상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 디하이드로폴레이트 환원효소의 GC-리치(rich) 반복서열 결실 프로모터를 포함하는 동물세포주용 발현 벡터를 제공한다.
상기 언급한 바와 같이, 동물 세포주에서의 재조합 단백질의 고발현을 유도하기 위한 한 방법으로서 디하이드로폴레이트 환원효소에 의한 유전자 증폭법이 널리 사용되어 왔으나, 종래 기술에 따르면 디하이드로폴레이트 환원효소 저해제를 고농도로 오랜 기간 사용함에 따른 세포주 안정화 및 시간과 비용상의 문제가 있었던 바, 본 발명은 이러한 디하이드로폴레이트 환원효소의 프로모터 중 GC-리치 반복서열을 일부 또는 전부 결실시켜 변이시킨 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자를 이용한 발현 벡터가 보다 짧은 시간에 보다 낮은 디하이드로폴레이트 환원효소 저해제를 사용하는 경우에도 보다 높은 효율로 디하이드로폴레이트 환원효소 및/또는 상기 벡터에 포함된 목적 재조합 유전자의 발현을 유도할 수 있음을 발견하였다.
여기서, GC-리치 반복서열이란, 디하이드로폴레이트 환원효소의 전사조절인자인 프로모터에 포함된 CCGCCC 반복서열을 의미하는 것으로, 이 반복서열을 전부 또는 일부를 결실, 변이 등에 의한 방법으로 인위적으로 결손시키면 디하이드로폴레이트 환원효소의 발현은 최소한으로 이루어지게 된다. 이 때, 발현이 최소로 유지된 상태에서 디하이드로폴레이트 저해제를 첨가하는 경우, 세포는 생존을 위하여 더 많은 수의 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자를 증폭하게 되고, 따라서, 상기 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자를 포함하는 발현 벡터 내에 포함된 목적 재조합 유전자 또한 동시에 증폭되어 고발현되는 것으로 관찰되었다.
따라서, 본 발명의 구체적인 일 양태에서는, CCGCCC 반복서열이 하나 이상 제거된 프로모터를 포함하는 디하드로폴레이트 환원효소 유전자의 염기서열을 포함하는 고발현 유도 카세트를 제공한다. 바람직하게, 상기 고발현 유도 카세트는 6 개 이하의 CCGCCC 반복서열을 포함하는 디하이드로폴레이트 환원효소의 프로모터를 포함하며, 더욱 바람직하게는 3 개 이하의 CCGCCCC 반복 서열을 포함하는 프로모터를 포함하고, 특히 바람직하게는 1 개 이하의 CCGCCC 반복 서열을 포함하는 프로모터를 포함하며, 더욱 특히 바람직하게는 CCGCCC 반복 서열 전부가 제거된 프로모터를 포함한다.
이들 CCGCCC 반복서열의 제거는, 당 업계에 널리 알려져 있는 유전자 재조합 기술에 따른 염기서열의 치환이나 결실 등의 방법에 의해 이루어질 수 있으며, 본 발명의 구체적 실시예에서는 CCGCCC 반복서열을 포함하는 염기서열의 일부를 결실시키는 방법에 의하여 프로모터 내 GC-리치 서열의 일부 또는 전부를 제거하였다.
본 발명의 또 다른 양태에서는, 상기 고발현 유도 카세트를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
용어 ‘벡터’는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함하며, 바람직하게는 플라스미드 벡터이다.
상기 발현 벡터는 바람직하게, 목적하는 재조합 단백질을 암호화하는 유전자를 더 포함할 수 있으며, 이러한 발현벡터를 발현시킴으로써 목적하는 재조합 단백질을 고효율로 발현시킬 수 있다.
상기 목적 재조합 단백질이란, 일반적으로 생리활성 폴리펩타이드를 포함하는 개념으로서, 호르몬, 사이토카인, 인터루킨, 인터루킨 결합 단백질, 효소, 항체, 성장인자, 전사조절인자, 혈액인자, 백신, 구조단백질, 리간드 단백질 또는 수용체, 세포표면항원, 수용체 길항물질과 같은 다양한 단백질 및 이들의 유도체 및 유사체들을 예시할 수 있으며, 구체적으로는 인간 성장 호르몬, 인터페론류 및 인터페론 수용체류, 콜로니 자극인자, 인터루킨류, 에리스로포이에틴, 인슐린, 안지오텐신, 골 형성 성장인자, B 세포인자, T 세포인자, 신경 성장인자류, 세포 표면항원, 단일클론항체 및 바이러스 유래 백신 항원 등을 포함하며 이들에 제한되는 것이 아니다. 당업자는 현재의 기술 수준에서 디하이드로 폴레이트 환원효소에 의한 증폭 기술을 적용할 수 있는 재조합 단백질을 용이하게 선택할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시 양태에서, 상기 재조합 단백질은 인간 에리트로포이에틴이다.
상기 목적 재조합 단백질은 상기 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자의 프로모터에 의해 발현되거나 또는 별도의 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있다. 바람직하게는, 상기 목적 재조합 단백질은 별도의 프로모터에 의해 발현이 조절된다. 이러한 프로모터로는 당 업계에 널리 알려진 것으로서, 예를 들어 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, LTR 프로모터, EFα 프로모터, SV40 프로모터 및 TK 프로모터로 구성되는 군으로부터 당업자가 용이하게 선택하여 사용할 수 있을 것이며, 이들에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 발현 벡터는 동물세포주에서의 고발현을 유도하기 위한 것으로서, 바람직하게 동물세포에서의 영구적인 발현을 위한 선택 표지 인자로 사용되는 동물세포주용 저항성 유전자를 더 포함할 수 있다. 상기 동물세포주용 저항성 유전자로는 통상적으로 당업계에서 사용하는 동물세포주용 저항성 유전자인 네오마이신 저항성 유전자, 제오신 저항성 유전자, 하이그로마이신 저항성 유전자 및 블라스시스틴 저항성 유전자 등이 있으며, 이들에 한정되는 것은 아니다.
이 외에도, 본 발명의 발현 벡터는 또한 일반적인 벡터의 구성요소들, 예를 들어 복제원점 및 다중 아데닐레이션 신호와 기타 전사 조절인자 등을 더 포함할 수 있으며, 이들에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태에서는, 본 발명에 따른 상기 발현 벡터로 형질전환된 세포주를 제공한다.
구체적인 한 양태로서, 본 발명은 디하이드로폴레이트 환원효소의 프로모터 중 CCGCCC 반복서열을 하나만 가지는 고발현 유도 카세트 및 CCGCCC 반복서열을 전혀 포함하지 않는 고발현 유도 카세트를 각각 제조하였으며, 이들 발현카세트를 포함하는 발현벡터에 의해 형질전환된 E.coli 세포주를 제공한다. 이들 세포주는 2006년 10월 2일자로 대한민국 대전시 유성구에 소재하는 생명공학연구원 내 유전자은행에 수탁번호 KCTC 10991 BP 및 KCTC 10992 BP 로서 각각 기탁하였다. 이들 세포주는, 원하는 목적 재조합 단백질의 고발현을 유도하기 위하여, 상기 세포주로부터 상기한 고발현 유도 카세트를 포함하는 발현벡터를 분리하여 유전자 재조합 기술 등에 의한 클로닝 방법으로, 목적 재조합 단백질을 암호화하는 유전자를 더 포함하는 발현벡터의 제작에 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체적인 양태에서는, 상기 발현 벡터는 목적하는 재조합 단백질을 암호화하는 유전자를 더 포함하는 것으로서, 이러한 발현 벡터에 의해 형질전환된 세포주 또한 제공한다.
바람직한 한 양태로서, 이들 목적하는 재조합 단백질은 동물세포주에서의 발현이 요구되는 것으로서, 이러한 목적에 비추어, 본 발명에서 사용 가능한 바람직한 동물세포주로는 중국 햄스터 난소(CHO : Chinese hamster ovarian cacer)세포주, 원숭이 신장 세포 7(COS7 : Monkey kidney cells) 세포주, NSO 세포주, SP2/0 세포주, W138, 어린 햄스터 신장(BHK : Baby hamster kidney) 세포주, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 293 세포 등을 포함할 수 있으며, 이들에 제한되지 않는다. 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가지는 기술자라면 본 발명의 디하이드로폴레이트 환원 효소를 이용한 증폭 기술에 적용가능한 적절한 동물세포주를 용이 하게 선택할 수 있을 것이다.
본 발명의 구체적인 양태에서는, 상기 동물세포주로서 CHO 세포주를 사용하였으며, 보다 구체적으로는 디하이드로폴레이트 환원효소가 결핍된 중국 햄스터 난소 세포주(CHO/dhfr-)를 사용하였다. 즉, 디하이드로폴레이트 환원효소가 결핍된 CHO 세포주에 인간 재조합 에리트로포이에틴을 암호화하는 유전자를 포함하는 본 발명에 따른 발현 벡터를 형질전환하여, 100nM 이하의, 보다 바람직하게는 50nM 이하의 낮은 메토트렉세이트 농도에서도 충분한 수의 유전자가 증폭되어 생산성이 검증된 동물 세포주를 제공한다. 후술하는 실시예에 자세히 기술하는 바와 같은 이들 세포주는 2006년 10월 2일에, 상기한 대전시 유성구 소재 생명공학연구원 내 유전자 은행에 수탁번호 KCTC 10993BP, KCTC 10994BP 및 KCTC 10995BP로서 기탁하였다.
본 발명의 또 다른 양태에서는, 본 발명에 따른 GC-리치 서열이 일부 또는 전부 제거된 프로모터를 포함하는 디하이드로폴레이트 환원효소를 암호화하는 유전자 및 목적 재조합 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 본 발명의 동물세포용 발현 벡터로 동물 세포주를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 동물 세포주를 배양하는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에서 동물세포주로의 “형질전환”은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 사용하는 동물세포주에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 세포벽이 없 는 포유동물 세포의 경우, 인산칼슘 침전법을 사용할 수 있다(Graham et al, 1978, Virology, 52 : 456-457). 포유동물 숙주 세포로의 형질전환의 일반적인 방법 및 특징은 미합중국 특허 제4,399,216호에 기재되어 있다. 구체적으로 본 발명에서는 CHO 세포에 리포펙타민을 이용하여 재조합 단백질을 발현하는 벡터를 세포 안으로 형질전환하였다. 또한, 본 발명에서 동물세포주의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 동물세포주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 세포의 성장방식에 따라 현탁배양과 부착배양을, 배양방법에 따라 회분식과 유가식 및 연속배양식의 방법으로 구분된다. 배양에 사용되는 배지는 특정한 세포주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다.
동물세포 배양에 있어 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 사용될 수 있는 탄소원의 예에는 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유 및 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산 및 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올 및 아세트산과 같은 유기산이 포함된다, 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원의 예에는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL) 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기질소원이 포함된다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 그 외에, 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다.
또한 상기 배지에는 메톡트렉세이트와 같은 디하이드로폴레이트 환원효소 저해제가 첨가될 수 있다. 이는 상기한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 단백질 재조합 방법은 디하이드로폴레이트 환원효소가 결실된 동물세포주에 본 발명에 따른 발현 벡터를 형질전환하고, 재조합 유전자를 증폭하기 위해 디하이드로폴레이트 환원효소 저해제를 첨가하여 벡터 내의 디하이드로폴레이트 환원효소가 증폭되어 선택될 수 있도록 하는 시스템을 단기간에 효율적으로 구현하는데 그 목적이 있기 때문이다.
본 발명의 바람직한 구현에 따르면, 디하이드로폴레이트 저해제의 경우 세포주의 안정성과 경제성을 고려하여 가급적 낮은 농도로 짧게 사용하는 것이 바람직하다. 즉, 낮은 농도로 디하이드로폴레이트 환원효소 저해제를 사용함으로써 대량 생산을 하는 경우의 안정성과 짧은 생산 세포주 개발 기간을 가능하게 한다. 구체적으로, 본 발명은 디하이드로폴레이트 환원효소가 결핍된 중국 햄스터 난소 세포주에 상기의 재조합 단백질 발현벡터를 형질전환하여 100nM 이하의, 바람직하게는 50nM 이하 농도의 메토트렉세이트를 사용하는 재조합 단백질의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 추가적인 한 양태로서, 상기에 기술한 세포주로부터 에리트로포이에틴을 생산하는 경우, 생산된 에리트로포이에틴 중 시알산을 다량 함유하여 물성이 뛰어난 고시알산 함유 에리트로포이에틴을 대량으로 정제하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 디하이드로폴레이트 환원효소의 프로모터 중 GC-rich 서열을 인위적으로 결손시켜 발현이 최소한으로 이루어 질 수 있게 한 후 디하이드로폴레이트 환원효소 저해제를 첨가하여 유전자를 증폭시켰다. 유전자 증폭이 이루어진 세포주들 중 한 개의 세포로부터 기원한 클론을 얻기 위하여 한계 희석을 실시하여 단클론 세포주를 획득하고, 이를 대량 배양하여 무혈청 배지에서 재조합 인간 에리트로포이에틴을 생산하였다. 이 때, 저염 농도에서 용출되는 에리트로포이에틴은 시알산 함유량이 높은 분획이며, 고염 농도에서 용출되는 에리트로포이에틴은 시알산 함유량이 낮은 분획이 됨을 이용하여, 칼럼 볼륨 농도 구배를 적용하여 에리트로포이에틴을 용출시켜 고시알산 함유 에리트로포이에틴을 정제하여 활성을 확인하였다.
이하 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 본 실시예는 발명을 구체적으로 예시하기 위한 것일 뿐으로, 본 발명이 하기의 실시예에 국한되거나 제한되는 것은 아니다.
실시예
1.
실시예
1.
GC
-
rich
반복서열이 순차적으로 제거된 발현벡터의 제조
GC-rich 반복서열이 결실된 프로모터에 의해 발현되는 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자 카세트 구조를 만들기 위하여 pSV2-dhfr(ATCC # 37146) 플라스미 드로부터 SmaI 제한 효소 인식 부위를 갖는 프라이머 dhfr 01(5'-GCG CCC GGG ATG GTT CGA CCA TTG AAC TGC-3')과 BstBI 제한효소 인식부위를 갖는 프라이머 dhfr-02 (5'-CAC TTA GAA CCT GTT AGT CTT TCT TCT CGT AGA C-3')을 이용하여 PCR을 실시하여 디하이드로 폴레이트 환원 효소 유전자를 증폭하고 얻어진 약 200 bp의 증폭 산물을 1 % 아가로스 겔에서 전기영동 한 후 QIAGEN사의 gel extraction 키트(cat # 28706)를 사용하여 회수하였다. 회수한 유전자 절편은 Qiagen 사의 pDRIVE 벡터에 직접 삽입하여 클로닝 하고 염기서열 분석을 실시하여 오류가 없음을 확인하였다. 염기서열이 확인된 pDRIVE-dhfr 플라스미드로부터 디하이드로 폴레이트 환원 효소 유전자를 제한효소 SmaI/BstBI으로 절단하고 1.5 % 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 약 200 bp의 유전자 절편을 QIAGEN사의 gel extration 키트(cat # 28706)를 사용하여 회수하였다. 이러한 방법으로 얻어진 디하이드로폴레이트 환원 효소 유전자 절편은 Invitrogen 사의 pcDNA 3.1 벡터의 네오마이신 유전자 서열을 동일한 제한 효소로 절단하여 치환하였다. 이렇게 클로닝된 pcDNA3.1-dhfr 플라스미드를 주형으로 하여, BamHI 제한효소 인식부위를 가지며 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터의 각기 다른 GC-rich 반복서열에 상보적인 프라이머 x 1GC (5'-TCA GGA TCC ATT CTC CGC CCC ATG GCT GAC TAA-3'), x 3GC (5'-CAT GGA TCC TAA CTC CGC CCA GTT CCG CCC ATT CT-3'), x 6GC (5'-CAT GGA TCC CAT AGT CCC GCC CCT AAC TCC GCC C-3')와, 역시 BamHI제한효소 인식부위를 가지며 디하이드로폴레이트 환원효소와 구조적으로 연결된 폴리아데닐레이트화 신호서열과 상보적인 프라이머 BISVpAR(5'-TCA GGA TCC CAG ACA TGA TAA GAT ACA TTG ATG -3')를 이용한 PCR을 실 시하여 GC-rich 반복 서열이 순차적으로 일부 손실된 각기 다른 세가지 크기의 유전자 카세트를 얻었다. 이 유전자 카세트를 BglII 제한효소로 절단한 invitrogen사의 pcDNA3.1벡터에 삽입하여 클로닝 한 후, 제한효소 지도법을 이용하여 벡터의 CMV 프로모터와 동일한 방향성을 지니는 클론을 선별하였다. 이를 통하여 X1GC/dhfr, X3GC/dhfr 및 X6GC/dhfr 플라스미드를 제조하였다. 각각의 플라스미드는 인간 genomic DNA 유래의 에리트로포이에틴 유전자를 클로닝 하는데 사용하였다. 또한 GC-rich 반복서열이 완전히 제거된 대조군 발현벡터를 제작하기 위하여 다음과 같이 클로닝을 실시하였다.
디하이드로폴레이트 환원효소 유전자와 SV40 바이러스 폴리아데닐레이트 서열을 얻기 위하여 BamHI 제한효소 인식부위를 포함하는 프라이머 X0GC (5'-CGA TGG ATC CGA CAT GAT AAG ATA CAT TGA T-3')와 X0GCRR (5'-CGT TGG ATC CAC AGC TCA GGG CTG CGA TTT C-3')를 제작하였다. pSV2-dhfr 플라스미드를 주형으로 하여 PCR을 수행하여 SV40 바이러스 폴리아데닐레이트 서열로부터 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자의 5' 비해독 부위에 이르는 서열 1.5 kb의 증폭산물을 얻었다. 이 유전자절편을 1% 아가로스 겔에서 전기영동한 후 gel extraction 키트 (QIAGEN, cat #28706)를 사용하여 회수하여 invitrogen사의 pcDNA3.1을 제한효소 BglII로 절단한 위치에 삽입하였다. 제한효소 지도법을 이용하여 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자가 CMV 프로모터와 반대 방향으로 위치한 클론을 선별하였다. 몇 가지 제한효소 인식부위를 제거하기 위하여 벡터의 다클로닝 부위를 제한효소 NdeI과 DraIII로 절단하고, invitrogen사의 pRcCMV 벡터를 같은 방법으로 절단한 절편으로 치환하였다. 이를 통하여 X0GC/dhfr 벡터를 제작하였다.
이상의 클로닝 모식도를 도 1과 도 2에 정리하였다.
실시예
2.
gEPO
유전자의
클로닝
pCI-neo/gEPO 플라스미드를 XhoI/EcoRI 제한효소로 절단하고, DNA polymerase I Klenow fragment로 접착말단을 평활 말단으로 만든 후, 0.7% 아가로스 겔에서 전기 영동하여 인간 에리트로포이에틴 게놈유전자에 해당하는 약 2.2Kb 의 DNA절편을 gel extration 키트(QIAGEN사, cat #28706)를 사용하여 회수하였다. Invitrogen 사의 pRcCMV 벡터를 EcoRV로 절단하고 QIAGEN사의 PCR purification 키트(cat#28106)로 회수한 후, EcoRV 절단부위에 상기 에리트로포이에틴 게놈유전자를 접합시켜 클로닝하였다. 제한효소 지도법을 이용하여 벡터의 에리트로포이에틴 게놈유전자가 CMV 프로모터와 같은 방향성을 지니는 클론을 선별하였다. 실시예 1.의 X0GC/dhfr, x1GC/dhfr, x3GC/dhfr, x6GC/dhfr 벡터를 BamHI/XhoI 제한효소로 절단하고 1% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 gel extration 키트(QIAGEN사, cat #28706)를 사용하여 회수하였다. 같은 방법으로 pRcCMV벡터에 클로닝한 에리트로포이에틴 게놈유전자 절편을 회수하여, 절단한 x0GC/dhfr, x1GC/dhfr, x3GC/dhfr 및 x6GC/dhfr 벡터의 멀티클로닝 사이트의 BamHI/XhoI 위치에 삽입하여 서브클로닝 하였다. 얻어진 클론들의 염기서열을 분석하여 오류가 없음을 확인하고 이를 각각 X0GC/GEPO, X1GC/GEPO, X3GC/GEPO 및 X6GC/GEPO로 명명하였다. 이상의 클로닝 과정 을 도 3에 정리하였으며, 각각의 최종 서열을 서열목록에 표시하였다.
실시예
3
디하이드로폴레이트
유전자 결실 중국햄스터 난소 세포주의 형질전환
디하이드로폴레이트 유전자가 결손된 중국 햄스터 난소 세포주 CHO/DXB11 스트레인과 CHO/DG44 스트레인을 10 % 소태아 혈청(fetal bovine serum, Welgene, Cat # S101-01)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco, Cat # 15140-122)이 포함된 DMEM/F12 배지(Welgene, Cat # LM002-04)에 접종하여 37 ℃, 5 % CO2 항온기에서 계대배양 하였다. 상기 제조된 X0GC/GEPO, X1GC/GEPO, X3GC/GEPO 및 X6GC/GEPO 플라스미드로 각각의 디하이드로폴레이트 유전자 결손 중국 햄스터 난소 세포주를 형질 전환하기 위해 직경 6 cm 세포 배양 접시에 1×106 세포를 접종하고 37 ℃, 5 % CO2 항온기에서 24 시간 배양한 후, Gibco사의 Opti-MEM 배지(Gibco., Cat # 31985-070)로 2 회 세척하였다. 10 μg의 각각의 플라스미드가 들어있는 3 개의 1 mL의 Opti-MEM에 LipofectamineTM Reagent(Invitrogen, Cat # 18324-020) 1 mL을 혼합하여 상온에서 20분간 정치 반응시킨 후, 준비된 디하이드폴레이트 유전자 결손 중국 햄스터 난소 세포에 골고루 점적하고, 18시간 동안 37 ℃, 5 % CO2 항온기에서 배양한 후, 다시 10 % 소태아 혈청과 1 % 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM/F12 배양배지로 교환하여 48시간 동안 배양하였다. 형질전환된 세포주를 선별하기 위해 10 % 투석 소태아 혈청(dialyzed fetal bovine serum Welgene, Cat #XXXX)과 1% 페니실린-스트렙토마이신, 그리고 800 μg/mL의 geneticin(Mediatech, Cat # 61-234 RG)이 들어있는 α-MEM(Welgene, Cat # LM008-02) 선별 배지에서 0.5 % Trypsin-EDTA (Gibco., Cat # 15400-054) 처리와 원심분리를 통해 얻어진 세포주를 모두 T 25 세포 배양 용기로 옮겨 접종한 후, 37 ℃, 5 % CO2 항온기에서 배양하고, 형질 전환되어 제네티신(geneticin)으로 선별된 세포주가 배양 용기에 90% 이상 되도록 배양하였다. 동일한 농도의 제네티신과 배양 조건에서 세포주를 선별하였으며, GC 반복서열이 더 많이 제거된 세포주들에서 선별효과가 빠르게 나타남을 관찰할 수 있었다. 디하이드로폴레이트 유전자 결손 햄스터 난소세포주의 스트레인간의 유의적 차이는 발견되지 않았다.
실시예
4. 재조합 세포주의 선별과 에리트로포이에틴 유전자의 증폭
상기에서 형질전환되어 제네티신(geneticin)으로 선별된 각각 세포주(CHO/DXB11 스트레인 또는 CHO/DG44 strain)의 에리트로포이에틴 발현양을 증가시키기 위해 메토트렉세이트 (MTX, Sigma, Cat # M-8407)가 20 nM의 농도로 첨가된 선별 배지(상기의 선별배지와 동일)에 2×104세포/웰 을 24-well 배양 용기에 접종한 후, 37 ℃, 5 % CO2 항온기에서 2 주간 배양하였다. 에리트로포이에틴의 발현 양이 높은 세포주를 선별하기 위해 24 웰 배양 용기에서 웰의 바닥이 100 % 덮이도록 배양된 세포주를 PBS(Welgene, Cat # LB 001-02)로 2 회 세척한 후, 에리트로포이 에틴 생산 배지인 CHO-A-SFM(Gibco. Cat # 05-5072EF)을 200 μL/웰이 되도록 첨가하고 24시간 동안 배양한 배양 상층액을 회수하여 간접 이라이자(EPO ELISA kit, R&D, Cat # DEP00)방법으로 발현양을 측정하였다. 메토트렉세이트 농도를 30 nM으로 올린 후 동일한 선별배지에서 재차 2주간 배양을 실시하고 각각의 세포주들의 에리트로포이에틴 발현 양을 이라이자(ELISA ; Enzyme linked immunosorbent assay)키트 (R & D systems cat # DEP00)로 측정하여 비교하였다. 이라이자로 측정된 발현량은 도 4 ~ 도 7에서 보여지듯이 전반적으로 X0GC/GEPO와 X1GC/GEPO가 동일농도의 MTX 조건에서 가장 높은 발현량을 보이고 있음을 알 수 있으며, 이에 이어서 X3GC/GEPO와 X6GC/GEPO의 순이었다. 이러한 사실은 디하이드로폴레이트 유전자의 GC 반복서열을 많이 제거 할수록 동일 농도의 메토트렉세이트 존재시 유전자 증폭이 많이 일어나는 경우를 보여주고 있다. 또한 GC반복서열이 완전히 제거된 X0GC/GEPO에서도 효율적인 유전자 증폭이 일어남을 확인할 수 있었다. 따라서, GC 반복서열은 최소로 유지될 때 그 증폭 효과가 최대로 유지된다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 최대로 유전자 발현이 일어나는 메토트렉세이트의 농도를 확인하고자, 선별배지내 메토트렉세이트의 농도를 추가로 40 nM에서 60 nM 까지 증가시켜 보았으나 유의할 수준의 발현량 증가나 산성이소머의 함량변화는 일어나지 않음을 확인하였다. 본 결과를 바탕으로 실시예 6에서와 같이 X0GC/GEPO 및 X1GC/GEPO로 형질전환된 두 개의 세포주 스트레인에 대하여 한계 희석을 실시하였다.
실시예
5.
디하이드로폴레이트
유전자의 증폭 확인
실시예 4에서 얻어진 각각의 세포를 D-PBS용액으로 1회 세척하고 trypsin-EDTA를 처리하여 배양플라스크로부터 회수한 후 1,000 rpm에서 3 분간 원심분리하여 세포를 수득하였다. 이를 다시 D-PBS로 1회 세척하고 헤마사이토미터 (hemacytometer, incyto사)로 세포수를 세어 3 x 106개의 세포를 분리하고, 원심분리하여 세포침전을 얻었다. 얻어진 세포들은 각각 1.5 mL의 세포 용해 완충액(PBS, 5mM EDTA, 1% NP-40)으로 현탁한 후 4 ℃에서 30 분간 용해시킨 후 12,000 rpm으로 10 분간 원심 분리하여 상등액을 수득하였다.
12.5 % SDS 폴리아크릴아미드겔을 제작하고, 각각의 세포용해액과 음성대조군인 CHO/dhfr- 세포 용해액을 20 uL씩 취하여 샘플 완충액 10 uL와 혼합하여 100 ℃에서 5 분간 전처리하여 겔에 로딩하였다. 양성 대조군으로는 20 ng내지 100 ng의 디하이드로폴레이트 환원효소(Dihydrofolate Reductase, Sigma사, cat# D6566)를 샘플 완충액과 혼합하여 겔에 로딩하였다. 로딩한 겔을 30 mA의 전류로 전기 영동한 후, 겔을 분리하여 세미포어 웨스턴 블로팅 유닛(SEMI-PHOR, Hoefer사)에 PVDF여지와 3MM지와 포개어 장착하고 90 mA에서 1시간 동안 단백질을 PVDF 여지에 이동 시켰다. 이후 단백질이 이동된 PVDF 여지를 분리하여, 0.5% 탈지유가 포함된 TBS-T 용액 10 mL에 항-디하이드로폴레이트 환원효소 마우스 항체(BD Biosciences사, cat # 610697)를 1 : 500의 비율로 첨가한 용액에서 1시간 동안 교반하며 반응시켰다. TBS-T 용액으로 10 분씩 5 회 세척한 후, 0.5 % 탈지유가 포함된 TBS-T 용액 10ml에 호스 래디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase)가 표지된 항-마우스 항체(Amersham Biosciences사, cat# RPN2108 에 포함)를 1 : 3000의 비율로 첨가한 용액에서 1시간 동안 교반하며 반응시켰다. 다시 TBS-T용액으로 10 분씩 5 회 세척한 후, ECL 웨스턴 블로팅 분석 시약 (ECL Western Blotting Analysis System, Amersham Biosciences사, cat # RPN2108)의 1제와 2제를 1:1로 혼합하여 PVDF 여지 위에 뿌려 1분간 방치하여 반응시켰다. 반응 직후 엑스레이 필름으로 감광하고 현상하여 판독하였다. 웨스턴블로팅 결과는 도 9에 나타내었다. 도 9의 결과로부터 알 수 있듯이, 형질전환에 의해 dhfr 유전자의 발현량이 증가한 것을 알 수 있었다. 동일한 세포 개수에서 X0GC나 X1GC/GEPO에서의 dhfr 발현이 좀 더 높음을 알 수 있었다.
실시예
6.
단클론
세포주의 분리 및 선택
실시예 4에서 가장 발현 양이 높았던 웰의 X0GC/GEPO와 X1GC/GEPO 세포주를 6-웰 배양 용기로 옮겨 배양한 후, 단클론을 분리하기 위해 96-웰 배양 용기에 웰 당 0.5 세포가 되도록 메토트렉세이트가 첨가된 선별 배지로 각각의 세포주를 한계 희석하여 접종하였다. 37 ℃, 5 % CO2 항온기에서 약 2 ~ 3 주간 배양하며 단일 콜로니가 생성된 웰만을 선별하고 24-웰 배양 용기로 옮겨 배양하여 실시예 4와 같이 간접 이라이자 방법으로 에리트로포이에틴의 발현 양을 측정하였다.
이중 높은 발현량을 보이면서 등전집속 이형체중 산성 이소머의 비율도 높은 단클론 X0GC/GEPO9647(DXB11) 클론과 X1GC/GEPO9629(DG44) 및 X0GC/GEPO9603 clone 을 최종 단클론 세포주로 분리 및 선택하고, 시간에 따른 단클론들의 발현량과 등전집속 이형체 패턴을 분석하였다.
X0GC/GEPO9647(DXB11)의 경우 세포주당 발현량은 약 80 μg/10E6cell/day로 측정 되었다. 이와 같이 본 실시예에서 사용된 X0GC/GEPO나 X1GC/GEPO의 경우는 단 2 단계의 유전자 증폭만으로도 고발현 세포주를 획득할 수 있는 방법을 가능하게 하여 낮은 passage만으로도 단백질 생산용 단클론 생산 세포주를 제작하는 것이 가능함을 보여주고 있다.
실시예
7
단클론
세포주의 대량 배양
인간 에리트로포이에틴을 대량 생산하기 위해서 실시예 6에서 선별된 단클론 세포주들 중 X0GC/GEPO9647(DXB11)를 T175 배양 용기에서 계대 배양을 단계적으로 실시하여 총 120 개의 T175 flask까지 amplification을 실시하여 1 개의 Cell Factory(Nunc, Cat # 170009)당 약 2.5 X 108 개의 세포주를 접종하여, 총 8개의 cell factory를 접종 한 후 37 ℃, 5 % CO2 항온기에서 약 48 시간 동안 배양하였다. 인산 완충액으로 Cell Factory 1 개당 1 리터씩 2 번 수세한 후, 0.3 mM sodium butyrate(Sigma, Cat. B-5887)가 첨가된 에리트로포이에틴 대량 생산 배지인 무혈청 CHO-A-SFM(Gibco Fomula # 05-5072EF)을 1 리터씩 넣어주고 33 ℃, 5 % CO2 항온기에서 배양하며 2일마다 총 9회 동안 인간 에리트로포이에틴 발현 상등액을 회수하였다. 회수된 발현 상등액은 원심분리기와 pore size 0.2 μm 여과지를 이용하여 세포 잔존물등의 고형 부유물등을 제거하였다. 회수된 발현 상등액의 일부를 취하여 간접 이라이자 방법으로 발현량을 측정 하고 등전집속을 실시하여 산성의 등전집속 이형체의 함유량등을 분석하였다. 도 10의 결과에서와 같이 대량 배양에서도 40 - 50 mg/L 수준의 발현량을 유지하고 있음을 알 수 있었으며, 고시알산함유량의 척도가 될 수 있는 6번에서 8번 이소머의 함유량이 따로 정제과정을 거치지 않았음에도 높다는 것을 알 수 있었다.
실시예
8
고시알산
함유 인간 에리트로포이에틴의 분리 정제
실시예 7에서 생산된 세포 배양액내에 존재하는 부유물들을 제거하기 위하여 Beckman사의 XL-90 원심분리기를 이용하여 JLA-8.1000 로터에서 7,000 rpm으로 원심 분리 후 상등액을 회수 한 후 0.2 um의 여과지로 여과한 후 초여과지막(ultrafiltration membrane)을 이용하여 10분의 1 볼륨으로 농축을 실시하였다. 농축액에 동량의 20 mM Sodium Phosphate pH 7.4 버퍼를 섞었다. Amersham 사의 Blue FF 칼럼을 20 mM Sodium Phosphate pH 7.4 버퍼로 평형화 시키고 위의 에리트로포이에틴 함유액을 적용한 후, 20 mM Sodium Phosphate pH 7.4 버퍼로 칼럼의 5 배 볼륨으로 씻어 준 후, 2 M NaCl, 20 mM Sodium Phosphate pH 7.4 버퍼를 B 버퍼로 하여 칼럼 볼륨 2 배의 농도 구배를 적용하여 에리트로포이에틴을 용출시켰다.
에리트로포이에틴 분획이 주요 분획이 되는 부분을 모아 Sephardex G25 칼럼을 사용하여 에리트로포이에틴 함유 용액의 20 mM Sodium Phosphate pH 5.4 버퍼로 탈염 및 용액의 pH를 바꾸어 주었다. 이 에리트로포이에틴 함유 용액을 20 mM Sodium Phosphate pH 5.4로 평형화된 Amersham사의 SP HP 컬럼에 적용하고 20 mM Sodium Phosphate pH 5.4 버퍼로 5배의 칼럼 볼륨만큼 닦아 준 후 1 M NaCl, 20 mM Sodium Phosphate pH 7.4 버퍼를 B 버퍼로 하여 12배의 칼럼 볼륨 농도 구배를 적용하여 에리트로포이에틴을 용출시켰다. 이 때, 저염 농도에서 용출되는 에리트로포이에틴은 시알산 함유량이 높은 분획이며, 고염 농도에서 용출되는 에리트로포이에틴은 시알산 함유량이 낮은 분획이 되는데, 전체 용출양 중 고염 농도 부위의 에리트로포이에틴 30 %에 해당하는 부위는 제외하고 나머지 부분만을 취했다. SP HP 컬럼에서 정제한 에리트로포이에틴 분획은 다시 10 mM Tris, pH 7.5 버퍼로 평형화된 Sephardex G25 컬럼을 사용하여 염을 제거하고 버퍼를 바꾸어 준다. 이것을 10 mM Tris pH 7.5 버퍼로 평형화된 Amersham사의 Source 15 Q 컬럼에 적용하고 0.25 M NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5 버퍼를 B로 하여 6배의 칼럼볼륨 농도 구배를 적용하여 에리트로포이에틴을 용출시켰다. 에리트로포이에틴이 용출되는 부분을 15개 이상 분획하여, 각 분획을 SDS-PAGE, 등전집속과 모세관 전기영동(CZE; capillary zone electrophoresis)를 이용하여 전하 이성체 분포를 분석하여, 불순물이 없고, 시알산 함유량이 10개 붙은 에리트로포이에틴이 가장 많은 분획부터 고염 농도 분획을 모아 취하였다. 이상의 정제과정을 실시한 결과 시알산 함유량이 10 몰 이상인 재조합 인간 에리트로포이에틴의 생산성은 약 20 μg/mL에 달하는 것으로 조사되었다.
실시예
9
인간에리트로포이에틴의
특성 확인
①
SDS
-
PAGE
및
웨스턴
블로팅
분석
상기한 실시예 8에서 정제된 재조합 에리트로포이에틴을 두 개의 12 % SDS-PAGE서 전기영동을 실시하고, 한 개의 겔은 코마시 브릴리안트 블루 염색액에서 염색하고 탈색을 실시하여 관찰하였다. 나머지 하나의 겔은 세미 드라이 전기 전이기를 이용하여 PVDF 막 (Roche, cat # )에 흡착 시키고 항 인간 EPO항체 (R & D systems cat # AB-286-NA)를 1 : 5,000으로 처리한 후 세척을 실시하고 알칼라인 포스파타아제가 접합된 항 마우스 토끼 항체(Amersham cat # NA934V)를 처리하였다. 0.5 % Tween 20이 포함된 인산완충액으로 충분히 세척을 실시한 후 Amersham사의 발색시약(cat # RPN2108)으로 처리한 후 암실에서 필름 감광을 실시하고, 자동 현상기를 이용하여 현상을 실시하였다. 분석 결과 SDS-PAGE의 밴드가 에리트로포이에틴임을 확인할 수 있었으며, 당쇄화의 정도에 따라서 크기의 차이를 나타내는 것을 볼 수 있었다 (도 10 참조)
②
등전
집속
분석
세포배양 농축액과 상기한 실시예 4에서 정제된 재조합 에리트로포이에틴을 시료 완충액(Invitrogen cat # LC5371)과 1 : 1로 섞은 후 등전집속 겔 (Invitrogen cat # EC6655B)에 BRP (BRP cat # E1515000) 표준품 및 등전집속 기준물질과 함께 로딩하고 저전압과 고전압에서 차례로 전기영동을 실시하였다. 전기영동이 완료된 등전집속 겔을 12 % TCA와 3 % sulfosalisylic acid가 포함된 고정용 액에서 30 분간 흔들면서 고정을 실시하고, 코마시 브릴리언트 블루 R250(Amresco cat # 6104-59-2) 염색액에서 염색을 실시한 후 각각의 등전점에 해당하는 에리트로포이에틴을 관찰하였다. (도 11 참조)
③
TF
-1 세포주를 이용한
역가와
활성 분석
10 % 소태아 혈청과 10 uM β-mercaptoethanol, 20 ug/mL 트랜스페린, 12 ng/mL의 GM-CSF등이 함유된 RPMI 1640 (Welgene cat # LM 011-03)에서 자란 TF-1 (ATCC cat # CRL-2003)을 1,000 rpm에서 5 분간 원심 분리하여 회수한다. 회수된 TF-1 세포주는 인산완충액으로 2 회 세척을 실시하고, 2 % 소 태아 혈청 및 100 ug/mL 트랜스페린, 2 mg/mL protease-free 소 혈청, 1 % 페니실린/스트렙토마이신이 들어 있는 어세이 배지로 1회 세척을 실시하였다. 96 웰 플레이트에 50 uL의 어세이 배지를 첨가하고 시작하는 웰에 25 uL의 시료와 표준품을 넣어서 넣어 최종 농도가 1 ug/mL이 되도록 한 후 3 배씩 연속적으로 희석을 실시하였다. 각 웰에 어세이 배지로 세척을 실시한 TF-1 세포주를 2 X 104/50 uL/웰이 되게 더하였다. 37 ℃ 5 % CO2 배양기에서 약 72 시간동안 반응을 시킨 후 Promega사의 cell titer one solution 키트(cat # G4102)의 발색 용액 각 웰당 20 uL씩 첨가하였다. 4 시간 동안 37 ℃ 5 % CO2 배양기에서 발색을 실시 후 잘 섞어서 490 nm 파장에서의 흡광도를 Molecular Dynamics 사의 ELISA 리더에서 측정하였다. 본 시험을 통하여 X0GC/GEPO 유래의 재조합 에리트로포이에틴 활성이 표준품과의 차이가 없음을 확인 할 수 있었다.
실시예
10
단클론
세포주의
무혈청배지
adaptation
X1GC/GEPO9629(DG44)와 X0GC/GEPO9603(DG44) 스트레인을 10% 투석 소태아 혈청(dialyzed fetal bovine serum)과 1% 페니실린-스트렙토마이신, 800 ug/mL의 geneticin (Mediatech, Cat # 61-234 RG)이 들어있는 a-MEM(Welgene, Cat # LM008-02)선별 배지를 사용하여 2개의 T175 배양 용기에서 바닥에 90% 이상 배양되도록 하였다. 0.5% 트립신(Gibco., Cat # 15400-054) 처리 후, 원심 분리하여 얻은 세포 침전 덩어리를 10 ml의 PBS (Welgene, Cat # LM001-01)로 현탁하고, 재차 원심분리를 실시한 후 바닥의 세포덩어리를 8 mM 글루타민이 첨가된 JRH 사의 EX-CELL CD CHO (cat # 14360) 배양 배지로 현탁시켰다. 무혈청배지로 현탁된 세포배양액을 T175 배양용기에 넣어서 3일간 CO2 배양기에서 정치 배양을 실시하였다. 배양 후 약 3일 후에 바닥에 붙지 않고 떠서 자라는 세포들을 원심분리 한 후 새로운 T25 배양용기로 옮긴 후 다시 9 일간 정치 배양을 실시하였다. 9일 후 배양용기에서 떨어진 세포들을 다시 회수하여 세포수 및 성장곡선, 생존율 등을 측정하였다. 동일한 작업을 반복하여 세포분열이 24시간 내외로 이루어지고 생존률이 80 % 이상이 될 때가지 반복 실시하였다. 무혈청 배지로 완전 적응된 X0GC/GEPO9603(DG44) 세포주 및 X1GC/GEPO9629(DG44)의 발현 양상을 확인하기 위하여 500 mL spinner 배양용기(Bellco)에 1.0 X 10E5 cells/mL의 농도로 200 mL 배양배지에서 50 rpm으로 교반 배양을 실시하였다. 배양 7일 후 100 mL의 배양배지를 새 배양 배지로 바꾸고 배양온도를 33 ℃로 낮추어 저온발현을 실시하였다. 24시간 간격으로 배양 상등액을 취하여 등전집속을 실시하여 발현되는 에리트로포이에틴의 산성 이소머 함량을 확인하였다. 도 12에서 보이는 것과 같이 무혈청 배지에 완전 적응된 X0GC/GEPO9603(DG44) 및 X1GC/GEPO9629(DG44)의 경우 기존 cell factory에서 생산된 에리트로포이에틴과 대등한 수준의 등전집속 프로파일을 보이고 있음을 확인 할 수 있었다.