KR101149454B1 - 생리활성 펩티드의 액상 제제 - Google Patents

생리활성 펩티드의 액상 제제 Download PDF

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간가와 겐지
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Abstract

본 발명은 그렐린류를 포함하는 생리활성 펩티드 또는 생리활성 단백질을 유효성분으로 포함하는 약제의 생물학적 이용율(bioavailability: BA)을 확보하여, 보다 유효한 액상 제제; 그렐린류 등이 용해된 수용액의 피하 주사에 따른 BA 개선 방법; 그렐린류가 용해된 수용액의 피하 주사시 BA를 개선시키는 방법; 그렐린류를 포함하는 생리활성 펩티드 또는 생리활성 단백질을 유효성분으로 하고, 아세트산, 락트산, 인산, 글리신, 구연산, 염산, 피로피온산, 부티르산, 벤조산 또는 이들의 염으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 조합을 성분으로 포함하는 산성 용액, 및/또는 알코올류, N-메틸?2-피롤리돈, 디메틸포름아미드, 디메틸 설폭사이드 및 메틸파라벤으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 조합을 성분으로 포함하는 극성 유기 액체를 포함하는 것을 특징으로 하는 액상 제제를 제공한다.
그렐린, 생물학적 이용율

Description

생리활성 펩티드의 액상 제제{LIQUID PREPARATION OF PHYSIOLOGICALLY ACTIVE PEPTIDE}
본 발명은 생리활성 펩티드 또는 생리활성 단백질의 투여시 생물학적 이용율이 개선된 액상 제제 및 그 개선 방법에 관한 것이다.
현재 인슐린, 성장 호르몬, 심방성 나트륨 이뇨 펩티드, 칼시토닌, LH-RH 유도체, 부갑상선 호르몬, 부신피질 자극 호르몬 유도체 등의 다양한 생리활성 펩티드 또는 생리활성 단백질 제제가 의약품으로 판매되고 있다. 그러나, 이들 화합물은 소화관내 프로테아제에 의한 분해로 불활성화되므로, 경구 투여 제제로 개발하기 어려우며, 대부분 비경구 투여, 주로 주사제의 제제 형태로 임상적으로 사용되고 있다.
질병 치료를 위해 연속 투여, 장기 투여할 경우, 주사제는 그때마다 환자가 통원하여 투여 받아야 하므로, 환자에게는 큰 부담이 된다. 따라서, 주사제이더라도 환자 스스로 투여할 수 있는 피하 주사 형태가 요구되고 있다. 그러나, 피하 주사로 투여하는 경우, 피하로부터 흡수되는 도중에 프로테아제 등에 의해 분해되기 때문에, 정맥 주사로 투여한 경우와 비교하면 생물학적 이용율(bioavailability; 이하, BA라고 함)이 낮은 문제점이 있다.
그러므로, 피하 주사에 의한 투여시에는 정맥내 투여의 경우보다 약제를 다량 사용하거나/사용하여야 하며, 투여 회수를 높여야 하므로, 환자에게 큰 부담이 된다. 본 발명에서 생물학적 이용율 BA는 투여된 제제로부터 약물이 체순환 혈액으로까지 도달하는 비율(생물학적 이용율, EBA: extent of bio availability)을 의미한다.
그렐린(ghrelin)은 성장 호르몬 분비 촉진 인자 리셉터(GHS-R)에 결합하는 내인성 성장 호르몬 분비 촉진 인자(GHS)로, 1999년에 랫의 위에서 분리 정제된 생리활성 펩티드이다(비특허문헌 1). 그 후, 랫 이외의 척추동물, 예를 들면 인간, 마우스, 돼지, 닭, 뱀장어, 소, 말, 양, 개구리, 무지개 송어(rainbow trout), 개에서도, 유사한 1차 구조를 가지는 그렐린이 분리되었으며, 또는 cDNA 분석에 의해 추정되었다. 이들의 구조식은 표 1에 나타낸다. 또한, 여기에 열거된 것 이외에도, 고양이, 염소 등에서도 그렐린이 분리되었다.
(표 1)
인간 : GSS(n-octanoyl)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR
: GSS(n-octanoyl)FLSPEHQRVQRKESKKPPAKLQPR
랫 : GSS(n-octanoyl)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR
: GSS(n-octanoyl)FLSPEHQKAQRKESKKPPAKLQPR
마우스 : GSS(n-octanoyl)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR
돼지 : GSS(n-octanoyl)FLSPEHQKVQQRKESKKPAAKLKPR
소 : GSS(n-octanoyl)FLSPEHQKLQRKEAKKPSGRLKPR
양 : GSS(n-octanoyl)FLSPEHQKLQRKEPKKPSGRLKPR
개 : GSS(n-octanoyl)FLSPEHQKLQQRKESKKPPAKLQPR
뱀장어 : GSS(n-octanoyl)FLSPSQRPQGKDKKPPRV-NH2
송어 : GSS(n-octanoyl)FLSPSQKPQVRQGKGKPPRV-NH2
: GSS(n-octanoyl)FLSPSQKPQGKGKPPRV-NH2
닭 : GSS(n-octanoyl)FLSPTYKNIQQQKGTRKPTAR
: GSS(n-octanoyl)FLSPTYKNIQQQKDTRKPTAR
: GSS(n-octanoyl)FLSPTYKNIQQQKDTRKPTARLH
황소개구리 : GLT(n-octanoyl)FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNM
: GLT(n-decanoyl)FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNM
: GLT(n-octanoyl)FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNMN
탈라피아 : GSS(n-octanoyl)FLSPSQKPQNKVKSSRI-NH2
캣피시(Catfish) : GSS(n-octanoyl)FLSPTQKPQNRGDRKPPRV-NH2
: GSS(n-octanoyl)FLSPTQKPQNRGDRKPPRVG
말 : GSS(n-butanoyl)FLSPEHHKVQHRKESKKPPAKLKPR
(상기 표 1에서, 아미노산 잔기는 IUPAC 또는 IUC의 단문자 표기에 따라 기재함)
이들 각각의 동물에 내재하는 천연형 그렐린은 3번 위치의 세린 잔기(S) 또는 트레오닌 잔기(T)의 측쇄 수산기가 옥탄산, 데칸산 등의 지방산에 의해 아실화된 특이적인 구조를 가지는 펩티드로, 소수성의 수식 구조를 가진다. 또한, 이것은 성장 호르몬 분비 촉진 인자 리셉터에 결합하여, 세포내의 칼슘 이온 농도를 상승시키는 활성을 가진다. 이들 그렐린은 강력한 성장 호르몬 분비 촉진 활성을 가져, 성장 호르몬 분비를 조절하는 기능을 하는 것으로 밝혀졌으며, 그렐린의 생리활성 기능과 의약품으로의 적용이 기대되고 있다(특허문헌 1). 덧붙여, 본 발명에서는 천연형 그렐린을 총칭하여 그렐린이라고 한다.
또한, 이들 각각의 동물에 내재하는 천연형 그렐린과 상기 그렐린에서 일부 구조가 치환 또는 결손된 그렐린 유도체, 또는 그렐린 유사체(특허문헌 3) 등도, 각 질병 등의 치료제로서 기대되고 있다.
그렐린 유도체는, 그렐린의 소수성 수식 구조가, 옥타노일기(C8)가 아닌, 헥사노일기(C6), 데카노일기(C10),도데카노일기(C12) 등의 탄소수 2 내지 20개, 바람직하게는 탄소수 4 내지 12개 가량의 지방산에 의해 이루어진 수식 구조이거나, 또는 분지 구조를 가지는 지방산이나 불포화 지방산에 의한 수식 구조, 페닐프로피오닐기 등의 방향환을 포함하는 수식 구조, 또는 아다만탄 골격을 가지는 수식 구조 등으로 치환된 것을 의미한다. 또한, 이들 각각의 동물에 내재하는 천연형의 그렐린은 소수성 수식 구조와 펩티드 주쇄가 에스테르 결합으로 결합되어 있지만, 그렐린 유도체는 에스테르, 에테르, 티오에테르, 아미드 또는 디설파이드 결합으로 결합된 것도 포함한다(특허문헌 1).
그렐린, 그렐린 유도체 또는 그렐린 유사체로 이루어진 그렐린류의 의약품으로의 적용이 상당히 기대되고 있지만, 아직 구체적인 의약 조성물로서 제형화되지 않았으며, 체내에서의 동태도 많이 알려져 있지 않다.
특허문헌 2에는 의약 조성물로서 그렐린류로, 그렐린류 수용액의 안정성에 미치는 pH 영향, 그렐린류의 소수성 수식 구조의 분해를 억제하는 방법 등이 보고되어 있다. 상기 문헌에 따르면, 그렐린류를 포함하는 수용액의 안정적인 pH 범위는 2 내지 7이고, 이러한 pH 조절은 pH 조절제나 완충액을 사용하여 수행할 수 있는 것으로 기재되어 있다. 또한, 보존중에 수용액의 pH 변화가 매우 적은 것이 바 람직하므로, 완충력이 있는 완충액이 바람직하며, 상기 완충액으로는 글리신 염산 완충액, 아세트산 완충액, 구연산 완충액, 락트산 완충액, 인산 완충액, 구연산-인산 완충액, 인산-아세트산-붕산 완충액, 프탈산 완충액을 들 수 있다(특허문헌 2: p11, 5-17줄)
또한, 실시예에는 McIlvaine 완충액(구연산 수용액과 인산수소2나트륨(disodium hydrogen phosphate) 수용액의 혼합물), Britton-Robinson 완충액(인산/ 아세트산/ 붕산 수용액과 수산화나트륨 수용액의 혼합물), 구연산 완충액, 글리신 염산 완충액, 아세트산 완충액 중의 그렐린 수용액에서의 안정성 시험이 기재되어 있다. 임의 종류의 완충액을 사용하여 그렐린류 수용액의 pH 범위를 2 내지 7로 조절함으로써, 그렐린류 수용액의 안정성을 확보할 수 있는 것으로 기재되어 있지만, 체내에 투여한 경우에서의 동태는 전혀 검토되어 있지 않다.
의약 조성물을 고려하면 경우, 펩티드 단백질은 일반적으로 수용액중에서는 불안정하기 때문에, 투여하기 전까지 안정성을 어떻게 확보할지도 중요한 과제이지만, 투여에 가장 유효한 제제를 설계하는 것이 더욱 중요한 과제이다.
특허문헌 1: 국제공개 WO01/07475호 공보
특허문헌 2: 국제공개 WO03/097083호 공보
특허문헌 3: 특허 공개 2004-514651호 공보
특허문헌 4: 특허 공개 소 63-40166호 공보
특허문헌 5: 특허 제2643426호
특허문헌 6: 특허 공개 2004-522803호 공보
특허문헌 7: 일본 특허 공개 평 2-19092호 공보
특허문헌 8: 일본 특허 공개 평 5-24129호 공보
특허문헌 9: 특허 제3120987호
비특허문헌 1: Kojima 등 : Nature, 402권, 656-660페이지, 1999년
비특허문헌 2: Tokihiro 등 : J. Pharm. Pharmaco1., 52권, 911-917쪽, 2000년.
발명의 공개
발명이 해결하려고하는 과제
그렐린류는 생리활성 펩티드이므로, 의약품으로서 투여할 경우 프로테아제 등의 영향을 받지 않는 비경구 투여제, 그중에서도 주사제로 고려된다. 주사제에서도 피하 주사의 경우에는 주사 부위로부터의 약물의 흡수와 혈중 이동을 보증할 수 있어야 한다. 그러나, 일반적으로 펩티드 제제는 피하 주사에 의한 투여시에는 BA가 낮은 것으로 여겨지고 있어, 주사제로의 제제 설계는 어려운 실정이다.
현재, 그렐린류의 각 약리 효과에 대한 유효량은 약물의 투여량에 대한 약리 효과를 지표로 검토되고 있다. 약물 치료를 합리적이면서도 안전하게 수행하기 위하여는, 약물의 혈중 농도를 조절할 수 있어야 하며 약물의 흡수에 크게 관여하는 제제 기술의 확립이 요구된다.
우선 그렐린류들 중 그렐린을 피하 주사제로 투여한 경우의 BA를 랫 및 원숭이를 이용하여 확인하였으며, 다른 펩티드 제제의 BA는 그외 약물 보다 낮아 일반적으로 20% 내지 40% 정도인 것으로 알려져 있으나, 그렐린의 BA는 랫에서 5% 정도이고, 원숭이에서는 3% 정도로, 현저히 낮다는 것을 확인하였다. 이러한 사실은 최초로 확인한 것이다.
BA율의 변동 요인으로는 우선 투여 부위에서 근처 말초 혈액으로의 전달 효율이나 전달 속도에 따른 영향을 고려할 수 있다. 이는 체액 및 조직 중에서의 확산, 생체막 투과성을 결정하는 약물의 분자량, pKa나 지용성 등의 물리 화학적 특성, 투여된 부위의 조직학적 형태나 생리적 특성을 포함한, 약물과 투여 부위의 고유한 성질에 의한 것이다.
BA가 낮을 경우에는, 치료에 필요한 혈장내 유효 농도를 확보하기 위하여 투여량 및/또는 투여 회수를 늘려야 하는데, 이는 환자에게 큰 부담이 되므로 BA를 높이는 제제 기술이 필요하다.
따라서, 본 발명은 그렐린류를 포함하는 생리활성 펩티드 또는 생리활성 단백질의 약제로서의 BA를 확보하고, 보다 유효한 액상 제제를 제공하며, 그렐린류를 포함하는 생리활성 펩티드 또는 생리활성 단백질이 용해된 수용액을 피하 주사하였을 때 BA를 개선하는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
과제를 해결하기 위한 수단
이와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명자들은 그렐린류를 주사한 후 투여 후 혈중 농도를 상세하게 검토하였다.
먼저, 그렐린과 주사제에 사용할 수 있는 각종 보조제를 함께 투여하여, BA를 확인하였다. 등장화제로 만니톨, 용해 보조제로 요소, 또는 완충액으로 아세트산 나트륨 완충액(pH 4.0) 등을 그렐린에 첨가하여 랫에 피하 주사한 결과, 아세트산 나트륨 완충액(pH 4.0)은 BA를 35.3%로 현저하게 증가시켰지만, 그외 물질들에서는 거의 변화가 없어, 가장 높은 요소도 3.4%에 불과하였다.
다음으로, 산성 용액의 종류를 바꾸어 동일하게 BA를 측정한 결과, 유사한 BA 증가가 있었다.
따라서, 그렐린의 피하 주사시에 산성 용액을 함께 투여하면, BA가 현저하게 증가한다는 것이 확인되었다.
또한, 산성 용액의 종류, 농도, pH 등을 조정하여 BA를 제어할 수 있음을 확인하였다. 산성 용액의 종류에 따라 BA 개선 효과가 상이한 것으로 확인되었는데, 이는 그렐린 제제 또는 그렐린 용액의 pH 값을 제어함으로써 이루어진 효과만은 아님을 의미한다.
또한, 그렐린 피하 주사시 극성 유기 액체를 함께 투여하면, BA가 현저하게 증가한다는 것도 확인되었다.
또한, 그렐린을 산성 용액 및 극성 유기 액체와 함께 투여한 경우에는, 산성 용액을 단독으로 그렐린과 함께 투여한 경우 및 극성 유기 액체를 단독으로 그렐린과 함께 투여한 경우에 비해, BA가 증가하였다.
또한, 그렐린 피하 주사시 산성 용액과 당류, 또는 극성 유기 액체와 당류를 함께 투여하면, BA가 현저하게 증가하였다.
또한, 이들의 BA 상승 효과는 그렐린에만 국한되지 않았으며, 생리활성 펩티드 또는 생리활성 단백질의 제제에 산성 용액 및/또는 극성 유기 액체 및/또는 당류를 함께 투여한 경우에도, BA가 현저하게 증가하였다.
따라서, 본 발명의 구체적 특징은 다음과 같다.
(1) 산성 용액과, 유효성분으로 생리활성 펩티드 또는 생리활성 단백질을 포함하는 액상 제제;
(2) 산성 용액이 아세트산, 락트산, 인산, 글리신, 구연산, 염산, 피로피온산, 부티르산, 벤조산 또는 이들의 염으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 조합을 성분으로 포함하는, 상기 (1)에 기재된 액상 제제;
(3) 산성 용액이 아세트산, 락트산, 피로피온산, 부티르산 및/또는 인산 또는 이들의 염으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 조합을 성분으로 포함하는, 상기 (1)에 기재된 액상 제제;
(4) 액상 제제의 pH가 3.0 내지 7.0의 범위인 것을 특징으로 하는, 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 액상 제제;
(5) 산성 용액의 농도가 1-1000 mM인 것을 특징으로 하는, 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 액상 제제;
(6) 산성 용액의 농도가 10-500 mM인 것을 특징으로 하는, 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 액상 제제;
(7) 산성 용액이 pH 3.0-7.0의 산성 완충액인 것을 특징으로 하는, 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 액상 제제.
또한, 본 발명의 다른 특징은,
(8) 극성 유기 액체와, 유효성분으로 생리활성 펩티드 또는 생리활성 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 액상 제제;
(9) 생리활성 펩티드 또는 생리활성 단백질을 유효성분으로 포함하며, 극성 유기 액체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 액상 제제;
(10) 극성 유기 액체가 알코올류 및/또는 N-메틸?2-피롤리돈, 디메틸포름아미드, 디메틸설폭사이드 및 메틸파라벤으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 조합을 성분으로 포함하는, 상기 (8) 또는 (9)에 기재된 액상 제제;
(11) 극성 유기 액체가 벤질알코올, 에탄올, 페놀, tert-부탄올, 클로로부탄올, N-메틸?2-피롤리돈, 디메틸포름아미드 및 디메틸설폭사이드로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 조합인 것을 특징으로 하는, 상기 (8) 또는 (9)에 기재된 액상 제제;
(12) 극성 유기 액체의 농도가 0.001-80%(w/v)인 것을 특징으로 하는, 상기 (8) 내지 (11) 중 어느 하나에 기재된 액상 제제;
(13) 극성 유기 액체의 농도가 0.1-10%(w/v)인 것을 특징으로 하는, 상기 (8) 내지 (11) 중 어느 하나에 기재된 액상 제제;
(14) 당류를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 액상 제제;
(15) 당류를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 (8) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 액상 제제;
(16) 극성 유기 액체 및 당류를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 액상 제제;
(17) 당류가 만니톨, 슈크로스, 포도당 및 시클로덱스트린류로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 조합인 것을 특징으로 하는, 상기 (14) 내지 (16) 중 어느 하나에 기재된 액상 제제;
(18) 당류가 시클로덱스트린류인 것을 특징으로 하는, 상기 (14) 내지 (17) 중 어느 하나에 기재된 액상 제제;
(19) 당류의 농도가 0.1-20%(w/v)인 것을 특징으로 하는, 상기 (14) 내지 (18) 중 어느 하나에 기재된 액상 제제이다.
또한, 보다 구체적으로, 본 발명은
(20) 생리활성 펩티드 또는 생리활성 단백질이 그렐린류, 인간 글루카곤형 펩티드-1(hGLP-1), 인간 심방성 나트륨 이뇨 펩티드(hANP), 인간 아드레노메둘린(adrenomedulin), 인간 부갑상선 호르몬(hPTH(1-34)) 및 인간 인슐린중에서 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는, 상기 (1) 내지 (19) 중 어느 하나에 기재된 액상 제제;
(21) 생리활성 펩티드 또는 생리활성 단백질이 그렐린류인 것을 특징으로 하는, 상기 (1) 내지 (19) 중 어느 하나에 기재된 액상 제제;
(22) 그렐린류가 그렐린인 것을 특징으로 하는, 상기 (1) 내지 (19) 중 어느 하나에 기재된 액상 제제;
(23) 그렐린이 인간 그렐린인 것을 특징으로 하는, 상기 (1) 내지 (19) 중 어느 하나에 기재된 액상 제제;
(24) 그렐린류의 농도가 0.03 nmol/mL - 15μmol/mL인 것을 특징으로 하는, 상기 (1) 내지 (19) 중 어느 하나에 기재된 액상 제제;
(25) 액상 제제가 주사용 액상 제제인 것을 특징으로 하는, 상기 (1) 내지 (24) 중 어느 하나에 기재된 액상 제제;
(26) 주사용 액상 제제가 피하 주사용 제제 또는 근육 주사용 제제인 것을 특징으로 하는, 상기 (25)에 기재된 액상 제제이다.
또한 보다 구체적인 본 발명의 특징은
(27) 유효성분인 그렐린류; 아세트산, 락트산, 피로피온산, 부티르산 및/또는 인산으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 조합을 성분으로 포함하는 산성 용액; 및 벤질알코올, 에탄올, 페놀, tert-부탄올, N-메틸?2-피롤리돈, 디메틸포름아미드 및 디메틸설폭사이드로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 조합을 포함하는 극성 유기 액체;를 포함하며, pH가 3.0-7.0인 액상 제제;
(28) 그렐린류가 용해된 수용액에 산성 용액 및 극성 유기 액체를 첨가하는 단계를 포함하는 그렐린류의 생물학적 이용율을 개선하는 방법에 관한 것이다.
발명의 효과
본 발명에 따라, 그렐린류를 포함하는 생리활성 펩티드 또는 생리활성 단백질을 유효성분으로 하는 약제로서의 생물학적 이용율(bio availability:BA)을 확보한, 보다 유효한 액상 제제를 제공한다.
또한, 그렐린류를 포함하는 생리활성 펩티드 또는 생리활성 단백질이 용해된 수용액의 피하 주사시 BA 개선 방법을 제공한다.
따라서, 예를 들면 피하 투여에서는 의학적으로 유효한 혈장 농도를 확보하기 어려운 것으로 간주되었으나, 그렐린류를 포함하는 생리활성 펩티드 또는 생리활성 단백질의 혈중 농도를 유지할 수 있어, 의학적인 가치가 매우 높다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하, 본 발명이 제공하는 그렐린류를 포함하는 생리활성 펩티드 또는 생리활성 단백질을 유효성분으로 포함하는 액상 제제 및 BA 개선 방법을 상세하게 설명한다.
본 발명에 따른 그렐린류는 내인성의 성장 호르몬 분비 촉진 인자(GHS)로, 세포내 칼슘 이온 농도를 상승시키는 활성과 성장 호르몬의 분비를 유도하는 활성이 있는 펩티드이다. 본 발명에서는, 각각의 동물에 내재된 천연형 그렐린, 및 상기 그렐린의 펩티드 주쇄의 아미노산 배열 중 그 일부 아미노산이 삽입, 제거, 치환 및/또는 부가된 상기 그렐린과 동등한 생리활성을 나타내는 그렐린 유도체 펩티드를 의미한다.
또한, 본 발명에서는, 인간, 랫, 돼지, 닭, 뱀장어, 소, 말, 양, 개구리, 무지개송어(rainbow trout), 또는 개 유래 그렐린 등과 같이, 각각의 동물에 내재된 천연형 그렐린을 사용하는 것이 바람직하다. 그렐린 유도체는, 바람직하게는, 이들 각각의 동물에 내재된 천연형 그렐린과 동일한 활성을 가지는 펩티드이며, 예를 들면, 3번 위치의 세린 위치에 옥타노일기가 없으며 탄소수 4 내지 12의 지방산에 의해 아실화 수식되어 있는 유도체, 또는 3번 위치의 세린 측쇄에 옥타노일기가 제거된 데스옥타노일(des-octanoyl)체를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 액상 제제의 투여 대상자가 인간일 경우에는 인간의 그렐린을 사용하는 것이 가장 바람직하다.
또한, 그렐린류는 유리 펩티드 이외에도, 염 형태의 것을 포함할 수 있다. 유리 펩티드 및 그 염은 통상적인 방법에 의해 상호 변환 가능하다. 유리 펩티드를 약리적으로 허용가능한 염으로의 변환은, 예를 들면, 유리 펩티드를 무기산 또는 유기산과 반응시킴으로써 수행할 수 있다. 상기 염의 예로는 예를 들면, 탄산염, 중탄산염, 염산염, 황산염, 질산염, 붕산염 등의 무기산과의 염; 및 예를 들면, 숙신산염, 아세트산염, 피로피온산염, 트리플루오로아세트산염 등의 유기산과의 염이 있다.
또한, 상기 염은 무기 염기, 예를 들면, 나트륨, 칼륨 등의 알카리 금속, 칼슘, 마그네슘 등의 알카리 토금속, 또는 유기 염기, 예를 들면, 트리에틸아민 등의 유기 아민류, 아르기닌 등의 염기성 아미노산류 등과의 염을 들 수 있다. 또한, 상기 펩티드는 금속 착물화합물 (예를 들면, 구리착물, 아연착물 등)을 형성할 수도 있다.
또한, 그렐린류의 기원은 특별히 한정되지 않으며, 제조 방법 역시 천연 원료에서 분리하는 방법 이외에도 통상적인 방법에 의한 화학 합성법, 반화학 합성법, 유전자 재조합 방법, 또는 이들의 적절한 조합이나, 생체 추출 등에 의해 수득할 수 있으며, 임의의 방법을 사용할 수 있다. 예컨대, 특허문헌 1에 기재된 방법으로 수득할 수 있다.
본 발명에 따른 액상 제제의 그렐린류의 농도는 의약품으로 제공할 수 있는 범위이면 특별히 한정되지 않는다. 즉, 하한은 의약품으로서 약효를 나타내는 농도일 수 있으며, 상한은 수용액중에 용해가능한 농도일 수 있다. 바람직하게는, 일반적으로 이용되는 제제 포함량인 0.03 nmol/mL 내지 15μmol/mL이며, 보다 바람직하게는 0.03 nmol/mL 내지 6μmol/mL의 범위일 수 있다.
본 발명에 따른 액상 제제에서, 산성 용액은 카르복시기를 가지는 화합물로, 아세트산, 락트산, 구연산, 염산, 피로피온산, 부티르산, 벤조산, 황산, 질산, 붕산, 탄산, 중탄산, 글루콘산, 숙신산, 푸마르산, 말레산, 메탄설폰산, 말산, 트리플루오로아세트산 또는 이들의 염 등이 있다. 또는, 이들 염으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 조합 성분을 포함하는 산성 용액을 포함한다. 바람직하게는, 아세트산, 락트산, 인산, 글리신, 구연산, 염산, 피로피온산, 부티르산, 벤조산 또는 이들의 염으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 조합을 성분으로 하는 산성 용액이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 아세트산, 락트산, 피로피온산, 부티르산 및/또는 인산, 또는 이들의 염으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 조합을 성분으로 하는 산성 용액을 사용한다.
산성 용액의 농도는 특별히 한정되지 않으며, 바람직하게는 BA를 높이는 효과를 가지는 농도일 수 있으며, 1 mM 내지 1000 mM이며, 보다 바람직하게는 10 내지 500 mM이다.
그렐린류의 안정성을 고려하면, 보존중에 수용액의 pH 변동이 낮은 것이 바람직하며, 산성 용액으로서, 완충 기능을 가지는 수용액, 즉 완충액을 사용할 수 있다. 그 경우, 완충액의 pH 범위는 3.0 내지 7.0가 바람직하다. 완충액을 첨가한 후의 액상 제제의 pH는 완충액에 의해 pH가 유지되지만, 완충액의 농도나 특이적인 상황에 따라 pH는 약 0.1 내지 0.2 변동될 수 있으며, 이 역시 본 발명의 범위내에 포함된다.
바람직한 구체적인 완충액으로는, 아세트산 완충액(아세트산 나트륨 완충액, 아세트산 암모늄 완충액을 포함함), 락트산 완충액, 인산 완충액(인산 나트륨 완충액을 포함함), 글리신 염산 완충액, 구연산 완충액(구연산 나트륨 완충액을 포함함), 구연산-인산 완충액(맥일바인(Mcilvaine) 완충액을 포함함), 인산-아세트산-붕산 완충액(브리튼-로빈슨(Britton-Robinson) 완충액을 포함함), 프탈산 완충액, 피로피온산 완충액을 들 수 있다. 이들 완충액을 1종 또는 복수개의 조합을 사용할 수 있다. 본 발명에서는 특히, 아세트산 완충액, 부티르산 완충액, 피로피온산 완충액, 락트산 완충액 및/또는 인산 완충액을 사용하는 것이 바람직하다.
액상 제제의 pH는 3.0 내지 7.0이다. 보다 바람직하게는, pH 4.0 내지 7.0의 범위이다. pH가 3.0보다 낮으면 BA를 상승시키는 효과가 있지만, 액상 제제, 특히 주사제의 경우, 통증을 야기할 수 있는 문제가 있어 바람직하지 않다.
액상 제제의 pH 조절에는 상기 완충액 이외에도, 예를 들면 pH 조절제를 사용할 수 있다. 상기 pH 조절제로는 염산, 황산, 질산, 붕산, 탄산, 중탄산, 글루콘산, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 수용액, 구연산, 모노에탄올아민, 락트산, 아세트산, 숙신산, 푸마르산, 말레산, 인산, 메탄설폰산, 말산, 피로피온산, 트리플루오로 아세트산 또는 이들의 염 등이 있다.
또한, 본 발명에서는, pH 완충액 이외에도 극성 유기 액체를 첨가할 수 있다. 본 발명에서는 산성 용액 이외에도 극성 유기 액체를 첨가하여 피하 주사하였을때의BA가 산성 용액의 단독 사용시의 BA보다 높아, 알코올류를 포함하는 극성 유기 액체를 첨가에 의해 BA를 증가시키는 효과, 또는 흡수 패턴을 조절하는 효과가 있음을 확인하였다.
주사제는 항상 무균 상태이어야 하며, 특히 분할 사용을 목적으로 할 경우에는 보존제 또는 방부제가 첨가될 수 있다. 이러한 목적으로 사용되는 첨가제로는 벤질 알코올, 클로로부탄올, 페놀 및 파라옥시안식향산에스테르류 등이 있다.
또한, 주사제는 투여시 통증을 수반할 수 있어, 무통화제를 첨가할 수도 있다. 이러한 목적으로 사용되는 첨가제로는 벤질알코올, 클로로부탄올, 페놀 또는 프로카인, 크실로카인(xylocaine) 등의 국소 마취제가 있다.
예로, 특허문헌 4에는 약효 성분 이외에도 통증 완화제로서 벤질알코올 또는 그것의 유사 화합물과, 시클로덱스트린을 포함하는 주사제가 공개되어 있다. 벤질알코올은 주사시 통증을 완화시키며, 벤질알코올 또는 그것의 유사 화합물은 벤질알코올에 의한 적혈구 용혈 작용을 방지하기 위한 목적으로 사용된다.
일반적으로, 알코올류는 보존제, 방부제, 무통화제 등으로서 첨가되는 것이지만, 본 발명에서는 알코올류를 포함하는 극성 유기 액체를 산성 용액과 함께 투여하면, 그렐린 액상 제제의 BA를 더욱 상승시키는 효과가 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 사실은 본 발명자들이 최초로 발견한 것이며, 매우 특이적인 일이다.
본 발명에 사용되는 상기 알코올류로는 예컨대, 벤질알코올, 클로로부탄올, 페놀, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 이소프로판올, 2-부탄올, 이소부탄올, 크레졸, m-크레졸, 클로로크레졸, 파라옥시안식향산에스테르류(메틸파라벤, 에틸파라벤 등), 이노시톨, 프로필렌글리콜, 부틸렌 글리콜, 세탄올, 스테아릴알코올, 헥실데칸올, 헥산트리올, 베헤닐알코올, 라우릴알코올, 라놀린알코올, 글리세롤(글리세린), 에틸렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 디에틸렌글리콜 모노부틸에테르, 디에틸렌글리콜 모노메틸에테르, 멘톨, 보르네올, 말톨, 에틸말톨, 유제놀, 게라니올, 티몰, 디이소프로판올아민, 디에탄올아민, 트로메타몰 등을 들 수 있다. 본 발명에서 바람직하게 사용되는 것은, 벤질알코올, 에탄올, 페놀, tert-부탄올 또는 클로로부탄올이다.
또한, 알코올류와 유사하게 BA를 증가시키는 극성 유기 액체로, N-메틸?2-피롤리돈, 디메틸포름아미드, 디메틸설폭사이드, 메틸파라벤을 동일하게 사용할 수 있다.
이들 극성 유기 액체는 1종 또는 복수개를 조합하여 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 극성 유기 액체의 함량은 상술한 효과를 가지는 농도이면서 동시에, 본 발명의 약제 제조시 또는 장기 보존시에 문제가 발생되지 않는 범위에서 적절하게 설정할 수 있다. 예를 들면, 투여시 용액 중의 농도는 0.001-80%(w/v)이며, 바람직하게는 0.1-20%(w/v)의 범위이다.
그 이외에도, 본 발명의 액상 제제에는 목적에 따라 여러가지 첨가제를 첨가할 수 있다. 이러한 첨가제로는, 예컨대, 염화나트륨, 만니톨 등의 등장화제; 벤조산 나트륨 등의 방부제; 아황산수소 나트륨, 피로아황산 나트륨, 아스코르빈산등의 항산화제; 염산 리도카인, 염산메프릴카인 등의 무통화제 등을 적절하게 선택하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 BA가 개선된 그렐린류를 포함하는 생리활성 펩티드 또는 생리활성 단백질을 유효성분으로 포함하는 액상 제제를 제공하며, 또한, 제제마다 필요적인 요건, 예를 들면 주사제이면, 침투압, 용해성, 저자극성, 방부 효과 및 흡착 억제 효과 등을 고려하여, 각종 첨가제를 선택적으로 사용할 수 있다.
본 발명의 액상 제제는 비경구 투여 방법으로 사용할 수 있는 제제이다. 더욱 상세하게는, 주사제, 수액, 비강제(pernasality) 등을 들 수 있다. 주사제의 경우 정맥 주사, 피하 주사, 피내 주사, 근육 주사, 정맥 점적 주사(intravenous drip infusion) 등을 들 수 있으며, 특히 피하 주사, 근육 주사 등이 본 발명이 목적으로 하는 바인 BA 개선 효과가 가장 우수하다.
본 발명에 따른 액상 제제는 제제학적으로 통상적인 제조방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들면, 그렐린류를 포함하는 생리활성 펩티드 또는 생리활성 단백질의 동결 건조품 형태의 약물을 정제수에 용해하고, 또한, 완충액 및 기타 첨가제를 정제수에 용해시킨다. 그 후, 상기 약물 용해액과 첨가제 용해액을 혼합하고, 적절히 멸균 및 여과 등의 공정을 실시한 후, 앰플이나 바이얼 등에 분주하여, 그렐린류를 유효성분으로 하는 제제를 제조할 수 있다.
또한, 주사제를 취할 수 있는 형태로 사용하기 바로 전에 용해하여 사용하는 형태의 제제가 있다. 이러한 제제 타입은 장기간의 용액중 안정성을 확보하기 어려운 경우에 적합한 제형이다. 사용하기 바로 전에 본 발명의 그렐린류를 포함하는 생리활성 펩티드 또는 생리활성 단백질을 유효성분으로 포함하는 액상 제제로 제조되는, 사용시 용해형(dissolved upon use)의 약제도 본 발명의 하나의 형태이다. 용시용해형 약제는 예를 들면, 분말제 등의 고체 조성물로 제공되는 그렐린류에, 목적에 따라 상기 여러가지 첨가제를 적절하게 선택하여, 필요량을 첨가하여 고형 조성물로 제조하며, 또는 그렐린류를 포함하는 수용액에 목적에 따라 상기 여러가지 첨가제를 적절하게 선택하여 필요량을 첨가함으로써 제조한 액체 조성물을 건조시켜 고체 조성물로 제조된다. 이러한 고체 조성물들을 사용할때 물 등의 용매에 용해시켜 사용할 수 있다. 상기 용매에는 물이외에도 의약품으로 허용되는 범위의 용매가 포함될 수 있다. 예를 들면, 에탄올, 2-프로판올 등을 사용할 수 있다.
본 발명에서, 그렐린류를 포함하는 생리활성 펩티드 또는 생리활성 단백질을 고형 조성물로 제공하는 경우, 당류를 사용할 수도 있다. 당류를 산성 용액 및/또는 극성 유기 액체와 함께 첨가하는 경우, 그렐린류를 포함하는 생리활성 펩티드 또는 생리활성 단백질의 BA가 증가되었다.
사용가능한 당류로는 단당류, 예컨대 만니톨, 포도당, 과당, 이노시톨, 소르비톨, 자일리톨 등, 이당류, 예컨대 백당(슈크로오스), 유당, 말토오스, 트레할로스 등, 다당류, 예컨대 스타치, 덱스트란, 플루란, 알긴산, 히알론산, 펙트산(pectic acid), 피트산(phytic acid), 피틴, 키틴, 키토산 등이 있다. 또한, 덱스트린류로는 α-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린, γ-시클로덱스트린, 덱스트린, 하이드록시프로필 스타치, 하이드록시에틸 스타치 등이 있으며, 셀룰로오스류로는 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨 등이 있다. 상기 당류는 1종 또는 복수개를 조합하여 사용할 수도 있다.
바람직하게는, 본 발명에는 특히 만니톨, 백당, 포도당, 시클로덱스트린류가 사용된다. 더 바람직하기로는 시클로덱스트린류이다.
시클로덱스트린류와 관련하여, 인슐린를 피하 주사할때 설포부틸에테르 β-시클로덱스트린 유도체(β-CyDs)를 함께 첨가하며, 랫에서의 BA가 증가하는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 2).
시클로덱스트린류는 의약품과 함께 첨가함으로써, 수용성이 낮은 물질의 용해도가 개선되고 의약품의 보존 안정성이 개선되는 것으로 잘 알려져 있다.
특허문헌 6에는 인터페론 폴리펩티드와 설포알킬에테르 시클로덱스트린을 포함하는 제제가 개시되어 있으며, 상기 제제에서 설포알킬에테르 시클로덱스트린 유도체는 제제 조성물의 보존 안정화제로 사용되어, 인터페론 폴리펩티드의 생물활성을 보유시키는 것을 특징으로 한다.
특허문헌 7에는 생리활성 폴리펩티드와 시클로덱스트린을 포함하는 비강 투여 제제가, 특허문헌 8에는 생리활성을 가지는 폴리펩티드와 시클로덱스트린을 포함하는 질 투여 제제가 개시되어 있다. 생리활성을 가지는 폴리펩티드 모두, 소화관내 또는 소화관벽에 존재하는 효소에 의해 가수분해되므로, 소화관 흡수성을 높인 비주사형 제제인, 경비 투여용 제제 또는 질 투여용 제제를 개발한 것이다. 시클로덱스트린은 생리활성 폴리펩티드의 흡수 촉진제로 사용되었다.
특허문헌 9에는 β- 및 γ-시클로덱스트린류에 의한 인터페론 등의 단백질의 가용화 및 안정화 방법이 개시되어 있다. 그러나, 이들 어느 문헌에도 본 발명의 생리활성 펩티드 또는 생리활성 단백질의 피하 주사시의 BA를 증가시키는 것에 대하여는, 시사하거나 개시되어 있지 않다.
상기 당류는 1종 또는 복수개를 조합하여 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 상기 당류의 함량은 상술한 효과를 가지는 농도일 수 있으며, 동시에, 본 발명의 약제를 제조하는 중에 또는 장기간 보관하는 중에 문제가 발생되지 않는 범위내에서, 또는 물약의 점도가 제조 또는 투여시에 문제를 발생시키지 않는 범위내에서, 적절하게 설정할 수 있다. 예를 들면, 투여시의 용액의 경우, 당류의 농도는 0.1 내지20%(w/v)의 범위인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에서는, 생리활성 펩티드 또는 생리활성 단백질가 그렐린, 그렐린 유도체 또는 그렐린 유사체 등의 그렐린류, 인간 글루카곤형 펩티드-1(hGLP-1), 인간 심방성 나트륨 이뇨 펩티드(hANP), 인간 아드레노메둘린, 인간 부갑상선 호르몬(hPTH(1-34)), 인간 인슐린인 액상 제제에, 산성 용액, 극성 유기 액체, 당류 등을 첨가함으로써, 피하 주사 투여시 BA가 현저하게 증가한다는 사실을 확인하였다. 특히 그렐린류와 같이, 피하 투여시 의학적으로 유효한 혈장 농도를 형성할 수 없는 생리활성 펩티드 또는 생리활성 단백질에 대해, 본 발명은 새로운 투여 형태를 제공한다.
도 1은 인간 그렐린을 5%(w/v) 만니톨 수용액에 용해하여 랫에 정맥내 투여 및 피하 투여한 실험에서, 혈장내 상기 그렐린의 농도 변화를 나타낸 그래프이다(비교예 2).
도 2는 인간 그렐린을 아세트산 나트륨 완충액에 용해하여 랫에 피하 투여한 실험에서, 혈장내 상기 그렐린의 농도 변화를 나타낸 그래프이다(실시예 2).
도 3은 0.1M 아세트산 나트륨 완충액(pH 4.0)에 0-20%(w/v)의 백당을 첨가한 용액에 인간 그렐린을 용해하여 이를 랫에 피하 투여한 실험에서, 혈장내 상기 그렐린의 농도 변화를 나타낸 그래프이다(실시예 8).
도 4는 그렐린을 10, 50, 250 또는 2,000㎍/kg의 투여량으로 랫에 피하 투여한 실험에서, 혈장내 상기 그렐린의 농도 변화를 나타낸 그래프이다(실시예 11). 또한, 0.1M 아세트산 나트륨 완충액(pH 4.0) 및 10%(w/v) 백당을 첨가한 실험 결과이다.
도 5는 그렐린을 10, 50, 250 또는 2,000㎍/kg의 투여량으로 랫에 피하 투여한 실험에서의, 투여량과 AUC의 관계를 나타낸 그래프이다(실시예 11).
도 6은 인간 그렐린을 5%(w/v) 만니톨 수용액 또는 아세트산 나트륨 완충액에 용해하여 랫에 근육내 투여한 실험에서, 혈장내 상기 그렐린의 농도 변화를 나타낸 그래프이다(실시예 21).
도 7은 인간 그렐린을 5%(w/v) 만니톨 수용액 또는 아세트산 나트륨 완충액에 용해하여 키노몰구스 원숭이에 정맥내 투여 또는 피하 투여한 실험에서, 혈장내 상기 그렐린의 농도 변화를 나타낸 그래프이다(실시예 22).
도 8은 인간 그렐린을 5%(w/v) 만니톨 수용액 또는 아세트산 나트륨 완충액에 용해하여 랫에 피하 투여한 실험에서의, 혈장내 성장 호르몬의 농도 변화를 나타낸 그래프이다(실시예 23).
이하, 본 발명은 실시예를 들어, 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명은 하기 실시예로 한정되는 것은 아니다.
본 실시예에 사용된 주된 약호는 각각 이하의 의미를 가진다. 또한, 사용한 시험 방법과 기기는 특별히 기재하지 않는 한, 이하에 기재된 것을 사용하였다.
(사용 기기)
(A) pH 측정
기기: 주식회사 호리바제작소(Horiba Ltd.)의 카스타니(CASTANY)-LAB pH 측정기 F-22
(B) 방사선면역분석(RIA)
기기: Packard Instruments사의 γ-카운터 COBRA-II
(C) 효소면역분석(ELISA)
기기: Molecular Devices Corporation사의 마이크로플레이트 리더
비교예1: 인간 그렐린을 포함하는 제제의 제조(1)
5%(w/v)의 만니톨 수용액, 생리식염수 또는 10%(w/v) 백당 수용액에, 하기 표 2의 농도로 인간 그렐린을 용해하여, 제제 1-5 및 34-35을 제조하였다.
(표 2)
제제 번호 용액 인간 그렐린의 농도
1 5%(w/v) 만니톨 수용액 5㎍/mL
2 5%(w/v) 만니톨 수용액 20㎍/mL
3 5%(w/v) 만니톨 수용액 50㎍/mL
4 5%(w/v) 만니톨 수용액 1,000㎍/mL
5 5%(w/v) 만니톨 수용액 2,000㎍/mL
34 생리식염수 50㎍/mL
35 10%(w/v) 백당 수용액 50㎍/mL
실시예1: 인간 그렐린을 포함하는 제제의 제조(2)
하기 방법으로, 0.5M 아세트산 나트륨 완충액, 0.5M 아세트산 암모늄 완충액, 0.5M 아세트산 완충액, 0.5M 인산 나트륨 완충액, 0.5M 구연산 완충액, 0.5M 글리신 염산 완충액, 1M 락트산 완충액, 0.06M 피로피온산 완충액 및 0.06M n-부티르산 완충액을 괄호 안의 pH 값을 가지는 완충액으로 각각 제조하였다.
(1) 0.5M 아세트산 나트륨 완충액(pH 7.0):
아세트산 나트륨(분자량 82.03) 8.20g에 정제수를 첨가하여 100mL을 만든 후, 여기에 1M 염산을 첨가하여 pH 7.0로 조절하고, 다시 정제수를 첨가하여 총 200mL을 제조하였다.
(2) 0.5M 아세트산 나트륨 완충액(pH 4.0):
아세트산 나트륨(분자량 82.03) 8.20g에 정제수를 첨가하여 100mL을 만든 후, 여기에 1M 염산을 첨가하여 pH 4.0로 조절하고, 다시 정제수를 첨가하여 총 200mL을 제조하였다.
(3) 0.5M 아세트산 나트륨 완충액(pH 5.0):
아세트산 나트륨(분자량 82.03) 8.20g에 정제수ㄹ를 첨가하여 100mL을 만든 후, 여기에 1M 염산을 첨가하여 pH 5.0로 조절하고, 정제수를 첨가하여 총 200mL을 제조하였다.
(4) 0.5M 아세트산 나트륨 완충액(pH 6.0):
아세트산 나트륨(분자량 82.03) 8.20g에 정제수를 첨가하여 100mL을 만든 후, 여기에 1M 염산을 첨가하여 pH 6.0로 조절하고, 정제수를 첨가하여 총 200mL을 제조하였다.
(5) 0.5M 아세트산 암모늄 완충액(pH 4.0):
아세트산 암모늄(분자량 77.08) 7.71g에 정제수를 첨가하여 10OmL로 하고, 여기에 1M 염산을 첨가하여 pH 4.0로 조절하고, 정제수를 첨가하여 총 200mL을 제조하였다.
(6) 0.5M 아세트산 완충액(pH 4.0):
아세트산(분자량 60.05) 6.01g에 정제수를 첨가하여 100mL을 만든 후, 여기에 1M 수산화나트륨을 첨가하여 pH 4.0로 조절하고, 정제수를 첨가하여 총 200mL을 제조하였다.
(7) 0.5M 인산 나트륨 완충액(pH 4.0):
소듐 디하이드로겐 포스페이트 디하이드레이트(분자량 156.01) 15.60g에 정제수를 첨가하여 100 mL로 하고, 여기에 1M 염산을 첨가하여 pH 4.0로 조절하고, 정제수를 첨가하여 총 200mL을 제조하였다.
(8) 0.5M 인산 나트륨 완충액(pH 5.0):
소듐 디하이드로겐 포스페이트 디하이드레이트(분자량 156.01) 15.60g에 정제수를 첨가하여 100 mL로 하고, 여기에 1M 수산화나트륨을 첨가하여 pH 5.0로 조 절하고, 정제수를 첨가하여 20OmL로 제조하였다.
(9) 0.5M 구연산 완충액(pH 4.0):
시트르산 모노하이드레이트(분자량 210.14) 10.51g에 정제수를 첨가하여 10OmL의 구연산 수용액을 제조하고, 또한, 트리소듐 시트레이트(분자량 294.10) 14.71g에 정제수를 첨가하여 100mL의 트리소듐 시트레이트 수용액을 제조하였다. 이후, 상기 구연산 수용액 및 트리소듐 시트레이트 수용액을 혼합하여, pH 4.0를 만들었다.
(10) 0.5M 글리신 염산 완충액(pH 4.0):
글리신(분자량 75.07) 7.51g에 정제수를 첨가하여 100mL을 만든 후, 여기에 1M 염산을 첨가하여 pH 4.0로 조절하고, 정제수를 첨가하여 총 200mL을 제조하였다.
(11) 1M 락트산 완충액(pH 4.0):
락트산(분자량 90.08) 45.04g에 정제수를 첨가하여 250mL을 만든 후, 여기에 1M 수산화나트륨을 첨가하여 pH 4.0로 조절하고, 정제수를 첨가하여 500mL을 제조하였다.
(12) 0.06M 피로피온산 완충액(pH 4.0):
피로피온산(분자량 74.08) 2.22g에 정제수를 첨가하여 250mL을 만든 후, 여기에 1M 수산화나트륨을 첨가하여 pH 4.0로 조절하고, 정제수를 첨가하여 500mL을 제조하였다.
(13) 0.06M n-부티르산 완충액(pH 4.0):
부티르산(분자량 88.11) 2.64g에 정제수를 첨가하여 250mL을 만든 후, 여기에 1M 수산화나트륨을 첨가하여 pH 4.0로 조절하고, 정제수를 첨가하여 500mL을 제조하였다.
상기 완충액 또는 상기 완충액을 적절히 희석한 용액을 산성 용액으로 사용하거나, 또는 다른 첨가물을 용해시켜, 하기 표 3의 농도로 인간 그렐린을 포함하는 제제 6-33, 51-59, 73 및 81-97을 제조하였다.
(표 3.1)
제제 번호 산성 용액(pH) 인간그렐린의농도(㎍/mL) 첨가제
6 0.5M 아세트산 나트륨 완충액(7.0) 50 무첨가
7 0.5M 아세트산 나트륨 완충액(4.0) 50 무첨가
8 0.5M 아세트산 암모늄 완충액(4.0) 50 무첨가
9 0.5M 구연산 완충액(4.0) 50 무첨가
10 0.5M 글리신/염산 완충액(4.0) 50 무첨가
11 0.5M 인산 나트륨 완충액(4.0) 50 무첨가
12 0.5M 아세트산 나트륨 완충액(4.0) 50 10%(w/v) 백당
13 0.1M 아세트산 나트륨 완충액(4.0) 50 10%(w/v) 백당
14 0.03M 아세트산 나트륨 완충액(4.0) 50 10%(w/v) 백당
15 0.01M 아세트산 나트륨 완충액(4.0) 50 10%(w/v) 백당
16 0.1M 아세트산 나트륨 완충액(5.0) 50 10%(w/v) 백당
17 0.1M 아세트산 나트륨 완충액(6.0) 50 10%(w/v) 백당
18 0.5M 인산 나트륨 완충액(4.0) 50 10%(w/v) 백당
19 0.25M 인산 나트륨 완충액(4.0) 50 10%(w/v) 백당
20 0.1M 인산 나트륨 완충액(4.0) 50 10%(w/v) 백당
21 0.5M 인산 나트륨 완충액(5.0) 50 10%(w/v) 백당
22 0.25M 인산 나트륨 완충액(5.0) 50 10%(w/v) 백당
23 0.1M 인산 나트륨 완충액(5.0) 50 10%(w/v) 백당
24 0.1M 아세트산 나트륨 완충액(4.0) 50 무첨가
25 0.1M 아세트산 나트륨 완충액(4.0) 50 20%(w/v) 백당
26 0.1M 아세트산 나트륨 완충액(4.0) 10 10%(w/v) 백당
27 0.1M 아세트산 나트륨 완충액(4.0) 250 10%(w/v) 백당
28 0.1M 아세트산 나트륨 완충액(4.0) 2000 10%(w/v) 백당
29 0.1M 아세트산 나트륨 완충액(4.0) 50 10%(w/v) 백당/1%(w/v) 벤질 알코올
30 0.03M 아세트산 나트륨 완충액(4.0) 50 10%(w/v) 백당/1%(w/v) 벤질 알코올
31 0.03M 아세트산 나트륨 완충액(4.0) 1000 10%(w/v) 백당/1%(w/v) 벤질 알코올
32 0.03M 아세트산 완충액(4.0) 1000 10%(w/v) 백당/1%(w/v) 벤질 알코올
33 0.03M 아세트산 나트륨 완충액(4.0) 2000 10%(w/v) 백당/1%(w/v) 벤질 알코올
51 0.01M 아세트산 완충액(4.0) 50 10%(w/v) 백당/1%(w/v) 벤질 알코올
52 0.03M 아세트산 완충액(3.0) 50 10%(w/v) 백당/1%(w/v) 벤질 알코올
53 0.03M 아세트산 완충액(4.0) 50 10%(w/v) 백당/1%(w/v) 벤질 알코올
54 0.01M 아세트산 완충액(4.0) 50 10%(w/v) 백당/1%(w/v) 벤질 알코올
(표 3.2)
제제
No.		 산성 용액
(pH)		 인간 그렐린의 농도
(㎍/mL)		 첨가제
55 0.03M 락트산 완충액(4.0) 50 10%(w/v) 백당/
1%(w/v) 벤질 알코올
56 0.1M 락트산 완충액(4.0) 50 10%(w/v) 백당/
1%(w/v) 벤질 알코올
57 0.5M 락트산 완충액(4.0) 50 10%(w/v) 백당/
1%(w/v) 벤질 알코올
58 0.03M 프로피온산 완충액(4.0) 50 10%(w/v) 백당/
1%(w/v) 벤질 알코올
59 0.03M n-부티르산 완충액(4.0) 50 10%(w/v) 백당/
1%(w/v) 벤질 알코올
73 16mM 벤조산 50 10%(w/v) 백당
81 0.03M 아세트산 완충액(4.0) 50 10%(w/v) 백당/
0.1%(w/v) 벤질 알코올
82 0.03M 아세트산 완충액(4.0) 50 10%(w/v) 백당/
3%(w/v) 벤질 알코올
83 0.03M 아세트산 완충액(4.0) 50 10%(w/v) 백당/
1%(w/v) 벤질 알코올/
10%(w/v) N-메틸-2-피롤리돈
84 0.03M 아세트산 완충액(4.0) 50 10%(w/v) 포포도당/
1%(w/v) 벤질 알코올
85 0.03M 아세트산 완충액(4.0) 50 10%(w/v) 덱스트란70/
1%(w/v) 벤질 알코올
86 0.03M 아세트산 완충액(4.0) 50 10%(w/v) 백당/
0.5%(w/v) 클로로부탄올
87 0.25M 인산 나트륨 완충액(4.0) 50 10%(w/v) 설포부틸 에테르-β-시클로덱스트린 소듐 염(상표명: Captizol)
88 0.01M 아세트산 나트륨 완충액(4.0) 50 1%(w/v) 설포부틸 에테르-β-시클로덱스트린 소듐 염(상표명: Captizol)
89 0.1M 아세트산 나트륨 완충액(4.0) 50 1%(w/v) 설포부틸 에테르-β-시클로덱스트린 소듐 염(상표명: Captizol)
90 0.1M 아세트산 나트륨 완충액(4.0) 50 1%(w/v)2-하이드록시프로필-β-시클로덱스트린
91 0.01M 아세트산 나트륨 완충액(4.0) 1000 1%(w/v) 설포부틸 에테르-β-시클로덱스트린 소듐 염(상표명: Captizol)
(표 3.3)
제제
No.		 산성 용액
(pH)		 인간 그렐린의 농도(㎍/mL) 첨가제
92 0.1M 아세트산 나트륨 완충액(4.0) 1000 1%(w/v) 설포부틸 에테르-β-시클로덱스트린 소듐 염(상표명: Captizol)
93 0.01M 아세트산 나트륨 완충액(4.0) 1000 10%(w/v) 설포부틸 에테르-β-시클로덱스트린 소듐 염(상표명: Captizol)
94 0.1M 아세트산 나트륨 완충액(4.0) 1000 10%(w/v) 설포부틸 에테르-β-시클로덱스트린 소듐 염(상표명: Captizol)
95 0.03M 아세트산 나트륨 완충액(4.0) 1000 1%(w/v) 설포부틸 에테르-β-시클로덱스트린 소듐 염(상표명: Captizol)/10%(w/v) 백당
96 0.03M 아세트산 나트륨 완충액(4.0) 1000 4%(w/v) 설포부틸 에테르-β-시클로덱스트린 소듐 염(상표명: Captizol)/10%(w/v) 백당
97 0.03M 아세트산 완충액(4.0) 50 10%(w/v) 설포부틸 에테르-β-시클로덱스트린 소듐 염(상표명: Captizol)/1%(w/v) 벤질 알코올
상기 완충액 또는 상기 완충액을 적절하게 희석한 용액을 산성 용액으로 사용하거나, 또는 다른 첨가물을 용해시켜, 하기 표 4의 농도를 가지는 펩티드류를 포함하는 제제 36-50 및 98-107을 제조하였다.
(표 4.1)
제제
No.		 용액 펩티드의 종류 펩티드 농도
36 생리식염수 랫 그렐린 20㎍/mL
37 5%(w/v) 만니톨 수용액 랫 그렐린 50㎍/mL
38 5%(w/v) 만니톨 수용액 인간 데스-옥타노일 그렐린 10㎍/mL
39 5%(w/v) 만니톨 수용액 인간 데스-옥타노일 그렐린 50㎍/mL
40 생리식염수 [L-2-아미노도데카노익산3]그렐린 20㎍/mL
41 5%(w/v) 만니톨 수용액 [L-2-아미노도데카노익산3]그렐린 50㎍/mL
42 생리식염수 인간 글루카곤형 펩티드-1(hGLP-1) 30㎍/mL
43 5%(w/v) 만니톨 수용액 인간 글루카곤형 펩티드-1(hGLP-1) 50㎍/mL
44 5%(w/v) 만니톨 수용액 인간 심방성 나트륨 이뇨 펩티드(hANP) 100㎍/mL
45 5%(w/v) 만니톨 수용액 인간 심방성 나트륨 이뇨 펩티드(hANP) 100㎍/mL
46 5% 포포도당 수용액 인간 아드레노메듈린 75㎍/mL
47 5%(w/v) 만니톨 수용액 인간 아드레노메듈린 150㎍/mL
48 생리식염수 인간 부갑상선 호르몬(hPTH(1-34)) 50㎍/mL
49 5%(w/v) 만니톨 수용액 인간 부갑상선 호르몬(hPTH(1-34)) 50㎍/mL
50 5%(w/v) 만니톨 수용액 인간 인슐린 50㎍/mL
(표 4.2)
제제 No. 용액 펩티드의 종류 펩티드 농도
98 0.03M 아세트산 완충액(4.0)/
10%(w/v) 백당/
1%(w/v) 벤질 알코올		 랫 그렐린 50㎍/mL
99 0.03M 아세트산 완충액(4.0)/
10%(w/v) 백당		 인간 데스-옥타노일 그렐린 50㎍/mL
100 10%(w/v) 백당/
1%(w/v) 벤질 알코올		 인간 데스-옥타노일 그렐린 50㎍/mL
101 0.03M 아세트산 완충액(4.0)/
10%(w/v) 백당/
1%(w/v) 벤질 알코올		 인간 데스-옥타노일 그렐린 50㎍/mL
102 0.03M 아세트산 완충액(4.0)/
10%(w/v) 백당/
1%(w/v) 벤질 알코올		 [L-2-아미노도데카노익산3]그렐린 50㎍/mL
103 0.03M 아세트산 완충액(4.0)/
10%(w/v) 백당/
1%(w/v) 벤질 알코올		 인간 글루카곤형 펩티드-1
(hGLP-1)		 50㎍/mL
104 0.03M 아세트산 완충액(4.0)/
10%(w/v) 백당/
1%(w/v) 벤질 알코올		 인간 심방성 나트륨 이뇨 펩티드(hANP) 100㎍/mL
105 0.03M 아세트산 완충액(4.0)/
10%(w/v) 백당/
1%(w/v) 벤질 알코올		 인간 아드레노메듈린 150㎍/mL
106 0.03M 아세트산 완충액(4.0)/
10%(w/v) 백당/
1%(w/v) 벤질 알코올		 인간 부갑상선 호르몬
(hPTH(1-34)		 50㎍/mL
107 0.03M 아세트산 완충액(4.0)/
10%(w/v) 백당/
1%(w/v) 벤질 알코올		 인간 인슐린 50㎍/mL
산성 용액을 사용하지 않았으며, 다른 첨가물을 용해하여, 하기 표 5의 농도를 가지는 인간 그렐린을 포함하는 제제 60-68, 70-72, 74, 76 및 78-80을 제조하였다.
(표 5)
제제
No.		 당류 인간 그렐린 농도(㎍/mL) 첨가제
60 10%(w/v) 백당 50 1%(w/v) 에탄올
61 10%(w/v) 백당 50 10%(w/v) 에탄올
62 10%(w/v) 백당 50 20%(w/v) 에탄올
63 10%(w/v) 백당 50 1%(w/v)tert-부탄올
64 10%(w/v) 백당 50 1%(w/v)N-메틸-2-피롤리돈
65 10%(w/v) 백당 50 10%(w/v)N-메틸-2-피롤리돈
66 10%(w/v) 백당 50 20%(w/v)N-메틸-2-피롤리돈
67 10%(w/v) 백당 50 10%(w/v)디메틸포름아미드
68 10%(w/v) 백당 50 10%(w/v)디메틸설폭사이드
70 10%(w/v) 백당 50 1%(w/v) 소듐 도데실설페이트(SDS)
71 10%(w/v) 백당 50 0.2%(w/v) 페놀
72 10%(w/v) 백당 50 1%(w/v) 페놀
74 10%(w/v) 백당 50 0.2%(w/v) 메틸파라벤
76 10%(w/v) 백당 50 1%(w/v)프로필렌 글리콜
78 10%(w/v) 백당 50 0.1%(w/v) 벤질 알코올
79 10%(w/v) 백당 50 1%(w/v) 벤질 알코올
80 5%(w/v) 만니톨 50 1%(w/v) 벤질 알코올
이상의 제제에 사용한 의약품 첨가제는 일본 약전에 기재되어 있는 것으로,는, 기재된 규격의 것을 사용하였다.
비교예 2: 랫을 이용한 정맥 주사 및 피하 주사에 의한 약물 동태 시험
비교예 1로 제조한 제제 2 및 3을 랫에 정맥내 투여 또는 피하 투여하여, 혈장 농도를 측정하였다.
시험계로, 생후 7주된 웅성 SD계 랫(일본 찰스?리버사제) 3마리를 각 군에 사용하였다. 정맥내 투여는 미리 랫의 대퇴 동맥에 폴리에틸렌관(PE-50, Clay Adams Co., Ltd)를 삽입하여 실시하였다. 제제 2를 0.5 mL/kg의 투여 용량으로, 꼬리 정맥을 통해 주사기기 및 26G의 주사 바늘(모두 Terumo Co. Ltd.)을 사용하여 투여하고, 투여 전 및 투여 후 1, 3, 5, 10, 20, 30, 60, 90분 후에 대퇴 동맥에 삽입한 폴리에틸렌관을 통해 채혈하였다.
피하 투여도 역시, 미리 랫의 대퇴 동맥에 폴리에틸렌관을 삽입하여 실시하 였다. 제제 3을 1 mL/kg의 투여 용량으로, 등의 피하를 통해 주사기 및 26G의 주사 바늘을 사용하여 투여하였고, 투여 전, 및 투여 후 5, 10, 20, 30분 후에 대퇴 동맥에 삽입한 폴리에틸렌관으로부터 채혈하였다.
각각의 채취한 혈액에는 즉시 1/100 용량의 EDTA?2Na?2H2O 용액 및 1/50 용량의 AEBSF 용액을 첨가하고, 원심분리하여 혈장을 분리하였다. 혈장에는 즉시 1/10 용량의 1N 염산을 첨가, 혼합하고, 측정하기 전까지 -80℃에 보관하였다.
그렐린의 혈장 농도 측정은 항-그렐린 항체를 이용한 방사선면역분석(RIA)법으로 실시하였다. 즉, 혈장 시료에 항-그렐린 항체를 첨가한 뒤, [125I-Tyr29] 그렐린을 첨가하여 경쟁적인 반응을 수행하였다. 여기에 2차 항체를 첨가하여 항-그렐린 항체에 결합한 그렐린을 침강시키고, 상청을 분리한 후 침전 분획의 방사능을 γ-카운터(Packard Instruments Co., Ltd.)로 측정하였다. 여기서 사용한 항-그렐린 항체는 그렐린은 인지하지만 데스-아실 그렐린(그렐린의 옥타노일기가 분해된 불활성체)은 인지하지 못한다. 즉, 본 분석 방법은 활성형의 그렐린을 특이적으로 검출하는 방법이다.
얻어진 혈장중의 그렐린의 농도 변화를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 약물 속도 파라미터로 최고 혈장 농도(Cmax), 최고 혈장 농도 도달 시간(Tmax)을 구하였다. 정맥내 투여에서는 시간 0에서의 외삽값(C0)을 산출하였다. 또한, 혈장 농도 곡선 아래 면적(AUC)을 사다리꼴법으로 산출하고, 이 값으로부터 생물학적 이용율(bio availability:BA)을 구하였다. 그 결과는 표 6에 나타낸다. 그리고, 이들의 값은 각 군의 3마리 랫으로부터 얻어진 값의 평균값이다.
표 6: 그렐린의 5% 만니톨 수용액을 첨가한 제제를 랫에 정맥내 투여 또는 피하 투여하였을 때의 약물 속도 파라미터
(표 6)
제제 번호
투여 경로		 투여용량
(mL/kg)		 C0 또는 Cmax
(ng/mL)		 Tmax
(분)		 AUC
(ng?분/mL)		 BA(%)
2
정맥내 투여		 0.5 40.69+4.28 - 205.98+14.69 -
3
피하 투여		 1 1.70+0.69 6.67+2.89 25.72+9.50 2.5+0.9
상기 표에 나타낸 결과로부터 확인되는 바와 같이, 제제 2를 10㎍/kg의 용량으로 정맥내 투여하였을 때의 AUC은 205.98 ng?분/mL이며, 제제 3을 50㎍/kg의 용량으로 피하 투여하였을 때의 AUC은 25.72 ng?분/mL이었다. 따라서, 5%(w/v) 만니톨 수용액에 용해한 경우의 인간 그렐린의 BA는 2.5%로 산출되었다.
실시예 2: 랫을 이용한 피하 주사에 의한 약물 동태 시험(아세트산나트륨 완충액의 효과)
제제 34, 6 및 제제 7을 비교예 2와 동일하게 1 mL/kg의 투여 용량으로 피하 투여하여, 혈장 농도를 RIA 방법으로 측정하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다. 또한, 약물 속도 파라미터는 하기 표 7에 나타내었다.
표 7: 그렐린 제제를 랫에 피하 투여하였을 때의 약물 속도 파라미터(아세트산 나트륨 완충액의 효과)
(표 7)
제제 번호 투여 용량
(mL/kg)		 Cmax
(ng/mL)		 Tmax
(분)		 AUC
(ng?분/mL)		 BA
(%)
34 1 3.35+1.28 5.00+0.00 51.94+21.60 5.0+2.1
6 1 12.57+1.62 5.00+0.00 235.38+22.59 22.9+2.2
7 1 22.29+8.97 8.33+2.89 363.38+16.64 35.3+1.6
상기 표에서 확인되는 바와 같이, 제제 6 및 제제 7의 BA는 각각 22.9% 및 35.3%이었다. 생리식염수의 용액에 대한 제제 34의 BA가 5.0%, 5%( w/v) 만니톨 수용액에 대한 제제 3의 BA가 2.5%인 것에 비해, 놀랍게도, 0.5M 아세트산 나트륨 완충액을 첨가하였을 때의 BA는 완충액의 pH에 관계없이, 5%(w/v) 만니톨 수용액에 비해 9-14 배로 현저하게 증가하였다.
실시예 3: 랫을 이용한 피하 주사에 의한 약물 동태 시험(산성 용액 성분의 영향)
제제 7, 8, 9, 10 및 11을 비교예 2와 동일하게 1 mL/kg의 투여 용량으로 피하 투여하여, 혈장 농도를 RIA 방법으로 측정하였다. 약물 속도 파라미터는 하기 표 8에 나타내었다.
표 8: 그렐린 제제를 랫에 피하 투여하였을 때의 약물 속도 파라미터(산성 용액 성분의 영향)
(표 8)
제제 번호 투여 용량
(mL/kg)		 Cmax
(ng/mL)		 Tmax
(분)		 AUC
(ng?분/mL)		 BA
(%)
7 1 22.29+8.97 8.33+2.89 363.38+16.64 35.3+1.6
8 1 13.29+4.74 6.67+2.89 214.93+41.01 20.9+4.0
9 1 3.70+1.09 13.33+5.77 72.02+10.33 7.0+1.0
10 1 6.12+3.60 6.67+2.89 91.68+76.60 8.9+7.4
11 1 10.99+5.40 5.00+0.00 167.50+61.11 16.3+5.9
제제 7, 8, 9, 10 및 11의 BA는 각각 35.3%, 20.9%, 7.0%, 8. 9% 및 16.3%이 었다. 즉, pH가 4.0인 임의 성분의 완충액을 산성 용액으로 사용한 경우에도 BA는 5%(w/v) 만니톨 수용액에 비해 현저하게 증가하였다.
실시예 4: 랫을 이용한 피하 주사에 의한 약물 동태 시험(산성 용액 농도의 영향)
제제 12, 13, 14 및 15를 비교예 2와 동일하게 1 mL/kg의 투여 용량으로 피하 투여하여, 혈장 농도를 RIA 방법으로 측정하였다. 그 약물 속도 파라미터는 하기 표 9에 나타내었다.
표 9: 그렐린 제제를 랫에 피하 투여하였을 때의 약물 속도 파라미터(산성 용액 농도의 영향)
(표 9)
제제 번호 투여 용량
(mL/kg)		 Cmax
(ng/mL)		 Tmax
(분)		 AUC
(ng?분/mL)		 BA
(%)
12 1 20.84+6.82 5.00+0.00 350.53+51.36 34.0+5.0
13 1 16.47+2.82 6.67+2.89 289.90+57.30 28.1+5.6
14 1 9.08+2.76 6.67+2.89 142.04+32.17 13.8+3.1
15 1 3.04+0.85 5.00+0.00 49.38+15.82 4.8+1.5
제제 12, 13, 14 및 15의 BA는 각각 34.0%, 28.1%, 13.8% 및 4.8%이었다. 즉, 산성 용액(pH 4.0)의 아세트산 나트륨 농도가 0.01 M-0.5 M인 모든 농도에서도, BA는 5%(w/v) 만니톨 수용액보다도 높게 나타났다.
실시예 5: 랫을 이용한 피하 주사에 의한 약물 동태 시험(액상 제제의 pH 영향)
제제 13, 16 및 17을 비교예 2와 동일하게 1 mL/kg의 투여 용량으로 피하 투여하여, 혈장 농도를 RIA 방법으로 측정하였다. 약물 속도 파라미터는 하기 표 10에 나타내었다.
표 10: 그렐린 제제를 랫에 피하 투여하였을 때의 약물 속도 파라미터(액상 제제의 pH 영향)
(표 10)
제제 번호 투여 용량
(mL/kg)		 Cmax
(ng/mL)		 Tmax
(분)		 AUC
(ng?분/mL)		 BA
(%)
13 1 16.47+2.82 6.67+2.89 289.90+57.30 28.1+5.6
16 1 9.49+2.27 6.67+2.89 170.56+56.93 16.6+5.5
17 1 5.59+1.70 5.00+0.00 93.23+28.88 9.1+2.8
제제 13, 16 및 17의 BA는 각각 28.1%, 16.6% 및 9.1%이었다. 즉, 산성 용액인 아세트산 나트륨 완충액(0.1 M)의 pH가 4.0-6.0인 경우, 모두 BA가 5%(w/v) 만니톨 수용액보다도 높게 나타났다.
실시예 6: 랫을 이용한 피하 주사에 의한 약물 동태 시험(인산 완충액의 농도 및 pH 영향)
제제 18, 19, 20, 21, 22 및 23을 비교예 2와 동일하게 1 mL/kg의 투여 용량으로 피하 투여하여, 혈장 농도를 RIA 방법으로 측정하였다. 약물 속도 파라미터는 하기 표 11에 나타내었다.
표 11: 그렐린 제제를 랫에 피하 투여하였을 때의 약물 속도 파라미터(인산 완충액의 농도 및 pH 영향)
(표 11)
제제 번호 투여 용량
(mL/kg)		 Cmax
(ng/mL)		 Tmax
(분)		 AUC
(ng?분/mL)		 BA
(%)
18 1 8.38
+1.45		 11.67
+7.64		 182.55
+22.06		 17.7
+2.1
19 1 5.00
+0.91		 8.33
+2.89		 82.65
+2.78		 8.0
+0.3
20 1 3.36
+1.66		 5.00
+0.00		 54.11
+25.62		 5.3
+2.5
21 1 8.74
+0.31		 6.67
+2.89		 154.73
+19.02		 15.0
+1.8
22 1 6.68
+3.01		 8.33
+2.89		 109.58
+52.62		 10.6
+5.1
23 1 3.16
+1.26		 6.67
+2.89		 55.23
+28.90		 5.4
+2.8
제제 18, 19, 20, 21, 22 및 23의 BA는 각각 17.7%, 8.0%, 5.3%, 15.0%, 10.6% 및 5.4%이었다. 즉, 산성 용액으로 인산 완충액(pH 4.0-5.0)을 사용한 경우에서도 BA는 5%(w/v) 만니톨 수용액보다도 높게 나타났다.
실시예 7: 랫을 이용한 피하 주사에 의한 약물 이동 시험(알코올류의 종류와 농도의 영향)
제제 14, 30, 81, 82 및 86을 비교예 2와 동일하게 1 mL/kg의 투여 용량으로 피하 투여하여, 혈장 농도를 RIA 방법으로 측정하였다. 약물 속도 파라미터는 하기 표 12에 나타내었다.
표 12: 그렐린 제제를 랫에 피하 투여하였을 때의 약물 속도 파라미터(알코올류의 종류와 농도의 영향)
(표 12)
제제 번호 투여 용량
(mL/kg)		 Cmax
(ng/mL)		 Tmax
(분)		 AUC
(ng?분/mL)		 BA
(%)
14 1 9.08
+2.76		 6.67
+2.89		 142.04
+32.17		 13.8
+3.1
30 1 15.99
+3.66		 5.00
+0.00		 259.89
+43.08		 25.2
+4.2
81 1 13.94
+5.21		 10.00
+0.00		 265.31
+104.94		 25.8
+10.2
82 1 11.77
+5.13		 5.00
+0.00		 141.91
+46.62		 13.8
+4.5
86 1 14.30
+1.50		 6.67
+2.89		 231.96
+43.06		 22.5
+4.2
제제 14, 30, 81, 82 및 86의 BA는 각각 13.8%, 25.2%, 25.8%, 13.8% 및 22.5%이었다. 제제 14는 산성 용액과 당류를 포함하지만, 알코올류를 포함하지 않는 제제이다. 제제 30은 제제 14과 같은 산성 용액과 당류를 포함하고, 또한 알코올류로 벤질알코올을 포함하는 제제이지만, 제제 14의 BA에 비해 2배 높은 BA를 나타내어, 알코올류를 포함하지 않는 제제보다 BA가 높아지는 것을 알 수 있었다. 또한, 알코올류의 종류 및 농도에 관계없이, BA가 높아지는 것을 확인하였다.
실시예 8: 랫을 이용한 피하 주사에 의한 약물 동태 시험(백당의 농도 영향)
제제 24, 13 및 25를 비교예 2와 동일하게 1 mL/kg의 투여 용량으로 피하 투여하여, 혈장 농도를 RIA 방법으로 측정하였다. 그 결과는 도 3에 나타내고, 약물 속도 파라미터는 하기 표 13에 나타내었다.
표 13: 그렐린 제제를 랫에 피하 투여하였을 때의 약물 속도 파라미터(백당의 농도 영향)
(표 13)
제제 번호 투여 용량
(mL/kg)		 Cmax
(ng/mL)		 Tmax
(분)		 AUC
(ng?분/mL)		 BA
(%)		 T1/2
(분)
24 1 22.15
+2.10		 8.33
+2.89		 393.84
+62.46		 38.2
+6.1		 9.74
+1.65
13 1 16.47
+2.82		 6.67
+2.89		 289.90
+57.30		 28.1
+5.6		 13.11
+1.85
25 1 8.99
+0.86		 7.50
+3.54		 199.76
+6.67		 19.4
+0.6		 27.47
+15.69
제제 24, 13 및 25의 BA는 각각 38.2%, 28.1% 및 19.4%이었다. 즉, 산성 용액인 아세트산 나트륨 완충액에 0, 10 및 20%(w/v)의 백당을 첨가했을 때의 BA는 모두 5%(w/v) 만니톨 수용액보다도 높게 나타났다. 산성 용액만을 포함하는 제제 24에 비해, 당류로서 백당을 더 첨가한 제제 13 및 25는 T1/2이 연장되었다.
실시예 9: 랫을 이용한 피하 주사에 의한 약물 동태 시험(당류의 종류의 영향)
제제 35, 53, 84 및 85을 비교예 2와 동일하게 1 mL/kg의 투여 용량으로 피하 투여하여, 혈장 농도를 RIA 방법으로 측정하였다. 약물 속도 파라미터는 하기 표 14에 나타내었다.
표 14: 그렐린 제제를 랫에 피하 투여하였을 때의 약물 속도 파라미터(당류의 종류 따른 영향)
(표 14)
제제 번호 투여 용량
(mL/kg)		 Cmax
(ng/mL)		 Tmax
(분)		 AUC
(ng?분/mL)		 BA
(%)
35 1 1.82
+0.20		 5.00
+0.00		 30.49
+5.03		 3.0
+0.5
53 1 13.59
+3.72		 5.00
+0.00		 230.71
+43.38		 22.4
+4.2
84 1 14.45
+2.88		 5.00
+0.00		 219.06
+23.27		 21.3
+2.3
85 1 5.49
+3.66		 6.67
+2.89		 89.38
+53.97		 8.7
+5.2
제제 35, 53, 84 및 85의 BA는 각각 3.0%, 22.4%, 21.3% 및 8.7%이었다. 백 당만을 포함하는 제제 35의 BA는 증가되었지만 3.0%으로 낮은 수치였다. 산성 용액 및 알코올류의 첨가 조건을 일치시키고 당류의 종류를 변경한 경우의 BA는 모두 5%(w/v) 만니톨 수용액보다도 높게 나타났다. 또한, 당류 중에서도 백당과 포도당이 덱스트란 70 보다도 효과가 높은 것으로 나타났다.
실시예 10: 랫을 이용한 피하 주사에 의한 약물 동태 시험(당류 중에서도 시클로덱스트린류를 사용한 경우의 영향)
제제 87-97을 비교예 2와 동일하게 1 mL/kg의 투여 용량으로 피하 투여하여, 혈장 농도를 RIA 방법으로 측정하였다. 약물 속도 파라미터는 하기 표 15에 나타내었다.
표 15: 그렐린 제제를 랫에 피하 투여하였을 때의 약물 속도 파라미터(당류 중에서도 시클로덱스트린류를 사용한 경우의 영향)
(표 15)
제제 번호 투여 용량
(mL/kg)		 Cmax
(ng/mL)		 Tmax
(분)		 AUC
(ng?분/mL)		 BA
(%)
87 1 10.87
+2.07		 23.33
+5.77		 257.40
+34.41		 25.0
+3.3
88 1 8.29
+1.10		 10.00
+0.00		 356.44
+11.79		 34.6
+1.1
89 1 18.64
+1.79		 10.00
+0.00		 857.01
+253.30		 83.2
+24.6
90 1 18.82
+4.04		 10.00
+0.00		 861.52
+176.63		 83.6
+17.1
91 0.05 7.79
+2.63		 8.33
+2.89		 185.26
+61.90		 18.0
+6.0
92 0.05 27.69
+7.03		 8.33
+2.89		 671.73
+122.02		 65.2
+11.8
93 0.05 11.79
+7.41		 25.00
+30.41		 650.88
+242.71		 63.2
+23.6
94 0.05 17.21
+8.52		 25.00
+30.41		 977.79
+208.78		 94.9
+20.3
95 0.05 11.25
+4.79		 6.67
+2.89		 242.38
+116.53		 23.5
+11.3
96 0.05 19.65
+3.04		 5.00
+0.00		 511.84
+66.67		 49.7
+6.5
97 1 11.87
+1.34		 40.00
+17.32		 1078.71
+86.68		 104.7
+8.4
제제 87 내지 97은 모두 높은 BA를 나타내었다. 당류로 백당을 사용한 제제 53의 BA가 22.4%이고, 포도당을 사용한 제제 84의 BA가 21.3%이며, 당류로 시클로덱스트린류를 사용한 경우에도 동일하게 높은 BA가 확인되었다.
실시예 11: 랫을 이용한 피하 주사에 의한 약물 동태 시험(그렐린 투여량의 영향)
제제 26, 13, 27 및 28을 비교예 2와 동일하게 1 mL/kg의 투여 용량으로 피하 투여하였다. 즉, 그렐린 투여량은 10, 50, 250 및 2,000㎍/kg이다. 채혈은 실시예 2와 동일하게 실시하여 혈장 농도를 RIA 방법으로 측정하고, 그 결과는 도 4 및 5에 나타내었다. 또한, 약물 속도 파라미터는 하기 표 16에 나타내었다.
표 16: 그렐린 제제를 랫에 피하 투여하였을 때의 약물 속도 파라미터(그렐린 투여량의 영향)
(표 16)
제제 번호 투여 용량
(mL/kg)		 Cmax
(ng/mL)		 Tmax
(분)		 AUC
(ng?분/mL)		 BA
(%)
26 1 2.41
+0.18		 10.00
+0.00		 49.28
+4.04		 23.9
+2.0
13 1 16.47
+2.82		 6.67
+2.89		 289.90
+57.30		 28.1
+5.6
27 1 81.36
+19.60		 8.33
+2.89		 1580.28
+351.83		 30.7
+6.8
28 1 653.86
+96.82		 15.00
+8.66		 15050.59
+2720.50		 36.5
+6.6
제제 26, 13, 27 및 28의 AUC은 각각 49.28 ng?분/mL, 289.90 ng?분/mL, 1580.28 ng?분/mL, 및 15050.59 ng?분/mL이며, BA는 각각 23.9%, 28.1%, 30.7% 및 36.5%이었다. 즉, 그렐린 투여량을 10㎍/kg부터 2,000㎍/kg까지 높여도, 흡수에 포화는 보이지 않고, 흡수 개선 효과가 유지되는 것으로 확인되었다.
실시예 12: 랫을 이용한 피하 주사에 의한 약물 동태 시험(벤질알코올의 첨가 영향)
제제 13, 14, 29 및 30을 비교예 2와 동일하게 1 mL/kg의 투여 용량으로 피하 투여하여, 혈장 농도를 RIA 방법으로 측정하였다. 그 약물 속도 파라미터는 하기 표 17에 나타내었다.
표 17: 그렐린 제제를 랫에 피하 투여하였을 때의 약물 속도 파라미터(벤질알코올의 효과)
(표 17)
제제 번호 투여 용량
(mL/kg)		 Cmax
(ng/mL)		 Tmax
(분)		 AUC
(ng?분/mL)		 BA
(%)
13 1 16.47
+2.82		 6.67
+2.89		 289.90
+57.30		 28.1
+5.6
14 1 9.08
+2.76		 6.67
+2.89		 142.04
+32.17		 13.8
+3.1
29 1 19.59
+2.58		 8.33
+2.89		 404.34
+80.11		 39.3
+7.8
30 1 15.99
+3.66		 5.00
+0.00		 259.89
+43.08		 25.2
+4.2
제제 13, 14, 29 및 30의 BA는 각각 28.1%, 13.8%, 39.3% 및 25.2%이었다. 즉, 산성 용액인 아세트산 나트륨 완충액에, 알코올류로 1%(w/v)의 벤질알코올을 첨가하였을 때의 BA는, 아세트산 나트륨 농도가 0.1 M 및 0.03 M인 모든 경우에서, 벤질알코올 비첨가한 경우에 비해 높았으며, 알코올류인 벤질알코올도 그렐린의 BA를 개선하는 효과가 있는 것으로 확인되었다.
실시예 13: 랫을 이용한 피하 주사에 의한 약물 동태 시험(그렐린의 농도 영향)
제제 30 및 31을 비교예 2와 동일하게 피하 투여하였다. 투여 용량은 제제 30은 1 mL/kg, 제제 31은 50㎕/kg으로 하였다(50㎕/kg의 용량으로 투여할 때에는 마이크로 시린지(SGE. Co., Ltd.)를 사용함). 즉, 그렐린 투여량은 양자 모두 50㎍/kg으로 동일하였다. 채혈은 비교예 2와 동일하게 실시하여, 혈장 농도를 RIA 방법으로 측정하였다. 그 약물 속도 파라미터는 하기 표 18에 나타내었다.
표 18: 그렐린 제제를 랫에 피하 투여하였을 때의 약물 속도 파라미터(그렐린 농도의 영향)
(표 18)
제제 번호 투여 용량
(mL/kg)		 Cmax
(ng/mL)		 Tmax
(분)		 AUC
(ng?분/mL)		 BA
(%)
30 1 15.99
+3.66		 5.00
+0.00		 259.89
+43.08		 25.2
+4.2
31 0.05 21.19
+1.47		 6.67
+2.89		 238.83
+32.09		 23.2
+3.1
제제 30 및 31의 BA는 각각 25.2% 및 23.2%이며, 거의 비슷하였다. 즉, 아세트산 나트륨 완충액 및 벤질알코올의 흡수 개선 효과는 그렐린 농도나 투여 용량에 관계없이 유지되는 것으로 확인되었다.
실시예 14: 랫을 이용한 피하 주사에 의한 약물 동태 시험(아세트산 완충액의 제조 방법의 영향)
제제 31 및 32를 50㎕/kg의 투여 용량으로 피하 투여하였다. 즉, 그렐린 투여량은 50㎍/kg이다. 채혈은 비교예 2와 동일하게 실시하여, 혈장 농도를 RIA 방법으로 측정하였다. 그 약물 속도 파라미터는 하기 표 19에 나타내었다.
표 19: 그렐린 제제를 랫에 피하 투여하였을 때의 약물 속도 파라미터(아세트산 완충액의 제조 방법의 영향)
(표 19)
제제 번호 투여 용량
(mL/kg)		 Cmax
(ng/mL)		 Tmax
(분)		 AUC
(ng?분/mL)		 BA
(%)
31 0.05 21.19
+1.47		 6.67
+2.89		 238.83
+32.09		 23.2
+3.1
32 0.05 38.39
+28.38		 5.00
+0.00		 445.28
+262.56		 43.2
+25.5
제제 31 및 32의 BA는 각각 23.2% 및 43.2%이었다. 즉, 산성 용액으로 아세트산 나트륨 수용액을 염산으로 pH 4.0으로 조정한 완충액, 또는 아세트산을 수산화나트륨 용액으로 pH 4.0로 조정한 완충액 모두, 5%(w/v) 만니톨 수용액에 비해 BA가 높았으며, 산성 용액의 성분에 관계없이 BA가 증가하는 것으로 확인되었다.
실시예 15: 랫을 이용한 피하 주사에 의한 약물 동태 시험(아세트산 완충액의 영향)
제제 32, 51, 52 및 53을 비교예 2와 동일하게 1 mL/kg의 투여 용량으로 피하 투여하여, 혈장 농도를 RIA 방법으로 측정하였다. 약물 속도 파라미터는 하기 표 20에 나타내었다
표 2O: 그렐린 제제를 랫에 피하 투여하였을 때의 약물 속도 파라미터(아세트산 완충액의 농도 및 pH 영향)
(표 20)
제제 번호 투여 용량
(mL/kg)		 Cmax
(ng/mL)		 Tmax
(분)		 AUC
(ng?분/mL)		 BA
(%)
32 0.05 21.19
+1.47		 6.67
+2.89		 238.83
+32.09		 23.2
+3.1
51 1 14.52
+1.32		 5.00
+0.00		 234.78
+71.01		 22.8
+6.9
52 1 11.55
+1.62		 6.67
+2.89		 185.48
+24.32		 18.0
+2.4
53 1 13.59
+3.72		 5.00
+0.00		 230.71
+43.38		 22.4
+4.2
제제 32, 51, 52 및 53의 BA는 각각 23.2%, 22.8%, 18.0% 및 22.4%이었다. 제제 32 및 51 내지 53은 BA를 상승시키는 알코올류인 벤질알코올과, 당류인 백당을 첨가하고, 산성 용액으로 아세트산 완충액을 사용한 제제로, 모두 제제 79의 벤질알코올과 백당을 포함하는 제제의 BA인 14.2%보다 BA가 높았으며, 산성 용액, 알코올류 및 당류를 포함하는 제제의 BA가 높음을 알 수 있었다.
실시예 16: 랫을 이용한 피하 주사에 의한 약물 동태 시험(기타 산성 용액의 영향)
제제 54-59 및 73을 비교예 2와 동일하게 1 mL/kg의 투여 용량으로 피하 투여하여, 혈장 농도를 RIA 방법으로 측정하였다. 약물 속도 파라미터는 하기 표 21에 나타내었다.
표 21: 그렐린 제제를 랫에 피하 투여하였을 때의 약물 속도 파라미터(기타 산성 용액의 영향)
(표 21)
제제 번호 투여 용량
(mL/kg)		 Cmax
(ng/mL)		 Tmax
(분)		 AUC
(ng?분/mL)		 BA
(%)
54 1 13.66
+4.85		 5.00
+0.00		 204.81
+48.86		 19.9
+4.7
55 1 13.97
+5.00		 5.00
+0.00		 178.41
+42.96		 17.3
+4.2
56 1 12.16
+3.84		 6.67
+2.89		 229.86
+77.72		 22.3
+7.5
57 1 11.48
+4.49		 6.67
+2.89		 204.27
+87.60		 19.8
+8.5
58 1 15.10
+0.60		 5.00
+0.00		 274.07
+11.37		 26.6
+1.1
59 1 13.52
+3.41		 5.00
+0.00		 238.52
+39.24		 23.2
+3.8
73 1 8.70
+0.96		 5.00
+0.00		 147.75
+25.47		 14.3
+2.5
제제 54-59 및 73의 BA는, 각각 19.9%, 17.3%, 22.3%, 19.8%, 26.6%, 23.2% 및 14.3%이었다. 제제 54 내지 59는, BA를 상승시키는 알코올류인 벤질알코올과, 당류인 백당 문을 첨가한 제제에 있어서, 산성 용액을 사용한 제제이지만, 모두 제제 79의 벤질알코올과 백당을 포함하는 제제의 BA 14.2%보다 높고, 산성 완충액과 알코올류와 당류를 포함하는 제제는 높은 BA를 나타내는 것을 알았다. 또한, 산성 용액의 성분에 관계없이 BA는 상승하였다.
실시예 17: 랫을 이용한 피하 주사에 의한 약물 동태 시험(산성 용액을 포함하지 않는 경우의 알코올류와 당류에 의한 영향)
제제 78-80을 비교예 2와 동일하게 1 mL/kg의 투여 용량으로 피하 투여하여, 혈장 농도를 RIA 방법으로 측정하였다. 약물 속도 파라미터는 하기 표 22에 나타내었다.
표 22: 그렐린 제제를 랫에 피하 투여하였을 때의 약물 속도 파라미터(산성 용액을 포함하지 않을 경우의 알코올류와 당류의 영향)
(표 22)
제제 번호 투여 용량
(mL/kg)		 Cmax
(ng/mL)		 Tmax
(분)		 AUC
(ng?분/mL)		 BA
(%)
78 1 4.84
+1.60		 6.67
+2.89		 85.88
+11.43		 8.3
+1.1
79 1 9.17
+3.65		 5.00
+0.00		 146.27
+30.58		 14.2
+3.0
80 1 12.11
+6.21		 5.00
+0.00		 174.20
+69.76		 16.9
+6.8
제제 78-80의 BA는 각각 8.3%, 14.2%, 16.9%이었다. 백당만을 포함하는 제제 35의 BA는 3.0%이며, 산성 용액 무첨가 및 알코올류 첨가한 제제의 BA는 증가되었다.
실시예 18: 랫을 이용한 피하 주사에 의한 약물 동태 시험(산성 용액을 포함하지 않은 경우에서의 알코올류의 영향)
제 60-63, 71 및 72를 비교예 2와 동일하게 1 mL/kg의 투여 용량으로 피하 투여하여, 혈장 농도를 RIA 방법으로 측정하였다. 약물 속도 파라미터는 하기 표 23에 나타내었다
표 23: 그렐린 제제를 랫에 피하 투여하였을 때의 약물 속도 파라미터(산성 용액을 포함하지 않을 경우에서의 알코올류의 영향)
(표 23)
제제 번호 투여 용량
(mL/kg)		 Cmax
(ng/mL)		 Tmax
(분)		 AUC
(ng?분/mL)		 BA
(%)
60 1 4.96
+1.60		 5.00
+0.00		 78.95
+20.93		 7.7
+2.0
61 1 7.48
+3.20		 8.33
+2.89		 168.30
+82.00		 16.3
+8.0
62 1 1.59
+0.47		 13.33
+5.77		 31.39
+15.09		 3.0
+1.5
63 1 10.95
+2.91		 5.00
+0.00		 202.97
+47.31		 19.7
+4.6
71 1 10.16
+3.54		 5.00
+0.00		 164.08
+51.45		 15.9
+5.0
72 1 8.57
+2.96		 5.00
+0.00		 129.60
+51.53		 12.6
+5.0
제제 60-63, 71 및 72의 BA는 생리식염수 제제 34의 BA가 5.0%이고, 10%(W/V) 백당 수용액 제제 35의 BA가 3.0%인 것에 비해, 대부분이 증가되었다. 산성 용액을 첨가하지 않고, 알코올류만 첨가한 경우, BA는 증가하는 것으로 나타났다.
실시예 19: 랫을 이용한 피하 주사에 의한 약물 동태 시험(산성 용액을 포함하지 않은 경우에서의 알코올류 이외의 극성 유기 액체에 의한 영향)
제제 64-68, 70, 74-76을 비교예 2와 동일하게 1 mL/kg의 투여 용량으로 피하 투여하여, 혈장 농도를 RIA 방법으로 측정하였다. 약물 속도 파라미터는 하기 표 24에 나타내었다.
표 24: 그렐린 제제를 랫에 피하 투여하였을 때의 약물 속도 파라미터(산성 용액을 포함하지 않을 경우에성의 알코올류 이외의 극성 유기 액체에 의한 영향)
(표 24)
제제 번호 투여 용량
(mL/kg)		 Cmax
(ng/mL)		 Tmax
(분)		 AUC
(ng?분/mL)		 BA
(%)
64 1 4.12
+2.18		 5.00
+0.00		 75.76
+17.40		 7.4
+1.7
65 1 9.85
+0.57		 23.33
+11.55		 591.33
+66.15		 57.4
+6.4
66 1 6.95
+1.46		 30.00
+0.00		 418.55
+50.13		 40.6
+4.9
67 1 10.47
+3.04		 13.33
+5.77		 655.33
+82.39		 63.6
+8.0
68 1 9.54
+4.00		 6.67
+2.89		 304.04
+144.01		 29.5
+14.0
70 1 2.14
+1.45		 15.00
+13.23		 29.59
+15.19		 2.9
+1.5
74 1 5.07
+2.27		 6.67
+2.89		 89.20
+36.34		 8.7
+3.5
76 1 3.72
+2.21		 5.00
+0.00		 61.51
+33.12		 6.0
+3.2
제제 64-68, 70, 74, 76의 BA는, 생리식염수 제제 34의 BA가 5.0%이고, 10%(W/V) 백당 수용액 제제 35의 BA가 3.0%인 것에 비하여, 대부분 증가되었다. 산성 용액을 첨가하지 않고, 극성 유기 액체만 첨가하는 경우, BA가 증가되는 것으로 나타났다. 특히, N-메틸?2-피롤리돈에서 BA가 현저히 증가되는 것으로 확인되었다.
실시예 20: 랫을 이용한 피하 주사에 의한 약물 동태 시험(N-메틸-2-피롤리돈에 의한 영향)
제제 83과 65를 비교예 2와 동일하게 1 mL/kg의 투여 용량으로 피하 투여하여, 혈장 농도를 RIA 방법으로 측정하였다. 약물 속도 파라미터는 하기 표 25에 나타내었다.
표 25: 그렐린 제제를 랫에 피하 투여하였을 때의 약물 속도 파라미터(N-메틸?2-피롤리돈에 의한 영향)
(표 25)
제제 번호 투여 용량
(mL/kg)		 Cmax
(ng/mL)		 Tmax
(분)		 AUC
(ng?분/mL)		 BA
(%)
83 1 16.22
+3.13		 10.00
+0.00		 697.53
+102.00		 67.7
+9.9
65 1 9.85
+0.57		 23.33
+11.55		 591.33
+66.15		 57.4
+6.4
제제 83 및 65의 BA는 각각 65.7%, 57.4%로 상당히 높았다. 산성 용액이 포함되지 않은 제제 65에 비해, 산성 용액이 포함된 제제 83의 BA가 높았으며, N-메틸?2-피롤리돈을 단독 사용한 경우에도 BA 상승 효과는 우수하였지만, 산성 용액을 첨가한 경우에 BA가 더욱 증가하였다.
실시예 21: 랫을 이용한 근육내 주사에 의한 약물 동태 시험
근육내 투여는 피하 투여와 마찬가지로, 미리 랫의 대퇴 동맥에 폴리에틸렌관을 삽입하여 실시하였다. 제제 3 및 13을 1 mL/kg의 투여 용량으로, 대퇴부 근육에 주사기 및 26G의 주사 바늘을 사용하여 투여하였다. 채혈은 비교예 2와 동일하게 실시하였고, 혈장 농도를 RIA 방법으로 측정하였다. 그 결과는 도 6에 나타내었다. 또한, 약물 속도 파라미터는 하기 표 26에 나타내었다.
표 26: 그렐린 제제의 랫의 근육내 투여시 약물 속도 파라미터(아세트산 나트륨 완충액의 효과)
(표 26)
제제 번호 투여 용량
(mL/kg)		 Cmax
(ng/mL)		 Tmax
(분)		 AUC
(ng?분/mL)		 BA
(%)
3 1 9.93
+3.64		 5.00
+0.00		 111.92
+39.98		 10.9
+3.9
13 1 16.82
+3.39		 8.33
+2.89		 293.78
+89.38		 28.5
+8.7
정맥내 투여한 경우에 대한, 제제 3 및 13의 근육내 투여시의 BA는 각각 10.9% 및 28.5%이었다. 즉, 아세트산 나트륨 완충액을 첨가하였을 때의 BA는 5%(w/v) 만니톨 수용액에 비해 2.6배 증가되었으며, 근육내 투여도 피하 투여와 동일하게 흡수 개선 효과가 있는 것으로 나타났다.
실시예 22: 키노몰구스 원숭이(cynomolgus)를 이용한 약물의 동태 시험
제제 5 및 33을 키노몰구스 원숭이에 피하 투여하여, 혈장 농도를 측정하였다. 또한, 제제 1을 키노몰구스 원숭이에 정맥내 투여하여, 혈장 농도를 측정하였다.
시험계로, 생후 4-6년 된 웅성 키노몰구스 원숭이(중국산)를 각 군에 3마리씩 사용하였다. 투여 용액은 0.2 mL/body의 투여 용량으로, 등쪽 피하에 주사기 및 26G의 주사 바늘(모두 Terumo Co., Ltd.)을 사용하여 투여하였다.
정맥내 투여는, 투여 용액은 2 mL/kg의 투여 용량으로, 전완 요측피정맥(vena cephalica)에 주사기 및 26G의 주사 바늘(모두 Terumo Co., Ltd.)을 사용 하여 실시하였다.
피하 및 정맥내 투여 모두, 투여 전, 및 투여 후 5, 10, 15, 30, 40, 60, 90, 120분에 전완 요측피정맥에서 채혈하였다. 혈액에는 즉시 1/100 용량의 EDTA?2Na?2H2O 용액 및 1/50 용량의 AEBSF 용액을 첨가하고, 원심분리하여 혈장을 분리하였다. 혈장에는 즉시 1/10 용량의 1N 염산을 첨가 및 혼합하고, 측정하기 전까지 -80℃에 보관하였다.
혈장중의 그렐린 농도는 Active Ghrelin ELISA Kit (Mitsubishi Kagaku latron Inc., Cat. No. MM-401)를 사용하여 효소 면역분석(ELISA) 방법으로 측정하였다. 본 측정법은, RIA 방법과 동일하게, 활성형의 그렐린만을 특이적으로 검출하는 측정법이다.
확인된 혈장중 그렐린 농도 변화는 도 7에 나타내었다. 도 7의 결과로부터, 약물 속도 파라미터 Cmax, Tmax를 구하였다. 또한, AUC을 사다리꼴법으로 산출하고, 그 값으로 BA를 구하였다. 그 결과는 하기 표 27에 나타내었다. 한편, 이의 값들은 각 군마다 3마리의 키노몰구스 원숭이로부터 얻어진 값의 평균값이다.
표 27: 그렐린 제제를 키노몰구스 원숭이에 정맥내 투여 또는 피하 투여하였을 때의 약물 속도 파라미터
(표 27)
제제 번호
투여 경로		 투여 용량 투여량
(㎍/kg)		 C0 또는 Cmax
(ng/mL)		 Tmax
(분)		 AUC
(ng?분/mL)		 BA
(%)
1
정맥내 투여		 2mL/kg 10 126.53
+27.67		 - 1290.83
+165.21		 -
5
피하 투여		 0.2mL/body 108
+3		 39.66
+8.22		 6.67
+2.89		 684.33
+47.00		 4.9
+0.5
33
피하 투여		 0.2mL/body 100
+14		 66.31
+9.68		 6.67
+2.89		 1586.10
+646.73		 12.8
+5.8
제제 5 및 33을 피하 투여하였을 때 정맥내 투여에 대한 BA는, 각각 4.9% 및 12.8%이었다. 즉, 1%(w/v)의 벤질알코올을 포함하는 아세트산 나트륨 완충액을 첨가한 제제의 BA는, 5%(w/v) 만니톨 수용액 제제에 비해, 2.6배 증가하였고, 키노몰구스 원숭이에서도 랫과 마찬가지로, 벤질알코올이 그렐린의 흡수를 개선시키는 효과가 있는 것으로 나타났다.
실시예 23: 그렐린 제제의 랫의 혈장 중 성장 호르몬 상승 작용
랫에 그렐린을 투여한 이후의 혈장중 성장 호르몬(GH) 상승 작용을, 제제 4 및 31을 사용하여 아래와 같이 검토하였다.
시험계로, 생후 7주 된 웅성 SD계 랫(Charles River Laboratories Japan Inc.) 3마리를 1군으로 이용하고, 미리 대퇴동맥에 폴리에틸렌관(PE-50, Clay Adams Co., Ltd.)를 삽입하여 실시하였다.
투여 용액은 50㎕/kg의 투여 용량으로, 등쪽 피하에 주사기 및 26G의 주사 바늘(모두 Terumo Co., Ltd.)을 사용하여 투여하고, 투여 전, 및 투여 후 5, 10, 20, 30, 60분에 대퇴동맥에 삽입한 폴리에틸렌관로부터 채혈하였다. 혈액에는 즉시 1/100 용량의 EDTA?2Na?2H2O 용액을 첨가하여 원심분리함으로써 혈장을 분리하 고, 측정하기 전까지 -80℃에 보관하였다.
혈장의 GH 농도는 랫 성장 호르몬(Rat growth hormone)(rGH) (125I) 분석 시스템(Amersham Bioscience Co., Ltd.: Cat. No. RPA551)을 사용한 방사선 면역 분석(RIA) 방법으로 측정하였다. 얻어진 혈장 GH의 농도 변화는 도 8에 나타내었다. 상기 값은 각 군의 3마리 랫으로부터 얻어진 값의 평균값이다.
도면에 나타낸 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 제제 4를 피하 투여하면 혈장내 GH의 농도는 투여 전(113ng/mL)에 비해 일부 증가하였으며, 투여 5분 후에는 정상치(208ng/mL)를 나타내었다. 이에 비해, 제제 31을 피하 투여한 경우 혈장내 GH의 농도는 투여한지 20분 후에 정상치(316ng/mL)를 보였으며, 이는 투여 전(96ng/mL)에 비해 3.3배 높은 수치이다. 따라서, 그렐린 제제를 투여한 후 발생되는 혈장내 GH의 농도 상승 작용에는, 아세트산 나트륨 및 벤질알코올을 포함하는 제제가 유효한 것으로 밝혀졌다.
실시예 24: 랫을 이용한 피하 주사에 의한 약물 동태 시험(그렐린류에 대한 영향)
제제 37, 39, 41 및 98-102을 비교예 2와 동일하게 1 mL/kg의 투여 용량으로 피하 투여하여, 혈장 농도를 RIA 방법으로 측정하였다. 약물 속도 파라미터는 하기 표 28에 나타내었다. 제제 36, 38, 40을 비교예 2와 동일하게 1 mL/kg의 투여 용량으로 정맥내 투여하고, 혈장 농도를 RIA 방법으로 측정하였다. 상기 값으로부 터 BA를 구하였다.
또한, 랫 그렐린의 혈장 농도를 인간 그렐린과 동일한 방법으로 측정하였으며, 인간 데스-옥타노일체의 혈장 농도는 항-그렐린 항체를 이용한 방사선 면역분석(RIA) 방법으로 구하였다. 즉, 혈장 시료에 항-그렐린 항체를 첨가한 다음, [125I-Tyr]그렐린(13-28)을 첨가하여 경쟁적으로 반응시켰다. 여기에, 2차 항체를 첨가하여 항-그렐린 항체에 결합된 그렐린은 침강시키고, 상청 분리하여 침전 분획의 방사능을 γ-카운터(Packard Instruments Co., Ltd.)로 측정하였다. 그리고, 상기 항-그렐린 항체는 그렐린과 데스-옥타노일체를 동등하게 인식한다.
또한, 아미노도데칸 인간 그렐린(Adod 그렐린)의 혈장 농도는 항-Adod 그렐린 항체를 이용한 방사선 면역 분석(RIA) 방법으로 측정하였다. 즉, 혈장 시료에 항-Adod 그렐린 항체를 첨가한 다음, [125I]표지 항체를 첨가하여 경쟁 반응을 실시하였다. 여기에, 2차 항체를 첨가하여 항-Adod 그렐린 항체에 결합된 Adod 그렐린은 침강시키고, 상청은 분리하여, 침전 분획의 방사능을 γ-카운터(Packard Instruments Co., Ltd.)로 측정하였다.
표 28: 그렐린류를 랫에 피하 투여하였을 때의 약물 속도 파라미터
(표 28)
제제 번호
투여 경로		 투여 용량
(mL/kg)		 Cmax
(ng/mL)		 Tmax
(분)		 AUC
(ng?분/mL)		 BA
(%)
36
정맥내 투여		 1 188.34
+180.25		 - 478
+198		 -
37
피하 투여		 1 3.94
+1.71		 5.00
+0.00		 55.58
+12.99		 4.7
+1.1
98
피하 투여		 1 20.34
+2.99		 6.67
+2.89		 332.40
+64.97		 27.8
+5.4
38
정맥내 투여		 1 45.15
+4.04		 - 584.69
+71.77		 -
39
피하 투여		 1 24.79
+5.56		 16.67
+5.77		 636.02
+139.77		 21.7
+4.8
99
피하 투여		 1 44.35
+5.56		 16.67
+5.77		 1047.20
+185.63		 35.8
+6.3
100
피하 투여		 1 47.12
+4.39		 16.67
+5.77		 1212.94
+91.19		 41.5
+3.1
101
피하 투여		 1 52.67
+8.45		 16.67
+5.77		 1252.98
+115.29		 42.8
+3.9
40
정맥내 투여		 1 154.65
+10.13		 - 2991.13
+173.15		 -
41
피하 투여		 1 6.67
+3.30		 20.00
+10.00		 291.67
+124.33		 3.9
+1.7
102
피하 투여		 1 52.27
+5.43		 10.00
+0.00		 2194.50
+341.83		 29.3
+4.6
그렐린류, 랫 그렐린, 데스-옥타노일(인간 그렐린의 3번 위치, 세린 측쇄의 옥타노일기가 제거된 형태), [L-2-아미노도데칸산3] 인간 그렐린은, 인간 그렐린과 마찬가지로, 당류, 알코올류를 포함하는 극성 유기 액체 및 산성 용액이 첨가된 제제 형태일 경우에, 피하 주사시의 BA가 현저하게 증가한다는 것을 알 수 있었다.
실시예 25: 랫의 피하 주사에 의한 약물 동태 시험(기타 생리활성 펩티드, 단백질의 영향)
제제 43, 45, 47, 49, 50, 103-107은 비교예 2와 동일하게 1 mL/kg의 투여 용량으로 피하 투여하여, 혈장 농도를 RIA 방법으로 측정하였다. 약물 속도 파라미터는 하기 표 29에 나타내었다. 제제 42, 44, 46, 48은 비교예 2와 동일하게 1 mL/kg의 투여 용량으로 정맥내 투여하고, 혈장 농도를 RIA 방법으로 측정하였다. 이러한 측정치로부터 BA를 구하였다.
그리고, 인간 부갑상선 호르몬(1-34)(hPTH)의 혈장 농도는 항-PTH 항체를 이용한 방사선 면역 분석(RIA) 방법으로 측정하였다. 즉, 혈장 시료에 항-PTH 항체를 첨가한 다음, [125I-Tyr34]PTH(1-34)을 첨가하여 경쟁적으로 반응시켰다. 여기에, 2차 항체를 첨가하여 항-PTH 항체에 결합된 PTH(1-34)은 침강시키고, 상청은 분리하여, 침전 분획의 방사능을 γ-카운터(Packard Instruments Co., Ltd.)로 측정하였다.
인간 글루카곤형 펩티드-1(GLP-1)의 혈장 농도는 Glucagon-like Peptide-1(Active) ELISA 키트(LINCO Research Inc.)를 사용하여 효소 면역 분석(ELISA) 방법으로 측정하였다.
인간 아드레노메둘린의 혈장 농도는 AM mature RIA Shionogi(Shionogi Co., Ltd.)를 이용하여 방사선 면역 분석(RIA) 방법으로 측정하였다.
인간 인슐린의 혈장 농도는 인슐린-RIA-bead II(Yamasa Co., Ltd.)를 이용하여 방사선 면역 분석(RIA) 방법으로 측정하였다.
인간 심방성 나트륨 이뇨 펩티드(hANP)의 혈장 농도는 Shiono RIA ANP(Shionogi Co., Ltd.)를 이용하여 방사선 면역 분석(RIA) 방법으로 측정하였다.
표 29: 다른 생리활성 펩티드 및 단백질을 랫에 피하 투여하였을 때의 약물의 속도 파라미터
(표 29)
제제 번호
투여 경로		 투여 용량
(mL/kg)		 Cmax
(ng/mL)		 Tmax
(분)		 AUC
(ng?분/mL)		 BA
(%)
T2
정맥내 투여		 1 413
+291		 - 294
+184		 -
T3
피하 투여		 1 1.74
+0.86		 5.00
+0.00		 24.00
+7.26		 4.9
+1.5
103
피하 투여		 1 5.74
+0.47		 5.00
+0.00		 68.50
+6.95		 14.0
+1.4
44
정맥내 투여		 1 995
+178		 - 1136
+142		 -
45
피하 투여		 1 5.46
+3.55		 5.00
+0.00		 71.64
+51.00		 6.3
+4.5
104
피하 투여		 1 11.89
+1.95		 5.00
+0.00		 162.37
+19.63		 14.3
+1.7
46
정맥내 투여		 1 30.90
+19.33		 - 201.8
+4.0		 -
47
피하 투여		 1 0.89
+0.92		 16.67
+5.77		 30.10
+30.93		 7.5
+7.7
105
피하 투여		 1 1.81
+0.38		 6.67
+2.89		 42.29
+12.98		 10.5
+3.2
48
정맥내 투여		 1 216.36
+19.31		 - 2423.3
+288.7		 -
49
피하 투여		 1 11.66
+8.98		 11.67
+5.77		 320.77
+133.23		 13.2
+5.5
106
피하 투여		 1 16.34
+1.77		 15.00
+0.00		 626.68
+48.25		 25.9
+2.0
50
피하 투여		 1 8.17
+1.74		 20.00
+8.66		 388.04
+113.97		 18.5
+5.4
107
피하 투여		 1 27.30
+3.95		 15.00
+0.00		 1254.64
+397.47		 59.8
+18.9
펩티드류로 랫 그렐린, 데스아실 인간 그렐린(인간 그렐린의 3번 위치 세린의 측쇄 옥타노일기가 제거된 데스-옥타노일), [L-2-아미노도데칸산3] 인간 그렐린, 인간 글루카곤형 펩티드-1(hGLP-1), 인간 심방성 나트륨 이뇨 펩티드(hANP), 인간 아드레노메둘린, 인간 부갑상선 호르몬(hPTH(1-34)), 인간 인슐린 역시, 그렐린류와 마찬가지로, 당류, 알코올류 및 산성 용액을 첨가한 제제의 형태로 피하 주사하는 경우, BA가 현저하게 증가함을 알 수 있었다.
제조예 1: pH를 조절한 인간 그렐린을 포함하는 의약 조성물의 제조
그렐린 중 하나로, 인간 그렐린을 정제수에 용해하여, 인간 그렐린 농도가 약 0.15μmol/mL(=0.5mg/mL)인 수용액을 제조하였다. 이 수용액의 pH를 측정하면서 0.1M 염산 수용액을 소량 첨가하여, 최종 pH를 4.0에 조절함으로써, 인간 그렐린을 포함하는 수용액을 의약 조성물로 수득하였다.
제조예 2: 랫 그렐린을 아세트산 완충액에 용해시킨 의약 조성물의 제조
그렐린 중, 랫 그렐린을 0.05M 아세트산 완충액(pH 4.0)에 용해하여, 랫 그렐린의 농도가 약 0.15μmol/mL(=0.5mg/mL)인 수용액을 의약 조성물로 제조하였다. 이 수용액의 pH를 측정하였고, pH는 4.0이었다.
제조예 3: 인간 그렐린 의약 조성물의 제조
그렐린 중, 인간 그렐린을 벤질알코올과 함께 0.05M 아세트산 완충액(pH 4.0)에 용해하여, 인간 그렐린의 농도가 약 0.15μmol/mL(=0.5mg/mL)이고, 벤질알코올의 농도가 약 1% (w/v)인 수용액를 의약 조성물로 제조하였다. 이 수용액의 pH를 측정하였고, pH는 4.0이었다.
제조예 4: 인간 그렐린 의약 조성물의 제조
그렐린 중 인간 그렐린을, 벤질알코올 및 백당과 함께 정제수에 용해하여, 인간 그렐린의 농도가 약 0.15μmol/mL(=0.5mg/mL)이고, 벤질알코올의 농도가 약 1%(w/v)이고, 백당의 농도가 10%(w/v)인 수용액을 의약 조성물로 제조하였다. 이 수용액의 pH를 측정하였고, pH는 4.7이었다.
제조예 5: 인간 그렐린 의약 조성물의 제조
그렐린 중 인간 그렐린을, 벤질알코올 및 백당과 함께 0.1M 아세트산 완충액(pH 4.0)에 용해 및 혼합하여, 인간 그렐린 농도가 약 0.15μmol/mL(=0.5mg/mL)이고, 벤질알코올의 농도가 약 1%(w/v)이고, 백당의 농도가 10%(w/v)인 수용액을 의약 조성물로 제조하였다. 이 수용액의 pH를 측정하였고, pH는 4.0이었다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 그렐린류를 포함하는 생리활성 펩티드 또는 생리활성 단백질 약제의 생물학적 이용율(bio availability: BA)을 확보하여, 보다 유효한 액상 제제를 제공하며, 또한, 그렐린류를 포함하는 생리활성 펩티드 또는 생리활성 단백질이 용해된 수용액의 피하 주사에 따른 BA 개선 방법을 제공한다.
일반적으로 피하 투여에 의한 흡수 과정에서 생리활성 펩티드 또는 생리활성 단백질이 프로테아제 등에 의해 분해되어 정맥 주사 투여시에 비해 BA가 낮아지지만, 본 발명에 따른 그렐린류를 포함하는 생리활성 펩티드 또는 생리활성 단백질의 액상 제제는, 피하 주사 투여에서도 그렐린류를 포함하는 생리활성 펩티드 또는 생리활성 단백질을 유효한 수준으로 혈중에 유지시킬 수 있어, 본 발명의 의료적인 가치는 매우 높다.
SEQUENCE LISTING <110> DAIICHI SUNTORY PHARMA CO., LTD. <120> Liquid Preparation Containing Physiologically Active Peptides <130> DSP461 <160> 21 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(28) <223> Amino acid sequence for human endogenous peptides of growth hormo ne secretagogue <400> 1 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys 1 5 10 15 Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg 20 25 <210> 2 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(27) <223> Amino acid sequence for human endogenous peptides (27 amino acids ) of growth hormone secretagogue <400> 2 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Arg Lys Glu 1 5 10 15 Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg 20 25 <210> 3 <211> 28 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(28) <223> Amino acid sequence for rat endogenous peptides of growth hormone secretagogue <400> 3 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys 1 5 10 15 Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg 20 25 <210> 4 <211> 27 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(27) <223> Amiino acid sequence for rat endogenous peptides of growth hormon e secretagogue <400> 4 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Arg Lys Glu 1 5 10 15 Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg 20 25 <210> 5 <211> 28 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(28) <223> Amino acid sequence for mouse endogenous peptides of growth hormo ne secretagogue <400> 5 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys 1 5 10 15 Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg 20 25 <210> 6 <211> 28 <212> PRT <213> Sus scrofa <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(28) <223> Amino acid sequence for porcine endogenous peptides of growth hor mone secretagogue <400> 6 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Val Gln Gln Arg Lys 1 5 10 15 Glu Ser Lys Lys Pro Ala Ala Lys Leu Lys Pro Arg 20 25 <210> 7 <211> 27 <212> PRT <213> Bos taurus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(27) <223> Amino acid sequence for bovine endogenous peptides (27 amino acid s) of growth hormone secretagogue <400> 7 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Arg Lys Glu 1 5 10 15 Ala Lys Lys Pro Ser Gly Arg Leu Lys Pro Arg 20 25 <210> 8 <211> 27 <212> PRT <213> Ovis aries <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(27) <223> Amino acid sequence for ovine endogenous peptides (27 amino acids ) of growth hormone secretagogue <400> 8 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Arg Lys Glu 1 5 10 15 Pro Lys Lys Pro Ser Gly Arg Leu Lys Pro Arg 20 25 <210> 9 <211> 28 <212> PRT <213> Canis familiaris <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(28) <223> Amino acid sequence for dog endogenous peptides of growth hormone secretagogue <400> 9 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Gln Arg Lys 1 5 10 15 Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg 20 25 <210> 10 <211> 21 <212> PRT <213> Anguilla japonica <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <223> Amino acid sequence for eel endogenous peptides of growth hormone secretagogue. This peptide is amidated at C-terminus. <400> 10 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Arg Pro Gln Gly Lys Asp Lys 1 5 10 15 Lys Pro Pro Arg Val 20 <210> 11 <211> 23 <212> PRT <213> Oncorhynchus mykiss <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(23) <223> Amino acid sequence for rainbow trout endogenous peptides (23 ami no acids) of growth hormone secretagogue. This peptide is amidate d at C-terminus. <400> 11 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Lys Pro Gln Val Arg Gln Gly 1 5 10 15 Lys Gly Lys Pro Pro Arg Val 20 <210> 12 <211> 20 <212> PRT <213> Oncorhynchus mykiss <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(20) <223> Amino acid sequence for rainbow trout endogenous peptides (20 ami no acids) of growth hormone secretagogue. This peptide is amidat ed at C-terminus. <400> 12 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Lys Pro Gln Gly Lys Gly Lys 1 5 10 15 Pro Pro Arg Val 20 <210> 13 <211> 24 <212> PRT <213> Gallus domesticus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(24) <223> Amino acid sequence for chicken endogenous peptides of growth hor mone secretagogue <400> 13 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Tyr Lys Asn Ile Gln Gln Gln Lys 1 5 10 15 Gly Thr Arg Lys Pro Thr Ala Arg 20 <210> 14 <211> 24 <212> PRT <213> Gallus domesticus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(24) <223> Amino acid sequence for chicken endogenous peptides of growth hor mone secretagogue <400> 14 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Tyr Lys Asn Ile Gln Gln Gln Lys 1 5 10 15 Asp Thr Arg Lys Pro Thr Ala Arg 20 <210> 15 <211> 26 <212> PRT <213> Gallus domesticus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(26) <223> Amino acid sequence for chicken endogenous peptides of growth hor mone secretagogue <400> 15 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Tyr Lys Asn Ile Gln Gln Gln Lys 1 5 10 15 Asp Thr Arg Lys Pro Thr Ala Arg Leu His 20 25 <210> 16 <211> 27 <212> PRT <213> Rana catesbeiana <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(27) <223> Amino acid sequence for frog endogenous peptides of growth hormon e secretagogue <400> 16 Gly Leu Thr Phe Leu Ser Pro Ala Asp Met Gln Lys Ile Ala Glu Arg 1 5 10 15 Gln Ser Gln Asn Lys Leu Arg His Gly Asn Met 20 25 <210> 17 <211> 28 <212> PRT <213> Rana catesbeiana <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(28) <223> Amino acid sequence for frog endogenous peptides of growth hormon e secretagogue <400> 17 Gly Leu Thr Phe Leu Ser Pro Ala Asp Met Gln Lys Ile Ala Glu Arg 1 5 10 15 Gln Ser Gln Asn Lys Leu Arg His Gly Asn Met Asn 20 25 <210> 18 <211> 20 <212> PRT <213> Tilapia nilotica <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(20) <223> Amino acid sequence for tilapia endogenous peptides of growth hor mone secretagogue. This peptide is amidated at C-terminus.Amidation <400> 18 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Lys Pro Gln Asn Lys Val Lys 1 5 10 15 Ser Ser Arg Ile 20 <210> 19 <211> 22 <212> PRT <213> Silurus asotus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> Amino acid sequence for catfish endogenous peptides of growth hor mone secretagogue. This peptide is amidated at C-terminus. <400> 19 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Gln Lys Pro Gln Asn Arg Gly Asp 1 5 10 15 Arg Lys Pro Pro Arg Val 20 <210> 20 <211> 23 <212> PRT <213> Silurus asotus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(23) <223> Amino acid sequence for catfish endogenous peptides of growth hor mone secretagogue <400> 20 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Gln Lys Pro Gln Asn Arg Gly Asp 1 5 10 15 Arg Lys Pro Pro Arg Val Gly 20 <210> 21 <211> 28 <212> PRT <213> Equus caballus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(28) <223> Amino acid sequence for equine endogenous peptides of growth horm one secretagogue <400> 21 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His His Lys Val Gln His Arg Lys 1 5 10 15 Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Lys Pro Arg 20 25

Claims (30)

  1. 유효성분을 함유하며, 또한 (i) 산성 용액과 극성 유기 액체를 포함하거나, 또는 (ii) 극성 유기 액체를 포함하는 액상 제제로서, 이하의 제제로부터 선택되는 액상 제제:
    (1) 인간 그렐린(296.7 nmol/mL)을 유효 성분으로서 함유하고, 아세트산 완충액(0.03 M, pH 4.0)을 산성 용액으로서 함유하고, 벤질알콜 (1 %(w/v))을 극성 유기 액체로서 함유하며, 또한 백당(10 %(w/v))을 함유하는 것을 특징으로 하는 액상 제제;
    (2) 인간 그렐린(14.8 nmol/mL)을 유효 성분으로서 함유하고, 아세트산 완충액(0.03 M, pH 4.0)을 산성 용액으로서 함유하고, 벤질알콜(1 %(w/v)) 및 N-메틸-2-피롤리돈(10 %(w/v))을 극성 유기 액체로서 함유하며, 또한 백당(10 %(w/v))을 함유하는 것을 특징으로 하는 액상 제제;
    (3) 인간 그렐린(14.8 nmol/mL)을 유효 성분으로서 함유하고, 아세트산 완충액(0.03 M, pH 4.0)을 산성 용액으로서 함유하고, 벤질알콜 (1 %(w/v))을 극성 유기 액체로서 함유하며, 또한 설포부틸에테르 β-시클로덱스트린 나트륨염(10 %(w/v))을 함유하는 것을 특징으로 하는 액상 제제;
    (4) 인간 그렐린(14.8 nmol/mL)을 유효 성분으로서 함유하고, N-메틸-2-피롤리돈(10 %(w/v))을 극성 유기 액체로서 함유하며, 또한 백당(10 %(w/v))을 함유하는 것을 특징으로 하는 액상 제제;
    (5) 인간 그렐린(14.8 nmol/mL)을 유효 성분으로서 함유하고, N-메틸-2-피롤리돈(20 %(w/v))을 극성 유기 액체로서 함유하며, 또한 백당(10 %(w/v))을 함유하는 것을 특징으로 하는 액상 제제; 및
    (6) 인간 그렐린(14.8 nmol/mL)을 유효 성분으로서 함유하고, 디메틸포름아미드(10 %(w/v))를 극성 유기 액체로서 함유하며, 또한 백당(10 %(w/v))을 함유하는 것을 특징으로 하는 액상 제제.
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  15. 제1항에 있어서, 상기 액상 제제는 주사용 액상 제제인 것을 특징으로 하는 액상 제제.
  16. 제15항에 있어서, 상기 주사용 액상 제제는 피하 주사용 제제 또는 근육내 주사용 제제인 것을 특징으로 하는 액상 제제.
  17. 삭제
  18. 그렐린을 용해한 수용액에, (i) 산성 용액과 극성 유기 액체, 또는 (ii) 극성 유기 액체를 첨가하는 단계를 포함하는, 그렐린의 생물학적 이용율이 개선된 액상 제제의 제조 방법으로서, 상기 그렐린, 산성 용액, 및 극성 유기 액체는 제1항에 기재된 조합으로 사용되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
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