JP2004513069A - ペプチド医薬処方 - Google Patents
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Abstract
哺乳動物に投与するための医薬組成物が開示される。組成物は，治療上有効量のペプチド，例えばＧＬＰ−１分子，ＰＴＨ分子，またはＧＲＦ分子を含む。組成物はさらに，約１ｘ１０−５より大きい値の酸解離定数を有する弱酸，例えば酢酸を含む緩衝液を含む。組成物はまた，組成物を一般に等張にするための賦形剤，例えばＤ−マンニトールを含む。
Description
【０００１】
本出願は，米国特許出願６０／２０５，３７７（２０００年５月１７日出願）および米国特許出願６０／２０５，２６２（２０００年５月１９日出願）に基づく優先権を主張する。いずれの出願も本明細書の一部としてここに引用する。
【０００２】
発明の分野
本発明は，一般にペプチドの医薬処方に関する。より詳細には，本発明は，ペプチド，例えばグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１），上皮小体ホルモン（ＰＴＨ）または成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ），またはそのようなペプチドの薬学的に活性な誘導体または類似体，酸性緩衝液およびマンニトールの医薬処方に関する。例えば，新規処方は，ヒトにおいてよく許容され，例えば，驚くほど安定な組成物である。可溶性ペプチドは二量体を形成せず，凝集しない。
【０００３】
発明の背景
ペプチド，例えばＧＬＰ−１，ＰＴＨ，およびＧＲＦは，種々の疾患の治療に有用であることが当該技術分野において知られている。例えば，ＧＬＰ−１（７−３６）アミドはＩＩ型糖尿病（インスリン非依存性真性糖尿病，ＮＩＤＤＭとしても知られる）の治療に有用である。ＰＴＨ（１−３４）は骨粗鬆症の治療に有用であり，ＧＲＦ（ｌ−４４）アミドも同様である。米国特許４，８７０，０５４を参照。ＰＴＨ（ｌ−３４）とＧＲＦ（ｌ−４４）アミドとの組み合わせも骨粗鬆症の治療に用いることができる。米国特許５，１６４，３６８を参照。
【０００４】
そのようなペプチドを薬学的に許容しうる組成物中に処方することに伴う，当該技術分野において認識されている種々の問題が存在する。十分に高い濃度の可溶性ペプチドを有し，ペプチドの凝集およびペプチド二量体の形成が最小限であることが重要である。そのような凝集物および二量体の形成は，ＧＬＰ−１等のペプチドから医薬処方を作成する際に遭遇する顕著な問題点であることが当該技術分野において知られている。例えば，ＧＬＰ−１は多くの条件下でゲル化および凝集することが知られており，このため安定な可溶ペプチド処方を作成することが困難である（ＥＰ０９７８５６５Ａ１を参照）。
【０００５】
ＧＬＰ−１，ＰＴＨおよびＧＲＦを含む種々の医薬処方が当該技術分野において記述されている。このようなペプチドは，一般に，アルブミンまたは他の補助剤を含む水にペプチドを溶解し，これをヒトに注射することにより投与されている（Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ ｅｔ ａｌ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ １９，１（１９９６）；Ａｈｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏ．Ｍｅｔａｂ．８２，４７３（１９９７））。このようなペプチドはそのような条件下（中性に近いｐＨ値）では安定ではないかまたは十分に溶解性ではなく，アルブミン等の補助剤は酸性ｐＨ値では安定ではないため，この方法は欠点を有する。
【０００６】
さらに，当該技術分野においては，有害な副作用および患者の不快を最小限にするためには，生理学的ｐＨである医薬処方を用いることが望ましいことが知られている（Ｂｒａｚｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８７，６６７（１９９８）を参照）。しかし，生理学的ｐＨ（ｐＨ約７．４）においては，ＧＬＰ−１，ＰＴＨ，およびＧＲＦの溶解性は低い。例えば，ｐＨ約７．４の水中におけるペプチドＧＬＰ−１の溶解性は約０．２ｍｇ／ｍＬより低い。生理学的食塩水におけるＧＬＰ−１の溶解性も低い。生理学的ｐＨにおけるＰＴＨおよびＧＲＦの溶解性はやや高いが，４ｍｇ／ｍＬ以下である。
【０００７】
生理学的ｐＨにおけるペプチドの溶解性を増大させるために，従来の処方は，当該技術分野において認められる種々の薬剤，例えば界面活性剤および溶媒を使用してきた。しかし，そのような薬剤は患者において有害な副作用を引き起こしうるため，その使用は望ましくない（Ｂｒａｚｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８７，６６７（１９９８）を参照）。また，ヒト血清アルブミンは，その緩衝化能力および保存容器または投与に用いられる装置へのＧＬＰ−１の吸着を減少させる能力のため，ＧＬＰ−１処方において用いられてきた。ＧＬＰ−１は疎水性ペプチドであり，例えば，管およびシリンジに見いだされる疎水性表面に吸着する。しかし，患者において有害な免疫反応を刺激しうるため，ヒト血清アルブミンを使用することは望ましくない。また，高度に精製されたアルブミンを使用して，望ましくない副作用を引き起こしうる夾雑物を最小限にすることに多大な注意を払わなければならない。
【０００８】
アミド結合の安定性は，一般に，約４．０−４．５の範囲のｐＨにおいて最も高い。しかし，そのようなｐＨの範囲は，治療用ペプチドの処方においてはしばしば用いることができない。低いｐＨは三次または四次構造を有するペプチドの変性を引き起こす可能性があり，および／またはペプチドを不活性化させる可能性がある。さらに，低ｐＨの医薬処方は，注射の際に患者に不快をもたらすことが知られている（Ｂｒａｚｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８７，６６７（１９９８）を参照）。
【０００９】
米国特許５，７０５，４８３は，蒸留水と混合し，ｐＨを約６．０−９．０に調節したＧＬＰ−１の処方を記載する。この’４８３特許は，Ｄ−マンニトールはＧＬＰ−１の適当な賦形剤の例であると述べている。しかし，’４８３特許に記載される高いｐＨにおいては，処方はＧＬＰ−１の不安定性に寄与するかもしれない。
【００１０】
ＰＣＴ出願ＷＯ９８／１９６９８は，５Ｍ酢酸を用いてｐＨを４に調節した，１００ｎｍｏｌのＧＬＰ−１（７−３６）アミドと０．０２５ｍＬのヒトアルブミン溶液（２０％）との組み合わせを記載する。ヒト腹部に投与するために，通常の食塩水を用いてこの処方の容量を１ｍＬとしており，ＧＬＰ−１の濃度は１００μＭ（約０．３ｍｇ／ｍＬ）となる。しかし，上述したように，医薬処方においてはアルブミンを使用しないことが望ましい。
【００１１】
Ｔｈｅ １９９９ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ｐｐ．５３２−５３９）は，Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから市販されているＮＥＵＰＯＧＥＮを記載する。ＰＤＲ登録物には，ＮＥＵＰＯＧＥＮが，白血球産生の刺激における医薬用途に適した，組換えＤＮＡ技術により製造されたヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）であるフィルグラスチム（ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）の処方である医薬製品の名前であることが記述されている。ＰＤＲ登録物には，ＮＥＵＰＯＧＥＮが，５％ソルビトールおよび０．００４％ＴＷＥＥＮ８０を含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）中に処方されていることが記述されている。ＴＷＥＥＮ８０は，Ａｔｌａｓ Ｐｏｗｄｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｄｅｌａｗａｒｅから市販されている乳化，湿潤，および分散剤（すなわち界面活性剤）である。ＰＤＲ登録物にはさらに，ＮＥＵＰＯＧＥＮの量的な組成（ｍＬあたり）が，フィルグラスチム３００ｍｃｇ，酢酸塩０．５９ｍｇ，ソルビトール５０ｍｇ，ＴＷＥＥＮ８０ ０．００４％，ナトリウム０．０３５ｍｇをＵＳＰｑ．ｓ．注射水で１．０ｍＬとすることが記述されている。Ｇ−ＣＳＦは，１７５アミノ酸の長さの蛋白質であり，記載されるように，ＮＥＵＰＯＧＥＮ処方は界面活性剤を含む。
【００１２】
したがって，当該技術分野においては，補助剤が有害な副作用を引き起こしうるため，最小レベルの非治療用補助剤（例えばアルブミン，界面活性剤，および溶媒）を含む，比較的小さいペプチド，例えばＧＬＰ−１，ＰＴＨおよびＧＲＦの安定な医薬処方が必要とされている。ヒトにおいてよく許容される，すなわち，患者の不快を最小にする有効かつ安定な医薬処方を提供することも有益であろう。さらに，許容しうる濃度を有し，可溶性であり，ペプチド二量体および／または凝集を含まないか最小限に含むペプチド処方を提供することも有用であろう。記載されるように，ＧＬＰ−１は，多くの条件下でゲル化および凝集することが知られており，このため安定な処方が困難である（ＥＰ０９７８５６５Ａ１を参照）。本発明の他の利点は，本明細書および特許請求の範囲を検討することにより当業者には明らかとなるであろう。
【００１３】
発明の概要
患者によりよく許容され，最小限の非ペプチド成分を有する安定なペプチド医薬処方を提供するため，本発明者らは，ペプチド，緩衝液，および希釈剤を含む医薬処方を開発した。特に，本発明者らは，それぞれ酢酸およびＤ−マンニトール中に調製されたペプチド，例えばＧＬＰ−１（７−３６）アミド，ＰＴＨ（１−３４）ＯＨ，またはＧＲＦ（ｌ−４４）アミドを哺乳動物に投与するための安定な医薬組成物を開発した。
【００１４】
したがって，本発明の目的は，哺乳動物に投与するためのペプチドの良好な安定性を与える，ペプチド，緩衝液，および希釈剤を含む安定な単位用量の医薬組成物を提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的は，ペプチド，緩衝液および希釈剤を含む，哺乳動物によりよく許容される，哺乳動物に投与するための医薬組成物を用いて，哺乳動物において疾患または疾病を治療する方法を提供することである。
【００１６】
これらのおよび他の目的を達成するために，本発明の１つの観点にしたがえば，哺乳動物に投与するための単位用量の医薬組成物が提供される。該組成物は，治療上有効量のペプチドを含む。組成物はまた，約５未満のまたは５未満のｐＫａを有する酸を含む緩衝液を含む。特に，本発明の処方は酢酸を含む。処方はまた，組成物を等張にするための希釈剤を含む。特に，本発明の処方はＤ−マンニトールを含む。
【００１７】
好ましい態様においては，組成物は，本質的に，ペプチド，約５未満または５未満のｐＫａを有する酸を含む緩衝液，およびＤ−マンニトール等の希釈剤からなる。
【００１８】
別の好ましい態様においては，組成物は，ペプチド，約５未満または５未満のｐＫａを有する酸を含む緩衝液，および希釈剤からなる。
【００１９】
１つの好ましい態様においては，本発明の処方は，ペプチド，酢酸，およびＤ−マンニトールを含む。別の好ましい態様においては，本発明の処方は，本質的に，ペプチド，酢酸，およびＤ−マンニトールからなる。別の好ましい態様においては，本発明の処方は，ペプチド，酢酸，およびＤ−マンニトールからなる。
【００２０】
これらの処方はすべて，好ましくは，約３．０−約５．０，または３．０−５．０のｐＨ；より好ましくは，約４．０−約５．０または４．０−５．０；より好ましくは約４．５−約５．０または４．５−５．０；最も好ましくは約４．５−約４．７または４．５−４．７のｐＨを有する。別の好ましい態様は，４．５，４．６，または４．７のｐＨを有する。
【００２１】
本発明の別の観点にしたがえば，有効量の医薬処方を哺乳動物に投与するためのシステムが開示される。該システムは，単位用量の本発明の医薬処方を投与するための注入ポンプを含む。単位用量は，約２００−５０，０００原子量単位の分子量を有する治療上有効量のペプチド，例えば，ＧＬＰ−１分子，ＧＲＦ分子，またはＰＴＨ分子を含む。
【００２２】
本発明の別の観点にしたがえば，疾病を有する哺乳動物において疾病を治療する方法が開示される。該方法は，哺乳動物に有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む。
【００２３】
別の目的には以下のものが含まれる。（１）ＧＬＰ１分子，およびＧＲＦ分子，およびＰＴＨ分子からなる群より選択される分子；（２）１ｘ１０−５より大きい値の解離定数を有する酸；および（３）賦形剤，を含む医薬組成物であって，組成物のｐＨが約３．０−５．０であることを特徴とする医薬組成物。酸が酢酸を含む上述の組成物。賦形剤がＤ−マンニトールである上述の組成物。酸が酢酸であり，賦形剤がＤ−マンニトールである上述の組成物。組成物がＧＬＰ−１（７−３６）アミドを含む上述の組成物。組成物がＧＲＦ（ｌ−４４）アミドを含む上述の組成物。組成物がＰＴＨ（１−３４）ＯＨを含む上述の組成物。組成物が単位投与量の形態中にある上述の組成物。組成物が滅菌されている上述の組成物。単位用量の上述の組成物を投与するための注入ポンプを含む，医薬組成物を投与するためのシステム。投与前に組成物が等張食塩水で約４０倍までに希釈される，上述のシステム。薬学的に有効量の上述の組成物を哺乳動物に投与することを含む，哺乳動物において疾病または状態を治療するための方法。疾病または状態が，糖尿病，過剰欲求，肥満，発作，虚血，再灌流障害，グルコース代謝障害，外科手術，昏睡，ショック，胃腸疾病，消化ホルモン疾病，アテローム性動脈硬化症，心臓疾病，妊娠糖尿病，肝臓疾病，肝硬変，グルココルチコイド過剰，クッシング病，外傷または疾病後に生ずる活性化された逆制御ホルモンの存在，高トリグリセリド血症，慢性膵炎，非経口摂取の必要性，骨粗鬆症，および外科手術または創傷後の異化状態からなる群より選択される上述の方法。組成物が，静脈内，皮下，連続的，間欠的，非経口，およびこれらの組み合わせからなる群より選択される方法により哺乳動物に投与される，上述の方法。組成物が約４．５のｐＨを有する上述の組成物。組成物が約４．７のｐＨを有する上述の組成物。組成物が約４．５−４．７のｐＨを有する上述の組成物。組成物が４．５のｐＨを有する上述の組成物。組成物が４．７のｐＨを有する上述の組成物。本質的に，酢酸，Ｄ−マンニトール，および，ＧＬＰ１分子およびＧＲＦ分子およびＰＴＨ分子からなる群より選択される分子からなり，組成物が液体形態である，上述の組成物。酢酸，Ｄ−マンニトール，およびＧＬＰ１分子およびＧＲＦ分子およびＰＴＨ分子からなる群より選択される分子からなり，組成物が液体の形態である，上述の組成物。酢酸塩（約１０ｍＭ）およびＤ−マンニトール（約５０．７ｍｇ／ｍＬ）を含む上述の組成物。本質的に，酢酸塩（約１０ｍＭ），Ｄ−マンニトール（約５０．７ｍｇ／ｍＬ），およびＧＬＰ１分子およびＧＲＦ分子およびＰＴＨ分子からなる群より選択される分子からなる上述の組成物。酢酸塩（約１０ｍＭ），Ｄ−マンニトール（約５０．７ｍｇ／ｍＬ），およびＧＬＰ−１（７−３６）アミド（約１ｍｇ／ｍＬ）を含む上述の組成物。本質的に，酢酸塩（約１０ｍＭ），Ｄ−マンニトール（約５０．７ｍｇ／ｍＬ），およびＧＬＰ−１（７−３６）アミド（約１ｍｇ／ｍＬ）からなる上述の組成物。組成物が，酢酸塩（約１０ｍＭ），Ｄ−マンニトール（約５０．７ｍｇ／ｍＬ），およびＧＲＦ（ｌ−４４）アミド（約４ｍｇ／ｍｌ）を含む上述の組成物。本質的に，酢酸塩（約１０ｍＭ），Ｄ−マンニトール（約５０．７ｍｇ／ｍＬ），およびＧＲＦ（ｌ−４４）アミド（約４ｍｇ／ｍｌ）からなる上述の組成物。組成物が酢酸塩（約１０ｍＭ），Ｄ−マンニトール（約５０．７ｍｇ／ｍＬ），およびＰＴＨ（１−３４）ＯＨ（約５０ｍｇ／ｍＬ）を含む上述の組成物。組成物が本質的に，酢酸塩（約１０ｍＭ），Ｄ−マンニトール（約５０．７ｍｇ／ｍＬ），およびＰＴＨ（１−３４）ＯＨ（約５０ｍｇ／ｍＬ）からなる上述の組成物。ポンプが１時間あたり約１０μＬまたはそれ以上の速度で分子を放出するようプログラムされている，上述のシステム。
【００２４】
本発明のさらに別の目的，特徴および利点は，付随する図面を参照して，以下の発明の詳細な説明から明らかであろう。
【００２５】
図面の簡単な説明
図１は，ペプチドの純度分析のための逆相ＨＰＬＣの使用の例を示し，ペプチドの分解をモニターする能力を示す。試料は，逆相ＨＰＬＣで，０．１％トリフルオロ酢酸中の水／アセトニトリル勾配で溶出することにより分析した。用いたＨＰＬＣシステムは，ＨＰ１１００クロマトグラフィーシステムである。上パネル：ｐＨ４．５に調節した１０ｍＭ酢酸，５．０７％Ｄ−マンニトール中で，−２０℃（点線）および５０℃（実線）で１か月保存したＧＬＰ−１。Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｈａｓｅ Ｃ１８カラム，４．６ｘ２５０ｍｍを用いて，３３％から９５％アセトニトリルの２２分間の勾配で溶出した。下パネル：ｐＨ４．７に調節した１０ｍＭ酢酸，５．０７％Ｄ−マンニトール中で，−２０℃（点線）および３７℃（実線）で１か月保存したＧＲＦ。ＨＰＬＣ緩衝液ＡおよびＢの組成は，それぞれ２０％および５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルであり，Ｚｏｒｂａｘ ５ミクロンの４．６ｘ２５０ｍｍカラムを用いて２５％から５５％Ｂの２５分間の勾配で溶出した。
【００２６】
図２は，５．０７％Ｄ−マンニトールを含む１０ｍＭ酢酸塩緩衝液中のＧＬＰ−１の溶解性を２５℃におけるｐＨの関数として示す。溶液は，過剰のＧＬＰ−１とともに４日間撹拌した。遠心分離した後，溶液中のペプチドの量を紫外線吸収分光測光法により測定した。
【００２７】
図３は，ＨＰＬＣ（左パネル）および生物学的活性（右パネル）により決定したＧＲＦの安定性を，好ましい処方（４ｍｇ／ｍＬ ＧＲＦ，１０ｍＭ酢酸ナトリウム，５．０７％Ｄ−マンニトールに溶解，ｐＨ４．７に調節）中における保存時間の関数として示す。丸は−２０℃を表し，四角は４℃を表す。
【００２８】
図４は，ＨＰＬＣ分析（左パネル）およびバイオアッセイ（右パネル）により決定した，好ましい処方（１ｍｇ／ｍＬ ＧＬＰ−１，１０ｍＭ酢酸ナトリウム，５．０７％Ｄ−マンニトールに溶解，ｐＨ４．５に調節）中のＧＬＰ−１の安定性を示す。丸は−２０℃を表し，四角は４℃を表す。
【００２９】
図５は，ＨＰＬＣ分析により決定したＰＴＨ（１ｍｇ／ｍＬ ＰＴＨ，１０ｍＭ酢酸ナトリウム，５．０７％Ｄ−マンニトールに溶解，ｐＨ４．７に調節）の安定性を示す。丸は−２０℃を表し，四角は４℃を表す。
【００３０】
図６は，１０ｍＭ酢酸ナトリウム，５．０７％Ｄ−マンニトール，ｐＨ４．５中で１ｍｇ／ｍＬで処方したＧＬＰ−１のＨＰＬＣ分析による，ＧＬＰ−１の安定性を示す。試料は，ガラスバイアル中で４℃で（黒丸），ガラスバイアル中で３７℃で（四角），ＭｉｎｉＭｅｄポリプロピレン貯蔵器中で３７℃で（菱形）保存し，試料はＭｉｎｉＭｅｄポンプを用いて３７℃でポンプ注入した（三角）。
【００３１】
図７は，１２０μｇ／ｋｇのＧＬＰ−１を好ましい処方（１ｍｇ／ｍＬ ＧＬＰ−１，１０ｍＭ酢酸ナトリウム，５．０７％Ｄ−マンニトールに溶解，ｐＨ４．５に調節）中で皮下注射したときのラットの応答を示す。値は４匹の異なる動物の応答の平均である。
【００３２】
図８は，２０μｇのＧＲＦを好ましい処方（４ｍｇ／ｍＬ ＧＲＦ，１０ｍＭ酢酸ナトリウム，５．０７％Ｄ−マンニトール中に溶解，ｐＨ４．７に調節）中で静脈内投与した後に，ラットの血漿中で検出された総ＧＲＦを示す。
【００３３】
好ましい態様の詳細な説明
本発明にしたがえば，ペプチド，酸性緩衝液および希釈剤の医薬処方を哺乳動物への注射に用いることができる。ペプチドは，約２００−５０，０００原子量単位の分子量を有することができる。好ましい態様にしたがえば，ペプチドはＧＬＰ−１分子，ＰＴＨ分子，ＧＲＦ分子，またはこれらの組み合わせである。別の態様にしたがえば，ペプチドは，ＧＬＰ−１，ＰＴＨ，ＧＲＦの誘導体または類似体，またはこれらの組み合わせであってもよい。特に好ましい態様にしたがえば，ペプチドはＧＬＰ−１（７−３６）アミド，ＰＴＨ（１−３４）ＯＨ，またはＧＲＦ（ｌ−４４）アミドである。
【００３４】
処方のペプチド濃度（ＧＬＰ−１，ＰＴＨ，ＧＲＦ，またはこれらの組み合わせのいずれであっても）は，好ましくは，緩衝液および希釈剤の組み合わせ１ｍＬあたり約２５μｇ−５ｍｇの範囲内である。
【００３５】
ＧＬＰ−１
本発明の好ましい態様にしたがえば，ペプチドは，グルカゴン様ペプチド−１（７−３６）アミドである。この分子は回腸のＬ−細胞から分泌される天然のインクレチンホルモンである。これは，インスリン分泌速度の制御を助け，グルコースホメオスタシスに大きい影響を有する。ＧＬＰ−１はまた，全身的に作用して，多数の内分泌機能，例えば膵臓β細胞からのインスリンの制御および発現，およびグルカゴンの抑制により，遊離脂肪酸を抑制し，血中グルコースレベルの正常化を助ける。本発明の分脈において用いる場合，”ＧＬＰ−１分子”との用語は，グルカゴン様ペプチド，グルカゴン様ペプチド−１の類似体，およびグルカゴン様ペプチド−１レセプター蛋白質に結合するグルカゴン様ペプチド−１の誘導体を含む。
【００３６】
ＧＬＰ−１（７−３６）アミド（配列１）の配列：
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＮＨ２
【００３７】
本発明の別の態様にしたがえば，以下のＧＬＰ−１誘導体等のＧＬＰ−１の類似体を用いることができる：
ＧＬＰ−１（７−３６）ＯＨ（配列２）の配列：
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＯＨ
ＧＬＰ−１（７−３４）ＯＨ（配列３）の配列：
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−ＯＨ
ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列４）の配列：
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−ＩＩｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＯＨ
【００３８】
他のＧＬＰ−１類似体は当該技術分野において知られている。例えば，米国特許５，９５８，４０９は，適当なＧＬＰ−１類似体を記載する。さらに別の態様にしたがえば，ペプチドはＧＬＰ−１誘導体，例えばアルキル化またはアシル化ＧＬＰ−１誘導体または他の類似体でありうる。相同であるＧＬＰ−１の類似体，例えばエキセンジン（例えばエキセンジン３および４）およびＧＬＰ−２もまた本発明に含まれる。特に好ましい態様にしたがえば，ＧＬＰ−１分子は配列１のアミノ酸配列を有するＧＬＰ−１（７−３６）アミドである。
【００３９】
ＧＬＰ−１処方の安定性において役割を果たすであろう因子は，ＧＬＰ−１分子の濃度である。ｐＨの関数としてのＧＬＰ−１の溶解性プロファイルが図２に示される。約５．０より低いｐＨの値において，１０ｍＭ酢酸ナトリウム，５．０７％Ｄ−マンニトール中のＧＬＰ−１の溶解性は，一般に１ｍｇ／ｍＬより高く，皮下および静脈内注射用の有効な用量を可能とする。本発明者らは，約１ｍｇ／ｍＬの濃度のＧＬＰ−１（７−３６）アミドが本発明のｐＨ４．５の処方中で，２５℃で６か月まで安定であり，約４％が分解されることを見いだした。この安定性は，ＨＰＬＣ方法により決定して，この期間における分解産物（例えば酸分解およびアスパラギン酸におけるベータシフト）が最小量であったことにより証明された。図４を参照。特に安定な処方は，約０．１−４ｍｇ／ｍＬのＧＬＰ−１分子を含む。
【００４０】
本発明の”ＧＬＰ−１分子”にはまた，ＧＬＰ１と相同である毒トカゲの毒の６つのペプチドが含まれる。以下の表は，これらの配列をＧＬＰ１の配列と比較する。
【００４１】
【表１】
【００４２】
ペプチドｃおよびｈは，それぞれｂおよびｇから誘導される。天然に生ずる６個すべてのペプチド（ａ，ｂ，ｄ，ｅ，ｆ，およびｇ）は，位置１，７，１１および１８において相同である。ＧＬＰ−１（７−３６）アミドおよびエキセンジン３および４（ａ，ｂ，およびｄ）はさらに，位置４，５，６，８，９，１５，２２，２３，２５，２６および２９において相同である。位置２において，Ａ，ＳおよびＧは，構造的に類似する。位置３において，残基ＤおよびＥ（ＡｓｐおよびＧｌｕ）は構造的に類似する。位置２２および２３において，Ｆ（Ｐｈｅ）およびＩ（Ｉｌｅ）はそれぞれＹ（Ｔｙｒ）およびＬ（Ｌｅｕ）と構造的に類似する。同様に，位置２６において，ＬおよびＩは構造的に同等である。
【００４３】
すなわち，ＧＬＰ１の３０の残基のうち，エキセンジン３および４は，１５の位置において同一であり，さらに５の位置において同等である。主要な構造的変化が明らかな位置は，残基１６，１７，１９，２１，２４，２７，２８および３０のみである。エキセンジンはまた，カルボキシ末端に９個の余分の残基を有する。
【００４４】
ＰＴＨ
本発明の別の好ましい態様にしたがえば，ペプチドはＰＴＨ分子である。本発明の文脈において用いる場合，”ＰＴＨ分子”は，上皮小体ホルモン，上皮小体ホルモンの類似体，および上皮小体ホルモンの誘導体を含む。ＰＴＨは，カルシウムおよびリン酸代謝のホメオスタット調節における制御因子である。ＰＴＨ活性の主な部位は骨格，腎臓，および胃腸管であると考えられている。
【００４５】
ヒトＰＴＨ（１−３４）（配列５）の配列：
Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ
【００４６】
本発明の別の態様にしたがえば，ＰＴＨの類似体を用いることができる。ＰＴＨ類似体は当該技術分野において知られている。例えば，米国特許５，８４０，８３７は適当なＰＴＨ類似体を記載する。さらに別の態様にしたがえば，ペプチドはＰＴＨ誘導体，例えばＰＴＨ（１−８４），ＰＴＨ（１−３７），およびＰＴＨまたはその誘導体のＣ−末端アミデート化誘導体でありうる。特に好ましい態様にしたがえば，ペプチドはＰＴＨ（１−３４），すなわち天然のヒトＰＴＨ（配列５）である。
【００４７】
本発明者らは，本発明の処方中で約０．００５−１．０ｍｇ／ｍＬの濃度のＰＴＨ分子が４℃で４か月間安定であることを見いだした。特に安定な処方は，約０．０２−０．１０ｍｇ／ｍＬのＰＴＨを含む。
【００４８】
ＧＲＦ
本発明の別の好ましい態様にしたがえば，ペプチドはＧＲＦ（ｌ−４４）アミド（ＧＲＦ）である。ＧＲＦは，４４アミノ酸のペプチドである。ＧＲＦは，視床下部から分泌され，下垂体の成長ホルモン放出を刺激すると考えられているペプチドの群の１つである。ＧＲＦは小児期における正常な成長および発達に重要であり，（ソマトスタチンと一緒になって）ＧＨ分泌の神経制御を媒介することができる。ＧＲＦは，比較的小さく，したがって適当なベヒクルを用いて鼻吸入したときに有効でありうるため，閉経後骨粗鬆症および他の適応症の治療のために魅力的な分子である。
【００４９】
本発明の文脈において用いる場合，”ＧＲＦ分子”との用語は，成長ホルモン放出因子，成長ホルモン放出因子の類似体，および成長ホルモン放出因子レセプター蛋白質に結合する成長ホルモン放出因子の誘導体を含む。
【００５０】
ＧＲＦ（１−４４）アミド（配列６）の配列：
Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−ＮＨ２
【００５１】
本発明の別の態様にしたがえば，ＧＲＦの類似体を用いることができる。生物学的活性を有するＧＲＦ類似体は当該技術分野において知られており，一般に約２７−約４４アミノ酸を含む。ただし，このような類似体は，ＧＲＦよりいくぶん効力が低いかもしれない。例えば，Ｋｕｂｉａｋら（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６，８８８（１９９３））は，適当なＧＲＦ類似体を記載する。ＧＲＦ類似体の例としては，ＧＲＦ（１−４４）−ＯＨ，ＧＲＦ（１−４０）−ＯＨ，ＧＲＦ（１−４０）−ＮＨ２，ＧＲＦ（１−３２）−ＮＨ２，ＧＲＦ（１−３９）−ＮＨ２，ＧＲＦ（ｌ−４０）−Ｐｈｅ−ＮＨ２，ＧＲＦ（ｌ−４０）−Ｐｈｅ−ＯＨ，ＧＲＦ（１−４０）−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−ＮＨ２，ＧＲＦ（１−２９）−ＮＨ２，およびＧＲＦ（１−２７）−ＮＨ２，およびこれらの組み合わせが挙げられる。別の態様にしたがえば，ペプチドはＫｕｂｉａｋら（上述）に詳述されているようなＧＲＦ誘導体であってもよい。特に好ましい態様にしたがえば，ペプチドは配列６のアミノ酸配列を有するＧＲＦ（１−４４）アミドである。ＧＲＦの特に安定な処方は，約１．０−１０．０ｍｇ／ｍＬのＧＲＦを含む。
【００５２】
緩衝液
処方の緩衝液は，わずかに酸性のｐＨを有するべきである。いかなる特定の理論にも制限されることを意図するものではないが，酸性条件がペプチドのアミド結合の安定性を増加させることが当業者には知られている。酸性条件は一般弱酸により与えられる。酸は約１ｘ１０−５より大きいまたは１ｘ１０−５より大きい値の酸解離定数を有する場合，すなわち，ｐＫａ＜約５，またはｐＫａ＜５である場合，一般弱酸である。そのような酸としては，プロピオン酸，コハク酸，リンゴ酸，およびこれらの組み合わせが挙げられる。特に好ましい態様にしたがえば，酸は酢酸である。別の態様にしたがえば，酸は約１ｘ１０−５より大きいかまたは１ｘ１０−５より大きい値の酸解離定数を有することができる（例えばプロピオン酸または乳酸）。緩衝液は，緩衝化能力を有しており，酢酸塩，ホウ酸塩，リン酸塩，フタル酸塩，炭酸塩，およびこれらの組み合わせからなる群より選択することができる。１つの好ましい態様においては，ペプチドおよび賦形剤を含む溶液中に緩衝液が含まれており，ｐＨを約３．０−約５．０の範囲にする。よく知られる試薬，例えば本明細書に記載されるような弱酸および水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウム等の強塩基を用いてｐＨを所望の範囲に調節することができることは当該技術分野においてよく知られている。別の好ましい態様においては，緩衝液のｐＨは３．０−５．０の範囲である。より好ましい態様においては，緩衝液のｐＨは約４．０−約５．０または４．０−５．０の範囲である。特により好ましい態様においては，緩衝液のｐＨは，約４．５−約５．０または４．５−５．０の範囲である。最も好ましい態様においては，緩衝液のｐＨは，約４．５−約４．７または４．５−４．７の範囲である。さらに別の最も好ましい態様においては，緩衝液のｐＨは，４．５，４．６または４．７である。緩衝液は好ましくは約１ｍＭ−２０ｍＭ，より好ましくは約５−１０ｍＭの範囲のモル濃度を有する。
【００５３】
等張賦形剤
賦形剤は，処方を体液（投与のモードに依存する）とほぼ等張にすることを助ける。賦形剤の濃度は，ペプチド処方中の張度調節剤の既知の濃度にしたがって選択される。好ましい賦形剤には，多糖類，例えば化学組成Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１を有するラクトースまたはＤ−トレハロースが含まれる。本発明において特に好ましい賦形剤（この分脈においては”希釈剤”とも称される）は，化学組成Ｃ６Ｈ１４Ｏ６を有するＤ−マンニトールである。他の好ましい賦形剤には，Ｃ１−Ｃ１２の鎖を有するアルコールが含まれる。別の態様にしたがえば，賦形剤には，限定されないが，食塩水，緩衝化食塩水，デキストロース，水，グリセロール，エタノール，ラクトース，Ｄ−マンニトール，アルギニン，他のアミノ酸，およびこれらの組み合わせが含まれる。
【００５４】
新規処方
本発明の組成物は，臨床治療用の投与に非常に適した新規ペプチド処方である。これは，（１）滅菌することができる，（２）張度を制御することができる，（３）ｐＨを調節することができる，および（４）種々の投与方法に適合性であるためである。本発明の処方の態様の予測しえなかった特徴は，比較的低いｐＨにもかかわらず，非経口的に投与したとき，患者において有害な副作用をほとんどまたは全く生じないことである。さらに，動物およびヒトでの研究において，ペプチドの皮下および静脈内注射のいずれによってもその機能を示す生物学的応答が生じた。
【００５５】
本発明者らは，処方中でのペプチドの許容しうる溶解性は，低いｐＨ範囲においても可能であることを見いだした。特に好ましい態様にしたがえば，処方が約４．０−５．０または４．０−５．０の範囲のｐＨを有するとき，少なくとも約２ｍｇのＧＬＰ−１，少なくとも約４ｍｇのＰＴＨ，または少なくとも約１０ｍｇのＧＲＦペプチドが，緩衝液と賦形剤の組み合わせ約１ｍＬに溶解する。これらの本発明の処方は，好ましくは，より高いｐＨの値における適切なペプチド溶解性のために必要とされる，界面活性剤，溶媒または他の補助剤または賦形剤等の薬剤を実質的に含まない。
【００５６】
好ましい態様においては，本発明の処方は，酢酸，Ｄ−マンニトール，およびＧＬＰ−１分子，ＧＲＦ分子，およびＰＴＨ分子からなる群より選択される分子を含み，約４．５−約４．７，または４．５−４．７のｐＨを有する。別の好ましい態様においては，本発明の処方は，本質的に，酢酸，Ｄ−マンニトール，および，ＧＬＰ−１分子，ＧＲＦ分子，およびＰＴＨ分子からなる群より選択される分子からなり，約４．５−約４．７，または４．５−４．７のｐＨを有する。別の好ましい態様においては，本発明の処方は，酢酸，Ｄ−マンニトール，およびＧＬＰ−１分子，ＧＲＦ分子またはＰＴＨ分子からなる群より選択される分子からなり，約４．５−約４．７または４．５−４．７のｐＨを有する。さらに別の好ましい態様においては，本発明の処方は，約４．５のｐＨ，約４．６のｐＨ，約４．７のｐＨ，４．５のｐＨ，４．６のｐＨ，または４．７のｐＨを有する。
【００５７】
約４．０−５．０のｐＨの範囲は，ペプチドが生理学的ｐＨにおいてやや不溶性であるとしても，注射部位における析出の問題を示さなかった。試験の結果は，ＧＬＰ−１をヒト被験者に注射して１０分以内に血中グルコースがオイグリセミックレベルに低下したことを示した。このことは，一般にペプチドが注射部位において析出しなかったことを示す。ＧＬＰ−１またはＧＲＦ処方をヒトの皮下に約１ｍＬの量で注射したとき，注射部位における明白な不快は生じず，血中に現れたペプチド薬剤のレベルにより評価して迅速な応答を生じた。
【００５８】
本発明の処方は，ヒト被験者に注射したときであっても，驚くほど安定である。ペプチド分子の生物学的半減期は非常に短い。例えば，米国特許５，１１８，６６６によれば，ＧＬＰ−１（７−３７）の血中の生物学的半減期は３−５分間である。いかなる特定の理論にも制限されることを意図するものではないが，これらの本発明の処方の有効性は，部分的には，緩衝液の種類およびｐＨと賦形剤（例えば，Ｄ−マンニトール）の安定化効果との組み合わせにより生ずると考えられる。本発明者らは，ペプチドの分解の程度を定量することができるＨＰＬＣ方法を開発した（図１を参照）。
【００５９】
ＧＬＰ−１を含む本発明の処方をヒト患者における臨床試験において用いたとき，有害な影響はほとんど生じなかった。そのような処方の１０，０００を越えるバイアルは，−２０℃，４℃，および２５℃で少なくとも９か月の期間安定であった。ペプチドがＧＲＦまたはＰＴＨである本発明の処方もまた，匹敵する安定性を示した（図３，５を参照）。
【００６０】
表１を参照すると，１０ｍＭ酢酸塩，５．０７％（ｗ／ｖ）Ｄ−マンニトール，ｐＨ４．５中の１ｍｇ／ｍＬのＧＬＰ−１の処方は，２５℃で２８日間にわたり少なくとも９８％；３７℃で２８日間にわたり少なくとも９２％，および５０℃で２８日間にわたり少なくとも６６％の安定性を示した。さらに，このＧＬＰ−１処方は，４℃または−２０℃で１か月保存したとき，純度の変化を示さなかった。追加の安定性実験は，この処方中のＧＬＰ−１が４℃で１８か月以上，および２５℃で６か月，少なくとも９０％安定であることを示した。
【００６１】
ＰＴＨ（ｌ−３４）の０．１，１．０および１０．０ｍｇ／ｍＬ，ｐＨ４．７，５．０７％Ｄ−マンニトール，１０ｍＭ酢酸塩の処方は非常に安定であり，−２０℃から２５℃の温度で１４日間にわたり少なくとも約９８％安定であった。ＰＴＨ（１−３４）は，５０μｇ／ｍＬで同じ処方中で，−２０℃および５℃で６か月以上，２５℃で３か月，少なくとも９０％安定であることが示された。
【００６２】
ｐＨ４．７，５．０７％Ｄ−マンニトール，１０ｍＭ酢酸塩中の，４，８，および１０ｍｇ／ｍＬのＧＲＦの処方は，１４日間にわたり，−２０℃から４℃の温度で少なくとも９８％，２５℃で少なくとも９６％，および５０℃で６３％の安定性を示した。延長された期間について試験した追加の処方は，４℃で１２か月，および２５℃で４−６週間，少なくとも９０％の安定性を示した。
【００６３】
したがって，本発明の処方は，非常に安定であり，おそらくは−２０℃で数年間保存可能なペプチドを含む。また，より高い温度におけるこれらの分解により，これまでに同定され予測可能なフラグメントが生成する。これらの処方においては，検出可能な二量体形成および凝集はなかった。
【００６４】
ペプチドの製造
本発明のペプチドは，ペプチド製造の分野で一般に知られる方法により製造することができる。例えば，ペプチドは，固相化学ペプチド合成により，または慣用的な組換え技術により製造することができる。”組換え”との用語は，所望のペプチドまたは蛋白質が組換え（例えば微生物または哺乳動物）発現システムに由来することを意味する。組換え製造の基本的工程および技術は組換えＤＮＡ技術の当業者にはよく知られている。例えば，（１）本発明のペプチド分子をコードする天然のＤＮＡ配列を単離するか，またはペプチド分子用の合成または半合成のＤＮＡコーディング配列を構築し；（２）コーディング配列を，蛋白質を単独でまたは融合蛋白質として発現させるのに適当な様式で発現ベクター中に配置し；（３）適当な真核生物または原核生物宿主細胞を発現ベクターでトランスフォームし；（４）トランスフォームした宿主細胞をペプチド分子の発現を可能とする条件下で培養し；そして（５）組換え的に製造したペプチド分子を回収し，精製する。ペプチドは，例えば，限定されないが，硫酸アンモニウムまたはエタノール沈澱，酸抽出，アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー，ホスホセルロースクロマトグラフィー，疎水性相互作用クロマトグラフィー，アフィニティークロマトグラフィー，ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィー等の方法により，組換え細胞培養物から回収し精製することができる。最終精製工程のためには，高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いることができる。
【００６５】
治療方法および投与
本発明の処方は，哺乳動物における疾病および病気の治療において種々の用途を有する。当業者は，本発明の処方を，ＧＬＰ−１分子，ＧＲＦ分子，またはＰＴＨ分子の非経口投与を必要とする任意の疾病または状態のために用いることができることを認識するであろう。ＧＬＰ−１を含む処方は，糖尿病，過剰欲求，および肥満の治療に有用でありうる。ＰＴＨを含む処方は，骨成長不全および骨粗鬆症の治療に有用でありうる。ＧＲＦを含む処方は，骨粗鬆症およびるいそうの治療に有用でありうる。本発明の処方を注射した患者は，注射に際して最小限の刺激を有するかまたは全く有さず，成長ホルモン応答が生じ，これはペプチドが循環中に入ったことを示す。
【００６６】
本発明の処方は，好ましくは，単位投与量形態で投与する。そのような形態中では，処方は，適当な量のペプチドを含む単位用量に分割されている。単位用量は，包装された製剤であることができ，包装は個々の量のペプチドを含む。例えば，バイアルまたはアンプル中の可溶化ペプチドを含む液体，包装された錠剤，カプセル，およびバイアルまたはアンプル中の粉体でありうる。特定の状況についての適切な用量の決定は当業者の技術の範囲内である。一般に，治療は，製剤の最適用量より少ない用量で開始される。その後，その状況下において最適な効果が達成されるまで用量を少しずつ増加する。便宜的には，所望の場合には，１日の総用量を分割し，その日の間に一部ずつ投与する。
【００６７】
典型的な単位用量は，ＧＬＰ−１を含む処方については約０．１−２ｍｇまたは０．１−２ｍｇであり，ＰＴＨを含む処方については約１０−５０μｇであり，ＧＲＦを含む処方については約１−８ｍｇまたは１−８ｍｇであるが，これらの量より多いまたは少ない用量も用途を有するかもしれない。特に好ましい態様にしたがえば，用量は，約１ｍｇ／ｍＬのＧＬＰ−１，約５０μｇ／ｍＬまたは５０μｇ／ｍＬのＰＴＨ，および約１−４ｍｇ／ｍＬまたは１−４ｍｇ／ｍＬのＧＲＦの液体処方であり，商業的施設（例えば，ＳＰ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ）において各用量を標準的な３ｍＬバイアル中に作成し，充填する。
【００６８】
本発明の処方は，主としてヒト被験者への投与を意図するものであるが，他の哺乳動物被験体，例えばイヌおよびネコに投与してもよい（例えば獣医学的目的のために）。処方はまた，好ましくは，例えば，Ｐａｃｅｓｅｔｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから市販のＭｉｎｉＭｅｄ（登録商標）プログラム可能投薬注入ポンプを用いて，連続的皮下輸送として投与することができる。インビトロおよびインビボ研究は，ＭｉｎｉＭｅｄポンプの部品への処方の吸着が最小限であることを示す。さらに，好ましい態様においては，処方を等張食塩水で４０倍までに希釈し，ポンプ，例えばＨａｒｖａｒｄ Ｐｕｍｐ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，ＭＡ）により，生物学的活性の喪失もペプチドの吸着もなしに輸送することができる。
【００６９】
図６を参照すると，４℃および３７℃でガラスバイアル中およびＭｉｎｉＭｅｄポンプシステムのポリプロピレン貯蔵器中に保存したＧＬＰ−１処方の安定性，ならびに６日間ポンプ注入された処方の安定性の実験は，高い安定性を示し，このことは，この期間中にわたって物質の減損もペプチドの分解もない，輸送方法としての有用性を示す。
【００７０】
ＧＬＰ−１およびＧＲＦの好ましい処方を用いた，ヒト被験者における静脈内および皮下輸送の両方の広範な経験は，有意な合併症なしにペプチドが良好に輸送されることを示し，患者からの炎症または不快の報告はほとんどなかった。別の態様にしたがえば，処方は他の手段，例えば皮下またはマイクロプレッシャー注射，外部または移植ポンプ，デポ注射，および他の延長適用用投与装置により輸送することができる。あるいは，別の態様においては，本発明の処方を含むシリンジを用いることができる。そのようなシリンジは，ＧＬＰ−１分子の自己投与のために用いることができる。そのようなシリンジは当該技術分野においてよく知られている。例えば，米国特許５，９８０，４９１および５，９８４，９００を参照。
【００７１】
本発明の別の態様にしたがえば，処方は滅菌することができる。本発明の文脈において用いる場合，”滅菌”との用語は，無菌的であるか，または実質的に微生物を含まないことを意味する。当該技術分野において知られる種々の方法，例えば，限定されないが，物理学的方法（例えば加熱，音波，光線，放射，吸着，濾過）および化学的方法（例えば防腐薬）により，実質的にすべての微生物を破壊または除去することによって，処方を滅菌することができる。
【００７２】
本発明の処方は，本発明の精神または本発明の中心的特徴から逸脱することなく，他の特定の形態で具体化することができる。記載される態様は，すべての点において，例示的なものであって制限的なものではないと考えるべきである。したがって，本発明の範囲は，上述の説明ではなく特許請求の範囲により示される。特許請求の範囲の意味および均等の範囲内に含まれるすべての変更は，本発明の範囲内に包含される。例えば，本発明の処方は，薬学的に許容しうる保存剤，張度調節剤，ペプチドの作用を助ける補助剤または補助的薬剤，ペプチド用の賦形剤または不活性担体，界面活性剤，例えばＴＷＥＥＮ８０，またはペプチドの溶解性を増加させる溶媒を含んでいてもよい。
【００７３】
以下の実施例および製剤は，本発明の処方の製造，安定性および有効性をさらに例示するためにのみ提供される。本発明の範囲は以下の実施例に限定されない。
【００７４】
実施例
実施例１
ＧＬＰ−１，ＰＴＨ，およびＧＲＦを，塩化物塩として，表１に示すｐＨ値で処方中に溶解し，１ｍＬ管ガラスバイアル中に分取し，ヘルヴォート・オムニフレックス（Ｈｅｌｖｏｅｔ Ｏｍｎｉｆｌｅｘ）ストッパーおよび金属クリンプシール（ＳＰ Ｐｈａｎｎａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＫＭ）で密封した。バイアルは，示される温度で示される時間保存した。試料を取り出し，ＨＰＬＣにより逆相Ｃ１８（１ｘ１５ｃｍ）分析カラムを用いて元のペプチドの減損を分析した。試料（１０μｌ）を直接注入し，０．１％トリフルオロ酢酸の存在下で水中アセトニトリルの勾配で分離した。示される時間において残存するペプチドのパーセンテージは，無傷のペプチドの面積を無傷のペプチドと分解産物の合計面積で割り，１００を乗じて計算した。
【００７５】
【表２】
【００７６】
実施例２
種々の処方中におけるＧＲＦ（ｌ−４４）アミドの安定性を調べた。ＧＲＦ（ｌ−４４）アミドを表２に記載されるように処方し，種々の温度における７日後の純度を，Ｂｅｃｋｍａｎ ＨＰＬＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＣＡから市販）を用いて，逆相Ｃ１８分析カラムを用いて，０．１％トリフルオロ酢酸の存在下で水中の増加するアセトニトリルの勾配で測定した。
【００７７】
【表３】
【００７８】
表２のデータは，炭酸塩（処方Ｃ，Ｆ，Ｉ）はペプチドの分解を促進するようであることを示す。ラクトース（処方Ｂ，Ｃ，Ｄ）は，いずれの条件下においても，ペプチドの分解の防止についてはＤ−マンニトール（処方Ｅ，Ｆ，Ｇ）より劣っているようであり，Ｄ−トレハロース（処方Ｈ，Ｉ，Ｊ）はＤ−マンニトールとほぼ同程度にペプチドを安定化させるようである。酢酸塩処方（処方Ｂ，Ｅ，Ｈ）における主要な分解産物は，酸分解およびアスパラギン酸におけるベータシフトであった。炭酸塩（処方Ｃ，Ｆ，Ｉ）における主要な分解産物は不明であった。
【００７９】
好ましい処方の独特の特性，特にＧＬＰ−１を用いる場合の特性が表３に示される。表では，ＧＬＰ−１を用いて１ｍｇ／ｍＬの等張処方を調製する多くの試みが失敗し，これは主として，光スキャッタリングおよび沈澱／ゲル形成により証明されるように，粒子の形成によるものである。標準的な可溶化賦形剤，例えばＴｗｅｅｎ８０を用いた場合においても観察された明白な光スキャッタリングのため，このような処方は次善のものであり実用的ではない。
【００８０】
【表４】
【００８１】
実施例３
好ましい態様における長期安定性
ＧＬＰ−１，ＧＲＦ，およびＰＴＨは，ＳＰ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにおいて，ｃＧＭＰガイドラインにしたがって，ヘルヴォートストッパーおよび金属シールを有する３ｍＬガラスバイアル中で，１０ｍＭ酢酸塩，５．０７％Ｄ−マンニトール中に処方した。１ｍＬの処方された薬剤を含むバイアルを恒温チャンバに入れ，種々の温度で保存した後の時間の関数として残存したペプチドのパーセントをアッセイした。各時点における処方の生物活性も測定した。
【００８２】
図３，４，および５は，分解（ＨＰＬＣにより測定）および／または生物活性により評価して，処方が−２０℃および４℃で少なくとも９か月間非常に安定であることを示す結果を示す。ＧＬＰ−１処方の安定性データは図４に示され，ＰＴＨ処方の安定性データは図５に示される。
【００８３】
ＰＴＨの生物活性は，Ｐａｒｓｏｎｓら（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ９２，４５４（１９７３））のひな鳥高カルシウム血症アッセイにより測定した。ＧＬＰ−１の生物活性は，構成的に発現するＧＬＰ−１のレセプターを含む，トランスフォームしたヒト腎臓である胎児腎臓２９３細胞株を用いて測定した。ＧＲＦ活性は，ＧＲＦレセプターを発現する細胞株を用いて，ｃＡＭＰ応答性分泌アルカリホスファターゼレポーターシステムにより細胞のＧＲＦに対する応答をモニターすることにより，同様に評価した。
【００８４】
実施例４
ｐＨの関数としてのＧＬＰ−１の溶解性を調べたところ，図２に示されるｐＨ−溶解性プロファイルを有することが示された。このホルモンは，酸性条件（ｐＨ＜４）で最大の溶解性を有するが，５およびそれ以上のｐＨ値では溶解性は１ｍｇ／ｍＬより低い。ｐＨ４．６においては，溶解性は約１２ｍｇ／ｍＬである。
【００８５】
実施例５
好ましい処方がペプチドを動物に迅速かつ有効に輸送することを示すために，好ましい処方中のＧＬＰ−１をラットに皮下注射して，血漿のＧＬＰ−１を慣用的な総ＧＬＰ−１用のイムノアッセイにより時間の関数としてアッセイした。図７に示されるように，注射されたＧＬＰ−１は，血漿レベルの迅速な増加を引き起こし，このことは，ペプチドが迅速かつ有意に輸送されたことを示す。同様に，図８は，１０ｍＭ酢酸ナトリウム，５．０７％Ｄ−マンニトール，ｐＨ４．７中に処方した２０μｇのＧＲＦを静脈内ボーラスでラットに投与したとき，ペプチドが血漿中に迅速に現れたことを示す。
【００８６】
実施例６
処方され２４時間連続的に皮下に輸送されたＧＬＰ−１は，ヒトにおいて，基底レベルの約６倍高いＧＬＰ−１の血漿濃度を生じた。すなわち，５．０７％Ｄ−マンニトールおよび１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）に１ｍｇ／ｍＬで溶解したＧＬＰ−１をＭｉｎｉＭｅｄ５０７注入ポンプ中に入れ，ヒト被験者の皮下に２．４ｐｍｏｌ／ｋｇ／ｍｉｎの速度で２４時間輸送した。ラジオイムノアッセイにより測定した注入前の血漿中の平均（ｎ＝７）基底ＧＬＰ−１濃度は２４．７ｐＭであり，注入中の濃度は１４７ｐＭであった。このことは，処方の連続的皮下注入により，血漿ＧＬＰ−１が実質的に増加することを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は，ペプチドの純度分析のための逆相ＨＰＬＣの使用の例を示す。
【図２】図２は，本発明の処方中のＧＬＰ−１の溶解性を示す。
【図３】図３は，本発明の処方中のＧＲＦの安定性を示す。
【図４】図４は，本発明の処方中のＧＬＰ−１の安定性を示す。
【図５】図５は，本発明の処方中のＰＴＨの安定性を示す。
【図６】図６は，本発明の処方中のＧＬＰ−１の安定性を示す。
【図７】図７は，ＧＬＰ−１を本発明の処方中で皮下注射したときのラットの応答を示す。
【図８】図８は，ＧＲＦを本発明の処方中で静脈内投与した後に，ラットの血漿中で検出された総ＧＲＦを示す。
本出願は，米国特許出願６０／２０５，３７７（２０００年５月１７日出願）および米国特許出願６０／２０５，２６２（２０００年５月１９日出願）に基づく優先権を主張する。いずれの出願も本明細書の一部としてここに引用する。
【０００２】
発明の分野
本発明は，一般にペプチドの医薬処方に関する。より詳細には，本発明は，ペプチド，例えばグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１），上皮小体ホルモン（ＰＴＨ）または成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ），またはそのようなペプチドの薬学的に活性な誘導体または類似体，酸性緩衝液およびマンニトールの医薬処方に関する。例えば，新規処方は，ヒトにおいてよく許容され，例えば，驚くほど安定な組成物である。可溶性ペプチドは二量体を形成せず，凝集しない。
【０００３】
発明の背景
ペプチド，例えばＧＬＰ−１，ＰＴＨ，およびＧＲＦは，種々の疾患の治療に有用であることが当該技術分野において知られている。例えば，ＧＬＰ−１（７−３６）アミドはＩＩ型糖尿病（インスリン非依存性真性糖尿病，ＮＩＤＤＭとしても知られる）の治療に有用である。ＰＴＨ（１−３４）は骨粗鬆症の治療に有用であり，ＧＲＦ（ｌ−４４）アミドも同様である。米国特許４，８７０，０５４を参照。ＰＴＨ（ｌ−３４）とＧＲＦ（ｌ−４４）アミドとの組み合わせも骨粗鬆症の治療に用いることができる。米国特許５，１６４，３６８を参照。
【０００４】
そのようなペプチドを薬学的に許容しうる組成物中に処方することに伴う，当該技術分野において認識されている種々の問題が存在する。十分に高い濃度の可溶性ペプチドを有し，ペプチドの凝集およびペプチド二量体の形成が最小限であることが重要である。そのような凝集物および二量体の形成は，ＧＬＰ−１等のペプチドから医薬処方を作成する際に遭遇する顕著な問題点であることが当該技術分野において知られている。例えば，ＧＬＰ−１は多くの条件下でゲル化および凝集することが知られており，このため安定な可溶ペプチド処方を作成することが困難である（ＥＰ０９７８５６５Ａ１を参照）。
【０００５】
ＧＬＰ−１，ＰＴＨおよびＧＲＦを含む種々の医薬処方が当該技術分野において記述されている。このようなペプチドは，一般に，アルブミンまたは他の補助剤を含む水にペプチドを溶解し，これをヒトに注射することにより投与されている（Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ ｅｔ ａｌ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ １９，１（１９９６）；Ａｈｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏ．Ｍｅｔａｂ．８２，４７３（１９９７））。このようなペプチドはそのような条件下（中性に近いｐＨ値）では安定ではないかまたは十分に溶解性ではなく，アルブミン等の補助剤は酸性ｐＨ値では安定ではないため，この方法は欠点を有する。
【０００６】
さらに，当該技術分野においては，有害な副作用および患者の不快を最小限にするためには，生理学的ｐＨである医薬処方を用いることが望ましいことが知られている（Ｂｒａｚｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８７，６６７（１９９８）を参照）。しかし，生理学的ｐＨ（ｐＨ約７．４）においては，ＧＬＰ−１，ＰＴＨ，およびＧＲＦの溶解性は低い。例えば，ｐＨ約７．４の水中におけるペプチドＧＬＰ−１の溶解性は約０．２ｍｇ／ｍＬより低い。生理学的食塩水におけるＧＬＰ−１の溶解性も低い。生理学的ｐＨにおけるＰＴＨおよびＧＲＦの溶解性はやや高いが，４ｍｇ／ｍＬ以下である。
【０００７】
生理学的ｐＨにおけるペプチドの溶解性を増大させるために，従来の処方は，当該技術分野において認められる種々の薬剤，例えば界面活性剤および溶媒を使用してきた。しかし，そのような薬剤は患者において有害な副作用を引き起こしうるため，その使用は望ましくない（Ｂｒａｚｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８７，６６７（１９９８）を参照）。また，ヒト血清アルブミンは，その緩衝化能力および保存容器または投与に用いられる装置へのＧＬＰ−１の吸着を減少させる能力のため，ＧＬＰ−１処方において用いられてきた。ＧＬＰ−１は疎水性ペプチドであり，例えば，管およびシリンジに見いだされる疎水性表面に吸着する。しかし，患者において有害な免疫反応を刺激しうるため，ヒト血清アルブミンを使用することは望ましくない。また，高度に精製されたアルブミンを使用して，望ましくない副作用を引き起こしうる夾雑物を最小限にすることに多大な注意を払わなければならない。
【０００８】
アミド結合の安定性は，一般に，約４．０−４．５の範囲のｐＨにおいて最も高い。しかし，そのようなｐＨの範囲は，治療用ペプチドの処方においてはしばしば用いることができない。低いｐＨは三次または四次構造を有するペプチドの変性を引き起こす可能性があり，および／またはペプチドを不活性化させる可能性がある。さらに，低ｐＨの医薬処方は，注射の際に患者に不快をもたらすことが知られている（Ｂｒａｚｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８７，６６７（１９９８）を参照）。
【０００９】
米国特許５，７０５，４８３は，蒸留水と混合し，ｐＨを約６．０−９．０に調節したＧＬＰ−１の処方を記載する。この’４８３特許は，Ｄ−マンニトールはＧＬＰ−１の適当な賦形剤の例であると述べている。しかし，’４８３特許に記載される高いｐＨにおいては，処方はＧＬＰ−１の不安定性に寄与するかもしれない。
【００１０】
ＰＣＴ出願ＷＯ９８／１９６９８は，５Ｍ酢酸を用いてｐＨを４に調節した，１００ｎｍｏｌのＧＬＰ−１（７−３６）アミドと０．０２５ｍＬのヒトアルブミン溶液（２０％）との組み合わせを記載する。ヒト腹部に投与するために，通常の食塩水を用いてこの処方の容量を１ｍＬとしており，ＧＬＰ−１の濃度は１００μＭ（約０．３ｍｇ／ｍＬ）となる。しかし，上述したように，医薬処方においてはアルブミンを使用しないことが望ましい。
【００１１】
Ｔｈｅ １９９９ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ｐｐ．５３２−５３９）は，Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから市販されているＮＥＵＰＯＧＥＮを記載する。ＰＤＲ登録物には，ＮＥＵＰＯＧＥＮが，白血球産生の刺激における医薬用途に適した，組換えＤＮＡ技術により製造されたヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）であるフィルグラスチム（ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）の処方である医薬製品の名前であることが記述されている。ＰＤＲ登録物には，ＮＥＵＰＯＧＥＮが，５％ソルビトールおよび０．００４％ＴＷＥＥＮ８０を含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）中に処方されていることが記述されている。ＴＷＥＥＮ８０は，Ａｔｌａｓ Ｐｏｗｄｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｄｅｌａｗａｒｅから市販されている乳化，湿潤，および分散剤（すなわち界面活性剤）である。ＰＤＲ登録物にはさらに，ＮＥＵＰＯＧＥＮの量的な組成（ｍＬあたり）が，フィルグラスチム３００ｍｃｇ，酢酸塩０．５９ｍｇ，ソルビトール５０ｍｇ，ＴＷＥＥＮ８０ ０．００４％，ナトリウム０．０３５ｍｇをＵＳＰｑ．ｓ．注射水で１．０ｍＬとすることが記述されている。Ｇ−ＣＳＦは，１７５アミノ酸の長さの蛋白質であり，記載されるように，ＮＥＵＰＯＧＥＮ処方は界面活性剤を含む。
【００１２】
したがって，当該技術分野においては，補助剤が有害な副作用を引き起こしうるため，最小レベルの非治療用補助剤（例えばアルブミン，界面活性剤，および溶媒）を含む，比較的小さいペプチド，例えばＧＬＰ−１，ＰＴＨおよびＧＲＦの安定な医薬処方が必要とされている。ヒトにおいてよく許容される，すなわち，患者の不快を最小にする有効かつ安定な医薬処方を提供することも有益であろう。さらに，許容しうる濃度を有し，可溶性であり，ペプチド二量体および／または凝集を含まないか最小限に含むペプチド処方を提供することも有用であろう。記載されるように，ＧＬＰ−１は，多くの条件下でゲル化および凝集することが知られており，このため安定な処方が困難である（ＥＰ０９７８５６５Ａ１を参照）。本発明の他の利点は，本明細書および特許請求の範囲を検討することにより当業者には明らかとなるであろう。
【００１３】
発明の概要
患者によりよく許容され，最小限の非ペプチド成分を有する安定なペプチド医薬処方を提供するため，本発明者らは，ペプチド，緩衝液，および希釈剤を含む医薬処方を開発した。特に，本発明者らは，それぞれ酢酸およびＤ−マンニトール中に調製されたペプチド，例えばＧＬＰ−１（７−３６）アミド，ＰＴＨ（１−３４）ＯＨ，またはＧＲＦ（ｌ−４４）アミドを哺乳動物に投与するための安定な医薬組成物を開発した。
【００１４】
したがって，本発明の目的は，哺乳動物に投与するためのペプチドの良好な安定性を与える，ペプチド，緩衝液，および希釈剤を含む安定な単位用量の医薬組成物を提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的は，ペプチド，緩衝液および希釈剤を含む，哺乳動物によりよく許容される，哺乳動物に投与するための医薬組成物を用いて，哺乳動物において疾患または疾病を治療する方法を提供することである。
【００１６】
これらのおよび他の目的を達成するために，本発明の１つの観点にしたがえば，哺乳動物に投与するための単位用量の医薬組成物が提供される。該組成物は，治療上有効量のペプチドを含む。組成物はまた，約５未満のまたは５未満のｐＫａを有する酸を含む緩衝液を含む。特に，本発明の処方は酢酸を含む。処方はまた，組成物を等張にするための希釈剤を含む。特に，本発明の処方はＤ−マンニトールを含む。
【００１７】
好ましい態様においては，組成物は，本質的に，ペプチド，約５未満または５未満のｐＫａを有する酸を含む緩衝液，およびＤ−マンニトール等の希釈剤からなる。
【００１８】
別の好ましい態様においては，組成物は，ペプチド，約５未満または５未満のｐＫａを有する酸を含む緩衝液，および希釈剤からなる。
【００１９】
１つの好ましい態様においては，本発明の処方は，ペプチド，酢酸，およびＤ−マンニトールを含む。別の好ましい態様においては，本発明の処方は，本質的に，ペプチド，酢酸，およびＤ−マンニトールからなる。別の好ましい態様においては，本発明の処方は，ペプチド，酢酸，およびＤ−マンニトールからなる。
【００２０】
これらの処方はすべて，好ましくは，約３．０−約５．０，または３．０−５．０のｐＨ；より好ましくは，約４．０−約５．０または４．０−５．０；より好ましくは約４．５−約５．０または４．５−５．０；最も好ましくは約４．５−約４．７または４．５−４．７のｐＨを有する。別の好ましい態様は，４．５，４．６，または４．７のｐＨを有する。
【００２１】
本発明の別の観点にしたがえば，有効量の医薬処方を哺乳動物に投与するためのシステムが開示される。該システムは，単位用量の本発明の医薬処方を投与するための注入ポンプを含む。単位用量は，約２００−５０，０００原子量単位の分子量を有する治療上有効量のペプチド，例えば，ＧＬＰ−１分子，ＧＲＦ分子，またはＰＴＨ分子を含む。
【００２２】
本発明の別の観点にしたがえば，疾病を有する哺乳動物において疾病を治療する方法が開示される。該方法は，哺乳動物に有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む。
【００２３】
別の目的には以下のものが含まれる。（１）ＧＬＰ１分子，およびＧＲＦ分子，およびＰＴＨ分子からなる群より選択される分子；（２）１ｘ１０−５より大きい値の解離定数を有する酸；および（３）賦形剤，を含む医薬組成物であって，組成物のｐＨが約３．０−５．０であることを特徴とする医薬組成物。酸が酢酸を含む上述の組成物。賦形剤がＤ−マンニトールである上述の組成物。酸が酢酸であり，賦形剤がＤ−マンニトールである上述の組成物。組成物がＧＬＰ−１（７−３６）アミドを含む上述の組成物。組成物がＧＲＦ（ｌ−４４）アミドを含む上述の組成物。組成物がＰＴＨ（１−３４）ＯＨを含む上述の組成物。組成物が単位投与量の形態中にある上述の組成物。組成物が滅菌されている上述の組成物。単位用量の上述の組成物を投与するための注入ポンプを含む，医薬組成物を投与するためのシステム。投与前に組成物が等張食塩水で約４０倍までに希釈される，上述のシステム。薬学的に有効量の上述の組成物を哺乳動物に投与することを含む，哺乳動物において疾病または状態を治療するための方法。疾病または状態が，糖尿病，過剰欲求，肥満，発作，虚血，再灌流障害，グルコース代謝障害，外科手術，昏睡，ショック，胃腸疾病，消化ホルモン疾病，アテローム性動脈硬化症，心臓疾病，妊娠糖尿病，肝臓疾病，肝硬変，グルココルチコイド過剰，クッシング病，外傷または疾病後に生ずる活性化された逆制御ホルモンの存在，高トリグリセリド血症，慢性膵炎，非経口摂取の必要性，骨粗鬆症，および外科手術または創傷後の異化状態からなる群より選択される上述の方法。組成物が，静脈内，皮下，連続的，間欠的，非経口，およびこれらの組み合わせからなる群より選択される方法により哺乳動物に投与される，上述の方法。組成物が約４．５のｐＨを有する上述の組成物。組成物が約４．７のｐＨを有する上述の組成物。組成物が約４．５−４．７のｐＨを有する上述の組成物。組成物が４．５のｐＨを有する上述の組成物。組成物が４．７のｐＨを有する上述の組成物。本質的に，酢酸，Ｄ−マンニトール，および，ＧＬＰ１分子およびＧＲＦ分子およびＰＴＨ分子からなる群より選択される分子からなり，組成物が液体形態である，上述の組成物。酢酸，Ｄ−マンニトール，およびＧＬＰ１分子およびＧＲＦ分子およびＰＴＨ分子からなる群より選択される分子からなり，組成物が液体の形態である，上述の組成物。酢酸塩（約１０ｍＭ）およびＤ−マンニトール（約５０．７ｍｇ／ｍＬ）を含む上述の組成物。本質的に，酢酸塩（約１０ｍＭ），Ｄ−マンニトール（約５０．７ｍｇ／ｍＬ），およびＧＬＰ１分子およびＧＲＦ分子およびＰＴＨ分子からなる群より選択される分子からなる上述の組成物。酢酸塩（約１０ｍＭ），Ｄ−マンニトール（約５０．７ｍｇ／ｍＬ），およびＧＬＰ−１（７−３６）アミド（約１ｍｇ／ｍＬ）を含む上述の組成物。本質的に，酢酸塩（約１０ｍＭ），Ｄ−マンニトール（約５０．７ｍｇ／ｍＬ），およびＧＬＰ−１（７−３６）アミド（約１ｍｇ／ｍＬ）からなる上述の組成物。組成物が，酢酸塩（約１０ｍＭ），Ｄ−マンニトール（約５０．７ｍｇ／ｍＬ），およびＧＲＦ（ｌ−４４）アミド（約４ｍｇ／ｍｌ）を含む上述の組成物。本質的に，酢酸塩（約１０ｍＭ），Ｄ−マンニトール（約５０．７ｍｇ／ｍＬ），およびＧＲＦ（ｌ−４４）アミド（約４ｍｇ／ｍｌ）からなる上述の組成物。組成物が酢酸塩（約１０ｍＭ），Ｄ−マンニトール（約５０．７ｍｇ／ｍＬ），およびＰＴＨ（１−３４）ＯＨ（約５０ｍｇ／ｍＬ）を含む上述の組成物。組成物が本質的に，酢酸塩（約１０ｍＭ），Ｄ−マンニトール（約５０．７ｍｇ／ｍＬ），およびＰＴＨ（１−３４）ＯＨ（約５０ｍｇ／ｍＬ）からなる上述の組成物。ポンプが１時間あたり約１０μＬまたはそれ以上の速度で分子を放出するようプログラムされている，上述のシステム。
【００２４】
本発明のさらに別の目的，特徴および利点は，付随する図面を参照して，以下の発明の詳細な説明から明らかであろう。
【００２５】
図面の簡単な説明
図１は，ペプチドの純度分析のための逆相ＨＰＬＣの使用の例を示し，ペプチドの分解をモニターする能力を示す。試料は，逆相ＨＰＬＣで，０．１％トリフルオロ酢酸中の水／アセトニトリル勾配で溶出することにより分析した。用いたＨＰＬＣシステムは，ＨＰ１１００クロマトグラフィーシステムである。上パネル：ｐＨ４．５に調節した１０ｍＭ酢酸，５．０７％Ｄ−マンニトール中で，−２０℃（点線）および５０℃（実線）で１か月保存したＧＬＰ−１。Ｗａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｈａｓｅ Ｃ１８カラム，４．６ｘ２５０ｍｍを用いて，３３％から９５％アセトニトリルの２２分間の勾配で溶出した。下パネル：ｐＨ４．７に調節した１０ｍＭ酢酸，５．０７％Ｄ−マンニトール中で，−２０℃（点線）および３７℃（実線）で１か月保存したＧＲＦ。ＨＰＬＣ緩衝液ＡおよびＢの組成は，それぞれ２０％および５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルであり，Ｚｏｒｂａｘ ５ミクロンの４．６ｘ２５０ｍｍカラムを用いて２５％から５５％Ｂの２５分間の勾配で溶出した。
【００２６】
図２は，５．０７％Ｄ−マンニトールを含む１０ｍＭ酢酸塩緩衝液中のＧＬＰ−１の溶解性を２５℃におけるｐＨの関数として示す。溶液は，過剰のＧＬＰ−１とともに４日間撹拌した。遠心分離した後，溶液中のペプチドの量を紫外線吸収分光測光法により測定した。
【００２７】
図３は，ＨＰＬＣ（左パネル）および生物学的活性（右パネル）により決定したＧＲＦの安定性を，好ましい処方（４ｍｇ／ｍＬ ＧＲＦ，１０ｍＭ酢酸ナトリウム，５．０７％Ｄ−マンニトールに溶解，ｐＨ４．７に調節）中における保存時間の関数として示す。丸は−２０℃を表し，四角は４℃を表す。
【００２８】
図４は，ＨＰＬＣ分析（左パネル）およびバイオアッセイ（右パネル）により決定した，好ましい処方（１ｍｇ／ｍＬ ＧＬＰ−１，１０ｍＭ酢酸ナトリウム，５．０７％Ｄ−マンニトールに溶解，ｐＨ４．５に調節）中のＧＬＰ−１の安定性を示す。丸は−２０℃を表し，四角は４℃を表す。
【００２９】
図５は，ＨＰＬＣ分析により決定したＰＴＨ（１ｍｇ／ｍＬ ＰＴＨ，１０ｍＭ酢酸ナトリウム，５．０７％Ｄ−マンニトールに溶解，ｐＨ４．７に調節）の安定性を示す。丸は−２０℃を表し，四角は４℃を表す。
【００３０】
図６は，１０ｍＭ酢酸ナトリウム，５．０７％Ｄ−マンニトール，ｐＨ４．５中で１ｍｇ／ｍＬで処方したＧＬＰ−１のＨＰＬＣ分析による，ＧＬＰ−１の安定性を示す。試料は，ガラスバイアル中で４℃で（黒丸），ガラスバイアル中で３７℃で（四角），ＭｉｎｉＭｅｄポリプロピレン貯蔵器中で３７℃で（菱形）保存し，試料はＭｉｎｉＭｅｄポンプを用いて３７℃でポンプ注入した（三角）。
【００３１】
図７は，１２０μｇ／ｋｇのＧＬＰ−１を好ましい処方（１ｍｇ／ｍＬ ＧＬＰ−１，１０ｍＭ酢酸ナトリウム，５．０７％Ｄ−マンニトールに溶解，ｐＨ４．５に調節）中で皮下注射したときのラットの応答を示す。値は４匹の異なる動物の応答の平均である。
【００３２】
図８は，２０μｇのＧＲＦを好ましい処方（４ｍｇ／ｍＬ ＧＲＦ，１０ｍＭ酢酸ナトリウム，５．０７％Ｄ−マンニトール中に溶解，ｐＨ４．７に調節）中で静脈内投与した後に，ラットの血漿中で検出された総ＧＲＦを示す。
【００３３】
好ましい態様の詳細な説明
本発明にしたがえば，ペプチド，酸性緩衝液および希釈剤の医薬処方を哺乳動物への注射に用いることができる。ペプチドは，約２００−５０，０００原子量単位の分子量を有することができる。好ましい態様にしたがえば，ペプチドはＧＬＰ−１分子，ＰＴＨ分子，ＧＲＦ分子，またはこれらの組み合わせである。別の態様にしたがえば，ペプチドは，ＧＬＰ−１，ＰＴＨ，ＧＲＦの誘導体または類似体，またはこれらの組み合わせであってもよい。特に好ましい態様にしたがえば，ペプチドはＧＬＰ−１（７−３６）アミド，ＰＴＨ（１−３４）ＯＨ，またはＧＲＦ（ｌ−４４）アミドである。
【００３４】
処方のペプチド濃度（ＧＬＰ−１，ＰＴＨ，ＧＲＦ，またはこれらの組み合わせのいずれであっても）は，好ましくは，緩衝液および希釈剤の組み合わせ１ｍＬあたり約２５μｇ−５ｍｇの範囲内である。
【００３５】
ＧＬＰ−１
本発明の好ましい態様にしたがえば，ペプチドは，グルカゴン様ペプチド−１（７−３６）アミドである。この分子は回腸のＬ−細胞から分泌される天然のインクレチンホルモンである。これは，インスリン分泌速度の制御を助け，グルコースホメオスタシスに大きい影響を有する。ＧＬＰ−１はまた，全身的に作用して，多数の内分泌機能，例えば膵臓β細胞からのインスリンの制御および発現，およびグルカゴンの抑制により，遊離脂肪酸を抑制し，血中グルコースレベルの正常化を助ける。本発明の分脈において用いる場合，”ＧＬＰ−１分子”との用語は，グルカゴン様ペプチド，グルカゴン様ペプチド−１の類似体，およびグルカゴン様ペプチド−１レセプター蛋白質に結合するグルカゴン様ペプチド−１の誘導体を含む。
【００３６】
ＧＬＰ−１（７−３６）アミド（配列１）の配列：
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＮＨ２
【００３７】
本発明の別の態様にしたがえば，以下のＧＬＰ−１誘導体等のＧＬＰ−１の類似体を用いることができる：
ＧＬＰ−１（７−３６）ＯＨ（配列２）の配列：
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＯＨ
ＧＬＰ−１（７−３４）ＯＨ（配列３）の配列：
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−ＯＨ
ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列４）の配列：
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−ＩＩｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＯＨ
【００３８】
他のＧＬＰ−１類似体は当該技術分野において知られている。例えば，米国特許５，９５８，４０９は，適当なＧＬＰ−１類似体を記載する。さらに別の態様にしたがえば，ペプチドはＧＬＰ−１誘導体，例えばアルキル化またはアシル化ＧＬＰ−１誘導体または他の類似体でありうる。相同であるＧＬＰ−１の類似体，例えばエキセンジン（例えばエキセンジン３および４）およびＧＬＰ−２もまた本発明に含まれる。特に好ましい態様にしたがえば，ＧＬＰ−１分子は配列１のアミノ酸配列を有するＧＬＰ−１（７−３６）アミドである。
【００３９】
ＧＬＰ−１処方の安定性において役割を果たすであろう因子は，ＧＬＰ−１分子の濃度である。ｐＨの関数としてのＧＬＰ−１の溶解性プロファイルが図２に示される。約５．０より低いｐＨの値において，１０ｍＭ酢酸ナトリウム，５．０７％Ｄ−マンニトール中のＧＬＰ−１の溶解性は，一般に１ｍｇ／ｍＬより高く，皮下および静脈内注射用の有効な用量を可能とする。本発明者らは，約１ｍｇ／ｍＬの濃度のＧＬＰ−１（７−３６）アミドが本発明のｐＨ４．５の処方中で，２５℃で６か月まで安定であり，約４％が分解されることを見いだした。この安定性は，ＨＰＬＣ方法により決定して，この期間における分解産物（例えば酸分解およびアスパラギン酸におけるベータシフト）が最小量であったことにより証明された。図４を参照。特に安定な処方は，約０．１−４ｍｇ／ｍＬのＧＬＰ−１分子を含む。
【００４０】
本発明の”ＧＬＰ−１分子”にはまた，ＧＬＰ１と相同である毒トカゲの毒の６つのペプチドが含まれる。以下の表は，これらの配列をＧＬＰ１の配列と比較する。
【００４１】
【表１】
ペプチドｃおよびｈは，それぞれｂおよびｇから誘導される。天然に生ずる６個すべてのペプチド（ａ，ｂ，ｄ，ｅ，ｆ，およびｇ）は，位置１，７，１１および１８において相同である。ＧＬＰ−１（７−３６）アミドおよびエキセンジン３および４（ａ，ｂ，およびｄ）はさらに，位置４，５，６，８，９，１５，２２，２３，２５，２６および２９において相同である。位置２において，Ａ，ＳおよびＧは，構造的に類似する。位置３において，残基ＤおよびＥ（ＡｓｐおよびＧｌｕ）は構造的に類似する。位置２２および２３において，Ｆ（Ｐｈｅ）およびＩ（Ｉｌｅ）はそれぞれＹ（Ｔｙｒ）およびＬ（Ｌｅｕ）と構造的に類似する。同様に，位置２６において，ＬおよびＩは構造的に同等である。
【００４３】
すなわち，ＧＬＰ１の３０の残基のうち，エキセンジン３および４は，１５の位置において同一であり，さらに５の位置において同等である。主要な構造的変化が明らかな位置は，残基１６，１７，１９，２１，２４，２７，２８および３０のみである。エキセンジンはまた，カルボキシ末端に９個の余分の残基を有する。
【００４４】
ＰＴＨ
本発明の別の好ましい態様にしたがえば，ペプチドはＰＴＨ分子である。本発明の文脈において用いる場合，”ＰＴＨ分子”は，上皮小体ホルモン，上皮小体ホルモンの類似体，および上皮小体ホルモンの誘導体を含む。ＰＴＨは，カルシウムおよびリン酸代謝のホメオスタット調節における制御因子である。ＰＴＨ活性の主な部位は骨格，腎臓，および胃腸管であると考えられている。
【００４５】
ヒトＰＴＨ（１−３４）（配列５）の配列：
Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ
【００４６】
本発明の別の態様にしたがえば，ＰＴＨの類似体を用いることができる。ＰＴＨ類似体は当該技術分野において知られている。例えば，米国特許５，８４０，８３７は適当なＰＴＨ類似体を記載する。さらに別の態様にしたがえば，ペプチドはＰＴＨ誘導体，例えばＰＴＨ（１−８４），ＰＴＨ（１−３７），およびＰＴＨまたはその誘導体のＣ−末端アミデート化誘導体でありうる。特に好ましい態様にしたがえば，ペプチドはＰＴＨ（１−３４），すなわち天然のヒトＰＴＨ（配列５）である。
【００４７】
本発明者らは，本発明の処方中で約０．００５−１．０ｍｇ／ｍＬの濃度のＰＴＨ分子が４℃で４か月間安定であることを見いだした。特に安定な処方は，約０．０２−０．１０ｍｇ／ｍＬのＰＴＨを含む。
【００４８】
ＧＲＦ
本発明の別の好ましい態様にしたがえば，ペプチドはＧＲＦ（ｌ−４４）アミド（ＧＲＦ）である。ＧＲＦは，４４アミノ酸のペプチドである。ＧＲＦは，視床下部から分泌され，下垂体の成長ホルモン放出を刺激すると考えられているペプチドの群の１つである。ＧＲＦは小児期における正常な成長および発達に重要であり，（ソマトスタチンと一緒になって）ＧＨ分泌の神経制御を媒介することができる。ＧＲＦは，比較的小さく，したがって適当なベヒクルを用いて鼻吸入したときに有効でありうるため，閉経後骨粗鬆症および他の適応症の治療のために魅力的な分子である。
【００４９】
本発明の文脈において用いる場合，”ＧＲＦ分子”との用語は，成長ホルモン放出因子，成長ホルモン放出因子の類似体，および成長ホルモン放出因子レセプター蛋白質に結合する成長ホルモン放出因子の誘導体を含む。
【００５０】
ＧＲＦ（１−４４）アミド（配列６）の配列：
Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−ＮＨ２
【００５１】
本発明の別の態様にしたがえば，ＧＲＦの類似体を用いることができる。生物学的活性を有するＧＲＦ類似体は当該技術分野において知られており，一般に約２７−約４４アミノ酸を含む。ただし，このような類似体は，ＧＲＦよりいくぶん効力が低いかもしれない。例えば，Ｋｕｂｉａｋら（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６，８８８（１９９３））は，適当なＧＲＦ類似体を記載する。ＧＲＦ類似体の例としては，ＧＲＦ（１−４４）−ＯＨ，ＧＲＦ（１−４０）−ＯＨ，ＧＲＦ（１−４０）−ＮＨ２，ＧＲＦ（１−３２）−ＮＨ２，ＧＲＦ（１−３９）−ＮＨ２，ＧＲＦ（ｌ−４０）−Ｐｈｅ−ＮＨ２，ＧＲＦ（ｌ−４０）−Ｐｈｅ−ＯＨ，ＧＲＦ（１−４０）−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−ＮＨ２，ＧＲＦ（１−２９）−ＮＨ２，およびＧＲＦ（１−２７）−ＮＨ２，およびこれらの組み合わせが挙げられる。別の態様にしたがえば，ペプチドはＫｕｂｉａｋら（上述）に詳述されているようなＧＲＦ誘導体であってもよい。特に好ましい態様にしたがえば，ペプチドは配列６のアミノ酸配列を有するＧＲＦ（１−４４）アミドである。ＧＲＦの特に安定な処方は，約１．０−１０．０ｍｇ／ｍＬのＧＲＦを含む。
【００５２】
緩衝液
処方の緩衝液は，わずかに酸性のｐＨを有するべきである。いかなる特定の理論にも制限されることを意図するものではないが，酸性条件がペプチドのアミド結合の安定性を増加させることが当業者には知られている。酸性条件は一般弱酸により与えられる。酸は約１ｘ１０−５より大きいまたは１ｘ１０−５より大きい値の酸解離定数を有する場合，すなわち，ｐＫａ＜約５，またはｐＫａ＜５である場合，一般弱酸である。そのような酸としては，プロピオン酸，コハク酸，リンゴ酸，およびこれらの組み合わせが挙げられる。特に好ましい態様にしたがえば，酸は酢酸である。別の態様にしたがえば，酸は約１ｘ１０−５より大きいかまたは１ｘ１０−５より大きい値の酸解離定数を有することができる（例えばプロピオン酸または乳酸）。緩衝液は，緩衝化能力を有しており，酢酸塩，ホウ酸塩，リン酸塩，フタル酸塩，炭酸塩，およびこれらの組み合わせからなる群より選択することができる。１つの好ましい態様においては，ペプチドおよび賦形剤を含む溶液中に緩衝液が含まれており，ｐＨを約３．０−約５．０の範囲にする。よく知られる試薬，例えば本明細書に記載されるような弱酸および水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウム等の強塩基を用いてｐＨを所望の範囲に調節することができることは当該技術分野においてよく知られている。別の好ましい態様においては，緩衝液のｐＨは３．０−５．０の範囲である。より好ましい態様においては，緩衝液のｐＨは約４．０−約５．０または４．０−５．０の範囲である。特により好ましい態様においては，緩衝液のｐＨは，約４．５−約５．０または４．５−５．０の範囲である。最も好ましい態様においては，緩衝液のｐＨは，約４．５−約４．７または４．５−４．７の範囲である。さらに別の最も好ましい態様においては，緩衝液のｐＨは，４．５，４．６または４．７である。緩衝液は好ましくは約１ｍＭ−２０ｍＭ，より好ましくは約５−１０ｍＭの範囲のモル濃度を有する。
【００５３】
等張賦形剤
賦形剤は，処方を体液（投与のモードに依存する）とほぼ等張にすることを助ける。賦形剤の濃度は，ペプチド処方中の張度調節剤の既知の濃度にしたがって選択される。好ましい賦形剤には，多糖類，例えば化学組成Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１を有するラクトースまたはＤ−トレハロースが含まれる。本発明において特に好ましい賦形剤（この分脈においては”希釈剤”とも称される）は，化学組成Ｃ６Ｈ１４Ｏ６を有するＤ−マンニトールである。他の好ましい賦形剤には，Ｃ１−Ｃ１２の鎖を有するアルコールが含まれる。別の態様にしたがえば，賦形剤には，限定されないが，食塩水，緩衝化食塩水，デキストロース，水，グリセロール，エタノール，ラクトース，Ｄ−マンニトール，アルギニン，他のアミノ酸，およびこれらの組み合わせが含まれる。
【００５４】
新規処方
本発明の組成物は，臨床治療用の投与に非常に適した新規ペプチド処方である。これは，（１）滅菌することができる，（２）張度を制御することができる，（３）ｐＨを調節することができる，および（４）種々の投与方法に適合性であるためである。本発明の処方の態様の予測しえなかった特徴は，比較的低いｐＨにもかかわらず，非経口的に投与したとき，患者において有害な副作用をほとんどまたは全く生じないことである。さらに，動物およびヒトでの研究において，ペプチドの皮下および静脈内注射のいずれによってもその機能を示す生物学的応答が生じた。
【００５５】
本発明者らは，処方中でのペプチドの許容しうる溶解性は，低いｐＨ範囲においても可能であることを見いだした。特に好ましい態様にしたがえば，処方が約４．０−５．０または４．０−５．０の範囲のｐＨを有するとき，少なくとも約２ｍｇのＧＬＰ−１，少なくとも約４ｍｇのＰＴＨ，または少なくとも約１０ｍｇのＧＲＦペプチドが，緩衝液と賦形剤の組み合わせ約１ｍＬに溶解する。これらの本発明の処方は，好ましくは，より高いｐＨの値における適切なペプチド溶解性のために必要とされる，界面活性剤，溶媒または他の補助剤または賦形剤等の薬剤を実質的に含まない。
【００５６】
好ましい態様においては，本発明の処方は，酢酸，Ｄ−マンニトール，およびＧＬＰ−１分子，ＧＲＦ分子，およびＰＴＨ分子からなる群より選択される分子を含み，約４．５−約４．７，または４．５−４．７のｐＨを有する。別の好ましい態様においては，本発明の処方は，本質的に，酢酸，Ｄ−マンニトール，および，ＧＬＰ−１分子，ＧＲＦ分子，およびＰＴＨ分子からなる群より選択される分子からなり，約４．５−約４．７，または４．５−４．７のｐＨを有する。別の好ましい態様においては，本発明の処方は，酢酸，Ｄ−マンニトール，およびＧＬＰ−１分子，ＧＲＦ分子またはＰＴＨ分子からなる群より選択される分子からなり，約４．５−約４．７または４．５−４．７のｐＨを有する。さらに別の好ましい態様においては，本発明の処方は，約４．５のｐＨ，約４．６のｐＨ，約４．７のｐＨ，４．５のｐＨ，４．６のｐＨ，または４．７のｐＨを有する。
【００５７】
約４．０−５．０のｐＨの範囲は，ペプチドが生理学的ｐＨにおいてやや不溶性であるとしても，注射部位における析出の問題を示さなかった。試験の結果は，ＧＬＰ−１をヒト被験者に注射して１０分以内に血中グルコースがオイグリセミックレベルに低下したことを示した。このことは，一般にペプチドが注射部位において析出しなかったことを示す。ＧＬＰ−１またはＧＲＦ処方をヒトの皮下に約１ｍＬの量で注射したとき，注射部位における明白な不快は生じず，血中に現れたペプチド薬剤のレベルにより評価して迅速な応答を生じた。
【００５８】
本発明の処方は，ヒト被験者に注射したときであっても，驚くほど安定である。ペプチド分子の生物学的半減期は非常に短い。例えば，米国特許５，１１８，６６６によれば，ＧＬＰ−１（７−３７）の血中の生物学的半減期は３−５分間である。いかなる特定の理論にも制限されることを意図するものではないが，これらの本発明の処方の有効性は，部分的には，緩衝液の種類およびｐＨと賦形剤（例えば，Ｄ−マンニトール）の安定化効果との組み合わせにより生ずると考えられる。本発明者らは，ペプチドの分解の程度を定量することができるＨＰＬＣ方法を開発した（図１を参照）。
【００５９】
ＧＬＰ−１を含む本発明の処方をヒト患者における臨床試験において用いたとき，有害な影響はほとんど生じなかった。そのような処方の１０，０００を越えるバイアルは，−２０℃，４℃，および２５℃で少なくとも９か月の期間安定であった。ペプチドがＧＲＦまたはＰＴＨである本発明の処方もまた，匹敵する安定性を示した（図３，５を参照）。
【００６０】
表１を参照すると，１０ｍＭ酢酸塩，５．０７％（ｗ／ｖ）Ｄ−マンニトール，ｐＨ４．５中の１ｍｇ／ｍＬのＧＬＰ−１の処方は，２５℃で２８日間にわたり少なくとも９８％；３７℃で２８日間にわたり少なくとも９２％，および５０℃で２８日間にわたり少なくとも６６％の安定性を示した。さらに，このＧＬＰ−１処方は，４℃または−２０℃で１か月保存したとき，純度の変化を示さなかった。追加の安定性実験は，この処方中のＧＬＰ−１が４℃で１８か月以上，および２５℃で６か月，少なくとも９０％安定であることを示した。
【００６１】
ＰＴＨ（ｌ−３４）の０．１，１．０および１０．０ｍｇ／ｍＬ，ｐＨ４．７，５．０７％Ｄ−マンニトール，１０ｍＭ酢酸塩の処方は非常に安定であり，−２０℃から２５℃の温度で１４日間にわたり少なくとも約９８％安定であった。ＰＴＨ（１−３４）は，５０μｇ／ｍＬで同じ処方中で，−２０℃および５℃で６か月以上，２５℃で３か月，少なくとも９０％安定であることが示された。
【００６２】
ｐＨ４．７，５．０７％Ｄ−マンニトール，１０ｍＭ酢酸塩中の，４，８，および１０ｍｇ／ｍＬのＧＲＦの処方は，１４日間にわたり，−２０℃から４℃の温度で少なくとも９８％，２５℃で少なくとも９６％，および５０℃で６３％の安定性を示した。延長された期間について試験した追加の処方は，４℃で１２か月，および２５℃で４−６週間，少なくとも９０％の安定性を示した。
【００６３】
したがって，本発明の処方は，非常に安定であり，おそらくは−２０℃で数年間保存可能なペプチドを含む。また，より高い温度におけるこれらの分解により，これまでに同定され予測可能なフラグメントが生成する。これらの処方においては，検出可能な二量体形成および凝集はなかった。
【００６４】
ペプチドの製造
本発明のペプチドは，ペプチド製造の分野で一般に知られる方法により製造することができる。例えば，ペプチドは，固相化学ペプチド合成により，または慣用的な組換え技術により製造することができる。”組換え”との用語は，所望のペプチドまたは蛋白質が組換え（例えば微生物または哺乳動物）発現システムに由来することを意味する。組換え製造の基本的工程および技術は組換えＤＮＡ技術の当業者にはよく知られている。例えば，（１）本発明のペプチド分子をコードする天然のＤＮＡ配列を単離するか，またはペプチド分子用の合成または半合成のＤＮＡコーディング配列を構築し；（２）コーディング配列を，蛋白質を単独でまたは融合蛋白質として発現させるのに適当な様式で発現ベクター中に配置し；（３）適当な真核生物または原核生物宿主細胞を発現ベクターでトランスフォームし；（４）トランスフォームした宿主細胞をペプチド分子の発現を可能とする条件下で培養し；そして（５）組換え的に製造したペプチド分子を回収し，精製する。ペプチドは，例えば，限定されないが，硫酸アンモニウムまたはエタノール沈澱，酸抽出，アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー，ホスホセルロースクロマトグラフィー，疎水性相互作用クロマトグラフィー，アフィニティークロマトグラフィー，ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィー等の方法により，組換え細胞培養物から回収し精製することができる。最終精製工程のためには，高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いることができる。
【００６５】
治療方法および投与
本発明の処方は，哺乳動物における疾病および病気の治療において種々の用途を有する。当業者は，本発明の処方を，ＧＬＰ−１分子，ＧＲＦ分子，またはＰＴＨ分子の非経口投与を必要とする任意の疾病または状態のために用いることができることを認識するであろう。ＧＬＰ−１を含む処方は，糖尿病，過剰欲求，および肥満の治療に有用でありうる。ＰＴＨを含む処方は，骨成長不全および骨粗鬆症の治療に有用でありうる。ＧＲＦを含む処方は，骨粗鬆症およびるいそうの治療に有用でありうる。本発明の処方を注射した患者は，注射に際して最小限の刺激を有するかまたは全く有さず，成長ホルモン応答が生じ，これはペプチドが循環中に入ったことを示す。
【００６６】
本発明の処方は，好ましくは，単位投与量形態で投与する。そのような形態中では，処方は，適当な量のペプチドを含む単位用量に分割されている。単位用量は，包装された製剤であることができ，包装は個々の量のペプチドを含む。例えば，バイアルまたはアンプル中の可溶化ペプチドを含む液体，包装された錠剤，カプセル，およびバイアルまたはアンプル中の粉体でありうる。特定の状況についての適切な用量の決定は当業者の技術の範囲内である。一般に，治療は，製剤の最適用量より少ない用量で開始される。その後，その状況下において最適な効果が達成されるまで用量を少しずつ増加する。便宜的には，所望の場合には，１日の総用量を分割し，その日の間に一部ずつ投与する。
【００６７】
典型的な単位用量は，ＧＬＰ−１を含む処方については約０．１−２ｍｇまたは０．１−２ｍｇであり，ＰＴＨを含む処方については約１０−５０μｇであり，ＧＲＦを含む処方については約１−８ｍｇまたは１−８ｍｇであるが，これらの量より多いまたは少ない用量も用途を有するかもしれない。特に好ましい態様にしたがえば，用量は，約１ｍｇ／ｍＬのＧＬＰ−１，約５０μｇ／ｍＬまたは５０μｇ／ｍＬのＰＴＨ，および約１−４ｍｇ／ｍＬまたは１−４ｍｇ／ｍＬのＧＲＦの液体処方であり，商業的施設（例えば，ＳＰ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ）において各用量を標準的な３ｍＬバイアル中に作成し，充填する。
【００６８】
本発明の処方は，主としてヒト被験者への投与を意図するものであるが，他の哺乳動物被験体，例えばイヌおよびネコに投与してもよい（例えば獣医学的目的のために）。処方はまた，好ましくは，例えば，Ｐａｃｅｓｅｔｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから市販のＭｉｎｉＭｅｄ（登録商標）プログラム可能投薬注入ポンプを用いて，連続的皮下輸送として投与することができる。インビトロおよびインビボ研究は，ＭｉｎｉＭｅｄポンプの部品への処方の吸着が最小限であることを示す。さらに，好ましい態様においては，処方を等張食塩水で４０倍までに希釈し，ポンプ，例えばＨａｒｖａｒｄ Ｐｕｍｐ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，ＭＡ）により，生物学的活性の喪失もペプチドの吸着もなしに輸送することができる。
【００６９】
図６を参照すると，４℃および３７℃でガラスバイアル中およびＭｉｎｉＭｅｄポンプシステムのポリプロピレン貯蔵器中に保存したＧＬＰ−１処方の安定性，ならびに６日間ポンプ注入された処方の安定性の実験は，高い安定性を示し，このことは，この期間中にわたって物質の減損もペプチドの分解もない，輸送方法としての有用性を示す。
【００７０】
ＧＬＰ−１およびＧＲＦの好ましい処方を用いた，ヒト被験者における静脈内および皮下輸送の両方の広範な経験は，有意な合併症なしにペプチドが良好に輸送されることを示し，患者からの炎症または不快の報告はほとんどなかった。別の態様にしたがえば，処方は他の手段，例えば皮下またはマイクロプレッシャー注射，外部または移植ポンプ，デポ注射，および他の延長適用用投与装置により輸送することができる。あるいは，別の態様においては，本発明の処方を含むシリンジを用いることができる。そのようなシリンジは，ＧＬＰ−１分子の自己投与のために用いることができる。そのようなシリンジは当該技術分野においてよく知られている。例えば，米国特許５，９８０，４９１および５，９８４，９００を参照。
【００７１】
本発明の別の態様にしたがえば，処方は滅菌することができる。本発明の文脈において用いる場合，”滅菌”との用語は，無菌的であるか，または実質的に微生物を含まないことを意味する。当該技術分野において知られる種々の方法，例えば，限定されないが，物理学的方法（例えば加熱，音波，光線，放射，吸着，濾過）および化学的方法（例えば防腐薬）により，実質的にすべての微生物を破壊または除去することによって，処方を滅菌することができる。
【００７２】
本発明の処方は，本発明の精神または本発明の中心的特徴から逸脱することなく，他の特定の形態で具体化することができる。記載される態様は，すべての点において，例示的なものであって制限的なものではないと考えるべきである。したがって，本発明の範囲は，上述の説明ではなく特許請求の範囲により示される。特許請求の範囲の意味および均等の範囲内に含まれるすべての変更は，本発明の範囲内に包含される。例えば，本発明の処方は，薬学的に許容しうる保存剤，張度調節剤，ペプチドの作用を助ける補助剤または補助的薬剤，ペプチド用の賦形剤または不活性担体，界面活性剤，例えばＴＷＥＥＮ８０，またはペプチドの溶解性を増加させる溶媒を含んでいてもよい。
【００７３】
以下の実施例および製剤は，本発明の処方の製造，安定性および有効性をさらに例示するためにのみ提供される。本発明の範囲は以下の実施例に限定されない。
【００７４】
実施例
実施例１
ＧＬＰ−１，ＰＴＨ，およびＧＲＦを，塩化物塩として，表１に示すｐＨ値で処方中に溶解し，１ｍＬ管ガラスバイアル中に分取し，ヘルヴォート・オムニフレックス（Ｈｅｌｖｏｅｔ Ｏｍｎｉｆｌｅｘ）ストッパーおよび金属クリンプシール（ＳＰ Ｐｈａｎｎａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＫＭ）で密封した。バイアルは，示される温度で示される時間保存した。試料を取り出し，ＨＰＬＣにより逆相Ｃ１８（１ｘ１５ｃｍ）分析カラムを用いて元のペプチドの減損を分析した。試料（１０μｌ）を直接注入し，０．１％トリフルオロ酢酸の存在下で水中アセトニトリルの勾配で分離した。示される時間において残存するペプチドのパーセンテージは，無傷のペプチドの面積を無傷のペプチドと分解産物の合計面積で割り，１００を乗じて計算した。
【００７５】
【表２】
実施例２
種々の処方中におけるＧＲＦ（ｌ−４４）アミドの安定性を調べた。ＧＲＦ（ｌ−４４）アミドを表２に記載されるように処方し，種々の温度における７日後の純度を，Ｂｅｃｋｍａｎ ＨＰＬＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＣＡから市販）を用いて，逆相Ｃ１８分析カラムを用いて，０．１％トリフルオロ酢酸の存在下で水中の増加するアセトニトリルの勾配で測定した。
【００７７】
【表３】
表２のデータは，炭酸塩（処方Ｃ，Ｆ，Ｉ）はペプチドの分解を促進するようであることを示す。ラクトース（処方Ｂ，Ｃ，Ｄ）は，いずれの条件下においても，ペプチドの分解の防止についてはＤ−マンニトール（処方Ｅ，Ｆ，Ｇ）より劣っているようであり，Ｄ−トレハロース（処方Ｈ，Ｉ，Ｊ）はＤ−マンニトールとほぼ同程度にペプチドを安定化させるようである。酢酸塩処方（処方Ｂ，Ｅ，Ｈ）における主要な分解産物は，酸分解およびアスパラギン酸におけるベータシフトであった。炭酸塩（処方Ｃ，Ｆ，Ｉ）における主要な分解産物は不明であった。
【００７９】
好ましい処方の独特の特性，特にＧＬＰ−１を用いる場合の特性が表３に示される。表では，ＧＬＰ−１を用いて１ｍｇ／ｍＬの等張処方を調製する多くの試みが失敗し，これは主として，光スキャッタリングおよび沈澱／ゲル形成により証明されるように，粒子の形成によるものである。標準的な可溶化賦形剤，例えばＴｗｅｅｎ８０を用いた場合においても観察された明白な光スキャッタリングのため，このような処方は次善のものであり実用的ではない。
【００８０】
【表４】
実施例３
好ましい態様における長期安定性
ＧＬＰ−１，ＧＲＦ，およびＰＴＨは，ＳＰ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにおいて，ｃＧＭＰガイドラインにしたがって，ヘルヴォートストッパーおよび金属シールを有する３ｍＬガラスバイアル中で，１０ｍＭ酢酸塩，５．０７％Ｄ−マンニトール中に処方した。１ｍＬの処方された薬剤を含むバイアルを恒温チャンバに入れ，種々の温度で保存した後の時間の関数として残存したペプチドのパーセントをアッセイした。各時点における処方の生物活性も測定した。
【００８２】
図３，４，および５は，分解（ＨＰＬＣにより測定）および／または生物活性により評価して，処方が−２０℃および４℃で少なくとも９か月間非常に安定であることを示す結果を示す。ＧＬＰ−１処方の安定性データは図４に示され，ＰＴＨ処方の安定性データは図５に示される。
【００８３】
ＰＴＨの生物活性は，Ｐａｒｓｏｎｓら（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ９２，４５４（１９７３））のひな鳥高カルシウム血症アッセイにより測定した。ＧＬＰ−１の生物活性は，構成的に発現するＧＬＰ−１のレセプターを含む，トランスフォームしたヒト腎臓である胎児腎臓２９３細胞株を用いて測定した。ＧＲＦ活性は，ＧＲＦレセプターを発現する細胞株を用いて，ｃＡＭＰ応答性分泌アルカリホスファターゼレポーターシステムにより細胞のＧＲＦに対する応答をモニターすることにより，同様に評価した。
【００８４】
実施例４
ｐＨの関数としてのＧＬＰ−１の溶解性を調べたところ，図２に示されるｐＨ−溶解性プロファイルを有することが示された。このホルモンは，酸性条件（ｐＨ＜４）で最大の溶解性を有するが，５およびそれ以上のｐＨ値では溶解性は１ｍｇ／ｍＬより低い。ｐＨ４．６においては，溶解性は約１２ｍｇ／ｍＬである。
【００８５】
実施例５
好ましい処方がペプチドを動物に迅速かつ有効に輸送することを示すために，好ましい処方中のＧＬＰ−１をラットに皮下注射して，血漿のＧＬＰ−１を慣用的な総ＧＬＰ−１用のイムノアッセイにより時間の関数としてアッセイした。図７に示されるように，注射されたＧＬＰ−１は，血漿レベルの迅速な増加を引き起こし，このことは，ペプチドが迅速かつ有意に輸送されたことを示す。同様に，図８は，１０ｍＭ酢酸ナトリウム，５．０７％Ｄ−マンニトール，ｐＨ４．７中に処方した２０μｇのＧＲＦを静脈内ボーラスでラットに投与したとき，ペプチドが血漿中に迅速に現れたことを示す。
【００８６】
実施例６
処方され２４時間連続的に皮下に輸送されたＧＬＰ−１は，ヒトにおいて，基底レベルの約６倍高いＧＬＰ−１の血漿濃度を生じた。すなわち，５．０７％Ｄ−マンニトールおよび１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）に１ｍｇ／ｍＬで溶解したＧＬＰ−１をＭｉｎｉＭｅｄ５０７注入ポンプ中に入れ，ヒト被験者の皮下に２．４ｐｍｏｌ／ｋｇ／ｍｉｎの速度で２４時間輸送した。ラジオイムノアッセイにより測定した注入前の血漿中の平均（ｎ＝７）基底ＧＬＰ−１濃度は２４．７ｐＭであり，注入中の濃度は１４７ｐＭであった。このことは，処方の連続的皮下注入により，血漿ＧＬＰ−１が実質的に増加することを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は，ペプチドの純度分析のための逆相ＨＰＬＣの使用の例を示す。
【図２】図２は，本発明の処方中のＧＬＰ−１の溶解性を示す。
【図３】図３は，本発明の処方中のＧＲＦの安定性を示す。
【図４】図４は，本発明の処方中のＧＬＰ−１の安定性を示す。
【図５】図５は，本発明の処方中のＰＴＨの安定性を示す。
【図６】図６は，本発明の処方中のＧＬＰ−１の安定性を示す。
【図７】図７は，ＧＬＰ−１を本発明の処方中で皮下注射したときのラットの応答を示す。
【図８】図８は，ＧＲＦを本発明の処方中で静脈内投与した後に，ラットの血漿中で検出された総ＧＲＦを示す。
Claims (14)
- ＧＬＰ１分子，およびＧＲＦ分子およびＰＴＨ分子からなる群より選択される分子；１ｘ１０−５より高い値の解離定数を有する酸；および賦形剤を含む医薬組成物であって，前記組成物のｐＨが約３．０−５．０であることを特徴とする医薬組成物。
- 前記酸が酢酸を含む，請求項１記載の組成物。
- 前記賦形剤がＤ−マンニトールである，請求項１記載の組成物。
- 前記酸が酢酸であり，前記賦形剤がＤ−マンニトールである，請求項１記載の組成物。
- 前記組成物がＧＬＰ−１（７−３６）アミドを含む，請求項１記載の組成物。
- 前記組成物がＧＲＦ（ｌ−４４）アミドを含む，請求項１記載の組成物。
- 前記組成物がＰＴＨ（１−３４）ＯＨを含む，請求項１記載の組成物。
- 前記組成物が単位投与量の形態中にある，請求項１記載の組成物。
- 前記組成物が滅菌されている，請求項１記載の組成物。
- 医薬組成物を投与するためのシステムであって，単位用量の請求項１記載の組成物を投与するための注入ポンプを含むシステム。
- 前記組成物が，投与前に等張食塩水で約４０倍までに希釈される，請求項１０記載のシステム。
- 哺乳動物において疾病または状態を治療する方法であって，哺乳動物に薬学的に有効量の請求項１記載の組成物を投与することを含む方法。
- 疾病または状態が，糖尿病，過剰欲求，肥満，発作，虚血，再灌流障害，グルコース代謝障害，外科手術，昏睡，ショック，胃腸疾病，消化ホルモン疾病，アテローム性動脈硬化症，心臓疾病，妊娠糖尿病，肝臓疾病，肝硬変，グルココルチコイド過剰，クッシング病，外傷または疾病後に生ずる活性化された逆制御ホルモンの存在，高トリグリセリド血症，慢性膵炎，非経口摂取の必要，骨粗鬆症，および外科手術または創傷後の異化状態からなる群より選択される，請求項１２記載の方法。
- 前記組成物が，静脈内，皮下，連続的，間欠的，非経口，およびこれらの組み合わせからなる群より選択される方法により前記哺乳動物に投与される，請求項１２記載の方法。
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