CN110198722A - 稳定性增强的快速作用的胰岛素类似物 - Google Patents

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Abstract

一种双链胰岛素类似物含有修饰的A‑链多肽和修饰的B‑链多肽。A‑链多肽包含以下中的一个或多个：在位置A8的His或Glu取代，在位置A14的Glu取代；和在位置A17的Gln或Arg取代。B‑链多肽包含以下中的一个或多个：在位置B1、B1‑B2、B1‑B3、B30或其组合处的氨基酸缺失；在位置B2的Ala或Glu取代；在位置B3的Glu取代。所述类似物表现出无锌溶液中的热力学稳定性，减少的自缔合，保持生物活性，且不增加促有丝分裂性。所述类似物表现出对化学降解和物理降解的抗性。一种治疗具有糖尿病或肥胖症的患者的方法，其包括向患者施用生理有效量的胰岛素类似物或其生理上可接受的盐。

Description

稳定性增强的快速作用的胰岛素类似物
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年11月21日提交的待审的美国临时申请号62/424,892的权益。
关于联邦资助的研究或开发的声明
本发明是在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的拨款号DK040949和DK074176的政府支持下进行的。政府在本发明中有特定的权利。
发明背景
本发明涉及一种多肽激素类似物，其表现出增强的药物特性，例如提高的热力学稳定性，降低的促有丝分裂性，以及不存在锌离子的高蛋白浓度(1-5 mM)的快速作用制剂的可行性。更特别的是，本发明涉及胰岛素类似物，其赋予在提高的制剂强度(相对于野生型胰岛素)下的快速作用和/或能够在药物形成中使用范围更广的赋形剂(相对于传统上被配制为锌离子稳定蛋白组装体的野生型胰岛素或常规胰岛素类似物)。
非标准蛋白(包括治疗剂和疫苗)的工程改造，可能具有广泛的医学和社会益处。天然存在的蛋白-如在人类、其他哺乳动物、脊椎动物生物、无脊椎动物生物或一般真核细胞的基因组中编码的-可能已经进化到在细胞背景内发挥最佳功能，但在治疗应用方面可能是次优的。这样的蛋白的类似物可表现出改进的生物物理、生物化学、或生物学特性。蛋白类似物的优势将是实现增强的“中靶(on-target)”活性(例如代谢作用的代谢调节，导致血液葡萄糖浓度降低)，伴有减少的意外和不良副作用，例如促进癌细胞生长。这种蛋白工程改造的另一个益处是在蛋白浓缩以获得更高强度的制剂后保持快速作用起效。社会益处的又另一个例子将是增强与递送装置的兼容性，所述递送装置例如胰岛素泵或闭环系统，其中算法将泵的流速与连续的葡萄糖监测器的输出连接起来。一种治疗性蛋白的例子由胰岛素提供。其他哺乳动物基因组中编码的野生型人胰岛素和胰岛素分子结合多个器官和不同类型的细胞中的胰岛素受体，而无论受体同种型通过选择性RNA剪接模式产生，还是通过翻译后糖基化的选择性模式产生。野生型胰岛素也以较低但显著的亲和力与同源1型胰岛素样生长因子受体(IGF-1R)结合。
胰岛素是一种双链蛋白分子，其在脊椎动物中是称为胰岛素原(proinsulin)的单链前体的生物合成产物。人胰岛素原的序列和结构分别在图1A (SEQ ID NO: 1)和1B中说明；人胰岛素的序列显示于图1C中。胰岛素含有两个多肽链，一个A链，含有21个残基(SEQID NO: 2)，以及一个B链，含有30个残基(SEQ ID NO: 3)。在下文中，将一个或另一个链中的特定氨基酸指定为标准的三字母代码(例如，“Ala”表示丙氨酸或“Asp”表示天冬氨酸)，后接指定该链(A或B)的字母和该链中相对于野生型胰岛素的位置编号(任选上标)。例如，B链的位置10处的组氨酸被指定为HisB10，B链的位置12处的缬氨酸被指定为ValB12，且A链的位置8处的苏氨酸被指定为ThrA8。或者，氨基酸可以指定为标准的一字母代码(例如，“A”表示丙氨酸或“D”表示天冬氨酸)，后接指定A或B链的字母，后接相对于野生型胰岛素的位置编号。根据该惯例，B链的位置10处的组氨酸被指定为HB10，B链的位置12处的缬氨酸被指定为VB12，且A链的位置8处的苏氨酸被指定为TA8。保持相对于野生型胰岛素的氨基酸编号，即使存在从多肽的N-末端起的氨基酸缺失的情况下也是如此。因此，在des B1胰岛素类似物(这表示已从野生型序列的N-末端缺失第一个氨基酸)中，B-链的第一个氨基酸为缬氨酸，其仍被指定为占据B2位置。同样，在其中已从野生型序列中缺失前两个N-端氨基酸的des [B1, B2]胰岛素类似物中，第一个氨基酸是天冬酰胺，它仍然被指定为占据B3位置。
术语“胰岛素类似物”是指与一类分子，其通过用不同类型的氨基酸取代一个或多个氨基酸残基，或通过用不同原子或一组原子修饰此类残基的侧链或主链中的一个或多个原子而与野生型胰岛素相关，但仍将保持野生型胰岛素的一种或多种特性的至少一部分，例如结合胰岛素受体(IR)的能力。本领域已知的胰岛素类似物的一个例子是赖脯胰岛素(lispro)，其中ProB28由Lys取代且LysB29由Pro取代。赖脯胰岛素(也称为KP-胰岛素)是产品Humalog® (Eli Lilly and Co.)的活性组分。
本领域已知胰岛素的B链可以通过在一个或几个位置的氨基酸取代来修饰，以提高胰岛素类似物制剂从皮下贮库的吸收速率。增加强度(国际单位/ml)的胰岛素制剂有望对表现出明显胰岛素抵抗的患者特别有益，并且在内部或外部胰岛素泵中也可能有价值，或者延长贮库寿命，或者允许在新一代泵技术中使贮库小型化。
现有的胰岛素产品通常在增加胰岛素或胰岛素类似物的浓度以达到大于或等于U-200 (200国际单位/ml)的制剂强度后表现出延长的药代动力学和药效动力学特性。这种延长损害这样的产品在皮下注射后血糖的膳食控制效力，并且损害基于泵的连续皮下输注的效力和安全性。鉴于这些缺点，可以通过工程改造在U-200和U-1000 (包括这些下界和上界)之间的强度保持快速作用的胰岛素类似物，来提高快速作用的胰岛素类似物制剂的治疗和社会益处。如果新型的可溶性胰岛素类似物相对于野生型人胰岛素表现出对1型IGF受体的较弱的亲和力，则会获得额外的益处。如果浓缩的胰岛素类似物制剂可以在开发以监测胰岛素-刺激的人癌细胞系增殖的测定中，和/或在开发以监测与刺激或阻止细胞增殖有关的基因表达的胰岛素-导向的变化的测定中，表现出降低的促有丝分裂性(mitogenicity)，则将产生仍额外的治疗和社会益处。
长期以来，胰岛素的施用已被确立为对糖尿病的一种治疗。在具有糖尿病的患者中，常规胰岛素替代疗法的一个主要目标是严格控制血液葡萄糖浓度，以防止其在健康人类受试者特征性的正常范围以上或以下的漂移。在正常范围以下的漂移与立即的肾上腺素能或神经性低血糖症状(其在严重发作时导致抽搐、昏迷和死亡)有关。正常范围以上的漂移与增加的微血管疾病(包括视网膜病变、失明、和肾衰竭)的长期风险有关。
胰岛素是一种小的球形蛋白，其在脊椎动物的新陈代谢中起着核心作用。该激素作为Zn2+-稳定的六聚体被储存在胰腺β-细胞中，但在血流中作为不含Zn2+-的单体起作用。胰岛素是单链前体胰岛素原(其中连接区域(35个残基)将B链的C-端残基(残基B30)连接至A链的N-端残基)的产物。各种证据表明，它由胰岛素样核心和无序连接肽组成。三种特殊的二硫桥(A6–A11、A7–B7和A20–B19)的形成与粗面内质网(ER)中胰岛素原的氧化折叠相关。胰岛素原在反式高尔基体网络途径(trans-Golgi network en route)中转化为胰岛素，在胰腺β-细胞内的葡萄糖-调节分泌颗粒中作为锌胰岛素六聚体储存。
图2是本领域已知的膳食(快速作用)胰岛素类似物的设计所依据的药代动力学原理的示意图。尽管在皮下贮库中，胰岛素六聚体(左上)太大，无法有效地渗透进入毛细血管(底部)，但更快的吸收是由胰岛素二聚体(中上部)和胰岛素单体(右上)介导的。膳食胰岛素产品Humalog®和Novolog®含有胰岛素类似物(分别为赖脯胰岛素(lispro)和门冬胰岛素(aspart))，其氨基酸取代位于或接近锌胰岛素六聚体的二聚化表面，从而加快了其去组装速率；膳食胰岛素产品Apidra® (谷赖胰岛素(deglulisine))被配制为无锌寡聚体(作为偶合平衡)，其同样在贮库中表现出快速的去组装速率。本发明的胰岛素类似物提供分离的胰岛素单体和弱缔合二聚体，其增强的稳定性使得能够在没有锌介导的组装或无锌的高阶组装的情况下配制。左上的六聚体描绘了T3Rf 3锌六聚体，其中A链以浅灰色显示，且B链以深灰色显示；三个结合的酚类配体显示为CPK模型(成对的卵形)。中间的二聚体描绘无锌的T2二聚体，其中A链以深灰色显示，且B链以浅灰色(残基B1-B23和B29-B30)或中等灰色(B24-B28；反平行β-折叠)显示；二聚体相关的链间氢键以虚线显示。右上显示一组晶体原聚体(T、R和Rf)，其中A链以深灰色显示，且B链以中等灰色(B1-B9)和浅灰色(B10-B30)显示。
胰岛素类似物制剂在皮下注射后的快速作用，可反映一旦胰岛素受体在靶组织内接合，则从皮下贮库吸收蛋白的药代动力学特性和/或胰岛素类似物的药效动力学特性。本发明的胰岛素类似物制剂内的氨基酸取代可采用这些机制中的一种或两种。
本领域已知位置B28和/或B29的取代损害无锌胰岛素二聚化的强度和锌胰岛素类似物六聚体的稳定性。然而，用LysB28-ProB29取代野生型残基ProB28-LysB29(赖脯胰岛素，Humalog®在锌-稳定的制剂中的活性组分)和用Asp取代ProB28(门冬胰岛素，Novolog®在锌-稳定的制剂中的活性组分)损害了胰岛素的热力学稳定性、化学稳定性和物理稳定性，表明胰岛素中的氨基酸取代通常赋予有利和不利的特性之间的权衡。用Glu取代LysB29(赖谷胰岛素(glulisine)中的两个取代之一，Apidra®的活性组分)且保留野生型ProB28对二聚化或六聚体稳定性的影响更有限，但允许在中性pH下在无锌溶液中稳定制剂。尽管存在胰岛素作用的缩尾的潜在药效动力学优势，但这样的取代可能引起蛋白设计中的权衡，因为引入的氨基酸残基在难以预测的程度上损害胰岛素的稳定性或受体结合亲和力。
医学和社会上需要在可溶性制剂中的、在中性pH、在U-200到U-1000范围(包括这些上下值)内的强度的快速作用的胰岛素类似物或甚至超快速作用的胰岛素类似物。长期以来，野生型胰岛素的复杂的自缔合特性对这样的产品构成了障碍，所述野生型胰岛素在中性pH可以形成单体、二聚体、三聚体、四聚体、六聚体、十二聚体和高阶物质的浓度依赖性分布。本领域已知的传统胰岛素制剂通常利用标称蛋白浓度(以单体单位计)为0.6 mM (稀释后更低)的锌胰岛素六聚体的优势，其天然自组装并通过锌离子稳定并保护激素免受物理和化学降解。浓缩野生型胰岛素六聚体高于该蛋白浓度导致进行性的六聚体-六聚体相互作用；这种自缔合的进一步水平与注射的胰岛素从皮下贮库的延迟吸收有关，进而导致药代动力学和药效动力学的延长。目前膳食胰岛素类似物产品(Humalog®、Novolog®和Apidra®)的浓度高于约2 mM (以单体单位计)时，它们发生类似的延长。
为了克服这一障碍，本发明人设想了朝向工程改造具有增加强度的快速作用胰岛素类似物制剂的新型途径。第一种方法是设计超稳定的胰岛素单体，其在蛋白浓度高达3-8mM时的二聚化和高阶自组装不会对皮下贮库中的蛋白去组装施加动力障碍。在这种方法中，单个胰岛素类似物分子的加强的内在稳定性，将使其锌介导的六聚体组装对于稳定的制剂是不必要的，即根据美国食品和药品管理局(U.S. Food & Drug Administration)关于化学降解、聚合和纤维化的指南。在没有锌配位的情况下，胰岛素自组装和去组装的时间尺度明显快于锌配位存在的情况下；通常用于标准药物制剂中的锌离子和防腐剂的组合(作为赋形剂的这种组合)进一步放大了差异，这产生了“R6”型六聚体，其在这样的制剂中形成的构象平衡中的寿命非常长。本发明的一个特征是这样的类似物在每分子基础上保持野生型胰岛素的生物活性的至少20%。
本领域已知表现出在不存在锌离子的情况下增强的内在稳定性和减少的超出二聚体的自组装的胰岛素类似物由AspB10-胰岛素提供。野生型残基(HisB10)在天然的六聚体组装中起着配位六聚体的中心轴中的两个轴向锌离子的作用。用Asp取代HisB10损害锌离子在这个轴向模式下的结合，并阻止经由经典六聚体的三聚体相关表面的高阶自组装。根据一般理由，可期望AspB10通过静电机制增强无锌单体或二聚体中的中心B-链α-螺旋的区段稳定性：作为有利的C-Cap残基，并通过(i, i+4)盐桥(与GluB14)的潜在形成。与蛋白稳定性的理论基础无关，确实观察到用Asp取代HisB10增强无锌胰岛素单体的热力学稳定性，如通过化学-变性研究探测到的那样。AspB10还增强了胰岛素对胰岛素受体的亲和力，并且平行地增强了其在分离的脂肪细胞中刺激脂肪生成的效力。尽管通过在野生型胰岛素中用Asp取代HisB10而赋予了上述有利的特性，但是其临床使用通过以下排除：在肿瘤细胞系(包括来源于人乳腺癌的细胞系)的细胞培养测定中增加的促有丝分裂性，以及通过AspB10-胰岛素相对于野生型胰岛素的长期治疗Sprague-Dawley大鼠后发现的乳腺肿瘤的过度发病率。本发明排除使用AspB10作为稳定取代物，因为它与Sprague-Dawley大鼠的致癌作用存在不利的相关。本发明还排除了本领域已知提高球形蛋白或非极性肽界面(例如氟化脂肪族或芳香族侧链)的热力学稳定性的人工氨基酸，因为这样的非天然氨基酸与制造成本升高以及意欲长期用于患者或人类受试者中的医疗产品中的未知毒性有关。
发明简述
因此，本发明的一个方面是提供一种胰岛素类似物，其在无锌溶液中具有增强的热力学稳定性，同时表现出降低的自缔合，特别是在更高的浓度下，例如大于0.6 mM的浓度下，同时在纳摩尔的基础上维持野生型人胰岛素的生物效力的至少20%。本发明的另一个方面是胰岛素类似物没有表现出增强的促有丝分裂性。另一个方面是胰岛素类似物可以被设计为表现出足够的无锌稳定性，从而赋予对化学降解的抗性和对物理降解的抗性，并且因此使得能够开发以U-100到U-300和在一些情况下高达U-500的强度在皮下注射后快速作用的药物制剂。还有的另一方面是，可以在不存在癌症相关的AspB10取代和在不存在人工氨基酸的情况下，获得这样的稳定性。不需要锌离子，而且这些类似物的内在稳定性增强，将使得广泛范围的赋形剂是可行的，包括增强注射的胰岛素类似物从皮下贮库吸收到血流中的赋形剂。进一步的设想是，目前的稳定要素的组合赋予了足够的稳定性，以便允许在位点处额外并入取代，所述取代被设计为一旦接合胰岛素受体就缩短胰岛素信号传导的持续时间。发明人设想了本发明的产品将不成比例地有益于通过胰岛素泵进行持续皮下输注治疗的患者，并可进一步使得这样的泵能够小型化。
因此，本发明的类似物由两条多肽链组成，所述多肽链含有新型的氨基酸取代的组合，使得该类似物表现出：(i)在无锌溶液中增强的热力学稳定性；(ii)在蛋白浓度大于0.6 mM时降低的自缔合能力，和(iii)在糖尿病大鼠中，其生物效力(基于纳摩尔)为野生型人胰岛素生物效力的至少20%。为此目的，本发明的类似物包含以下的新型组合：(i)稳定取代(在位置A8、A14和/或B29)，(ii)增强物理稳定性的修饰(N-端B-链缺失一个、两个或三个残基)，任选地(iii)在B链的N端附近和/或在A21位置的取代，其增强化学稳定性；和另外，任选地(iv)胰岛素的“位点2”-相关表面(位置B13、B17、B18、A12、A13、A14和/或A17)处或其附近的取代，被设计为一旦接合胰岛素受体就缩短信号传导的持续时间。后一种取代可能是稳定的或去稳定的，使得取代和修饰的组合提供了一种类似物，其热力学稳定性大于WT胰岛素的稳定性。本发明的类似物可任选地含有B链的一个或两个残基延伸(残基B31和B32)。特别排除的是非天然氨基酸和促有丝分裂的取代AspB10。
据设想，本发明可以这样的形式提供医疗益处：优化可溶性胰岛素类似物制剂的药代动力学特性，使得在U-200到U-1000范围内的强度(即为常规的U-100胰岛素产品2至10倍)的制剂中，保持快速作用起效(在该命名法中，“U-X”表示X国际单位/ml溶液或悬浮液)。
本发明人设想了本发明的胰岛素类似物和制剂将具有在糖尿病的治疗中的用途。因此，本发明的一个方面是，含有氨基酸取代和/或N-端B-链缺失的组合的类似物(如本文提出的)，其能够实现在蛋白浓度范围为0.6-6.0 mM的中性pH的无锌溶液中的其稳定制剂，使得在糖尿病的动物模型中皮下注射后保持“快速作用” - “快速作用”由蛋白浓度为0.6mM (即，如在标准的U-100胰岛素产品中)的Humalog®或Apidra®在同一动物模型中在皮下注射后的参考药效动力学曲线定义。本发明的一个额外方面是，在不存在锌离子或其他二价金属离子的情况下，所述类似物在中性pH的溶液中溶解时，表现出等于或大于赖脯胰岛素或谷赖胰岛素(分别为Humalog®或Apidra®的活性组分)的热力学稳定性、化学稳定性和物理稳定性。本发明的另一个方面是，所述类似物在人乳腺癌细胞系的组织培养测定中表现出促有丝分裂性，并且还介导细胞增殖相关的细胞周期蛋白-D1基因的转录激活，其在每种情况下都等于或小于赖脯胰岛素(KP-胰岛素)。本发明的又另一个方面是提供一种重组制造胰岛素类似物的方法，所述胰岛素类似物含有残基B1、B1-B2或B1-B3的N-端缺失，任选地与相邻位置的阻止它们的化学降解的取代结合。
一般来说，本发明提供了各自含有多种修饰(但不包括位置B10的取代和不并入非天然氨基酸)的胰岛素类似物，所述修饰在0.6-6 mM范围内的广泛范围的蛋白浓度下一起赋予快速作用，并且在不存在锌离子或其他二价金属离子的情况下，一起与稳定的药物制剂相容。取代位于以下位置中的一个或多个：A8、A14、A17、B2、B3、B28和/或B29。所述类似物可任选地包含B链的N-端缺失(直到并包括B3)，以及在新的N-端处或附近的减轻化学降解的取代。因此，本发明涉及一类新的胰岛素类似物，其含有修饰的组合，所述修饰一起提供了组成修饰中的任一种不能赋予的长期寻找的临床优势。在本发明的另一个版本中，残基B30是不存在的。在又另一个实施方案中，本发明的类似物可含有在位置A21的甘氨酸、丙氨酸或天冬氨酸。
附图简述
图1A是人胰岛素原的序列(SEQ ID NO: 1)的示意图，所述人胰岛素原包括A-和B-链以及显示有侧翼二碱性裂解位点(实心圆)和C-肽(空心圆)的连接区。
图1B是胰岛素原的结构模型，所述胰岛素原由胰岛素样部分和无序连接肽(虚线)组成。
图1C是人胰岛素序列的示意图，其指示B-链中残基B27和B30的位置。顶部链是胰岛素A-链(SEQ ID NO: 2)且底部链是胰岛素B-链(SEQ ID NO: 3)。
图2是本领域已知的膳食(快速作用)胰岛素类似物的示意图，所述胰岛素类似物包括胰岛素六聚体(左上)，胰岛素二聚体(中上)和胰岛素单体(右上)，以及这些形式的每一种有效渗透到毛细血管的能力的描述(底部)。
图3是柱状图，其显示了本发明的胰岛素类似物的几个实施方案和赖脯胰岛素的每微克胰岛素类似物的血液葡萄糖下降(以mg/dL计)。
图4是柱状图，其提供了野生型人胰岛素(HI)、赖脯胰岛素(lispro)、AspB10-赖脯胰岛素(DB10, KP)；和EA8、EA14、RA17 des B1、des B30胰岛素(T-0688)的ΔGu值的比较。
图5是柱状图，其提供了本发明的胰岛素类似物的实施方案在45℃持续7天的高分子量蛋白(HMWP)的百分比的变化，如由反相HPLC所测定的。所有的实验样品都是无锌配制的。
图6是柱状图，其提供了在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，在pH 7.4、40℃下，在1000cpm的恒定摇动下，本发明的胰岛素类似物的实施方案的纤维化滞后时间，以及赖脯胰岛素的纤维化滞后时间。所有的实验样品都是无锌配制的。
图7是柱状图，其提供了相对于赖脯胰岛素，本发明的胰岛素类似物的实施方案与人1型胰岛素-样生长因子受体(hIGFR)的结合亲和力。相对亲和力定义为由结合的125I-标记的人胰岛素的竞争置换测定的解离常数的比率。所有的实验样品都是无锌配制的。
图8是柱状图，其提供了利用具有胰岛素受体的高表达的大鼠成肌细胞细胞系(L6)作为细胞模型的细胞周期蛋白D1 mRNA积聚的变化。所有的实验样品都是无锌配制的。
发明详述
本发明涉及一种胰岛素类似物，其提供在每分子基础上增强的体内生物效力，在广泛范围的蛋白浓度和制剂强度(通常从U-100到U-500，并任选地高达U-1000)下快速作用，具有相对于野生型人胰岛素的亲和力在5-100%范围内的绝对亲和力的IR-A/IR-B受体-结合亲和力(选择的下限与原胰岛素相对应)，对IGF-1R的亲和力不大于赖脯胰岛素的亲和力，和在不存在锌离子的情况下的热力学稳定性等于或大于人赖脯胰岛素的在不存在锌离子的情况下的热力学稳定性。
上述特征的组合是由A-和B链内的取代、任选地与B链的N-端缺失和任选地des-ThrB30的新型组合所赋予的。A-和B链取代分为5类：(i) 位点-相关位置(B13、B17、B18、A12、A13、A14和/或A17)的取代；(ii) 在位置A8的非-β-支链取代；(iii) 含有极性、带电或小于天然酪氨酸的侧链的在位置A14的生螺旋取代(helicogenic substitution)；(iv) 在位置B28和/或B29的如本领域已知减少胰岛素的二聚化或增强其在中性pH的溶解度的取代；和(v) B链的N端附近的取代与N-端缺失结合。这些取代中的一些可能在分离的情况下增加野生型胰岛素的稳定性，而其他在分离的情况下可能损害野生型胰岛素的稳定性。同样地，这些取代中的一些可能在分离的情况下延伸胰岛素作用的尾部(静脉内推注后)，而其他可能在分离的情况下减轻或缩短该尾部。本发明的一个方面提供了这样的取代、任选地与B链的N-端缺失结合的组合，其一起提供了一种胰岛素类似物，其制剂在0.6-6.0 mM范围内的广泛范围的蛋白浓度下保持皮下注射后的快速作用，并表现出足够的物理和化学稳定性，以对于治疗糖尿病是可行的。
A1-A8 α-螺旋的C-CAP残基的优化. 在位置A8的苏氨酸β-支化侧链违反了基于肽的oc-螺旋倾向和C-CAP电位规则。ThrA8接近但不在胰岛素的经典受体结合表面内，如结合到受体胞外域的片段的胰岛素的共晶体结构中所定义的。本领域已知在野生型胰岛素和赖脯胰岛素的背景下，在这个位置的非-β-支化取代稳定胰岛素分子，但它们的功能相容性和对含有位点-2相关取代的胰岛素类似物的生物物理效应尚不清楚且难以预测，因为球形蛋白中的C-CAP取代的影响一般是背景依赖性的。
A12-A18 α–螺旋的表面的优化. 胰岛素单体的结构的一种不寻常的特征是A12-A18 oc-螺旋的表面上位置A14的酪氨酸的超暴露。该侧链的构象在晶体结构间是可变的，并在1H-NMR研究中在不同的溶液条件下表现出运动变窄。这样的暴露的大型非极性侧链被具有类似的螺旋倾向的较小(例如丙氨酸)、极性(例如谷氨酰胺)或带电(例如谷氨酸或精氨酸)的侧链取代，可能通过减轻反向疏水效应来增强整体稳定性，但是与上述C-CAP电位一样，这种效应是背景依赖性的并且在幅度上高度可变。对反向疏水效应的实例描述太少，以致无法预测A14取代对胰岛素稳定性的影响。
B链的N-端3个残基表现出可变或无序的构象。虽然本领域已知缺失胰岛素B链的残基B1、B1-B2或B1-B3并不损害胰岛素的活性或其激素与胰岛素受体的结合，但该“臂”有助于哺乳动物细胞内胰岛素原的新生折叠效率。虽然这样的缺失不改变溶液中成熟的无锌激素的热力学稳定性，但这样的缺失消除了非极性侧链(在位置B1的苯丙氨酸和位置B2的缬氨酸)的溶剂暴露，并且所以可降低蛋白经历非自然聚集的趋势，延长了物理稳定性。由于这样的缺失可增强新的N端处或附近的残基的化学降解，所以残基B1、B1-B2或B1-B3的缺失可任选地与旨在减轻在中性pH溶液中这样的化学降解的邻近氨基酸取代组合。此外，不希望受到理论的约束，发明人进一步设想，位点-2-相关的取代和GluB29的累加性或非累加性效应减弱这样的类似物与胰岛素受体结合后的促有丝分裂信号传导，并与减少的与促有丝分裂1型IGF受体的结合有关。
本发明的一个方面是，从皮下贮库的快速吸收动力学可以由一种胰岛素类似物产生，所述胰岛素类似物在蛋白浓度为0.6-6.0 mM (如相对于正式单体浓度计算)的中性pH的无锌溶液中是单体、二聚体、三聚体、四聚体或六聚体的 - 但不是自组装的高阶状态。在不存在锌离子或其他二价金属离子的情况下，这样的天然自缔合的特征是自组装状态中的快速交换(即解离速率常数，其使得组分二聚体、三聚体、四聚体和六聚体的寿命，在它们平衡存在的程度上，小于1秒)。这种快速交换与锌-稳定的胰岛素六聚体中观察到的数小时的寿命形成对比。常规膳食产品，如本领域已知的，代表了自组装状态(包括锌稳定的六聚体或由潜在的六聚体-六聚体相互作用扩展的锌离子非依赖性的六聚体)之间可能的耦合平衡的连续区(continuum)。这种策略的分子实施提供了一类新的胰岛素类似物：其(i)相对于赖脯胰岛素，作为无锌单体和二聚体是稳定或更稳定的；和(ii)在每分子或每纳摩尔基础上，保留野生型人胰岛素的至少部分生物效力(如通过激素调节的血液葡萄糖浓度的降低来评估)。本发明的一个特征是，保留的与血糖控制相关的效力与不高于赖脯胰岛素的促有丝分裂性相关。对本发明的许多类似物来说，促有丝分裂性相对于野生型胰岛素降低，这种降低是从癌症风险和癌症生长的角度来看不期望的独特信号传导通路的生物学后果。
还设想了胰岛素类似物可以用从动物胰岛素(通过非限制性的例子，例如猪、牛、马和犬科动物胰岛素)衍生的A-和B链序列制得，只要在位置B10不存在取代，并且不使用非天然的氨基酸。从人胰岛素或动物胰岛素衍生的这样的变体B链可任选地缺乏ThrB30 (des-B30)或含有C-端二肽延伸(具有指定为B31和B32的相应的残基位置)，其中这些C-端延伸残基中的至少一个是酸性氨基酸。另外或在替代方案中，本发明的胰岛素类似物可含有残基B1、B1-B2或B1-B3的缺失；或可与缺失位置B28的脯氨酸的变体B链组合(例如，LysB28、AlaB28或GlnB28与在位置B29的谷氨酸组合)。
还设想了本发明的胰岛素类似物可从巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisciae)或其他酵母表达物种或菌株中的酵母生物合成中的前体多肽的Lys-引导的蛋白水解而衍生得到。这样的菌株可以工程改造以在位置B1、B2或B3处编码赖氨酸，以便使得能够发酵后加工含有N-端B-链延伸的前体，使得产生分别缺少残基B1、B1-B2或B1-B3的类似物。新的N-端残基可任选地由谷氨酸或丙氨酸取代。因此，des-B1类似物的变体B链可开始于N-端缬氨酸(野生型胰岛素中的天然B2残基)、丙氨酸或谷氨酸和任选在第二位置的丙氨酸或谷氨酸；des-[B1-B2]类似物的变体B链可同样地开始于在第一位置的N-端天冬酰胺(野生型胰岛素中的天然B2残基)、丙氨酸或谷氨酸和任选在第二位置的丙氨酸或谷氨酸；des-[B1-B3]类似物的变体B链可同样地开始于N-端谷氨酰胺(野生型胰岛素中的天然B3残基)、丙氨酸或谷氨酸。在变体B链的新N端处或与其附近的这样的取代旨在避免野生型位置B3的天冬酰胺和野生型位置B4的谷氨酰胺的化学降解。这种谷氨酸的取代也会增加胰岛素类似物在中性pH下的净负电荷，这将预期增强其在中性pH下的溶解度。
此外，鉴于人与动物胰岛素之间的相似性，以及过去在具有糖尿病的人患者中使用动物胰岛素，还设想在胰岛素序列中可引入其他小的修饰，特别是那些被认为是“保守”的取代。例如，在不偏离本发明的情况下，可以在具有类似侧链的氨基酸组中进行额外的氨基酸取代。这些包括中性疏水性氨基酸：丙氨酸(Ala或A)、缬氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、异亮氨酸(Ile或I)、脯氨酸(Pro或P)、色氨酸(Trp或W)、苯丙氨酸(Phe或F)和甲硫氨酸(Met或M)。同样，中性极性氨基酸可在其甘氨酸(Gly或G)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、酪氨酸(Tyr或Y)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Glu或Q)和天冬酰胺(Asn或N)的组中相互取代。酸性氨基酸是天冬氨酸(Asp或D)和谷氨酸(Glu或E)。为了保持这类类似物的增强的净负电荷，引入碱性氨基酸取代(包括赖氨酸(Lys或K)、精氨酸(Arg或R)和组氨酸(His或H))不是优选的。除非另有说明或从上下文中明显看出，否则此处注明的氨基酸应视为L-氨基酸。标准的氨基酸也可以被属于相同化学类别的非标准氨基酸取代。
为了比较的目的，提供作为SEQ ID NO: 1的人胰岛素原的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 1 (人胰岛素原)
提供作为SEQ ID NO: 2的人胰岛素A链的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 2 (人A链；残基位置A1-A21)
提供作为SEQ ID NO: 3的人胰岛素B链的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 3 (人B链；残基位置B1-B30)
本发明的修饰的胰岛素的氨基酸序列以SEQ ID NO 4和SEQ ID NO: 5的一般形式给出，其中6个半胱氨酸残基被配对，以提供3个二硫桥，如同野生型人胰岛素中一样。
SEQ ID NO: 4
A链
SEQ ID NO: 5
B链
其中Xaa1 (位置A8)可以是Thr (如同在野生型胰岛素中)、His、Glu或任何其他非-β-支链氨基酸；其中Xaa2可以是Ser (如同在野生型胰岛素中)、Ala、Asp、Glu或His；其中Xaa3可以是Leu (如同在野生型胰岛素中)、Ala、Glu、His、Phe、Tyr或Trp；其中Xaa4可以是Tyr(如同在野生型胰岛素中)、Ala、Glu、Gln、His或Leu；其中Xaa5可以是Glu (如同在野生型胰岛素中)、Ala、Arg、Gln、His、Leu、Phe或Tyr；其中Xaa6可以是Asn (如同在野生型胰岛素中)、Ala、Gly或Glu；其中Xaa7-Xaa8-Xaa9可以是如在野生型人胰岛素中的Phe-Val-Asn或N-端缺失的变体Val-Asn (des-B1；无残基Xaa7)、Asn (des-B1,B2；无残基Xaa7和无残基Xaa8)或省略的(des-B1-B3；无残基Xaa7、无残基Xaa8和无残基Xaa9)，或任选相应的des-B1变体(开始于Ala-Asn、Glu-Asn、Ala-Ala、Ala-Glu或Glu-Glu)，des-B1,B2变体(开始于Asn-Glu、Asn-Ala、Ala-Asn、Glu-Asn、Ala-Ala、Ala-Glu、Glu-Ala或Glu-Glu)，或des-B1-B3变体(开始于Ala-His或Glu-His)；其中Xaa10可以是Gln (如同在野生型胰岛素中)、Ala或Glu；其中Xaa11可以是Glu (如同在野生型胰岛素中)、Ala、Gln、His或Leu；其中Xaa12可以是Leu (如同在野生型胰岛素中)、Ala、Arg、Glu、His、Lys、Phe、Trp、Tyr或Val；其中Xaa13可以是Val(如同在野生型胰岛素中)、Ala、His、Leu、Lys、Glu、Phe、Thr、Trp或Tyr；其中Xaa14可以是Pro(如同在野生型胰岛素中)、Ala、Arg、Glu或Lys；其中Xaa15可以是Lys (如同在野生型胰岛素中)、Ala、Arg、Glu，或Pro；且其中任选地Xaa16-Xaa17提供B链的C-端单肽或二肽延伸，以使至少一个残基是酸性侧链(Asp或Glu)。本发明的类似物可缺失C-端延伸Xaa16-Xaa17，并且还缺失在位置B30的ThrB30 (或任何其他氨基酸)。
因此，本发明的类似物可任选地含有如在SEQ ID NO: 6-26中指明的B链的N-端缺失(des-B1、des-B1, B2或des-B1-B3)。这些N-端残基并不是受体结合所必需的，但它们在生物合成单链前体中的存在被认为增强内质网中天然二硫化物配对的效率，且因此增强产量。通过非限制性实例，下面的序列举例说明了含有N-端缺失的变体B链。
根据本发明的特定A-链和B-链序列的例子包括SEQ ID NO: 6-104。
SEQ ID NO 6: GluB28-胰岛素的des-(B1)衍生物
SEQ ID NO 7: GluB28-胰岛素的des-(B1, B2)衍生物
SEQ ID NO 8: GluB28-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物
SEQ ID NO 9: AspB28-胰岛素的des-(B1)衍生物
SEQ ID NO 10: AspB28-胰岛素的des-(B1, B2)衍生物
SEQ ID NO 11: AspB28-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物
SEQ ID NO 12: (LysB28, ProB29)-胰岛素的des-(B1)衍生物
SEQ ID NO 13: (LysB28, ProB29)-胰岛素的des-(B1, B2)衍生物
SEQ ID NO 14: (LysB28, ProB29)-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物
SEQ ID NO 15: (AlaB28)-胰岛素的des-(B1)衍生物
SEQ ID NO 16: (AlaB28)-胰岛素的des-(B1, B2)衍生物
SEQ ID NO 17: (AlaB28)-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物
SEQ ID NO 18: (GluB28, ProB29)-胰岛素的des-(B1)衍生物
SEQ ID NO 19: (GluB28, ProB29)-胰岛素的des-(B1, B2)衍生物
SEQ ID NO 20: (GluB28, ProB29)-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物
SEQ ID NO 21: (AlaB28, ProB29)-胰岛素的des-(B1)衍生物
SEQ ID NO 22: (AlaB28, ProB29)-胰岛素的des-(B1, B2)衍生物
SEQ ID NO 23: (AlaB28, ProB29)-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物
本发明含有具有上述N-端缺失的变体B链的胰岛素类似物也可含有在新的N端或其附近的氨基酸取代，如以下作为非限制性实例的序列中所例示。
SEQ ID NO 24: GluB28-胰岛素的des-(B1)衍生物，其中变体B链开始于Ala-Asn、Glu-Asn、Val-Ala、Val-Glu、Glu-Ala或Glu-Glu。
SEQ ID NO 25: GluB28-胰岛素的des-(B1,B2)衍生物，其中变体B链开始于Asn-Glu、Asn-Ala、Ala-Gln、Glu-Gln、Ala-Glu、Glu-Glu或Glu-Ala。
SEQ ID NO 26: GluB28-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物，其中新的N-端残基是Ala或Glu。
SEQ ID NO 27: AspB28-胰岛素的des-(B1)衍生物，其中变体B链开始于Ala-Asn、Glu-Asn、Val-Ala、Val-Glu、Glu-Ala或Glu-Glu。
SEQ ID NO 28: AspB28-胰岛素的des-(B1,B2)衍生物，其中变体B链开始于Asn-Glu、Asn-Ala、Ala-Gln、Glu-Gln、Ala-Glu、Glu-Glu或Glu-Ala。
SEQ ID NO 29: AspB28-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物，其中新的N-端残基是Ala或Glu。
SEQ ID NO 30: (LysB28, ProB29)-胰岛素的des-(B1)衍生物，其中变体B链开始于Ala-Asn、Glu-Asn、Val-Ala、Val-Glu、Glu-Ala或Glu-Glu。
SEQ ID NO 31: (LysB28, ProB29)-胰岛素的des-(B1,B2)衍生物，其中变体B链开始于Asn-Glu、Asn-Ala、Ala-Gln、Glu-Gln、Ala-Glu、Glu-Glu或Glu-Ala。
SEQ ID NO 32: (LysB28, ProB29)-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物，其中新的N-端残基是Ala或Glu。
SEQ ID NO 33: (GluB28)-胰岛素的des-(B1)衍生物，其中变体B链开始于Ala-Asn、Glu-Asn、Val-Ala、Val-Glu、Glu-Ala或Glu-Glu。
SEQ ID NO 34: (AlaB28)-胰岛素的des-(B1,B2)衍生物，其中变体B链开始于Asn-Glu、Asn-Ala、Ala-Gln、Glu-Gln、Ala-Glu、Glu-Glu或Glu-Ala。
SEQ ID NO 35: (AlaB28)-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物，其中新的N-端残基是Ala或Glu。
SEQ ID NO 36: (GluB28, ProB29)-胰岛素的des-(B1)衍生物，其中变体B链开始于Ala-Asn、Glu-Asn、Val-Ala、Val-Glu、Glu-Ala或Glu-Glu。
SEQ ID NO 37: (GluB28, ProB29)-胰岛素的des-(B1, B2)衍生物，其中变体B链开始于Asn-Glu、Asn-Ala、Ala-Gln、Glu-Gln、Ala-Glu、Glu-Glu或Glu-Ala。
SEQ ID NO 38: (GluB28, ProB29)-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物，其中新的N-端残基是Ala或Glu。
SEQ ID NO 39: (AlaB28, ProB29)-胰岛素的des-(B1)衍生物，其中变体B链开始于Ala-Asn、Glu-Asn、Val-Ala、Val-Glu、Glu-Ala或Glu-Glu。
SEQ ID NO 40: (AlaB28, ProB29)-胰岛素的des-(B1,B2)衍生物，其中变体B链开始于Asn-Glu、Asn-Ala、Ala-Gln、Glu-Gln、Ala-Glu、Glu-Glu或Glu-Ala。
SEQ ID NO 41: (AlaB28, ProB29)-胰岛素的des-(B1-B3)衍生物，其中新的N-端残基是Ala或Glu。
根据本发明的A-链和B-链多肽的更进一步例子包括以下：
下面的表1提供了已合成或设想的根据本发明的胰岛素类似物或其胰岛素原前体的例子的列表。已经测试了代表性胰岛素类似物样品的生物活性，如所示。
表1. 本发明的胰岛素类似物的例子
表2提供了一系列由质粒合成的胰岛素类似物，在所述质粒中，编码单链前体多肽的N-端前序列的5'-DNA元件含有密码子5'到编码PheB1的密码子的缺失。这些质粒构建体在以下条目中被指定为“desB(-)1”。含有“KB2”(LysB2)的那些使得能够胰蛋白酶消化以产生des-(B1, B2)类似物，而含有“KB3”(LysB3)的那些使得能够胰蛋白酶消化产生des-(B1-B3)类似物。
表2. desB(-)1胰岛素类似物
在一亚组的实例中，在用链脲佐菌素(streptozotocin)导致糖尿病的雄性Sprague-Dawley大鼠(约300 g)中进行了生物活性和药效动力学测试。在一亚组的实例中，胰岛素类似物的受体结合亲和力是相对于野生型人胰岛素测定的(数据未显示)。在凝集素-纯化和洗涤剂溶解的胰岛素受体(同种型A和B)的研究中，观察到了相对于野生型人胰岛素在5-100%范围内的值。解离常数(Kd)是通过拟合至Whittaker和Whittaker (2005. J. Biol. Chem. 280: 20932-20936)描述的数学模型来确定的；该模型采用了具有异源竞争假设的非线性回归(Wang, 1995, FEBS Lett. 360: 111-114)。
对一亚组胰岛素类似物，测试在向STZ大鼠的尾静脉中IV推注后，胰岛素作用的尾部的缩短。对每300克大鼠的类似物剂量(以微克计)相对于赖脯胰岛素进行了调整，使得观察到类似的低谷(即血液葡萄糖浓度的最大下降)。虽然一般来说，要达到类似的血糖控制，需要比赖脯胰岛素的量更多量的类似物，但两者之间的差别绝不超过5倍。观察到六种本发明的类似物表现出尾部的缩短(定义为曲线上的面积，且相对于0-300分钟之间曲线上的总面积而言，在90-300分钟之间小于缓冲对照)。这些是：des-B1、GluA8、GluA14、ArgA17、des-B30-胰岛素(T-0688)，des-B1、GluB2、HisA8、GluA14、GlnA17、des-B30-胰岛素(T-0695)，des-[B1, B2]、GluB3、HisA8、GluA14、GlnA17、des-B30-胰岛素-胰岛素(T-0706)，des-B1、AlaB2、HisA8、GluA14、GlnA17、des-B30-胰岛素(T-0715)，des-B1、AlaB2、GluA8、GluA14、GlnA17、des-B30胰岛素(T-0719)，和des-B1、AlaB2、GluB29、HisA8、GluA14、GlnA17-胰岛素(T-0737)。
在雄性糖尿病Lewis大鼠中评价了这些类似物的效力。实验类似物、赖脯胰岛素和仅有稀释剂的对照溶液经皮下注射，并通过使用临床血糖仪的连续测量来监测所得的血液葡萄糖(BG)变化。剂量响应经计算为超过稀释剂对照的最大BG下降并绘制。使用迭代加权拟合Langmuir等温线，以计算最佳拟合剂量响应曲线，并确定EC50作为实现在拟合最大和最小下降之间的半程下降(drop half way)所需的内插剂量。所有的实验类似物都被配制为不含锌的。结果在图3中提供。每种测试的类似物具有赖脯胰岛素的效力的至少2/3的效力。三种类似物，显示其效力等于或大于赖脯胰岛素、des-B1、GluA8、GluA14、ArgA17、des-B30-胰岛素(T-0688)，des-[B1, B2]、GluB3、HisA8、GluA14、GlnA17、des-B30-胰岛素-胰岛素(T-0706)，和des-B1、AlaB2、GluA8、GluA14、GlnA17、des-B30胰岛素(T-0719)。
热力学稳定性. 在一亚组的实例中，通过CD-监测的胍变性对胰岛素类似物的热力学稳定性进行了探测。该方法如所述(Hua, Q.X., 等人 J. Biol. Chem. 283, 14703-16 (2008))。简单地说，于25℃、pH 7.4，通过圆二色谱(CD)-检测的胍变性测量解折叠的自由能变化(ΔGu)。结果表明，与赖脯胰岛素(其在25℃的解折叠的自由能(ΔGu)为2.9±0.1kcal/摩尔)相比，这些类似物各自对化学变性是稳定的(且实际上更稳定)。选择的类似物的结果在下表3中给出。表3中提供的在25℃的ΔGu的估计值是通过应用外推到零变性浓度的类似的两态模型而得到的。这样的更高的ΔGu值预测了在无锌条件下，本发明的胰岛素类似物对化学降解的抗性比在相同条件下野生型胰岛素或KP-胰岛素的研究中所观察到的增强。
在图4中提供了人类胰岛素(HI)、赖脯胰岛素(lispro)、AspB10-KP胰岛素(DB10KP)和根据本发明的EA8 EA14 RA17 des B1 des B30胰岛素的类似比较的解折叠自由能值的变化的图示。于25℃、pH 7.4，通过圆二色谱(CD)-检测的胍变性测量解折叠的自由能变化(ΔGu)。实验类似物被配制为不含锌的。稳定性增强为至少1 kcal/摩尔，达到与AspB10-胰岛素相似或比AspB10-胰岛素更大的ΔGu值，所述AspB10-胰岛素是本领域已知具有足够的稳定性、使得能够实现有效的无锌制剂的一种类似物。这些数据表明，可以使无锌胰岛素类似物像AspB10-胰岛素一样稳定，而在位置B10不使用非天然的氨基酸取代而具有天然组氨酸。
表3. 选择的胰岛素类似物的热力学稳定性
物理稳定性–高分子量蛋白形成. 通过分析高分子量蛋白的形成，还测试了要求保护的本发明的类似物的稳定性。几种胰岛素类似物的标称U-100制剂在45℃下热应激7天，并通过反相HPLC测定高分子量蛋白(HMWP)的形成。图5显示了以下类似物的从第1天到第7天的HMWP百分比的变化：des-B1、GluA8、GluA14、ArgA17、des-B30-胰岛素(T-0688)，des-B1、GluB2、HisA8、GluA14、GlnA17、des-B30-胰岛素(T-0695)，des-[B1、B2]、GluB3、HisA8、GluA14、GlnA17、des-B30-胰岛素-胰岛素(T-0706)，des-B1、AlaB2、HisA8、GluA14、GlnA17、des-B30-胰岛素(T-0715)，des-B1、AlaB2、GluA8、GluA14、GlnA17、des-B30胰岛素(T-0719)，和des-B1、AlaB2、GluB29、HisA8、GluA14、GlnA17-胰岛素(T-0737)。所有的实验类似物都被配制为不含锌的。2%或更大的面积损失(对于胰岛素类似物的洗脱曲线)被认为是失败。要求保护的本发明的每种类似物都表现出少于2%的面积损失，和实际少于1.5%的面积损失。测试的5种类似物(T-0695、T-0706、T-0715、T-0719、T-0737)中的4种都表现出小于1%的面积损失。这样，与在无锌溶液中重新配制的赖脯胰岛素相比，经测试的无锌配制的胰岛素类似物在行为上更接近标准的Humalog® U100 (赖脯胰岛素；Eli Lilly)。
纤维形成的评价. 在含0.1%叠氮化钠的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)中，将赖脯胰岛素或要求保护的本发明的胰岛素类似物的实施方案制成60 µM，并在37℃，在液体/空气界面存在下，在玻璃小瓶中轻轻摇动。每隔一定时间取出等分试样，并冷冻用于后来的硫黄素T (ThT)荧光的分析。视觉出现浑浊时，测定结束。因此，对于ThT-阳性纤维化发作前的滞后时间的延长，测试五种类似物：des-B1、GluA8、GluA14、ArgA17、des-B30-胰岛素(T-0688)，des-B1、GluB2、HisA8、GluA14、GlnA17、des-B30-胰岛素(T-0695)，des-[B1、B2]、GluB3、HisA8、GluA14、GlnA17、des-B30-胰岛素-胰岛素(T-0706)，des-B1、AlaB2、HisA8、GluA14、GlnA17、des-B30-胰岛素(T-0715)，和des-B1、AlaB2、GluB29、HisA8、GluA14、GlnA17-胰岛素(T-0737)。尽管在多次测试后，在这些条件下，赖脯胰岛素表现出2-4天的滞后时间，但每种测试的类似物的滞后时间延长了至少10倍。
也进行了类似的测定。赖脯胰岛素或要求保护的本发明的胰岛素类似物的实施方案在含有0.1%叠氮化钠且不含锌的磷酸盐缓冲盐水(PBS, pH 7.4)中被配制为U10的最终浓度，并于37℃，在液体/空气界面存在下，在玻璃小瓶中轻轻摇动。向每种溶液中加入1 µM硫黄素T (ThT)，并将150 µl加入到各孔中。使板在40℃下孵育，伴有1000 cpm的不断的线性摇动。通过440/480 nm的激发/发射波长分析硫黄素T (ThT)荧光。图6是比较这些胰岛素类似物和赖脯胰岛素的纤维化滞后时间的图表。测试的样品为：des-B1、GluA8、GluA14、ArgA17、des-B30-胰岛素(T-0688)，des-B1、GluB2、HisA8、GluA14、GlnA17、des-B30-胰岛素(T-0695)，des-[B1, B2]、GluB3、HisA8、GluA14、GlnA17、des-B30-胰岛素-胰岛素(T-0706)，des-B1、AlaB2、HisA8、GluA14、GlnA17、des-B30-胰岛素(T-0715)，des-B1、AlaB2、GluB29、HisA8、GluA14、GlnA17-胰岛素(T-0737)和des-B1、GluA8、GluA14、GlnA17、AlaB2、des-B30-胰岛素(T-0719)。
IGF-R结合亲和力. 如上所述，减少与促有丝分裂1型IGF受体(IGF-R1)的结合将是有利的。表4和图7提供相对于赖脯胰岛素的要求保护的本发明的胰岛素类似物的几个实施方案的结合亲和力。测试的样品为：des-B1、GluA8、GluA14、ArgA17、des-B30-胰岛素(T-0688)，des-B1、GluB2、HisA8、GluA14、GlnA17、des-B30-胰岛素(T-0695)，des-[B1, B2]、GluB3、HisA8、GluA14、GlnA17、des-B30-胰岛素-胰岛素(T-0706)，des-B1、AlaB2、HisA8、GluA14、GlnA17、des-B30-胰岛素(T-0715)，des-B1、AlaB2、GluB29、HisA8、GluA14、GlnA17-胰岛素(T-0737)和des-B1、GluA8、GluA14、GlnA17、AlaB2、des-B30-胰岛素(T-0719)。研究采用了FLAG表位-标记的人1型胰岛素-样生长因子受体(hIGFR)的完整全受体，其结合至用抗-FLAG单克隆抗体包被的96孔板。相对亲和力被定义为如由结合的125I标记的人胰岛素的竞争置换所测定的解离常数的比率。所有的实验类似物都被配制为不含锌的。在这里测试的每一个要求保护的本发明的实施方案都显示出与赖脯胰岛素相比对IGF-R的26%或更低的亲和力。4种类似物，T-0688、T-0706、T-0719和T-0737，显示出低于20%的赖脯胰岛素对IGF-R1的亲和力。一种类似物，T-0719，显示出低于10%的赖脯胰岛素对IGF-R1的结合亲和力。
表4. 相对IGF-R1结合亲和力
促有丝分裂性–细胞周期蛋白调节. RT-qPCR测定监测通过不同胰岛素类似物的处理所刺激的促有丝分裂性探针的转录响应。两种细胞周期蛋白的表达调节用作主要探针。细胞周期蛋白D1上调和细胞周期蛋白G2下调与活性细胞分裂周期(增殖，其通常与促有丝分裂性相关)相关。D1/G2转录水平的比率给出化合物的促有丝分裂潜力的描述；较高的比率意味着更多的促有丝分裂潜力。在该测定中，具有胰岛素受体(IR)的高表达的大鼠成肌细胞细胞系(L6)用作细胞模型。所有的实验类似物都被配制为不含锌的。测试的样品为：des-B1、GluA8、GluA14、ArgA17、des-B30-胰岛素(T-0688)，des-B1、GluB2、HisA8、GluA14、GlnA17、des-B30-胰岛素(T-0695)，des-[B1,B2]、GluB3、HisA8、GluA14、GlnA17、des-B30-胰岛素-胰岛素(T-0706)，des-B1、AlaB2、HisA8、GluA14、GlnA17、des-B30-胰岛素(T-0715)，des-B1、AlaB2、GluB29、HisA8、GluA14、GlnA17-胰岛素(T-0737)和des-B1、GluA8、GluA14、GlnA17、AlaB2、des-B30-胰岛素(T-0719)。细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白G2的mRNA积聚，和细胞周期蛋白D1/细胞周期蛋白G2的比率与其标准偏差在表5中提供。细胞周期蛋白D1 mRNA积聚的变化在图8中提供。测试的每一个要求保护的本发明的实施方案都具有低于人胰岛素和赖脯胰岛素两者的细胞周期蛋白D1/细胞周期蛋白G2比率。
表5. 细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白G表达
由于这些类似物中的大多数在STZ大鼠中IV推注后也表现出缩短的尾部(见上文)，这些数据一起表明，原则上可以绕过权衡，以获得修饰的组合，以达到期望的治疗和药理学特性。
发明人设想了本发明的类似物，其提供用于治疗糖尿病或代谢综合征的方法。胰岛素类似物的递送途径是通过经由使用注射器或笔装置进行皮下注射。本发明的胰岛素类似物还可由于残基B1、B1-B2、B1-B3和/或B30的缺失而含有缩短的B-链。本发明的胰岛素类似物也可含有延伸一个或两个残基(正式位置B31和B32)的B链，所述残基中的至少一个是酸性残基(天冬氨酸或谷氨酸)。
一种药物组合物可以包含制剂中的这样的胰岛素类似物，所述制剂特定排除锌离子或其他二价金属离子以避免金属离子稳定的胰岛素类似物六聚体的形成。制剂的pH是在pH 7.0-8.0范围内；缓冲剂(通常是磷酸钠或Tris-盐酸盐)可能存在，或可能不存在。在这样的制剂中，胰岛素类似物的浓度通常会在0.6-6.0 mM范围内；可在小瓶或笔中使用多至6mM的浓度；更浓缩的制剂((U-200或更高浓度)在具有明显的胰岛素抵抗的患者中可特别有益。赋形剂可以包括意欲加速激素从皮下贮库吸收到血流中的试剂(例如EDTA钠或EGTA钠、精氨酸和烟酰胺)、甘油、甘氨酸、Tris-盐酸盐或其他缓冲剂、氯化钠或其他盐以及抗微生物防腐剂，例如苯酚和/或间甲酚。这样的药物组合物可被用来通过向患有糖尿病或其他医学病况的患者施用生理有效量的组合物来治疗所述患者。
基于前述公开内容，现在显而易见的是，所提供的双链胰岛素类似物将实现上述的目的。也就是说，这些胰岛素类似物表现出与野生胰岛素相似的生物活性(由皮下或静脉内注射后降低哺乳动物中的血液葡萄糖浓度所需的蛋白单体的纳摩尔数来定义)，但具有足够的内在稳定性，以便在0.6-6.0 mM范围内的蛋白浓度下，在没有锌离子(或其他二价金属离子)的情况下能够配制。因此，应该理解的是，任何明显的变化都落入所要求保护的发明的范围内，并且因此，可以在不偏离本发明在本文公开和描述的精神的情况下确定特定组分要素的选择。
以下文献被引用以证明本文所述的测试和测定方法将被本领域普通技术人员理解。

Claims (25)

1.一种包含修饰的A-链多肽和修饰的B-链多肽的胰岛素类似物，其中所述修饰的A-链多肽相对于野生型人胰岛素A-链包含一个或多个取代，所述取代选自：
在位置A8的His或Glu取代；
在位置A14的Glu取代；和
在位置A17的Gln或Arg取代；
且其中所述修饰的B-链多肽相对于野生型人胰岛素B-链包含一个或多个修饰，所述修饰选自：
在位置B1的氨基酸的缺失，在位置B1和B2的氨基酸的缺失，在位置B1-B3的氨基酸的缺失，在位置B30的氨基酸的缺失或其组合；
在位置B2的Ala或Glu取代；
在位置B3的Glu取代。
2.权利要求1的胰岛素类似物，其中所述修饰的A-链多肽包含在位置A14的Glu取代。
3.权利要求2的胰岛素类似物，其中所述修饰的A-链多肽还包含在位置A17的Gln取代。
4.权利要求2的胰岛素类似物，其中所述修饰的A-链多肽还包含在位置A17的Arg取代。
5.权利要求1-4的任一项的胰岛素类似物，其中所述修饰的A-链多肽还包含在位置A8的His取代。
6.权利要求5的胰岛素类似物，其中所述修饰的B-链多肽包含在位置B1的氨基酸缺失。
7.权利要求6的胰岛素类似物，其中所述修饰的B-链多肽还包含在位置B30的氨基酸缺失。
8.权利要求7的胰岛素类似物，其中所述修饰的B-链多肽还包含在位置B2的Ala取代。
9.权利要求7的胰岛素类似物，其中所述修饰的B-链多肽还包含在位置B2的Glu取代。
10.权利要求7的胰岛素类似物，其中所述修饰的B-链多肽还包含在位置B2的氨基酸缺失且还包含在位置B3的Glu取代。
11.权利要求6的胰岛素类似物，其还包含在位置B2的Glu取代和在位置B29的Glu取代。
12.权利要求1-4的任一项的胰岛素类似物，其中所述修饰的A-链多肽还包含在位置A8的Glu取代。
13.权利要求12的胰岛素类似物，其中所述修饰的B-链多肽包含在位置B1的氨基酸缺失，在位置B30的氨基酸缺失，或二者。
14.权利要求13的胰岛素类似物，其中所述修饰的B-链多肽还包含在位置B2的Ala取代。
15.权利要求13的胰岛素类似物，其中所述修饰的B-链多肽还包含在位置B2的Glu取代。
16.权利要求13的胰岛素类似物，其中所述修饰的B-链多肽还包含在位置B2的氨基酸缺失，并且还包含在位置B3的Glu取代。
17.权利要求12的胰岛素类似物，其中所述修饰的B-链多肽包含在位置B1的氨基酸缺失，还包含在位置B2的Glu取代和在位置B29的Glu取代。
18.权利要求1的胰岛素类似物，其中所述修饰的A-链多肽包含SEQ ID NO: 42或SEQID NO: 44的多肽。
19.权利要求18的胰岛素类似物，其中所述修饰的B-链多肽是选自SEQ ID NO: 43和45-48的多肽。
20.一种降低患者血糖的方法，所述方法包括向所述患者施用生理有效量的权利要求1-4的任一项的胰岛素类似物或其生理上可接受的盐。
21.权利要求20的方法，其中所述胰岛素类似物相对于人胰岛素序列还包含在位置A8的His或Glu取代。
22.权利要求21的方法，其中所述胰岛素类似物还包含在位置B1的氨基酸缺失，在位置B30的氨基酸缺失，或二者。
23.权利要求22的方法，其中所述修饰的B-链多肽还包含在位置B2的Ala或Glu取代。
24.一种包含修饰的A-链多肽和修饰的B-链多肽的胰岛素类似物，其用作药物，其中所述修饰的A-链多肽相对于野生型人胰岛素A-链包含一个或多个取代，所述取代选自：
在位置A8的His或Glu取代；
在位置A14的Glu取代；和
在位置A17的Gln或Arg取代；
且其中所述修饰的B-链多肽相对于野生型人胰岛素B-链包含一个或多个修饰，所述修饰选自：
在位置B1的氨基酸的缺失，在位置B1和B2的氨基酸的缺失，在位置B1-B3的氨基酸的缺失，在位置B30的氨基酸的缺失或其组合；
在位置B2的Ala或Glu取代；
在位置B3的Glu取代。
25.一种包含修饰的A-链多肽和修饰的B-链多肽的胰岛素类似物，其用于治疗疾病，其中所述修饰的A-链多肽相对于野生型人胰岛素A-链包含一个或多个取代，所述取代选自：
在位置A8的His或Glu取代；
在位置A14的Glu取代；和
在位置A17的Gln或Arg取代；
且其中所述修饰的B-链多肽相对于野生型人胰岛素B-链包含一个或多个修饰，所述修饰选自：
在位置B1的氨基酸的缺失，在位置B1和B2的氨基酸的缺失，在位置B1-B3的氨基酸的缺失，在位置B30的氨基酸的缺失或其组合；
在位置B2的Ala或Glu取代；
在位置B3的Glu取代。
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