CN114591417B - 人源单链胰岛素类似物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种人源单链胰岛素类似物及其应用，该人源单链胰岛素类似物包含由如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示序列编码片段。该胰岛素类似物是使用柔性肽替代C肽，并对序列的编码方向进行选择性改变，得到的胰岛素类似物，其基因可以在骨骼肌细胞中产生具有高活性的人源单链胰岛素，不依赖β细胞，具有广泛的使用方式。

Description

人源单链胰岛素类似物及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种人源单链胰岛素类似物及其应用。

背景技术

糖尿病是一种自身免疫性疾病，起因于胰岛中产生胰岛素的β细胞丧失或功能障碍，但具体病因和发病机制尚不明确，可能是遗传和环境因素的共同参与。糖尿病的并发症，比如慢性高血糖、系统性代谢衰竭和多器官损害，造成巨大的医疗和社会负担，并导致患者过早死亡。目前没有任何药物治疗可以有效阻止或逆转这种疾病的进展，主要治疗方式是胰岛素注射。

前胰岛素原具有108个氨基酸，在内质网中信号肽被切除形成胰岛素原，在高尔基体PC酶和羧肽酶E(CPE)对胰岛素原进行一步进行剪切加工切除C肽形成成熟的胰岛素，成熟的胰岛素由A、B两个肽链构成，A链有21个氨基酸，B链30个氨基酸，其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)形成两对链间二硫键，A链中A6(Cys)与A11(Cys)形成一对链内二硫键。未经过蛋白酶水解的胰岛素原与胰岛素受体的结合很弱，生物活性仅为成熟胰岛素的5％，PC酶主要存在胰岛β细胞，因此在其他靶细胞中表达天然胰岛素序列不能形成具有高活性的胰岛素。所以治疗需要进行外部胰岛素注射，目前全球主流的胰岛素生产技术有两种，第一种是诺和诺德的酿酒酵母表达体系，第二种是礼来的大肠杆菌表达体系，不过均存在生产壁垒：(1)生产工艺复杂，胰岛素有两条链，两条链是通过一条多肽链进行表达的，称为前体，表达完一条链后，需要进行酶切、提纯、连接等形成双链结构；(2)对成本控制要求极高。

T1D患者从诊断开始就需要终生胰岛素替代治疗，而且糖尿病的全球负担巨大且不断增长，胰岛素注射，给病人生活带来了经济心理负担与生活的不便。现有基因治疗使得病人能够体内生产胰岛素，生理性替代胰岛素不足，为了实现胰岛素基因在靶细胞中表达维持血糖的稳定，胰岛素表达系统需要包括以下部分：(1)具有生物活性的胰岛素类似物的序列；(2)合适的靶细胞，能表达目的蛋白并且操作方便，安全；(3)高效安全的靶细胞基因传递系统。

综上，现需要一种可以治疗糖尿病的胰岛素类似物基因药物。

发明内容

本发明目的在于提供一种人源单链胰岛素类似物及其应用，该人源单链胰岛素类似物可以显著控制机体血糖，使得高血糖水平下降接近正常水平；而且连接骨骼肌特异性启动子pEMS，调控胰岛素类似物基因的表达，实现了单链人源胰岛素类似物SIA在骨骼肌部位特异性高效表达，达到有效降血糖的效果。

本发明一方面在于提供了一种人源单链胰岛素类似物，其包含由如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示序列编码片段。

本发明再一方面提供了一种多核苷酸，其包含编码上述的人源单链胰岛素类似物核酸序列。

在某些具体示例中，编码上述的人源单链胰岛素类似物核酸序列包含如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示序列。

在某些具体示例中，上述多核苷酸还包括启动子，启动子包含如SEQIDNO.1所示序列。

本发明再一方面提供了一种表达载体，其包含上任一所述的多核苷酸。

在某些具体示例中，表达载体包含如SEQIDNO.5、SEQIDNO.6或SEQIDNO.7所示的序列。

在某些具体示例中，表达载体也可以包含如SEQIDNO.9、SEQIDNO.10或SEQIDNO.11所示的序列。

本发明再一方面提供了一种工程细胞，其包含以上所述的人源单链胰岛素类似物或以上所述的多核苷酸或以上所述的表达载体。

本发明再一方面提供了一种药物组合物，其包含以上所述的人源单链胰岛素类似物或以上所述的多核苷酸或以上所述的表达载体。

本发明再一方面提供了一种以上所述的人源单链胰岛素类似物或以上所述的多核苷酸或以上所述的表达载体或以上所述的工程细胞在制备用于提高机体胰岛素水平药物中的应用。

本发明再一方面提供了一种以上所述的人源单链胰岛素类似物或以上所述的多核苷酸或以上所述的表达载体或以上所述的工程细胞在制备用于治疗糖尿病药物中的应用。

在某些具体示例中，用于治疗糖尿病药物为用于治疗1型糖尿病药物。

本发明有益效果在于：本发明提供的人源单链胰岛素类似物是使用柔性肽替代C肽得到的胰岛素类似物，其基因可以在非β细胞中可以产生具有高活性的单链胰岛素，不依赖β细胞，具有广泛的使用方式；而且以骨骼肌特异性启动子pEMS调控SIA表达，实现了单链人源胰岛素类似物基因在骨骼肌部位特异性高效表达，达到有效降血糖的效果。

附图说明

图1为使用柔性肽(GGGPGKR)替代人胰岛素C肽并且对胰岛素原序列氨基酸顺序进行替换，将A链编码顺序从N端编码到C端改变成C端至N端编码示意图。

图2为使用柔性肽(GGGPGKR)2替代人胰岛素C肽编码示意图。

图3为使用柔性肽(GGGGS)3替代人胰岛素C肽编码示意图。

图4为ELISA法检测质粒pSC-SIA和pSC转染小鼠人胚胎肾细胞HEK293T后SIA表达情况，每组N＝3。

图5为检测SIA与HRP-Human insulin竞争性结合人胰岛素抗体情况，每组N＝3。

图6为检测不同浓度SIA与人胰岛素竞争性结合人胰岛素受体情况，每组N＝3。

图7为检测不同浓度SIA与人胰岛素竞争性结合鼠胰岛素受体情况，每组N＝3。

图8为检测不同浓度SIA促进成熟脂肪细胞对葡萄糖的摄取情况，每组N＝4。

图9为SIA对MCF-7细胞增殖影响情况。

图10为SIA对HEK293细胞增殖影响情况。

图11为SIA对C2C12细胞增殖影响情况。

图12为SIA对HL7702细胞增殖影响情况。

图13为各组小鼠血糖水平检测图。

图14为各组小鼠的生存曲线图。

图15为各组小鼠在不同时间的葡萄糖耐量IPGTT检测情况。

图16为各组小鼠在不同时间的AUC检测情况。

图17为各组小鼠在不同时间的血清胰岛素含量检测图。

具体实施方式

本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，并且无意于限制本公开。除非在上下文中具有明显不同的含义，否则单数形式的表达包括复数形式的表达。如本文所使用的，应当理解，诸如“包括”、“具有”、“包含”之类的术语旨在指示特征、数字、操作、组件、零件、元件、材料或组合的存在。在说明书中公开了本发明的术语，并且不旨在排除可能存在或可以添加一个或多个其他特征、数字、操作、组件、部件、元件、材料或其组合的可能性。如在此使用的，根据情况，“/”可以被解释为“和”或“或”。

本发明目的在于提供一种胰岛素类似物及其应用，该胰岛素类似物可以显著控制机体血糖，使得高血糖水平下降接近正常水平；而且以骨骼肌特异性启动子pEMS调控SIA表达，实现了单链人源胰岛素类似物SIA在骨骼肌部位特异性高效表达，达到有效降血糖的效果。

本发明一方面在于提供了一种胰岛素类似物，其包含由如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示序列编码片段。

具体地，使用柔性肽(GGGPGKR)替代人胰岛素C肽并且对胰岛素原序列氨基酸顺序进行替换，将A链编码顺序从N端编码到C端改变成C端至N端编码，获得具有高活性单链胰岛素类似物(简称SIA3)，其示意图如图1所示，胰岛素类似物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

具体地，使用柔性肽(GGGPGKR)2替代人胰岛素C肽并且对胰岛素原序列氨基酸顺序进行替换，获得具有高活性单链胰岛素类似物(简称SIA4)，其示意图如图2所示，胰岛素类似物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。

具体地，使用柔性肽(GGGGS)3替代人胰岛素C肽并且对胰岛素原序列氨基酸顺序进行替换，获得具有高活性单链胰岛素类似物(简称SIA7)，其示意图如图3所示，胰岛素类似物的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。

具体地，上述胰岛素类似物为人源单链胰岛素，当然也可以是其他来源改造的序列，比如鼠源、兔源等。

具体地，上述胰岛素类似物除了包含由如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示序列编码片段外，也可以是包含与上述胰岛素类似物的蛋白序列同一性≥80％以上序列的物质，比如包含同一性

≥80％、85％、90％、95％序列的物质。

本发明再一方面提供了一种多核苷酸，其包含编码上述的胰岛素类似物核酸序列。

进一步地，编码上述的胰岛素类似物核酸序列包含如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示序列。

具体地，除了上述的包含如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示序列，还可以是如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示序列优化密码子后的序列。

进一步地，上述多核苷酸还包括启动子，启动子可以是根据不同环境所需要的启动子，比如增强型肌肉特异性启动子(启动子包含如SEQIDNO.1所示序列)，将上述的如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示序列的胰岛素类似物编码序列分别连接增强型肌肉特异性启动子，可以实现胰岛素类似物在骨骼肌部位特异性高效表达。

本发明再一方面提供了一种表达载体，其包含上任一所述的多核苷酸。

进一步地，表达载体包含如SEQIDNO.5、SEQIDNO.6或SEQIDNO.7所示的序列。

具体地，上述如SEQIDNO.5所示序列的表达载体是用BamHI/EcoRI双酶切pSC载体，柱回收载体骨架，与BamHI/EcoRI双酶切的SIA3-his片段进行连接，构建得到的pSC-SIA3-his载体。

具体地，上述如SEQIDNO.6所示序列的表达载体是用BamHI/EcoRI双酶切pSC载体，柱回收载体骨架，与BamHI/EcoRI双酶切的SIA4-his片段进行连接，构建得到的pSC-SIA4-his载体。

具体地，上述如SEQIDNO.7所示序列的表达载体是用BamHI/EcoRI双酶切pSC载体，柱回收载体骨架，与BamHI/EcoRI双酶切的SIA7-his片段进行连接，构建得到的pSC-SIA7-his载体。

进一步地，表达载体也可以包含如SEQIDNO.9、SEQIDNO.10或SEQIDNO.11所示的序列。

具体地，上述如SEQIDNO.9所示序列的表达载体是通过以下方法制得：从质粒pGL3-EMS-Luc上扩增EMS片段，质粒pGL3-EMS-Luc的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示；将上述pSC-SIA3-his载体进行MluⅠ/NheI双酶切，将去除sv40enhancer-CMV片段的部分与扩增得到的EMS片段进行连接，得到重组表达载体pEMS-SIA3-his，pEMS-SIA3-his的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示。

具体地，上述如SEQIDNO.10所示序列的表达载体是通过以下方法制得：从质粒pGL3-EMS-Luc上扩增EMS片段，质粒pGL3-EMS-Luc的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示；将上述pSC-SIA4-his载体进行MluⅠ/NheI双酶切，将去除sv40 enhancer-CMV片段的部分与扩增得到的EMS片段进行连接，得到重组表达载体pEMS-SIA3-his，pEMS-SIA4-his的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示。

具体地，上述如SEQIDNO.11所示序列的表达载体是通过以下方法制得：从质粒pGL3-EMS-Luc上扩增EMS片段，质粒pGL3-EMS-Luc的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示；将上述pSC-SIA7-his载体进行MluⅠ/NheI双酶切，将去除sv40enhancer-CMV片段的部分与扩增得到的EMS片段进行连接，得到重组表达载体pEMS-SIA3-his，pEMS-SIA7-his的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示。

具体地，上述扩增EMS片段的引物序列可以使用引物设计软件进行设计，如本发明中设计出的一种引物如下所示：EMS-F:SEQIDNO.12所示；EMS-R:SEQIDNO.13所示。

本发明再一方面提供了一种工程细胞，其包含以上所述的胰岛素类似物或以上所述的多核苷酸或以上所述的表达载体。

具体地，上述工程细胞可以是上述的多核苷酸或上所的表达载体转染工具细胞，使得胰岛素类似物的基因表达，获得含有胰岛素类似物的工程细胞，比如骨骼肌细胞，上述表达载体可以很好的在骨骼肌细胞中进行表达。

本发明再一方面提供了一种药物组合物，其包含以上所述的胰岛素类似物或以上所述的多核苷酸或以上所述的表达载体。

进一步，药物组合物还包括可药用稀释剂和/或可药用载体。

具体地，药学上可接受的载体和/或稀释剂指的是可以将上述的胰岛素类似物或上述的多核苷酸或上述的表达载体或上述的工程细胞制备成各种所需的剂型。例如可以列举作为口服剂的片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片、膏剂等，作为非口服剂，可以列举注射剂、栓剂、经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂等，本领域的技术人员能够根据给药途径和给药对象等选择适当的剂型。

进一步，药物组合物还包括EGCG或L64，作为上述核酸序列或者表达载体的高效安全的靶细胞基因传递系统介质。

本发明再一方面提供了一种以上所述的胰岛素类似物或以上所述的多核苷酸或以上所述的表达载体或以上所述的工程细胞在制备用于提高机体胰岛素水平药物中的应用。

具体地，上述的胰岛素类似物可以制备成注射剂补充机体胰岛素来源，也可以将上述的多核苷酸或上述的表达载体或上述的工程细胞制成细胞或者基因药物在机体内选择性或者非选择性表达产生胰岛素，从而提高机体胰岛素水平。为了安全性考虑，可以直接一次肌肉注射pEMS-SIA质粒后，基因自己在体内表达产生胰岛素；某些实施例中，肌肉注射pEMS-SIA质粒时，将其与EGCG或L64混合，然后进行注射；而且pEMS-SIA质粒可以在骨骼肌细胞类进行良好的表达，产生胰岛素。

本发明再一方面提供了一种以上所述的胰岛素类似物或以上所述的多核苷酸或以上所述的表达载体或以上所述的工程细胞在制备用于治疗糖尿病药物中的应用。

进一步地，用于治疗糖尿病药物为用于治疗1型糖尿病药物。除此之外，也可以根据糖尿病具体的情况，只要涉及补充胰岛素的治疗药物，均可以考虑使用上述的胰岛素类似物或上述的多核苷酸或上述的表达载体或上述的工程细胞进行治疗。同样地，上述的胰岛素类似物可以制备成注射剂补充机体胰岛素从而治疗糖尿病，也可以将上述的多核苷酸或上述的表达载体或上述的工程细胞制成细胞或者基因药物在机体内选择性或者非选择性表达产生胰岛素，从而治疗糖尿病。

为了更好地理解本发明，下面结合具体示例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的示例。

以下实施例中，HL7702人肝正常细胞(ratmyoblastcell)、NIH3T3-L1小鼠前脂肪胚胎成纤维贴壁细胞(preadipocytes)、C2C12小鼠成肌细胞(mousemyoblasts)和HEK293T人胚肾细胞(humanembryonickidneycells)均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

以下实施例中，所用到的试剂配方如下表1所示。

表1试剂配方

以下实施例中，在NCBI中查找人胰岛素基因(NM_000207.2)，将基因序列下载后分析信号肽、胰岛素B链、胰岛素A链、胰岛素C肽等各部分的核酸序列，将C肽的序列删除，替换成柔性肽(GGGPGKR)的核苷酸序列，并且将A链编码顺序从N端编码到C端改变成C端至N端编码，命名为SIA3，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；将C肽的序列删除，替换成柔性肽(GGGPGKR)的核酸序列，命名为SIA4，其核苷酸序列如SEQIDNO.3；将C肽的序列删除，替换成柔性肽(GGGGS)的核酸序列，命名为SIA7，其核苷酸序列如SEQIDNO.4。

以下实施中，质粒携带的“his标签”仅仅是6×his在表达纯化蛋白的时候加上的便签，不会影响目的质粒的表达与性能。

以下实施例中，委托擎科公司对上述的SIA3、SIA4和SIA7进行DNA序列合成并克隆到pSC质粒上，具体如下：

(1)用BamHI/EcoRI双酶切pSC载体，柱回收载体骨架，分别与BamHI/EcoRI双酶切的SIA3-his、SIA4-his和SIA7-his片段进行连接，构建pSC-SIA3-his、pSC-SIA4-his和pSC-SIA7-his载体。具体地，酶切按照Thermo Scientific^TM的ER0273、ER0053的说明书操作；连接按照Thermo Scientific^TM的EL0013说明书操作。

(2)用MluⅠ/NheI分别双酶切上述的pSC-SIA3-his、pSC-SIA4-his和pSC-SIA7-his载体，胶回收大片段，从pGL3-EMS-Luc上扩增EMS片段，上游酶切位点选用MluⅠ，引物为EMS-F，其序列如SEQIDNO.12所示，下游酶切位点选用NheI，引物为EMS-R，其序列如SEQIDNO.13所示；将扩增基因片段EMS、与MluⅠ/NheI双酶切的pSC-SIA3-his、pSC-SIA4-his和pSC-SIA7-his载体片段进行连接构建pEMS-SIA3-his、pEMS-SIA4-his和pEMS-SIA7-his载体。具体地，酶切按照Thermo Scientific^TM的ER0561、ER0971的说明书操作；连接按照ThermoScientific^TM的EL0013说明书操作。

将以上序列测序检验以确保合成序列完全准确，以上的质粒构建情况如下表2所示。

表2质粒构建情况

目的质粒	插入位点	插入序列	被改造质粒
				pSC-SIA3-his	BamHI/EcoRI	SIA3-his	pSC
pSC-SIA4-his	BamHI/EcoRI	SIA4-his	pSC
				pSC-SIA7-his	BamHI/EcoRI	SIA7-his	pSC
pEMS-SIA3-his	MluI/NheI	pEMS	pSC-SIA3-his
				pEMS-SIA4-his	MluI/NheI	pEMS	pSC-SIA4-his
pEMS-SIA7-his	MluI/NheI	pEMS	pSC-SIA7-his

细胞实验

以下实施例中，标准品为人胰岛素，来自优品生物Cat#RXD104930H。

以下实施例中，辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体为HRP-抗人胰岛素抗体，来自优品生物YP100201。

以下实施例中，DMEM培养基的配方为：L-谷氨酰胺4mM、NaHCO33700mg/L、D-葡萄糖4500mg/L、丙酮酸钠1mM和酚红指示剂15mg/L。

以下实施例中，样本稀释液为ELISA检测试剂盒中的稀释液。

实施例1细胞表达SIA的ELISA检测

(1)使用前将所有试剂和组分先恢复到室温；

(2)设置标准品孔、0值孔、空白孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL，0值孔加样本稀释液50μL，空白孔不加，样本孔加待测样本50μL；除空白孔外，标准品孔、0值孔和样本孔，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL；

(3)用封板膜盖住反应板，37℃培养箱孵育60min；

(4)揭开封板膜，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置20S，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复5次；若使用自动洗板机，请按洗板机操作程序进行洗板，添加浸泡30s的程序，可以提高检测的精度；洗板结束，加底物前，要在干净不掉屑的纸上，充分拍干反应板；

(5)将显色液A和B按1:1体积充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL，用封板膜盖住反应板，37℃培养箱温育15min；

(6)所有孔加入终止液50μL在酶标仪上读取各孔吸光度0D450值；以标准品浓度做为纵坐标(6个标准品孔，加1个0值孔共7个浓度点)，对应的吸光度(OD值)作为横坐标，创建标准曲线方程，通过样本的吸光度(OD值)，利用方程计算样品的浓度值。

将HEK-293T细胞分别转染pEMS-SIA3-his、pEMS-SIA4-his和pEMS-SIA7-his质粒后培养48h后的细胞上清作为待测样本按照上述方法进行检测细胞培养基中SIA3、SIA4和SIA7的表达，结果如图1所示，SIA3在HEK293T中的表达量约为1.34ng/ml，SIA4在HEK293T中的表达量约为6.56ng/ml，SIA7在HEK293T中的表达量约为6.52ng/ml。

实施例2细胞表达的SIA与抗体结合能力检测

(1)在10cm板中均匀接种细胞HEK293T，过夜培养；

(2)用质粒pSC-SIA-his对HEK293T进行瞬时转染，48h后收取上清液，同时以pSC质粒作为对照转染；

(3)在ELISA板每孔4℃过夜包被1μg/mL胰岛素抗体0.1μg(抗人胰岛素抗体，优品生物YP100200)，100μL每孔；PBST洗5次，每次30s；

(4)每孔添加1％BSA(PBS配制)100μL，37℃封闭2h；PBST洗5次，每次30s；

(5)加入标准品或检测样本50μL和50μL浓度为1.25ng/mlHRP标记人胰岛素，37℃，孵育1h(稀释样本和抗体都用1％BSA(PBST配制)；PBST洗5次，每次30s；

(6)将显色液A和B按1:1体积充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL，用封板膜盖住反应板，37C水浴锅或恒温箱温育15min；

(7)所有孔加入终止液50μL，在酶标仪上读取各孔吸光度。

按照上述步骤分别检测转染pSC-SIA3-his、pSC-SIA4-his和pSC-SIA7-his的细胞上清内的SIA3、SIA4和SIA7与人胰岛素抗体结合情况，结果如图2所示，转染pSC-SIA3-his、pSC-SIA4-his和pSC-SIA7-his的细胞上清内的SIA3、SIA4和SIA7均可以与人胰岛素抗体结合，且能与人胰岛素竞争性结合人胰岛素抗体，在相同浓度下SIA3与人胰岛素抗体结合能力最强，SIA7次之。

实施例3细胞表达的SIA与人胰岛素/鼠胰岛素受体结合能力检测

(1)在10cm板中均匀接种细胞HEK293T，过夜培养；

(2)用质粒pSC-SIA-his对HEK293T进行瞬时转染，48h后收取上清，以Millipore的Amiconultra规格为3k超滤管进行浓缩检测并调整浓度后用于进行胰岛素抗体结合实验同时以pSC质粒作为对照转染；

(3)ELISA板每孔4℃过夜包被1μg/mL胰岛素受体0.1μg(抗人胰岛素抗体，优品生物YP100200)，100μL每孔；PBST洗5次，每次30s；

(4)每孔添加1％BSA(PBS配制)100μL，37℃封闭2h；PBST洗5次，每次30s；

(5)加入检测不同浓度梯度SIA样本50μL和浓度为1.25ng/mLHRP-humaninsulin50μL，37℃孵育1h；PBST洗5次，每次30s；

(6)将显色液A和B按1:1体积充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL，用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱温育15min；

(7)所有孔加入终止液50μL，酶标仪上读取OD450各孔吸光度。

按照上述步骤分别检测转染pSC-SIA3-his、pSC-SIA4-his和pSC-SIA7-his的细胞上清内的SIA3、SIA4和SIA7与人胰岛素受体结合能力，结果如图3所示，SIA3、SIA4和SIA7均能与人胰岛素受体结合并与人胰岛素产生竞争关系。

按照上述步骤分别检测转染pSC-SIA3-his、pSC-SIA4-his和pSC-SIA7-his的细胞上清内的SIA3、SIA4和SIA7与鼠胰岛素受体结合能力，结果如图4所示，SIA3、SIA4和SIA7均能与鼠胰岛素受体结合并与人胰岛素产生竞争关系

图3和图4说明，SIA3、SIA4和SIA7均能与人胰岛素受体以及鼠胰岛素受体结合并与人胰岛素产生竞争关系，说明SIA具有与胰岛素相同的生物功能。

实施例4SIA促进细胞吞噬葡萄糖类似物分子测试

葡萄糖的主要来源是：肠道对食物的吸收，肝糖原的分解，以及糖异生。胰岛素在糖代谢中的作用包括：抑制糖原分解和糖异生、促进葡萄糖转运至脂肪和肌肉组织、增强脂肪和肌肉中的糖酵解、刺激糖原合成。胰岛素与其靶细胞外膜上的特定受体结合，从而激活细胞内的代谢过程。在骨骼肌和脂肪组织中，胰岛素刺激细胞对葡萄糖摄取和利用。胰岛素及其类似物是通过促进骨骼肌和脂肪等周围组织摄取葡萄糖、抑制肝葡萄糖的产生而降低血糖的。因此在检测胰岛素类似物功能时，将促进葡萄糖摄取能力作为检测的重要指标。

将NIH3T3-L1细胞传代于96孔培养板中，使用DMEM培养基培养，当与细胞接触抑制2d后，加入诱导剂10％胎牛血清FBS的高糖DMEM培养液(含10μg/ml胰岛素、1μmol/L地塞米松额0.5mmol/LIBMX)，培养2d；然后换为10％胎牛血清的高糖DMEM培养液(含10μg/ml的胰岛素)，培养2d；然后改为10％的胎牛血清的DMEM培养液，每2d换液直到诱导成为成熟的脂肪细胞(细胞体积增大，细胞中出现串状的脂肪滴)，占总体积的90％分化的成熟的3T3-L1脂肪细胞用于下一步实验。

在10cm板中接种HEK293T细胞，分别用pSC-SIA3-his、pSC-SIA4-his、pSC-SIA7-his和pSC质粒进行转染，以pSC质粒作为对照48h后收集细胞上清，以Millipore的-进行浓缩检测SIA浓度；吸掉NIH3T3-L1诱导分化的成熟的3T3-L1脂肪细胞的培养基，在SFM/1％BSA中血清饥饿4小时，用含1％BSA的Krebs-Ringer磷酸盐缓冲液，在37℃孵育15分钟；胰岛素或SIA以降低的浓度(从5，2.5，1nM)在37℃下孵育30分钟；用冰冷的KRP快速洗涤细胞三次，结束实验。

在激发波长为485nm，发射波长为535nm的条件下，用荧光酶标仪测量荧光密度，结果如图5所示，SIA3、SIA4和SIA7不同浓度处理能够增强成熟脂肪细胞对2-NBDG的摄取能力，且在5nM浓度的SIA7处理后对葡萄糖类似物摄取能力增强最显著。

实施例5SIA对细胞增殖影响测试

胰岛素类似物设计需要考虑药物有效性、分子动力学与安全性。胰岛素和胰岛素样生长因子(IGF-1)结构相似，两者氨基酸序列约有50％同源，与IGF-1受体结合可调节细胞的生长和分化，并且胰岛素或胰岛素类似物与胰岛素受体结合并且缓慢解离会促进有丝分裂。正常的生理条件下胰岛素并不具有促进有丝分裂的作用，胰岛素类似物在一定程度上对胰岛素分子结构进行改变对其与胰岛素受体和IGF-1受体的亲和力可能产生影响，因此需要检测其具有潜在促有丝分裂作用。

将MCF-7、HEK293、C2C12和HL7702细胞分别接种在96孔板中，培养液中含有0.1％的FCS和0.5％的优质牛血清白蛋白(不含胰岛素样生长因子污染物)，24小时后在HEK293、C2C12和HL7702细胞中分别添加不同浓度的含有SIA3、SIA4和SIA7的细胞上清(浓度:10nM、5nM和1nM)，在MCF-7细胞培养24小时后，孵育10nM的配体，配体处理48h后，进行细胞换液后，每孔加入CCK-8试剂(10μL)，孵育2h；在450nm处读取吸光度。

结果如图6、图7、图8、图9所示，增殖试验中，除MCF-7外，胰岛素、SIA3、SIA4和SIA7在各细胞系中对细胞增殖无明显作用，胰岛素可以与胰岛素受体(IR)和胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)结合，两种受体都是酪氨酸激酶受体家族的成员，在酪氨酸激酶结构域具有高度同源性。IR负责代谢作用，而IGF-1R负责有丝分裂作用，MCF-7细胞主要表达IGF-1受体，因此浓度为10nM的SIA3与SIA4会与IGF-R结合在一定程度上促进MCF-7细胞增殖。

体内实验

以下实施例中，先将C57BL/6J雄性小鼠，6周龄购入，适应性喂养1周用于以下测试。

以下实施例中，先建立1型糖尿病小鼠模型：建模鼠连续5d腹腔注射STZ溶液(60mg/kg)，注射前禁食12h，不禁水；注射时将STZ溶于柠檬酸缓冲液中(pH4.5)，避光冰上配制；注射后，禁食6个小时；注射完成后的第三天开始，用剪尾法采集小鼠血液，尾尖剪去1-2mm，弃掉第一滴，用罗氏血糖仪检测血糖，血糖大于16.7mmol/L且持续2周则视为糖尿病模型构建成功。

以下实施例中，先将建模成功小鼠进行随机分组，分别设置：T1D组(建模、不处理)、Exp1组(建模、注射pEMS-SIA3)、Exp2组(建模、注射pEMS-SIA4-his)和Exp3组(建模、注射pEMS-SIA7-his)，另增加WT组(正常小鼠)，每组8只小鼠。

以下实施例中，将100μg pEMS-SIA3-his、100μg pEMS-SIA4-his和100μg pEMS-SIA7-his质粒分别与EGCG混匀孵育30min后与10％L64混合(最终L64终浓度为0.1％)，在每只小鼠左腿胫骨前肌注射，一小时后进行电脉冲处理(5Hz，3min，强度3级)。

实施例6小鼠血糖检测

糖尿病患者会出现三多一少症状，多食、多饮、多尿，体重减少。糖尿病小鼠禁食不禁水处理12小时，尾尖剪去1-2mm，弃掉第一滴，用第二滴检测血糖；动作轻柔，避免应激性的高血糖，采用罗氏血糖仪对小鼠血糖进行检测。

在上述小鼠模型建前一周开始以3天为一间隔检测血糖，检测五组小鼠在接受治疗33天期间的血糖水平变化情况(每组8只)，如图10所示，在实验期间正常C57BL/6J小鼠血糖始终在5-10mM范围内波动，T1D造模未治疗组小鼠血糖始终高于16.7mM，分别使用pSC-SIA3-his、pSC-SIA4-his和pSC-SIA7-his质粒进行治疗后发现，pSC-SIA3-his、pSC-SIA4-his和pSC-SIA7-his治疗小鼠血糖均得到明显控制，高血糖水平下降接近正常小鼠组。

实施例7小鼠生存率检测

从上述小鼠治疗当天开始，每日观察小鼠的毛色和生存情况，对死亡的小鼠进行记录，最后用GraphPadprism对其生存情况做出统计学分析。

结果如图11所示，经过pEMS-SIA3-his，pEMS-SIA4-his，pEMS-SIA7-his质粒治疗的小鼠生存期增长。

实施例8小鼠葡萄糖耐量实验

葡萄糖耐量测试用于评价机体对血糖浓度的调节能力，广泛应用于临床中。正常小鼠在给予葡萄糖注射或灌胃后，血糖升高，刺激胰岛素分泌、肝糖原合成增加，分解受抑制，肝糖原输出减少，体内组织对葡萄糖利用增加，2小时内血糖浓度可恢复至正常空腹水平，服用一定量葡萄糖后，每隔一定时间检测个体血糖，称为耐糖试验。

在上述小鼠治疗后第14天进行糖耐实验，小鼠禁食不禁水处理12h后，每只小鼠腹腔注射剂量为2g/Kg的葡萄糖溶液；配置的葡萄糖浓度为200mg/mL，体重20g的小鼠注射剂量为200μL；注射葡萄糖后0min，15min，30min，60min，90min，120min，150min测定小鼠的血糖。结果如图12和图13所示，WT组正常小鼠在葡萄糖处理后血糖升高，但是在2h内血糖恢复正常；T1D建模未治疗的糖尿病小鼠注射葡萄糖溶液后血糖浓度急剧升高，并且持续高血糖这表明T1D对葡萄糖几乎无处理能力；pEMS-SIA3-his、pEMS-SIA4-his和pEMS-SIA7-his这3组小鼠的葡萄糖处理能力都得到一定恢复，在150min后血糖下降接近正常水平，其中pEMS-SIA3-his葡萄糖处理能力恢复最为显著，数据表明SIA3、SIA4和SIA7均能够有效提高葡萄糖处理能力，达到降血糖作用。

实施例9小鼠体内胰岛素水平检测

上述经过pEMS-SIA3-his、pEMS-SIA4-his和pEMS-SIA7-his分别治疗的T1D小鼠血糖降低，检测治疗后第0、6、12、18、24、30、36天各组小鼠体内胰岛素表达情况。

采用上述小鼠眼眶后血管丛取血约200μL，4℃过夜放置后在预冷的4℃离心机中以3500rpm离心15min，收集上清-80℃长期保存，按照胰岛素检测试剂盒提供的方法进行检测。

结果如图14所示，经过pEMS-SIA3-his、pEMS-SIA4-his和pEMS-SIA7-his治疗之后，在血清中均有SIA3、SIA4和SIA7表达持续至30天，36天仅有微弱表达，这与治疗后30天内血糖能控制在正常范围内，33天左右血糖上升的情况一致。

                         序列表

<110>  四川大学

<120>  人源单链胰岛素类似物及其应用

<130>  2022-4-5

<160>  13

<170>  SIPOSequenceListing 1.0

<210>  1

<211>  689

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<400>  1

ttgatgtact gccaagttgg aaagtcccgt tagtgcccat tgacgtcaat aatatatggc  60

gacggccggg cccctccctg gggacagccc cggtgtggaa agtccccagg ctccccagca 120

ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccaggactat ataaaaaacc 180

tgacccgata tgcctggcca gccaatagcg gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg 240

cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc agacacccaa atatggcgac 300

gggtgaggaa tggtgaccaa gtcagcaggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca 360

gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccac caacacctgc tgcctgcccg 420

ctctaaaaat aactcccggc ttcaggtttc cctagggccc ctccctgggg acagccccat 480

atggcgacgg ccccccattg acgtcaatgg gacggtaaat ggcccgcctg gcgcccattg 540

acgtcaataa tccagccaat agcacccgat atgcctgggg actatataaa aaacctggga 600

cacccgagat gcctggttac aaggcctggg gacacgctct aaaaataact cccccaacac 660

ctgctgcctg ccggcttcag gtttcccta                                   689

<210>  2

<211>  267

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<400>  2

atggccctgt ggatgcgcct cctgcccctg ctggcgctgc tggccctctg gggacctgac  60

ccagccgcag cctttgtgaa ccaacacctg tgcggctcac acctggtgga agctctctac 120

ctagtgtgcg gggaacgagg cttcttctac acacccaaga ccggcggcgg ccctggcaag 180

cgtaactgct acaacgagct gcagtacctc tcctgcatca gcacctgttg ccaagaagtg 240

attggccatc atcaccatca ccattga                                     267

<210>  3

<211>  288

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<400>  3

atggccctgt ggatgcgcct cctgcccctg ctggcgctgc tggccctctg gggacctgac  60

ccagccgcag cctttgtgaa ccaacacctg tgcggctcac acctggtgga agctctctac 120

ctagtgtgcg gggaacgagg cttcttctac acacccaaga ccggcggcgg ccctggcaag 180

cgtggcggcg gccctggcaa gcgtggcatt gtggaacaat gctgtaccag catctgctcc 240

ctctaccagc tggagaacta ctgcaaccat catcaccatc accattga              288

<210>  4

<211>  291

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<400>  4

atggccctgt ggatgcgcct cctgcccctg ctggcgctgc tggccctctg gggacctgac  60

ccagccgcag cctttgtgaa ccaacacctg tgcggctcac acctggtgga agctctctac 120

ctagtgtgcg gggaacgagg cttcttctac acacccaaga ccggcggcgg cggcagcggc 180

ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcggc attgtggaac aatgctgtac cagcatctgc 240

tccctctacc agctggagaa ctactgcaac catcatcacc atcaccattg a          291

<210>  5

<211>  5705

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<400>  5

gacggatcgg gagatctcga tggagcggag aatgggcgga actgggcgga gttaggggcg  60

ggatgggcgg agttaggggc gggactatgg ttgctgacta attgagatgc atgctttgca 120

tacttctgcc tgctggggag cctggggact ttccacacct ggttgctgac taattgagat 180

gcatgctttg catacttctg cctgctgggg agcctgggga ctttccacac cctaactgac 240

acacattcca cagcacgcgt tgacattgat tattgactag ttattaatag taatcaatta 300

cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg 360

gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc 420

ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa 480

ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca 540

atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta 600

cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt 660

acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg 720

acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca 780

actccgcccc attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca 840

gagctctctg gctaactaga gaacccactg cttactggct tatcgaaatt aatacgactc 900

actataggga gacccaagct ggctagcgtt taaacttaag cttggtaccg agctcggatc 960

catggccctg tggatgcgcc tcctgcccct gctggcgctg ctggccctct ggggacctga 1020

cccagccgca gcctttgtga accaacacct gtgcggctca cacctggtgg aagctctcta 1080

cctagtgtgc ggggaacgag gcttcttcta cacacccaag accggcggcg gccctggcaa 1140

gcgtaactgc tacaacgagc tgcagtacct ctcctgcatc agcacctgtt gccaagaagt 1200

gattggccat catcaccatc accattgaga attctgcaga tatccagcac agtggcggcc 1260

gctcgagtct agagggcccg tttaaacccg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg 1320

ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc 1380

cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc 1440

tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag gattgggaag acaatagcag 1500

gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggc ttctgaggcg gaaagaacca gctggggctc 1560

tagggggtat ccccacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac 1620

gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc 1680

ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt 1740

agggttccga tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg 1800

ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac 1860

gttctttaat agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta 1920

ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat 1980

ttaacaaaaa tttaacgcga attaattctg tggaatgtgt gtcagttagg gtgtggaaag 2040

tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc 2100

aggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat 2160

tagtcagcaa ccatagtccc gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt 2220

tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc 2280

gcctctgcct ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt 2340

tgcaaaaagc tcccgggagc ttgtatatcc attttcggat ctgatcaaga gacaggatga 2400

ggatcgtttc gcatgattga acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg 2460

gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg 2520

ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc 2580

ctgaatgaac tgcaggacga ggcagcgcgg ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct 2640

tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa 2700

gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg 2760

gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa 2820

gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat 2880

gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg 2940

cgcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc 3000

atggtggaaa atggccgctt ttctggattc atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac 3060

cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg 3120

gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc 3180

tatcgccttc ttgacgagtt cttctgagcg ggactctggg gttcgaaatg accgaccaag 3240

cgacgcccaa cctgccatca cgagatttcg attccaccgc cgccttctat gaaaggttgg 3300

gcttcggaat cgttttccgg gacgccggct ggatgatcct ccagcgcggg gatctcatgc 3360

tggagttctt cgcccacccc aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca 3420

atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt 3480

ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct gtataccgtc gacctctagc tagagcttgg 3540

cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca 3600

acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca 3660

cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc 3720

attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt 3780

cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact 3840

caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag 3900

caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata 3960

ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc 4020

cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 4080

ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc 4140

tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 4200

gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 4260

ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 4320

ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 4380

gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 4440

aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ttttttgttt 4500

gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 4560

cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 4620

caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 4680

gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 4740

cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta 4800

cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 4860

caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 4920

gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 4980

gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt 5040

cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 5100

catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 5160

gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 5220

ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 5280

gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg 5340

cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 5400

tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact 5460

gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa 5520

atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 5580

ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 5640

gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg 5700

acgtc                                                            5705

<210>  6

<211>  5726

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<400>  6

gacggatcgg gagatctcga tggagcggag aatgggcgga actgggcgga gttaggggcg  60

ggatgggcgg agttaggggc gggactatgg ttgctgacta attgagatgc atgctttgca 120

tacttctgcc tgctggggag cctggggact ttccacacct ggttgctgac taattgagat 180

gcatgctttg catacttctg cctgctgggg agcctgggga ctttccacac cctaactgac 240

acacattcca cagcacgcgt tgacattgat tattgactag ttattaatag taatcaatta 300

cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg 360

gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc 420

ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa 480

ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca 540

atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta 600

cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt 660

acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg 720

acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca 780

actccgcccc attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca 840

gagctctctg gctaactaga gaacccactg cttactggct tatcgaaatt aatacgactc 900

actataggga gacccaagct ggctagcgtt taaacttaag cttggtaccg agctcggatc 960

catggccctg tggatgcgcc tcctgcccct gctggcgctg ctggccctct ggggacctga 1020

cccagccgca gcctttgtga accaacacct gtgcggctca cacctggtgg aagctctcta 1080

cctagtgtgc ggggaacgag gcttcttcta cacacccaag accggcggcg gccctggcaa 1140

gcgtggcggc ggccctggca agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc 1200

cctctaccag ctggagaact actgcaacca tcatcaccat caccattgag aattctgcag 1260

atatccagca cagtggcggc cgctcgagtc tagagggccc gtttaaaccc gctgatcagc 1320

ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt 1380

gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca 1440

ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga 1500

ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg cttctgaggc 1560

ggaaagaacc agctggggct ctagggggta tccccacgcg ccctgtagcg gcgcattaag 1620

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<210>  7

<211>  5729

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<213>  人工序列(Artificial Sequence)

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ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg 3720

ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc 3780

ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact 3840

gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta 3900

atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag 3960

caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc 4020

cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta 4080

taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg 4140

ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc 4200

tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac 4260

gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac 4320

ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg 4380

aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga 4440

agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt 4500

agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtt tttttgtttg caagcagcag 4560

attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac 4620

gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc 4680

ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag 4740

taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt 4800

ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag 4860

ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca 4920

gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact 4980

ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca 5040

gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg 5100

tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc 5160

atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg 5220

gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca 5280

tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt 5340

atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc 5400

agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc 5460

ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca 5520

tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa 5580

aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat 5640

tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa 5700

aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtc      5754

<210>  11

<211>  5757

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<400>  11

gacggatcgg gagatctcga tggagcggag aatgggcgga actgggcgga gttaggggcg  60

ggatgggcgg agttaggggc gggactatgg ttgctgacta attgagatgc atgctttgca 120

tacttctgcc tgctggggag cctggggact ttccacacct ggttgctgac taattgagat 180

gcatgctttg catacttctg cctgctgggg agcctgggga ctttccacac cctaactgac 240

acacattcca cagcacgcgt ttgatgtact gccaagttgg aaagtcccgt tagtgcccat 300

tgacgtcaat aatatatggc gacggccggg cccctccctg gggacagccc cggtgtggaa 360

agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa 420

ccaggactat ataaaaaacc tgacccgata tgcctggcca gccaatagcg gtgtggaaag 480

tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc 540

agacacccaa atatggcgac gggtgaggaa tggtgaccaa gtcagcaggt gtggaaagtc 600

cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccac 660

caacacctgc tgcctgcccg ctctaaaaat aactcccggc ttcaggtttc cctagggccc 720

ctccctgggg acagccccat atggcgacgg ccccccattg acgtcaatgg gacggtaaat 780

ggcccgcctg gcgcccattg acgtcaataa tccagccaat agcacccgat atgcctgggg 840

actatataaa aaacctggga cacccgagat gcctggttac aaggcctggg gacacgctct 900

aaaaataact cccccaacac ctgctgcctg ccggcttcag gtttccctag ctagcgttta 960

aacttaagct tggtaccgag ctcggatcca tggccctgtg gatgcgcctc ctgcccctgc 1020

tggcgctgct ggccctctgg ggacctgacc cagccgcagc ctttgtgaac caacacctgt 1080

gcggctcaca cctggtggaa gctctctacc tagtgtgcgg ggaacgaggc ttcttctaca 1140

cacccaagac cggcggcggc ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc ggcagcggca 1200

ttgtggaaca atgctgtacc agcatctgct ccctctacca gctggagaac tactgcaacc 1260

atcatcacca tcaccattga gaattctgca gatatccagc acagtggcgg ccgctcgagt 1320

ctagagggcc cgtttaaacc cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat 1380

ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc 1440

tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg 1500

ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg 1560

gggatgcggt gggctctatg gcttctgagg cggaaagaac cagctggggc tctagggggt 1620

atccccacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg 1680

tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc 1740

tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc 1800

gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta 1860

gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta 1920

atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg 1980

atttataagg gattttgccg atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa 2040

aatttaacgc gaattaattc tgtggaatgt gtgtcagtta gggtgtggaa agtccccagg 2100

ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg 2160

aaagtcccca ggctccccag caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc 2220

aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca 2280

ttctccgccc catggctgac taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctctgc 2340

ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa 2400

gctcccggga gcttgtatat ccattttcgg atctgatcaa gagacaggat gaggatcgtt 2460

tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg tggagaggct 2520

attcggctat gactgggcac aacagacaat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct 2580

gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga 2640

actgcaggac gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc 2700

tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg 2760

gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc 2820

aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca 2880

tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga 2940

cgaagagcat caggggctcg cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgcgcatgcc 3000

cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga 3060

aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca 3120

ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg 3180

cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct 3240

tcttgacgag ttcttctgag cgggactctg gggttcgaaa tgaccgacca agcgacgccc 3300

aacctgccat cacgagattt cgattccacc gccgccttct atgaaaggtt gggcttcgga 3360

atcgttttcc gggacgccgg ctggatgatc ctccagcgcg gggatctcat gctggagttc 3420

ttcgcccacc ccaacttgtt tattgcagct tataatggtt acaaataaag caatagcatc 3480

acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc 3540

atcaatgtat cttatcatgt ctgtataccg tcgacctcta gctagagctt ggcgtaatca 3600

tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga 3660

gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt 3720

gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga 3780

atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc 3840

actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 3900

gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 3960

cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 4020

ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 4080

ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 4140

ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 4200

agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 4260

cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 4320

aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 4380

gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 4440

agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 4500

ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtttttttgt ttgcaagcag 4560

cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct 4620

gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg 4680

atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat 4740

gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc 4800

tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg 4860

gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct 4920

ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca 4980

actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg 5040

ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg 5100

tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc 5160

cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag 5220

ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg 5280

ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag 5340

tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat 5400

agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg 5460

atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca 5520

gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca 5580

aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat 5640

tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag 5700

aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtc 5757

<210>  12

<211>  34

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<400>  12

cgacgcgttt gatgtactgc caagttggaa agtc                              34

<210>  13

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<400>  13

ctagctagct agggaaacct gaagccggca                                   30

Claims (9)

1.人源单链胰岛素类似物，其特征在于，由如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.4所示序列编码。

2.多核苷酸，其特征在于，其编码权利要求1所述的人源单链胰岛素类似物。

3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，编码权利要求1所述的人源单链胰岛素类似物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

4.根据权利要求2或3所述的多核苷酸，其特征在于，还包括启动子，启动子包含如SEQID NO.1所示序列。

5.表达载体，其特征在于，包含权利要求2至4中任一项权利要求所述的多核苷酸。

6.工程细胞，其特征在于，包含权利要求1所述的人源单链胰岛素类似物或包含权利要求2至4中任一项权利要求所述的多核苷酸或权利要求5所述的表达载体。

7.药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的人源单链胰岛素类似物或包含权利要求2至4中任一项权利要求所述的多核苷酸或权利要求5所述的表达载体。

8.权利要求1所述的人源单链胰岛素类似物或权利要求2至4中任一项权利要求所述的多核苷酸或权利要求5所述的表达载体或权利要求6所述的工程细胞在制备用于治疗糖尿病药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，用于治疗糖尿病药物为用于治疗1型糖尿病药物。

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