CN113166223A - 位点2单链胰岛素类似物 - Google Patents

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Abstract

单链胰岛素类似物可包含通过连接多肽(或C‑结构域)序列连接至胰岛素A‑链多肽序列的胰岛素B‑链多肽序列。所述连接多肽序列可以是Glu‑Xaa‑Gly‑Pro‑Arg‑Arg，其中Xaa是Glu或Ala。所述胰岛素类似物可另外包含在对应于人胰岛素的A8的位置处的Glu或His取代和/或在对应于人胰岛素的A14的位置处的Glu取代。在一些实施方案中，所述胰岛素类似物可另外包含在对应于野生型胰岛素的B28和B29的位置处的Pro或Glu。另外的取代可包含在对应于野生型胰岛素的A13的位置处的Phe或Trp和/或在对应于野生型胰岛素的A17的位置处的Gln、Arg、Phe或Glu。在一些实施方案中，在对应于野生型胰岛素的B16的位置处可存在Glu取代。在其它实施方案中，在对应于野生型胰岛素的A10和/或B4的位置处可存在Cys取代。此外或可选择地，所述类似物可包含在对应于野生型胰岛素的B22的位置处的His或Ala取代和/或所述连接多肽序列可以是Glu‑Glu‑Gly‑Pro‑Ala‑His。治疗患有糖尿病的患者的方法包括借助于静脉内、腹膜内或皮下注射，给患者施用生理学有效量的胰岛素类似物或其生理学可接受的盐。

Description

位点2单链胰岛素类似物
关于联邦资助研究或开发的声明
本发明在由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的资助号DK040949和DK074176下由政府支持进行。美国政府在本发明中拥有一定权利。
发明背景
本发明涉及多肽激素类似物，其显示出增强的药学特性，例如改变的药代动力学和药效学特性，即相对于相应的野生型人激素的可溶制剂，赋予缩短的作用持续时间。更特别地，本发明涉及显示这样的特性的单链胰岛素类似物。甚至更特别地，本发明涉及含有下述的胰岛素类似物：任选与(ii)一个或多个B链取代结合的(i)在其“位点2受体结合表面”中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个B链取代是本领域已知加速胰岛素类似物从皮下储库吸收到血流内的。本发明的胰岛素类似物含有在A和B链之间的连接结构域(C结构域)(并且因此描述为单链类似物)，并且可以任选含有在A或B链中的其他位点处的标准或非标准氨基酸取代。
本发明依据的基本想法是通过在激素的位点2受体结合表面中同时掺入取代，来增强速效类似物的安全和功效。这种取代组合赋予“快开/快关”药代动力学特性，其在作为糖尿病治疗方法的皮下注射后在血糖浓度的膳食控制中具有效用，以及在用于治疗糖尿病的闭环系统(“智能泵”)的基于算法的操作中具有进一步效用。
蛋白质(包括治疗剂和疫苗)的改造可以具有广泛的医学和社会益处。天然存在的蛋白质—如人类、其他哺乳动物、脊椎动物生物、无脊椎动物生物或一般而言的真核细胞的基因组中编码的—通常含有两个或更多个功能表面。蛋白质类似物的益处将实现这些功能表面之一或另一个的选择性修饰，例如以提供生物活性的细调。治疗蛋白质的实例由胰岛素提供。野生型胰岛素的三维结构已充分表征为锌六聚体、无锌二聚体以及溶液中的分离单体(图1和2)。在其他哺乳动物的基因组中编码的野生型人胰岛素和胰岛素分子与胰岛素受体(IR)结合，所述IR各自含有多重结构域和相关结构域表面。IR是αβ半受体的二聚体(称为(αβ)2)，其中α链和β链是单个前体多肽的翻译后产物。(αβ)2二聚体的激素结合表面已分类为与受体的非线性结合和动力学特性有关的位点1和位点2。这种结合方案在图3中以图解形式显示。IR胞外结构域片段的结构和生物化学分析中的近期进展已显示，位点1由通过(αβ)2二聚体中的两个亚基形成的反式结合元件组成：一个亚基的N末端L1结构域和另一个亚基的C末端α-螺旋(αCT)。位点2的位置并未得到充分表征，但提议为包含第一和第二纤连蛋白同源结构域的部分。
胰岛素或胰岛素类似物的受体结合表面可以同样在同源的基础上进行分类：分别的位点1结合表面(典型受体结合表面)和位点2结合表面(非典型受体结合表面)。胰岛素的位点1结合表面重叠其在B链中的二聚体形成界面，而位点2结合表面重叠其六聚体形成界面。位点1激素-IR界面近期已在低分辨率下显现。假定的位点2相关残基可以基于突变的动力学效应，或基于其中突变仍然损害结合的对于位点1外在的位置进行限定。这些标准突出显示了非典型残基A12、A13、A17、B13和B17的潜在重要性。各自的位点1相关和位点2相关表面于图4中与胰岛素单体的表面相关显示。然而，本领域已知加速来自皮下储库的胰岛素吸收的取代通常在激素的位点1结合表面内和与激素的位点1结合表面相邻(例如在残基B24、B28或B29)，我们设想位点2结合表面的修饰可以调节一旦在靶细胞或组织的表面上接合的激素受体复合物的信号传导的细胞持续时间。尽管不希望受理论限制，我们进一步设想信号传导的细胞持续时间的此类缩短对速效胰岛素类似物(“快开”)赋予“快关”药代动力学特性，所述速效胰岛素类似物在皮下储库中的分解已通过如本领域已知的在位点1结合表面内或与位点1结合表面相邻的取代得到加速(关于原理，参见图6)。因此，此类位点1/位点2相关取代的新型组合一起赋予在糖尿病治疗中具有新型效用的快开/快关药代动力学特性的所需组合。
本领域已知在胰岛素的典型受体结合表面内的修饰或取代可以使激素对于其受体的体外亲和力损害最高达约五倍(例如从0.05 nM的解离常数到0.25 nM的解离常数)，而对体内效力没有显著作用，如通过皮下或静脉内注射时，变体胰岛素引起血糖浓度的降低的能力评价的。此类稳固性至少部分归于亲和力和激素从血流中的清除速率之间的补偿关系。因为与IR的结合介导胰岛素作用和在很大程度上的胰岛素清除两者，所以亲和力的降低导致循环半衰期的成比例增加，且因此导致影响生物学信号传导的机会。此类补偿的实例已与胰岛素类似物相关公开，在所述胰岛素类似物中，在位置B24处的苯丙氨酸由环己基丙氨酸(Cha)取代，公开于2016年11月8日公布的专利号9,487,572中，所述专利的公开内容通过引用并入本文。在位置B24处的Cha的非平面脂环(图8中举例说明的)使受体结合亲和力损害约三倍，但对KP-胰岛素的效力或药效学特性没有作用，如在糖尿病Sprague-Dawley大鼠中测试的(图9A)。另外的实例已通过在位置B24处经由氟-芳香族和氯-芳香族取代进行修饰而提供，如图7中举例说明的(与野生型二聚体界面有关)，并且如2015年7月14日公布的美国专利号9,079,975、2014年12月30日公布的美国专利号8,921,313和2018年3月6日公布的美国专利号9,908,925中公开的，所述专利通过引用并入本文。
在赖脯胰岛素([LysB28，ProB29]-胰岛素，也称为KP-胰岛素(Humalog®的活性组分)；Eli Lilly and Co., Indianapolis, Indiana)中的PheB24通过在芳环的邻位处的单个氯取代(2-Cl-PheB24)的修饰，因此使变体激素在体外对于经分离的IR的生物化学亲和力损害约三倍，而不改变其体内效力，如在经由链脲菌素致使糖尿病的Sprague-Dawley大鼠中评价的，或如在麻醉的非糖尿病青春期约克夏猪中评价的，在所述约克夏猪中，内源胰岛素分泌被静脉内奥曲肽抑制(数据未显示)。甚至更引人注意地，虽然含有2-F-PheB24(在位置B24处的邻-单氟苯丙氨酸)的[AspB10，LysB28，ProB29]-胰岛素(DKP-胰岛素)的衍生物显示出受体结合亲和力中的相似减少量(相对于KP-胰岛素约35(±5)%)，其效力和信号传导持续时间在糖尿病Sprague-Dawley大鼠中得到增强(图9B)，如上文引用的美国专利号8,921,313中公开的。因此，预期一般在胰岛素分子中对IR结合引入适度扰乱(如在体外评估的)的修饰或取代在体内将是良好耐受的，并且就效力或(在不存在对自装配的作用的情况下)其他药理学特性而言，与野生型胰岛素无法区别—或甚至如在2-F-PheB24-DKP-胰岛素的情况下更有效力和延长的。尽管在位置B13、B17、A12、A13和A17处的侧链不被认为在胰岛素受体的主要激素结合表面处接合，但丙氨酸扫描诱变已显示在位点2相关位置处的单个丙氨酸取代如下影响相对受体结合亲和力：(位置B13) 12(±3)%、(B17) 62(±14)%、(A12) 108(±28)%、(A13) 30(±7)%和(A17) 56(±20)%。
胰岛素施用长久以来已确定为糖尿病的治疗。在患有糖尿病的患者中的常规胰岛素替代疗法的主要目标是血糖浓度的紧密控制，以阻止其偏移高于或低于健康人主体特有的正常范围。偏移低于正常范围与立即肾上腺素能或神经低血糖(neuroglycopenic)症状相关，其在严重发作中导致抽搐、昏迷和死亡。偏离高于正常范围与微血管疾病的长期危险增加相关，所述微血管疾病包括视网膜病变、失明和肾衰竭。胰岛素是在脊椎动物的代谢中起关键作用的小型球状蛋白质。胰岛素含有两条链：含有21个残基的A链和含有30个残基的B链；各个残基通过氨基酸的身份(通常使用标准三字母代码)、链和序列位置(通常为上标)指出。激素作为Zn2+稳定六聚体贮存于胰β-细胞，但在血流中充当无Zn2+单体。胰岛素是单链前体胰岛素原的产物，其中连接区(35个残基)将B链的C末端残基(残基B30)与A链的N末端残基连接。各种证据指出它由胰岛素样核心和无序的连接肽组成。三个特定二硫桥(A6–A11、A7–B7和A20–B19；在图2中标记)的形成被认为与胰岛素原在糙面内质网(ER)中的氧化折叠偶联。在从ER输出到高尔基体后不久，胰岛素原装配以形成可溶性Zn2+配位六聚体。内切蛋白酶解消化和转化为胰岛素在不成熟的分泌颗粒中发生，随后为形态压缩。锌胰岛素六聚体在成熟贮存颗粒内的结晶阵列已通过电子显微镜检查(EM)进行显现。
存在改造速效双链胰岛素类似物或单链胰岛素类似物的医学和社会需要，所述胰岛素类似物组合(i)在皮下储库中的胰岛素复合物的加速分解，与(ii)一旦激素受体复合物在靶细胞或组织表面上接合，细胞信号传导的持续时间缩短。还存在用膳食胰岛素注射治疗的患者子集避免晚期餐后低血糖症的未满足的需要，以及闭环基于算法的泵系统(“智能泵”)就安全和功效而言的未满足的性能规范。通过信号传导的持续时间缩短使得智能泵中的反馈控制更稳固，因为过度递送事件的效应将被削减。因此，希望提供新的一类胰岛素类似物，其组合在B链中设计为加速胰岛素复合物分解的修饰，与蛋白质分子中的其他地方导致信号传导的持续时间缩短的修饰。
尽管改造的蛋白可提供益处，例如选择性活性和作用持续时间，但不需要的效果也可产生，例如结合与促进癌细胞生长有关的同源细胞受体。野生型胰岛素不仅结合胰岛素受体，而且还以较低的亲和力结合同源1型胰岛素样生长因子受体(IGF-1R)。某些变化，如与AspB10和位置B10的其它取代有关的那些，由于可能与在服用这样的类似物的动物或人患者中的癌症风险增加有关，已引起广泛顾虑。关于基础胰岛素类似物，即设计用于具有来自皮下储库的胰岛素吸收的12-24小时分布和胰岛素作用的12-24小时分布的一天一次给予的那些，这种顾虑尤其明显。这包括先前的单链胰岛素类似物，例如美国专利公开号US2011/0195896 (题目“Isoform-Specific Insulin Analogues”，2011年8月11日公布，并且通过引用并入本文)中公开的那些。描述了具有高受体结合亲和力的单链胰岛素类似物，其中缩短的C-结构域是胰岛素样生长因子I的12-残基C-结构域(IGF-I；序列GYGSSSRRAPQT；SEQ ID NO: 12)，产生嵌合蛋白。然而，这样的嵌合分子显示对IGF-1R的相对和绝对亲和力提高。因此，需要对IGF-1R的交叉亲和力降低的单链胰岛素类似物。
发明概述
因此，本发明的一个方面是提供单链胰岛素类似物，其提供(i)由于B链的位点1相关表面中或毗邻B链的位点1相关表面的取代或修饰，进入血流内的快速吸收，和(ii)由于A和/或B链的位点2相关表面的突变或修饰，靶细胞信号传导的持续时间缩短。本发明的类似物含有野生型胰岛素的生物活性的至少一部分，以指导在皮下或静脉内注射时血糖浓度的降低。本发明的一个方面是类似物的等电点在范围3.5-6.0内，使得作为pH范围6.8-8.0中的澄清可溶溶液的配制是可行的。
本发明的单链胰岛素类似物可以含有在位置B10处的组氨酸，并且因此顺应作为锌胰岛素六聚体的配制。任选地，本发明的类似物可以含有在位置B10处的天冬氨酸，当与蛋白质中其他地方的取代或修饰组合时，使得类似物显示出对于IR的亲和力等于或小于野生型胰岛素的亲和力(并且因此不太可能显示出在激素受体复合物中的延长驻留时间)，以及对于1型IGF-1受体的亲和力等于或小于野生型胰岛素的亲和力(并且因此不太可能显示出IGF-I相关促细胞分裂活性(mitogenicity))。
一般而言，本发明的单链胰岛素类似物可包含通过连接多肽(或C-结构域)序列连接至胰岛素A-链多肽序列的胰岛素B-链多肽序列。连接多肽序列可以是Glu-Xaa-Gly-Pro-Arg-Arg，其中Xaa是Glu或Ala。胰岛素类似物可另外包含在对应于人胰岛素的A8的位置处的Glu或His取代和/或在对应于人胰岛素的A14的位置处的Glu取代。在一些实施方案中，胰岛素类似物可另外包含在对应于野生型胰岛素的B28和B29的位置处的Pro或Glu。另外的取代可包含在对应于野生型胰岛素的A13的位置处的Phe或Trp和/或在对应于野生型胰岛素的A17的位置处的Gln、Arg、Phe或Glu。在一些实施方案中，在对应于野生型胰岛素的B16的位置处可存在Glu取代。在其它实施方案中，在对应于野生型胰岛素的A10和/或B4的位置处可存在Cys取代。此外或可选择地，类似物可包含在对应于野生型胰岛素的B22的位置处的His或Ala取代和/或连接多肽序列可以是Glu-Glu-Gly-Pro-Ala-His。
本发明相关的是长度6-11个残基的新型缩短的C结构域代替人胰岛素原特有的36残基野生型C结构域的发明。单链胰岛素类似物提供了针对顺应作为无锌单体配制的原纤维化抗性胰岛素类似物的设计的有利方法。此类单链类似物可以设计为具有在B链的位点1结合表面内或毗邻B链的位点1结合表面的取代，例如以赋予速效药代动力学。适合于在选自B13、B17、A12、A13或A17的一个或多个位置处的进一步修饰的单链胰岛素类似物如美国专利公开号US2011/0195896 (于2010年10月22日提交)和美国专利号8,192,957中公开的，所述专利通过引用并入本文。
令人惊讶地发现，在位点2内的取代或修饰可显著缩短体内胰岛素作用的持续时间(药效学的变化)，尽管对变体胰岛素关于IR的生物化学亲和力赋予的扰乱小于五倍。
附图的几个视图的简述
图1是在通常药物制剂中和作为血流中的分离单体的胰岛素结构的表示。(A)苯酚稳定的R6锌六聚体。轴向锌离子(覆盖的)显示为通过组氨酸侧链配位的一致黑色球体。A链以深灰色显示，并且B链以中灰色(残基B1-B8)和浅灰色(B9-B30)显示。(B)胰岛素单体的结构。A链以深灰色显示，并且B链以中灰色显示；二硫桥描述为球和棒(标记在图2中提供)。
图2是胰岛素二聚体和核心β片层的结构的表示。关于反向平行的β片层的残基B24-B28(中灰色)在六聚体中通过对称重复三次。A和B链以其他方式分别以浅灰色和深灰色显示。PheB24的位置以深灰色箭头突出显示。半胱氨酸通过作为球体显示的硫原子鉴定。坐标得自T6六聚体(PDB 4INS)。
图3是胰岛素受体的模型的表示：受体的每个α亚基含有两个独特的胰岛素结合位点：位点1(高亲和力)和位点2(低亲和力但对信号传播关键)。特定胰岛素结合桥连两个α亚基，依次改变β亚基之间的取向，将信号通讯给细胞内酪氨酸激酶(TK)结构域。
图4是胰岛素的功能表面的表示。虽然胰岛素的典型受体结合表面接合IR位点1(B12、B16、B24-B26)，但它的位点2相关表面包括六聚体接触ValB17和LeuA13；显示了所提议的位点2残基(B13、B17、A12、A13和A17)，添加邻近残基B10，其可以促成位点1和2两者。A和B链以其他方式分别以浅灰色和深灰色显示。
图5是在胰岛素六聚体、二聚体和单体的表面上的LeuA13位置的表示。坐标得自R6六聚体(PDB 1TRZ)。
图6是关于餐时胰岛素类似物的设计和配制的原理的表示。锌六聚体的快速解离获得能够进入毛细血管的二聚体和单体。目前餐时胰岛素类似物含有在核心β片层的边缘处的标准取代。
图7是显示在用皮下注射的本发明的单链胰岛素类似物治疗后，在于用链脲菌素处理后的通过用链脲菌素处理导致糖尿病的雄性Lewis大鼠中的血糖水平降低的柱状图。
图8是显示对于赖脯胰岛素和本发明的单链胰岛素类似物，原纤维形成的天数的柱状图。
图9是显示相对于赖脯胰岛素，本发明的单链胰岛素类似物与人1型胰岛素样生长因子受体的结合的柱状图。
图10是显示在用本发明的单链胰岛素类似物处理后，细胞周期蛋白D1:细胞周期蛋白G2表达的比率的倍数变化的柱状图。
图11是显示本发明的单链胰岛素类似物和人胰岛素(HI)、赖脯胰岛素(KP)和DB10 KP胰岛素的计算的解折叠自由能(ΔGu)的柱状图。
发明详述
本发明涉及单链胰岛素类似物，其可提供与赖脯胰岛素相比延长的原纤维化时间和降低的对人1型胰岛素样生长因子受体(hIGFR)的亲和力，同时与赖脯胰岛素相比保持至少一部分血糖降低活性。与人胰岛素和/或含有位置B10的Asp (或D)取代的胰岛素类似物相比，单链胰岛素还可提供降低的促细胞分裂活性。
一般而言，本发明的单链胰岛素类似物包含通过连接多肽(或C-结构域)序列连接至胰岛素A-链多肽序列的胰岛素B-链多肽序列。连接多肽序列可以是Glu-Xaa-Gly-Pro-Arg-Arg (EXGPRR)，其中Xaa (X)是Glu (E)或Ala (A)。胰岛素类似物可另外包含在对应于人胰岛素的A8的位置处的Glu (E)或His (H)取代和/或在对应于人胰岛素的A14的位置处的Glu (E)取代。在一些实施方案中，胰岛素类似物可另外包含在对应于野生型胰岛素的B28和B29的位置处的Pro (P)或Glu (E)。另外的取代可包含在对应于野生型胰岛素的A13的位置处的Phe (F)或Trp (W)和/或在对应于野生型胰岛素的A17的位置处的Gln (Q)、Arg(R)、Phe (F)或Glu (E)。在一些实施方案中，在对应于野生型胰岛素的B16的位置处可存在Glu取代。在其它实施方案中，在对应于野生型胰岛素的A10和/或B4的位置处可存在Cys(C)取代。此外或可选择地，类似物可包含在对应于野生型胰岛素的B22的位置处的His (H)或Ala (A)取代和/或连接多肽序列可以是Glu-Glu-Gly-Pro-Ala-His (EEGPAH)。
在一些实施方案中，本发明的特点在于单链类似物的等电点在3.5 - 6.0之间，使得可溶性制剂中性条件(pH 6.8-8.0)将是可行的。
还设想单链类似物还可以由衍生自动物胰岛素的A和B结构域序列制备，所述动物胰岛素作为非限制性实例例如猪、牛、马和犬胰岛素。另外或可替代地，本发明的胰岛素类似物可以含有残基B1-B3的缺失，或可以与缺乏赖氨酸(例如野生型人胰岛素中的LysB29)变体B链组合，以避免前体多肽在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或其他酵母表达物种或菌株中的酵母生物合成中Lys指导的前体多肽的蛋白酶解。本发明的单链胰岛素的B结构域可以任选含有非标准取代，例如在位置B20和/或B23处的D-氨基酸(预期加强热力学稳定性、受体结合亲和力和对原纤维化的抗性)、在PheB24的2环位置处的卤素修饰(即，邻-F-PheB24、邻-Cl-PheB24或邻-Br-PheB24；预期增强热力学稳定性和对原纤维化的抗性)、PheB24的2-甲基环修饰(预期增强受体结合亲和力)。还设想ThrB27、ThrB30或者C结构域中的一个或多个丝氨酸残基可以单独地或组合地通过单糖加合物进行修饰；实例通过O联N-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷(称为GalNAc-Oβ-Ser或GalNAc-Oβ-Thr)、O联α-D-吡喃甘露糖苷(甘露糖-Oβ-Ser或甘露糖-Oβ-Thr)、和/或α-D-吡喃葡萄糖苷(葡萄糖-Oβ-Ser或葡萄糖-Oβ-Thr)提供。
此外，考虑到人和动物胰岛素之间的相似性，以及过去动物胰岛素在患有糖尿病的人患者中的使用，还设想可以引入在胰岛素序列中的其他微小修饰，尤其是视为“保守”的那些取代。例如，另外的氨基酸取代可以在具有相似侧链的氨基酸组内进行，而不背离本发明。这些包括中性疏水性氨基酸：丙氨酸(Ala或A)、缬氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、异亮氨酸(Ile或I)、脯氨酸(Pro或P)、色氨酸(Trp或W)、苯丙氨酸(Phe或F)和甲硫氨酸(Met或M)。同样地，中性极性氨基酸可以在其甘氨酸(Gly或G)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、酪氨酸(Tyr或Y)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Glu或Q)、和天冬酰胺(Asn或N)的组内彼此取代。碱性氨基酸被认为包括赖氨酸(Lys或K)、精氨酸(Arg或R)和组氨酸(His或H)。酸性氨基酸是天冬氨酸(Asp或D)和谷氨酸(Glu或E)。除非另有说明或无论由上下文显而易见的地方，本文所示的氨基酸应视为L-氨基酸。标准氨基酸还可以通过属于相同化学类别的非标准氨基酸取代。作为非限制性实例，碱性侧链Lys可以替换为更短侧链长度的碱性氨基酸(鸟氨酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸)。Lys还可以替换为中性脂肪族电子等排物正亮氨酸(Nle)，这进而可以通过含有更短的脂肪族侧链的类似物(氨基丁酸或氨基丙酸)取代。
为了比较目的，人胰岛素原的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 1提供。
SEQ ID NO: 1 (人胰岛素原)
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
人胰岛素A链的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 2提供。
SEQ ID NO: 2 (人A链)
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
人胰岛素B链的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 3提供。
SEQ ID NO: 3 (人B链)
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr
本发明的单链胰岛素类似物的一些实施方案可参考SEQ ID NO: 4概述。
SEQ ID NO: 4
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Xaa-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Xaa-Xaa-Thr-Glu-Xaa-Gly-Pro-Arg-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Xaa-Ser-Ile-Cys-Ser-Xaa-Xaa-Gln-Leu-Xaa-Asn-Tyr-Cys-Asn，
其中位置16 (相对于野生型胰岛素，对应于位置B16)的Xaa是Tyr (如在野生型胰岛素中)或Glu；位置28 (相对于野生型胰岛素，对应于位置B28)的Xaa是Pro (如在野生型胰岛素中)或Glu；位置29 (相对于野生型胰岛素，对应于位置B29)的Xaa是Lys (如在野生型胰岛素中)、Pro或Glu；位置32 (对应于在胰岛素的B-和A-链之间的接头序列的第二个氨基酸)的Xaa是Glu或Ala；位置44 (相对于野生型胰岛素，对应于位置A8)的Xaa是Thr (如在野生型胰岛素中)、Glu或His；位置49 (相对于野生型胰岛素，对应于位置A13)的Xaa是Leu(如在野生型胰岛素中)、Phe或Trp；位置50 (相对于野生型胰岛素，对应于位置A14)的Xaa是Tyr (如在野生型胰岛素中)或Glu；和位置53 (相对于野生型胰岛素，对应于位置A17)的Xaa是Glu (如在野生型胰岛素中)、Gln、Arg或Phe。
在一个实施方案中，称为EA8, EA14, QA17, PE, EAGPRR的单链胰岛素的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 5提供。
SEQ ID NO: 5
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr-Glu-Ala-Gly-Pro-Arg-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Glu-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Glu-Gln-Leu-Gln-Asn-Tyr-Cys-Asn。
在另一个实施方案中，称为EA8, EA14, RA17, PE, EAGPRR的单链胰岛素的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 6提供。
SEQ ID NO: 6
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr-Glu-Ala-Gly-Pro-Arg-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Glu-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Glu-Gln-Leu-Arg-Asn-Tyr-Cys-Asn。
在另一个实施方案中，称为HA8, EA14, QA17, PE, EAGPRR的单链胰岛素的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 7提供。
SEQ ID NO: 7
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr-Glu-Ala-Gly-Pro-Arg-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Glu-Gln-Leu-Gln-Asn-Tyr-Cys-Asn。
在另一个实施方案中，称为EA8, EA14, RA17, EP, EAGPRR的单链胰岛素的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 8提供。
SEQ ID NO: 8
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Glu-Pro-Thr-Glu-Ala-Gly-Pro-Arg-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Glu-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Glu-Gln-Leu-Arg-Asn-Tyr-Cys-Asn。
在另一个实施方案中，称为HA8, EA14, EB17, PE, EEGPRR的单链胰岛素的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 9提供。
SEQ ID NO: 9
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Glu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr-Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Glu-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn。
在又一个实施方案中，称为HA8, EA14, FB17, PE, EEGPRR的单链胰岛素的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 10提供。
SEQ ID NO: 10
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Phe-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr-Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Glu-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn。
在另一个实施方案中，称为HA8, EA14, FA13, PE, EEGPRR的单链胰岛素的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 11提供。
SEQ ID NO: 11
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr-Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Phe-Glu-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn。
在又一个实施方案中，称为HA8, EA14, EB16, PE, EEGPRR的单链胰岛素的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 12提供。
SEQ ID NO: 12
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Glu-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr-Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Glu-Gln-Glu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn。
在又一个实施方案中，称为HA8, EA14, RA17, PE, EAGPRR的单链胰岛素的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 13提供。
SEQ ID NO: 13
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr-Glu-Ala-Gly-Pro-Arg-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Glu-Gln-Leu-Arg-Asn-Tyr-Cys-Asn。
在又一个实施方案中，称为HA8, WA13, EA14, PE, EAGPRR的单链胰岛素的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 14提供。
SEQ ID NO: 14
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr-Glu-Ala-Gly-Pro-Arg-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Trp-Glu-Gln-Leu-Gln-Asn-Tyr-Cys-Asn。
在又一个实施方案中，称为EA8, EA14, QA17, EP, EAGPRR的单链胰岛素的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 15提供。
SEQ ID NO: 15
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Glu-Pro-Thr-Glu-Ala-Gly-Pro-Arg-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Glu-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Glu-Gln-Leu-Gln-Asn-Tyr-Cys-Asn。
在又一个实施方案中，称为HA8, EA14, QA17, EP, EAGPRR的单链胰岛素的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 16提供。
SEQ ID NO: 16
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Glu-Pro-Thr-Glu-Ala-Gly-Pro-Arg-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Glu-Gln-Leu-Gln-Asn-Tyr-Cys-Asn。
在又一个实施方案中，称为HA8, EA14, RA17, EP, EAGPRR的单链胰岛素的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 17提供。
SEQ ID NO: 17
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Glu-Pro-Thr-Glu-Ala-Gly-Pro-Arg-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Glu-Gln-Leu-Arg-Asn-Tyr-Cys-Asn。
在又一个实施方案中，称为HA8, WA13, EA14, EP, EAGPRR的单链胰岛素的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 18提供。
SEQ ID NO: 18
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Glu-Pro-Thr-Glu-Ala-Gly-Pro-Arg-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Trp-Glu-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn。
在又一个实施方案中，称为EA8, LA14, QA17, PE, EAGPRR的单链胰岛素的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 19提供。
SEQ ID NO: 19
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr-Glu-Ala-Gly-Pro-Arg-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Glu-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Leu-Gln-Leu-Gln-Asn-Tyr-Cys-Asn。
在又一个实施方案中，称为HA8, CA10, EA14, CB4, HB22, PE, EEGPAH的单链胰岛素的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 20提供。
SEQ ID NO: 20
Phe-Val-Asn-Cys-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Cys-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr-Glu-Glu-Gly-Pro-Ala-His-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Cys-Cys-Ser-Leu-Glu-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn。
在又一个实施方案中，称为HA8, CA10, EA14, CB4, AB22, PE, EEGPAH的单链胰岛素的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 21提供。
SEQ ID NO: 21
Phe-Val-Asn-Cys-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Ala-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr-Glu-Glu-Gly-Pro-Ala-His-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Cys-Cys-Ser-Leu-Glu-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn。
将本发明的胰岛素类似物与在前的胰岛素类似物例如赖脯胰岛素(或者称为“KP”胰岛素)比较，所述赖脯胰岛素包含具有取代LysB28, ProB29的B-链序列，如SEQ ID NO: 22所示。
SEQ ID NO: 22 (赖脯胰岛素)
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr
赖脯胰岛素的A-链序列是上文提供的SEQ ID NO: 2的序列。
用于比较目的的另一种在前的胰岛素类似物是在本文中称为“DB10”的胰岛素类似物，其包含位置B10的Asp取代，如SEQ ID NO: 23所示：
SEQ ID NO: 23 (DB10)
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-Asp-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr
进一步的变化组合了赖脯胰岛素与DB10的取代，如在SEQ ID NO: 24中。对于各取代，该类似物有时被称为“DKP”胰岛素。
SEQ ID NO: 24 (DKP)
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-Asp-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr
在DB10和DKP胰岛素二者中，A-链序列是上文SEQ ID NO: 2的序列。
在另一个实施方案中，称为EA8, EA14, RA17, PE, EAGPRR的单链胰岛素的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 25提供。
SEQ ID NO: 25
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr-Glu-Ala-Gly-Pro-Arg-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Glu-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Glu-Gln-Leu-Arg-Asn-Tyr-Cys-Asn。
在又一个实施方案中，称为HA8, EA14, RA17, PE, EEGPRR的单链胰岛素的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 26提供。
SEQ ID NO: 26
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr-Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Glu-Gln-Leu-Arg-Asn-Tyr-Cys-Asn。
在另一个实施方案中，称为HA8, EA14, NB17, PE, EEGPRR的单链胰岛素的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 27提供。
SEQ ID NO: 27
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Asn-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr-Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Glu-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn。
本发明的胰岛素类似物的几个实施方案的效力在雄性糖尿病Lewis大鼠中评价，所述大鼠通过用链脲菌素(STZ)处理而导致糖尿病。皮下注射实验类似物、赖脯胰岛素(KP)和仅稀释剂的对照溶液，并且产生的血糖(BG)变化通过使用临床血糖仪进行连续测量来监测。剂量反应作为超出稀释剂对照的最大BG下降计算并作图。Langmuir等温线使用迭代加权拟合以计算最佳拟合剂量反应曲线，并且EC50作为实现在拟合的最大和最小下降之间半途的下降所需的内插剂量确定。得到的值提供在下表1和图7中。
表1
胰岛素类似物 BG下降(mg/dL)
每µg剂量
KP (SEQ ID NO: 2和22) <i>25</i>
EA8 EA14 QA17 PE EAGPRR (SEQ ID NO: 5) 16.8
EA8 EA14 RA17 PE EAGPRR (SEQ ID NO: 6) 11.3
HA8 EA14 QA17 PE EAGPRR (SEQ ID NO: 7) 15.1
EA8 EA14 RA17 EP EAGPRR (SEQ ID NO: 8) 12.4
HA8 EA14 FB17 PE EEGPRR (SEQ ID NO: 10) 27.2
HA8 EA14 NB17 PE EEGPRR (SEQ ID NO: 27) 15.2
EA8 EA14 QA17 EP EAGPRR (SEQ ID NO: 15) 17.8
HA8 EA14 RA17 EP EAGPRR (SEQ ID NO: 17) 18.5
发现本发明的代表性类似物保留显著比例的赖脯胰岛素的生物活性。测试的类似物显示至少45%的赖脯胰岛素效力。在大多数情况下，类似物具有超过一半的赖脯胰岛素效力，和一种类似物具有大于赖脯胰岛素的效力。
通过轻轻搅拌使用磷酸盐缓冲盐水(PBS) pH 7.4配制为终浓度U10的样品，测定对原纤维化的抗性。将1uM的硫磺素T (ThT)加入各溶液，并将150 uL加入各孔。以1000 cpm的恒定线性摇动，将板在40℃孵育。以440/480 nm的激发/发射波长每日进行采样。结果提供在表2和图8中。
表2
类似物 U10原纤维天数
KP (SEQ ID NO: 2和22) 5
EA8 EA14 QA17 PE EAGPRR (SEQ ID NO: 5) 209
EA8 EA14 RA17 PE EAGPRR (SEQ ID NO: 6) 209
HA8 EA14 QA17 PE EAGPRR (SEQ ID NO: 7) 209
EA8 EA14 RA17 EP EAGPRR (SEQ ID NO: 8) 292
HA8 EA14 EB17 PE EEGPRR (SEQ ID NO: 9) 82
HA8 EA14 FB17 PE EEGPRR (SEQ ID NO: 10) 131
HA8 EA14 FA13 PE EEGPRR (SEQ ID NO: 11) 82
HA8 EA14 EB16 PE EEGPRR (SEQ ID NO: 12) 103
HA8 EA14 RA17 PE EAGPRR (SEQ ID NO: 13) 131
HA8 WA13 EA14 PE EAGPRR (SEQ ID NO: 14) 125
EA8 EA14 QA17 EP EAGPRR (SEQ ID NO: 15) 131
HA8 EA14 QA17 EP EAGPRR (SEQ ID NO: 16) 131
HA8 EA14 RA17 EP EAGPRR (SEQ ID NO: 17) 20
HA8 WA13 EA14 EP EAGPRR (SEQ ID NO: 18) 103
EA8 LA14 QA17 PE EAGPRR (SEQ ID NO: 19) 111
本文提供的数据证实了测试的类似物提供赖脯胰岛素的至少4倍长的原纤维化时间。在大多数情况下，类似物显示超过10倍或甚至20倍的更长原纤维化时间。在一些情况下，类似物显示超过40倍的更长原纤维化时间。
单链胰岛素类似物与IGF-1R的交叉反应性使用人1型胰岛素样生长因子受体(hIGFR)的FLAG表位-标记的全受体研究，所述全受体结合至用抗-FLAG单克隆抗体包被的96孔板。相对亲和力定义为通过结合的125I标记的人IGF-I的竞争性置换确定的解离常数的比率。解离常数(Kd)通过拟合至Whittaker和Whittaker (2005. J. Biol. Chem.280,20932-20936)描述的数学模型确定；所述模型使用具有异源竞争的假设的非线性回归(Wang, 1995, FEBS Lett.360, 111-114)。这用作促细胞分裂潜力的标记，其中较少的IGF-R亲和力被解释为较低的促细胞分裂潜力。结果提供在表3和图9中。
表3
Figure 161251DEST_PATH_IMAGE001
与赖脯胰岛素相比，测试的胰岛素类似物各自显示对IGF -1R的亲和力降低。特别地，与赖脯胰岛素相比，类似物显示25%或更低的亲和力。在大多数情况下，与赖脯胰岛素相比，胰岛素类似物显示少于20%的对IGF-1R的亲和力。在一些情况下，与赖脯胰岛素相比，类似物显示少于10%的对IGF-1R的亲和力。
为了证实本发明的单链胰岛素类似物的促细胞分裂活性降低，进行RT-qPCR测定，其监测通过不同的胰岛素类似物处理刺激的促细胞分裂活性探针的转录反应。两种细胞周期蛋白的表达调节用作主要探针：细胞周期蛋白D1被上调，而细胞周期蛋白G2被下调，其与活跃的细胞分裂周期(增殖，其通常与促细胞分裂活性相关)有关。D1/G2转录水平的比率提供了化合物的促细胞分裂潜力的描绘；比率越高意味着促细胞分裂潜力越大。在该测定中，具有高表达的胰岛素受体(IR)的大鼠成肌细胞细胞系(L6)用作细胞模型。结果提供在表4和图10中。
表4
Figure 547233DEST_PATH_IMAGE002
数据显示与人胰岛素(HI)和DB10胰岛素二者相比，本发明的单链胰岛素类似物各自具有降低的细胞周期蛋白D1/G2比率。在大多数情况下，细胞周期蛋白D1/G2比率低于人胰岛素的一半。
本发明的单链胰岛素类似物的热力学稳定性在25℃和pH 7.4下通过圆二色性(CD)-监测的胍变性评价。测试的每一种单链胰岛素类似物的解折叠自由能(ΔGu)大于人胰岛素(HI)、赖脯胰岛素(KP)和甚至DB10 KP (DKP)胰岛素中的每一种，如表5和图11所示。这种自由能增加预测了化学稳定性提高。
表5
Figure 530233DEST_PATH_IMAGE003
用于治疗患有糖尿病的患者的方法包括施用如本文描述的单链胰岛素类似物。本发明的另一个方面是单链胰岛素类似物可以在酵母(巴斯德毕赤酵母)中进行制备，或实施通过天然片段连接的全化学合成。我们进一步设想本发明的类似物提供了用于治疗糖尿病或代谢综合征的方法。胰岛素类似物的递送途径是通过经由使用针和注射器或笔装置的皮下注射。
本发明的单链胰岛素类似物还可以含有其他修饰，例如在B24、B25或B26位置处的卤素原子，如共同未决的美国专利号8,921,313中更全面地描述的，所述专利的公开内容通过引用并入本文。本发明的胰岛素类似物还可以含有由于残基B1-B3缺失的缩短B链，如共同未决的美国临时专利申请9,725,493中更全面地描述的。
药物组合物可以包含此类胰岛素类似物，并且其可以任选包括锌。锌离子可以以不同锌离子:蛋白质比包括，范围从2.2个锌原子/胰岛素类似物六聚体到3个锌原子/胰岛素类似物六聚体。制剂的pH在pH 6.8 – 8.0范围内。在此类制剂中，胰岛素类似物的浓度通常为约0.6-5.0 mM；高达5 mM的浓度可以用于小瓶或笔中；更浓缩的制剂(U-200或更高)可以在具有显著胰岛素抵抗的患者中具有特别益处。赋形剂可以包括甘油、甘氨酸、精氨酸、Tris、其他缓冲剂和盐、以及抗微生物防腐剂例如苯酚和间甲酚；已知后者防腐剂增强胰岛素六聚体的稳定性。单链胰岛素类似物可以在锌离子的存在下或其不存在下进行配制。通过给患者施用生理学有效量的组合物，如上所述的此类药物组合物可以用于治疗患有糖尿病或其他医学状况的患者。
基于前述公开内容，目前应显而易见的是提供的单链胰岛素类似物进行上文所示的目的。即，这些胰岛素类似物显示出从皮下储库加速吸收到血流内(“快开”)和缩短的信号传导持续时间(“快关”)，同时维持野生型胰岛素的生物活性的至少一部分。因此，应当理解的是，显而易见的任何变化落入所要求保护的发明的范围内，和因此可以确定具体组分要素的选择，而不背离本文公开且描述的本发明的精神。
引用下述参考文献，以证实本文描述的测试和测定方法由本领域普通技术人员理解。
Glendorf, T., Knudsen, L., Stidsen, C.E., Hansen, B.F., Hegelund,A.C., Sørensen, A.R., Nishimura, E., & Kjeldsen, T. 2012. Systematicevaluation of the metabolic to mitogenic potency ratio for B10-substitutedinsulin analogues. PLoS One 7(2), e29198.
Hohsaka, T., & Sisido, M. 2012. Incorporation of non-natural aminoacids into proteins. Curr. Opin. Chem. Biol. 6, 809-15.
Hua, Q.X., Nakagawa, S.H., Jia, W., Huang, K., Phillips, N.B., Hu, S.& Weiss, M.A. (2008) Design of an active ultrastable single-chain insulinanalog: synthesis, structure, and therapeutic implications. J. Biol. Chem.283, 14703-14716.
Kristensen, C., Andersen, A.S., Hach, M., Wiberg, F.C., Schäffer, L.,& Kjeldsen, T. 1995. A single-chain insulin-like growth factor I/insulinhybrid binds with high affinity to the insulin receptor. Biochem. J. 305,981-6.
Lee, H.C., Kim, S.J., Kim, K.S., Shin, H.C., & Yoon, J.W. 2000.Remission in models of type 1 diabetes by gene therapy using a single-chaininsulin analogue. Nature 408, 483-8. Retraction in: Lee HC, Kim KS, Shin HC.2009. Nature 458, 600.
Phillips, N.B., Whittaker, J., Ismail-Beigi, F., & Weiss, M.A. (2012)Insulin fibrillation and protein design: topological resistance of single-chain analogues to thermal degradation with application to a pump reservoir.J. Diabetes Sci. Technol. 6, 277-288.
Sciacca, L., Cassarino, M.F., Genua, M., Pandini, G., Le Moli, R.,Squatrito, S., & Vigneri, R. 2010. Insulin analogues differently activateinsulin receptor isoforms and post-receptor signalling. Diabetologia53, 1743-53.
Wang, Z.X. 1995. An exact mathematical expression for describingcompetitive biding of two different ligands to a protein molecule FEBS Lett.360: 111-114.
Whittaker, J., 和Whittaker, L. 2005. Characterization of thefunctional insulin binding epitopes of the full-length insulin receptor. J. Biol. Chem.280: 20932-20936。
Figure IDA0003075974500000011
Figure IDA0003075974500000021
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Claims (18)

1.单链胰岛素类似物，其包含通过C-结构域连接多肽序列连接至胰岛素A-链多肽序列的胰岛素B-链多肽序列，其中所述C-结构域连接多肽序列选自序列Glu-Glu-Gly-Pro-Ala-His和序列Glu-Xaa-Gly-Pro-Arg-Arg，其中Xaa是Glu或Ala。
2.权利要求1的单链胰岛素类似物，其另外包含在对应于人胰岛素的A8的位置处的Glu或His取代、在对应于人胰岛素的A14的位置处的Glu取代或其组合。
3.权利要求1或2的单链胰岛素类似物，其另外包含在对应于野生型胰岛素的B28和B29的位置处的Pro或Glu。
4.权利要求3的单链胰岛素类似物，其另外包含在对应于野生型胰岛素的A13的位置处的Phe或Trp取代，在对应于野生型胰岛素的A17的位置处的Gln、Arg、Phe或Glu，或其组合。
5.权利要求4的单链胰岛素类似物，其中所述C-结构域连接多肽序列是Glu-Ala-Gly-Pro-Arg-Arg。
6.权利要求5的单链胰岛素类似物，其包含SEQ ID NO: 5-8和13-19中的任何一个。
7.权利要求6的单链胰岛素类似物，其包含在对应于野生型胰岛素的A17的位置处的Arg取代。
8.权利要求7的单链胰岛素类似物，其包含SEQ ID NO: 8。
9.权利要求5的单链胰岛素类似物，其包含SEQ ID NO: 13和17中的任何一个。
10.权利要求3的单链胰岛素类似物，其中所述C-结构域连接多肽序列是Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Arg。
11.权利要求5的单链胰岛素类似物，其包含SEQ ID NO: 9-12中的任何一个。
12.权利要求1的单链胰岛素类似物，其另外包含可存在的在对应于野生型胰岛素的B16的位置处的Glu取代。
13.权利要求1的单链胰岛素类似物，其另外包含在对应于野生型胰岛素的A10和/或B4的位置处的Cys取代。
14.权利要求1的单链胰岛素类似物，其另外包含在对应于野生型胰岛素的B22的位置处的His或Ala取代。
15.根据权利要求1-14中任一项的胰岛素类似物用作药物的用途。
16.根据权利要求1-14中任一项的胰岛素类似物用于降低患者的血糖的用途。
17.根据权利要求1-14中任一项的单链胰岛素类似物，其用于治疗糖尿病。
18.降低患者的血糖的方法，所述方法包括向所述患者施用药学有效量的根据权利要求1-14中任一项的胰岛素类似物。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114591417A (zh) * 2022-04-22 2022-06-07 四川大学 人源单链胰岛素类似物及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105228643A (zh) * 2013-03-15 2016-01-06 卡斯西部储备大学 位点2胰岛素类似物
WO2016057529A2 (en) * 2014-10-06 2016-04-14 Case Western Reserve University Biphasic single-chain insulin analogues
WO2017112952A1 (en) * 2015-12-23 2017-06-29 Case Western Reserve University Encapsulation of ultra-stable insulin analogues with polymer melts

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2012009618A (es) * 2010-02-22 2013-02-26 Univ Case Western Reserve Preperaciones de analogo de insulina de larga accion en formas solubles y cristalinas.
CN106102763A (zh) * 2014-01-13 2016-11-09 塞尔玛琳糖尿病有限责任公司 速效胰岛素制剂和药物递送系统
EP3529615A1 (en) * 2016-10-24 2019-08-28 Novo Nordisk A/S Bioassay for insulin formulations
CN110198722A (zh) * 2016-11-21 2019-09-03 卡斯西部储备大学 稳定性增强的快速作用的胰岛素类似物
WO2018165290A1 (en) * 2017-03-07 2018-09-13 Case Western Reserve University Single-chain insulin analogues stabilized by a fourth disulfide bridge

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105228643A (zh) * 2013-03-15 2016-01-06 卡斯西部储备大学 位点2胰岛素类似物
WO2016057529A2 (en) * 2014-10-06 2016-04-14 Case Western Reserve University Biphasic single-chain insulin analogues
WO2017112952A1 (en) * 2015-12-23 2017-06-29 Case Western Reserve University Encapsulation of ultra-stable insulin analogues with polymer melts

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
G. RAJPAL ET AL.: "Single-Chain Insulins as Receptor Agonists", MOLECULAR ENDOCRINOLOGY, vol. 23, no. 5, pages 679 - 688, XP055085086, DOI: 10.1210/me.2008-0349 *
MICHAEL D. GLIDDEN ET AL.: "An ultra-stable single-chain insulin analog resists thermal inactivation and exhibits biological signaling duration equivalent to the native protein", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 293, no. 1, pages 47 - 68, XP055540483, DOI: 10.1074/jbc.M117.808626 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114591417A (zh) * 2022-04-22 2022-06-07 四川大学 人源单链胰岛素类似物及其应用
CN114591417B (zh) * 2022-04-22 2023-04-25 四川大学 人源单链胰岛素类似物及其应用

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