Água purificada foi ainda adicionada para dar um volume final de 200 ml. (8) tampão de fosfato de sódio 0,5 M (pH 5,0)
[0097] Água purificada foi adicionada a 15,60 g de fosfato diácido de sódio dihidratado (PM = 156,01) até dar um volume de 100 ml. A esta solução, hidróxido de sódio 1 M foi adicionado para um pH de 5,0. Água purificada foi ainda adicionada para dar um volume final de 200 ml. (9) tampão de ácido cítrico 0,5 M (pH 4,0)
[0098] Água purificada foi adicionada a 10,51 g de ácido cítrico monohidratado (PM = 210,14) para fazer 100 ml de ácido cítrico aquoso. Enquanto isso, água purificada foi adicionada a 14,71 g de citrato trissódico (PM = 294,10) para fazer 100 ml de uma solução aquosa de citrato trissódico. O ácido cítrico aquoso e a solução aquosa de citrato trissódico foram misturados para obter o tampão desejado com um pH de 4,0. (10) tampão de cloridrato de glicina 0,5 M (pH 4,0)
[0099] Água purificada foi adicionada a 7,51 g de glicina (PM = 75,07) até dar um volume de 100 ml. A esta solução, ácido clorídrico 1 M foi adicionado para dar um pH de 4,0. Água purificada foi ainda adicionada para dar um volume final de 200 ml. (11) tampão de ácido láctico 1 M (pH 4,0)
[00100] Água purificada foi adicionada a 45,04 g de ácido láctico (PM = 90,08) para dar um volume de 250 ml. A esta solução, hidróxido de sódio 1 M foi adicionado para um pH de 4,0. Água purificada foi ainda adicionada para dar um volume final de 500 ml. (12) tampão de ácido propiônico 0,06 M (pH 4,0)
[00101] Água purificada foi adicionada a 2,22 g de ácido propiônico (PM = 74,08) para dar um volume de 250 ml. A esta solução, hidróxido de sódio 1 M foi adicionado para um pH de 4,0. Água purificada foi ainda adicionada para dar um volume final de 500 ml. (13) tampão de ácido n-butírico 0,06 M (pH 4,0)
[00102] Água purificada foi adicionada a 2,64 g de ácido butírico (PM = 88,11) para dar um volume de 250 ml. A esta solução, hidróxido de sódio 1 M foi adicionado para um pH de 4,0. Água purificada foi ainda adicionada para dar um volume final de 500 ml.
[00103] Estes tampões ou soluções obtidas por diluição dos tampões foram usados como soluções ácidas. As solução ácidas, grelina humana e aditivos opcionais foram misturados para fazer as Preparações N° 6 a 33, N° 51 a 59, N° 73, e N° 81 a 97, contendo grelina humana nas concentrações mostradas na Tabela 3. (Tabela 3.1)
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(Tabela 3.2)
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(Tabela 3.3)
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[00104] Os tampões acima ou soluções obtidas por diluição dos tampões foram usados como soluções ácidas. As soluções ácidas, diferentes peptídeos e aditivos opcionais foram misturados para fazer as Preparações N° 36 a 50 e N° 98 a 107, contendo peptídeo nas concentrações mostradas na Tabela 4. (Tabela 4.1)
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(Tabela 4.2)
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[00105] Grelina humana e aditivos foram misturados sem soluções ácidas para fazer as Preparações N° 60 a 68, N° 70 a 72, N° 74, N° 76, e N° 78 a N° 80. (Tabela 5)
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[00106] Alguns dos aditivos farmacêuticos usados nas Preparações acima descritas estão listados na Farmacopéia Japonesa. Todos esses aditivos satisfazem aos padrões especificados na Farmacopéia Japonesa. Exemplo Comparativo 2: Farmacocinética de grelinas injetadas por via intravenosa e por via subcutânea em ratos
[00107] As preparações N° 2 e N° 3 obtidas no Exemplo Comparativo 1 foram administradas por via intravenosa e por via subcutânea a ratos e os níveis plasmáticos de grelina foram medidos.
[00108] Foram usados ratos SD machos, com 7 semanas de idade (Charles River Laboratories Japan Inc.). Um grupo de três ratos foi usado para os testes. Para administração intravenosa, três animais tendo cada um um tubo de polietileno (PE-50, Clay Adams Co., Ltd.) inserido na artéria femoral foram administrados. A preparação No 2 através da veia terminal a uma dose de 0,5 ml/kg usando uma seringa e uma agulha 26G (ambas disponíveis na Terumo Co., Ltd.). Amostras de sangue foram coletadas do tubo de polietileno na artéria femoral antes da administração e 1, 3, 5, 10, 20, 30, 60 e 90 minutos após a administração.
[00109] Igualmente, três animais, cada um com um tubo de polietileno inserido na artéria femoral, receberam por via subcutânea a preparação No 3 na pele dorsal a uma dose de 1 ml/kg usando uma seringa e uma agulha 26G. Amostras de sangue foram coletadas do tubo de polietileno na artéria femoral antes da administração e 5, 10, 20 e 30 minutos após a administração.
[00110] A cada amostra, um centésimo de uma solução de EDTA.2Na.2H2O e um cinqüenta avos de uma solução de AEBSF foram adicionados imediatamente após a coleta da amostra. A amostra foi então centrifugada para separar o plasma, ao qual um décimo de ácido clorídrico 1 N foi adicionado imediatamente. A amostra foi misturada e armazenada a -80oC até análise.
[00111] As amostras de plasma foram então analisadas quanto aos níveis de grelina por radio-imunoensaio (RIA) usando um anticorpo antigrelina. Especificamente, o anticorpo antigrelina e depois [125I- Tyr29]grelina foram adicionados a cada amostra de plasma para competição. Em seguida, um segundo anticorpo foi adicionado para precipitar o complexo de anticorpo-grelina. O sobrenadante foi separado e analisado quanto à radioatividade por um contador y (Packard Instruments Co., Ltd.). Como o anticorpo antigrelina usado no ensaio reconhece especificamente a grelina, mas não a des-acil grelina (uma forma inativa de grelina que não possui um grupo octanoíla), o ensaio pode detectar especificamente a grelina ativa.
[00112] A figura 1 mostra as alterações nas concentrações plasmáticas de grelina ao longo do tempo. Os resultados mostrados na figura 1 foram usados para determinar os seguintes parâmetros farmacocinéticos para cada via de injeção: a concentração plasmática máxima de grelina (Cmax) e o tempo transcorrido até ser alcançada a concentração plasmática máxima (Tmax). A concentração (C0) no tempo 0 foi extrapolada para administração intravenosa. Usando o método trapezoidal, também foi calculada a área sob a curva de concentração (AUC) para cada via de injeção. As AUCs foram então usadas para determinar a biodisponibilidade (BA) de grelina. Os resultados são mostrados na Tabela 6. Esses valores foram obtidos como médias dos dados obtidos para os três ratos em cada grupo. Tabela 6: Parâmetros farmacocinéticos de preparações de grelina administradas por via intravenosa ou por via subcutânea a ratos com uma solução aquosa de manitol a 5%. (Tabela 6)
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[00113] Como se pode ver dos resultados mostrados na Tabela 6, a AUC para a administração intravenosa da preparação N° 2 a uma dose de 10 mg/kg foi determinada como sendo igual a 205,98 ng.min/ml, ao passo que a AUC para administração subcutânea da preparação de N° 3 a uma dose de 50 mg/kg foi determinada como sendo igual a 25,72 ng.min/ml. Assim, a BA de grelina humana dissolvida em uma solução aquosa de manitol a 5% foi determinada como sendo igual a 2,5%. Exemplo 2: Efeitos de tampões de acetato de sódio sobre a farmacocinética de grelina injetada por via subcutânea em ratos
[00114] Como no Exemplo Comparativo 2, as Preparações N° 34, N° 6 e N° 7 foram administradas por via subcutânea a uma dose de 1 mg/kg e os níveis plasmáticos de grelina foram medidos pelo método de RIA. Os resultados são mostrados na figura 2. Os parâmetros farmacocinéticos são mostrados na Tabela 7 abaixo. Tabela 7: Parâmetros farmacocinéticos de preparações de grelina administradas por via subcutânea a ratos (efeitos do tampão de acetato de sódio) (Tabela 7)
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[00115] Como se pode ver dos resultados da Tabela 7, as BAs obtidas para as Preparações N° 6 e N° 7 foram 22,9% e 35,3%, respectivamente. Estas foram surpreendentemente altas em comparação com a BA para a Preparação N° 34 com solução salina fisiológica (5,0%) e para a BA para a Preparação N° 3 com uma solução aquosa de manitol a 5% (p/v) (2,5%): independente do pH do tampão de acetato de sódio 0,5 M, a BA de grelina foi significativamente aumentada pela adição do tampão de acetato de sódio. Com o tampão de acetato de sódio, a BA foi 9 a 14 vezes maior que a BA obtida para a solução aquosa de manitol a 5% (p/v). Exemplo 3: Efeitos do tipo de solução ácida sobre a farmacocinética de grelina injetada por via subcutânea em ratos
[00116] Como no Exemplo Comparativo 2, as Preparações N° 7, N° 8, N° 9, N° 10 e N° 11 foram administradas por via subcutânea a uma dose de 1 ml/kg e os níveis plasmáticos de grelina foram medidos pelo método de RIA. Os parâmetros farmacocinéticos são mostrados na Tabela 8 abaixo. Tabela 8: Parâmetros farmacocinéticos de grelina como preparações administradas por via subcutânea a ratos (Efeitos do tipo de solução ácida) (Tabela 8)
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[00117] As BAs obtidas para as Preparações N° 7, N° 8, N° 9, N° 10 e N° 11 foram 35,3%, 20,9%, 7,0%, 8,9% e 16,3%, respectivamente. Assim, a BA de grelina foi significativamente aumentada em qualquer uma das soluções de tampão ácidas, cada um tendo um pH de 4,0, em comparação com a BA para a solução aquosa de manitol a 5% (p/v). Exemplo 4: Efeitos da concentração de solução ácida sobre a farmacocinética de grelina injetada por via subcutânea em ratos
[00118] Como no Exemplo Comparativo 2, as Preparações N° 12, N° 13, N° 14 e N° 15 foram administradas por via subcutânea a uma dose de 1 ml/kg e os níveis plasmáticos de grelina foram medidos pelo método de RIA.
[00119] Os parâmetros farmacocinéticos são mostrados na Tabela 9 abaixo. Tabela 9: Parâmetros farmacocinéticos de grelina como preparações administradas por via subcutânea a ratos (Efeitos da concentração de solução ácida) (Tabela 9)
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[00120] As BAs obtidas para as Preparações N° 12, N° 13, N° 14 e N° 15 foram 34,0%, 28,1%, 13,8% e 4,8%, respectivamente. Assim, a BA de grelina foi significativamente aumentada em qualquer uma das soluções ácidas (pH 4,0) e uma concentração de acetato de sódio na faixa de 0,01 M a 0,5 M, em comparação com a BA para a solução aquosa de manitol a 5% (p/v). Exemplo 5: Efeitos do pH da preparação líquida sobre a farmacocinética de grelina injetada por via subcutânea em ratos
[00121] Como no Exemplo Comparativo 2, as Preparações N° 13, N° 16 e N° 17 foram administradas por via subcutânea a uma dose de 1 ml/kg e os níveis plasmáticos de grelina foram medidos pelo método de RIA. Os parâmetros farmacocinéticos são mostrados na Tabela 10 abaixo. Tabela 10: Parâmetros farmacocinéticos de grelina como preparações administradas por via subcutânea a ratos (Efeitos do pH sobre a preparação líquida) (Tabela 10)
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[00122] As BAs obtidas para as Preparações N° 13, N° 16 e N° 17 foram 28,1%, 16,6% e 9,1%, respectivamente. Assim, a BA de grelina foi significativamente aumentada em qualquer uma das preparações líquidas, cada uma formulada com uma solução de acetato de sódio 0,1 M servindo de solução ácida e tendo um pH na faixa de 4,0 a 6,0, em comparação com a BA para a solução aquosa de manitol a 5% (p/v). Exemplo 6: Efeitos da concentração e do pH de tampão de ácido fosfórico sobre a farmacocinética de grelina injetada por via subcutânea em ratos
[00123] Como no Exemplo Comparativo 2, as Preparações N° 18, N° 19, N° 20, N° 21, N° 22 e N° 23 foram administradas por via subcutânea a uma dose de 1 ml/kg e os níveis plasmáticos de grelina foram medidos pelo método de RIA.
[00124] Os parâmetros farmacocinéticos são mostrados na Tabela 11 abaixo. Tabela 11: Parâmetros farmacocinéticos de grelina como preparações administradas por via subcutânea a ratos (Efeitos da concentração e do pH do tampão de ácido fosfórico) (Tabela 11)
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[00125] As BAs obtidas para as Preparações N° 18, N° 19, N° 20, N° 21, N° 22 e N° 23 foram 17,7%, 8,0%, 5,3%, 15,0%, 10,6% e 5,4%, respectivamente. Assim, a BA de grelina foi significativamente aumentada em qualquer uma das preparações líquidas, cada uma formulada com um tampão de ácido fosfórico (pH 4,0 a 5,0), em comparação com a BA para a solução aquosa de manitol a 5% (p/v). Exemplo 7: Efeitos do tipo e da concentração de álcool sobre a farmacocinética de grelina injetada por via subcutânea em ratos
[00126] Como no Exemplo Comparativo 2, as Preparações N° 14, N° 30, N° 81, N° 82 e N° 86 foram administradas por via subcutânea a uma dose de 1 ml/kg e os níveis plasmáticos de grelina foram medidos pelo método de RIA.
[00127] Os parâmetros farmacocinéticos são mostrados na Tabela 12 abaixo. Tabela 12: Parâmetros farmacocinéticos de grelina como preparações administradas por via subcutânea a ratos (Efeitos do tipo e da concentração de álcool) (Tabela 12)
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[00128] As BAs obtidas para as Preparações N° 14, N° 30, N° 81, N° 82 e N° 86 foram 13,8%, 25,2%, 25,8%, 13,8% e 22,5%, respectivamente. A Preparação N° 14 continha uma solução ácida e um açúcar, porém nenhum álcool. A Preparação N° 30 continha a mesma solução ácida e açúcar como na Preparação N° 14 e continha ainda álcool benzílico. A BA de grelina na Preparação N° 30 foi duas vezes maior que na Preparação N° 14 sem álcool. Também foi demonstrado que a presença de um álcool resulta em um aumento na BA de grelina independente do tipo e da concentração do álcool. Exemplo 8: Efeitos da concentração de sacarose sobre a farmacocinética de grelina injetada por via subcutânea em ratos
[00129] Como no Exemplo Comparativo 2, as Preparações N° 24, N° 13 e N° 25 foram administradas por via subcutânea a uma dose de 1 ml/kg e os níveis plasmáticos de grelina foram medidos pelo método de RIA. Os resultados são mostrados na Figura 3 e os parâmetros farmacocinéticos são mostrados na Tabela 13 abaixo. Tabela 13: Parâmetros farmacocinéticos de grelina como preparações administradas por via subcutânea a ratos (Efeitos da concentração de sacarose) (Tabela 13)
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[00130] As BAs obtidas para as Preparações N° 24, N° 13 e N° 25 foram 38,2%, 28,1% e 19,4%, respectivamente. Assim, a BA de grelina foi significativamente maior em qualquer das preparações líquidas que contêm o tampão de acetato de sódio servindo de solução ácida e sacarose a 0, 10 ou 20% (p/v) do que na solução aquosa de manitol a 5% (p/v). A presença de sacarose resultou em um maior aumento na BA de grelina nas Preparações N° 13 e N° 25 que na Preparação N° sem sacarose. A presença de sacarose levou a um aumento em T1/2 de grelina em preparação N° 13 e N° 25 em relação à preparação isenta de sacarose N° 24. Exemplo 9: Efeitos do tipo de açúcar sobre a farmacocinética de grelina injetada por via subcutânea em ratos
[00131] Como no Exemplo Comparativo 2, as Preparações N° 35, N° 53, N° 84 e N° 85 foram administradas por via subcutânea a uma dose de 1 ml/kg e os níveis plasmáticos de grelina foram medidos pelo método de RIA. Os parâmetros farmacocinéticos são mostrados na Tabela 14 abaixo. Tabela 14: Parâmetros farmacocinéticos de grelina como preparações administradas por via subcutânea a ratos (Efeitos do tipo de açúcar) (Tabela 14)
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[00132] As BAs obtidas para as Preparações N° 35, N° 53, N° 84 e N° 85 foram 3,0%, 22,4%, 21,3% e 8,7%, respectivamente. Embora a BA de grelina tenha aumentado na Preparação N° 35 contendo somente sacarose, o aumento foi relativamente pequeno (3,0%). Foi demonstrado que a BA de grelina foi significativamente aumentada em qualquer uma das preparações líquidas que continham a mesma solução ácida e o mesmo álcool, porém açúcares diferentes, em comparação com a BA para a solução aquosa de manitol a 5% (p/v). O aumento na BA foi maior para sacarose e glicose do que para dextrana 70. Exemplo 10: Efeitos de ciclodextrina sobre a farmacocinética de grelina injetada por via subcutânea em ratos
[00133] Como no Exemplo Comparativo 2, as Preparações N° 87 a N° 97 foram administradas por via subcutânea a uma dose de 1 ml/kg e os níveis plasmáticos de grelina foram medidos pelo método de RIA.
[00134] Os parâmetros farmacocinéticos são mostrados na Tabela 15 abaixo. Tabela 15: Parâmetros farmacocinéticos de grelina como preparações administradas por via subcutânea a ratos (Efeitos de ciclodextrina como açúcar) (Tabela 15)
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[00135] A BA foi significativamente aumentada em qualquer uma das Preparações No 87 a N° 97. As BAs de grelina na Preparação contendo sacarose No 53 e na Preparação contendo glicose No 84 foram 22,4% e 21,3%, respectivamente. O aumento na BA de grelina foi comparativamente alto em qualquer uma das preparações líquidas usando ciclodextrina. Exemplo 11: Efeitos da dose de grelina sobre a farmacocinética de grelina injetada por via subcutânea em ratos
[00136] Como no Exemplo Comparativo 2, as Preparações N° 26, N° 13, N° 27 e N° 28 foram administradas por via subcutânea a uma dose de 1 ml/kg. As doses de grelina distribuídas por estas preparações líquidas foram de 10, 50, 250 e 2,000 mg/kg, respectivamente. As amostras de sangue foram coletadas da mesma maneira que no Exemplo 2 e os níveis plasmáticos de grelina foram medidos pelo método de RIA. Os resultados são mostrados nas Figuras 4 e 5. Os parâmetros farmacocinéticos são mostrados na Tabela 16 abaixo. Tabela 16: Parâmetros farmacocinéticos de grelina como preparações administradas por via subcutânea a ratos (Efeitos da dose de grelina) (Tabela 16)
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[00137] A AUC para as Preparações N° 26, N° 13, N° 27 e N° 28 foram 49,28 ng^min/ml, 289,90 ng^min/ml, 1580,28 ng^min/ml e 15050,59 ng^min/ml, respectivamente. As BAs de grelina para estas Preparações foram 23,9%, 28,1%, 30,7% e 36,5%, respectivamente. Esta observação indica que a absorção de grelina não atinge a saturação e continua aumentando à medida que a dose de grelina é aumentada de 10 mg/kg para 2.000 mg/kg. Exemplo 12: Efeitos do álcool benzílico sobre a farmacocinética de grelina injetada por via subcutânea em ratos
[00138] Como no Exemplo Comparativo 2, as Preparações N° 13, N° 14, N° 29 e N° 30 foram administradas por via subcutânea a uma dose de 1 ml/kg e os níveis plasmáticos de grelina foram medidos pelo método de RIA. Os parâmetros farmacocinéticos são mostrados na Tabela 17 abaixo. Tabela 17: Parâmetros farmacocinéticos de grelina como preparações administradas por via subcutânea a ratos (Efeitos do álcool benzílico) (Tabela 17)
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[00139] As BAs obtidas para as Preparações N° 13, N° 14, N° 29 e N° 30 foram 28,1%, 13,8%, 39,3% e 25,2%, respectivamente. Assim, a presença de álcool benzílico a 1% (p/v) resultou em um aumento significativo na BA de grelina em uma das preparações líquidas contendo tampão de acetato de sódio 0,1 M ou 0,03 M servindo de solução ácida, em comparação com seus equivalentes sem álcool benzílico. Isto indica o poder do álcool benzílico de aumentar a BA de grelina. Exemplo 13: Efeitos da concentração de grelina sobre a farmacocinética de grelina injetada por via subcutânea em ratos
[00140] Como no Exemplo Comparativo 2, as Preparações N° 30 e N° 31 foram administradas por via subcutânea. A Preparação N° 30 foi administrada em um volume de 1 ml/kg e a Preparação N° 31 em um volume de 50 ml/kg (foi usada uma microsseringa (SGE. Co., Ltd.) para administrar 50 ml/kg), para que a mesma dose de 50 mg/kg de grelina fosse distribuída pelas duas preparações. As amostras de sangue foram coletadas da mesma maneira que no Exemplo Comparativo 2 e os níveis plasmáticos de grelina foram medidos pelo método de RIA. Os parâmetros farmacocinéticos são mostrados na Tabela 18 abaixo. Tabela 18: Parâmetros farmacocinéticos de grelina como preparações administradas por via subcutânea a ratos (Efeitos da concentração de grelina) (Tabela 18)
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[00141] A BA de grelina na Preparação N° 30 (25,2%) foi tão alta quanto aquela na Preparação N° 31 (23,2%). Isto indica que a presença de um tampão de acetato de sódio e álcool benzílico aumenta a absorção de grelina independente da concentração e da dose de grelina. Exemplo 14: Efeitos do processo de preparação de tampão de ácido acético sobre a farmacocinética de grelina injetada por via subcutânea em ratos
[00142] As Preparações N° 31 e N° 32 foram administradas por via subcutânea a uma dose de 50 ml/kg, para que a mesma dose de grelina fosse distribuída pelas duas Preparações (50 mg/kg). As amostras de sangue foram coletadas da mesma maneira que no Exemplo Comparativo 2 e os níveis plasmáticos de grelina foram medidos pelo método de RIA. Os parâmetros farmacocinéticos são mostrados na Tabela 19 abaixo. Tabela 19: Parâmetros farmacocinéticos de grelina como preparações administradas por via subcutânea a ratos (Efeitos do processo de preparação de tampão de ácido acético) (Tabela 19)
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[00143] As BAs obtidas para as Preparações N° 31 e N° 32 foram 23,2% e 43,2%, respectivamente. O tampão ácido usando na Preparação No 31 foi preparado por adição de ácido clorídrico a uma solução aquosa de acetato de sódio para dar um pH de 4,0, ao passo que o tampão ácido usado na Preparação N° 32 foi preparado por adição de uma solução aquosa de hidróxido de sódio para dar um pH de 4,0. A BA de grelina foi significativamente aumentada em cada uma das duas preparações líquidas em comparação com a BA obtida para a solução aquosa de manitol a 5% (p/v). isto indica que a presença de um tampão ácido aumenta a BA de grelina independente da constituição da solução ácida. Exemplo 15: Efeitos de tampão de ácido acético sobre a farmacocinética de grelina injetada por via subcutânea em ratos
[00144] Como no Exemplo Comparativo 2, as Preparações N° 32, N° 51, N° 52 e N° 53 foram administradas por via subcutânea a uma dose de 1 ml/kg e os níveis plasmáticos de grelina foram medidos pelo método de RIA. Os parâmetros farmacocinéticos são mostrados na Tabela 20 abaixo. Tabela 20: Parâmetros farmacocinéticos de grelina como preparações administradas por via subcutânea a ratos (Efeitos da concentração e do pH de tampão de ácido acético) (Tabela 20)
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[00145] As BAs obtidas para as Preparações N° 32, N° 51, N° 52 e N° 53 foram 23,2%, 22,8%, 18,0% e 22,4%, respectivamente. As Preparações N° 32 e N° 51 a N° 53, cada uma contém álcool benzílico, um álcool que pode aumentar a BA de grelina, e sacarose, junto com um tampão de ácido acético servindo de solução ácida. Cada uma destas preparações líquidas alcançou uma BA maior que aquela alcançada pela Preparação N° 79 (14,2%), que continha álcool benzílico e sacarose, mas não continha tampão de ácido acético. Isto indica que uma preparação de grelina líquida contendo uma solução ácida, um álcool e um açúcar pode alcançar alta BA de grelina. Exemplo 16: Efeitos de outras soluções ácidas sobre a farmacocinética de grelina injetada por via subcutânea em ratos
[00146] Como no Exemplo Comparativo 2, as Preparações N° 54 a N° 59 e N° 73 foram administradas por via subcutânea a uma dose de 1 ml/kg e os níveis plasmáticos de grelina foram medidos pelo método de RIA. Os parâmetros farmacocinéticos são mostrados na Tabela 21 abaixo. Tabela 21: Parâmetros farmacocinéticos de grelina como preparações administradas por via subcutânea a ratos (Efeitos de outras soluções ácidas) (Tabela 21)
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[00147] As BAs obtidas para as Preparações N° 54 a N° 59 e N° 73 foram 19,9%, 17,3%, 22,3%, 19,8%, 26,6%, 23,2% e 14,3%, respectivamente. As Preparações N° 54 a 59 cada uma continha álcool benzílico, um álcool que pode aumentar a BA de grelina, e sacarose, junto com uma solução ácida. Cada uma dessas preparações líquidas alcançou uma BA maior que aquela alcançada pela Preparação N° 79 (14,2%), que continha álcool benzílico e sacarose, mas não continha solução ácida. Isto indica que uma preparação de grelina líquida contendo um tampão ácido, um álcool e um açúcar pode alcançar alta BA de grelina. A presença de uma solução ácida resultou em um aumento na BA de grelina independente da constituição da solução ácida. Exemplo 17: Efeitos de álcool e açúcar na ausência de solução ácida sobre a farmacocinética de grelina injetada por via subcutânea em ratos
[00148] Como no Exemplo Comparativo 2, as Preparações N° 78 a N° 80 foram administradas por via subcutânea a uma dose de 1 ml/kg e os níveis plasmáticos de grelina foram medidos pelo método de RIA. Os parâmetros farmacocinéticos são mostrados na Tabela 22 abaixo. Tabela 22: Parâmetros farmacocinéticos de grelina como preparações administradas por via subcutânea a ratos (Efeitos de álcool e açúcar na ausência de solução ácida) (Tabela 22)
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[00149] As BAs obtidas para as Preparações N° 78 a N° 80 foram 8,3%, 14,2% e 16,9%, respectivamente. A BA de grelina na Preparação N° 35 é 3,0, que contém apenas sacarose, e foi confirmado que a adição de um álcool pode aumentar a BA de grelina mesmo na ausência de uma solução ácida. Exemplo 18: Efeitos de álcool na ausência de solução ácida sobre a farmacocinética de grelina injetada por via subcutânea em ratos
[00150] Como no Exemplo Comparativo 2, as Preparações N° 60 a N° 63, N° 71 e N° 72 foram administradas por via subcutânea a uma dose de 1 ml/kg e os níveis plasmáticos de grelina foram medidos pelo método de RIA. Os parâmetros farmacocinéticos são mostrados na Tabela 23 abaixo. Tabela 23: Parâmetros farmacocinéticos de grelina como preparações administradas por via subcutânea a ratos (Efeitos de álcool na ausência de solução ácida) (Tabela 23)
Figure img0036
[00151] As BAs das Preparações N° 60 a N° 63, N° 71 e N° 72 foram principalmente maiores que aquela da Preparação N° 34 (5,0%), que usou solução salina fisiológica, e que aquela da Preparação N° 35 (3,0%), que usou uma solução aquosa de sacarose a 10% (p/v). Estes resultados indicam que a presença de um álcool isolado pode aumentar a BA de grelina mesmo na ausência de uma solução ácida. Exemplo 19: Efeitos de líquidos orgânicos polares não-alcoólicos na ausência de soluções ácidas sobre a farmacocinética de grelina injetada por via subcutânea em ratos
[00152] Como no Exemplo Comparativo 2, as Preparações N° 64 a N° 68, N° 70, e N° 76 foram administradas por via subcutânea a uma dose de 1 ml/kg e os níveis plasmáticos de grelina foram medidos pelo método de RIA. Os parâmetros farmacocinéticos são mostrados na Tabela 24 abaixo. Tabela 24: Parâmetros farmacocinéticos de grelina como preparações administradas por via subcutânea a ratos (Efeitos de líquidos orgânicos polares não-alcoólicos na ausência de soluções ácidas) (Tabela 24)
Figure img0037
[00153] As BAs das Preparações N° 64 a N° 68, N° 70, N° 74 e N° 76 foram principalmente maiores que aquela da Preparação N° 34 (5,0%), que usou solução salina fisiológica, e que aquela da Preparação N° 35 (3,0%), que usou uma solução aquosa de sacarose a 10% (p/v). Estes resultados indicam que a presença de um líquido orgânico polar isolado pode aumentar a BA de grelina mesmo na ausência de uma solução ácida. O aumento na BA foi mais significativo para N-metil-2- pirrolidona. Exemplo 20: Efeitos de N-metil-2-pirrolidona sobre a farmacocinética de grelina injetada por via subcutânea em ratos
[00154] Como no Exemplo Comparativo 2, as Preparações N° 83 e N° 65 foram administradas por via subcutânea a uma dose de 1 ml/kg e os níveis plasmáticos de grelina foram medidos pelo método de RIA. Os parâmetros farmacocinéticos são mostrados na Tabela 25 abaixo. Tabela 25: Parâmetros farmacocinéticos de grelina como preparações administradas por via subcutânea a ratos (Efeitos de N-metil-2- pirrolidona) (Tabela 25)
Figure img0038
[00155] As Preparações N° 83 e N° 65 alcançam ambas BAs consideravelmente altos de 65,7% e 57,4%, respectivamente. A BA de grelina foi maior na Preparação N° 83, que continha uma solução ácida, que na Preparação N° 65, que não continha solução ácida. Isto indica que o poder da N-metil-2-pirrolidona para aumentar a BA, embora alto por si só, pode aumentar ainda mais pela adição de uma solução ácida. Exemplo 21: Farmacocinética de grelina injetada por via intramuscular em ratos
[00156] Como com os exemplos de administração subcutânea, três ratos, cada um tendo um tubo de polietileno inserido na artéria femoral, receberam por via intramuscular as Preparações N° 3 e N° 13 no músculo femoral a uma dose de 1 ml/kg, usando uma seringa e uma agulha 26G. As amostras de sangue foram coletadas da mesma maneira que no Exemplo Comparativo 2 e os níveis plasmáticos de grelina foram medidos pelo método de RIA. Os resultados são mostrados na figura 6. Os parâmetros farmacocinéticos são mostrados na Tabela 26 abaixo. Tabela 26: Parâmetros farmacocinéticos de grelina como preparações administradas por via intramuscular a ratos (Efeitos de tampão de acetato de sódio) (Tabela 26)
Figure img0039
[00157] As BAs obtidas para as Preparações N° 3 e N° 13 administradas por via intramuscular foram 10,9% e 28,5% em relação ao caso em que elas foram administradas por via intravenosa, respectivamente. Assim, a BA de grelina na presença de tampão de acetato de sódio foi 2,6 vezes maior que a BA de grelina obtida para a solução aquosa de manitol a 5% (p/v). Isto indica que tampões de acetato de sódio podem aumentar a absorção de grelina na administração intramuscular de maneira tão eficaz quanto na administração subcutânea. Exemplo 22: Farmacocinética de grelina em macacos cinomolgos
[00158] As Preparações N° 5 e N° 33 foram administradas por via subcutânea a grupos separados de macacos cinomolgos e os níveis plasmáticos de grelina foram medidos. Além disso, a Preparação N ° 1 foi administrada por via intravenosa a um outro grupo de macacos cinomolgos. Os níveis plasmáticos de grelina foram medidos.
[00159] Cada grupo consistia em três macacos machos (importados da China) com idade de 4 a 6 anos. As Preparações N° 5 e N° 33 foram injetadas por via subcutânea na pele dorsal a uma dose de 0,2 ml/corpo usando uma seringa e uma agulha 26G (ambas disponíveis na Terumo Co., Ltd.).
[00160] Usando uma seringa e uma agulha 26G (ambas disponíveis na Terumo Co., Ltd.), a Preparação N° 1 foi injetada por via intravenosa na veia cefálica do antebraço a uma dose de 2 ml/kg.
[00161] Em cada caso, amostras de sangue foram coletadas da veia cefálica do antebraço antes da administração e 5, 10, 15, 30, 40, 60, 90, e 120 minutos após a administração. A cada amostra, um centésimo de uma solução de EDTA.2Na.2H2O e um cinqüenta avos de uma solução de AEBSF foram adicionados imediatamente após a coleta da amostra. A amostra foi então centrifugada para separar o plasma, ao qual foi imediatamente adicionado um décimo de ácido clorídrico 1 N. A mostra foi misturada e armazenada a -80oC até análise.
[00162] As amostras de plasma foram então analisadas quanto aos níveis de grelina pelo ensaio imunossolvente ligado à enzima (ELISA) usando o kit Active Ghrelin ELISA (Cat. N° MM-401, Mitsubishi Kagaku latron Inc.). De maneira semelhante ao RIA, este ensaio pode detectar especificamente a grelina ativa.
[00163] A figura 7 mostra as alterações nas concentrações plasmáticas de grelina ao longo do tempo. Os resultados mostrados na figura 7 foram usados para determinar a Cmax e o Tmax para cada preparação líquida. Usando o método trapezoidal, também foi calculada a AUC para cada preparação. As AUCs foram então usadas para determinar a BA de grelina. Os resultados são mostrados na Tabela 27. Esses valores foram obtidos como médios dos dados obtidos para os três macacos cinomolgos em cada grupo. Tabela 27: Parâmetros farmacocinéticos de grelina como preparações administradas por via intravenosa ou por via subcutânea a macacos cinomolgos (Tabela 27)
Figure img0040
[00164] As BAs obtidas para as Preparações N° 5 e N° 33 subcutâneas foram de 4,9% e 12,8% em relação ao caso em que foram administradas por via intravenosa, respectivamente. Assim, a BA de grelina foi 2,6 vezes maior na preparação líquida formulada com um tampão de acetato de sódio e álcool benzílico a 1% (p/v) do que na preparação líquida formulada com uma solução aquosa de manitol a 5% (p/v). Isto indica que o tampão de acetato de sódico contendo álcool benzílico pode aumentar a absorção de grelina em macacos cinomolgos tão eficazmente quanto em ratos. Exemplo 23: O poder da preparação de grelina de aumentar os níveis plasmáticos de hormônio de crescimento em ratos
[00165] As Preparações N° 4 e No 31 foram usadas para examinar o poder das preparações de grelina de aumentar a concentração plasmática de hormônio de crescimento (GH) em ratos.
[00166] Foram usados ratos SD machos, com 7 semanas de idade (Charles River Laboratories Japan Inc.). Cada preparação foi administrada a um grupo de três ratos tendo cada um um tubo de polietileno (PE-50, Clay Adams Co., Ltd.) inserido na artéria femoral.
[00167] Usando uma seringa e uma agulha 26 G (disponível na Terumo Co., Ltd.),cada preparação foi administrada por via subcutânea na pele dorsal a uma dose de 50 ml/kg. Amostras de sangue foram coletadas do tubo de polietileno na artéria femoral antes da administração e 5, 10, 20, 30 e 60 minutos após a administração.
[00168] A cada amostra, um centésimo de uma solução de EDTA.2Na.2H2O foi adicionado imediatamente após a coleta da amostra. A amostra foi então centrifugada para separar o plasma, que por sua foi armazenado a -80oC até análise.
[00169] As amostras de plasma foram analisadas quanto às concentrações de GH por radioimunoensaio (RIA) usando o sistema de ensaio de Hormônio de Crescimento de Rato (rGH) [125I] (Amersham Bioscience Co., Ltd.: Cat. N° RPA551). A Figura 8 mostra as alterações nas concentrações plasmáticas de GH ao longo do tempo. Esses valores foram obtidos como médias dos dados obtidos para os três ratos em cada grupo.
[00170] Como pode ser visto dos resultados mostrados na figura 8, a concentração plasmática de GH aumentou ligeiramente do valor inicial (113 ng/ml) e atingiu seu valor máximo (208 ng/ml) 5 minutos depois da administração subcutânea da Preparação N° 4. Em comparação, a concentração plasmática de GH atingiu seu pico (316 ng/ml) 20 minutos depois da administração subcutânea da Preparação N° 31. O valor máximo foi 3,3 vezes maior que o valor inicial (96 ng/ml). Estes resultados indicam que o aumento na concentração plasmática de GH é mais significativo para a preparação que usa acetato de sódio e álcool benzílico. Exemplo 24: Farmacocinética de outros tipos de grelina injetados por via subcutânea em ratos
[00171] Como no Exemplo Comparativo 2, as Preparações N° 37, N° 39, No 41, e N° 98 a N° 102 foram administradas por via subcutânea a uma dose de 1 ml/kg e os níveis plasmáticos de grelina foram medidos por RIA. Os parâmetros farmacocinéticos são mostrados na Tabela 28 abaixo. Como no Exemplo Comparativo 2, as Preparações N° 36, N° 38 e N° 40 foram administradas por via intravenosa a uma dose de 1 ml/kg e os níveis plasmáticos de grelina foram medidos por RIA. As concentrações plasmáticas foram usadas para determinar a BA para cada tipo de grelina.
[00172] Os níveis plasmáticos de grelina de rato foram medidos da mesma maneira que os de grelina. Os níveis plasmáticos de grelina humana e des-octanoil grelina humana foram medidos por radio- imunoensaio (RIA) usando um anticorpo antigrelina. Especificamente, o anticorpo antigrelina e em seguida [125I-Tyr]grelina(13-28) foram adicionados a cada amostra de plasma para competição. Subseqüentemente, um anticorpo secundário foi adicionado para precipitar o complexo de anticorpo-grelina. O sobrenadante foi separado e analisado quanto à radioatividade por um contador y (Packard Instruments Co., Ltd.). O anticorpo antigrelina usando no ensaio pode reconhecer des-octanoil grelina bem como grelina.
[00173] Os níveis plasmáticos de aminododecano grelina humana (Adod grelina) foram medidos por radioimunoensaio (RIA) usando um anticorpo anti-Adod grelina. Especificamente, o anticorpo anti-Adod grelina e em seguida antígeno marcado com 125I foram adicionados a cada amostra de plasma para competição. Subseqüentemente, um anticorpo secundário foi adicionado para precipitar o complexo de anticorpo-Adod grelina. O sobrenadante foi separado e analisado quanto à radioatividade por um contador y (Packard Instruments Co., Ltd.). Tabela 28: Parâmetros farmacocinéticos de diferentes tipos de grelina injetados por via subcutânea em ratos (Tabela 28)
Figure img0041
[00174] Os resultados demonstram que as preparações de grelina líquidas contendo um líquido orgânico polar, uma solução ácida, um açúcar e um álcool podem aumentar significativamente não apenas a BA de grelina humana injetada por via subcutânea, mas também as BAs de outras grelinas injetadas por via subcutânea, inclusive grelina de rato, des-octanoil grelina (grelina humana que tem a modificação octanoil em Ser3) e [ácido L-2-aminododecanóico3]grelina humana. Exemplo 25: Farmacocinética de outros peptídeos e proteínas fisiologicamente ativas injetadas por via subcutânea em ratos
[00175] Como no Exemplo Comparativo 2, as Preparações N° 43, 45, 47, 49, 50, e 103 a 107 foram administradas por via subcutânea a uma dose de 1 ml/kg e os níveis plasmáticos dos peptídeos e proteínas foram medidos por RIA. Os parâmetros farmacocinéticos são mostrados na Tabela 29 abaixo. Como no Exemplo Comparativo 2, as Preparações N° 42, 44, 46 e 48 foram administradas por via intravenosa a uma dose de 1 ml/kg e os níveis plasmáticos dos peptídeos e proteínas foram medidos por RIA. As concentrações plasmáticas foram usadas para determinar a BA para cada peptídeo ou proteína.
[00176] Os níveis plasmáticos de hormônio paratireóideo humano (134) (hPTH) foram medidos por radio-imunoensaio (RIA) usando um anticorpo anti-PTH. Especificamente, o anticorpo anti-PTH e em seguida [125I-Tyr34]PTH(1-34) foram adicionados a cada amostra de plasma para competição. Subseqüentemente, um anticorpo secundário foi adicionado para precipitar o complexo de anticorpo-PHT(1-34). O sobrenadante foi separado e analisado quanto à radioatividade por um contador y (Packard Instruments Co., Ltd.).
[00177] Os níveis plasmáticos de peptídeo-1 semelhante ao glicogênio humano (GLP-1) foram medidos pelo Ensaio Imunossolvente Ligado à Enzima (ELISA) usando o kit Glucagon-like Peptide-1 (Active) ELISA (LINCO Research Inc.).
[00178] Os níveis plasmáticos de adrenomedulina humana foram medidos por radioimunoensaio (RIA) usando AM mature RIA Shionogi (Shionogi Co., Ltd).
[00179] Os níveis plasmáticos de insulina humana foram medidos por radioimunoensaio (RIA) usando Insulin-RIA-bead II (Yamasa Co., Ltd.).
[00180] Os níveis plasmáticos de peptídeo natriurético atrial humano (hANP) foram medidos por radioimunoensaio (RIA) usando Shiono RIA ANP (Shionogi Co., Ltd.). Tabela 29: Parâmetros farmacocinéticos de outros peptídeos e proteínas fisiologicamente ativas administrados por via subcutânea a ratos (Tabela 29)
Figure img0042
[00181] Os resultados demonstram que as preparações de peptídeo líquidas contendo um açúcar, um álcool e uma solução ácida podem aumentar significativamente não apenas a BA de grelina humana administrada por via subcutânea, mas também as BAs de outros peptídeos injetados por via subcutânea, incluindo grelina de rato, des-octanoil grelina (grelina humana que não tem a modificação octanoil em Ser3), [ácido L-2-aminododecaníco 3] grelina humana, peptídeo-1 semelhante ao glicogênio humano (GLP-1), peptídeo natriurético atrial humano (hANP), adrenomedulina humana, hormônio paratireóideo humano (hPTH(1-34)) e insulina humana. Exemplo de Produção 1: Preparação de composição farmacêutica de pH ajustado contendo grelina humana
[00182] Grelina humana que é uma das grelinas, foi dissolvida em água purificada para formar uma solução aquosa contendo cerca de 0,15 mmol/ml (= 0,5 mg/ml) de grelina humana. Enquanto o pH desta solução era monitorado, ácido clorídrico aquoso 0,1 M foi adicionado em pequenas quantidades até um pH final de 4,0. Isto deu uma composição farmacêutica como uma solução aquosa contendo grelina humana. Exemplo de Produção 2: Preparação de composição farmacêutica consistindo em grelina de rato dissolvida em tampão ácido acético
[00183] Grelina de rato que é uma das grelinas, foi dissolvida em tampão de ácido acético 0,05 M (pH 4,) para formar uma composição farmacêutica como uma solução aquosa contendo cerca de 0,15 mmol/ml (= 0,5 mg/ml) grelina de rato. Foi determinado que a solução aquosa tinha um pH de 4,0. Exemplo de Produção 3: Preparação de composição farmacêutica contendo grelina humana
[00184] Grelina humana que é uma das grelinas, e álcool benzílico foram adicionados a tampão de ácido acético 0,05 M (pH 4,0) para formar uma composição farmacêutica como uma solução aquosa contendo cerca de 0,15 mmol/ml (= 0,5 mg/ml) grelina humana e cerca de 1% (p/v) de álcool benzílico. Foi determinado que a solução aquosa tinha um pH de 4,0. Exemplo de Produção 4: Preparação composição farmacêutica contendo grelina humana
[00185] Grelina humana que é uma das grelinas, álcool benzílico e sacarose foram adicionados à água purificada para formar uma composição farmacêutica como uma solução aquosa contendo cerca de 0,15 mmol/ml (= 0,5 mg/ml) de grelina humana, cerca de 1% (p/v) de álcool benzílico e 10% (p/v) de sacarose. Foi determinado que a solução aquosa tinha um pH de 4,7. Exemplo de Produção 5: Preparação composição farmacêutica contendo grelina humana
[00186] Grelina humana, que é uma das grelinas, álcool benzílico e sacarose foram adicionados a um tampão de ácido acético 0,1 M (pH 4,0) para formar uma composição farmacêutica como uma solução aquosa contendo cerca de 0,15 mmol/ml (= 0,5 mg/ml) de grelina humana, cerca de 1% (p/v) de álcool benzílico e 10% (p/v) de sacarose. Foi determinado que a solução aquosa tinha um pH de 4,0. APLICABILIDADE INDUSTRIAL
[00187] Como apresentado, a presente invenção oferece uma preparação líquida eficaz que obtém alta biodisponibilidade (BA) de peptídeos ou proteínas fisiologicamente ativas, inclusive grelina, que são administrados como drogas. A presente invenção também oferece um método para aumentar a biodisponibilidade de peptídeos ou proteínas fisiologicamente ativas, inclusive grelina, que são injetados por via subcutânea em soluções aquosas.
[00188] Em geral, peptídeos e proteínas fisiologicamente ativas administradas por via subcutânea são digeridos por proteases, de modo que sua BA fica mais baixa que aquela obtida por injeção intravenosa. A preparação líquida da presente invenção contendo um peptídeo ou proteína fisiologicamente ativa, tal como grelinas, pode ser injetada por via subcutânea para manter níveis sangüíneos eficazes do peptídeo ou proteína. Por conseguinte, a presente invenção é de importância médica significativa.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00189] Figura 1 é um gráfico mostrando as alterações ao longo do tempo nos níveis plasmáticos de grelina humana administrada por via intravenosa ou por via subcutânea a ratos, a grelina humana sendo dissolvida em uma solução aquosa de manitol a 5% (p/v) (Exemplo Comparativo 2).
[00190] Figura 2 é um gráfico mostrando as alterações ao longo do tempo nos níveis plasmáticos de grelina humana administrada por via subcutânea a ratos, a grelina humana sendo dissolvida em um tampão de acetato de sódio (Exemplo 2).
[00191] Figura 3 é um gráfico mostrando as alterações ao longo do tempo nos níveis plasmáticos de grelina humana administrada por via subcutânea a ratos, a grelina humana sendo dissolvida em um tampão de acetato de sódio 0,1 M (pH 4,0) contendo 0 a 20% (p/v) de sacarose (Exemplo 8).
[00192] Figura 4 é um gráfico mostrando as alterações ao longo do tempo nos níveis plasmáticos de grelina administrada por via subcutânea a ratos a uma dose de 10, 50, 250 ou 2.000 mg/kg (Exemplo 11). A preparação contém tampão de acetato de sódio 0,1 M (pH 4,0) e 10% (p/v) de sacarose.
[00193] Figura 5 é um gráfico mostrando a relação entre a dose de grelina administrada a ratos a uma dose de 10, 50, 250 ou 2.000 mg/kg, e as AUCs (Exemplo 11).
[00194] Figura 6 é um gráfico mostrando as alterações ao longo do tempo nos níveis plasmáticos de grelina humana administrada por via intramuscular a ratos, a grelina humana sendo dissolvida em uma solução aquosa de manitol a 5% (p/v) ou em um tampão de aceteato de sódio (Exemplo 21).
[00195] Figura 7 é um gráfico mostrando as alterações ao longo do tempo nos níveis plasmáticos de grelina humana administrada por via intravenosa ou por via subcutânea a macacos cinomolgos, a grelina humana sendo dissolvida em a solução aquosa de manitol a 5% (p/v) ou em um tampão de acetato de sódio (Exemplo 22).
[00196] Figura 8 é um gráfico mostrando as alterações ao longo do tempo nos níveis plasmáticos de hormônio de crescimento em ratos depois da administração subcutânea de grelina humana dissolvida em uma solução aquosa de manitol a 5% (p/v) ou em um tampão de acetato de sódio (Exemplo 23).

Claims (19)

1. Preparação líquida, caracterizada pelo fato de que compreende um peptídeo fisiologicamente ativo ou uma proteína fisiologicamente ativa como ingrediente ativo em combinação com um líquido orgânico polar, sendo que o líquido orgânico polar é um ou uma combinação de dois ou mais selecionados do grupo que consiste em um álcool e/ou N-metil-2-pirrolidona, dimetilformamida, dimetil sulfóxido e metilparabeno, em que a dita preparação líquida contém ainda um açúcar, sendo que o dito açúcar é um ou uma combinação de dois ou mais selecionados do grupo que consiste em manitol, sacarose, glicose e ciclodextrina.
2. Preparação líquida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o líquido orgânico polar é um ou uma combinação de dois ou mais selecionados do grupo que consiste em um álcool benzílico, etanol, fenol, terc-butanol, clorobutanol, N-metil-2- pirrolidona, dimetilformamida e dimetil sulfóxido.
3. Preparação líquida de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a concentração do líquido orgânico polar varia de 0,001 a 80% (p/v).
4. Preparação líquida de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a concentração do líquido orgânico polar varia de 0,1 a 10% (p/v).
5. Preparação líquida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o açúcar é ciclodextrina.
6. Preparação líquida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a concentração do açúcar varia de 0,1 a 20% (p/v).
7. Preparação líquida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o peptídeo fisiologicamente ativo ou a proteína fisiologicamente ativa é um selecionado do grupo que consiste em grelinas, peptídeo-1 semelhante ao glicogênio humano (hGLP-1), peptídeo natriurético atrial humano (hANP), adrenomedulina humana, hormônio paratireóideo humano (hPTH(1-34)) e insulina humana.
8. Preparação líquida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o peptídeo fisiologicamente ativo ou a proteína fisiologicamente ativa é uma das grelinas.
9. Preparação líquida de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a uma das grelinas é grelina.
10. Preparação líquida de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a grelina é grelina humana.
11. Preparação líquida de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizada pelo fato de que a concentração das grelinas varia de 0,03 nmol/ml a 15 mmol/ml.
12. Preparação líquida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que é para uso como injeção.
13. Preparação líquida de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que é para uso como injeção subcutânea ou injeção intramuscular.
14. Preparação líquida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que compreende o dito peptídeo fisiologicamente ativo ou proteína fisiologicamente ativa em combinação com uma solução ácida.
15. Preparação líquida de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a solução ácida compreende um ou uma combinação de dois ou mais selecionados do grupo que consiste em ácido acético, ácido láctico, ácido fosfórico, glicina, ácido cítrico, ácido clorídrico, ácido propiônico, ácido butírico, ácido benzóico e sais dos mesmos.
16. Preparação líquida de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizada pelo fato de que tem um pH na faixa de 3,0 a 7,0.
17. Preparação líquida de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizada pelo fato de que a concentração da solução ácida varia de 1 a 1000 mM.
18. Preparação líquida de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a concentração da solução ácida varia de 10 a 500 mM.
19. Preparação líquida de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18, caracterizada pelo fato de que a solução ácida é um tampão ácido tendo um pH na faixa de 3,0 a 7,0.
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