KR20190101963A - 안정성을 강화한 속효성 인슐린 유사체 - Google Patents

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케이스 웨스턴 리저브 유니버시티
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Abstract

2-사슬 인슐린 유사체는 변형된 A-사슬 폴리펩티드 및 변형된 B-사슬 폴리펩티드를 포함한다. 상기 변형된 A-사슬 폴리펩티드는 A8 위치에서의 His 또는 Glu 치환체; A14 위치에서의 Glu 치환체; 및 A17 위치에서의 Gln 또는 Arg 치환체 중 하나 이상을 포함한다. 상기 변형된 B-사슬 폴리펩티드는 B1, B1-B2, B1-B3, B30 위치에서의 아미노산의 결실 또는 이들의 조합; B2 위치에서의 Ala 또는 Glu 치환체; 및 B3 위치에서의 Glu 치환체 중의 하나 이상을 포함한다. 상기 유사체는 무아연 용액에서 열역학적 안정성, 감소된 자기 결합, 생물학적 효능의 유지, 증가 안된 유사분열촉진을 나타낸다. 상기 유사체는 화학적 분해 및 물리적 분해에 대한 내성을 나타낸다. 당뇨 또는 비만 환자를 치료하기 위한 방법은 생리학적으로 유효한 양의 인슐린 유사체 또는 생리학적으로 허용가능한 그 염을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.

Description

안정성을 강화한 속효성 인슐린 유사체
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2016년 11월 21일에 제출된 미합중국 가출원 제62/424,892호의 편익을 주장한다.
연방 후원 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 허가 번호 DK040949 및 DK074176하에 미국 국립 보건원에 의해 수여된 협력 협정에 의한 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 소정의 권리를 가질 수 있다.
본 발명은 증가된 열역학적 안정성, 감소된 유사분열촉진(mitogenicity) 및 아연 이온 없는 고단백질 농도(1 mM 내지 5 mM)에서의 속효성 제형 가능성과 같은 향상된 약학 특성을 보이는 폴리펩티드 호르몬 유사체에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 증가된 제형 강도에서의 신속한 작용(통상적인 야생형(wild-type) 인슐린과 관련)을 부여하거나, 및/또는 약학적 제형(야생형 인슐린과 관련 또는 통상적으로 아연-이온-안정화된 단백질 조립체로서 제형화되는 종래 인슐린 유사체와 관련)에 부형제를 광범위하게 사용할 수 있도록 하는 인슐린 유사체에 관한 것이다.
치료제와 백신을 포함한 비표준 단백질 조작을 통해 광범위한 의학적 및 사회적 효용을 가질 수 있다. 자연 발생 단백질(일반적으로 인간, 기타 포유동물, 척추 동물, 무척추 동물 또는 진핵 세포의 유전체에 코딩되어 있음)은 세포 환경 내에서는 최적으로 기능하도록 진화했을 수 있지만, 치료용으로는 준최적일 수 있다. 이러한 단백질의 유사체는 향상된 생물리학적, 생화학적 또는 생물학적 특성을 나타낼 수있다.
단백질 유사체는 암세포의 증식 촉진 등 의도되지 않고 바람직하지도 않은 부작용이 감소된 향상된 "표적" 활성(혈당 농도의 감소로 이어지는 신진대사의 대사 조절 등)을 달성할 수 있다는 효용이 있다. 이러한 단백질 조작의 또 다른 효용은 단백질 농도상 신속한 작용 발생(onset of action)을 유지하여 보다 높은 강도의 제형을 구현할 수 있다는 것이다. 사회적 효용에 있어서의 또 다른 예로서, 인슐린 펌프의 배송 장치 또는 펌프의 유량과 연속적인 포도당 모니터의 출력이 알고리즘으로 연결되어 있는 폐쇄순환 시스템 등의 배송 장치와의 호환성을 향상시킬 수 있다는 점을 들 수 있다. 예컨대, 치료용 단백질은 인슐린에 의해 제공된다. 야생형 인간 인슐린 및 인슐린 수용체에 결합하는 기타 포유동물의 유전체에 코딩된 인슐린 분자는 RNA 잇기(splicing)의 선택적 모드에 의해 또는 번역후-당화의 선택적 패턴에 의해 생성된 아형(isoform) 수용체와 무관한 다수의 기관 및 다양한 유형의 세포이다. 또한, 야생형 인슐린은 낮지만 중요한 친화성을 가지면서 상동의 제1형 인슐린유사 성장인자 수용체(IGF-1R)와 결합한다.
인슐린은 척추 동물에서 프로인슐린으로 지칭되는 단일 사슬 전구체의 생합성 산물인 이중 사슬 단백질 분자이다. 인간 프로인슐린의 염기서열 및 구조는 각각 도 1A(서열 번호 1) 및 1B에 도시되어 있다; 인간 인슐린의 염기서열은 도 1C에 도시되어 있다. 인슐린은 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는데, A사슬은 21개의 잔기(서열 번호 2)를 함유하며 B사슬은 30개의 잔기(서열 번호 3)를 함유한다. 하나 또는 다른 사슬 내의 특정 아미노산들은 표준 3문자 코드(예컨대, "Ala"는 알라닌이고 "Asp"는 아스파르트산)에 이어서 상기 사슬(A 또는 B) 및 상기 사슬 내에서 야생형 인슐린에 상대적인 위치 번호를 나타내는 문자(위첨자 가능)로 표시된다. 예컨대, B사슬의 10번 위치의 히스티딘(Histidine)은 HisB10로 표시되고, B사슬의 12번 위치의 발린(Valine)은 ValB12로 표시되며, A사슬의 8번 위치의 트레오닌(Threonine)은 ThrA8로 표시된다. 또는, 아미노산은 표준 1문자 코드(예컨대, "A"는 알라닌이고 "D"는 아스파르트산)에 이어서 상기 A 또는 B 사슬이 표시되고, 그 뒤로 야생형 인슐린에 상대적인 위치 번호가 표시된다. 상기 규칙에 따르면, B사슬의 10번 위치의 히스티딘은 HB10으로 나타나고, B사슬의 12번 위치의 발린은 VB12로 나타나며, A사슬의 8번 위치의 트레오닌은 TA8로 나타난다. 아미노산이 폴리펩티드의 N-말단으로부터 결실되더라도 아미노산의 번호매기기는 야생형 인슐린에 상대적으로 유지된다. 따라서, 제1 아미노산이 야생형 염기서열의 N-말단으로부터 결실되었다는 것을 나타내는 des B1 인슐린 유사체에서, B사슬의 제1 아미노산은 발린을 나타내며 여전히 B2 위치를 점유하고 있는 것으로 표시된다. 마찬가지로, 첫 2개의 N-말단 아미노산이 야생형 염기서열로부터 결실된 des [B1, B2] 인슐린 유사체에서, 제1 아미노산은 아스파라긴으로서 여전히 B3 위치를 점유하고 있는 것으로 표시된다.
"인슐린 유사체"라는 용어는 상이한 유형의 아미노산에 의하여 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환되거나, 상이한 원자 또는 원자 집합에 의하여 이러한 잔기의 측쇄 또는 주쇄에서 하나 이상의 원자가 변형된 야생형 인슐린과 관련된 분자의 부류를 지칭한다. 하지만, 인슐린 수용체(IR)과 결합하는 능력과 같은 야생형 인슐린의 하나 이상의 특성의 적어도 일부는 여전히 유지된다. 해당 기술 분야에 공지된 인슐린 유사체의 예로는 ProB28을 Lys로 치환하고 LysB29를 Pro로 치환한 인슐린 리스프로를 들 수 있다. 인슐린 리스프로(KP-인슐린이라고도 함)는 Humalog®(Eli Lilly and Co.) 제품의 유효 성분이다.
인슐린의 B사슬이 하나 또는 다수의 위치에서 아미노산 치환을 통해 변형됨으로써 피하 저장소로부터의 인슐린 유사 제형의 흡수율을 향상시킬 수 있다는 점은 해당 기술 분야에 공지되어 있다. 증가된 강도의 인슐린 제형(ml 당 국제 단위)은 뚜렷한 인슐린 저항성을 보이는 환자에게 특히 효용이 있을 것으로 기대되며, 차세대 펌프 기술상 저장소의 수명을 연장하거나 저장소의 소형화를 가능하게 하므로 내부 또는 외부 인슐린 펌프에 있어서도 가치가 있을 것이다.
기존의 인슐린 제품은 일반적으로 인슐린 또는 인슐린 유사체의 농도를 증가시킬 때 장기간 지속되는 약동학 및 약역학 특성을 나타내어 U-200(200 국제단위/ml) 이상의 제형 강도를 구현하게 된다. 이러한 지속성은 피하 주사시 혈당증 식이조절용 제품의 효능을 저해하고, 펌프 기반의 지속적인 피하 주입의 효능 및 안전성을 저해한다. 이러한 단점에 비추어, 속효성 인슐린 유사체 제형의 치료적 및 사회적 효용은 U-200 내지 U-1000(상기 범위의 상한 및 하한 포함)의 강도에서 속효성을 유지시키는 인슐린 유사체 조작을 통해 증대될 것이다. 신규한 가용성 인슐린 유사체가 야생형 인간 인슐린에 비해 제1형 IGF 수용체에 대한 약한 친화성을 나타내는 경우에는 추가적인 효용이 발생하게 된다.
농축된 인슐린 유사체 제형이 인간 암세포주의 인슐린 자극 증식을 모니터링하기 위해 개발된 분석법 및/또는 세포 증식의 자극 또는 억제와 관련된 유전자 발현 상의 인슐린-지향 변화를 모니터링하기 위해 개발된 분석법에서 감소된 유사분열촉진을 나타낼 경우, 또 다른 추가적인 치료적 및 사회적 효용이 발생할 것이다.
인슐린 투여는 당뇨병 치료법으로 오랫동안 확립되어 왔다. 당뇨병 환자에 대한 종래 인슐린 보충 요법의 주요 목표는 건강한 인간 피험자의 정상 범위 특성을 초과 또는 미달하여 이탈되지 않도록 혈당 농도를 엄격하게 통제하는 것이다. 정상 범위 미만으로 이탈하는 것은 급성의 아드레날린적 또는 신경저혈당적 증상과 관련이 있으며 심한 경우에는 경련, 혼수상태 및 사망을 초래한다. 정상 범위를 초과하여 이탈하는 것은 망막장애, 실명 및 신부전을 포함한 미세혈관 질환에서 장기적인 위험이 증가하는 것과 관련이 있다. 인슐린은 척추 동물의 신진대사에 있어 중추적인 역할을 하는 작은 구상 단백질이다. 호르몬은 췌장 -세포에 Zn2 +안정화된 육량체로 저장되지만 혈류에서는 Zn2 +가 없는 단량체로 작용한다. 인슐린은 단일 사슬 전구체, 즉 프로인슐린의 산물로서, 연결 영역(35 잔기)이 B사슬(잔기 B30)의 C-말단 잔기에서 A사슬의 N-말단 잔기까지 연결된다. 인슐린이 인슐린 유사 코어와 무질서한(disordered) 연결 펩티드로 구성된다는 것은 다양한 증거를 통해 알 수 있다. 3개의 특정 이황화 가교(A6-A11, A7-B7, 및 A20-B19)의 제형은 거친 소포체(ER)에서 프로인슐린의 산화성 폴딩에 결합된다. 프로인슐린은 췌장 베타 세포 내의 당조절된 분비과립에 아연 인슐린 육량체로 저장되는 과정에서 트랜스-골지 네트워크에서 인슐린으로 변환된다.
도 2는 해당 기술 분야에 공지된 (속효성) 식이 인슐린 유사체에 관한 설계의 기저가 되는 약동학적인 원리를 나타내는 개략도이다. 즉, 피하 저장소에서 인슐린 육량체(상단 좌측)는 너무 커서 모세혈관(하단) 내부로 효과적으로 투과할 수 없고, 인슐린 이량체(상단 중앙) 및 인슐린 단량체(상단 우측)에 의해 신속한 흡수가 매개된다. 식이 인슐린 제품인 Humalog® 및 Novolog®는 인슐린 유사체(각각 인슐린 리스프로 및 아스파르트에 해당)를 포함하며, 아연 인슐린 육량체의 이량체화 표면 또는 그 근처에 아미노산 치환체를 구비함으로써 결합 비율이 가속된다; 식이 인슐린 제품인 Apidra®(insulin deglulisine)는 무아연(zinc-free) 올리고머로(짝을 이룬 평형으로) 제형화되어 마찬가지로 저장소에서 빠른 분해 비율을 나타낸다. 본 발명의 인슐린 유사체는 분리된 인슐린 단량체 및 약하게 연결된 이량체를 제공하며, 이들 단량체 및 이량체의 증강된 안정성으로 인해 아연 매개된 결합 또는 무아연 고차(higher-order) 결합이 없는 제형화가 가능하다. 상단 좌측의 육량체에서, A사슬이 밝은 회색으로 표시되고 B 사슬이 어두운 회색으로 표시되는 T3Rf 3 아연 육량체가 도시된다; 3개의 결합된 페놀 리간드가 CPK 모델(짝을 이룬 타원형)로 도시된다. 중앙의 이량체는, A사슬이 어두운 회색으로 표시되고 B사슬이 밝은 회색(잔기 B1~B23 및 B29~B30) 또는 중간 회색(B24-B28; 역평행 베타병풍(
Figure pct00001
시트))으로 표시되는 아연 없는 T2 이량체로 도시된다; 이량체 관련 사슬간 수소 결합은 점선으로 표시된다. 결정학상의 프로토머(T, R 및 Rf)의 집합은 상단 우측에 도시되며, A사슬이 어두운 회색으로 표시되고 B사슬이 중간 회색(B1~B9) 및 밝은 회색(B10~B30)으로 표시된다.
피하 주사 후의 인슐린 유사체 제형의 속효성은, 일단 인슐린 수용체가 표적 조직 내에서 결속되면, 피하 저장소로부터의 단백질 흡수의 약동학적 성질 및/또는 인슐린 유사체의 약역학적 성질을 반영할 수 있다. 본 발명의 인슐린 유사체 제형 내의 아미노산 치환은 상기 메커니즘 중 하나 또는 모두를 사용할 수 있다.
B28 및/또는 B29 위치의 치환체는 무아연 인슐린 이량체화의 강도 및 아연 인슐린 유사체 육량체의 안정성을 손상시키는 것으로 해당 기술 분야에 공지되어있다. 그러나, LysB28-ProB29(아연 안정화 제형에서 Humalog®의 활성 성분인 인슐린 리스프로)에 의한 야생형 잔기 ProB28-LysB29의 치환 및 Asp(아연 안정화 제형에서 Novolog®의 활성 성분인 인슐린 아스파르트)에 의한 ProB28의 치환이 인슐린의 열역학적 안정성, 화학적 안정성 및 물리적 안정성을 손상시켜, 일반적으로 인슐린에서의 아미노산 치환이 바람직한 특성과 바람직하지 않은 특성들을 상쇄하는 것을 의미한다. 야생형 ProB28을 유지하는 Glu(Apidra®의 활성 성분인 인슐린 글루리신에서의 두 치환체 중 하나)에 의한 LysB29의 치환은 이량체화 또는 육량체 안정성에 더 제한된 영향을 미치지만, 중성 pH의 무아연 용액에서 안정한 제형을 갖도록 한다. 인슐린 작용으로 인한 짧은 꼬리의 잠재적인 약역학적 이점에도 불구하고, 유입된 아미노산 잔기가 인슐린의 안정성 또는 수용체-결합 친화성을 예측 곤란할 정도로 손상시키므로, 상기와 같은 치환은 단백질 설계상에서 상쇄를 발생할 수 있다.
U-200 내지 U-1000(최저값 및 최고값을 포함) 범위의 강도 및 중성 pH의 용해성 제형에서 속효성 인슐린 유사체 또는 초속효성 인슐린 유사체에 대한 의학적 및 사회적 요구가 존재한다. 중성 pH에서 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체, 육량체, 십이량체 및 고차 종류의 농도-종속적 분산을 형성할 수 있는 야생형 인슐린의 복잡한 자가 결합 특성에 의해, 이러한 제품에 대한 문제점이 오랫동안 제기되어 왔다. 일반적으로, 해당 기술 분야에 공지된 종래의 인슐린 제형은 명목 단백질 농도에서의 아연 인슐린 육량체의 주성분을 0.6 mM(희석시 더 낮음)의 단량체 단위로 사용하며, 그 천연 자가 조립은 아연 이온에 의해 안정화되며, 물리적 및 화학적 분해로부터 호르몬을 보호한다. 야생형 인슐린 육량체를 상기 단백질 농도 이상으로 농축하면 점진적으로 육량체-육량체 상호 작용이 발생한다; 이러한 자가 결합의 심화된 수준이 피하 저장소로부터 주입된 인슐린의 지연된 흡수와 관련되므로, 차례로 약동학 및 약역학적의 장기화가 야기된다. 종래의 식이 인슐린 유사체 생성물(Humalog®, Novolog® 및 Apidra®)의 유사한 연장은 약 2 mM(모노머 단위)를 초과하는 농도에서 발생한다.
이러한 장애를 극복하기 위해, 본 발명자들은 강도를 증가시킨 속효성 인슐린 유사체 제형을 조작하기 위한 신규한 방법을 구상하였다. 첫째 접근법은 3 mM 내지 8 mM 정도의 높은 단백질 농도에서의 이량체화 및 고차원 자가 조립이 피하 저장소에서의 단백질 분해에 대한 운동상의 장벽을 부여하지 않도록 하는 초안정 인슐린 단량체를 설계하는 것이었다. 이러한 접근법에서, 개별 인슐린 유사체 분자의 증강된 내인성 안정성으로 인해, 안정적인 제형을 위한 아연-매개된 육량체 조립이 불필요하게 된다. 즉, 화학적 분해, 중합 및 세동에 대한 미국 식품의약청(FDA)의 가이드 라인에 따른 안정적인 제형을 위한 육량체 조립이 불필요하게 된다. 아연 배위(coordination)가 없는 경우, 인슐린 자가 조립 및 분해의 시간 척도는 아연 배위가 존재하는 경우 보다 현저히 빠르다; 상기 차이점은, 이러한 제형에서 형성된 형태적(conformational) 평형에서 예외적으로 장수명을 갖는 "R6"형 육량체를 생성하는 부형제의 조합으로서, 아연 이온과 표준 약학 제형에서 통상적으로 사용되는 방부제를 조합하면 더욱 분명해진다. 본 발명은 상기와 같은 유사체가 분자 단위 기준으로 야생형 인슐린의 생물학적 활성의 20% 이상을 보유하는 것을 특징으로 한다.
해당 기술 분야에 공지된 인슐린 유사체는 아연 이온이 없는 경우에 향상된 고유한 안정성을 나타내며, 이량체 이상으로 감소된 자가 조립은 AspB10-인슐린에 의해 제공된다. 천연 육량체 결합체에서 야생형 잔기(HisB10)는 육량체의 중심 축에서 두 축의 아연 이온을 조정하는 기능을 한다. Asp로 HisB10을 치환함으로써 상기 축 모드에서 아연 이온의 결합을 저해하며, 고전적인 육량체의 삼량체 관련 표면을 통하여 고차원의 자가 결합을 차단한다. 바람직한 C-Cap 잔기로서, 그리고 (GluB14와의) (i, i+4) 염교의 전위 형성을 통하여, AspB10은 정전기적 메커니즘을 통하여 무아연 단량체 또는 이량체에서 중심 B사슬 α-나선의 분절 안정성을 향상시키는 일반적인 근거가 될 것으로 기대될 수 있다. 단백질 안정성의 이론적 토대와 무관하게, HisB10를 Asp로 치환하는 것은 화학적 변성 연구에 의해 조사된 바와 같이 무아연 인슐린 단량체의 열역학적 안정성을 증가시키는 것으로 관찰되었다. 또한, AspB10은 인슐린 수용체에 대한 인슐린 친화성을 향상시키고, 분리된 지방 세포에서의 지방 형성을 촉진시키는 효능을 동시에 증가시킨다. 야생형 인슐린에서 HisB10를 Asp로 치환하여 제공된 상기와 같은 바람직한 특성에도 불구하고, 야생형 인슐린에 대한 AspB10-인슐린에 의한 Sprague-Dawley 쥐의 만성 치료에서의 유방 종양의 과도한 발병률의 발견과 관련하여, 종양 세포주(인간 유방암 유래의 세포주 포함)의 세포-배양 분석에서의 증가된 유사분열촉진 때문에 임상적 사용이 배제되었다. Sprague-Dawley 쥐의 발암성과의 바람직하지 않은 관련성 때문에 본 발명은 안정화 치환체로서 AspB10의 사용을 배제한다. 비천연 아미노산은 환자 또는 피험체 인간의 장기간 사용을 목적으로 하는 의약품에 있어서 높은 제조 비용 및 알려지지 않은 독성과 관련되기 때문에, 본 발명은 구체형 단백질 또는 비극성 펩티드 계면(불소화 지방족 및 방향족 측쇄 등)의 열역학적 안정성을 향상시키는 해당 기술 분야에 공지된 인공 아미노산도 배제한다.
따라서, 본 발명의 일 측면에 의하면, 특히 0.6 mM를 초과하는 고농도에서 감소된 자가결합을 나타내며 야생형 인간 인슐린의 생물학적 효능을 나노몰 기준으로 20 퍼센트 이상으로 유지하면서도, 무아연 용액에서 향상된 열역학적 안정성을 갖는 인슐린 유사체가 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 상기 인슐린 유사체는 향상된 유사분열촉진(mitogenicity)을 나타내지 않는다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 인슐린 유사체는 화학적 분해에 대한 내성 및 물리적 분해에 대한 내성을 부여하기 위해 충분한 무아연 안정성을 나타내도록 설계될 수 있으며, 따라서, 인슐린 유도체는 강도 U-100 내지 U-300, 경우에 따라서는 U-500의 고강도로 피하 주사시 신속하게 작용하는 약학 제형의 개발이 가능하도록 한다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기와 같은 안정성은 암 관련 AspB10 치환체가 부재하고 인공 아미노산이 부재한 경우에 획득할 수 있다.
아연 이온의 필요성이 없어지고 이러한 유사체의 고유한 안정성이 증가하면, 피하 저장소로부터 혈류로 주입된 인슐린 유사체의 흡수를 향상시키는 부형제를 포함하여 광범위한 부형제들을 사용할 수 있게 될 것이다.
또한, 본 발명의 안정화 요소를 조합하면, 인슐린 수용체가 결합되는 경우에 인슐린 신호 전달의 지속 기간을 단축시키도록 설계된 부위에서 치환의 추가적 결합을 허용하기에 충분한 안정성을 부여할 것으로 예상된다.
본 발명에 따른 제품은 인슐린 펌프를 통한 연속적인 피하 주입으로 치료를 받는 환자들에게 현저한 이익을 줄 것이며, 상기 펌프의 소형화를 가능하게 할 수 있을 것으로 예상된다.
따라서, 본 발명의 유사체는 아미노산 치환체의 신규한 조합을 함유하는 2개의 폴리펩티드 사슬로 이루어짐으로써, 상기 유사체는 (i) 무아연 용액에서 열역학적 안정성이 향상되고, (ⅱ) 0.6 mM 초과의 단백질 농도에서 자가 결합이 감소되며, (iii) 당뇨 쥐에서의 나노몰 기준으로 야생형 인간 인슐린의 생물학적 효능의 20% 이상을 나타낸다.
이를 위해, 본 발명의 유사체는 다음의 신규한 조합을 포함한다: (i) (A8, A14 및/또는 B29 위치에서의) 안정화 치환, (ii) 물리적 안정성을 증가시키는 변형(하나, 둘 또는 세 개의 잔기의 N-말단 B-사슬 결실), 선택적으로 (iii) 화학적 안정성을 향상시키는 B 사슬의 N 말단 근처 및/또는 위치 A21에서의 치환; 추가적이고 선택적으로, (iv) 인슐린 수용체가 결합하는 경우에 신호전달의 지속성을 단축시키도록 설계된 인슐린의 "부위 2"-관련(위치 B13, B17, B18, A12, A13, A14 및/또는 A17) 표면 또는 이에 인접한 치환.
열역학적 안정성이 WT 인슐린의 안정성보다 큰 유사체가 치환 및 변형의 조합에 의해 제공되도록 상기 후자의 치환은 안정화되거나 불안정화될 수 있다.
본 발명의 유사체는 B사슬의 1개 또는 2개의 잔기 확장(잔기 B31 및 B32)을 선택적으로 포함할 수 있다.
특히, 비천연 아미노산 및 유사분열촉진 치환체 AspB10은 제외된다.
본 발명은 가용성 인슐린 유사체 제제의 약동학적 특성의 최적화 형태로 의학적 효용을 제공함으로써, 신속한 작용 발생이 U-200 내지 U-1000 범위에서, 즉, 종래의 U-100 인슐린 제품보다 2배 내지 10배 높은 강도를 갖는 제형으로 유지될 수 있을 것으로 예상된다("U-X"라는 표현에서 X는 용액 또는 현탁액 1ml 당의 내부 단위를 나타낸다). 본 발명의 인슐린 유사체 및 제제는 당뇨병의 치료에 유용할 것으로 예상된다.
따라서, 본 발명의 일 측면에 의하면, 아미노산 치환 및/또는 N-말단 B-사슬 결실의 조합을 함유하는 유사체가, 기재된 바와 같이, 0.6 mM 내지 6.0 mM의 단백질 농도 범위에서 중성 pH의 무아연 용액에서 안정된 제형을 가능하게 함으로써 당뇨병 동물 모델에 피하 주사 후 "신속한 작용"이 유지되며, 상기 "신속한 작용"은 동일한 동물 모델에 단백질 농도 0.6 mM로 피하 주사한 경우에 Humalog® 또는 Apidra®의 참조 약력학 프로필에 의해 정의된다(즉, 표준 U-100 인슐린 제품에서와 같음).
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 아연 이온 또는 기타 2가 금속 이온이 없는 중성 pH의 용액에 용해되었을 경우, 인슐린 리스프로(Humalog®의 활성 성분) 또는 인슐린 글루리신(Apidra®의 활성 성분) 이상의 열역학적 안정성, 화학적 안정성 및 물리적 안정성을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 유사체는 인간 유방암 세포주의 조직 배양 분석에서 유사분열촉진이 나타난다. 또한, 세포-증식과 관련된 사이클린-1 유전자의 전사적 활성화를 매개하여 각각의 경우에 인슐린 리스프로(KP-인슐린) 이하이다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 잔기 B1, B1-B2 또는 B1-B3의 N-말단 결실을 포함하고, 인접한 위치에서의 치환체를 선택적으로 함께 포함하여 화학적 분해를 지연시키도록 하는 인슐린 유사체의 재조합 제조의 방법을 제공한다.
일반적으로, 본 발명은 0.6 mM 내지 6 mM 범위의 광범위한 단백질 농도 하에서 신속한 작용을 함께 제공하며, 아연 이온 또는 기타 2가 금속 이온이 없는 안정된 약학 제제와 호환가능한 다수의 변형(다만, 위치 B10에서의 치환체 및 비천연 아미노산의 혼입을 배제)을 각각 포함하는 인슐린 유사체를 제공한다. 치환체는 A8, A14, A17, B2, B3, B28 및/또는 B29 중 하나 이상에 위치한다. 상기 유사체는 선택적으로 B사슬의 N-말단 결실(B3까지 포함) 및 화학적 분해를 완화시키기 위한 새로운 N-말단 또는 그 근처의 치환체들을 포함할 수 있다. 즉, 본 발명은 성분 변형 중 어떤 것에 의해서도 부여되지 않은 오랫동안 탐색된 임상 효과를 함께 제공하는 변형된 조합을 포함하는 신규한 부류의 인슐린 유사체와 관련된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 잔기 B30은 존재하지 않는다.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 유사체는 위치 A21에서의 글리신, 알라닌 또는 아스파르트산을 포함할 수 있다.
도 1A는 측면으로 배치된 이염기성 절단 부위(채워진 원) 및 C-펩티드(비어있는 원)로 도시된 A- 및 B- 사슬 및 연결 영역을 포함하는 인간 프로인슐린(서열 번호 1) 염기서열의 개략도이다.
도 1B는 인슐린 유사 모이어티 및 무질서 연결 펩티드(파선)로 구성된 프로인슐린의 구조적인 모델이다.
도 1C는 B-사슬에서 잔기 B27 및 B30의 위치를 표시하는 인간 인슐린의 서열을 나타내는 개략도이다.
상부의 사슬은 인슐린 A-사슬(서열 번호 2)이고, 하부의 사슬은 인슐린 B-사슬(서열 번호 3)이다.
도 2는 인슐린 육량체(상단 좌측), 인슐린 이량체(상단 중앙) 및 인슐린 단량체(상단 우측)를 포함하는 해당 기술 분야에 공지된 (속효성) 식이 인슐린 유사체를 도시하는 개략도로서, 모세혈관(하단) 내에 효율적으로 침투할 수 있는 상기 각각의 형태에 따른 능력를 함께 나타낸다
도 3은 본 발명의 인슐린 유사체 및 인슐린 리스프로의 여러 실시예에 대한 인슐린 유사체 1 마이크로그램당 혈당 저하(mg/dL)를 도시하는 막대 그래프이다.
도 4는 야생형 인간 인슐린(HI)에 대한 ΔGu 값; 인슐린 리스프로(lispro); AspB10-인슐린 리스프로(DB10, KP); 및 EA8, EA14, RA17 des B1, des B30 인슐린(T-0688)을 비교하는 막대 그래프이다.
도 5는 역상 HPLC에 의해 판단된 바와 같이, 45°C에서 7일 동안 본 발명의 인슐린 유사체의 실시예에 따른 고분자량 단백질(HMWP)의 백분율 변화를 제공하는 막대 그래프이다. 실험상의 모든 시료들은 아연 없이 제형화되었다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 인슐린 유사체, 및 pH 7.4로 40°C에서 1000 cpm의 일정한 진동을 수행한 인산염 완충 식염수(PBS)에서의 인슐린 리스프로의 세동 지연 시간을 제공하는 막대 그래프이다. 실험상의 모든 시료들은 아연 없이 제형화되었다.
도 7은 인슐린 리스프로와 비교한 본 발명의 인슐린 유사체의 인간 1형 인슐린-유사 성장 인자 수용체(hIGFR)에 대한 결합 친화도를 제공하는 막대 그래프이다. 상대 친화도는 결합된 125I로 라벨 처리된 인간 인슐린의 경쟁적 변위에 의해 결정되는 해리 상수의 비율로 정의된다. 실험상의 모든 시료들은 아연 없이 제형화되었다.
도 8은 세포 모델로서 인슐린 수용체의 높은 발현을 갖는 쥐 근섬유 세포주(L6)를 활용하여 사이클린 D1 mRNA 누적의 변화를 나타내는 막대 그래프이다. 실험상의 모든 시료들은 아연 없이 제형화되었다.
본 발명은 분자 단위 수준에서 향상된 체내 생물학적 효능, 광범위한 단백질 농도 및 제제 강도(전형적으로는 U-100 내지 U-500이며 선택적으로는 U-1000으로 높음) 하에서의 속효성, 야생형 인간의 친화력에 비해 5% 내지 100% 범위의 절대 친화도를 갖는 IR-A/IR-B 수용체-결합 친화도(프로인슐린에 대응되게 선택된 하한), 인슐린 리스프로의 친화도보다 높지 않은 IGF-1R을 위한 친화도, 및 아연 이온이 없는 인간 인슐린 리스프로 이상의 열역학적 안정성을 제공하는 인슐린 유사체에 관한 것이다.
상기 특징들의 조합은 A-사슬 및 B-사슬 내의 치환체들의 신규 조합에 의해 부여되며, 선택적으로 B사슬의 N-말단 결실 및 선택적으로 des-ThrB30을 갖는다. A-사슬 및 B-사슬의 치환체는 다섯 종류로 분류된다: (i) 부위 관련된 위치에서의 치환체(B13, B17, B18, A12, A13, A14 및/또는 A17); (ii) 위치 A8에서의 비-β-분지형 치환체; (iii) 천연 티로신보다 극성이거나, 하전되거나 또는 작은 측쇄를 함유하는 위치 A14에서의 나선형 유전자형 치환체; (iv) 인슐린의 이량체화를 감소시키거나 중성 pH에서 그 용해도를 증가시키는 해당 기술 분야에 공지된 위치 B28 및/또는 B29에서의 치환체; 및 (v) N-말단 결실과 함께 B사슬의 N 말단에 인접한 치환체. 이러한 치환체 중 일부는 야생형 인슐린의 안정성을 개별적으로 증가시킬 수 있지만, 다른 일부는 야생형 인슐린의 안정성을 개별적으로 손상시킬 수 있다. 마찬가지로, 이러한 치환체 중 일부는 (정맥 볼러스 주사시)개별적으로 인슐린 작용의 꼬리를 확장하지만, 다른 일부는 개별적으로 상기 꼬리를 완화하거나 단축할 수 있다. 본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 치환체들의 조합을 B사슬의 N-말단 결실과 선택적으로 결합하여 제공하며, 0.6 mM 내지 6.0 mM 범위의 광범위한 단백질 농도 하에서 피하 주사시 신속한 작용을 유지하며 당뇨병 치료에 실행가능하도록 적합한 물리적 및 화학적 안정성을 나타내는 제형을 갖는 인슐린 유사체를 함께 제공한다.
A1 내지 A8 α-나선구조의 C-CAP 잔기의 최적화. A8 위치에서의 트레오닌의 β-분지형 측쇄는 α-나선구조의 경향 및 C-CAP 전위 대한 펩티드 기반 규칙들을 위반한다. ThrA8은 수용체 엑토도메인의 단편에 결합된 인슐린의 공결정 구조에 정의된 바와 같이 인슐린의 고전적인 수용체 결합 표면 내에 위치하지는 않지만 근접하게 위치한다. 이 위치에서의 비-β-분지형 치환체들은 야생형 인슐린 및 인슐린 리스프로의 환경에서 인슐린 분자를 안정화시키는 것으로 해당 기술 분야에 공지되어 있지만, 부위-2-관련 치환체를 함유한 인슐린 유사체에 대한 이들의 기능적 호환성 및 생체물리적 효과는 알려져 있지 않으며, 구체형 단백질에서 C-CAP 치환의 효과가 일반적으로 상황에 따라 다르므로 예측하기도 곤란하다.
A12 내지 A18 α-나선구조의 표면 최적화. 인슐린 단량체 구조의 이례적인 특징은 A12 내지 A18 α-나선구조의 표면 상의 A14 위치에서의 티로신 과다 노출이다. 이 측쇄의 형태는 결정 구조들 사이에서 가변적이며, 다양한 용액 조건 하의 1H-NMR 연구에서 움직임 협소화(motional narrowing)를 보인다. 작거나(알라닌 등), 극성을 갖거나(글루타민 등), 전하를 띠는(글루타민산 및 아르기닌 등) 유사한 나선구조의 경향을 갖는 측쇄에 의해 노출된 대형 비-극성 측쇄의 치환체는, 역소수성 효과를 완화시켜 안정성을 전반적으로 향상시킬 수 있다. 하지만, 전술한 C-CAP 전위와 마찬가지로, 상기 효과는 상황에 따라 다양하며 그 크기가 매우 다양하다. 그러나, 인슐린의 안정성에 대한 A14 치환체의 효과를 예측하기에는 역소수성 효과의 예들이 너무 적게 기술되었다.
B사슬의 N-말단의 세 잔기는 가변적이거나 무질서한 형태를 나타낸다. 비록 인슐린의 B사슬의 잔기 B1, B1-B2 또는 B1-B3의 결실이 인슐린의 활성 또는 호르몬의 인슐린 수용체에 대한 결합을 손상시키지 않는 것으로 해당 기술 분야에 공지되어 있지만, 이러한 "아암(arm)"은 포유 동물 세포 내의 프로인슐린의 초기 접힘 효율에 기여한다. 이러한 결실은 용액 내의 성숙한 무아연 호르몬의 열역학적 안정성을 변화시키지 않는 반면, 그러한 결실은 비극성 측쇄 (B1 위치에서의 페닐알라닌 및 B2 위치에서의 발린)의 용매 노출을 제거함으로써, 단백질이 비천연 응결되어 물리적 안정성을 확장시키도록 할 수 있다. 이러한 결실은 새로운 N 말단 또는 그 근처의 잔기의 화학적 분해를 증가시킬 수 있기 때문에, 잔기 B1, B1-B2 또는 B1-B3의 결실은 중성 pH 용액에서의 화학적 분해를 완화시키고자 하는 아미노산 치환과 인접하여 선택적으로 결합될 수 있다. 또한, 이론적인 제한을 받지 않은 조건에서, 부위-2-관련 치환 및 GluB29의 첨가제 또는 비첨가제 효과가 인슐린 수용체에 결합하는 상기 유사체에 의한 유사분열촉진 신호 전달을 약화시키며, 유사분열촉진 제1형 IGF 수용체에 대한 결합 감소와 관련된다고 본 발명자들은 예상한다.
본 발명의 일 측면에 의하면, 중성 pH 및 0.6 mM 내지 6.0 mM의 단백질 농도의 무아연 용액에서(공식 단량체 농도와 관련하여 계산됨) 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체 또는 육량체인(다만, 자가 결합의 고차원 상태는 아닌) 인슐린 유사체에 의해 피하 저장소로부터의 급속 흡수 동역학이 생성될 수 있다. 아연 이온 또는 기타 2가 금속 이온이 없는 경우, 이러한 천연 자가 결합은 자가 조립의 상태들간의 신속한 교환에 의해 특징을 갖는다(즉, 성분 이량체, 삼량체, 사량체 및 육량체의 수명은, 평형 상태에 처해 있을 때까지, 1초 미만이다). 이러한 신속한 교환은 아연-안정화된 인슐린 육량체들 중에서 관찰된 몇 시간의 수명과 대조적이다. 당 업계에 알려진 바와 같이, 종래의 식이 제품은 전위 육량체간의 상호작용에 의해 확장된 아연 안정화되거나 아연 이온 독립적인 육량체를 포함하는 자가 결합 상태 사이에서 평형 결합을 이룰 수 있는 연속체를 나타낸다. 이러한 방법에 따른 분자 구현으로 인해, (i) 인슐린 리스프로에 비해 아연이 없는 단량체 및 이량체 이상으로 안정되며, (ii) 분자 또는 나노몰 단위를 기준으로, (호르몬 조절된 혈당 농도의 저하에 의해 평가된 바와 같이) 야생형 인간 인슐린의 생물학적 효능의 적어도 일부를 보유하는 특성을 갖는 새로운 부류의 인슐린 유사체가 제공된다. 본 발명은, 혈당 조절과 관련하여 보유된 효능이 인슐린 리스프로의 효능보다 높지 않은 유사분열촉진과 관련된다는 특징을 갖는다. 본 발명의 많은 유사체에 있어서, 유사분열촉진은 야생형 인슐린과 비교하여 감소되며, 이러한 감소는 암 위험 및 암 성장의 관점에서 바람직하지 않은 별개의 신호 전달 경로의 생물학적 결과이다.
제한없이 예를 들자면 인슐린 유사체는 돼지, 소, 말 및 개와 같은 동물성 인슐린으로부터 유래된 A- 및 B-사슬 염기서열로 구성될 수 있다고 예상된다. 다만, 아스파르트산이 B10 위치에, 알라닌이 B12 위치에, B10 위치에 치환체가 존재하지 않아야 하며 비자연적인 아미노산이 사용되지 않아야 한다. 인간 인슐린 또는 동물성 인슐린으로부터 유도된 이러한 변종 B사슬은 선택적으로 ThrB30(des-B30)이 결핍되거나 C-말단 디펩티드 확장(각각 B31 및 B32로 지정된 잔기 위치를 가짐)을 함유할 수 있으며, 이들 C-말단 확장 잔기 중 적어도 하나는 산성 아미노산이다. 추가적으로 또는 선택적으로, 본 발명의 인슐린 유사체는 잔기 B1, B1-B2 또는 B1-B3의 결실을 함유할 수 있다; 또는 B28 위치에 프롤린이 결여된 변이체 B사슬(예컨대, B29 위치의 글루탐산과 결합한 LysB28, AlaB28 또는 GlnB28)과 결합될 수 있다.
본 발명의 인슐린 유사체는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisciae) 또는 다른 효모 발현 종 또는 균주에서의 효모 생합성에서 전구체 폴리펩티드의 Lys-유도된 단백질 가수분해로부터 유래될 수 있다. 이러한 균주는 N-말단 B-사슬 확장을 포함하는 전구체의 발효후처리를 가능하도록 위치 B1, B2 또는 B3에서 리신을 코딩하도록 조작됨으로써, 잔기 B1, B1-B2 또는 B1-B3이 부적한 유사체가 제조되도록 할 수 있다. 새로운 N- 말단 잔기는 선택적으로 글루탐산 또는 알라닌으로 치환될 수 있다. 따라서, des-B1 유사체의 변이체 B사슬은 N-말단 발린(야생형 인슐린의 천연 B2 잔기), 알라닌 또는 글루탐산으로 시작할 수 있고, 선택적으로 제2 위치에서 알라닌 또는 글루탐산으로 시작할 수 있다; 마찬가지로, des-[B1-B2] 유사체의 변이체 B사슬은 제1 위치에서 N-말단 아스파라긴(야생형 인슐린의 천연 B2 잔기), 알라닌 또는 글루탐산으로 시작할 수 있고, 선택적으로 제2 위치에서 알라닌 또는 글루탐산으로 시작할 수 있다; 마찬가지로, des-[B1-B3] 유사체의 변이체 B사슬은 N-말단 글루타민(야생형 인슐린의 천연 B3 잔기), 알라닌 또는 글루탐산으로 시작할 수 있다. 변형체 B사슬의 새로운 N 말단에 또는 이와 인접한 상기 치환은 야생형 위치 B3에서의 아스파라긴 및 야생형 위치 B4에서의 글루타민의 화학적 분해를 회피하기 위한 것이다. 글루탐산의 상기 치환은 또한 중성 pH에서 인슐린 유사체의 순 음전하를 증가시켜, 중성 pH에서의 용해도를 향상시킬 것으로 기대된다.
또한, 인간과 동물의 인슐린 유사성 및 당뇨병 환자에 동물성 인슐린을 사용했던 과거에 비추어 볼 때, 인슐린 서열에서 기타 사소한 변형, 특히 "보수적"으로 간주되는 치환이 도입될 수 있다는 것도 고려된다. 예컨대, 본 발명의 사상을 벗어나지 않는 범위에서 유사한 측쇄를 갖는 아미노산의 군 내에서 추가적인 아미노산 치환이 형성될 수 있다. 이들은 중성의 소수성 아미노산을 포함한다: Alanine(Ala 또는 A), 발린(Val 또는 V), 류신(Leu 또는 L), 이소류신(Ile 또는 I), 프롤린(Pro 또는 P), 트립토판(Trp 또는 W), 페닐알라닌(Phe 또는 F) 및 메티오닌(Met 또는 M). 마찬가지로, 중성의 극성 아미노산은 글리신(Gly 또는 G), 세린(Ser 또는 S), 트레오닌(Thr 또는 T), 티로신(Tyr 또는 Y), 시스테인(Cys 또는 C), 글루타민(Glu 또는 Q) 및 아스파라긴(Asn 또는 N) 중에서 서로 치환될 수 있다. 산성 아미노산은 아스파르트산(Asp 또는 D) 및 글루타민산(Glu 또는 E)이다. 염기성 아미노산 치환(리신(Lys 또는 K), 아르기닌(Arg 또는 R) 및 히스티딘(His 또는 H)을 포함함)을 도입하는 것은 이러한 부류의 유사체의 증가된 순 음전하를 유지하기 위해서는 바람직하지 않다. 별도로 언급하지 않는 한 또는 문맥상 명백한 경우를 제외하고는 본 명세서에 언급된 아미노산은 L-아미노산으로 간주되어야 한다. 표준 아미노산은 동일한 화학 분류에 속하는 비표준 아미노산으로 대체될 수도 있다.
비교 목적상, 인간 프로인슐린의 아미노산 염기서열은 서열 번호 1로 제공된다.
서열 번호: 1(인간 프로인슐린)
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
인간 인슐린의 A 사슬의 아미노산 서열은 서열 번호 2로 제공된다.
서열 번호 2 (인간 A사슬; A1-A21 위치의 잔기)
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
인간 인슐린의 B사슬의 아미노산 서열은 서열 번호 3으로 제공된다.
서열 번호 3(인간 B사슬; B1-B30 위치의 잔기)
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr
본 발명의 변형된 인슐린의 아미노산 서열은 일반적으로 서열 번호 4 및 서열 번호 5로 부여되며, 이때 6개의 시스테인 잔기는 야생형 인간 인슐린에서와 같이 쌍을 이루어 3개의 이황화물 가교를 제공한다.
서열 번호 4
A사슬
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Xaai-Ser-Ile-Cys-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Gln-Leu-Xaa5-Asn-Tyr-Cys-Xaa6
서열 번호 5
B사슬
Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Ala-Xaa11-Ala-Leu-Tyr-Xaa12-Xaa13-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Xaa14-Xaa15-Thr-Xaa16-Xaa17
Xaa1(A8 위치)은 Thr(야생형 인슐린에서와 같음), His, Glu 또는 기타 비-β-분지형 아미노산일 수 있고; Xaa2는 Ser(야생형 인슐린에서와 같음),Ala, Asp, Glu 또는 His일 수 있고; Xaa3는 Leu(야생형 인슐린에서와 같음), Ala, Glu, His, Phe, Tyr 또는 Trp일 수 있고; Xaa4는 Tyr(야생형 인슐린에서와 같음), Ala, Glu, Gln, His 또는 Leu일 수 있고; Xaa5는 Glu(야생형 인슐린에서와 같음), Ala, Arg, Gln, His, Leu, Phe 또는 Tyr일 수 있고; Xaa6은 Asn(야생형 인슐린에서와 같음), Ala, Gly 또는 Glu일 수 있고; Xaa7-Xaa8-Xaa9는 야생형 인간 인슐린으로서의 Phe-Val-Asn이거나, N-말단 결실된 변이체인 Val-Asn(des-B1; 잔기 Xaa7 없음)이거나, Asn(des-B1, B2; 잔기 Xaa7 없음, 잔기 Xaa8 없음)이거나, 생략하거나(des-B1-B3; 잔기 Xaa7 없음, 잔기 Xaa8 없음, 잔기 Xaa9 없음), 또는 선택적으로 각 des-B1 변이체(Ala-Asn, Glu-Asn, Ala-Ala, Ala-Glu 또는 Glu-Glu로 시작), a des-B1, B2 변이체(Asn-Glu, Asn-Ala, Ala-Asn, Glu-Asn, Ala-Ala, Ala-Glu, Glu-Ala 또는 Glu-Glu로 시작) 또는 a des-B1-B3 변이체(Ala-His 또는 Glu-His로 시작)일 수 있고; Xaa10은 Gln(야생형 인슐린에서와 같음), Ala 또는 Glu일 수 있고; Xaa11은 Glu(야생형 인슐린에서와 같음), Ala, Gln, His 또는 Leu일 수 있고; Xaa12는 Leu(야생형 인슐린에서와 같음), Ala, Arg, Glu, His, Lys, Phe, Trp, Tyr 또는 Val일 수 있고; Xaa13은 Val(야생형 인슐린에서와 같음), Ala, His, Leu, Lys, Glu, Phe, Thr, Trp 또는 Tyr일 수 있고; Xaa14는 Pro(야생형 인슐린에서와 같음), Ala, Arg, Glu 또는 Lys일 수 있고; Xaa15는 Lys(야생형 인슐린에서와 같음), Ala, Arg, Glu 또는 Pro일 수 있고; Xaa16-Xaa17은 B사슬의 C-말단 모노펩티드 또는 디펩티드 확장을 선택적으로 제공함으로써, 하나 이상의 잔기가 산성 측쇄가 된다. 본 발명의 유사체는 C-말단 연장 Xaa16-Xaa17이 결여될 수 있고 위치 B30에서 ThrB30(또는 기타 아미노산)이 결여될 수도 있다.
따라서, 본 발명의 유사체는 서열 번호 6 내지 26에 나타난 바와 같이 B사슬의 N-말단 결실(des-B1, des-B1, B2 또는 des-B1-B3)을 선택적으로 포함할 수 있다. 상기 N-말단 잔기들은 수용체 결합에는 필요하지 않지만, 생합성 단일 사슬 전구체에서 존재함으로써 소포체에서 본래의 이황화물이 쌍을 이루는 효율을 증가시키게 되어 생산 수율을 높이는 것으로 간주된다. 비한정적인 예로서, 하기 서열들은 N-말단 결실을 포함하는 변이체 B사슬들을 예시한다.
본 발명에 따른 특정 A-사슬 및 B-사슬 서열의 예들에는 서열 번호 6 내지 104를 포함한다.
서열 번호 6: GluB28-인슐린의 des-(B1) 유도체
Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Glu-Lys-Thr
서열 번호 7: GluB28-인슐린의 des-(B1, B2) 유도체
Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Glu-Lys-Thr
서열 번호 8: GluB28-인슐린의 des-(B1-B3) 유도체
Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Glu-Lys-Thr
서열 번호 9: AspB28-인슐린의 des-(B1) 유도체
Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Lys-Thr
서열 번호 10: AspB28-인슐린의 des-(B1, B2) 유도체
Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Lys-Thr
서열 번호 11: AspB28-인슐린의 des-(B1-B3) 유도체
Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Lys-Thr
서열 번호 12: (LysB28, ProB29)-인슐린의 des-(B1) 유도체
Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr
서열 번호 13: (LysB28, ProB29)-인슐린의 des-(B1, B2) 유도체
Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr
서열 번호 14: (LysB28, ProB29)-인슐린의 des-(B1-B3) 유도체
Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr
서열 번호 15: (AlaB28)-인슐린의 des-(B1) 유도체
Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Ala-Lys-Thr
서열 번호 16: (AlaB28)-인슐린의 des-(B1, B2) 유도체
Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Ala-Lys-Thr
서열 번호 17: (AlaB28)-인슐린의 des-(B1-B3) 유도체
Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Ala-Lys-Thr
서열 번호 18: (GluB28, ProB29)-인슐린의 des-(B1) 유도체
Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Glu-Pro-Thr
서열 번호 19: (GluB28, ProB29)-인슐린의 des-(B1, B2) 유도체
Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Glu-Pro-Thr
서열 번호 20: (GluB28, ProB29)-인슐린의 des-(B1-B3) 유도체
Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Glu-Pro-Thr
서열 번호 21: (AlaB28, ProB29)-인슐린의 des-(B1) 유도체
Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Ala-Pro-Thr
서열 번호 22: (AlaB28, ProB29)-인슐린의 des-(B1, B2) 유도체
Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Ala-Pro-Thr
서열 번호 23: (AlaB28, ProB29)-인슐린의 des-(B1-B3) 유도체
Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Ala-Pro-Thr
상기 N-말단 결실들을 갖는 변이체 B 사슬들을 함유하는 본 발명의 인슐린 유사체는 비한정적인 예로서의 하기 서열에 예시된 바와 같이 새로운 N 말단 또는 그 근처에 아미노산 치환체를 함유할 수도 있다.
서열 번호 24: GluB28-인슐린의 des-(B1) 유도체이며, 이때 변이체 B사슬이 Ala-Asn, Glu-Asn, Val-Ala, Val-Glu, Glu-Ala, 또는 Glu-Glu로 시작한다.
Xaa-Xaa-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Glu-Lys-Thr
서열 번호 25: GluB28-인슐린의 des-(B1, B2) 유도체이며, 이때 변이체 B사슬이 Asn-Glu, Asn-Ala, Ala-Gln, Glu-Gln, Ala-Glu, Glu-Glu, 또는 Glu-Ala로 시작한다.
Xaa-Xaa-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Glu-Lys-Thr
서열 번호 26: GluB28-인슐린의 des-(B1-B3) 유도체이며, 이때 새로운 N-말단 잔기는 Ala 또는 Glu이다.
Xaa-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Glu-Lys-Thr
서열 번호 27: AspB28-인슐린의 des-(B1) 유도체이며, 이때 변이체 B사슬이 Ala-Asn, Glu-Asn, Val-Ala, Val-Glu, Glu-Ala, 또는 Glu-Glu로 시작한다.
Xaa-Xaa-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Lys-Thr
서열 번호 28: AspB28-인슐린의 des-(B1, B2) 유도체이며, 이때 변이체 B사슬이 Asn-Glu, Asn-Ala, Ala-Gln, Glu-Gln, Ala-Glu, Glu-Glu, 또는 Glu-Ala로 시작한다.
Xaa-Xaa-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Lys-Thr
서열 번호 29: AspB28-인슐린의 des-(B1-B3) 유도체이며, 이때 새로운 N-말단 잔기는 Ala 또는 Glu이다.
Xaa-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Lys-Thr
서열 번호 30: (LysB28, ProB29)-인슐린의 des-(B1) 유도체이며, 이때 변이체 B사슬이 Ala-Asn, Glu-Asn, Val-Ala, Val-Glu, Glu-Ala, 또는 Glu-Glu로 시작한다.
Xaa-Xaa-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr
서열 번호 31: (LysB28, ProB29)-인슐린의 des-(B1, B2) 유도체이며, 이때 변이체 B사슬이 Asn-Glu, Asn-Ala, Ala-Gln, Glu-Gln, Ala-Glu, Glu-Glu, 또는 Glu-Ala로 시작한다.
Xaa-Xaa-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr
서열 번호 32: (LysB28, ProB29)-인슐린의 des-(B1-B3) 유도체이며, 이때 새로운 N-말단 잔기는 Ala 또는 Glu이다.
Xaa-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr
서열 번호 33: (GluB28)-인슐린의 des-(B1) 유도체이며, 이때 변이체 B사슬이 Ala-Asn, Glu-Asn, Val-Ala, Val-Glu, Glu-Ala, 또는 Glu-Glu로 시작한다.
Xaa-Xaa-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Glu-Lys-Thr
서열 번호 34: (AlaB28)-인슐린의 des-(B1, B2) 유도체이며, 이때 변이체 B사슬이 Asn-Glu, Asn-Ala, Ala-Gln, Glu-Gln, Ala-Glu, Glu-Glu, 또는 Glu-Ala로 시작한다.
Xaa-Xaa-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Ala-Lys-Thr
서열 번호 35: (AlaB28)-인슐린의 des-(B1-B3) 유도체이며, 이때 새로운 N-말단 잔기는 Ala 또는 Glu이다.
Xaa-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Ala-Lys-Thr
서열 번호 36: (GluB28, ProB29)-인슐린의 des-(B1) 유도체이며, 이때 변이체 B사슬이 Ala-Asn, Glu-Asn, Val-Ala, Val-Glu, Glu-Ala, 또는 Glu-Glu로 시작한다.
Xaa-Xaa-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Glu-Pro-Thr
서열 번호 37: (GluB28, ProB29)-인슐린의 des-(B1, B2) 유도체이며, 이때 변이체 B사슬이 Asn-Glu, Asn-Ala, Ala-Gln, Glu-Gln, Ala-Glu, Glu-Glu, 또는 Glu-Ala로 시작한다.
Xaa-Xaa-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Glu-Pro-Thr
서열 번호 38: (GluB28, ProB29)-인슐린의 des-(B1-B3) 유도체이며, 이때 새로운 N-말단 잔기는 Ala 또는 Glu이다.
Xaa-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Glu-Pro-Thr
서열 번호 39: (AlaB28, ProB29)-인슐린의 des-(B1) 유도체이며, 이때 변이체 B사슬이 Ala-Asn, Glu-Asn, Val-Ala, Val-Glu, Glu-Ala, 또는 Glu-Glu로 시작한다.
Xaa-Xaa-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Ala-Pro-Thr
서열 번호 40: (AlaB28, ProB29)-인슐린의 des-(B1, B2) 유도체이며, 이때 변이체 B사슬이 Asn-Glu, Asn-Ala, Ala-Gln, Glu-Gln, Ala-Glu, Glu-Glu, 또는 Glu-Ala로 시작한다.
Xaa-Xaa-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Ala-Pro-Thr
서열 번호 41: (AlaB28, ProB29)-인슐린의 des-(B1-B3) 유도체이며, 이때 새로운 N-말단 잔기는 Ala 또는 Glu이다.
Xaa-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Ala-Pro-Thr
본 발명에 따른 특정 A-사슬 및 B-사슬 폴리펩티드의 또 다른 예들에는 다음의 것들을 포함한다:
서열 번호 42(HA8 EA14 QA17):
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Glu-Gln-Leu-Gln-Asn-Tyr-Cys-Asn
서열 번호 43 (des B1 AB2 EB29):
Ala-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr
서열 번호 44 (EA8 EA14 QA17):
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Glu-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Glu-Gln-Leu-Gln-Asn-Tyr-Cys-Asn
서열 번호 45 (des B1 AB2 des B30):
Ala-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys
서열 번호 46 (des B1 EB2 des B30):
Glu-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys
서열 번호 47 (des[B1 B2] EB3 des B30):
Glu-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys
서열 번호 48 (des B1 des B30):
Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys
서열 번호 49 (HA8, EA14)
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Glu-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
서열 번호 50 (des B1, EB29)
Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr
서열 번호 51 (des B1 QB13 des B30)
Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Gln-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys
서열 번호 52 (EA8, EA14 RA17)
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Glu-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Glu-Gln-Leu-Arg-Asn-Tyr-Cys-Asn
서열 번호 53 (des B1 QB13 EB 22 des B30)
Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Gln-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Glu-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys
서열 번호 54 (HA8 EA14 RA17)
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Glu-Gln-Leu-Arg-Asn-Tyr-Cys-Asn
서열 번호 55 (des B1 EB 22 des B30):
Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Glu-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys
서열 번호 56 (des B1, QB13 EB29)
Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Gln-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr
서열 번호 57 (HA8 WA13)
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Trp-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
서열 번호 58 (HA8 LA14 QA17):
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Leu-Gln-Leu-Gln-Asn-Tyr-Cys-Asn
서열 번호 59 (EA8 WA13)
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Glu-Ser-Ile-Cys-Ser-Trp-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
서열 번호 60 (EA8)
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Glu-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
서열 번호 61 (EA8 LA14 RA17):
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Glu-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Leu-Gln-Leu-Arg-Asn-Tyr-Cys-Asn
서열 번호 62 (des B1 EB2 EB29):
Glu-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr
서열 번호 63 (des B1 EB2 EB17 des B30):
Glu-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Glu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys
서열 번호 64 (des B1 EB2 FB17 des B30):
Glu-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Phe-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys
서열 번호 65 (des B1 EB2 NB17 des B30):
Glu-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Asn-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys
서열 번호 66 (des B1 AB2 EB17 des B30):
Ala-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Glu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys
서열 번호 67 (des B1 AB2 FB17 des B30):
Ala-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Phe-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys
서열 번호 68 (des [B1, B2] EB29)
Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr
서열 번호 69 (des [B1, B2] des B30):
Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys
서열 번호 70 (des [B1, B2] QB13 des B30):
Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Gln-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys
서열 번호 71 (des [B1,B2], QB13 EB29)
Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Gln-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr
서열 번호 72 (des [B1, B2] QB13 EB22 des B30):
Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Gln-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Glu-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys
서열 번호 73 (des [B1, B2] EB 22 des B30):
Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Glu-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys
서열 번호 74 (EA8 LA14 QA17):
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Glu-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Leu-Gln-Leu-Gln-Asn-Tyr-Cys-Asn
서열 번호 75 (HA8)
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
서열 번호 76 (EA8 LA14)
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Glu-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Leu-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
서열 번호 77 (EA8 EA14)
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Glu-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Glu-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
서열 번호 78 (EA8 QA17)
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Glu-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Gln-Asn-Tyr-Cys-Asn
서열 번호 79 (EA8 WA13 EA14)
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Glu-Ser-Ile-Cys-Ser-Trp-Glu-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
서열 번호 80 (HA8 WA13 EA14)
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Trp-Glu-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
서열 번호 81 (des [B1, B2] AB3 des B30):
Ala-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys
서열 번호 82 (des [B1, B2] EB3 des B30):
Glu-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys
서열 번호 83 (des [B1,B2] EB3 EB29)
Glu-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr
서열 번호 84 (des [B1,B2] AB3 EB29)
Ala-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr
서열 번호 85 (des [B1, B2] EB3 FB17 des B30):
Glu-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Phe-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys
서열 번호 86 (des [B1, B2] EB3 EB17 des B30):
Glu-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Glu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys
서열 번호 87 (des [B1, B2] EB3 NB17 des B30):
Glu-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Asn-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys
서열 번호 88 (des [B1,B2] EB3 FB17 EB29)
Glu-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Phe-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr
서열 번호 89 (des [B1-B3] des B30):
Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys
서열 번호 90 (des [B1-B3] QB13 des B30):
Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Gln-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys
서열 번호 91 (des [B1-B3] EB29)
Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr
서열 번호 92 (des [B1-B3] QB13 EB29)
Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Gln-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr
서열 번호 93 (des [B1-B3] QB13 EB22 des B30):
Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Gln-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Glu-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys
서열 번호 94 (des [B1-B3] QB13 FB17 des B30):
Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Gln-Ala-Leu-Tyr-Phe-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys
서열 번호 95 (des [B1-B3] FB17 des B30):
Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Phe-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys
서열 번호 96 (des [B1-B3] FB17 EB29)
Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Phe-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr
서열 번호 97 (des [B1-B3] QB13 FB17 EB29)
Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Gln-Ala-Leu-Tyr-Phe-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr
서열 번호 98 (des [B1-B3] EB4 des B30):
Glu-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys
서열 번호 99 (des [B1-B3] AB4 des B30):
Ala-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys
서열 번호 100 (des [B1-B3] EB4 EB29)
Glu-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr
서열 번호 101 (des [B1-B3] AB4 EB29)
Ala-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr
서열 번호 102 (des [B1-B3] EB4 FB17 des B30):
Glu-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Phe-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys
서열 번호 103 (des [B1-B3] EB4 EB17 des B30):
Glu-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Glu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys
서열 번호 104 (des B1 KB2 AB3 EB17):
Lys-Ala-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Glu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr
서열 번호 105 (des B1 KB2 AB3 FB17):
Lys-Ala-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Phe-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr
서열 번호 106 (des B1 KB2 EB3 EB17):
Lys-Glu-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Glu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr
서열 번호 107 (des B1 KB2 EB3 FB17):
Lys-Glu-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Phe-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr
서열 번호 108 (KB2 AB3 EB17):
Phe-Lys-Ala-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Glu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr
서열 번호 109 (KB2 AB3 FB17):
Phe-Lys-Ala-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Phe-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr
서열 번호 110 (KB2 EB3 EB17):
Phe-Lys-Glu-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Glu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr
서열 번호 111 (KB2 EB3 FB17):
Phe-Lys-Glu-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Phe-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr
하기의 표 1은 본 발명에 따른 합성되거나 가시화된 인슐린 유사체 또는 그 프로 인슐린 전구체의 예들을 열거한다. 인슐린 유사체의 대표적인 시료는 제시된 바와 같이 생물학적 활성을 실험하였다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
[본 발명의 인슐린 유사체의 예]
표 2는 플라스미드로부터 합성된 일련의 인슐린 유사체를 제공하며, 이때 단일-사슬 전구체 폴리펩티드의 N-말단 예비-서열을 코딩하는 5'-DNA 요소가 PheB1을 코딩하는 요소에 대한 코돈 5'의 결실을 함유한다. 상기 플라스미드 구조물들은 하기의 항목에서 "desB(마이너스)1"로 표시된다. "KB2"(LysB2)를 함유하는 것들은 트립신 소화가 des-(B1, B2) 유사체가 생성하도록 하는 반면, "KB3"(LysB3)을 함유하는 것들은 트립신 소화가 des-(B1-B3) 유사체를 생성하도록 한다.
Figure pct00006
[desB(마이너스)1 인슐린 유사체]
스트렙토조토신에 의해 당뇨병을 발현시킨 수컷 Sprague-Dawley 쥐(약 300g)의 하위 집합에서 생물학적 활성 및 약역학을 실험하였다. 인슐린 유사체의 수용체-결합 친화도는 야생형 인간 인슐린과 관련하여 결정된 하위 집합이다(데이터 미표시). 렉틴-정제되고 세제-가용화된 인슐린 수용체(아형 A 및 B)에 대한 연구에서 야생형 인간 인슐린에 비해 5% 내지 100% 범위의 값이 관찰되었다. 해리 상수(Kd)는 Whittaker 및 Whittaker(2005. J. Biol. Chem. 280: 20932-20936)에 기술된 바와 같이 수학적 모델에 맞춰 결정하였다; 모델은 이종 경쟁을 가정한 비선형 회귀를 사용했다(Wang, 1995, FEBS Lett. 360: 111-114).STZ 쥐의 꼬리 정맥 내에 IV 볼러스 주사한 후에 인슐린 작용으로 인한 꼬리 단축(foreshortening of tail)하기 위해 인슐린 유사체의 하위 집합들을 실험하였다. 300 그램짜리 쥐 1마리당 마이크로그램에 있어 유사체 투여량을 인슐린 리스프로에 상대적으로 조정함으로써, 유사 최저점들이 관찰되었다(즉, 혈당 농도의 최대 저하). 유사한 혈당 조절을 구현하기 위해 인슐린 리스프로의 질량보다 더 많은 유사체의 질량이 일반적으로 요구되었지만, 5배가 넘는 차이가 나는 경우는 없었다. 본 발명의 6개의 유사체에서 꼬리의 단축이 나타나는 것으로 관찰되었다(곡선 상의 면적으로 정의되며, 0분 내지 300분 사이의 곡선 상의 전체 면적에 대해 90분 내지 300분 사이의 버퍼 대조군 보다 적음). 이들은 다음과 같다: des-B1, GluA8, GluA14, ArgA17, des-B30-인슐린(T-0688), des-B1, GluB2, HisA8, GluA14, GlnA17, des-B30-인슐린(T-0695), des-[B1, B2], GluB3, HisA8, GluA14, GlnA17, des-B30-인슐린-인슐린(T-0706), des-B1, AlaB2, HisA8, GluA14, GlnA17, des-B30-인슐린(T-0715), des-B1, AlaB2, GluA8, GluA14, GlnA17, des-B30-인슐린(T-0719), and des-B1, AlaB2, GluB29, HisA8, GluA14, GlnA17-인슐린(T-0737).
수컷 당뇨 루이스 쥐에서 이들 유사체의 효능을 평가하였다. 실험용의 유사체, 인슐린 리스프로 및 희석액 전용 대조군 용액을 피하 주사하였고, 임상 혈당측정기를 이용한 연속 측정에 의해 혈당(BG)의 변화를 모니터링하였다. 투여량 반응은 희석액 대조군을 초과하는 최대 BG 저하로 계산하여 구성하였다. 최적의 투여량 반응 곡선을 계산하고 최대 및 최소 방울 사이의 절반을 달성하는 데 필요한 보간 투여량으로 결정된 EC50을 계산하기 위해 반복적 가중치를 사용하여 랭뮤어 등온선을 조정하였다. 실험상의 모든 유사체들은 아연 없이 제형화되었다. 결과는 도 3에 제시되어 있다. 실험된 각 유사체의 효능은 인슐린 리스프로의 효능의 2/3 이상이었다. 3개의 유사체의 효능은 인슐린 리스프로, des-B1, GluA8, GluA14, ArgA17, des-B30-인슐린(T-0688), des-[B1, B2], GluB3, HisA8, GluA14, GlnA17, des-B30-인슐린-인슐린(T-0706), 및 des-B1, AlaB2, GluA8, GluA14, GlnA17, des-B30-인슐린(T-0719)의 효능 이상으로 나타났다.
열역학적 안정성. CD-모니터링 구아디닌 변성에 의해 인슐린 유사체의 열역학적 안정성을 조사하였다. 상기 방법은 기술된 바와 같다(Hua, Q.X., 외 J. Biol. Chem. 283, 14703-16 (2008)). 간단히 설명하면, 전개된 (ΔGu)의 자유 에너지의 변화는 25°C 및 pH 7.4에서의 원편광 이색 분광법(CD)으로 검출된 구아니딘 변성에 의해 측정되었다. 이들 유사체 각각이 인슐린 리스프로(전개된 ΔGu의 자유 에너지가 25°C에서 2.9 ± 0.1 kcal/몰)보다 화학 변성에 대해 안정적인(실제로 더 안정적인) 결과를 보인다. 하기 표 3은 선택된 유사체에 대한 결과를 나타내고 있다. 표 3에 제공된 25°C에서의 ΔGu의 평가는 제로 변성제 농도로 추정된 유사체 2-상태 모델을 적용하여 획득하였다. ΔGu의 이러한 높은 값을 통해, 동일 조건에서의 야생형 인슐린 또는 KP-인슐린의 연구에서 관찰되는 것보다, 본 발명에 따른 인슐린 유사체가 무아연 조건에서의 화학적 분해에 대해 향상된 내성을 가진다는 것을 예측할 수 있다.
도 4는 본 발명에 따른 인간 인슐린(HI), 인슐린 리스프로(lispro), AspB10-KP 인슐린(DB10 KP) 및 EA8 EA14 RA17 des B1 des B30 인슐린의 유사한 비교를 위한 전개 값들의 자유 에너지 변화에 관한 그래프를 제공한다. 전개된 ΔGu의 자유 에너지의 변화는 25°C 및 pH 7.4에서 원편광 이색 분광법(CD)으로 검출된 구아니딘 변성에 의해 측정되었다. 실험상의 유사체들은 아연 없이 제형화되었다. 안정성의 증가는 적어도 1 kcal/몰로서, 해당 기술 분야에 공지된 유사체인 AspB10-인슐린과 유사하거나 더 큰 ΔGu 값을 달성하여, 유효한 무아연 제형을 가능하게 하는 충분한 안정성을 갖도록 한다. 이러한 데이터는 무아연 인슐린 유사체가 비천연 아미노산 치환체를 사용하지 않고 위치 B10에서의 천연 히스티딘을 사용하여 AspB10-인슐린만큼 안정적일 수 있음을 입증한다.
Figure pct00007
[선택된 인슐린 유사체의 열역학적 안정성]
물리적 안정성 - 고분자량 단백질 형성. 본 발명의 유사체의 안정성은 고분자량 단백질의 형성을 분석하여 안정성에 대해서도 실험하였다. 여러 인슐린 유사체의 명목 U-100 제형들에 45°C에서 7일간 열응력을 가하여, 역상 HPLC에 의한 고분자량 단백질(HMWP)의 형성을 분석하였다. 도 5는 1일부터 7일까지 하기의 유사체들에 대한 HMWP의 퍼센트 변화를 나타낸다: des-B1, GluA8, GluA14, ArgA17, des-B30-인슐린(T-0688), des-B1, GluB2, HisA8, GluA14, GlnA17, des-B30-인슐린(T-0695), des-[B1, B2], GluB3, HisA8, GluA14, GlnA17, des-B30-인슐린-인슐린(T-0706), des-B1, AlaB2, HisA8, GluA14, GlnA17, des-B30-인슐린(T-0715), des-B1, AlaB2, GluA8, GluA14, GlnA17, des-B30-인슐린(T-0719), 및 des-B1, AlaB2, GluB29, HisA8, GluA14, GlnA17-인슐린(T-0737)??. 실험상의 모든 유사체들은 아연 없이 제형화되었다. (인슐린 유사체의 용출 프로파일에 대한) 2 퍼센트 이상의 면적 손실은 실패로 간주되었다. 본 발명에 따른 유사체 각각의 면적 손실은 2 퍼센트 미만으로 나타났으며, 실제 면적 손실은 1.5 퍼센트 미만이었다. 실험한 5개 유사체(T-0695, T-0706, T-0715, T-0719, T-0737) 중 4개는 모두 면적 손실이 1 퍼센트 미만으로 나타났다. 이러한 방식에 의하면, 아연 없이 제형화하여 실험한 인슐린 유사체는 아연 없는 용액으로 재구성된 인슐린 리스프로에 비해 표준 Humalog® U100(인슐린 리스프로; Eli Lilly)과 작용 측면에서 더 근접했다.
소섬유 형성 평가. 인슐린 리스프로 또는 본 발명의 인슐린 유사체 실시예들은 0.1% 아지드화 나트륨을 함유하는 인산염 완충 식염수(pH 7.4) 중에 60 μM로 만들어, 액체/기체 계면의 존재하에 유리 바이알 내에 37°C에서 부드럽게 진동시켰다. 부분 표본들을 정기적으로 채취하여 추후의 티오플라빈 T(ThT) 형광 분석을 위해 동결시켰다. 시각적 외관이 탁하게 되면 분석이 종료되었다. 따라서, ThT-양성 세동의 발병 이전에 지연 시간의 연장을 위해 5가지 유사체들을 실험하였다: des-B1, GluA8, GluA14, ArgA17, des-B30-인슐린(T-0688), des-B1, GluB2, HisA8, GluA14, GlnA17, des-B30-인슐린(T-0695), des-[B1, B2], GluB3, HisA8, GluA14, GlnA17, des-B30-인슐린-인슐린(T-0706), des-B1, AlaB2, HisA8, GluA14, GlnA17, des-B30-인슐린(T-0715), 및 des-B1, AlaB2, GluB29, HisA8, GluA14, GlnA17-인슐린(T-0737). 다중 검사에서, 인슐린 리스프로는 이러한 조건에서 2 내지 4일의 지연 시간을 나타냈지만 실험한 유사체 각각의 지연 시간은 적어도 10배 연장되었다.
유사한 분석도 수행되었다. 인슐린 리스프로 또는 본 발명의 인슐린 유사체 실시예들은 0.1% 아지드화 나트륨을 함유하는 인산염 완충 식염수(PBS; pH 7.4) 중에 U10의 최종 농도로 만들어, 액체/기체 계면의 존재하에 유리 바이알 내에 37°C에서 부드럽게 진동시켰다. 티오플라빈 T(ThT) 1 μM를 각 용액에 첨가하고 150 μl를 각 웰에 첨가하였다. 상기 플레이트를 40°C에서 1000 cpm의 일정한 선형 진동으로 배양하였다. 440/480 nm의 여기/방출 파장에 의한 티오플라빈 T(ThT) 형광 분석. 도 6은 이들 인슐린 유사체 및 인슐린 리스프로의 세동 지연 시간을 비교한 그래프이다. 테스트된 시료는 다음과 같다: des-B1, GluA8, GluA14, ArgA17, des-B30-인슐린(T-0688), des-B1, GluB2, HisA8, GluA14, GlnA17, des-B30-인슐린(T-0695), des-[B1, B2], GluB3, HisA8, GluA14, GlnA17, des-B30-인슐린-인슐린(T-0706), des-B1, AlaB2, HisA8, GluA14, GlnA17, des-B30- 인슐린(T-0715), des-B1, AlaB2, GluB29, HisA8, GluA14, GlnA17-인슐린(T-0737), 및 des-B1, GluA8, GluA14, GlnA17, AlaB2, des-B30-인슐린(T-0719).
IGF-R 결합 친화도. 전술한 바와 같이, 유사분열촉진 제1형 IGF 수용체(IGF-R1)에 대한 감소된 결합이 유리할 수 있다. 표 4 및 도 7은 인슐린 리스프로에 대한 본 발명의 인슐린 유사체의 여러 실시예에의 결합 친화도를 나타내고 있다. 테스트된 시료는 다음과 같다: des-B1, GluA8, GluA14, ArgA17, des-B30-인슐린(T-0688), des-B1, GluB2, HisA8, GluA14, GlnA17, des-B30-인슐린(T-0695), des-[B1, B2], GluB3, HisA8, GluA14, GlnA17, des-B30-인슐린-인슐린(T-0706), des-B1, AlaB2, HisA8, GluA14, GlnA17, des-B30-인슐린(T-0715), des-B1, AlaB2, GluB29, HisA8, GluA14, GlnA17-인슐린(T-0737), 및 des-B1, GluA8, GluA14, GlnA17, AlaB2, des-B30-인슐린(T-0719). 연구에서는 항-FLAG 단일 클론 항체로 코팅된 96개의 웰 플레이트에 결합된 인간 제1형 인슐린-유사 성장 인자 수용체 (hIGFR)에 대해 FLAG 항원결정-태그된 홀로수용체를 사용했다. 상대 친화도는 결합된 125I로 라벨 처리된 인간 인슐린의 경쟁적 변위에 의해 결정되는 해리 상수의 비율로 정의된다. 실험상의 모든 유사체들은 아연 없이 제형화되었다. 여기서 실험된 본 발명의 각 구현예는 인슐린 리스프로보다 IGF-R에 대한 친화도가 26% 이하로 나타났다. T-0688, T-0706, T-0719 및 T-0737 이들 4개 유사체는 IGF-R1에 대한 인슐린 리스프로의 친화도가 20% 미만으로 나타났다. T-0719인 1개 유사체는 IGF-R1에 대한 인슐린 리스프로의 결합 친화도가 10% 미만으로 나타났다.
T-코드 염기서열 IGF1 -R 　 　
( Rel . Aff .) kD 결합 친화도
　 명세 < HI/KP 　 　
　 　
Lispro Lispro 100% 　 　
T-0688 EA8 EA14 RA17 desB1 desB30 11% 6.72 0.15
T-0695 HA8 EA14 QA17 desB1 EB2 desB30 25% 4.33 0.23
T-0706 HA8 EA14 QA17 des[B1-B2] EB3 desB30 18% 6.09 0.16
T-0715 HA8 EA14 QA17 desB1 AB2 desB30 26% 4.16 0.24
T-0719 EA8 EA14 QA17 desB1 AB2 desB30 5% 38.04 0.03
T-0737 HA8 EA14 QA17 desB1 AB2 EB29 16% 12.52 0.08
[상대적 IGF-R1 결합 친화도]
유사분열촉진 - 사이클린 조절. RT-qPCR 분석을 통해, 상이한 인슐린 유사체들을 처리하여 자극된 유사분열촉진 프로브의 전사적 반응을 모니터링 하였다. 주요 프로브로서, 2개의 사이클린의 발현을 조절하였다. 사이클린 D1 상향 조절 및 사이클린 G2 하향 조절은 활성 세포 분열주기(일반적으로 유사분열촉진과 상호 관련이 있는 증식)와 상호 관련이 있다. D1/G2 전사적 수준의 비율을 통해 화합물의 유사분열촉진의 잠재력을 이해할 수 있다; 비율이 높을수록 유사분열촉진의 가능성이 높아진다. 본 분석에서, 인슐린 수용체(IR)의 발현이 높은 쥐의 근섬유 세표주(L6)는 세포 모델로 사용되었다. 실험상의 모든 유사체들은 아연 없이 제형화되었다. 시험된 시료는 다음과 같다: des-B1, GluA8, GluA14, ArgA17, des-B30-인슐린(T-0688), des-B1, GluB2, HisA8, GluA14, GlnA17, des-B30-인슐린(T-0695), des-[B1, B2], GluB3, HisA8, GluA14, GlnA17, des-B30-인슐린-인슐린(T-0706), des-B1, AlaB2, HisA8, GluA14, GlnA17, des-B30-인슐린(T-0715), des-B1, AlaB2, GluB29, HisA8, GluA14, GlnA17-인슐린(T-0737), 및 des-B1, GluA8, GluA14, GlnA17, AlaB2, des-B30-인슐린(T-0719). 사이클린 D1과 사이클린 G2에 대한 mRNA 누적 및 사이클린 D1/사이클린 G2의 비율은 표준 편차와 함께 표 5에 나타나 있다. 사이클린 D1 mRNA 누적의 변화는 도 8에 제공된다. 실험된 본 발명의 실시예 각각은 인간 인슐린 및 인슐린 리스프로보다 적은 사이클린 D1/사이클린 G2 비율을 가졌다.
T-코드 염기서열 D1 SD D1 G2 SD G2 Cyclin D1/G2
HI HI 5.5 1.0 0.29 0.04 18.8
DB10 DB10 18.0 1.2 0.13 0.01 138.8
Lispro Lispro 4.5 0.3 0.36 0.03 12.4
T-0688 EA8 EA14 RA17 desB1 desB30 2.6 0.3 0.49 0.07 5.4
T-0695 HA8 EA14 QA17 desB1 EB2 desB30 4.0 0.8 0.34 0.06 11.8
T-0706 HA8 EA14 QA17 des[B1-B2] EB3 desB30 3.3 0.1 0.40 0.13 8.1
T-0715 HA8 EA14 QA17 desB1 AB2 desB30 3.1 0.1 0.45 0.03 6.8
T-0719 EA8 EA14 QA17 desB1 AB2 desB30 3.0 0.3 0.47 0.03 6.5
T-0737 HA8 EA14 QA17 desB1 AB2 EB29 3.8 1.9 0.48 0.30 7.9
[사이클린 D1 및 사이클린 G 발현]
이러한 유사체의 대부분 역시 STZ 쥐(위)에서 IV 볼러스 주사시 단축된 꼬리를 나타냈기 때문에, 이러한 데이터는 원칙적으로 원하는 치료상 및 약리학상의 특성을 얻기 위한 변형의 조합을 획득하도록 상충을 회피할 수 있음을 보여준다.본 발명인들은 당뇨병 또는 대사 증후군의 치료를 위한 방법을 제공하기 위해 본 발명에 따른 유사체를 구상하였다. 인슐린 유사체의 전달 경로는 주사기 또는 펜 장치를 사용한 피하 주사에 의한다. 본 발명의 인슐린 유사체는 잔기 B1, B1-B2, B1-B3 및/또는 B30의 결실로 인하여 단축된 B-사슬을 함유할 수도 있다. 본 발명의 인슐린 유사체는 1개 또는 2개의 잔기(정위치의 B31 및 B32)의해 연장된 B사슬들을 포함할 수 있으며, 그 중 적어도 하나는 산성 잔기(아스파르트산 또는 글루탐산)이다.
약학 조성물은 금속-이온-안정화된 인슐린 유사체 육량체의 형성을 방지하기 위해 아연 이온 또는 기타 2가 금속 이온을 특별히 배제하는 제형 내에 상기와 같은 인슐린 유사체를 포함할 수 있다. 상기 제제의 pH는 7.0 pH 내지 8.0 pH의 범위에 있다; 완충액(전형적으로 인산나트륨 또는 트리스-염산염)이 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있다. 이러한 제형에서, 인슐린 유사체의 농도는 통상적으로 0.6 mM 내지 6.0 mM의 범위일 것이다; 6 mM까지의 농도는 바이알 또는 펜에서 사용할 수 있다; 보다 농축된 제제(U-200 이상)는 현저한 인슐린 저항성을 가진 환자에게 특히 유용할 수 있다. 부형제는 피하 저장소에서 혈류로의 호르몬 흡수를 촉진하기 위한 첨가제(나트륨 EDTA, 나트륨 EGTA, 아르기닌 및 니코틴아미드 등), 글리세롤, 글리신, 트리스 염산염 또는 기타 완충액, 염화나트륨 또는 기타 염, 및 페놀 및/또는 메타-크레졸과 같은 항균 보존제를 포함한다. 상기 약학적 조성물은 생리학적 유효량의 조성물을 환자에게 투여함으로써 당뇨병 또는 다른 의학적 상태를 갖는 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다.
개시된 바에 의하면, 제공된 이중 사슬 인슐린 유사체가 전술한 목적을 수행할 것이라는 점은 명백해졌을 것이다. 즉, 이들 인슐린 유사체는 야생형 인슐린과 유사한 생물학적 활성(피하 또는 정맥 주사시 포유 동물에서 혈당 농도를 낮추기 위해 필요한 단백질 단량체의 나노몰로 정의됨)이 나타나지만, 0.6 mM 내지 6.0 mM 범위의 단백질 농도에서 아연 이온(또는 기타 2가 금속 이온)이 없는 제형을 가능하도록 하는 충분한 고유의 안정성을 가진다. 그러므로, 어떠한 변형된 증거도 청구된 본 발명의 범위 내에 있는 것이며, 따라서 특정 구성 요소의 선택은 본 명세서에 개시되고 설명된 본 발명에 사상을 벗어나지 않는 범위에서 결정될 수 있는 것으로 이해되어야 할 것이다.
하기 문헌은 본 명세서에 기술된 실험 및 분석 방법을 당업자가 이해할 수 있도록 인용되었다.
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Lys Thr 20 25 30 <210> 4 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> insulin analogue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X may be Thr, His, Glu, Ala, Met, Gly, Ser, Asp, Lys or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> X may be Ser, Ala, Asp, Glu or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> X may be Leu, Ala, Glu, His, Phe, Tyr or Trp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> X may be Tyr, Ala, Glu, Gln, His or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> X may be Glu, Ala, Arg, Gln, His, Leu, Phe or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> X may be Asn, Ala, Gly or Glu <400> 4 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Xaa Xaa Xaa Gln Leu 1 5 10 15 Xaa Asn Tyr Cys Xaa 20 <210> 5 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> insulin analogue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(3) <223> X may be Phe-Val-Asn or Ala-Asn, Glu-Asn, Ala-Ala, Ala-Glu, Glu-Glu, Asn-Glu, Asn-Ala, Glu-Ala, Ala-His, or Glu-His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X may be Gln, Ala or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> X may be Glu, Ala, Gln, His or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> X may be Leu, Ala, Arg, Glu, His, Lys, Phe, Trp, Tyr or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> X may be Val, Ala, His, Leu, Lys, Glu, Phe, Thr, Trp or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> X may be Pro, Ala, Arg, Glu, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> X may be Lys, Ala, Arg, Glu, or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(32) <223> X is one or two amino acids, one of which is Asp or Glu, or is absent <400> 5 Xaa Xaa Xaa Xaa His Leu Cys Gly Ser His Leu Ala Xaa Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Xaa Xaa Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Xaa Thr Xaa Xaa 20 25 30 <210> 6 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des-(B1) derivative of GluB28-insulin <400> 6 Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu 1 5 10 15 Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Glu Lys Thr 20 25 <210> 7 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des (B1, B2) derivative of GluB28 insulin <400> 7 Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val 1 5 10 15 Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Glu Lys Thr 20 25 <210> 8 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des (B1 B3) derivative of GluB28 insulin <400> 8 Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Glu Lys Thr 20 25 <210> 9 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des (B1) derivative of AspB28 insulin <400> 9 Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu 1 5 10 15 Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Lys Thr 20 25 <210> 10 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des (B1, B2) derivative of AspB28 insulin <400> 10 Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val 1 5 10 15 Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Lys Thr 20 25 <210> 11 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des (B1 B3) derivative of AspB28 insulin <400> 11 Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Lys Thr 20 25 <210> 12 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des (B1) derivative of (LysB28, ProB29) insulin <400> 12 Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu 1 5 10 15 Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr 20 25 <210> 13 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des (B1, B2) derivative of (LysB28, ProB29) insulin <400> 13 Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val 1 5 10 15 Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr 20 25 <210> 14 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des (B1 B3) derivative of (LysB28, ProB29) insulin <400> 14 Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr 20 25 <210> 15 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des (B1) derivative of (Ala B28) insulin <400> 15 Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu 1 5 10 15 Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ala Lys Thr 20 25 <210> 16 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des (B1, B2) derivative of (AlaB28) insulin <400> 16 Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val 1 5 10 15 Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ala Lys Thr 20 25 <210> 17 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des (B1 B3) derivative of (AlaB28) insulin <400> 17 Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ala Lys Thr 20 25 <210> 18 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des (B1) derivative of (GluB28, ProB29) insulin <400> 18 Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu 1 5 10 15 Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Glu Pro Thr 20 25 <210> 19 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des (B1, B2) derivative of (GluB28, ProB29) insulin <400> 19 Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val 1 5 10 15 Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Glu Pro Thr 20 25 <210> 20 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des (B1 B3) derivative of (GluB28, ProB29) insulin <400> 20 Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Glu Pro Thr 20 25 <210> 21 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des (B1) derivative of (AlaB28, ProB29) insulin <400> 21 Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu 1 5 10 15 Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ala Pro Thr 20 25 <210> 22 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des (B1, B2) derivative of (AlaB28, ProB29) insulin <400> 22 Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val 1 5 10 15 Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ala Pro Thr 20 25 <210> 23 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des (B1 B3) derivative of (AlaB28, ProB29) insulin <400> 23 Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ala Pro Thr 20 25 <210> 24 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des (B1) derivative of GluB28 insulin <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> X is Ala Asn, Glu Asn, Val Ala, Val Glu, Glu Ala, or Glu Glu <400> 24 Xaa Xaa Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu 1 5 10 15 Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Glu Lys Thr 20 25 30 <210> 25 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des (B1, B2) derivative of GluB28 insulin <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> X is Asn Glu, Asn Ala, Ala Gln, Glu Gln, Ala Glu, Glu Glu, or Glu Ala <400> 25 Xaa Xaa Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Glu Lys Thr 20 25 30 <210> 26 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des (B1 B3) derivative of GluB28 insulin <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X is Ala or Glu <400> 26 Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val 1 5 10 15 Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Glu Lys Thr 20 25 <210> 27 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des (B1) derivative of AspB28 insulin <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> X is Ala Asn, Glu Asn, Val Ala, Val Glu, Glu Ala, or Glu Glu <400> 27 Xaa Xaa Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu 1 5 10 15 Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Lys Thr 20 25 30 <210> 28 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des (B1, B2) derivative of AspB28 insulin <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> X is Asn Glu, Asn Ala, Ala Gln, Glu Gln, Ala Glu, Glu Glu, or Glu Ala <400> 28 Xaa Xaa Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Lys Thr 20 25 30 <210> 29 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des (B1 B3) derivative of AspB28 insulin <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X is Ala or Glu <400> 29 Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val 1 5 10 15 Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Lys Thr 20 25 <210> 30 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des (B1) derivative of (LysB28, ProB29) insulin <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> X is Ala Asn, Glu Asn, Val Ala, Val Glu, Glu Ala, or Glu Glu <400> 30 Xaa Xaa Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu 1 5 10 15 Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr 20 25 30 <210> 31 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des (B1, B2) derivative of (LysB28, ProB29) insulin <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> X is Asn Glu, Asn Ala, Ala Gln, Glu Gln, Ala Glu, Glu Glu, or Glu Ala <400> 31 Xaa Xaa Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr 20 25 30 <210> 32 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des (B1 B3) derivative of (LysB28, ProB29) insulin <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X is Ala or Glu <400> 32 Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val 1 5 10 15 Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr 20 25 <210> 33 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des (B1) derivative of (GluB28) insulin <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> X is Ala Asn, Glu Asn, Val Ala, Val Glu, Glu Ala, or Glu Glu <400> 33 Xaa Xaa Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu 1 5 10 15 Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Glu Lys Thr 20 25 30 <210> 34 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des (B1, B2) derivative of (AlaB28) insulin <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> X is Asn Glu, Asn Ala, Ala Gln, Glu Gln, Ala Glu, Glu Glu, or Glu Ala <400> 34 Xaa Xaa Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ala Lys Thr 20 25 30 <210> 35 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des (B1 B3) derivative of (AlaB28) insulin <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X is Ala or Glu <400> 35 Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val 1 5 10 15 Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ala Lys Thr 20 25 <210> 36 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des (B1) derivative of (GluB28, ProB29) insulin <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> X is Ala Asn, Glu Asn, Val Ala, Val Glu, Glu Ala, or Glu Glu <400> 36 Xaa Xaa Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu 1 5 10 15 Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Glu Pro Thr 20 25 30 <210> 37 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des (B1, B2) derivative of (GluB28, ProB29) insulin <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> X is Asn Glu, Asn Ala, Ala Gln, Glu Gln, Ala Glu, Glu Glu, or Glu Ala <400> 37 Xaa Xaa Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Glu Pro Thr 20 25 30 <210> 38 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des (B1 B3) derivative of (GluB28, ProB29) insulin <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X is Ala or Glu <400> 38 Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val 1 5 10 15 Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Glu Pro Thr 20 25 <210> 39 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des (B1) derivative of (AlaB28, ProB29) insulin <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> X is Ala Asn, Glu Asn, Val Ala, Val Glu, Glu Ala, or Glu Glu <400> 39 Xaa Xaa Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu 1 5 10 15 Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ala Pro Thr 20 25 30 <210> 40 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des (B1, B2) derivative of (AlaB28, ProB29) insulin <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> X is Asn Glu, Asn Ala, Ala Gln, Glu Gln, Ala Glu, Glu Glu, or Glu Ala <400> 40 Xaa Xaa Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ala Pro Thr 20 25 30 <210> 41 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des (B1 B3) derivative of (AlaB28, ProB29) insulin <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X is Ala or Glu <400> 41 Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val 1 5 10 15 Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Ala Pro Thr 20 25 <210> 42 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA8 EA14 QA17 insulin A-chain <400> 42 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu 1 5 10 15 Gln Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 43 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des B1 AB2 EB29 insulin B-chain <400> 43 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu 1 5 10 15 Gln Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 44 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EA8 EA14 QA17 insulin A-chain <400> 44 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Glu Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu 1 5 10 15 Gln Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 45 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des B1 AB2 des B30 insulin B-chain <400> 45 Ala Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu 1 5 10 15 Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25 <210> 46 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des B1 EB2 des B30 insulin B-chain <400> 46 Glu Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu 1 5 10 15 Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25 <210> 47 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des [B1 B2] EB3 des B30 insulin B-chain <400> 47 Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val 1 5 10 15 Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25 <210> 48 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des B1 des B30 insulin B-chain <400> 48 Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu 1 5 10 15 Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25 <210> 49 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA8, EA14 insulin A-chain <400> 49 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Glu Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu 1 5 10 15 Arg Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 50 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des B1, EB29 insulin B-chain <400> 50 Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu 1 5 10 15 Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr 20 25 <210> 51 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> desB1 QB13 desB30 insulin B-chain <400> 51 Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Gln Ala Leu Tyr Leu 1 5 10 15 Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25 <210> 52 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EA8, EA14 RA17 insulin A-chain <400> 52 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Glu Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu 1 5 10 15 Arg Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 53 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> desB1 QB13 EB 22 desB30 insulin B-chain <400> 53 Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Gln Ala Leu Tyr Leu 1 5 10 15 Val Cys Gly Glu Glu Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25 <210> 54 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA8 EA14 RA17 insulin A-chain <400> 54 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu 1 5 10 15 Arg Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 55 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des B1 EB 22 des B30 insulin B-chain <400> 55 Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu 1 5 10 15 Val Cys Gly Glu Glu Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25 <210> 56 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des B1, QB13 EB29 insulin B-chain <400> 56 Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Gln Ala Leu Tyr Leu 1 5 10 15 Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr 20 25 <210> 57 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA8 WA13 insulin A-chain <400> 57 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Trp Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 58 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA8 LA14 QA17 insulin A-chain <400> 58 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Leu Gln Leu 1 5 10 15 Gln Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 59 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EA8 WA13 insulin A-chain <400> 59 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Glu Ser Ile Cys Ser Trp Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 60 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EA8 insulin A-chain <400> 60 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Glu Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 61 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EA8 LA14 RA17 insulin A-chain <400> 61 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Glu Ser Ile Cys Ser Leu Leu Gln Leu 1 5 10 15 Arg Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 62 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des B1 EB2 EB29 insulin B-chain <400> 62 Glu Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu 1 5 10 15 Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr 20 25 <210> 63 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des B1 EB2 EB17 des B30 insulin B-chain <400> 63 Glu Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Glu 1 5 10 15 Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25 <210> 64 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des B1 EB2 FB17 des B30 insulin B-chain <400> 64 Glu Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Phe 1 5 10 15 Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25 <210> 65 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des B1 EB2 NB17 des B30 insulin B-chain <400> 65 Glu Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Asn 1 5 10 15 Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25 <210> 66 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des B1 AB2 EB17 des B30 insulin B-chain <400> 66 Ala Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Glu 1 5 10 15 Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25 <210> 67 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des B1 AB2 FB17 des B30 insulin B-chain <400> 67 Ala Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Phe 1 5 10 15 Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25 <210> 68 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des [B1, B2] EB29 insulin B-chain <400> 68 Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val 1 5 10 15 Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr 20 25 <210> 69 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des [B1, B2] des B30 insulin B-chain <400> 69 Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val 1 5 10 15 Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25 <210> 70 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des [B1, B2] QB13 des B30 insulin B-chain <400> 70 Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Gln Ala Leu Tyr Leu Val 1 5 10 15 Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25 <210> 71 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des [B1, B2] QB13, EB29 insulin B-chain <400> 71 Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Gln Ala Leu Tyr Leu Val 1 5 10 15 Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr 20 25 <210> 72 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des [B1, B2] QB13 EB22 des B30 insulin B-chain <400> 72 Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Gln Ala Leu Tyr Leu Val 1 5 10 15 Cys Gly Glu Glu Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25 <210> 73 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des [B1, B2] EB 22 des B30 insulin B-chain <400> 73 Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val 1 5 10 15 Cys Gly Glu Glu Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25 <210> 74 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EA8 LA14 QA17 insulin A-chain <400> 74 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Glu Ser Ile Cys Ser Leu Leu Gln Leu 1 5 10 15 Gln Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 75 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA8 insulin A-chain <400> 75 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 76 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EA8 LA14 insulin A-chain <400> 76 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Glu Ser Ile Cys Ser Leu Leu Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 77 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EA8 EA14 insulin A-chain <400> 77 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Glu Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 78 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EA8 QA17 insulin A-chain <400> 78 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Glu Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Gln Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 79 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EA8 WA13 EA14 insulin A-chain <400> 79 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Glu Ser Ile Cys Ser Trp Glu Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 80 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA8 WA13 EA14 insulin A-chain <400> 80 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Ser Ile Cys Ser Trp Glu Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 81 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des [B1, B2] AB3 des B30 insulin B-chain <400> 81 Ala Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val 1 5 10 15 Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25 <210> 82 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des [B1, B2] EB3 des B30 insulin B-chain <400> 82 Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val 1 5 10 15 Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25 <210> 83 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des [B1,B2] EB3 EB29 insulin B-chain <400> 83 Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val 1 5 10 15 Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr 20 25 <210> 84 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des [B1,B2] AB3 EB29 insulin B-chain <400> 84 Ala Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val 1 5 10 15 Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr 20 25 <210> 85 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des [B1, B2] EB3 FB17 des B30 insulin B-chain <400> 85 Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Phe Val 1 5 10 15 Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25 <210> 86 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des [B1, B2] EB3 EB17 des B30 insulin B-chain <400> 86 Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Glu Val 1 5 10 15 Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25 <210> 87 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des [B1, B2] EB3 NB17 des B30 insulin B-chain <400> 87 Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Asn Val 1 5 10 15 Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25 <210> 88 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des [B1,B2] EB3 FB17 EB29 insulin B-chain <400> 88 Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Phe Val 1 5 10 15 Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr 20 25 <210> 89 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des [B1-B3] des B30 insulin B-chain <400> 89 Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25 <210> 90 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des [B1-B3] QB13 des B30 insulin B-chain <400> 90 Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Gln Ala Leu Tyr Leu Val Cys 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25 <210> 91 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des [B1-B3] EB29 insulin B-chain <400> 91 Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr 20 25 <210> 92 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des [B1-B3] QB13 EB29 insulin B-chain <400> 92 Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Gln Ala Leu Tyr Leu Val Cys 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr 20 25 <210> 93 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des [B1-B3] QB13 EB22 des B30 insulin B-chain <400> 93 Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Gln Ala Leu Tyr Leu Val Cys 1 5 10 15 Gly Glu Glu Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25 <210> 94 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des [B1-B3] QB13 FB17 des B30 insulin B-chain <400> 94 Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Gln Ala Leu Tyr Phe Val Cys 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25 <210> 95 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des [B1-B3] FB17 des B30 insulin B-chain <400> 95 Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Phe Val Cys 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25 <210> 96 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des [B1-B3] FB17 EB29 insulin B-chain <400> 96 Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Phe Val Cys 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr 20 25 <210> 97 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des [B1-B3] QB13 FB17 EB29 insulin B-chain <400> 97 Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Gln Ala Leu Tyr Phe Val Cys 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr 20 25 <210> 98 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des [B1-B3] EB4 des B30 insulin B-chain <400> 98 Glu His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25 <210> 99 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des [B1-B3] AB4 des B30 insulin B-chain <400> 99 Ala His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25 <210> 100 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des [B1-B3] EB4 EB29 insulin B-chain <400> 100 Glu His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr 20 25 <210> 101 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des [B1-B3] AB4 EB29 insulin B-chain <400> 101 Ala His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr 20 25 <210> 102 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des [B1-B3] EB4 FB17 des B30 insulin B-chain <400> 102 Glu His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Phe Val Cys 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25 <210> 103 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des [B1-B3] EB4 EB17 des B30 insulin B-chain <400> 103 Glu His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Glu Val Cys 1 5 10 15 Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys 20 25 <210> 104 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des B1 KB2 AB3 EB17 insulin B-chain <400> 104 Lys Ala Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Glu 1 5 10 15 Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 <210> 105 <211> 0 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des B1 KB2 AB3 FB17 insulin B-chain <400> 105 000 <210> 106 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des B1 KB2 EB3 EB17 insulin B-chain <400> 106 Lys Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Glu 1 5 10 15 Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 <210> 107 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> des B1 KB2 EB3 FB17 insulin B-chain <400> 107 Lys Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Phe 1 5 10 15 Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 <210> 108 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KB2 AB3 EB17 insulin B-chain <400> 108 Phe Lys Ala Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Glu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30 <210> 109 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KB2 AB3 FB17 insulin B-chain <400> 109 Phe Lys Ala Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Phe Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30 <210> 110 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KB2 EB3 EB17 insulin B-chain <400> 110 Phe Lys Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Glu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30 <210> 111 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KB2 EB3 FB17 insulin B-chain <400> 111 Phe Lys Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Phe Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30

Claims (25)

  1. 변형된 A-사슬 폴리펩티드 및 변형된 B-사슬 폴리펩티드를 포함하고,
    상기 변형된 A-사슬 폴리펩티드는 A8 위치에서의 His 또는 Glu 치환체; A14 위치에서의 Glu 치환체; 및 A17 위치에서의 Gln 또는 Arg 치환체로 이루어지는 군으로부터 선택된 야생형 인간 인슐린 A-사슬에 대해 하나 이상의 치환체를 포함하며,
    상기 변형된 B-사슬 폴리펩티드는 B1 위치에서의 아미노산의 결실, B1 및 B2 위치에서의 아미노산, B1 내지 B3 위치에서의 아미노산의 결실, B30 위치에서의 아미노산의 결실, 또는 이들의 조합; B2 위치에서의 Ala 또는 Glu 치환체; 및 B3 위치에서의 Glu 치환체로 이루어지는 군으로부터 선택된 야생형 인간 인슐린 B-사슬에 대해 하나 이상의 치환체를 포함하는 것을 특징으로 하는 인슐린 유사체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 변형된 A-사슬 폴리펩티드는 A14 위치에서의 Glu 치환체를 포함하는 것을 특징으로 하는 인슐린 유사체.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 변형된 A-사슬 폴리펩티드는 A17 위치에서의 Gln 치환체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인슐린 유사체.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 변형된 A-사슬 폴리펩티드는 A17 위치에서의 Arg 치환체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인슐린 유사체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변형된 A-사슬 폴리펩티드는 A8 위치에서의 His 치환체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인슐린 유사체.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 변형된 B-사슬 폴리펩티드는 B1 위치에서의 아미노산의 결실을 포함하는 것을 특징으로 하는 인슐린 유사체.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 변형된 B-사슬 폴리펩티드는 B30 위치에서의 아미노산의 결실을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인슐린 유사체.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 변형된 B-사슬 폴리펩티드는 B2 위치에서의 Ala 치환체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인슐린 유사체.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 변형된 B-사슬 폴리펩티드는 B2 위치에서의 Glu 치환체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인슐린 유사체.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 변형된 B-사슬 폴리펩티드는 B2 위치에서의 아미노산의 결실을 포함하며, B3 위치에서의 Glu 치환체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인슐린 유사체.
  11. 제6항에 있어서,
    B2 위치에서의 Glu 치환체 및 B29 위치에서의 Glu 치환체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인슐린 유사체.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변형된 A-사슬 폴리펩티드는 A8 위치에서의 Glu 치환체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인슐린 유사체.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 변형된 B-사슬 폴리펩티드는 B1 위치에서의 아미노산의 결실, B30 위치에서의 아미노산의 결실, 또는 이들 모두를 포함하는 것을 특징으로 하는 인슐린 유사체.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 변형된 B-사슬 폴리펩티드는 B2 위치에서의 Ala 치환체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인슐린 유사체.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 변형된 B-사슬 폴리펩티드는 B2 위치에서의 Glu 치환체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인슐린 유사체.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 변형된 B-사슬 폴리펩티드는 B2 위치에서의 아미노산의 결실을 포함하며, B3 위치에서의 Glu 치환체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인슐린 유사체.
  17. 제12항에 있어서,
    상기 변형된 B-사슬 폴리펩티드는 B1 위치에서의 아미노산의 결실을 포함하고, B2 위치에서의 Glu 치환체 및 B29 위치에서의 Glu 치환체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 인슐린 유사체.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 변형된 A-사슬 폴리펩티드는 서열 번호 42 또는 서열 번호 44인 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 인슐린 유사체.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 변형된 B-사슬 폴리펩티드는 서열 번호 43 및 45 내지 48로 이루어지는 군으로부터 선택된 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 인슐린 유사체.
  20. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 유사체의 생리학적으로 유효한 양 또는 상기 인슐린 유사체의 생리학적으로 허용가능한 염을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 환자의 혈당을 낮추는 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 인슐린 유사체는 인간 인슐린의 염기서열에 대해 A8 위치에서의 His 또는 Glu 치환체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 환자의 혈당을 낮추는 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 인슐린 유사체는 B1 위치에서의 아미노산의 결실, B30 위치에서의 아미노산의 결실, 또는 상기 모두를 포함하는 것을 특징으로 하는 환자의 혈당을 낮추는 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 변형된 B-사슬 폴리펩티드는 B2 위치에서의 Ala 또는 Glu 치환체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 환자의 혈당을 낮추는 방법.
  24. 의약품으로 사용하기 위한 변형된 A-사슬 폴리펩티드 및 변형된 B-사슬 폴리펩티드를 포함하고,
    상기 변형된 A-사슬 폴리펩티드는 A8 위치에서의 His 또는 Glu 치환체; A14 위치에서의 Glu 치환체; 및 A17 위치에서의 Gln 또는 Arg 치환체로 이루어지는 군으로부터 선택된 야생형 인간 인슐린 A-사슬에 대해 하나 이상의 치환체를 포함하며,
    상기 변형된 B-사슬 폴리펩티드는 B1 위치에서의 아미노산의 결실, B1 및 B2 위치에서의 아미노산, B1 내지 B3 위치에서의 아미노산의 결실, B30 위치에서의 아미노산의 결실, 또는 이들의 조합; B2 위치에서의 Ala 또는 Glu 치환체; 및 B3 위치에서의 Glu 치환체로 이루어지는 군으로부터 선택된 야생형 인간 인슐린 B-사슬에 대해 하나 이상의 치환체를 포함하는 것을 특징으로 하는 인슐린 유사체.
  25. 질병의 치료를 위한 변형된 A-사슬 폴리펩티드 및 변형된 B-사슬 폴리펩티드를 포함하고,
    상기 변형된 A-사슬 폴리펩티드는 A8 위치에서의 His 또는 Glu 치환체; A14 위치에서의 Glu 치환체; 및 A17 위치에서의 Gln 또는 Arg 치환체로 이루어지는 군으로부터 선택된 야생형 인간 인슐린 A-사슬에 대해 하나 이상의 치환체를 포함하며,
    상기 변형된 B-사슬 폴리펩티드는 B1 위치에서의 아미노산의 결실, B1 및 B2 위치에서의 아미노산, B1 내지 B3 위치에서의 아미노산의 결실, B30 위치에서의 아미노산의 결실, 또는 이들의 조합; B2 위치에서의 Ala 또는 Glu 치환체; 및 B3 위치에서의 Glu 치환체로 이루어지는 군으로부터 선택된 야생형 인간 인슐린 B-사슬에 대해 하나 이상의 치환체를 포함하는 것을 특징으로 하는 인슐린 유사체.
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