CN105228643A - 位点2胰岛素类似物 - Google Patents

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Abstract

胰岛素类似物含有在不同蛋白质表面处的一个或多个修饰，所述蛋白质表面包含在位置B13、B17、A12、A13和/或A17处的一个或多个残基。在摩尔比为2.2-10个锌离子/六个胰岛素类似物单体的存在下，或在小于1个锌离子/六个胰岛素类似物单体的存在下，上述类似物以连续强度U-100至U-1000在以至少pH值范围为6.8-8.0的可溶性溶液中的制剂。上述制剂在功能上整合有连续葡萄糖监测器和作为闭环系统的基于计算机的控制算法的胰岛素泵中的用途。治疗患有糖尿病的患者的方法包括借助于静脉内、腹膜内或皮下注射，给患者施用生理学有效量的胰岛素类似物。

Description

位点2胰岛素类似物
关于联邦资助研究或开发的声明
本发明在资助号DK040949和DK074176下，在由美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）授予的合作协议下，由政府支持进行。美国政府可能在本发明中拥有一定权利。
发明背景
本发明涉及多肽激素类似物，其显示出增强的药学特性，例如改变的药代动力学和药效动力学特性，即相对于相应的野生型人激素的可溶制剂，赋予缩短的作用持续时间。更特别地，本发明涉及含有下述的胰岛素类似物：任选与（ii）一个或多个B链取代结合的（i）在其“位点2受体结合表面”中的一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个B链取代是本领域已知加速胰岛素类似物从皮下储库吸收到血流内的。本发明的胰岛素类似物可以任选含有在A和B链之间的连接结构域（C结构域）（并且因此描述为单链类似物），并且可以任选含有在A或B链中的其他位点处的标准或非标准氨基酸取代。本发明依据的基本想法是通过在激素的位点2受体结合表面中同时掺入取代，来增强速效类似物的安全和功效。这种取代组合赋予在作为糖尿病治疗方法的皮下注射后，血糖浓度的膳食控制中的效用的“快开/快关”药代动力学特性，以及在用于治疗糖尿病的的基于算法的闭环系统操作（“智能泵”）中的进一步效用。
蛋白质包括治疗剂和疫苗的改造可以具有广泛的医学和社会利益。天然存在的蛋白质—如人类、其他哺乳动物、脊椎动物生物、无脊椎动物生物或一般而言的真核细胞的基因组中编码的—通常含有两个或更多个功能表面。蛋白质类似物的利益能够实现这些功能表面之一或另一个的选择性修饰，例如以提供生物活性的细调。治疗蛋白质的实例由胰岛素提供。野生型胰岛素的三维结构已充分表征为锌六聚体、无锌二聚体以及溶液中的分离单体（图1和2）。在其他哺乳动物的基因组中编码的野生型人胰岛素和胰岛素分子与胰岛素受体（IR）结合，所述IR各自含有多重结构域和相关结构域表面。IR是αβ半受体（指定为（αβ）2）的二聚体，其中α链和β链是单个前体多肽的翻译后产物。（αβ）2二聚体的激素结合表面已分类为与受体的非线性结合和动力学特性有关的位点 1和位点 2。这种结合方案在图3中以图解形式显示。IR胞外结构域片段的结构和生物化学分析中的近期进展已显示，位点1由通过（αβ）2二聚体中的两个亚基形成的反式结合元件组成：一个亚基的N末端L1结构域和另一个亚基的C末端α-螺旋（αCT）（Whittaker J，Whittaker LJ，Roberts CT Jr，Phillips NB，Ismail-Beigi F，Lawrence MC和Weiss MA. α-Helical element at the hormone-binding surface of the insulin receptor functions as a signaling element to activate its tyrosine kinase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109，1116-71（2012））。位点2的位置并未得到充分表征，但提议为包含第一和第二纤连蛋白同源结构域的部分。
胰岛素或胰岛素类似物的受体结合表面可以同样在同源的基础上进行分类：分别的位点1结合表面（典型受体结合表面）和位点2结合表面（非典型受体结合表面）。胰岛素的位点1结合表面重叠其在B链中的二聚体形成界面，而位点2结合表面重叠其六聚体形成界面。位点1激素-IR界面近期已在低分辨率下显现（Menting JG，Whittaker J，Margetts MB，Whittaker LJ，Kong GK，Smith BJ，Watson CJ，Záková L，Kletvíková E，Jiráček J，Chan SJ，Steiner DF，Dodson GG，Brzozowski AM，Weiss MA，Ward CW和Lawrence MC. How insulin engages its primary binding site on the insulin receptor. Nature 493，241-5（2103））。假定的位点2相关残基可以基于突变的动力学效应，或基于其中突变仍然损害结合的对于位点1外部的位置进行限定。这些标准突出显示了非典型残基A12、A13、A17、B13和B17的潜在重要性。各自的位点1相关和位点2相关表面与图4中的胰岛素单体的表面相关显示。然而，本领域已知加速来自皮下储库的胰岛素吸收的取代通常在激素的位点1结合表面内和与激素的位点1结合表面相邻（例如在残基B24、B28或B29），我们设想一旦在靶细胞或组织的表面上衔接，位点2结合表面的修饰就可以通过激素受体复合物的信号传导的细胞持续时间调节。尽管不希望受理论限制，我们进一步设想信号传导的细胞持续时间的此类缩短对速效胰岛素类似物（“快开”）赋予“快关”药代动力学特性，所述速效胰岛素类似物在皮下储库中的分解已通过如本领域已知的在位点1结合表面内或与位点1结合表面相邻的取代得到加速（关于原理，参见图6）。因此，此类位点1/位点2相关取代的新型组合一起赋予在糖尿病治疗中具有新型效用的快开/快关药代动力学特性的所需组合。
本领域已知在胰岛素的典型受体结合表面内的修饰或取代可以使激素对于其受体的体外亲和力损害最高达约五倍（例如从0.05 nM的解离常数到0.25 nM的解离常数），而对体内效力没有显著作用，如通过皮下或静脉内注射时，变体胰岛素引起血糖浓度中的降低的能力评价的。此类稳固性至少部分归于亲和力和激素从血流中的清除速率之间的补偿关系。因为与IR的结合介导胰岛素作用和在很大程度上的胰岛素清除两者，所以亲和力中的降低导致循环半衰期中的成比例增加，且因此导致影响生物学信号传导的机会。此类补偿的实例已与胰岛素类似物相关公开，在所述胰岛素类似物中，在位置B24处的苯丙氨酸由环己基丙氨酸(Cyclohexanylalanine)（Cha）取代，公开于2012年7月13日提交的国际专利申请序列号PCT/US12/46575和2013年1月22日提交的美国临时专利申请序列号61/755,020中，所述专利的内容通过引用并入本文。在位置B24处的Cha的非平面脂环（图8中举例说明的）使受体结合亲和力损害约三倍，但对KP-胰岛素的效力或药效动力学特性没有作用，如通过在糖尿病Sprague-Dawley大鼠中测试的（图9A）。另外的实例已通过在位置B24处经由氟-芳香族和氯-芳香族取代进行修饰而提供，如图7中举例说明的（与野生型二聚体界面有关），并且如分别于2012年7月18日和2011年1月31日提交的美国专利申请序列号13/515,192、13/018,011，于2012年10月4日提交的美国临时专利申请号61/709,448，以及分别于2010年12月13日和2012年10月29日提交的国际专利申请号PCT/US2010/60085和PCT/US2012/62423中公开的，所述专利通过引用并入本文。在赖脯胰岛素（[LysB28，ProB29]-胰岛素，也指定为KP-胰岛素（Humalog®的活性组分）；Eli Lilly and Co.）中的PheB24通过在芳环的邻位处的单个氯取代（2-Cl-PheB24）的修饰，因此使变体激素在体外对于经分离的IR的生物化学亲和力损害约三倍，而不改变其体内效力，如通过在经由链脲霉素致使糖尿病的Sprague-Dawley大鼠中评价的，或如在麻醉的非糖尿病青春期约克夏猪中评价的，在所述约克夏猪中，内源胰岛素分泌被静脉内奥曲肽抑制（数据未显示）。甚至更引人注意地，虽然含有2-F-PheB24（在位置B24处的邻-单氟苯丙氨酸）的[AspB10，LysB28，ProB29]-胰岛素（DKP-胰岛素）的衍生物显示出受体结合亲和力中的相似减少量（相对于KP-胰岛素约35（±5）%），其效力和信号传导持续时间在糖尿病Sprague-Dawley大鼠中得到增强（图9B），如于2011年1月31日提交的美国专利申请序列号13/018,011（其通过引用并入本文）中公开的。因此，预期如在体外评估的，一般在胰岛素分子中对IR结合引入适度扰乱的修饰或取代在体内将是良好耐受的，并且就效力或（在不存在对自装配的作用的情况下）其他药理学特性而言，与野生型胰岛素无法区别—或甚至更有效力和如在2-F-PheB24-DKP-胰岛素的情况下延长的。因此出乎意料地发现在位点2内的取代或修饰可以显著缩短体内胰岛素作用的持续时间（药代动力学的改变），尽管对变体胰岛素关于IR的生物化学亲和力赋予的扰乱小于五倍。尽管在位置B13、B17、A12、A13和A17处的侧链不被认为在胰岛素受体的主要激素结合表面处衔接，但丙氨酸扫描诱变已显示在位点2相关位置处的单个丙氨酸取代如下影响相对受体结合亲和力：（位置B13）12（±3）%、（B17）62（±14）%、（A12）108（±28）%、（A13）30（±7）%和（A17）56（±20）%。
胰岛素施用长久以来已确定为糖尿病的治疗。在患有糖尿病的患者中的常规胰岛素替代疗法的主要目标是血糖浓度的紧密控制，以阻止其偏移高于或低于健康人主体特有的正常范围。偏移低于正常范围与立即肾上腺素或神经低糖(neuroglycopenic)症状相关，其在严重发作中导致抽搐、昏迷和死亡。偏离高于正常范围与微血管疾病的长期危险增加相关，所述微血管疾病包括视网膜病变、失明和肾衰竭。胰岛素是在脊椎动物的代谢中起关键作用的小型球状蛋白质。胰岛素含有两条链：含有21个残基的A链和含有30个残基的B链；各个残基通过氨基酸的身份（通常使用标准三字母代码）、链和序列位置（通常为上标）指出。激素作为Zn2+稳定六聚体贮存于胰β-细胞，但在血流中充当无Zn2+单体。胰岛素是单链前体胰岛素原的产物，其中连接区（35个残基）将B链的C末端残基（残基B30）与A链的N末端残基连接。各种证据指出它由胰岛素样核心和无序的连接肽组成。三个特异性二硫桥（A6–A11、A7–B7和A20–B19；在图2中标记）的形成被认为与胰岛素原在糙面内质网（ER）中的氧化折叠偶联。在从ER输出到高尔基体后不久，胰岛素原装配以形成可溶性Zn2+配位六聚体。内切蛋白酶解消化和转换为胰岛素在不成熟的分泌颗粒中发生，随后为形态压缩。锌胰岛素六聚体在成熟贮存颗粒内的结晶阵列已通过电子显微镜检查（EM）进行显现。
存在改造速效双链胰岛素类似物或单链胰岛素类似物的医学和社会需要，所述胰岛素类似物组合（i）在皮下储库中的胰岛素复合物的加速分解，与（ii）激素受体复合物在靶细胞或组织表面上衔接后，细胞信号传导的持续时间缩短。还存在用膳食胰岛素注射治疗的患者子集的未满足的需要，以避免晚期餐后低血糖症(late post-prandial hypoglycemia)，以及闭环基于算法的泵系统（“智能泵”）就安全和功效而言的未满足的性能规范。智能泵中的反馈控制将通过信号传导的持续时间缩短使得更稳固，因为过度递送事件的效应将被削减。因此，希望提供新一类胰岛素类似物，其组合在B链中设计为加速胰岛素复合物分解的修饰，与蛋白质分子中的其他地方导致信号传导的持续时间缩短的修饰。
发明概述
因此，本发明的一个方面是提供双链和单链胰岛素类似物，其提供（i）由于B链的位点1相关表面中或毗邻B链的位点1相关表面的取代或修饰，进入血流内的快速吸收，和（ii）由于A和/或B链的位点2相关表面的突变或修饰，靶细胞信号传导的持续时间缩短。位点2相关取代是在一个或多个下述位置处的修饰：B13、B17、A12、A13和A17。本发明的类似物含有野生型胰岛素的生物活性的至少一部分，以指导在皮下或静脉内注射时血糖浓度中的降低。本发明的一个方面是类似物的等电点在范围3.5-6.0内，使得作为pH范围6.8-8.0中的澄清可溶溶液的配制是可行的。
本发明的类似物可以含有在位置B10处的组氨酸，并且因此顺应作为锌胰岛素六聚体的配制。任选地，本发明的类似物可以含有在位置B10处的天冬氨酸，当与蛋白质中其他地方的取代或修饰组合时，使得类似物显示出对于IR的亲和力等于或小于野生型胰岛素的那种（并且因此不太可能显示出在激素受体复合物中的延长滞留时间），以及对于1型IGF-1受体的亲和力等于或小于野生型胰岛素的那种（并且因此不太可能显示出IGF-I相关促细胞分裂活性(mitogenicity)）。
本发明相关的是本发明的长度6-11个残基的新型缩短的C结构域代替人胰岛素原特有的36残基野生型C结构域。单链胰岛素类似物提供了针对顺应作为无锌单体配制的纤维性颤动抗性胰岛素类似物的设计的有利方法。此类单链类似物可以设计为具有在B链的位点1结合表面内或毗邻B链的位点1结合表面的取代，以便赋予速效药代动力学。适合于在选自B13、B17、A12、A13或A17的一个或多个位置处的进一步修饰的单链胰岛素类似物如美国专利申请号12/989,399（于2010年10月22日提交）和美国专利号8,192,957中公开的，所述专利通过引用并入本文。
附图的几个视图的简述
图1. 在通常药物制剂中和作为血流中的分离单体的胰岛素结构的表示。（A）苯酚稳定的R6锌六聚体。轴向锌离子（覆盖的）显示为通过组氨酸侧链配位的一致黑色球体。A链以深灰色显示，并且B链以中灰色（残基B1-B8）和浅灰色（B9-B30）显示。（B）胰岛素单体中的结构。A链以深灰色显示，并且B链以中灰色显示；二硫桥描述为球和棒（标记在图2中提供）。
图2. 胰岛素二聚体和核心β片层的结构的表示。关于反向平行的β片层的残基B24-B28（中灰色）在六聚体中通过对称重复三次。A和B链以其他方式分别以浅灰色和深灰色显示。PheB24的位置以深灰色箭头突出显示。半胱氨酸通过作为球体显示的硫原子鉴定。坐标得自T6六聚体（PDB 4INS）。
图3. 胰岛素受体的模型：受体的每个α亚基含有两个独特的胰岛素结合位点：位点1（高亲和力）和位点2（低亲和力但对信号传播关键）。特异性胰岛素结合桥连两个α亚基，依次改变β亚基之间的取向，将信号通讯给细胞内酪氨酸激酶（TK）结构域。
图4. 胰岛素的功能表面的表示。虽然胰岛素的典型受体结合表面衔接IR位点1（B12、B16、B24-B26），但它的位点2相关表面包括六聚体接触ValB17和LeuA13；显示了所提议的位点2残基（B13、B17、A12、A13和A17），添加邻近残基B10，其可以促成位点1和2两者。A和B链另外分别以浅灰色和深灰色显示。
图5. 在胰岛素六聚体、二聚体和单体的表面上的LeuA13位置。坐标得自R6六聚体（PDB 1TRZ）。
图6. 关于餐时胰岛素类似物的设计和配制的原理。锌六聚体的快速解离获得能够进入毛细血管的二聚体和单体。目前餐时胰岛素类似物含有在核心β片层的边缘处的标准取代。
图7. 基于结构的对Cl-PheB24修饰的设计。（A）野生型R6锌胰岛素六聚体的丝带模型。A和B链以浅灰色和深灰色显示，轴向锌离子（覆盖的）作为球体显示，并且PheB24侧链以中灰色显色。（B）胰岛素二聚体的丝带模型；反向平行的B24-B28 β片层在中间。色彩方案如小图A中。（C）立体对显示在二聚体界面内的芳香族簇：残基B24和B24’、B25和B25’、以及B26和B26’。（D）经修饰的二聚体界面的预测模型；在B24（芳环位置2）处的对氯原子作为球体显示（50%的范德华半径）。
图8. 芳环和非芳环系统。（A）Phe含有平面六碳芳环。（B）环己基丙氨酸（Cha）含有非平面六碳脂肪族环。显示了每种氨基酸的三个视图。在每个小图中，球棒模型显示于顶部，并且分子表面模型显示于底部。碳和氢原子分别为中灰色和浅灰色，而氧（氮）原子为深灰色，并且氮原子为黑色。
图9. 具有1类相关修饰的胰岛素类似物的药效动力学。在通过链脲霉素致使糖尿病的Sprague-Dawley大鼠中，对赖脯胰岛素（KP-胰岛素）或类似物的皮下注射的血糖应答的研究。（A）KP-胰岛素（实心菱形）和ChaB24-DKP-胰岛素（B24Cha KP，空心正方形）以20 μg/大鼠的剂量的比较。ChaB24-DKP-胰岛素的相对亲和力为约30（±5）%。（B）KP-胰岛素（填充菱形）和邻单氟-PheB24-DKP-胰岛素（2F B24 DKP，空心正方形）以50 μg/大鼠的剂量的比较。2-F-PheB24-DKP-胰岛素的相对亲和力为约35（±5）%。
图10. 受体结合研究。使用人胰岛素受体的固定化凝集素纯化的同种型B的竞争结合测定。（A）TrpA13-KP-胰岛素（三角形）和KP-胰岛素（正方形）的比较。（B）上图，TrpA13-KP-胰岛素（正三角形）和野生型人胰岛素（正方形）的比较。下图，TrpA13-KP-胰岛素的4-Cl-PheB24衍生物（倒三角形）和野生型人胰岛素（正方形）的比较。（KP-胰岛素的亲和力类似于野生型人胰岛素的那种，并且因此任一提供了合适对照）。
图11. 药效动力学测定。（A）与失活对照样品有关，关于TrpA13-KP-胰岛素（三角形，A13W-KP）和KP-胰岛素（菱形，KP），随着时间过去的血糖水平的比较：单独的稀释剂（圆圈）和含有在位点1相关表面中的突变的类似物，其使受体结合损害约100倍（TrpA13-KP-胰岛素；正方形，A3W-KP）。（B）关于KP-胰岛素（填充菱形）和TrpA13-KP-胰岛素（空心圆圈，YA13-KP），随着时间过去的血糖水平的比较。（C）4-Cl-PheB24-TrpA13-KP-胰岛素（正方形，WA13 4Cl B24 KP）、TrpA13-KP-胰岛素（圆圈，WA13-KP）、2-Cl-TyrA14-KP-胰岛素（三角形，YA13 2CL B24 KP）和KP-胰岛素（菱形）的比较；不采用稀释剂对照。在小图A中，血糖浓度中的下降（作为相对于平均初始值的百分比；约400 mg/dl）作为在皮下注射后的时间函数显示，而在小图B和C中，显示了平均葡萄糖浓度。开始高血糖症的程度在每个日期时在每个大鼠集合中是相似的。剂量在每种情况下为60 μg/大鼠。符号还如每个小图的右下角处的插图定义。
图12. 圆二色谱。含有在位置A13处的取代的胰岛素类似物的远紫外线CD光谱与亲本类似物KP-胰岛素的CD光谱相关显示。图例显示于右上角，并且包括下述：KP-胰岛素、（YA13 B24 Cha KP）ChaB24-TyrA13-KP-胰岛素、（WA13 B24 4Cl KP）4-Cl-PheB24-TrpA13-KP-胰岛素、（WA13 KP）TrpA13-KP-胰岛素、（YA13 B24 4Cl KP）4-Cl-PheB24-TyrA13-KP-胰岛素和（YA13 KP）、TyrA13-KP-胰岛素。胰岛素类似物在50 mM磷酸钾（pH 7.4）中在25℃的温度下制备为约60 μM。
图13. 化学变性研究。作为变性剂盐酸胍浓度（水平轴）的函数的蛋白质解折叠的CD检测研究。符号在图例中限定：（实心黑色正方形，KP）KP-胰岛素、（圆圈，YA13 Cha KP）ChaB24-TyrA13-KP-胰岛素、（三角形）4-Cl-PheB24-TrpA13-KP-胰岛素、（倒三角形）TrpA13-KP-胰岛素、（菱形）4-Cl-PheB24-TyrA13-KP-胰岛素、以及（旋转三角形）TyrA13-KP-胰岛素。椭圆率在222 nm的波长处进行监控。
发明详述
本发明涉及双链或单链胰岛素类似物，其提供了（i）来自皮下储库的快速吸收，和（ii）作用持续时间的缩短，IR-A/IR-B受体结合亲和力的比类似于野生型胰岛素的那种，且绝对亲和力在5-100%范围内（下限选择为对应于胰岛素原）。赋予快速吸收的B链取代的实例是在位置B28处的天冬氨酸或赖氨酸，任选与在位置B29处的脯氨酸组合。来自位置B28的脯氨酸的去除与二聚化和六聚体装配的强度减少相关，与取代氨基酸的性质无关。赋予快速吸收的B链取代的仍另外一个实例是当在不存在锌离子的情况下配制时，在位置B3处的赖氨酸和在位置B29处的谷氨酸的组合。引入以实现信号传导持续时间缩短的氨基酸取代可以是在一个或多个下述位置处：B13、B17、A12、A13和A17。此类取代的实例通过（但不限于）色氨酸、酪氨酸（除了在A13处之外）、丙氨酸、组氨酸、谷氨酸（除了在B13和A17处之外）和谷氨酰胺（除了在B13处之外）提供。本发明的特点在于单链类似物的等电点在3.5 - 6.0之间，使得可溶性制剂中性条件（pH 6.8-8.0）将是可行的。
还设想单链类似物还可以由衍生自动物胰岛素的A和B结构域序列制备，所述动物胰岛素作为非限制性实例例如猪、牛、马和犬胰岛素。另外或可替代地，本发明的胰岛素类似物可以含有残基B1-B3的缺失，或可以与缺乏赖氨酸（例如野生型人胰岛素中的LysB29）变体B链组合，以避免前体多肽在巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisciae）或其他酵母表达物种或菌株中的酵母生物合成中Lys指导的前体多肽的蛋白酶解。本发明的单链胰岛素的B结构域可以任选含有非标准取代，例如在位置B20和/或B23处的D-氨基酸（预期加强热力学稳定性、受体结合亲和力和对纤维性颤动的抗性）、在PheB24的2环位置处的卤素修饰（即，邻-F-PheB24、邻-Cl-PheB24或邻-Br-PheB24；预期增强热力学稳定性和对纤维性颤动的抗性）、PheB24的2-甲基环修饰（预期增强受体结合亲和力）。还设想C结构域中的ThrB27、ThrB30或者一个或多个丝氨酸残基可以单独地或组合地通过单糖加合物进行修饰；实例通过O联N-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷（指定为GalNAc-Oβ-Ser或GalNAc-Oβ-Thr）、O联α-D-吡喃甘露糖苷（甘露糖-Oβ-Ser或甘露糖-Oβ- Thr）、和/或α-D-吡喃葡萄糖苷（葡萄糖-Oβ-Ser或葡萄糖-Oβ-Thr）提供。
此外，考虑到人和动物胰岛素之间的相似性，以及过去动物胰岛素在患有糖尿病的人患者中的使用，还设想可以引入在胰岛素序列中的其他微小修饰，尤其是视为“保守”的那些取代。例如，另外的氨基酸取代可以在具有相似侧链的氨基酸组内进行，而不背离本发明。这些包括中性疏水性氨基酸：丙氨酸（Ala或A）、缬氨酸（Val或V）、亮氨酸（Leu或L）、异亮氨酸（Ile或I）、脯氨酸（Pro或P）、色氨酸（Trp或W）、苯丙氨酸（Phe或F）和甲硫氨酸（Met或M）。同样地，中性极性氨基酸可以在其甘氨酸（Gly或G）、丝氨酸（Ser或S）、苏氨酸（Thr或T）、酪氨酸（Tyr或Y）、半胱氨酸（Cys或C）、谷氨酰胺（Glu或Q）、和天冬酰胺（Asn或N）的组内彼此取代。碱性氨基酸考虑包括赖氨酸（Lys或K）、精氨酸（Arg或R）和组氨酸（His或H）。酸性氨基酸是天冬氨酸（Asp或D）和谷氨酸（Glu或E）。除非另有说明或由上下文显而易见，本文所示的氨基酸应视为L-氨基酸。标准氨基酸还可以通过属于相同化学类别的非标准氨基酸取代。作为非限制性实例，碱性侧链Lys可以替换为更短侧链长度的碱性氨基酸（鸟氨酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸）。Lys还可以替换为中性脂肪族电子等排物正亮氨酸（Nle），这依次可以通过含有更短的脂肪族侧链的类似物（氨基丁酸或氨基丙酸）取代。
为了比较目的，人胰岛素原的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 1提供。
人胰岛素A链的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 2提供。
人胰岛素B链的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 3提供。
在位置A12处修饰的人胰岛素A链的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 4提供。
其中Xaa指示Ala、Thr、Asp、Asn Glu、Gln、His或Tyr。
在位置A13处修饰的人胰岛素A链的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 5提供。
其中Xaa指示Ala、Glu、Gln、His、Tyr或Trp。
在位置A17处修饰的人胰岛素A链的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 6提供。
其中Xaa指示Ala、Gln、His、Trp或Tyr。
在位置A12、A13和/或A17的一个或多个处修饰的人胰岛素A链的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 7提供。
其中至少一个Xaa位点含有相对于野生型人胰岛素的取代，并且其中Xaa1指示Ser、Ala、Thr、Asp、Asn Glu、Gln、His或Tyr；其中Xaa2指示Leu、Ala、Glu、Gln、His或Trp；并且其中Xaa3指示Glu、Ala、Gln、His、Trp或Tyr。
在残基A8处修饰以及在位置A12、A13和/或A17的一个或多个处也修饰的人胰岛素A链的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 8提供。
其中位点-2相关位点（A12、A13和A17）中的至少一个含有相对于野生型人胰岛素的取代，并且其中Xaa2指示Ser、Ala、Thr、Asp、Asn Glu、Gln、His或Tyr；其中Xaa3指示Leu、Ala、Glu、Gln、His或Trp；并且其中Xaa4指示Glu、Ala、Gln、His、Trp或Tyr；并且其中Xaa1指示His、Glu、Gln、Arg或Lys。
在位置B13处修饰的人胰岛素变体B链的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 9提供。
其中Xaa3指示Ala、Asp、His或Leu；其中Xaa1指示除去甘氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的任何氨基酸；并且其中Xaa2指示Pro、Glu或Lys。
在位置B17处修饰的人胰岛素B链的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 10提供。
其中Xaa3指示Glu、Gln、Ala、His、Trp或Tyr；其中Xaa1指示除去甘氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的任何氨基酸；并且其中Xaa2指示Pro、Glu或Lys。
在位置B13和B17两者处修饰的人胰岛素变体B链的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 11提供。
其中Xaa1指示Ala、Asp、His或Leu；其中Xaa2指示Gln、Glu、Ala、His、Trp或Tyr；其中Xaa3指示除去甘氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的任何氨基酸；并且其中Xaa4指示Pro、Glu或Lys。
本发明的单链胰岛素类似物的氨基酸序列在SEQ ID NO 12-14中给出。
其中位点2相关位点（B13、B17、A12、A13和A17）中的至少一个含有相对于野生型人胰岛素的取代，其中Xaa1指示Glu、Ala、Asp、His或Leu；其中Xaa2指示Leu、Glu、Gln、Ala、His、Trp或Tyr；其中Xaa3指示Ser、Ala、Thr、Asp、Asn、Glu、Gln、Tyr或His；其中Xaa4指示Leu、Ala、Glu、Gln、His、Tyr或Trp；其中Xaa5指示Glu、Gln、Ala、His、Trp、Tyr或Leu；其中Xaa1指示His或Asp；其中Xaa6指示除去甘氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的任何氨基酸；其中Xaa7指示Pro或Lys；Xaa8指示Glu、Gln、His、Arg、Lys或鸟氨酸；其中Xaa9指示Tyr或Glu；并且其中Z指示长度3-8的多肽区段。
其中位点2相关位点（B13、B17、A12、A13和A17）中的至少一个含有相对于野生型人胰岛素的取代，其中Xaa1指示Glu、Ala、Asp、His或Leu；其中Xaa2指示Leu、Glu、Gln、Ala、His、Trp或Tyr；其中Xaa3指示Ser、Ala、Thr、Asp、Asn、Glu、Gln、Tyr或His；其中Xaa4指示Leu、Ala、Glu、Gln、His、Tyr或Trp；其中Xaa5指示Glu、Gln、Ala、His、Trp、Tyr或Leu；其中Xaa1指示His或Asp；其中Xaa6指示除去甘氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的任何氨基酸；其中Xaa7指示Pro或Lys；Xaa8指示Glu、Gln、His、Arg、Lys或鸟氨酸；其中Xaa9指示Tyr或Glu；并且其中Z指示长度2-7的多肽区段。
其中位点2相关位点（B13、B17、A12、A13和A17）中的至少一个含有相对于野生型人胰岛素的取代，其中Xaa1指示Glu、Ala、Asp、His或Leu；其中Xaa2指示Leu、Glu、Gln、Ala、His、Trp或Tyr；其中Xaa3指示Ser、Ala、Thr、Asp、Asn、Glu、Gln、Tyr或His；其中Xaa4指示Leu、Ala、Glu、Gln、His、Tyr或Trp；其中Xaa5指示Glu、Gln、Ala、His、Trp、Tyr或Leu；其中Xaa1指示His或Asp；其中Xaa6指示除去甘氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的任何氨基酸；其中Xaa7指示Pro或Lys；Xaa8指示Glu、Gln、His、Arg、Lys或鸟氨酸；其中Xaa9指示Tyr或Glu；并且其中Z指示长度3-8的多肽区段。
类似的合成基因已在情况(cases)子集中制备且在巴斯德毕赤酵母中克隆。对于双链胰岛素类似物的产生，借助于N末端信号肽，通过巴斯德毕赤酵母表达、折叠且分泌53残基微型胰岛素原前体，基本上如所述的（Kjeldsen T，Pettersson AF，Hach M. The role of leaders in intracellular transport and secretion of the insulin precursor in the yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Biotechnol. 75，195-208（1999））。编码位置A13的密码子通过定点诱变改变，以编码Trp、Tyr、His或Glu。选择TrpA13和TyrA13类似物（SEQ. ID. NO:5）用于初始表征。
我们观察到在位点2中的TrpA13（SEQ ID NO: 20）使KP-胰岛素与IR的结合损害约两倍（表1和图10A），而TyrA13（SEQ ID NO: 23）对结合亲和力的作用是可忽略不计的（表1和图10B，上）。因此，TrpA13-KP-胰岛素与对照类似物TyrA13-KP-胰岛素的比较提供了指导下述假设的测试：通过位点2修饰对生物化学亲和力的适度扰乱导致体内胰岛素作用的持续时间缩短；即，长期追求但未满足的“快关”药效动力学特性的目标。我们因此着手调查这些和相关胰岛素类似物在如下详述的糖尿病大鼠模型中的药效动力学特性和相关效力。这些结果如图10和11中所示获得。TrpA13-KP-胰岛素的药效动力学（PD）特性的缩短通过用4-Cl-PheB24的共同修饰进一步增强（图11C；SEQ ID. NO: 17）。尽管这种修饰对受体结合亲和力具有可忽略不计的作用（图10B，底部，相对于图10A中的亲本TrpA13-KP-胰岛素），但在缩短的程度中观察到协同改善。从膳食胰岛素疗法，以及闭环系统的稳固和安全操作的观点来看，在位点1相关表面和位点2相关表面处的修饰之间的此类协同是希望的。作用持续时间越短，闭环系统可以越快速地补偿递送过度事件。
含有TrpA13或TyrA13的KP-胰岛素类似物通过胰蛋白酶催化的半合成进行制备。基本想法是使用“反向”胰蛋白酶作为有机共溶剂中的合成酶。这种方案采用（i）表示残基（N）-GXFYTKPT “KP”取代（有下划线的）的合成八肽，和（ii）截短类似物脱八肽（des-octapeptide）[B23-B30]-胰岛素（DOI）、TrpA13-DOI或TyrA13-DOI。因为八肽不同于野生型B23-B30序列（GFFYTPKT），所以在胰蛋白酶处理过程中不要求赖氨酸ε-氨基的保护。方案延长以允许A13位点伴随在位置B24处的非天然氨基酸取代的共同修饰，如合成八肽中包含的。野生型DOI由人或猪胰岛素制备；DOI的A13类似物通过在A13密码子处修饰的53残基微型胰岛素原（MPI）前体的胰蛋白酶消化生成，如通过酵母菌株巴斯德毕赤酵母表达且分泌的。在每种情况下，在操作自始至终保留三个天然二硫桥。
简言之，将脱八肽胰岛素（150 mg）和八肽（150 mg）溶解于含有10 mM乙酸钙和1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）（35:35:30，v/v，4 ml）的二甲基乙酰胺/1,4-丁二醇/0.2 M Tris乙酸盐（pH 8）的混合物中。八肽超过DOI的5倍摩尔过量确保胰蛋白酶的逆反应（蛋白酶解）通过底物饱和得到预防。最终pH用0.1 ml N-甲基吗啉调整至7.0。溶液冷却至12℃，并且加入15 mg TPCK-胰蛋白酶，并且在12℃下温育2天。在24小时后加入另外15 mg胰蛋白酶。反应随后用0.1%三氟乙酸酸化且通过制备型反相HPLC（C4）纯化。产物通过质谱法（MALDI-TOF-TOF；Applied Biosystems，Foster City，CA）加以验证。含有PheB24、2-Cl-PheB24、4-Cl-PheB24或ChaB24 （各自约600 mg粗材料）的KP-八肽由CCF Peptide Core Facility提供。
DOI和DOI类似物通过人胰岛素的胰蛋白酶消化生成，所述人胰岛素可从胰岛素制造商大量获得。为了生成DOI或DOI类似物，将胰岛素（300 mg）加入含有1M尿素的0.1 M碳酸氢铵（60 ml）溶液。首先将胰蛋白酶（30 mg）溶解于1.0 ml蒸馏去离子水中，并且随后加入蛋白质溶液中；切割进行48小时。通过使用C4柱的制备型反相HPLC，使DOI或DOI类似物从胰蛋白酶、未反应的胰岛素以及任何其他污染物中纯化。通常获得至少150 mg纯化DOI的得率。分析型反相HPLC（C18）用于跟踪半合成的时间过程，并且通过分析型HPLC和MALDI-TOF MS（下文）评价多肽试剂和产物的纯度，用于产物<1%的半定量估计。
KP-胰岛素的TrpA13和TyrA13衍生物的受体结合亲和力通过体内竞争置换测定进行测定，如图10中举例说明的。受体结合活性的测定方案如下。微量滴定条板（Nunc Maxisorb）在4℃下与AU5 IgG（在磷酸盐缓冲盐水中40 mg/ml的100 µl/孔）温育过夜。结合数据通过双位点序变模型进行分析。数据对于非特异性结合（在1 μM人胰岛素的存在下结合的放射性剩余膜的量）进行校正。在所有测定中，在不存在竞争配体的情况下结合的示踪剂百分比小于15%，以避免配体耗尽假象。解离常数（Kd）通过与如由Whittaker和Whittaker（2005. J. Biol. Chem. 280，20932-20936）描述的数学模型拟合进行测定；该模型采用假定为异源竞争的非线性回归（Wang，1995，FEBS Lett. 360，111-114）。结果在表1中概括。虽然TyrA13不影响KP-胰岛素的受体结合，但TrpA13导致结合亲和力约两倍的降低。适度变化也用ChaB24、2-Cl-PheB24或4-Cl-PheB24的共同取代观察到，依照先前公开的研究。
圆二色性（CD）谱在25℃下使用Aviv分光偏振计（Weiss等人，Biochemistry 39，15429-15440）获得，如图12中所示。CD模式在每种情况下与α螺旋的优势一致；观察到变异，其可以反映二级结构的稳定性中的小扰乱，或可以表示起于另外或经修饰的芳香族侧链的叠加CD条带。样品含有在50 mM磷酸钾（pH 7.4）中的约60 μM KP-胰岛素或类似物；将样品稀释至5 μM用于在25℃下的胍诱导的变性研究。代表性胍滴定显示于图13中。为了提取解折叠的自由能，变性转变通过非线性最小二乘法与二态模型拟合，如通过Sosnick等人，Methods Enzymol. 317，393-409描述的。简言之，根据下式通过非线性最小二乘法程序拟合CD数据，其中x指示变性剂的浓度
其中x是胍浓度，并且其中 θ A 和θ B 是天然和解折叠状态中的基线值。基线通过转变前和后的线和进行约计。在拟合变体解折叠转变中获得的m值低于在拟合野生型解折叠曲线中获得的m值。如通过应用该二态模型获得的，解折叠的自由能的估计值在表1中提供。
为了评估类似物在动物模型中的生物活性和效力，雄性Sprague-Dawley大鼠（平均体重~300克）通过用链脲霉素（STZ）处理致使糖尿病。蛋白质溶液含有KP-胰岛素（赖脯胰岛素，Humalog®的活性组分）、野生型人胰岛素和/或本发明的双链或单链胰岛素。对照通过无蛋白质Lilly稀释剂（得自Eli Lilly and Co.）的注射提供，所述无蛋白质Lilly稀释剂由16 mg丙三醇、1.6 mg间甲酚、0.65 mg苯酚和3.8 mg磷酸钠pH 7.4构成。胰岛素类似物的活性与Humulog®的那种相关进行评估（U-100强度取自未过期的商业小瓶）。皮下注射各20或60微克的这些制剂，通过使用临床血糖仪（Hypoguard Advance Micro-Draw仪器）的连续测量，监控所得到的血糖浓度中的变化。大鼠以五只一组（N=4-6）在时间t = 0时进行皮下注射。在时间0时以及每10分钟直到360分钟，从剪掉的尾尖获得血液。发现本发明的代表性双链类似物，本发明的TrpA14-KP-胰岛素，在类似于Humalog®那种的配制条件下，保留基本比例的胰岛素的生物活性，以及就Humalog®而言缩短的作用持续时间。代表性药效动力学数据显示于图11中。根据本发明的各种类似物在表2中提供。
如下分析通过本发明的各种类似物的受体结合。体外活性测定采用在96孔板上固定的人胰岛素受体同种型B（hIR-B）和/或同种型A（hIR-A）和/或同源人1型胰岛素样生长因子受体（hIGFR）的附加表位的全受体（holoreceptor）。相对活性定义为特异性解离常数的比，如通过结合的125I-TyrA14人胰岛素（在IR的情况下）或125I-Tyr31人IGF-I（在IGFR的情况下）的竞争置换测定的。解离常数（Kd）通过与如由Whittaker和Whittaker（2005. J. Biol. Chem. 280，20932-20936）描述的数学模型拟合进行测定；该模型采用假定为异源竞争的非线性回归（Wang，1995，FEBS Lett. 360，111-114）。表3中列出的结果（测定: hIR-A，hIR-B）与天然体内效力一致。与促有丝分裂IGF受体的交叉结合的相应研究（测定：hIGFR）证实类似于天然胰岛素的亲和力。
为了评估类似物在动物模型中的生物活性（作用效力和持续时间），雄性Sprague-Dawley大鼠通过用链脲霉素（STZ）处理致使糖尿病。胰岛素类似物的活性与Humulog®的那种相关进行评估（U-100强度取自未过期的商业小瓶）。皮下注射5、20或60微克的各种类似物制剂，通过使用临床血糖仪（Hypoguard Advance Micro-Draw仪器）的连续测量，监控所得到的血糖浓度中的变化。大鼠以五只一组（N=4-6）在时间t = 0时进行皮下注射。在时间0时以及每10分钟直到360分钟，从剪掉的尾尖获得血液，以测定经过第1个小时作为Δ/分钟和Δ/小时的血糖下降。发现本发明的代表性类似物，在类似于Humalog®那种的配制条件下，保留基本比例的胰岛素的生物活性，以及就Humalog®而言缩短的作用持续时间。
其胰腺β和α细胞功能已通过IV醋酸奥曲肽抑制的非糖尿病的麻醉的Sinclair猪用于评估大动物体内效应和药效动力学。在初始醋酸奥曲肽输注后大约30分钟，用10%右旋糖输注建立基线血糖正常。一旦处于血糖正常状态，0.1-0.2U/kg胰岛素就通过血管通路口静脉内施用。为了定量外周胰岛素介导的葡萄糖摄取，每5分钟测量血糖，同时可变速率的葡萄糖输注维持大约85 mg/dL的血糖水平。这种葡萄糖输注维持直至内源血糖返回至基线（胰岛素输注前）水平。药效动力学（PD）效应测量为至半最大效应的时间（T1/2早期）、至半最大效应的时间（T1/2晚期）、和至最大效应的时间（Tmax）。对于这些分析各自，采用20分钟移动平均曲线拟合。本发明的代表性类似物证实与天然胰岛素可比较的大动物生物学效应，如表5中所示。
用于治疗患有糖尿病的患者的方法包括施用如本文描述的单链胰岛素类似物。本发明的另一个方面是单链胰岛素类似物可以在酵母（巴斯德毕赤酵母）中进行制备，或实施通过天然片段连接的全化学合成。我们进一步设想本发明的类似物提供了用于治疗糖尿病或代谢综合征的方法。胰岛素类似物的递送途径是通过经由使用注射器或笔装置的皮下注射。
本发明的单链胰岛素类似物还可以含有其他修饰，例如在B24、B25或B26位置处的卤素原子，如共同未决的美国专利申请号13/018,011中更全面地描述的，所述专利的公开内容通过引用并入本文。本发明的胰岛素类似物还可以含有由于残基B1-B3缺失的缩短B链，如共同未决的美国临时专利申请61/589,012中更全面地描述的。
药物组合物可以包含此类胰岛素类似物，并且其可以任选包括锌。锌离子可以以不同锌离子:蛋白质比包括，范围从2.2锌原子/胰岛素类似物六聚体到3锌原子/胰岛素类似物六聚体。制剂的pH在pH 6.8 – 8.0范围内。在此类制剂中，胰岛素类似物的浓度通常为约0.6-5.0 mM；最高达5 mM的浓度可以用于小瓶或笔中；更浓缩的制剂（U-200或更高）可以在具有显著胰岛素抵抗的患者中具有特别利益。赋形剂可以包括甘油、甘氨酸、精氨酸、Tris、其他缓冲剂和盐、以及抗微生物防腐剂例如苯酚和间甲酚；后面一种防腐剂已知增强胰岛素六聚体的稳定性。单链胰岛素类似物可以在锌离子的存在下或其不存在下进行配制。通过给患者施用生理学有效量的组合物，如上所述的此类药物组合物可以用于治疗患有糖尿病或其他医学状况的患者。
基于前述公开内容，目前应显而易见的是提供的双链或单链胰岛素类似物进行上文所示的目的。即，这些胰岛素类似物显示出从皮下储库加速吸收到血流内（“快开”）和缩短的信号传导持续时间（“快关”），同时维持野生型胰岛素的生物活性的至少一部分。因此，应当理解显而易见的任何变化落入本发明范围内，和因此可以确定具体组分要素的选择，而不背离本文公开且描述的本发明的精神。
引用下述参考文献，以证实本文描述的测试和测定方法由本领域普通技术人员理解。
。
其中至少一个Xaa位点含有相对于野生型人胰岛素的取代，且其中Xaa1指示Ala、Thr、Asp、Asn Glu、Gln、His或Tyr；其中Xaa2指示Ala、Glu、Gln、His、或Trp；且其中Xaa3指示Ala、Gln、His、Trp、或Tyr。
其中至少一个位点2相关位点 (A12、A13、和A17)含有相对于野生型人胰岛素的取代，且其中Xaa2指示Ala、Thr、Asp、Asn Glu、Gln、His或Tyr；其中Xaa3指示Ala、Glu、Gln、His、或Trp；且其中Xaa4指示Ala、Gln、His、Trp、或Tyr；且其中Xaa1指示His、Glu、Gln、Arg、或Lys。
其中Xaa3指示Ala、Asp、His、或Leu；其中Xaa1指示除去脯氨酸、甘氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的任何氨基酸；且其中Xaa2指示Pro、Glu或Lys。
其中Xaa3指示Glu、Gln、Ala、His、Trp、或Tyr；其中Xaa1指示除去脯氨酸、甘氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的任何氨基酸；且其中Xaa2 指示Pro、Glu、或Lys。
其中Xaa1指示Ala、Asp、His、或Leu；其中Xaa2指示Gln、Glu、Ala、His、Trp、或Tyr；其中Xaa3指示除去脯氨酸、甘氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的任何氨基酸；且其中Xaa4 指示Pro、Glu、或Lys。
其中至少一个位点2相关位点(B13、B17、A12、A13、和A17) 含有相对于野生型人胰岛素的取代，其中Xaa1指示Glu、Ala、Asp、His、或Leu；其中Xaa2指示Leu、Glu、Gln、Ala、His、Trp、或Tyr；其中Xaa3指示Ser、Ala、Thr、Asp、Asn、Glu、Gln、或His；其中Xaa4指示Leu、Ala、Glu、Gln、His、或Trp；其中Xaa5指示Glu、Gln、Ala、His、或Leu；其中Xaa1指示His或Asp；其中Xaa6指示除去脯氨酸、甘氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的任何氨基酸；其中Xaa7指示Pro或Lys；Xaa8指示Glu、Gln、His、Arg、Lys或鸟氨酸；其中Xaa9指示Tyr或Glu；且其中Z指示长度3-8的多肽区段。
其中至少一个位点2相关位点(B13、B17、A12、A13、和A17) 含有相对于野生型人胰岛素的取代，其中Xaa1指示Glu、Ala、Asp、His、或Leu；其中Xaa2指示Leu、Glu、Gln、Ala、或His；其中Xaa3指示Ser、Ala、Thr、Asp、Asn、Glu、Gln、或His；其中Xaa4指示Leu、Ala、Glu、Gln、His、或Trp；其中Xaa5指示Glu、Gln、Ala、His、或Leu；其中Xaa1指示His或Asp；其中Xaa6指示除去脯氨酸、甘氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的任何氨基酸；其中Xaa7指示Pro或Lys；Xaa8指示Glu、Gln、His、Arg、Lys或鸟氨酸；其中Xaa9指示Tyr或Glu；且其中Z指示长度2-7的多肽区段。
其中至少一个位点2相关位点(B13、B17、A12、A13、和A17) 含有相对于野生型人胰岛素的取代，且其中Xaa1指示Glu、Ala、Asp、His、或Leu；其中Xaa2指示Leu、Glu、Gln、Ala、或His；其中Xaa3指示Ser、Ala、Thr、Asp、Asn、Glu、Gln、或His；其中Xaa4指示Leu、Ala、Glu、Gln、His、或Trp；其中Xaa5指示Glu、Gln、Ala、His、或Leu；其中Xaa1指示His或Asp；其中Xaa6指示除去脯氨酸、甘氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的任何氨基酸；其中Xaa7指示Pro或Lys；Xaa8指示Glu、Gln、His、Arg、Lys或鸟氨酸；其中Xaa9指示Tyr或Glu；且其中Z指示长度3-8的多肽区段。

Claims (20)

1.一种含有相对于野生型胰岛素的至少一个取代的胰岛素类似物，所述取代包括在选自下述的位置处的取代：在B13处的Ala、Asp、His或Leu取代，在B17处的Glu、Gln、Ala、His、Trp或Tyr取代，在A12处的Ala、Thr、Asp、Asn、Glu、Gln、His或Tyr取代，在A13处的Ala、Glu、Gln、His、Tyr、Phe或Trp取代，以及在A17处的Ala、Gln、His、Trp或Tyr取代。
2.权利要求1的胰岛素类似物，其另外包含在位置B28处的Asp或Lys取代。
3.权利要求2的胰岛素类似物，其另外包含在位置B29处的Pro取代。
4.权利要求1-3中任一项的胰岛素类似物，其中所述类似物含有在位置A13处的Glu、His、Trp、Tyr、Ala或Phe取代。
5.权利要求4的胰岛素类似物，其另外包含在位置B24处选自对氯苯丙氨酸、邻氟苯丙氨酸和环己基丙氨酸的取代。
6.权利要求5的胰岛素类似物，其包含在位置B24处的邻氟苯丙氨酸取代，并且另外包含在位置B10处的天冬氨酸取代。
7.权利要求1-3中任一项的邻氟，其中所述类似物含有在位置B17处的丙氨酸取代。
8.权利要求1-3中任一项的胰岛素类似物，其中所述类似物含有在位置A13处的丙氨酸或苯丙氨酸取代。
9.权利要求1-3中任一项的胰岛素类似物，其中所述类似物含有在位置A17处的Glu取代。
10.权利要求1-3中任一项的胰岛素类似物，其中A链序列选自SEQ ID NO: 4-8。
11.权利要求1-3中任一项的胰岛素类似物，其中B链序列选自SEQ ID NO: 9-11。
12.一种DNA序列，其编码权利要求1的胰岛素类似物的A链。
13.一种DNA序列，其编码符合SEQ ID NO: 4、5、6、7或8的胰岛素类似物的A链。
14.一种DNA序列，其编码权利要求1的胰岛素类似物的B链。
15.一种DNA序列，其编码符合SEQ ID NO: 9、10或11的胰岛素类似物的B链。
16.一种DNA序列，其编码符合SEQ ID NO: 9、10或11的胰岛素类似物的B链，并且其还含有在位置B24处的无义密码子。
17.根据权利要求1-3中任一项的胰岛素类似物用于降低患者血糖的用途。
18.权利要求17的用途，其中所述类似物在含有摩尔比为2至10个锌离子/六个单链胰岛素类似物单体的锌离子的组合物中配制，并且其中制剂的pH为pH 6.8至pH 8.0。
19.权利要求18的用途，其中所述胰岛素类似物以至少U-100的强度进行配制。
20.权利要求19的用途，其中所述胰岛素类似物以U-500至U-1000的强度进行配制。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113166223A (zh) * 2018-09-21 2021-07-23 卡斯西部储备大学 位点2单链胰岛素类似物

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2936563A1 (en) 2014-01-13 2015-07-16 Thermalin Diabetes, Llc Rapid action insulin formulations and pharmaceutical delivery systems
US10472406B2 (en) * 2015-01-20 2019-11-12 Case Western Reserve University Insulin analogues with selective signaling properties and reduced mitogenicity
EP3487876A4 (en) * 2016-07-22 2020-02-19 University of Utah Research Foundation INSULIN ANALOGS
EP3529615A1 (en) * 2016-10-24 2019-08-28 Novo Nordisk A/S Bioassay for insulin formulations
MY200047A (en) 2016-11-21 2023-12-06 Univ Case Western Reserve Rapid-acting insulin analogues of enhanced stability

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010014946A2 (en) * 2008-07-31 2010-02-04 Case Western Reserve University Halogen-stabilized insulin
CN102065885A (zh) * 2008-04-22 2011-05-18 卡斯西部储备大学 同种型特异性的胰岛素类似物

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK158390D0 (da) * 1990-07-02 1990-07-02 Novo Nordisk As Nye peptider
DK10191D0 (da) * 1991-01-22 1991-01-22 Novo Nordisk As Hidtil ukendte peptider
DK33591D0 (zh) * 1991-02-27 1991-02-27 Novo Nordisk As
ES2542146T3 (es) 2006-07-31 2015-07-31 Novo Nordisk A/S Insulinas extendidas PEGiladas.
ES2554773T3 (es) 2006-10-04 2015-12-23 Case Western Reserve University Insulina y análogos de la insulina resistentes a la fibrilación
WO2009129250A2 (en) * 2008-04-14 2009-10-22 Case Western Reserve University Meal-time insulin analogues of enhanced stability

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102065885A (zh) * 2008-04-22 2011-05-18 卡斯西部储备大学 同种型特异性的胰岛素类似物
WO2010014946A2 (en) * 2008-07-31 2010-02-04 Case Western Reserve University Halogen-stabilized insulin

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KRISTENSEN ET AL: "Alanine Scanning Mutagenesis of Insulin", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *
姜宁 等: "重组人胰岛素类似物的研究应用进展", 《食品与药品》 *
怀文辉 等: "一种人胰岛素类似物的制备、鉴定与活性研究", 《生物化学与生物物理进展》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113166223A (zh) * 2018-09-21 2021-07-23 卡斯西部储备大学 位点2单链胰岛素类似物

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