MX2012009618A - Preperaciones de analogo de insulina de larga accion en formas solubles y cristalinas. - Google Patents

Abstract

Una formulación farmacéutica comprende un análogo de insulina o una sal fisiológicamente aceptable del mismo, en donde el análogo de insulina o una sal fisiológicamente aceptable del mismo contiene una secuencia de cadena A de insulina que contiene sustituciones de Histidina emparejadas en A4 y A8, y opcionalmente una sustitución en A21. La formulación además contiene una solución reguladora farmacéuticamente aceptable que contiene por lo menos aproximadamente 4 iones zinc por 6 moléculas de análogo de insulina. La formulación forma un depósito subcutáneo dependiente de zinc de larga acción en la inyección subcutánea. En una formulación libre de zinc, el monómero de análogo de insulina exhibe afinidad disminuida para el receptor de Factor de Crecimiento similar a Insulina y por lo menos 20% de la afinidad para el receptor de insulina de la misma especie, en comparación con una insulina o análogo de insulina de otra manera idéntico que no contiene las sustituciones RisA4 y HisA8.

Description

PREPARACIONES DE ANÁLOGO DE INSULINA DE LARGA ACCIÓN EN FORMAS SOLUBLES Y CRISTALINAS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La terapia intensiva con insulina para el tratamiento de diabetes mellitus Tipo 1 requiere de inyección subcutánea de una formulación de insulina o de una formulación de análogo de insulina. Los regímenes pueden consistir de múltiples inyecciones diarias o la infusión subcutánea continua de insulina o de un análogo de insulina ("terapia con bomba") . El control de las concentraciones de glucosa en la sangre se busca durante, después, y entre las comidas y a través del ciclo de sueño-despierto. Debido a que las bombas que permiten la infusión continua se utilizan por solamente una minoría de pacientes, esfuerzos considerables se han llevado a cabo para desarrollar formulaciones de corta, .intermedia y larga acción, que típicamente se definen como preparaciones de insulina humana, preparaciones de insulina de mamífero, o preparaciones de análogo de insulina, con duraciones efectivas de aproximadamente 4, 12, y 18-24 horas, pero que duran potencialmente hasta 7, 16, y 30 horas respectivamente. El interés particular en las formulaciones de insulina de larga acción, o formulaciones de análogo de insulina de larga acción, se han motivado por la necesidad para evitar la hipoglucemia nocturna y/o hiperglucemia matutina. La presente invención pertenece a métodos de preparación de una clase novedosa de formulaciones de análogo de insulina de larga acción. Esta clase de formulaciones también pueden ser útiles para el tratamiento de la diabetes mellitus Tipo 2.

La administración de insulina se establece por largo tiempo como un tratamiento para la diabetes mellitus. La insulina es una proteina globular pequeña que desempeña una función central en el metalismo en vertebrados. La insulina contiene 2 cadenas, una cadena A, que contiene 21 residuos y una cadena B que contiene 30 residuos. La hormona se almacena en la célula ß pancreática como un hexámero estabilizado con Zn2+, pero funciona como un monómero sin Zn2+ en la corriente sanguínea.

La insulina es el producto de un precursor de cadena individual, proinsulina, en la cual una región de conexión (35 residuos) enlaza el residuo C-terminal de la cadena B (residuo B30) al residuo N-terminal de la cadena A (Fig. 1A) . La estructura de la proinsulina, como es determinada recientemente por la resonancia magnética nuclear como un monómero diseñado, contiene un núcleo similar a insulina y un péptido de conexión desordenada contemplado como largo (Fig. IB) . La formación de tres puentes de disulfuro específicos (A6-A11, A7-B7, y A20-B19; Fig. IB) se cree que es acoplada al plegamiento oxidante de proinsulina en el retículo endoplásmico rugoso (ER) . La proinsulina se ensambla para formar hexámeros coordinados de Zn2+ solubles poco tiempo después de la exportación desde el ER al aparato de Golgi. La digestión endoproteolitica y la conversión a insulina ocurre en los gránulos secretorios inmaduros seguido por la condensación morfológica. Los cristales de hexámeros de zinc-insulina dentro de gránulos de almacenamiento maduros se han visualizado mediante la microscopía electrónica (EM) . La presente invención describe formulaciones de análogo de insulina que dirigen los ensamblajes de multi-hexámero que contienen zinc novedosos para modificar la duración de acción de un análogo de insulina activo en la inyección subcutánea.

El diseño de análogos de insulina en el uso para el tratamiento de diabetes mellitus ha explotado la estructura tridimensional de la insulina como un monómero, dímero y hexámero. Un monómero de insulina contiene tres a-hélices, dos ß-vueltas y dos segmentos extendidos. La cadena A consiste de una a-hélice N-terminal (residuos A1-A8), vuelta no canónica (A9-A12), segunda a-hélice (A12-A18), y extensión C-terminal (A19-A21) . La cadena B contiene un brazo N-terminal (B1-B6) , ß-vuelta (B7-B10) , a-hélice central (B9-B19) , ß-vuelta (B20-B23) , ß-hebra (B24-B28), y residuos C-terminales flexibles B29-B30. Las dos cadenas se empacan para formar un dominio globular compacto estabilizado por tres puentes de disulfuro (cistinas A6-A11, A7-B7, y A20-B19) . Los estudios cristalográficos con rayos X extensivos se han llevado a cabo del hexámero de insulina coordinado con Zn2+ en una variedad de formas de red; las múltiples formas de cristal definen tres familias estructurales designadas T6, T3Rf3 y R6. En cada caso, se ha encontrado que dos iones Zn se encuentran a lo largo del eje central del hexámero ("iones de zinc axiales") , cada uno coordinado por tres cadenas laterales de Histidina (HisB1°) ; sitios de enlace de zinc de baja afinidad o parcialmente ocupados adicionales se han observado en algunas formas de cristal. El protómero de estado T se asemeja a la estructura de un monómero de insulina en solución. El protómero de estado R exhibe un cambio en la estructura secundaria de la cadena B: la a-hélice central se extiende a Bl (el estado R) o a B3 (el estado Rf desgastado) . Las tres familias de hexámeros también difieren en las características penetrantes del empacamiento de cadena lateral.

El desensamblaje subcutáneo de hexámeros de insulina puede ser un inductor clave de la farmacocinética de insulina inyectada. Por consiguiente, las formulaciones de insulina farmacéuticas frecuentemente se han basado en el ensamblaje o desensamblaje de hexámeros de zinc insulina. Por ejemplo, los análogos de rápida acción pueden limitar el auto-ensamblaje del hexámero de insulina o acelerar el desensamblaje del hexámero. Por otra parte, los análogos de larga acción típicamente se retardan en el desensamblaje o promueven la precipitación y el auto ensamblaje en un depósito subcutáneo. Pertinente al diseño y la farmacocinética de Humalog® y NovoLog®, por ejemplo, los análogos de insulina constituyentes se inyectan como hexámeros, que deben desensamblarse para permitir la absorción en los capilares. Las sustituciones en esos análogos facilitan el desensamblaje del hexámero para permitir una formulación de insulina de rápida acción. En contraste, Lantus® de larga acción se inyecta como una solución de principalmente monómeros y dimeros, que precipitan para formar un depósito amorfo o microcristalino después de la inyección a medida que el pH se eleva en el material inyectado en la solución de regulación por el tejido subcutáneo y los fluidos. Tres estrategias dependen de un principio común - una relación entre la disponibilidad de monómeros o dimeros de insulina libres en el depósito subcutáneo o su velocidad de absorción en los capilares. Una variedad de formulaciones de insulina asi desarrollada proporciona un intervalo de propiedades farmacocinéticas . Una combinación de formulaciones de insulina o formulaciones de análogo de insulina de corta acción, intermedia y larga acción permite el diseño de un régimen diario para restringir las fluctuaciones en la concentración de glucosa en la sangre y por consiguiente optimizar el control glucémico. Las clases mayores de formulaciones clínicas son: Insulina Regular - Las formulaciones de insulina de rápida acción se formulan en pH neutro como soluciones claras de hexámeros de zinc insulina solubles. El fenol, meta-cresol, o metilparabeno, originalmente introducidos como conservadores antimicrobianos, también enlazan a los hexámeros para inducir la transición estructural T—>R. El hexámero R6 exhibe más alta estabilidad termodinámica y cinética que el hexámero T6 clásico. Las formulaciones de análogo de insulina hexámericas, basadas en zinc, análogas se utilizan para productos de rápida acción Humalog® (Eli Lilly and Co.) y Novolog® (Novo-Nordisk) .

Insulina NPH - Las formulaciones de insulina de intermedia acción (NPH; Hagedom de protamina neutra) están basadas en suspensiones de cristales ortorombicos de hexámeros de zinc insulina Re que contienen fenol (o meta-cresol) y concentraciones sub-estequiométricas de protamina, mezcla de péptidos básicos pequeños que contienen múltiples residuos de arginina. Los estudios cristalográficos de rayos X de los cristales de insulina NPH sugieren que las posiciones de este péptido básico en el cristal dan sus modos de enlace al hexámero de zinc insulina. Una formulación de NPH análoga de la insulina lispro de otra manera de rápida acción (el componente activo de Humalog®) se ha desarrollado para permitir regímenes mezclados. Sin embargo la insulina NPH es dificultosa y costosa de formular: la protamina es una colección de péptidos básicos derivados del esperma, usualmente esperma de ganado vacuno; la producción de cristales NPH es un proceso de exactitud y complejo construido alrededor de una producción inicial de cristales de semilla uniformes. Además, la insulina NPH está propensa a la fibrilación.

El Principio Lente - También designadas suspensiones de insulina zinc (IZS), la acción prolongada por la insulina humana o insulinas animales se puede obtener al adicionar un exceso de iones de zinc (típicamente 20-30 por hexámero) a suspensiones de hexámeros de insulina T6. Este gran exceso conduce al enlace de sitios de baja afinidad y rendimientos de precipitados amorfos de complejos de zinc insulina (Semilente o IZS amorfo) o suspensiones microcristalinas de insulina T6 de zinc rombohédricas (Untralente o IZS, cristalino) . El metilparabeno típicamente se utiliza como conservador y se enlaza a una cara del hexámero de zinc insulina ?ß- Las formulaciones ultra lente son de más larga acción que las formulaciones semi-lente; los cursos de tiempo intermedios se pueden obtener al mezclar partículas amorfas y cristalinas (lente o IZC mezcladas) . Las siguientes dos etapas se llevan a cabo en la manufactura: (1) Cristales de Insulina Precursores - La primera etapa emplea iones zinc y una alta concentración ( supra-fisiológica) de iones cloruro (NaCl 1.2 M) en la ausencia de conservador para formar una suspensión de semillas micro-cristalinas en pH 5.5.

Los cristales precursores pertenecen al grupo espacial R3 y contienen hexámeros de zinc insulina T3Rf3 en los cuales un total de cuatro iones zinc (+8 en carga) y siete iones cloruro (-7 en carga) se enlazan por hexámero, conjuntamente proporcionando +1 a la carga formal del hexámero. Distinto a los hexámeros R6 de formulaciones regulares, los hexámeros precursores contienen solamente un ion zinc axial, localizado dentro del trímero T6. Los otros tres iones zinc están fuera del eje dentro del trímero R£j: HisB1° lanza su conformación de acuerdo con HisB5 y dos iones cloruro para formar un sitio de enlace de ion zinc tetrahédrico . Estos sitios fuera del eje están cerca de las cavidades de enlace de fenol de los hexámeros clásicos. Los sitios de enlace de ion zinc fuera del eje, de intrahexámero de los cristales precursores ultralente no están relacionados con los sitios de enlace de zinc interfacial/interhexámero de la presente invención. (2) Cristales de Insulina Ultralente - Para obtener la suspensión microcristalina ultra-lente, los cristales de semilla se diluyen en una solución reguladora pH 7.4 que contiene metilparabeno, una concentración menor de iones de cloruro (120 mM) y concentración más alta de iones zinc. Los cristales consisten de hexámeros de insulina en el grupo espacial R3. Como un resultado de los concentraciones de ion zinc muy altas en la formulación (por ejemplo, >5 por molécula de insulina) , iones zinc extras se observan por hexámero. Además de los dos iones zinc axiales normales, se observa ocupación parcial de una de dos sitios de enlace débil no clásico, mutuamente exclusivos también localizados en el centro del hexámero. La densidad de electrones no fue de calidad suficiente para permitir el análisis de iones cloruro enlazados. Los sitios de enlace de ion zinc fuera del eje, de intrahexámero de cristales ultralente maduros también no son relacionados con los sitios de enlace de zinc interfaciales/interhexámero de la presente invención .

Los análogos de insulina con cadenas B extendidas que forman hexámeros con más de 2 zinc por hexámero también son conocidos. La insulina humana con los siguientes conjuntos de sustitución: GlyA21-HisB31-HisB32, GlyA21-HisB31-HisB32-ArgB33 , GlyA21-AlaB31-HisB32-HisB33, y GlyA21-AlaB31- HisB32-HisB33-ArgB34 , forman complejos estables con 6.5, 5.3, 6.7, y 5 zinc por hexámero respectivamente. Estos complejos (GlyA21-AlaB31-HisB32-HisB33-ArgB34 in particular) también han mostrado farmacocinética extendida en perros. Es probable aquí que los iones zinc extras estén enlazados entre los grupos alfa-amino de la cadena A y las nuevas Histidinas en el C-terminal de la cadena B dentro de cada hexámero.

Otro - La acción prolongada se ha logrado después de la inyección subcutánea de una solución acídica clara de un análogo de insulina (insulina glargina, el componente activo de Lantus®; Sanofi-Aventis ) cuyo punto isoeléctrico se ha desplazado entre 7.0 y 7.4 mediante la modificación de la secuencia de polipéptido de la insulina humana. Un depósito de larga acción se forma debido a la precipitación en el pH del tejido subcutáneo (pH 7.4). La acción prolongada también se ha logrado mediante la modificación covalente de la insulina por una porción no polar (insulina detemir, el componente activo de Levimir®; Novo-Nordisk) para aumentar su hidrofobicidad en el depósito subcutáneo y para permitir el enlace a la albúmina del suero para el retardo de evacuación de la corriente sanguínea. De interés histórico son las mezclas de insulinas animales (tales como porcinas y bovinas) que explotaron sus diferencias en la solubilidad.

La presente invención hace uso novedoso de iones zinc no axiales para prolongar la duración de acción de las formulaciones de análogo de insulina proporcionadas en la presente. Los usos previos de los iones de zinc conocidos en la técnica son como sigue. Las formulaciones de insulina regular y las formulaciones de rápida acción correspondientes de Humalog® y Novalog® utilizan iones zinc para dirigir y estabilizar el ensamblaje de un hexámero de insulina. El hexámero consiste de tres dímeros de insulina relacionados por un eje tres veces central de simetría. Cada hexámero de insulina o hexámero de análogo de insulina contiene dos iones zinc localizados en el eje de simetría de tres veces del hexámero. Estos "iones zinc axiales" están coordinados con los anillos de imidazol de HisB1° en el hexámero R6 la geometría de coordinación se cree que es tetrahédrica; cada ion zinc es de esta manera enlazado a tres residuos HisB1° relacionados en simetría con el cuarto sitio de coordinación ocupado por un ion cloruro. Los dos iones zinc axiales (carga +4) y los dos iones cloruro de coordinación (carga -2) conjuntamente adicionan +2 a la carga formal total del hexámero. No hay iones zinc no axiales en esta estructura. Los estudios de difracción de rayos X de cristal individual de micro cristales de insulina NPH de tipo natural exhiben dos iones zinc axiales por hexámero sin iones zinc adicionales. La red fue ortorómbica con el grupo espacial ?2?2?2?, conduciendo a un patrón de empaquetamiento de hexámero-hexámero y consistente con la presente invención (enseguida) .

La mayoría de productos de insulina en uso actual para tratamiento de la diabetes mellitus contienen análogos de insulina cuya secuencia difiere de aquella de la insulina humana natural. Las sustituciones de aminoácido en las cadenas A y/o B de la insulina se han investigado ampliamente para efectos favorables posibles sobre la farmacocinética de la acción de la insulina después de la inyección subcutánea. Ejemplos conocidos en la técnica contienen sustituciones que aceleran o retardan el curso de tiempo de absorción. Los análogos formadores colectivamente definen los análogos de insulina "en el tiempo de comida" debido a que los pacientes con diabetes mellitus pueden inyectarse tales formulaciones de rápida acción en el tiempo de una comida mientras que la absorción retardada de insulina humana de tipo natural o insulinas animales (tal como insulina porcina o insulina bovina) hace necesario inyectar estas formulaciones 30-45 antes de una comida. Las sustituciones se diseñan para desestabilizar el hexámero de zinc insulina al alterar la complementariedad estérica o electrostática de las interfases subunitarias y de esta manera facilitar la disociación rápida del hexámero de zinc insulina después de la administración subcutánea. Los análogos de insulina en el tiempo de la comida se formulan como soluciones claras en pH 7.4 como hexámeros de análogo de zinc-insulina (Humalog® y Novalog®) o como soluciones sin zinc que contienen especies monoméricas, diméricas, triméricas, tetraméricas y hexaméricas en equilibrio (Apidra®; Sanofi-Aventis) . Aunque Humalog® y Novalog® se formularon en soluciones de zinc reguladas con fosfato similares a aquellas empleadas por largo tiempo en las formulaciones regulares de insulina humana e insulinas animales, su ensamblaje como hexámeros de zinc insulina, distinto a las formulaciones regulares previas conocidas en la técnica, requieren enlace de fenol, meta-cresol u otros derivados específicos para estabilizar el hexámero de insulina mutante. Es conocido en la técnica que la sustitución de ProB28 mediante sustituciones de aminoácido diversas (excepto Cisteina) desestabiliza de hexámero de zinc insulina a un grado similar a AspB28 y LysB28, opcionalmente incluyendo la sustitución de Prolina en B29.

También conocidos en la técnica son los análogos de insulina de larga acción cuya absorción lenta durante 12-24 horas se propone para proporcionar control basal de las concentraciones de glucosa en la sangre. Tales análogos, ejemplificados pero no restringidos a [GlyA21, ArgB31, ArgB32]-insulina (insulina glargina o Lantus®) , puede contener sustituciones de aminoácido y/o extensiones de las cadenas A o B diseñadas para desplazar el punto isoeléctrico del análogo de insulina entre pH 7.0 y 7.4. Los análogos se formulan típicamente como una solución clara que contiene monómeros de insulina solubles, dímeros y oligómeros de más alto orden en pH < 5 bajo las cuales las condiciones de ensamblaje mediado por zinc es deteriorado por la protonación de HisB1°. La absorción prolongada se logra mediante la agregación y precipitación del análogo de insulina en el tejido subcutáneo debido a un desplazamiento en el pH a 7.4. La formulación de insulina vendida como Lantus® contiene el análogo activo [GlyA21, ArgB31, ArgB32] -insulina (glargina) hecho de 0.6 mM en una solución en pH 4 mediante la adición de alícuotas de HC1 diluido o NaOH en la presencia de componentes inactivos meta-cresol (2.7 mg/ml o 25 mM) , glicerol (17 mg/ml o 185 rtiM) , polisorbato-20 (20 yg/ml), y (30 µg de iones zinc/ml o 0.52 mM) . Una solución U-100 de Lantus® contiene 0.60 mM de [GlyA21, ArgB31, ArgB32] -insulina . Debido a que la insulina de tipo natural AsnA21 se conoce en la técnica que se somete a cambios químicos catalizados con ácido, el propósito de la sustitución de GlyA21 es evitar tal degradación química en una solución acídica.

También conocido en la técnica es otro tipo de análogo de insulina de larga acción que es ejemplificado por insulina detemir (nombre comercial Levemir®) en el cual el residuo ThrB30 se ha suprimido y una cadena de ácido graso de C14 se conecta a la cadena lateral de LysB29 (masa molecular 5912.9 Daltons) . La cadena de ácido graso incrementa la hidrofobicidad de la molécula de insulina, que está asociada con la absorción retardada del depósito subcutáneo. La cadena de ácido grado también media el análogo de insulina a la albúmina de suero y por consiguiente extiende su tiempo de vida circulante. La insulina detemir se formula como hexámeros de zinc-análogo de insulina solubles (14.2 mg/ml o 2.5 mM en unidades de monómeros de insulina, defina como una solución U-100) en una solución clara regulada en 7.4 por fosfato de sodio (0.89 mg/ml del dihidrato de disodio) en la presencia de excipientes inactivos cloruro de sodio (1.17 mg/ml), metal-cresol (2.06 mg/ml), fenol (1.80 mg/ml mM) , manitol (30 mg/ml), e iones zinc (65.4 g/ml o 1.1 mM) . La concentración de iones zinc corresponde a una relación de aproximadamente 2.6 iones zinc por hexámero. La actividad molar de la insulina detemir es reducida por aproximadamente cuatro veces con relación a la insulina humana de tipo natural. La estructura cristalina del análogo de insulina modificado con des-ThrB30/Ci4-LysB29 en la presencia de iones zinc y fenol similar pero no idéntica a aquella encontrada en su formulación representa hexámeros R6 similares a los nativos con el empacamiento del ácido graso entre los hexámeros en la red de cristal. El estado físico o estructura de insulina detemir como se forma en un depósito subcutáneo no es conocido en la técnica.

Por lo tanto, hay una necesidad por un análogo de insulina con una combinación de sustituciones que puedan combinarse para crear sitios de enlace de zinc novedosos en la superficie de y entre los hexámeros del análogo de zinc insulina y al hacerlo de esta manera proporcionar la formación de un depósito de proteína subcutánea de larga acción .

La insulina pertenece a una superfamilia de proteínas relacionadas con insulina de vertebrado, incluyendo (además de la insulina misma) los factores de crecimiento I y II relacionados con la insulina (IGF-I e IGF-II), relaxina y factores relacionados con relaxina. Estas proteínas exhiben dominios a-helicoidales homólogos y puentes de disulfuro. Los IGFs son polipéptidos de cadena individual que contienen dominios A y B, un dominio de conexión de intervención (c) y un dominio D de C-terminal; debido al procesamiento proteolitico la insulina y los factores relacionados con relaxina contienen dos cadenas (designadas A y B) . Mientras que las seis cisteinas especificas de porción y los residuos de núcleos seleccionados son ampliamente conservados por toda la superfamilia relacionada con insulina de vertebrado, otros residuos son restringidos a proteínas particulares, dando origen a especificidad funcional. La insulina y la función de IGFs como ligandos para tirosina quinasas de receptor (el receptor de insulina (IR) y el receptor de IGF clase I (IGF- 1R) ) , mientras que la relaxina y los factores relacionados enlazan a los receptores acoplados de proteina G (GPCRs) . La insulina se enlaza más fuertemente a IR, débilmente a IGF-1R, y está sin enlace detectable a GPCRs. IGF-I se enlaza más fuertemente a IGF-1R, débilmente a IR, y está sin enlace detectable a GPCRs. En enlace cruzado de la insulina a IGF-1R puede activar rutas de señalización mitogénicas, incluyendo aquellas asociadas con la proliferación de células de cáncer. La seguridad a largo plazo de la terapia de reemplazo de insulina en el tratamiento de diabetes mellitus se puede aumentar mediante el uso de análogos de insulina que contiene sustituciones de aminoácido que disminuye el grado de tal enlace cruzado. Tales sustituciones de aminoácido aumentarían la relación de afinidad del análogo de insulina para IR contra IGF-1R. Por lo tanto, hay una necesidad por una formulación de análogo de insulina de larga acción en la cual el componente activo (el análogo de insulina componente en forma monomérica) exhiba afinidad intrínseca disminuida para IGF-1R y relación incrementada de afinidad del análogo de insulina para IR contra IGF-1R, en cada caso con relación a las propiedades de insulina humana de tipo natural.

La insulina glargina se enlaza más fuertemente que la insulina humana al receptor Tipo 1 para el factor de crecimiento I similar a insulina (IGF-I). Este receptor (IGF-1R) puede mediar las rutas de señalización mitogénicas e inhibir la apoptosis. El grado de enlace de IGF-1R aumentado y la señalización se ha estimado para estar entre un factor de 1.4 y 14 dependiendo del ensayo in vitro o basado en células empleado. Tal enlace de IGF-1R aumentado y señalización está asociado con la proliferación incrementada de líneas de célula de cáncer humanas en cultivo. El estado físico o estructura molecular de [GlyA21, ArgB31, ArgB32]- insulina bajo condiciones de formulación o como se forma en el depósito subcutáneo no es conocido en la técnica.

El problema para la seguridad de los análogos de insulina que exhiben afinidad relativa o absoluta incrementada para IGF-1R primero se llevó más de diez años aproximadamente por la mitogenicidad aumentada de AspB1° -insulina en estudios de cultivo de células de lineas de célula de cáncer humanas (con relación a insulina humana) y por una incidencia incrementada de carcinomas mamarios en ratas Sprague-Dawley que son tratadas por AspB10-insulina (con relación al tratamiento con insulina humana) . La Asp310-insulina por consiguiente no se propuso como una formulación análoga de insulina clínica para el uso humano. Recientemente, los problemas de los análogos se han elevado considerando Lantus®, que también exhibe enlace cruzado aumentado a IGF-IR y mitogenicidad incrementada en el cultivo de células humanas. Un estudio de caso retrospectivo reciente de más de 120,000 pacientes europeos con diabetes mellitus que son tratados con Lantus® sugirió un incremento dependiente de la dosis en la incidencia de diversos cánceres, incluyendo cánceres del seno, próstata, colon y páncreas. El grado de riesgo de cáncer se puede incrementar no solamente por el nivel elevado de enlace cruzado a IGF-IR, sino también por la afinidad reducida de Lantus® para IR. La selectividad del enlace de receptor de la [GlyA21, ArgB31, ArgB32] -insulina (la relación de la constante de asociación de IR a la constante de asociación de IGF-IR) así es anormalmente reducida con relación a la insulina de tipo natural u otros análogos de insulina en el uso clínico actual .

La insulina humana misma puede enlazar a IGF-IR pero con una afinidad in vitro para el receptor solubilizado en detergente y purificado con lectina 333 veces menor que aquel de su enlace a IR. Los análogos de insulina de tiempo de comida tal como Humalog® y Novolog® exhiben un nivel similar de enlace cruzado a IGF-1R (el enlace cruzado de insulina lispro a IGF-1R (el componente activo de Humalog®) se ha reportado que es ligeramente incrementado) . Los estudios epidemiológicos han relevado una asociación entre la hiperinsulinemia endógena (una respuesta compensatoria a resistencia de la insulina en el síndrome metabólico y las etapas tempranas de la diabetes mellitus tipo 2) con prevalencia incrementada de cáncer, especialmente cáncer colorrectal. El tratamiento de pacientes con resistencia a insulina, con insulina humana o análogos de insulina en altas dosis también se puede asociar con un incremento de riesgo de cáncer, que puede dejar este nivel de línea de base del enlace cruzada a IGF-1R. Para tales pacientes es posible que aun la especificidad de receptor de línea de base de la insulina humana y los análogos de insulina de tiempo de comida puedan ser insuficientemente severos para asegurar la seguridad del tratamiento a largo plazo con respecto al riesgo de cáncer acumulativo. Mientras que no se desea que sea restringido por la teoría, la prudencia sugiere que la selectividad de enlace de receptor de los análogos de insulina diseñados para el tratamiento de diabetes mellitus seria igual o mayor que la selectividad de enlace de receptor de la insulina humana de tipo natural.

La regulación de las concentraciones de glucosa en la sangre por los análogos de insulina no requiere enlace a IR en el nivel preciso de la insulina humana. Una disminución en la afinidad de un análogo para IR puede ser compensada in vivo por un retardo en su evacuación de la corriente sanguínea. Tal compensación ocurre debido a que la evacuación de insulina es mediada por su enlace a IR. Los análogos de insulina con tres veces afinidad reducida para IR no obstante pueden exhibir potencias in vivo similares a aquella de la insulina humana. Las disminuciones adicionales en la afinidad se pueden compensar por un incremento en la cantidad de análogo inyectado. Ejemplos de análogos de insulina con tal afinidad disminuida son la insulina glargina (Lantus®) e insulina detemir (Levemir®) . Los cambios en la afinidad de los análogos de insulina para IR usualmente reflejan los cambios en proporciones desviadas: reducciones en la afinidad están asociadas con el acortamiento del tiempo de residencia de la hormona sobre el receptor mientras que los incrementos en la afinidad están asociadas con la prolongación del tiempo de residencia. No es conocido que en general estén las relaciones entre el tiempo de residencia y la potencia metabólica o entre el tiempo de residencia y la señalización mitogénica. El tiempo de residencia prolongado de la AspB1°-insulina sobre el complejo IR se ha propuesto que depende, por lo menos en parte, de su mitogenicidad aumentada. Mientras que no se desea que sea restringido por la teoría, la experiencia en el pasado ha enseñado que los análogos de insulina con afinidades in vitro relativas para IR entre 20% y 200% con relación a insulina humana pueden ser efectivos para el tratamiento de la diabetes mellitus en mamíferos.

Por lo tanto, hay una necesidad por análogos de insulina que exhiban duración prolongada de acción con enlace cruzado reducido a IGF-IR mientras que mantengan por lo menos una porción de la actividad biológica del análogo en el control de la concentración de glucosa en la sangre. En particular, hay una necesidad por análogos de insulina que exhiban absorción retardada desde un depósito subcutáneo pero que, una vez absorbidos en la corriente sanguínea, exhiban afinidad de IGF-IR disminuida mientras que mantenga por lo menos una porción de la actividad biológica del análogo en el control de la concentración de glucosa en la sangre. Además hay una necesidad por análogos de insulina que exhiban un incremento del punto isoeléctrico hacia la neutralidad sin incremento en la afinidad de IGF-IR mientras que mantengan por lo menos una porción de la actividad biológica del análogo en el control de la concentración de glucosa en la sangre .

Las propiedades biológicas, físicas y químicas de los análogos de insulina se pueden alterar con relación a la insulina humana debido a la presencia de sustituciones de aminoácido en la cadena A y/o cadena B o debido a posibles extensiones de la cadena A y/o cadena B para crear una molécula más grande. Los estudios de análogos de insulina han indicado que las propiedades de los análogos que contienen dos o más modificaciones no pueden ser predichas confiablemente basadas en las propiedades de un conjunto de análogos que contienen modificaciones individuales correspondientes. Debido a que una sustitución de aminoácidos o extensión de cadena en una ubicación en la molécula puede conducir a cambios transmitidos en la conformación, dinámicas, o solvatación de la proteina, los efectos de una sustitución de aminoácido en otra ubicación en la molécula pueden diferir de los efectos de la misma sustitución en la ausencia de la primera modificación. Un ejemplo de un efecto transmitido no anticipado de una modificación se proporciona por las distorsiones en la estructura de cristal de ArgA0-insulina, que se han asociado con el enlace de receptor disminuido. La extensión de N-terminal de la cadena A para incluir Argñ0 de esta manera altera los ambientes estructurales y los A , A8, y otros sitios. Las sustituciones de aminoácido o extensiones de cadena que insertan uno o más residuos básicos (Arg o Lys) en general dan por resultado un desplazamiento hacia arriba en el punto isoeléctrico hacia la neutralidad; el grado de este desplazamiento es influenciado por la estructura, solvatación y cambios conformacionales transmitidos asociados con la modificación, y asi la experiencia ha enseñado que los pls observados no son bien predichos por las propiedades de los aminoácidos aislados. Mientras que no se desea que sea restringido por la teoría, la experiencia ha enseñado que los efectos combinados de dos o más modificaciones pueden ser anticipados basados en las propiedades de los análogos que contienen modificaciones individuales. Por lo tanto es posible que combinaciones de modificaciones novedosas conjuntamente puedan tener propiedades que proporcionen ventajas únicas para el uso terapéutico de análogos de insulina en el tratamiento de la diabetes mellitus.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención pertenece a formulaciones de análogo de insulina que contienen múltiples sustituciones de Histidina que pueden combinarse para crear sitios de enlace de zinc novedosos en la superficie de y entre los hexámeros de análogo de zinc insulina y al hacerlo de esta manera permitir la formación de un depósito de proteína subcutáneo de larga acción. Más particularmente, la presente invención proporciona análogos de insulina que contiene sustituciones de Histidina emparejadas en A4 y A8 con o sin una sustitución A21 y proporciona formulaciones para su administración subcutánea para permitir la duración de acción prolongada. Sin desear condicionar la patentabilidad sobre cualquier teoría particular, las cadenas laterales en estos sitios cada una se cree que se proyectan en el solvente desde la superficie de la cadena A en su ensamblaje en un hexámero de insulina, proporcionando de esta manera parte de un sitio de enlace de ion zinc novedoso que, en combinación con la proyección de cadena lateral complementaria de los hexámeros adjuntos, permite interacciones puenteadas de ion zinc entre los hexámeros de análogo de insulina adjuntos. Como es representado en la Fig. 1E, el hexámero de insulina T3Rf3 de tipo natural comprende una hilera superior (el trímero T3; rectángulo de esquina redonda) e hilera inferior (trímero Rf3; rectángulo de esquina aguda) , cada uno de los cuales contiene iones zinc axiales (círculos grises) . La Fig. 1F proporciona una representación esquemática de apilamiento de hexámeros variantes en la red de cristal que se cree que toma lugar con las sustituciones HisA4 y HisA8 de la presente formulación. Las capas de iones zinc en puente (círculos negros) son cada una coordinadas por los residuos HisA4 y HisA8 de cada protómero de estado T (no mostrado) y la cadena lateral HisA4' de un protómero de estado Rf anterior (segmento vertical) . También sin desear condicionar la patentatilidad sobre alguna teoría particular, esta combinación de sustituciones también aumenta la selectividad de enlace de receptor de los análogos de insulina y disminuye la afinidad absoluta para IGF-IR.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona una formulación de un análogo de insulina de larga acción en aproximadamente pH 4 que forma una suspensión microcristalina cuando su pH se desplaza a aproximadamente 6-7.4. En un ejemplo particular, la formulación contiene iones zinc en una concentración relativa de por lo menos aproximadamente 4 iones zinc por 6 moléculas de análogo de insulina. La formulación por lo tanto, es capaz de la inyección subcutánea en un individuo, después de lo cual forma un depósito subcutáneo debido a la exposición al pH fisiológico. La formulación adicionalmente puede exhibir afinidad disminuida para el receptor de IGF en comparación a la insulina de tipo natural de la misma especie y mantiene por lo menos 20% de la afinidad de la insulina de tipo natural para el receptor de insulina de la misma especie.

En la estructura nativa de insulina, los residuos A1-A8 comprenden una a-hélice. Este segmento se cree que contribuye al enlace de la insulina y análogos de insulina a tanto IR como IGF-IR. Mientras que no se desea condicionar la patentabilidad sobre la teoría, se cree que las sustituciones de los residuos expuestos a solvente GluA4 y ThrA8 (no conservados en IGF-1) son bien toleradas para el enlace de análogos de insulina al IR y todavía en proximidad a la interfase de hormona-receptor. La sustitución de AsnA21 por Gly es conocido en la técnica para retardar la degradación química de análogos de insulina cuando se formulan bajo condiciones acídicas.

Por lo tanto, se desea proporcionar análogos de insulina que proporcionen depósitos de proteína subcutánea de larga acción dependiente de zinc y que retengan alta afinidad para receptor de insulina con enlace cruzado disminuido del receptor IGF Tipo I. Sin desear que sea restringida por la teoría, también es deseable proporcionar análogos de insulina en la cual las dos cargas positivas de iones zinc no axiales enlazados en un hexámero de análogo de insulina contribuyen a un desplazamiento adicional en su punto isoeléctrico dependiente del ensamblaje. También es deseable proporcionar análogos de insulina en los cuales las cadenas laterales de Histidina emparejadas en las posiciones A4 y A8 pueden contribuir a los sitios de enlace de ion zinc interfaciales novedosos entre los hexámeros de análogo de insulina en una red de cristal. Nuevamente sin desear que sea restringido por la teoría tales iones zinc interfaciales pueden retardar el desensamblaje por los contactos de orden más alto entre y a través de los hexámeros para prolongar la duración de acción de un análogo de insulina.

La -hélice A1-A8 de la insulina o de análogos de insulina contribuye a su punto isoeléctrico (pl) mediante su combinación de sitios cargados, sitios neutros, momento de dipolo a-helicoidal e interacciones electrostáticas mutuas. Mientras que nuevamente no se desea que sea restringido por la teoría, un desplazamiento hacia arriba en pl hacia pero que no excede pH 6.5 sería anticipado por la remoción de residuos acídicos (como ocurre en la sustitución de GluA4 por His) . Cambios pequeños en pl se pueden asociar con la inserción de un residuo de Histidina en la posición A4 o A8 dependiendo del pKa local de la Histidina sustituida (ordinariamente entre 6 y 7) . Mientras que nuevamente no se desea que sea restringido por la teoría, se observa un residuo acídico en la insulina humana en la posición A . La sustitución de AsnA21 por Gly, Ala u otra cadena lateral neutra no sería esperada que cause un cambio significante en pl; la sustitución por una cadena lateral básica (Arg o Lys) sería esperada que cause un desplazamiento hacia arriba adicional en pl; la sustitución por Asp (como puede ocurrir en la desamidación de la cadena lateral AsnA21 nativa en el almacenamiento en solución acídica) sería esperado que cause un desplazamiento hacia abajo con el pl. Los iones zinc no axiales enlazados a la superficie del hexámero de análogo de insulina o enlazados en los sitios interfaciales entre los hexámeros de análogo de zinc insulina también pueden contribuir a la carga total del hexámero o complejo de multi-hexámero y así afectar sus solubilidades en pH 7.4 como en un depósito subcutáneo.

Por lo tanto también es deseable proporcionar análogos de insulina que exhiban las propiedades de enlace de receptor anteriores y también exhiban un desplazamiento hacia arriba en el punto isoeléctrico hacia pero que no exceda la neutralidad tal que, en el enlace de iones zinc no clásicos en la superficie de o entre los hexámeros de análogo de insulina, los efectos combinados de las sustituciones de aminoácido y los iones zinc enlazados adicionales vuelvan al complejo insoluble en pH 7.4 como en un depósito subcutáneo.

Por lo tanto es deseable proporcionar una formulación soluble del análogo de insulina en pH acidico como una solución clara que proporcione facilidad de manejo, ajuste preciso de la dosis para la inyección subcutánea mediante jeringa, y suministro dosificado preciso mediante una pluma de inyección. También es deseable proporcionar un método de cristalización como una base para una suspensión microcristalina del análogo de insulina en pH neutro, que pueda conferir vida en anaquel adicionada y estabilidad al producto a temperatura ambiente después de la utilización inicial.

En general, un método para tratar a un paciente comprende administrar una cantidad fisiológicamente efectiva de un análogo de insulina o una sal fisiológicamente aceptable del mismo al paciente, donde el análogo o una sal fisiológicamente aceptable del mismo contiene una secuencia de cadena A de insulina modificada en las posiciones A4 y A8 por un par de sustituciones de Histidina con modificación adicional posible en A21. En un ejemplo, la cadena lateral A21 es el residuo Asn nativo. En otro ejemplo, la cadena lateral A21 es Gly. En otro ejemplo, la sustitución A21 puede ser Ala, Thr, o Ser.

Un análogo de insulina puede ser un análogo de cualquier insulina o análogo de insulina de vertebrado que contiene una cadena B modificada conocida en la técnica que confiere absorción alterada después de la inyección subcutánea. En un ejemplo, el análogo de insulina es un análogo de insulina de mamífero tal como análogo de insulina de humano, murino, roedor, bovino, equino o canino. En otros ejemplos, el análogo de insulina es un análogo de insulina de oveja, ballena, rata, elefante, conejillo de indias o chinchilla .

Los análogos de insulina específicos incluyen aquellos que contienen una secuencia de cadena A como es proporcionada por cualquiera de SEQ. ID. NOS. 4-6 o 14 con una secuencia de cadena B de cualquiera de SEQ. ID. NOS. 7- 12. Un ácido nucleico puede codificar un polipéptido que tiene una de estas secuencias. Tal ácido nucleico puede ser parte de un vector de expresión, que se puede utilizar para transformar una célula hospedera.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS DIVERSAS VISTAS DE LOS DIBUJOS La Fig. 1A es una representación esquemática de la secuencia de proinsulina humana que incluye las cadenas A y B y la región de conexión mostrada con sitios de segmentación dibásicos flanqueantes (circuios en negro) y C-péptido (circuios en blanco) .

La FIG. IB proporciona un modelo estructural de proinsulina, que consiste de una porción similar a insulina y el péptido de conexión desordenado (linea de guiones) .

La FIG. 1C proporciona una representación de una ruta propuesta de la fibrilación de insulina por la vía del desplegamiento parcial del monómero. El estado nativo es protegido por el autoensamblaje clásico (izquierdo lejano) . El desensamblaje conduce al equilibrio entre los monómeros nativos y parcialmente plegados (triángulo en blanco y trapezoide, respectivamente) . Este plegamiento parcial puede desplegarse completamente como un evento fuera de ruta (circulo en blanco) o agregado para formar un núcleo en ruta a un protofilamento (derecho lejano) .

La FIG. ID es una representación esquemática de la secuencia de insulina humana que indica la posición del residuo A8 en la cadena A y los sitios de sustitución en la cadena B conocidos en la técnica para conferir absorción rápida después de la inyección subcutánea.

La FIG. 1E es una representación esquemática de un hexámero de insulina T3Rf3 de tipo natural que comprende una hilera superior (el trímero T3; rectángulo de esquina redonda) e hilera inferior (trímero Rf3; rectángulo de esquina aguda) , cada uno de los cuales contiene iones zinc axiales (círculos en gris) .

La FIG. 1F es una representación esquemática del apilamiento de hexámeros variantes en una red de cristal en la cual las capas de tres iones de zinc en puente (círculos en negro) son cada uno coordinados por los residuos HisA4 y HisA8 de cada promotor de estado T (rectángulo de esquina redonda) y la cadena lateral HisA4' (segmento vertical) de un promotor de estado Rf (rectángulo de esquina aguda) .

La FIG. 2a proporciona la secuencia de insulina de tipo natural y los sitios de modificación en (panel superior) insulina glargina (Lantus, Sanofi-Aventis ) y (panel inferior) el análogo presente. Las secuencias de cadena A y B de tipo natural se muestran en negro y en gris; los puentes de disulfuro (A6-A11, A7-B7, y A20-B19) son indicados por líneas negras. La insulina glargina contiene una extensión de dos residuos de la cadena B (ArgB31 y ArgB32) y la sustitución AsnA21?Gly (rojo en el panel superior) . Las proteasas subcutáneas endógenas pueden remover lentamente uno o ambos residuos Arg de la cadena B extendida de la insulina glargina, en parte para aliviar su mitogenicidad aumentada. El análogo presente contiene sustituciones emparejadas (i, i+4) GluA4?His y ThrA8?His (en el panel inferior). La insulina detemir de análogo de larga acción (Levemir, Novo-Nordisk) funciona mediante la unión de un elemento de enlace de albúmina (no mostrado) .

La FIG. 2b proporciona un modelo de cinta del monómero de insulina que representa la porción del sitio de enlace de ion zinc putativo formado por HisA4 y HisA8 en la superficie externa de la a-hélice A1-A8. Las cintas de cadena A y B se muestran en negro y en gris, respectivamente.

La FIG. 2c representa la estructura del hexámero de insulina T3Rf3 de tipo natural. Los dos iones zinc axiales dentro del hexámero están alineados en el centro, coordinados por las cadenas laterales HisB1° relacionadas con el dimero (gris claro) . Las cadenas A se muestran en negro, y las cadenas B en gris (a-hélice B1-B8 especifica de Rf) . La estructura de tipo natural se obtuvo del Banco de Datos de Proteina (entrada 1TRZ) .

La FIG. 2d representa la estructura del hexámero de insulina [HisA4, HisA8] T3Rf3 variante. Los dos iones zinc axiales dentro del hexámero están alineados en el centro, coordinados por las cadenas laterales HisB1° relacionadas con el trímero (gris claro) . El hexámero variante contiene tres iones zinc no clásicos en la superficie del trímero T3 (esferas periféricas) . Mostrado en gris están las cadenas laterales de His 4, HisA8, y el tercer Hisft4' del hexámero adjunto. En cada caso las cadenas A se muestran en negro, y las cadenas B en gris (a-hélice B1-B8 especifica de Rf) .

La FIG. 2e ilustra el mapa de densidad electrónica 2F0-FC (estéreo pares contorneados en 1 s) que muestran el sitio de enlace de ion zinc novedoso formados por HisA4 y HisA8 en el promotor de estado T. La coordinación tetrahédrica distorsionada se completa por el residuo A ' , perteneciente a un promotor de estado Rf en el hexámero adjunto.

La FIG 3A representa el empacamiento de hexámero-hexámero de tipo natural. (Izquierda) En cada hexámero el trímero superior tiene la conformación T3, y el trímero inferior Rf3. Los iones zinc axiales (esferas más grandes) y moléculas de agua interfaciales (esferas más pequeñas) cerca de los residuos A4 y A8 son mostrados. Las cadenas A se muestran en gris, y las cadenas B en negro. Los protómeros T y R difieren en la estructura secundaria de B1-B9, extendida (T) o helicoidal (R) ; los residuos Bl y B2 son desordenados en el estado Rf "desgastado" {Derecha) Expansión de la región en cuadro a la izquierda. La esfera más grande hacia el fondo es el ion zinc axial del trímero T3 en el hexámero del fondo. Las flechas indican los residuos de estado Rf GluA4 en el trímero R£3 superior.

La FIG. 3B representa el empacamiento de hexámero-hexámero mediado por zinc de [HisA4, HisA8] -insulina : el trímero superior tiene la conformación T3, y el trímero inferior Rf3. Los iones zinc axiales y A4-A8-A4' de los iones zinc coordinados son mostrados. Las cadenas A se muestran en gris, y las cadenas B en negro. (Derecho) Expansión de la región encuadrada. Tres iones zinc novedosos se observan en la interfase de hexámero-hexámero. Las flechas indican la cadena lateral de estado Rf de HisA4' (desde el trímero del fondo del hexámero superior) , que completa los sitios de enlace de zinc interfaciales.

La FIG. 3C proporciona modelos CP que muestran las caras T y Rf del hexámero de [HisA4, HisA8] -insulina (izquierda y derecha) . La vista mostrada es girada por 90° con relación al panel Fig. 3b. Los tres iones zinc no clásicos se muestran enlazados a las cadenas laterales de His 4 y HisA8. Las cruces blancas indican la posición de los iones cloruro; el esquema es de otra manera como en la Fig. 3B.

La FIG. 3D proporciona un estéreo par que muestra el ion zinc no clásico (esfera gris oscura grande) , ion cloruro (esfera gris claro sobrepuesta) y tres moléculas de agua enlazadas (esferas más pequeñas) en relación a HisA4' en el promotor Rf y HisA4-HisA8 en el promotor T. Las moléculas de agua enlazadas participan en una red de enlace de hidrógeno dentro de Rf que involucra el carboxilato de cadena lateral de GluB4' , para-OH de TyrB26' , y oxígeno de carbonilo de ProB28' (marcado) .

La FIG. 3E representa los resultados de los ensayos de desplazamiento competitivos que sondean el enlace de alta afinidad de insulina o análogo de insulina a IR (tres curvas a la izquierda; lineas sólidas) y el enlace cruzado de baja afinidad a IGF-1R (tres curvas a la derecha; lineas de puntos) . En cada grupo se muestran los resultados para la insulina tipo natural (x) , insulina glargina (¦) , y HisA<1, HisA8-insulina (T) . La selectividad de enlace de receptor aumentada de la HisM, HisA8-insulina resulta del desplazamiento hacia la izquierda de su titulación de enlace de IR y desplazamiento hacia la derecha de su titulación de enlace de IGF-1R. Se proporcionan las afinidades relativas y constantes de disociación en las Tablas 2 y 3. Los ensayos se realizaron en la ausencia de iones zinc.

La FIG. 3F proporciona los resultados de los ensayos in vivo. Ratas macho diabéticas inducidas por esteptozotocina se inyectaron subcutáneamente con ya sea con insulina de tipo natural (x) , insulina glargina (¦) , HisA4, HisA8-insulina (T) , o control de solución reguladora (diluyente de Lilly; ·) . Las dosis en el tiempo 0 fueron 3.44 nmoles de insulina de tipo natural (20 mg en volumen de inyección de 100 µ?) , 12 nmoles de insulina glargina (correspondiente a 2.0 ü de Lantus®) , 13.7 nmoles de [HisA4, HisA8] -insulina, y 100 µ? de solución reguladora sin proteina (diluyente Lilly) . La concentración de glucosa en la sangre se midió desde la punta de la cola en tiempos indicados. Cada análogo se probó en 5 ratas (media ± SEM) ; el experimento se repitió 2 veces con resultados similares. Las ratas se alimentaron 6-8 h después de las inyecciones.

La FIG. 4 proporciona una gráfica que muestra los niveles de glucosa en la sangre (en mg/dL) a través del tiempo en ratas macho diabéticas inducidas con esteptozotocina después de la inyección con el diluyente de insulina como un control (circuios) , insulina glargina (Lantus®, cuadros), lispro insulina (Humalog®, "X") o el análogo de insulina que contiene sustituciones His en las posiciones A4 y A8 y las sustituciones lispro de Humalog (A4A8-lispro+Zn, triángulos invertidos) , como se proporcionan de otra manera en lo anterior con respecto a la Fig. 3f.

La FIG. 5 es una representación esquemática del uso de las sustituciones de Histidina para permitir las asociaciones mediadas por zinc de las proteínas para crear depósitos de proteína de larga acción en cuestión.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige hacia el uso novedoso de iones zinc interfaciales no axiales entre hexámeros de insulina para prolongar la duración de acción de una formulación de análogo de insulina. La presente invención proporciona un sistema nuevo para crear un depósito subcutáneo prolongado. Este hace uso de iones zinc no axiales novedosos para enlazar en la superficie de y entre los hexámeros de análogo de insulina y para prolongar el tiempo que toma para los depósitos de estos análogos liberar el análogo de insulina monomérico a la corriente sanguínea. La invención también proporciona la disminución concomitante en el enlace absoluto y relativo de los análogos de insulina al receptor IGF Tipo 1. Esta combinación de propiedades aumentará la eficacia y seguridad del tratamiento de la diabetes, particularmente con respecto al riesgo de cáncer. Con ese fin, la presente invención proporciona análogos de insulina que contiene sustituciones de aminoácido de Histidina emparejadas en las posiciones A4 y A8 junto con formulaciones que contienen zinc, ya sea como una solución clara en pH 4 o como una suspensión microcristalina alrededor del pH neutro. Las sustituciones A4-A8 emparejadas se pueden combinar por una sustitución en la posición A21, tal como Gly, Ala, Ser, o Thr.

Los análogos de insulina de la presente invención también pueden contener otras modificaciones. Como se utiliza en esta especificación y en las reivindicaciones, varias sustituciones en los análogos de insulina se pueden observar mediante la convención que indica que el aminoácido es sustituido, seguido por la posición del aminoácido, opcionalmente en superíndice. La posición del aminoácido en cuestión incluye la cadena A o B de insulina donde se ubica la sustitución. Por ejemplo, un análogo de insulina de la presente invención también puede contener una sustitución de ácido Aspártico (Asp o D) o Lisina (Lys o K) para Prolina (Pro o P) en el aminoácido 28 de la cadena B (B28) , o una sustitución de Pro para Lys en el aminoácido 29 de la cadena B (B29) o una combinación de los mismos. Estas sustituciones también se pueden denotar como AspB28, LysB28, y ProB29, respectivamente. De manera similar, una insulina de la presente invención puede contener una adición de Arginina (Arg o R) , Histidina (His o H) , o Lisina (Lys o ) en el aminoácido AO de la cadena A (es decir, N-terminal a Gly l) . Estas adiciones se pueden denotar ArgA0, HisA0, o LysA0, respectivamente. Además, las presentes sustituciones se pueden combinar con la introducción de la sustitución PheB1?His. A menos que se mencione de otra manera o sea obvio del contexto, los aminoácidos anotados en la presente deben ser considerados que son L-aminoácidos .

Como se utiliza en la presente, una "hebra de metal" o "cremallera de metal" es un sitio de enlace de metal formado cuando dos o más cadenas laterales de aminoácido de dos o más moléculas o complejos moleculares se asocian con el metal en cuestión. Por ejemplo, una cadena lateral de una primera molécula puede combinarse con dos cadenas laterales de una segunda molécula para crear un sitio de enlace de zinc. Es bien conocido en la técnica que los trímeros de insulina así son "acoplados con zinc" conjuntamente por un ion zinc axial. Sin embargo, no se ha conocido previamente que los sitios de enlace de zinc podrían ser introducidos para causar que los hexárneros de ciertos análogos de insulina formen hebras de zinc entre los hexárneros.

La invención proporciona análogos de insulina que forman complejos de hexámero de insulina "acoplados con zinc" novedosos y exhiben afinidad reducida para IGF-1R mientras que retienen por lo menos una porción de su afinidad para IR y por consiguiente la actividad biológica. La invención también proporciona formulaciones de estos análogos con concentraciones relativamente altas de zinc, que forman complejos de hexámero "acoplados con zinc" y, en concentraciones aún más altas de zinc, cristales similares a Lente de estos complejos de hexámero. En algunas modalidades, los análogos de insulina contienen por lo menos 4, por lo menos 5, por lo menos 6, por lo menos 7, o por lo menos 8 iones zinc por hexámero del análogo de insulina.

Un método para tratar a un paciente comprende administrar un análogo de insulina al paciente. En un ejemplo, el análogo de insulina es un análogo de insulina que contiene modificaciones en la cadena A que causan concomitantemente un desplazamiento hacia arriba en el punto isoeléctrico (pl) hacia la neutralidad, permite el ensamblaje de hexárneros de insulina acoplados con zinc. En otro ejemplo, las modificaciones también reducen la afinidad del monómero libre de zinc para IGF-1R. En otro ejemplo, el análogo de insulina también contiene una sustitución en la posición A21 que protege al análogo de insulina de la degradación química cuando se formula bajo condiciones acídicas. El análogo de insulina se administra mediante inyección subcutánea utilizando una jeringa, una pluma dosificada u otro dispositivo adecuado.

También se contempla que sería posible aplicar la introducción de sustituciones de Histidina emparejadas en las posiciones A4 y A8 a análogos formulados con una concentración suficiente de iones zinc en pH acídico que volvería a los análogos insolubles en pH 7.4 por dos mecanismos concurrentes: un desplazamiento hacia el punto isoeléctrico más alto (aproximadamente 6.5-6.6) debido principalmente a la remoción de la carga negativa de GluA4 y un desplazamiento adicional del punto isoeléctrico neto del hexámero de zinc insulina debido al enlace de los iones zinc no axiales además de los iones zinc axiales clásicos. Las mismas sustituciones en A4 y A8 introducidas para los propósitos de disminuir la solubilidad del análogo de insulina en el depósito subcutáneo también reducirá un posible riesgo de cáncer propuesto que está asociado con el enlace cruzado de insulina y análogos de insulina al receptor IGF Tipo 1.

Además se contempla que sería posible aplicar la introducción de sustituciones combinadas en las posiciones A4 y A8, con o sin sustituciones en A21, en otras clases de formulaciones de análogos de insulina (tal como pero no restringido a regular, NPH, semi-lente y lente, incluyendo mezclas de tales tipos) para uno o más de los propósitos de disminuir el enlace cruzado de tales análogos al receptor IGF Tipo 1. Por el propósito de una formulación soluble regular en pH 7.4 las sustituciones de Histidina emparejadas deben ser combinadas con sustituciones en otra parte en las cadenas A o B que remueven uno o más cargas positivas o adicionan una o más cargas positivas, para de esta manera disminuir el pl lo suficiente para permitir la solubilidad similar a aquella de la insulina humana en pH 7.4 en la presencia de excipientes conocidos en la técnica, incluyendo pero no limitados a cloruro de zinc, fenol, meta-cresol, glicerol, solución reguladora de fosfato de sodio y agua para inyección. Ejemplos de sustituciones que disminuirían el pl cuando se combinan con las sustituciones de histidina emparejadas en A4 y A8 incluyen, pero no están limitadas a, GluA1\ AspA21, GluA21, AspB9, GluB9, AspB1°, GluB1°, AlaB22, Ser822, AspB2a, AspB28-ProB29, AspB28-AlaB29, AlaB29, y ProB29; o combinaciones de los mismos.

Se ha descubierto que la sustitución de Histidina emparejada en las posiciones A4 y A8 pueden reducir el enlace cruzado por un análogo de insulina al receptor de IGF Tipo I y efectuar un desplazamiento hacia arriba en el Pl hacia la neutralidad mientras que mantiene la afinidad nativa para el receptor de insulina.

También se ha descubierto que la [HisA4, HisA8]-insulina es altamente soluble cuando se hizo libre de zinc en pH 7.4 pero la adición de 4-6 iones zinc por 6 moléculas de análogo de insulina da por resultado la precipitación de un complejo de zinc-proteina . Este complejo es insoluble o escasamente soluble en pH 7.0-8.4, pero es soluble en aproximadamente pH . Mientras que no se desea que sea restringido por la teoría, es probable que esta insolubilidad dependiente del pH es debido a la precipitación isoeléctrica in vitro de un complejo de zinc proteína que contiene iones zinc enlazados tanto axiales como no axiales.

También se ha descubierto que la [HisA4, HisA8] -insulina, cuando se formula en una solución no regulada en pH 4.0 y que contiene una relación molar de 5.2 iones zinc por 6 moléculas de análogo de insulina y después de la inyección subcutánea en una rata Lewis macho hecha diabética por estreptozotocina, dirigirá el control prolongado de las concentraciones de glucosa en la sangre a una duración y grado similar a la acción farmacológica de Lantus®. Mientras que no se desea que sea restringido por la teoría, es probable que esta acción prolongada es debido a la precipitación isoeléctrica subcutánea de un complejo de zinc proteína que contiene iones zinc enlazados tanto axiales como no axiales.

También se ha descubierto que los cristales de [HisA4, HisA8 ] -insulina fácilmente pueden ser hechos crecer como hexámeros de análogo de insulina zinc que contienen dos iones zinc axiales por hexámero y tres iones zinc no axiales, enlazados entre hexámeros sucesivos en la red de cristal R3. Los iones zinc interfaciales últimos exhiben coordinación tetrahédrica por HisA4 y HisA3 en un hexámero, HisA4' en el hexámero adjunto, y un ion cloruro enlazado. Los tres iones zinc y cloruro enlazados adicionan cambios formales de +6 y -3 al hexámero, respectivamente, con el cambio formal neto de +3. Esos cambios adicionales extienden el cambio formal de +6 logrado por la sustitución de GluA4 por His. Mientras que no se desea que sea restringido por la teoría, es probable que la presencia de tres iones zinc no axiales por hexámero conduce a la insolubilidad dependiente del pH anterior y la precipitación isoeléctrica subcutánea presupuesta de un complejo de zinc proteína.

En general, un análogo de insulina de vertebrado o una sal fisiológicamente aceptable del mismo, comprende un análogo de insulina que contiene una cadena A de insulina y una cadena B de insulina. Un análogo de insulina de la presente invención también puede contener otras modificaciones, tales como sustituciones de extensiones de aminoácido básicas de la cadena B en los residuos Bl y/o B31.

En un ejemplo, el análogo de insulina de vertebrado es un análogo de insulina de mamífero, tal como un análogo de insulina de humano, porcino, bovino, felino, canino o equino. Un análogo de insulina de la presente invención también puede contener otras modificaciones, tal como una atadura entre el C-terminal de la cadena B y el N-terminal de la cadena A como es descrito más completamente en la solicitud de patente norteamericana copendiente No. 12/419,169, la descripción de la cual es incorporada por referencia en la presente.

Una composición farmacéutica puede comprender tales análogos de insulina y para lograr la duración de acción prolonga debe incluir iones zinc u otros iones de metal divalentes capaces de dirigir el ensamblaje de la proteína y el acoplamiento interfacial de los hexámeros. Los iones zinc pueden ser incluidos en tal composición a un nivel de una relación molar de entre 4.0 y 7.0, o entre 5.0 y 6.0 por hexámero del análogo de insulina. Los iones zinc se pueden incluir en una relación molar más alta así como el orden para crear complejos de hexámero con absorción aún más lenta; en tales relaciones molares más altas los iones zinc ocuparían los sitios de enlace de zinc débiles además de los sitios de enlace acoplados de zinc relacionados con [HisA4, HisA8] interfacial. En tal formulación, la concentración del análogo de insulina típicamente estaría entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 3 mM.

Los excipientes pueden incluir glicerol, Glicina, otras soluciones reguladoras y sales, y conservadores antimicrobianos tales como fenol y meta-cresol ; estos últimos conservadores se conocen que aumentan la estabilidad del hexámero de insulina. Tal composición farmacéutica se puede utilizar para tratar un paciente que tiene diabetes mellitus u otra condición médica al mezclar una cantidad fisiológicamente efectiva de la composición al paciente.

Un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que codifica un análogo de insulina que contiene una secuencia que codifica una cadena A con una combinación de sustituciones de Histidina A4 y A8, con o sin una sustitución adicional en A21. La secuencia particular puede depender de la utilización de codón preferida de una especie en la cual será introducida la secuencia de ácido nucleico. El ácido nucleico también codificar otras modificaciones de la insulina de tipo natural. La secuencia de ácido nucleico puede codificar una secuencia de cadena A o B modificada que contiene una sustitución no relacionada o extensión en otra parte del polipéptido o análogos de proinsulina modificados. El ácido nucleico también puede ser una porción de un vector de expresión, y ese vector puede ser insertado en una célula hospedera tal como una célula hospedera procariótica similar a una linea de célula de E. coli, o una linea de células eucarióticas tal como la cepa o linea de células de S. cereviciae o Pischia pastoris .

Además se contempla que las sustituciones no relacionadas o extensiones de cadena pueden ser combinadas con los análogos de la presente invención para modificar su punto isoeléctrico, ya sea adicionalmente hacia arriba como por sustituciones en la posición B13 o extensiones de cadena por Arg o Lys en las posiciones AO, A22, BO, o B31; o hacia abajo como por las sustituciones que insertan una carga negativa o remueven una carga positiva. Por ejemplo, las sustituciones podrían ser combinadas con AlaB31-HisB32-HisB33-ArgB34, HisB31-HisB32 , HisB31-HisB32-ArgB33, o AlaB31-HisB32-HisB33. En estos últimos casos, el enlace de zinc de intrahexámero adicional complementa el enlace dé zinc interhexámero de la presente invención para elevar la relación de zinc a hexámero y además estabilizar los complejos de hexámero.

Las sustituciones de la presente invención también pueden ser combinadas con modificaciones de cadena B que aumentar el enlace cruzado de IGF-1R para mitigar esta propiedad desfavorable; ejemplos incluyen la extensión de la cadena B por uno o dos residuos básicos (tales como Arg831, LysB31, ArgB31-ArgB32, ArgB31-LysB32, LysB31-ArgB32, y LysB31-LysB32) o la sustitución de HisB1° por Asp o Glu. Se proporciona un ejemplo por (pero no restringido a) insulina glargina (Lantus®) , que se formula en pH 4 pero que se somete a la agregación en un depósito subcutáneo en pH fisiológico.

Además se contempla que las sustituciones de Histidina emparejadas de la presente invención también se pueden utilizar en combinación con cualquiera de los cambios presentes en los análogos de insulina existentes o insulinas modificadas, o con varias formulaciones farmacéuticas, tal como insulina regular, insulina NPH, insulina lente o insulina ultralente. Los análogos de insulina de la presente invención también pueden contener sustituciones presente en análogos de insulina humana que, mientras que no se utilizan clínicamente, todavía son útiles experimentalmente, tal como DKP-insulina, que contiene las sustituciones AspB1°, LysB28 y Pro o la sustitución Asp . La presente invención, sin embargo, no se limita a la insulina humana y sus análogos. También se contempla que estas sustituciones también se pueden hacer en insulinas animales tales como insulinas porcinas, bovinas, equinas y caninas, a manera de ejemplo no limitantes. Además, en vista de la similitud entre las insulinas humanas y animales, y el uso en el pasado de insulinas animales en pacientes diabéticos humanos, también se contempla que otras modificaciones menores en la secuencia de insulina se pueden introducir, especialmente aquellas sustituciones consideradas sustituciones "conservativas". Por ejemplo, las sustituciones adicionales de aminoácidos se pueden hacer dentro de los grupos de aminoácidos con cadenas laterales similares, sin apartarse de la presente invención. Estos incluyen los animoácidos hidrofóbicos neutros: Alanina (Ala o A) , Valina (Val o V) , Leucina (Leu o L) , Isoleucina (lie o I), Prolina (Pro o P) , Triptofano (Trp o W) , Fenilalanina (Phe o F) y Metionina (Met o M) . Del mismo modo, los aminoácidos polares neutros se pueden sustituir uno por el otro dentro de su grupo de Glicina (Gly o G) , Serina (Ser o S), Treonina (Thr o T) , Tirosina (Tyr o Y), Cisteina (Cys o C) , Glutamina (Glu o Q) , y Asparagina (Asn o N) . Los aminoácidos básicos se consideran que incluyen Lisina (Lys o K) , Arginina (Arg o R) e Histidina (His o H) . Los aminoácidos acídicos son ácido Aspártico (Asp o D) y ácido Glutámico (Glu o E) .

La secuencia de aminoácidos de la proinsulina humana se proporciona, para propósitos comparativos, como SEQ. ID. NO. 1. La secuencia de aminoácidos de la cadena A de la insulina humana se proporciona como SEQ. ID. NO. 2. La secuencia de aminoácidos de la cadena B de la insulina humana se proporciona, para propósitos comparativos, como SEQ. ID. NO. 3.

SEQ. ID. NO. 1 (proinsulina) Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser^Ile- Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn SEQ. ID. NO. 2 (cadena A) Gly-ne-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn SEQ. ID. NO. 3 (cadena B) Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr Se contempla que los análogos de insulina de la presente invención tienen afinidades para el receptor de insulina similares a aquellas de la insulina natural pero exhiben afinidad disminuida para el receptor IGF Tipo 1. La actividad de insulina o análogo de insulina se puede determinar por el ensayo de enlace de receptor como es descrito en más detalle enseguida en la presente. La actividad relativa se puede definir en términos de las constantes de disociación de hormona-receptor (Ka) , como es obtenido mediante el ajuste de curva de ensayos de desplazamiento competitivos, o en términos de valores de ED50, la concentración de insulina o análogo de insulina no marcada requerida para desplazar 50 por ciento de insulina humana marcada específicamente enlazada tal como una insulina humana radioactivamente marcada (tal como insulina marcada con 125I) o análogo de insulina de alta afinidad radioactivamente marcada. Alternativamente, la actividad se puede expresar simplemente como un porcentaje de insulina normal. La afinidad para el receptor de factor de crecimiento similar a insulina también se puede tener con el desplazamiento del IGF-1R que es medido. En particular, es deseable para un análogo de insulina tener una actividad que sea de 20-200 por ciento de la insulina, tal como 25, 50, 110, 120, 130, 140, 150, o 200 por ciento de insulina normal o más, mientras que tenga una afinidad para IGF-1R que sea menor o igual a 50 por ciento de la insulina normal, tal como 10, 20, 30 o 50 por ciento de la insulina normal o menos. Un análogo de insulina también puede ser útil en el tratamiento de la diabetes aún si la actividad de enlace de receptor in vitro es tan baja como 20% debido a la evacuación maleta.

Síntesis de Análogos de Insulina. La combinación de cadenas se efectuó mediante la interacción del derivado S-sulfonado de la cadena A (41 mg) y el análogo de cadena B (21 mg) en solución reguladora de Glicina 0.1 M (pH 10.6, 10 mi) en la presencia de ditiotreitol (7 mg) . La cromatografía CM- 52 de cada mezcla de combinación permitió el aislamiento parcial de la forma de clorhidrato de la proteína contaminada por la cadena B libre. La purificación final se realizó mediante el HPLC de fase inversa. La masa molecular predicha de [HisA4, HisA8] -insulina se verificó mediante la espectrometría de masas MALDI . El rendimiento final (6.1 mg) fue similar a aquellos obtenidos en la síntesis de control de la insulina de tipo natural. El rendimiento correspondiente de [HisA\ HisA8] -DKP-insulina fue 8.8 mg.

Electroforesis de Enfocamiento Isoeléctrico . Los valores de pl de la insulina y análogos de insulina en sus estados nativos se midieron mediante electroforesis de gel IEF utilizando geles IEF de pH 3-10 pre-vaciados (125 x 125 mm, 300 ym, SERVALYT® Precotes® de SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg; obtenido de Crescent Chemical Co. Hauppauge, NY) . El Precotes® se ajustó en un aparato IEF horizontal, Multiphor II (Pharmacia Biotech) de acuerdo con el protocol del fabricante. La unidad se pre-enfrió a 4°C utilizando un baño de agua circulante (Brinkman) , antes de la colocación del gel IEF PRECOTE sobre el lecho de electroforesis recubierto con aceite mineral claro para el intercambio de calor eficiente. Los geles se conectaron a los electrodos utilizando mechas de papel de filtro humectadas con Fluido Ánodo en pH 3 y el Fluido de Cátodo pH 10 (ambos de SERVA) en los dos extremos del gel. Antes de cargar las muestras, el gel se pre-enfocó en un ajuste de voltaje inicial de 200 voltios y un ajuste final de 500 voltios durante 30 min utilizando suministro de energía de alto voltaje (LKB modelo 2197). Después de cargar las muestras y los estándares IEF (5-10 µ?,, en una concentración de proteína de carga de 5-10 yg) , el enfocamiento isoeléctrico se realizó en 500 - 2000 voltios durante 2 hrs o hasta que se alcanzó el voltaje final de 2000 voltios, después de lo cual el enfocamiento se continuó durante 15 min adicionales. Después del IEF, el gel se fijó con 200 mi de ácido tricloroacético al 20% durante 20 min, se enjuagó durante 1 min con 200 mi de agua desionizada y se manchó con la solución Serva Violet 17 y se desmanchó con ácido fosfórico al 86% de acuerdo con los protocolos del manual SERVA. Las proteínas estándares IEF (de SERVA) utilizadas son como sigue, con sus pl's respectivos en paréntesis: citocromo C de corazón de cabello (10.7), ribonucleasa A de páncreas bovino (9.5), Lectina de lens culinaris (8.3, 8.0, 7.8), Mioglobina de músculo de caballo (7.4, 6.9), anhidrasa Carbónica de eritrocitos bovinos (6.0), ß-lactoglobina de leche bovina (5.3, 5.2), inhibidor de tripsina de soja (4.5), glucosa oxidasa de Aspergillus niger (4.2), amiloglucosidasa de Aspergillus niger (3.5). Los pl's de las muestras de proteína se determinaron mediante la comparación a una gráfica de regresión lineal de distancia de migración contra el gradiente de pH de los estándares IEF.

Plásmidos de Expresión de .Receptor. Para la expresión del IR e IGF-1R, etiquetado con epítope, el vector de expresión mamífero pcDNA3.lZeo+ se obtuvo de InVitrogen y se modificó por la etiquetación por epítope C-terminal al subclonar un cásete de oligonucleótido en la estructura que codifica repeticiones triples en la estructura del epítope FLAG M2 (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) entre los sitios de restricción BamHI y Xbal. Los cDNAs respectivos que codifican IGF-1R y la isoforma B de IR fueron como es descrito previamente (Whittaker, J. y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA Vol 84, pp. 5237-5241 (1987)). Ellos se modificaron para las subclonaciones de vector de expresión modificado mediante la introducción de un sitio BamHI que codifica un enlazador de Gly-Ser C-terminal en la estructura \en sus extremos 3' justo antes del codón de detención mediante la mutagénesis dirigida al sitio.

Expresión de los cDNAs de Receptor. El DNA para la transfección se preparó como es descrito previamente. Los cDNAs de receptor se expresaron transientemente en células rápidas PEAK utilizando polietilenimina . Las células se recolectaron tres días de posttransfección cuando fue máxima la expresión de receptor. La lisis se realizó en una solución reguladora que consiste de NaCl 0.15 M y Tris-Cl 0.1 M (pH 8.0), que contiene Tritón X-100 al 1% (v/v) y un cóctel de inhibidores de proteasa (Roche) . Los lisados se almacenaron a -80°C hasta que se requirieron para el ensayo.

Ensayos de Enlace de Receptor. Los ensayos de enlace de IGF-1R e IR-B respectivos se realizaron mediante una modificación del ensayo de captura de anticuerpo de placa de microtitulo que Whittaker y colaboradores han descrito previamente. Las placas de tira de microtitulo (Nunc Maxisorb) se incubaron durante la noche a 4°C con IgG anti-FLAG (100 µ?/cavidad de una solución de 40 µ?/ml en solución salina regulada de fosfato) . El lavado y el bloqueo se realizaron como es descrito previamente. Los Usados de detergente de 293 células PEA transientemente transfectadas con cDNAs que codifican IR-B o IGF-IR de longitud completa con etiquetas FLAG C-terminales se purificaron parcialmente mediante la cromatografía de aglutinina de germen de trigo (WGA) para agotar a los lisados de los precursores de receptor. Los materiales eluidos de germen de trigo luego se incubaron en placas recubiertas de anticuerpo durante 1 hora a temperatura ambiente para inmovilizar los receptores. Después del lavado extensivo para remover la proteínas no enlazadas, los ensayos de enlace competitivos con el trazador de insulina marcado (125I- [TyrA14] -insulina) o el trazador de IGF-I marcado (125I-Tyr31-IGF-I) y los análogos de insulina no marcados se llevaron a cabo como es descrito. Todos los análogos de insulina se analizaron con ya sea insulina o receptor de IGF-I como ligandos de control en el mismo conjunto de ensayos. Los datos de enlace de los ensayos de competición homólogos se analizaron mediante el análisis de regresión no lineal utilizando un modelo secuencial de 2 sitios para obtener constantes de disociación para la insulina e IGF-I. Los datos de enlace para los experimentos de competición heterólogos se analizaron por el método de ang; este método utiliza una expresión matemática exacta para describir el enlace competitivo de dos diferentes ligandos a un receptor.

Los estudios de enlace representativos de análogos de insulina conocidos en la técnica se resumen en la Tabla 1. Debido a que la afinidad de insulina para IR (isoforma B) es similar a la afinidad de IGF-I para IGF-IR (en cada caso con Kd aproximadamente 0.04 nM) , la relación de afinidad de por ciento respectiva para IR e IGF-IR (columnas 2 y 3) , como se dan en la columna 4, proporciona un estimado de la especificidad absoluta del análogo de insulina. La normalización con relación a la especificidad de la insulina humana (hilera 1) proporciona un estimado de la especificidad relativa. La especificidad relativa mayor que 1 (menor que 1) indicaron severidad aumentada (disminuida) del enlace de receptor. En este ensayo AspB10-insulina exhibe afinidad incrementada para IGF-IR, debido a que la afinidad para IR es más notablemente incrementada, la especificidad relativa es mayor que 1. La insulina glargina (Lantus®) , que contiene la sustitución de AsnA21?Gly y la extensión de dos residuos de la cadena B (ArgB31 y ArgB32) , exhibe afinidad absoluta incrementada para IGF-IR, afinidad absoluta disminuida para IR, y severidad relativa disminuida del enlace de receptor. Los análogos de insulina de la presente invención exhiben la propiedad opuesta: afinidad absoluta disminuida para IGF-IR y severidad relativa incrementada del enlace de receptor.

Tabla 1 Propiedades de Enlace de Receptor de los Análogos de Insulina de Control3 aErrores derivados de los errores estándares de la media. bLa afinidad relativa de la insulina de tipo natural para IR (columna 2) se define en 100 por ciento; la afinidad relativa de IGF-I para IGF-1R (columna 3) también se define como 100 por ciento. Las constantes de disociación absolutas respectivas son similares.

Los análogos de cadena A de insulina que contienen combinaciones novedosas de sustituciones de aminoácido de la cadena A se hicieron mediante la síntesis química total de la cadena A variante. Las cadenas B de tipo natural se obtuvieron de formulaciones comerciales de insulina humana mediante la sulfitolisis oxidante; la cadena B de DKP se preparó del mismo modo mediante la síntesis química total.

Los análogos de insulina fueron en cada caso obtenidos por la combinación de cadena de insulina seguida por la purificación cromatográfica . En cada caso la masa molecular predicha se verificó mediante la espectrometría de masas.

Se sintetizaron análogos de insulina que contienen las sustituciones de Histidina emparejadas en las posiciones A4 y A8, con o sin sustitución de AsnA21 por Gly, que se muestran generalmente como SEQ. ID. NO. 4, en el contexto de una cadena B humana de tipo natural (SEQ. ID. NO. 3) . La comparación de las propiedades de estos análogos con la insulina humana indica los efectos generales dé las sustituciones Al, A8 para reducir la afinidad de los análogos para IGF-1R e incrementar la relación de afinidad para IR contra IGF-1R (Tabla 2).

SEQ. ID. NO. 4 (sustituciones de Histidina emparejadas en A4 y A8) Gly-Ile-Val-His-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln- Leu-Glu-Asn-Tvr-Cvs-Xaa Xaa= Asn, Gly, Ala, Ser, Thr Tabla 2 Propiedades de Enlace de Receptor de Análogos de Insulina3 IR-B IGF-1R d (nM) SEM Kd (nM) SEM insulina 0.060 0.009 12.2 1.8 Lantus 0.110 0.016 3.1 0.44 [HisA'A8] -HI 0.045 0.007 71.2 14.7 [HisA4,A8_ 0.091 0.012 133.3 33 GlyA21]-HI aIR-B designa la isoforma B del receptor de insulina humana; IGF-1R designa el receptor IGF Tipo 1 humano; SEM, error estándar de la media.

Los análogos de insulina que tienen las secuencias de polipéptido de cadena A de SEQ. ID. NOS. 5 o 6 y 20-21 se prepararon del mismo modo ya sea con la cadena B de insulina de tipo natural (SEQ. ID. NO. 3) o un análogo de insulina tal como insulina glargina. Un desplazamiento hacia arriba en los puntos isoeléctricos a un valor de 6.6 en la ausencia de iones zinc (desde un valor de linea de base de 5.6 encontrado para la insulina humana sin zinc) se verificó mediante la electroforesis de gel de enfocamiento eléctrico. Con este fin, los estudios emplearon geles IEF de pH 3-10 pre-vaciados (125 x 125 mm, 300 pm, SERVALYT® Precotes® de SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg; obtenido de Crescent Chemical Co . Hauppauge, NY) . El Precotes® se ajustó en un aparato IEF horizontal, Multiphor II (Pharmacia Biotech) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La unidad se pre- enfrió a 4°C utilizando un baño de agua circulante (Brinkman) , antes de colocar el gen IEF PRECOTE sobre el lecho de electroforesis recubierto con aceite mineral ligero para el intercambio de calor eficiente. Los geles se conectaron a electrodos utilizando mechas de papel filtro humectadas con Fluido de Ánodo pH 3 y Fluido de Cátodo pH 10 (ambos de SERVA) en los dos extremos del gel. Antes de la carga de las muestras, el gel se pre-enfocó en un ajuste de voltaje inicial de 200 voltios y un ajuste final de 500 voltios durante 30 min utilizando un suministro de energía de alto voltaje (LKB modelo 2197). Después de la carga de las muestras y los estándares IEF (5-10 yL, en una concentración de proteína de carga de 5-10 g) , el enfocamiento isoeléctrico se realizó en 500 - 2000 voltios durante 2 hrs o hasta que el voltaje final de 2000 voltios se alcanzó, después de lo cual se continuó el enfocamiento durante 15 min adicionales. Después del IEF, el gel se fijó con 200 mi de ácido tricloroacético al 20% durante 20 min, se enjuagó durante 1 min con 200 mi de agua desionizada y se manchó con solución Serva Violet 17 y se desmanchó con ácido fosfórico al 86% de acuerdo con los protocolos del manual SERVA. Las proteínas estándares IEF (de SERVA) utilizadas son como sigue, con sus pl's respectivos entre paréntesis: citocromo C de corazón de caballo (10.7), ribonucleasa A de páncreas bovino (9.5), Lectina de lens culinaris (8.3, 8.0, 7.8), ioglobina de músculo de caballo (7.4, 6.9), anhidrasa Carbónica de eritrocitos bovinos (6.0), ß-lactoglobina de leche bovina (5.3, 5.2), inhibidor de tripsina de soja (4.5), glucosa oxidasa de Aspergillus niger (4.2), amiloglucosidasa de Aspergillus niger (3.5). Los pl's de insulina humana o los análogos de insulina de la presente invención se determinaron mediante la comparación con la gráfica de regresión lineal a distancia de migración contra el gradiente de pH de los estándares para IEF.

SEQ. ID. NO. 5 (sustituciones HisA4, HisA8) Gly-ne-Val-His-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn SEQ. ID. NO. 6 (sustituciones HisA\ HisA8, GlyA21) Gly-Ile-Val-His-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Gly SEQ. ID. NO. 7 (cadena B de HisB1) His-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr Ensayos de Enlace de Receptor - La actividad relativa se define como la relación de constantes de disociación que pertenecen al complejo de receptor de hormona de tipo natural y variante. Los datos se corrigieron para el enlace no especifico (cantidad de radioactividad que permanece en la membrana asociada a la presencia de insulina humana 1 µ ) . En todos los ensayos, el porcentaje de trazador enlazado en la ausencia de ligando de competición fue menor que 15% para evitar los artificios de agotamiento de ligando. Las afinidades relativas de los análogos de insulina para el o los receptores de insulina aislada (isoforma B) se realizaron utilizando una técnica de captura de anticuerpo de placa de microtitulo como es conocido en la técnica. Las placas de tira de microtitulo (Nunc Maxisorb) se incubaron durante la noche a 4°C con AU5 de IgG (100 pL/cavidad de 40 mg/ml en solución salina regulada de fosfato) . Los datos de enlace se analizaron para un modelo secuencial de dos sitios. Un ensayo de anticuerpo de placa de microtitulo correspondiente utilizando el receptor Tipo I IGF se empleó para estimar el enlace cruzado a este receptor homólogo.

Ensayo de Roedor - Ratas Lewis macho (masa corporal medio ~300 g) se volvieron diabéticas mediante estreptozotocina . Los efectos de los análogos de insulina sobre la concentración de glucosa en la sangre después de la inyección subcutánea se estimaron utilizando un glucómetro clínico (Hypoguard Advance Micro-Draw meter) en relación a la insulina de tipo natural o solución reguladora sola (16 mg de glicerina, 1.6 mg meta-cresol, 0.65 mg de fenol, y 3.8 mg de fosfato de sodio (pH 7.4); diluyente Lilly). La insulina de tipo natural y la [HisM, HisA8] -insulina se hicieron libres de zinc en la solución reguladora anterior. La [HisM, His 8]- insulina y la insulina glargina también se disolvieron en HC diluido (pH 4) que contiene una relación 5.2:1 de ZnCl2: monómero de insulina, meta-cresol 25 mM, y glicerol 185 m . Las ratas se inyectaron subcutáneamente en el tiempo t = 0 con 3.44 nmoles de insulina o análogos de insulina (~12-13.7 nmoles) en 100 µ? de solución reguladora por rata (para la insulina de tipo natural esto corresponde a 2 IU/kg de peso corporal). Para las formulaciones libres de zinc neutro, la sangre se obtuvo de la punta engrapada de la cola en el tiempo 0 y cada 10 min hasta 90 min. Para las formulaciones de zinc acidicas, la sangre se obtuvo en los tiempos 0, 1, 2, 4, 6, 10.8, y 24 h.

La estructura de cristal de [HisM, HisA8] -insulina se determinó como es descrito enseguida para contar y visualizar el número de iones zinc por hexámero y para probar si las sustituciones de Histidina emparejada en las posiciones A4 y A8 dirigirían el enlace de los iones zinc interfaciales entre los hexámeros en la red de cristal. Los cristales se hicieron crecer en la presencia de iones zinc y fenol para producir hexámeros T3Rf3. La estructura se obtuvo mediante reemplazo molecular en una resolución de 1.9 Á (Tabla 3) . El modo del análogo del ensamblaje de hexámero (Fig. 2d) es idéntico a aquel de la insulina de tipo natural (Fig. 2c) . Las conformaciones respectivas de los protómeros T y Rf son esencialmente idénticas a aquellas de la insulina de tipo natural. No ocurren perturbaciones transmitidas en las superficies de enlace de receptor propuestas.

Los hexámeros de tipo natural y variantes cada uno contiene dos iones Zn axiales, uno por trímero T3 y Rf3 (esferas centrales sobrepuestas en las Figs. 2c, 2d) . La coordinación en cada sitio es mediada por las cadenas laterales de HisB1° relacionadas con el trímero con geometría tetrahédrica distorsionada (gris claro en el centro de los hexámeros en la Fig. 2c, d) . En el trímero Rf3 el cuarto ligando es un ion cloruro mientras que el trímero T3 este sitio (más expuesto que en el trímero Rf3) exhibe ocupación parcial por ya sea unión cloruro o molécula de agua enlazada. Estas características son consistentes con las estructuras de tipo natural. También se observan los cristales de tipo natural cultivados bajo condiciones similares, el trímero Rf3 contiene tres moléculas de fenol enlazadas (no mostrada) . Las sustituciones A4 y A8 de esta manera no bloquean la transición TR, un modelo clásico para la reorganización de insulina en el enlace de receptor.

El hexámero T3Rf3 variante contiene tres iones Zn relacionados con el trímero adicionales en las superficies de estado T (esferas magenta en las Figs. 2b y 2d) . Estos iones Zn novedosos están coordinados en parte por HisA4 y HisA8 en un sitio interfacial. La densidad electrónica representativa en el sito de enlace de Zn periférico define un sitio tetrahédrico distorsionado (Fig. 2e) . La coordinación se completa por un ion cloruro y una cadena lateral de HisA4 "acoplada" que pertenece al promotor Rf en un hexámero adjunto (A4 ' marcado en la Fig. 2e< y las flechas cafés en la Fig. 3b) . Las vistas de las caras T y Rf opuestas de hexámeros adjuntos se muestran en la Figura 3c (90° rotados de la orientación mostrada en la Fig. 3b) . El enlace del ion cloruro también es estabilizado por una red de tres moléculas de agua enlazadas al protómero Rf (esferas más pequeñas en estereopares en la Fig. 3d) ; HisA8 en Rf es desplazado del sitio de enlace de zinc. Los iones Zn no clásicos de esta manera puentean los trímeros T3 y Rf 3 de hexámeros adyacentes en la red (esferas más grandes, Figs. 3b y 3d) , en parte desplazando las moléculas de agua ordinariamente enlazadas en la interfase de tipo natural (esferas más pequeñas en la Fig. 3a) . Las distancias de enlace de N-Zn2+ y los ángulos son similares a aquellos de los sitios de enlace de ion de metal axial. Las conformaciones de cadena lateral de HisA4 y HisA8 difieren entre los protómeros T y Rf.

Estudios de enlace de hormona a IR e IGF-1R se llevaron a cabo para estimar las afinidades relativas y la selectividad de enlace de receptor (Fig. 3e y Tabla 2) . Los ligandos se caracterizaron como monómeros libres de zinc. Con relación al enlace de la insulina humana a IR e IGF-IR (líneas sólidas y de guiones con cruces que marcan puntos de datos en la Fig. 3e, respectivamente), la insulina glargina (líneas sólidas y de puntos con cuadros que marcan los puntos de datos) exhiben una afinidad reducida de 2 veces para IR y afinidad aumentada de 3 veces para IGF-IR. En contraste [HisA4, HisA8] -insulina exhibe afinidad similar a la native (línea sólida, triángulos invertidos en la Fig. 3e) para IR pero afinidad reducida 6 veces para IGF-IR (línea de puntos con triángulos invertidos, desplazada a la derecha) . Así, mientras que la selectividad de enlace de receptor de la insulina glargina es deteriorada por aproximadamente 6 veces, aquella de la [HisA4, HisA8] -insulina es aumentada por 7.5 (±2.5) veces. Esto representa una mejora de por lo menos 30 veces con relación a la insulina glargina.

La potencia y duración de acción de la [HisA4, HisA8] -insulina se probaron en ratas diabéticas inducidas por estreptozotocina en relación a la insulina glargina (Fig. 3f ) . El control glucémico mediante los análogos de insulina de larga acción en roedores (5-10 h) es menos prolongado que en humanos (18-24 h) , presumiblemente debido al tamaño más pequeño del depósito subcutáneo [HisA4, HisA8] -insulina e insulina glargina se disolvieron (similar a Lantus®) en HC1 diluidos (pH 4.0) con una relación molar de Zn2+: insulina de 5.2:1. El curso de tiempo y el grado de control glucémico fueron similares a la inyección de los dos análogos (líneas de puntos y de puntos/guiones en la Fig. 3f ) . Un control de rápida acción se proporcionó por la insulina humana libre de zinc en el diluyente de Lilly (línea que termina en aproximadamente 3 horas en la Fig. 3f ) . Debido a que las ratas comen solamente en la noche, los efectos de las inyecciones de insulina en el día fueron influenciadas por el ayuno diurno; se proporcionaron controles mediante la inyección del diluyente solo (linea de guiones en la Fig. 3f ) . También se llevaron a cabo estudios de control de la [HisA4, HisA8] -insulina en el diluyente de Lilly neutro libre de zinc; su curso de tiempo fue similar a aquel del control de insulina de tipo natural (no mostrado) . La glargina libre de zinc no se probó en pH neutro debido a su escasa solubilidad.

Cristalografía de Rayos X - Cristales se cultivaron mediante la difusión de vapor colgante en la presencia de una relación 1:1.7 de Zn2+ al monómero de proteina y una relación 3.5:1 de fenol al monómero de proteina en solución reguladora Tris-HCl. Las gotas consistieron de 1 µ? de solución de proteina (8 mg/ml en HCl 0.02 M) mezclada con 1 µ? de solución de depósito (Tris-HCl 0.38 M, citrato de sodio 0.1 M, acetona al 9%, fenol 4.83 mM, y acetato de zinc 0.8 mM en pH 8.4). Cada gota se suspendió sobre 1 mi de solución de depósito. Los cristales se obtuvieron a temperatura ambiente después de dos semanas. Los datos se recolectaron de los cristales individuales montados en una estructura de rayón y se congelaron instantáneamente a 100° K. Las reflexiones de 32.05-1.90 Á se midieron con un sistema detector CCD en la radiación sincrotrónica en Berkeley National Laboratory. Los datos se procesaron con el programa DTREK. El cristal pertenece al grupo espacial R3 con parámetros de celda unitaria: a=b=78.09 Á, c=36.40 Á, a=ß=90°, ?=120°. La estructura se determinó mediante el reemplazo molecular utilizado en CNS. Por consiguiente, se obtuvo un modelo utilizando el dimero TR nativo (Banco de Datos de Proteina (PDB) identificador IRWE después de la remoción de todas las moléculas de agua, iones zinc y cloruro. Una investigación de función de traducción se realizó utilizando las coordenadas de la mejor solución para la función de rotación después del análisis de datos entre las resoluciones 15.0 y 4.0 Á. El refinamiento de cuerpo rígido utilizando CNS, empleando factores de temperatura anisotrópicos totales y la corrección de solvente en volumen, produjo valores de 0.325 y 0.344 para R y Riibre/ respectivamente, para datos de resolución entre 19.2 y 3.0 Á. Entre los ciclos de refinamiento, los mapas 2Fo~Fc y Fo~Fc se calcularon utilizando los datos a la resolución de 3.0 Á; los iones zinc y cloruro y moléculas de fenol se construyeron en la estructura utilizando el programa O (Jones y colaboradores, Acta Crystallogr. A., Vol. 4, pp. 110-119 (1991)). Las moléculas de agua se calcularon y se verificaron utilizando el programa DDQ (Focco Van Akker y Wim Hoi, Acta Cryst. 1999, D55, 206-218) . La geometría se monitoreó continuamente con PROCHECK (Laskowski y colaboradores, J. Appl. Crystallogr., Vol. 26, pp. 283-291 (1993)); los iones zinc y moléculas de agua se acumularon en el mapa de diferencia conforme procedió el refinamiento. El cálculo de mapas de omisión (especialmente en los primeros ocho residuos del N-terminal de la cadena B de cada monómero) y además el refinamiento se llevaron a cabo utilizando CNS, con la dinámica de ángulo de torsión de probabilidad máxima de implemento y el refinamiento de gradiente de conjugado.

Tabla 3 Recolección de datos de rayos X y estadísticas de refinamiento [His , His ,flAS8]- -insulina Recolección de Datos Grupo espacial R3 Dimensiones de la cé a, b, c (Á) 78.09, 78.09, 36.40 , ß, ? (°) 90.00, 90.00, 120.00 Resolución (Á) 32.05 - 1.90 sym O ¾ierge 0.057 (0.422)* I / s? 14.1 (3.0)* Completación (%) 99.5 (100.0)* Redundancia 5.49 (5.43)* Refinamiento Resolución (Á) 32.05-1.90 No. de reflexiones 6475/955 ^trabajo / -Rlibre 0.199/0.257 No. de átomos Proteína 818 Ligando/ion 6 Agua Factores B Proteína Ligando/ion Agua Desviaciones de R.m.s Longitudes de Enlace Ángulos de Enlace (°) * Cubierta de más alta resolución La solubilidad dependiente del pH de los análogos de insulina se evaluó mediante una modificación del método de DiMarchi y colaboradores (Kohn, W. D., Micanovic, R. , Myers, S. L., Vick, A. . , Kahl, S. D., Zhang, L., Strifler, B. A., Li, S. , Shang, J., Beals, J. M., Mayer, J. P., y DiMarchi, R. D. Peptides 28, 935-48 (2007)). En breve, la insulin humana de tipo natural, la insulina glargina o la [HisA4, HisA8]-insulina se hicieron 0.60 mM en una solución no regulada que contiene HC1 diluido en pH 4.0; la composición de la solución, similar a aquella empleada en la formulación farmacéutica Lantus (Sanofi-Aventis) , contuvo 0.52 mM de ZnCl2, 20 mg/ml de una solución de glicerol an 85% vol/vol a una concentración final de 185 mM) , y 2.7 mg/ml de metácresol (25 mM) como conservador antimicrobiano. Cada una de las tres proteínas exhibe una solubilidad en esta solución de pH 4.0 que excede 0.60 mM. Una serie de alícuotas idénticas (10 mi) se removió y se diluyó 50 veces en soluciones reguladoras en varios valores de pH (en el intervalo de 5.0-9.0) a un volumen final de 500 mi; los valores de pH respectivos luego se reajustaron para ser 5.0, 6.0, 7.4, 8.0, 8.5, y 9.0. El diluyente fue compuesto de Tris-HCl 10 mM y NaCL 140 mM con valores de pH ajustados por HC1 diluido o NaOH. Las múltiples muestras luego se mezclaron 20 veces mediante inversión y se centrifugaron durante 5 min a 14,000 rpm en una microcentrifuga . 200 µ? del sobrenadante luego se removieron por duplicado de cada tubo y se inyectaron en un HPLC de fase inversa analítica (columna C4; 25 cm x 0.46 era) con un gradiente de elución de acetonitrilo que contiene ácido trifluoroacético al 0.1%. En cada caso se observe un solo pico de elución, y su área se cuantificó mediante la integración utilizando el software vendor (Waters, Inc.). Los valores de insulina de tipo natural en pH 7.4-9.0 proporcionaron un control para las pérdidas de solubilidad; el por ciento de recuperaciones estuvieron típicamente en el intervalo de 85-90%. La solubilidad de la insulina glargina en pH 7. se encontró que está entre 1 y 2 µ? de acuerdo con los resultados de DiMarchi y colaboradores. Esta solubilidad limitada fue similar en relaciones molares de zinc a análogo de 5.2:6 (es decir, 5.2 iones zinc por hexámero) y 2.2:6 (2.2 iones zin por hexámero) , consistente con una función axial de ion zinc en el hexámero de glargina. La solución de la [HisM, HisA8] -insulina en pH 7.4 también se encontró que es 1-2 µ? en una relación molar de 5.2 iones zinc por hexámero.

La formulación de la presente invención proporciona un análogo de insulina de intermedia acción que también contiene el Lys y Pro de lispro insulina (Humalog®) que se formula fácilmente como una solución clara en pH 4 con iones zinc y fenol. Los estudios de enlace representativos de un análogo de insulina que contiene el lispro y las sustituciones de Histidina en las posiciones A4 y A8 (HisA4, A8 KP-ins) y la insulina humana de tipo natural (HI) se proporciona en la Tabla 4 en relación a la Isoforma A del Receptor de Insulina Humana (HIRA) , Isoforma B de Receptor de Insulina Humana (HIRA) y el Receptor de Factor de Crecimiento similar a Insulina (IGF-1R) . Como se observa en la Tabla 4, HisA4, A8 KP-ins tiene una afinidad similar para HIRA y HIRB como HI, pero una afinidad grandemente reducida (mayor que 4 veces reducida) para IGF-1R en comparación a HI.

Tabla 4 HIRA HIRB IGF-1R Ka (nM) SEM K„ (nM) SEM (nM) SEM HisA4, 0.16 0.003 0.033 0.005 65.3 12.3 A8 KP- ins HI 0.023 0.004 0.062 0.009 13.2 2.0 La Fig. 4 proporciona un curso de tiempo de los niveles de glucosa en la sangre de ratas macho diabéticas bajo las condiciones como son mencionadas con la Fig 3f. La [His 4, HisA8]-KP insulina, lispro insulina e insulina glargina se disolvieron (similar a Lantus®) en HC1 diluido (pH 4.0) con una relación molar de Zn2+: insulina 5.2:1. El curso de tiempo de control glucémico para [HisA4, HisA8]-KP insulina fue más corto que para la insulina glargina (Lantus®) , pero más largo que para la lispro insulina (Humalog®) , indicando que esta formulación proporciona una formulación de análogo de insulina de intermedia acción. Además, los cristales de HisA4, A8 KP-ins también se han obtenido bajo condiciones similares como aquellas proporcionadas en lo anterior. Mientras que no se desea que sea limitado por la teoría, se cree que los efectos desestabilizantes del hexámero de las sustituciones lispro difieren de, y son por lo menos parcialmente desviadas por, los efectos estabilizantes del complejo de hexámero de las sustituciones [HisA4, HisA8] , dando por resultado un análogo de intermedia acción.

También se contempla que los análogos de [HisA4, HisA8] insulina también pueden contener otras sustituciones, tal como Asp , para obtener otras formulaciones de análogo de insulina de intermedia acción. Además se contempla que la incorporación de las cadenas laterales de aminoácido de coordinación de zinc emparejadas, tales como las cadenas laterales de Histidina, sobre la superficie de una estructura de proteína, se pueden utilizar en otras proteínas (FIG. 5) para estabilizar estructuras de más alto orden, tales como hexámeros de proteína, como en la insulina. Más particularmente, los inventores contemplan que las cadenas laterales de las sustituciones de Histidina emparejadas en las proteínas que contienen alfa-hélice pueden coordinarse con cadenas laterales complementarias en otros polímeros para crear complejos multi-poliméricos . Ejemplos de proteínas que contienen alfa-hélice de utilidad terapéutica son la eritropoyetina y las hormonas de crecimiento mamíferas.

Basado en la descripción anterior, ahora debe ser evidente que los análogos de insulina que contienen una combinación de sustituciones de cadena A como es proporcionado en la presente, proporcionarán duración de larga acción de la acción de insulina cuando se formulan en la presencia de iones zinc y concomitantemente exhibirán afinidad absoluta y relativa disminuida para el receptor IGF Tipo I mientras que retiene por lo menos 20% de la afinidad de la insulina humana para el receptor de insulina.

SECUENCIAS SEQ. ID. NO. 1 (proinsulinaa) Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu- Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn SEQ. ID. NO. 2 (cadena A) Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn SEQ. ID. NO. 3 (cadena B) Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr SEQ. ID. NO. 4 (sustituciones de Histidina emparejadas en A4 y A8) Gly-Ile-Val-His-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa Xaa= Asn, Gly, Ala, Ser, Thr SEQ. ID. NO. 5 (sustituciones HisA\ HisA8) Gly-Ile-Val-His-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn SEQ. ID. NO. 6 (sustituciones HisA4, HisR8, GlyA21) Gly-Ile-Val-His-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Gly SEQ. ID. NO. 7 (cadena B HisB1) His-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr SEQ. ID. NO. 8 (lispro - cadena B) Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr SEQ. ID. NO. 9 (aspart - cadena B) Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Lys-Thr SEQ. ID. NO. 10 (AspBlO - cadena B) Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-Asp-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr SEQ. ID. NO. 11 (secuencia de la cadena B de DKP) Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-Asp-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr SEQ. ID. NO. 12 (cadena B de Glargina) Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg SEQ. ID. NO 13 (cadena A de Glargina) Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Gly SEQ. ID. NO. 14 (sustitución ArgA0, HisA4, HisA8, GlyA21) Arg-Gly-Ile-Val-His-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Gly

Claims (30)

REIVINDICACIONES

1. Un método para tratar a un paciente, el método caracterizado porque comprende administrar una formulación farmacéutica que contiene una cantidad fisiológicamente efectiva de un análogo de insulina o una sal fisiológicamente aceptable del mismo al paciente, en donde el análogo de insulina o una sal fisiológicamente aceptable del mismo contiene una secuencia de cadena A de insulina que contiene sustituciones de Histidina emparejadas en A4 y A8, y opcionalmente una sustitución en A21 seleccionada del grupo que consiste de Glicina, Alanina, Serina y Treonina, y que contiene adicionalmente iones zinc en una concentración relativa de por lo menos aproximadamente 4 iones zinc por 6 moléculas de análogo de insulina.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el análogo de insulina o una sal fisiológicamente aceptable del mismo es una suspensión de insulina microcristalina en pH 6.5-7.5.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el análogo de insulina o una sal fisiológicamente aceptable del mismo se formula como una solución no regulada clara en pH 3.5-5 que contiene iones zinc en una concentración relativa de 4-6 iones zinc por 6 moléculas de análogo de insulina, un conservador seleccionado de fenol y meta-cresol, y un excipiente.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el análogo de insulina o una sal fisiológicamente aceptable del mismo se formula como una suspensión de insulina microcristalina modificada para incluir 4-6 iones zinc por 6 moléculas de análogo de insulina .

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque el análogo de insulina o una sal fisiológicamente aceptable del mismo se modifica en la posición A21 mediante la sustitución con Glicina .

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque el análogo de insulina o una sal fisiológicamente aceptable del mismo se modifica en la posición A21 mediante la sustitución con Alanina, Serina o Treonina.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el análogo de insulina o una sal fisiológicamente aceptable del mismo también se modifica mediante la extensión de la cadena B para incluir uno o dos residuos básicos C-terminales .

8. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el análogo de insulina o una sal fisiológicamente aceptable del mismo también se modifica mediante la extensión de la cadena B para incluir por lo menos un residuo básico N-terminal.

9. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el análogo de insulina o una sal fisiológicamente aceptable del mismo también se modifica mediante la extensión de la cadena A para incluir por lo menos un residuo básico N-terminal.

10. Un ácido nucleico, caracterizado porque codifica un polipéptido de cadena A de insulina, en donde el polipéptido de cadena A comprende la SEQ. ID. NO. 4.

11. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 10.

12. Una célula hospedera, caracterizada porque se transforma con el vector de expresión de la reivindicación 10.

13. Una formulación farmacéutica, caracterizada porque comprende un análogo de insulina o una sal fisiológicamente aceptable del mismo, en donde el análogo de insulina o una sal fisiológicamente aceptable del mismo contiene una secuencia de cadena A de insulina que contiene sustituciones de Histidina emparejadas en A4 y A8, y opcionalmente una sustitución en A21 seleccionada del grupo que consiste de Glicina, Alanina, Serina y Treonina, en una solución reguladora farmacéuticamente aceptable que contiene por lo menos aproximadamente 4 iones zinc por 6 moléculas de análogo de insulina, en donde la formulación forma un depósito subcutáneo dependiente de zinc de larga acción.

14. La formulación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el análogo de insulina o una sal fisiológicamente aceptable del mismo se formula como una suspensión de insulina microcristalina en pH 6.5-7.5.

15. La formulación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque se formula como una solución no regulada clara en pH 3.5-5, y además comprende un conservador seleccionado de fenol y meta-cresol y un excipiente.

16. La formulación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el análogo de insulina o una sal fisiológicamente aceptable del mismo se formula como una suspensión de insulina microcristalina modificada para incluir 4-6 iones zinc por 6 moléculas de análogo de insulina.

1 . La formulación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el análogo de insulina o una sal fisiológicamente aceptable del mismo también se modifica en la posición A21 mediante la sustitución con Gly.

18. La formulación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el análogo de insulina o una sal fisiológicamente aceptable del mismo también se modifica en la posición A21 mediante la sustitución con Gly.

19. " La formulación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque el análogo de insulina o una sal fisiológicamente aceptable del mismo también se modifica en la posición A21 mediante la sustitución con Gly.

20. La formulación farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14, 15 o 16, caracterizada porque el análogo de insulina o una sal fisiológicamente aceptable del mismo también se modifica en la posición A21 mediante la sustitución con Ala, Ser o Thr.

21. La formulación farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13, 17 o 20, caracterizada porque el análogo de insulina o una sal fisiológicamente aceptable del mismo también se modifica mediante la extensión de la cadena B para incluir uno o dos residuos básicos C-terminales .

22. La formulación farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13, 17 o 20, caracterizada porque el análogo de insulina o una sal fisiológicamente aceptable del mismo también se modifica mediante la extensión de la cadena B para incluir uno o dos residuos básicos N-terminales.

23. La formulación farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13, 17 o 20, caracterizada porque el análogo de insulina o una sal fisiológicamente aceptable del mismo también se modifica mediante la extensión de la cadena A para incluir uno o dos residuos básicos N-terminales .

24. Una formulación cristalina de un análogo de insulina, caracterizada porque el análogo de insulina contiene una secuencia de cadena A de insulina que contiene sustituciones de Histidina emparejadas en A4 y A8, y opcionalmente una sustitución en A21, en una solución reguladora farmacéuticamente aceptable que contiene por lo menos aproximadamente 4 iones zinc por 6 moléculas análogas de insulina, en donde la formulación forma un depósito subcutáneo dependiente de zinc de larga acción, en donde el análogo de insulina forma una suspensión cristalina en aproximadamente pH 6-7.4.

25. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el análogo de insulina forma un depósito subcutáneo dependiente de zinc de larga acción en la inyección subcutánea.

26. Una formulación farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13, 17 o 20, caracterizada porque la formulación forma un depósito subcutáneo dependiente de zinc de larga acción en la inyección subcutánea .

27. La formulación farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13, 17 o 20, caracterizada porque el análogo de insulina o una sal fisiológicamente aceptable del mismo, en una formulación libre de zinc, exhibe afinidad disminuida para el receptor de Factor de Crecimiento similar a Insulina tipo I en comparación a la insulina de tipo natural de la misma especie y por lo menos 20% de afinidad de la insulina de tipo natural para el receptor de insulina de la misma especie.

28. Una formulación farmacéutica, caracterizada porque comprende un análogo de insulina o una sal fisiológicamente aceptable del mismo, en donde el análogo de insulina o una sal fisiológicamente aceptable del mismo contiene una secuencia de cadena A de insulina que contiene sustituciones de Histidina emparejadas en A4 y A8 , una sustitución de Lisina o Ácido Aspártico en B28, opcionalmente una sustitución de Prolina en B29, y opcionalmente una sustitución en A21 seleccionada del grupo que consiste de Glicina, Alanina, Serina y Treonina, en una solución reguladora farmacéuticamente aceptable que contiene por lo menos aproximadamente 4 iones zinc por 6 moléculas de análogo de insulina, en donde la formulación forma un depósito subcutáneo dependiente de zinc de intermedia acción.

29. Una formulación farmacéutica, caracterizada porque comprende un análogo de insulina o una sal fisiológicamente aceptable del mismo, donde el análogo de insulina o una sal fisiológicamente aceptable del mismo contiene la secuencia de cadena A de insulina que contiene sustituciones de Histidina emparejadas en A4 y A8, una sustitución de aminoácido diferente de cisteina, glicina o ácido aspártico en B28, opcionalmente una sustitución de Prolina en B29, y opcionalmente una sustitución en A21 seleccionada del grupo que consiste de Glicina, Alanina, Serina y Treonina, en una solución reguladora farmacéuticamente aceptable que contiene por lo menos aproximadamente 4 iones zinc por 6 moléculas de análogo de insulina, en donde la formulación forma un depósito subcutáneo dependiente de zinc de intermedia acción.

30. Una formulación farmacéutica, caracterizada porque comprende dos o más análogos de insulina o sales fisiológicamente aceptables de los mismos, en donde por lo menos un análogo de insulina o una sal fisiológicamente aceptable del mismo contiene una secuencia de cadena A de insulina que contiene sustituciones de Histidina emparejadas en A4 y A8, en una solución reguladora farmacéuticamente aceptable que contiene por lo menos aproximadamente 4 iones zinc por 6 moléculas de análogo de insulina, en donde la formulación proporciona un depósito subcutáneo dependiente de zinc mezclado en larga, intermedia y/o corta acción.