KR20010022107A - 내인성 유전자 활성화에 의한 에리트로포이에틴의제조방법 - Google Patents

내인성 유전자 활성화에 의한 에리트로포이에틴의제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 내인성 사람 에리트로포이에틴 유전자의 활성화로 인해, 사람 에리트로포이에틴(EPO)을 약제 제조물로서 경제적으로 생성시키기에 충분한 양 및 순도로 EPO를 생성시킬 수 있는 사람 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 이러한 사람 EPO 생성 세포의 제조방법, 사람 세포에서 내인성 EPO 유전자를 활성화시키기 위한 DNA 구성물, 및 사람 세포에서 EPO를 대량 생성시키는 방법에 관한 것이다.

Description

내인성 유전자 활성화에 의한 에리트로포이에틴의 제조방법 {PRODUCTION OF ERYTHROPOIETIN BY ENDOGENOUS GENE ACTIVATION}
에리트로포이에틴(EPO)은 적혈구 세포의 생성을 자극하는 사람 당단백질이다. EPO는 건강한 사람의 혈장에서 매우 저농도로만 생성되므로, 이러한 방식으로는 대량 제조가 불가능하다. EP-B-0148 605호 및 EP-B-0205 564호에는 CHO 세포에서의 재조합 사람 EPO의 제조방법이 기술되어 있다. EP-B-0148 605호에 기술된 EPO는 요 EPO보다 분자량이 더 높고, O-글리코실화되지 않는다. 한편, EP-B-0205 564호에 기술된 CHO 세포로부터의 EPO는 다량으로 그리고 순수한 형태로 이용되지만, 이것은 비사람 세포로부터 기원한다. 또한, CHO 세포의 생성 능력은 조종 상대적으로 제한된다.
또한, 재생불량성 빈혈이 있는 환자의 요로부터의 사람 EPO의 채취는 공지되어 있다 [참조 : Miyake et al., J. Biol. Chem. 252 (1977), 5558-5564)]. 여기에는, 이온교환기 크로마토그래피, 에탄올 침전, 겔여과 및 흡착 크로마토그래피를 포함하는 7단계 공정이 기술되어 있다. 특이 활성이 약 70,000/mg 단백질인 EPO 제조물이 21% 수율로 수득된다. 요 EPO를 수득하기 위한 상기 방법 및 다른 방법의 단점은 충분한 양 및 반복성 질로 출발물질을 수득하는 것이다. 또한, 요로부터의 정제는 어렵고, 정제된 생성물도 요의 불순물을 함유한다.
GB-A-2085 887호는 EPO를 소량으로 생성시킬 수 있는 사람 림포블라스토이드 세포의 제조방법이 기술되어 있다. 이를 세포에 의한 약제의 경제적 제조는 불가능하다.
WO 91/06667호에는, EPO의 재조합 제조 방법이 기술되어 있다. 일차 사람 배 신장 세포에서의 제 1 공정 단계에서, 내인성 EPO 유전자는 상동성 재조합에 의해 바이러스 프로모터와 조작적으로 결합되고, DNA는 이들 세포로부터 단리된다. 제 2 단계에서, 이와 같이 단리된 DNA는 비사람 CHO 세포로 형질전환되고, 이들 세포에서의 EPO의 발현이 분석된다. 사람 세포에서의 EPO의 생성이 가능하다는 점은 언급되어 있지 않다.
WO 93/09222호에는, 사람 세포에서의 EPO의 생성이 기술되어 있는데, 여기에서는, 완전 EPO 유전자를 함유하는 벡터에 의해 형질전환된 사람 섬유아세포에서 960,620 mU/106세포/24 h의 비교적 높은 EPO 생성율이 발견되었다. 이들 세포는 정확한 EPO 유전자좌에 있지 않는 외인성 EPO 유전자를 함유하므로, 세포주의 안정성에 대해 예측되는 문제점이 있다. WO 93/09222호에는, 구조적 EPO 생성에 대한 어떠한 정보도 기재되어 있지 않다. 또한, 생성되는 EPO가 약제용으로 충분한 질로 수득될 수 있는 지에 대한 어떠한 정보도 없다.
또한, WO 93/09222호에는, 사람 HT1080 세포에서의 내인성 EPO의 활성화가 기술되어 있다. 여기에서, EPO 생성율은 24시간 내에 단지 2,500 mU/106세포(약 10 ng/106세포/24 h에 상응함)인 것으로 밝혀졌다. 이러한 저생성율은 약제 제조물의 경제적 제조에는 완전히 부적합하다.
WO 94/12560호 및 WO 95/31560호에는, 바이러스 프로모터에 의해 활성화된 내인성 EPO 유전자를 갖는 사람 세포를 내인성 EPO 유전자의 증식 후에, 약 100,000 mU/106세포/24 h(약 10㎍/106세포/24 h에 상응함) 까지 생성시킬 수 있는 방법이 기술되어 있다. 이러한 양은 또한, 약제의 경제적 제조에는 여전히 불충분하다.
본 발명은 내인성 사람 EPO 유전자의 활성화를 기초로 하여, 약제 제조물로서 사람 EPO를 경제적으로 제조하기에 충분한 양 및 순도로 EPO를 생성시킬 수 있는 사람 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 이러한 사람 EPO 생성 세포를 제조하는 방법, 사람 세포에서 내인성 EPO를 활성화시키기 위한 DNA 구성물, 및 사람 세포에서 EPO를 대량으로 생성시키는 방법에 관한 것이다.
도 1은 5'-비번역 서열, 엑손 1 및 인트론 1의 영역으로부터의 EPO 유전자의 상동 영역의 증폭의 개략도이다.
도 2는 5'-비번역 서열, 엑손 1 및 인트론 1의 영역으로부터의 EPO 상동 영역을 함유하는 플라스미드의 개략도이다.
도 3은 로우스 육종 바이러스 프로모터(RSV), 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자(NEO), SV40의 초기 폴리아데실화 영역(SVIpA), 초기 SV40 프로모터(SVI), 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자(DHFR), 추가의 초기 SV40 폴리아데닐화 영역, 및 시토메갈로바이러스 중간 초기 프로모터 및 인핸서(MCMV)를 함유하는 유전자 활성화 서열의 개략도이다.
도 4a는 EPO 유전자 표적 벡터 p176의 제조물의 도면이다.
도 4b는 EPO 유전자 표적 벡터 p176 및 p187의 제조물의 도면이다.
도 4c는 EPO 유전자 표적 벡터 p189의 제조물의 도면이다.
도 4d는 EPO 유전자 표적 벡터 p190의 제조물의 도면이다.
도 4e는 EPO 유전자 표적 벡터 p192의 제조물의 도면이다.
도 5는 시그널 서열 변이를 갖는 EPO cDNA의 제조물의 개략도이다.
도 6a는 세포 DNA와 도 3에 도시된 유전자 카세트의 CMV로부터의 프로브의 혼성화의 도면으로서, 레인 1 내지 4는 각각 제한 효소 AgeI 및 AscI에 의해 분열된 사람 세포로부터의 DNA의 레인이며; 레인 1은 1,000 nM MTX로 증폭된 EPO 생성 HeLaS3 세포이고; 레인 2는 500 nM MTX로 증폭된 EPO 생성 HeLaS3 세포이고; 레인 3은 증폭되지 않은 EPO 생성 HeLaS3 세포이고; 레인 4는 활성화된 EPO 유전자를 갖지 않는 HeLaS3 세포이고; 레인 5는 디곡시게닌 표지된 길이 마아커이며; 레인 1 내지 3에서의 혼성화 단편의 크기는 약 5,200 bp이다.
도 6b는 EPO의 코드화 영역으로부터의 프로브와 사람 세포로부터의 DNA의 혼성화의 도면으로서, 레인 1은 디곡시게닌 표지된 길이 마아커이고; 레인 2 내지 4는 제한 효소 BamHI, HindIII 및 SalI에 의해 분열된 사람 세포로부터의 DNA이고; 레인 2는 500 nM MTX로 증폭된 EPO 생성 HeLaS3 세포이고 (특이 활성화 내인성 유전자에 의해 생성된 밴드의 길이는 3,200 bp이고; 유전자 표적화에 의해 활성화된 EPO 유전자의 복제물의 길이는 2,600 bp이다); 레인 3은 증폭되지 않은 EPO 생성 HeLaS3 세포로부터의 DNA이고; 레인 4는 HeLaS3 대조 세포로부터의 DNA이다.
서열 번호 1 및 2 : PCR 생성물 1을 제조하는 데에 사용되는 프라이머의 누클레오티드 서열 (도 1).
서열 번호 3 및 4 : PCR 생성물 2를 제조하는 데에 사용되는 프라이머의 서열 (도 1).
서열 번호 5 : 프라이머 EPO EX1의 서열.
서열 번호 6 : 프라이머 EX2의 서열.
서열 번호 7 : 프라이머 EX3의 서열 (Met-Gly-Ala-His).
서열 번호 8 : 프라이머 EX3에 의해 코드화된 개질된 시그널 펩티드 출발물질의 서열.
서열 번호 9 : 프라이머 EX4의 서열 (Met-Ser-Ala-His).
서열 번호 10 : 프라이머 EX4에 의해 코드화된 개질된 시그널 펩티드 출발물질의 서열.
서열 번호 11 : 프라이머 EX5의 서열 (Met-Gly-Val-Pro).
서열 번호 12 : 프라이머 EX5에 의해 코드화된 개질된 시그널 펩티드 출발물질의 서열.
서열 번호 13 : 프라이머 EX6의 서열 (Met-Ser-Val-His).
서열 번호 14 : 프라이머 EX6에 의해 코드화된 개질된 시그널 펩티드 출발물질의 서열.
서열 번호 15 : 프라이머 EX 게놈 1의 서열.
서열 번호 16 : 프라이머 EX13의 서열.
서열 번호 17 : EPO EX17의 서열.
본 발명이 기초하는 문제점은 현재 기술의 상기 기술된 단점을 최소한 부분적으로 해결하고, 사람 세포에서의 EPO의 제조를 위한 기술적으로 더 우수한 방법을 제공하는 것이다. 특히, 이것은 약제의 경제적 생성을 가능하게 하기에 충분한 양 및 질로 생성물을 수득하는 것을 가능하게 한다.
상기 문제점은 사람 세포에서의 내인성 EPO 유전자의 활성화, 및 임의적으로 활성화된 사람 EPO 유전자의 후속 증폭에 의해 해결된다. 상기 방식으로, 적합한 출발 세포, DNA 구성물 및 선택 방법의 선택에 의해, 약제 제조물의 경제적 생성이 가능해지도록 충분한 질, 양 및 순도로 EPO를 생성시킬 수 있는 사람 세포를 제공하는 것이 가능해졌다. 특히, 활성화된 내인성 EPO의 증폭 후에, 재조합 EPO의 제조를 위해 이전에 사용된 CHO 생성 세포보다 생산율이 맹백히 더 높은 세포가 수득된다.
본 발명의 하나의 주제는 사람 세포에서 활성인 이종 발현 조절 서열과 조작적으로 결합되어 있는 내인성 EPO 유전자의 복제물을 함유하고, 사전 유전자 증폭 없이 200 ng EPO/106세포/24h 이상을 생성시킬 수 있는 사람 세포이다. 바람직하게는, 본 발명에 따르는 사람 세포는 200 내지 3000 ng EPO/106세포/24h, 가장 바람직하게는 1000 내지 3000 ng EPO/106세포/24h를 생성시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 주제는 상기 규정된 세포로부터의 유전자 증폭에 의해 수득될 수 있고, 각각 사람 세포에서 활성인 이종 발현 조절 서열과 조작적으로 결합되어 있는 내인성 EPO 유전자의 수가지 복제물을 함유하고, 1,000 ng EPO/106세포/24h 이상을 생성시킬 수 있는 사람 세포이다.
특히 바람직하게는, 유전자 증폭에 의해 수득될 수 있는 사람 세포주는 1,000 내지 25,000 ng EPO/106세포/24h, 가장 바람직하게는 5,000 내지 25,000 ng EPO/106세포/24h를 생성시킬 수 있다.
사람 세포는 생체외에서 배양될 수 있다면, 어떠한 세포일 수도 있다. 혈청 비함유 매질, 및 특히 현탁액 중에서 배양될 수 있는 사람 세포가 특히 바람직하다. 상기 방식으로, EPO의 생성은 배양 용량이 예를 들어 1,000 리터인 큰 발효기에서 수행될 수 있다.
부동화된 세포, 예를 들어 HT1080 세포[Rasheed et al., Cancer 33 (1974), 1027-1033], HeLaS3 세포[Puck et al., L.Exp. Med. 103 (1956), 273-286], 나말와(Namalwa) 세포[Nadkarni et al., Cancer 23 (1969), 64-79] 또는 이들로부터 유도된 세포인 사람 세포가 특히 바람직하다.
본 발명에 따르는 세포의 일례는 도이취 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌[Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)], 마쉐로데어 베크 1베, 38124 브라운쉬바이크(Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig)에서 부다페스트 조약의 규정에 따라 1997년 7월 15일에 수탁번호 DSM ACC 2320으로 수탁된 클론 "알라딘(Aladin)"이다.
본 발명에 따르는 세포에서, 내인성 EPO 유전자는 사람 세포에서 활성인 이종 발현 조절 서열과 결합된다. 발현 조절 서열은 프로모터, 및 바람직하게는 추가의 발현 증강 서열, 예를 들어 인핸서를 포함한다. 프로모터는 조절성 또는 구조성 프로모터일 수 있다. 바람직하게는, 프로모터는 강한 바이러스 프로모터, 예를 들어 SV40 또는 CMV 프로모터이다. CMV 프로모터/인핸서가 특히 바람직하다.
또한, EPO 발현을 최적화시키기 위해, 이종 프로모터와 조작적으로 관련되어 있는 사람 세포 중의 내인성 EPO 유전자가, 천연 시그널 펩티드 코드화 서열과 상이하고, 바람직하게는 개질된 아미노산 서열을 갖는 시그널 펩티드를 코드화시키는 시그널 펩티드 코드화 서열을 갖는 것이 바람직할 수 있다. Met-X1-X2-X3(여기에서, X1은 Gly 또는 Ser이고, X2는 Ala, Val, Leu, Ile, Ser 또는 Pro이고, X3는 Pro, Arg, Cys 또는 His이며, 단, X1-X2-X3는 서열 Gly-Val-His가 아니다), 및 특히 하기 서열로부터 선택되는 첫번째 4개의 아미노산의 영역에서 개질된 시그널 펩티드 서열을 코드화시키는 시그널 펩티드 코드화 서열이 특히 바람직하다 :
(a) Met-Gly-Ala-His,
(b) Met-Ser-Ala-His,
(c) Met-Gly-Val-Pro 또는
(d) Met-Ser-Val-HIs.
특히 바람직하게는, 시그널 펩티드의 첫번째 4개의 아미노산의 서열은 Met-Ser-Ala-His이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 상기 규정된 바와 같이 사람 EPO 생성 세포를 제조하는 방법으로서,
(a) 내인성 EPO 유전자의 하나 이상의 복제물을 함유하는 사람 출발 세포를 제공하는 단계,
(b) 세포를,
(i) 상동성 재조합이 가능하도록 사람 EPO 유전자좌의 영역과 상동인 2개의 플랭킹 DNA 서열,
(ii) 포지티브 선택 마아커 유전자, 및
(iii) 사람 세포에서 활성인 이종 발현 조절 서열을 포함하는 DNA 구성물로 형질전환시키는 단계,
(c) 형질전환된 세포를 포지티브 선택 마아커 유전자가 존재함으로써 선택이 이루어지는 조건하에 배양시키는 단계,
(d) 단계(c)에 따라 선택성인 세포를 분석하는 단계, 및
(e) EPO 생성 세포를 확인하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
사람 EPO 생성 세포를 제조하는 데에 사용되는 DNA 구성물은 상동성 재조합이 가능해지도록 사람 EPO 유전자좌의 영역과 상동인 2개의 플랭킹 DNA 서열을 함유한다. 적합한 플랭킹 서열의 선택은 예를 들어, WO 90/11 354호 및 WO 91/09955호에 기술된 방법에 의해 수행된다. 바람직하게는, 플랭킹 서열은 각각 길이가 150 bp 이상이다. 특히 바람직하게는, 상동 DNA 서열은 EPO 유전자의 5'-비번역 서열, 엔손 1 및 인트론 1의 영역으로부터 선택된다. 첫번째 아미노산에서 개질된 시그널 펩티드를 코드화시키는 엑손 1의 영역에서 개질된 DNA 서열을 사용하는 것이 특히 바람직하다. 엑손 1 영역에서의 개질은 바람직하게는 상기 규정된 바와 같다.
선택 마아커 유전자는 발현시에 선택성 표현형, 예를 들어 항생물질 저항성, 영양요구 등을 유도할 수 있는 진핵 세포에 적합한 임의의 선택 마아커 유전자일 수 있다. 특히 바람직한 포지티브 선택 마아커 유전자는 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자이다.
임의적으로, HSV-티미딘 키나아제 유전자와 같은 네거티브 선택 유전자가 또한 존재할 수 있으며, 이에 의해 발현 세포는 선택 제제의 존재하에 파괴된다.
사람 세포에서 내인적으로 활성화된 EPO 유전자의 증폭이 요구되는 경우, DNA 구성물은 증폭 유전자를 함유한다. 적합한 증폭 유전자의 예로는, 디하이드로폴레이트 환원효소, 아데노신 데아미나아제, 오르니틴 데카르복실라아제 등이 있다. 특히 바람직한 증폭 유전자는 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자, 특히 선택성 제제(메토트렉세이트)에 대해 와일드형 유전자보다 감도가 낮은 디하이드로폴레이트 환원효소 아르기닌 변이체이다 [참조 : Simonsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983); 2495].
증폭 유전자가 EPO 유전자를 활성화시키는 데에 사용되는 DNA 구성물에 존재하는 경우, 본 발명의 방법은 또한,
(f) EPO를 코드화시키는 DNA 구성물을 증폭시키는 단계; 및
(g) 출발 세포와 비교하여 더 큰, 이종 발현 조절 서열과 조작적으로 결합되어 있는 성숙 EPO를 코드화하는 내인성 DNA 서열의 많은 복제물을 함유하는 EPO 생성 세포를 수득하는 단계를 포함한다.
사람 출발 세포에 존재하는 내인성 EPO 유전자의 활성화에 적합한 DNA 구성물은 실시예에 기재된 플라스미드, 즉 p187, p189, p190 및 p192 또는 이들로부터 유도된 플라스미드이다. 부다페스트 조약의 규정에 따라 1997년 7월 16일에 수탁 번호 DSM 11661로 DSMZ에 수탁된 플라스미드 p189, 또는 이로부터 유도된 플라스미드가 특히 바람직하다. 바람직하게는, DNA 구성물은 선형으로 사람 세포의 형질전환에 사용되는 원형 플라스미드 분자이다.
본 발명의 추가의 주제는
(i) 상동성 재조합이 가능해지도록 5'-비번역 서열, 엑손 1 및 인트론 1로부터 선택된 사람 EPO 유전자좌의 영역에 상동인 선택된 2개의 플랭킹 DNA 서열 (개질된 서열이 아미노산 Met-X1-X2-X3(여기에서, X1은 Gly 또는 Ser이고, X2는 Ala, Val, Leu, Ile, Ser 또는 Pro이고, X3는 Pro, Arg, Cys 또는 His이며, 단, X1-X2-X3는 서열 Gly-Val-His가 아니다), 및 특히 하기 아미노산을 코드화하는 엑손 1의 영역 중에 존재한다 :
(a) Met-Gly-Ala-His,
(b) Met-Ser-Ala-His,
(c) Met-Gly-Val-Pro 또는
(d) Met-Ser-Val-HIs),
(ii) 포지티브 선택 마아커 유전자,
(iii) 사람 세포에서 활성인 이종 발현 조절 서열 및
(iv) 임의적으로 증폭 유전자를 포함하는, 사람 세포에서 내인성 EPO 유전자의 활성화를 위한 DNA 구성물이다.
본 발명의 또 다른 주제는
(i) 상동성 재조합이 가능해지도록 5'-비번역 서열, 엑손 1 및 인트론 1로부터 선택된 사람 EPO 유전자좌의 영역에 상동인 2개의 플랭킹 DNA 서열,
(ii) 포지티브 선택 마아커 유전자,
(iii) 사람 세포에서 활성인 이종 발현 조절 서열(이종 발현 조절 서열과 EPO 유전자의 번역 출발점 사이의 거리는 1100 bp 이하이다) 및
(iv) 임의적으로 증폭 유전자를 포함하는, 사람 세포에서 내인성 EPO 유전자의 활성화를 위한 DNA 구성물이다.
놀랍게도, EPO 시그널 서열의 개질 및/또는 이종 발현 조절 서열과 EPO 유전자의 출발점 사이의 거리의 단축의 경우에, 최적화된 발현이 얻어진다. 바람직하게는, 이종 발현 조절 서열의 프로모터와 EPO 유전자의 번역 출발점 사이의 거리는 1100 bp 이하, 특히 바람직하게는 150 bp 이하, 가장 바람직하게는 100 bp 이하이다. 본 발명에 따라 사용하려는 DNA 구성물의 특히 바람직한 예로는 플라스미드 p189(DAM 11661) 또는 이로부터 유도된 플라스미드이다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따르는 사람 세포를 EPO의 생성이 수행되고 EPO가 배지로부터 수득되는 조건하에 적합한 배지 중에서 배양시키는, 사람 EPO를 제조하는 방법이다. 혈청 비함유 배지가 우선적으로 사용된다. 세포는 현탁액 중에서 배양되는 것이 바람직하다. 배양은 발효기, 예를 들어 용량이 10ℓ 내지 50,000ℓ인 큰 발효기에서 특히 우선적으로 수행된다.
사람 세포주의 배지로부터의 EPO의 수득은,
(a) 세포 상청액을 친화성 크로마토그래피 배지 상으로 통과시키고, EPO를 함유하는 분획을 수득하는 단계,
(b) 임의적으로, EPO 함유 분획을 소수성 상호작용 크로마토그래피 배지 상으로 통과시키고, EPO 함유 분획을 수득하는 단계,
(c) EPO 함유 분획을 히드록시 아파타이트 상으로 통과시키고, EPO 함유 분획을 수득하는 단계 및
(d) 수득된 분획을 농축시키고/시키거나 역상(RP) HPLC 배지 상으로 통과시키는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
정제 공정의 단계(a)는 일부 경우에 사전처리될 수 있는 세포 상청액을 친화성 크로마토그래피 배지 상으로 통과시키는 것을 포함한다. 바람직한 친화성 크로마토그래피 배지는 청색 염료가 커플링된 배지이다. 특히 바람직한 예는 블루 세파로오스이다.
친화성 크로마토그래피 배지로부터의 용리 후에, EPO 함유 용리물은 임의적으로 소수성 상호작용 크로마토그래피 배지 상으로 통과한다. 이러한 단계는 혈청 함량이 2%(v/v) 이상인 배지를 사용하는 경우에 편리하다. 낮은 혈청 함량(예를 들어 1%(v/v)을 갖는 배지가 사용되는 경우, 또는 혈청 비함유 배지가 사용되는 경우, 상기 단계는 생략될 수 있다. 바람직한 소수성 상호작용 크로마토그래피 배지는 부틸 세파로오스이다.
단계(a)로부터의 용리물, 또는 사용된다면, 단계(b)로부터의 용리물은 본 발명의 방법의 단계(c)에서 히드록시아파타이트 상으로 통과하고, EPO 함유 용리물은 농축 단계 및/또는 역상 HPLC 정제 단계를 거친다. 농축은 바람직하게는, 배제 크로마토그래피, 예를 들어 막투과에 의해 수행되며, 배제 크기가 10kD인 막과 같은 배지의 사용이 바람직한 것으로 입증되었다.
본 발명에 따르는 방법에 의해, 생체(규정 이세포혈증 마우스)내에서 특이 활성이 100,000 U/mg 단백질 이상인 단리된 사람 EPO가 수득될 수 있으며, 이것은 요 불순물을 함유하지 않고, 재조합 EPO로부터의 글리코실화가 CHO 세포로부터의 글리코실화와 상이하다. 바람직하게는, 본 발명의 EPO는 특이 활성이 175,000 IU/mg 단백질 이상, 특히 바람직하게는 200,000 내지 400,000 IU/mg 단백질 이상이다. 본 발명의 방법에 의해 수득될 수 있는 사람 EPO는 α-2,3- 및/또는 α-2,6 결합 시알산 잔기이다. 본 발명의 예비 결과를 기초로, 내인적으로 활성화된 EPO 유전자를 함유하는 세포로부터의 EPO의 연구에서, α-2,3- 및/또는 α-2,6 결합 시알산 잔기의 존재가 밝혀졌다. 또한, 본 발명의 예비 결과를 기초로, 본 발명의 사람 EPO가 N-아세틸 뉴라민산의 함량을 기준으로 하여 0.2% 미만의 N-글리콜 뉴라민산의 함량을 가짐이 밝혀졌다.
본 발명의 사람 EPO의 순도는 바람직하게는 전체 단백질 함량의 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상이다. 전체 단백질 함량의 측정은 역상 HPLC에 의해, 에를 들어 포로스(Poros) R/2H 칼럼을 사용하여 수행될 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에 의해, 아미노산 서열이 상이한 사람 EPO 종이 수득될 수 있다. 따라서, 질량 분광 분석(MALDI-MS)에 의해, 사람 EPO가 HeLaS3 세포로부터 단리될 수 있으며, 이것은 주로 165개 아미노산의 길이를 갖는 폴리펩티드이고, 아르기닌 잔기의 C-말단 처리에 의해 생성될 수 있으며, 일부 경우에는, 166개 아미노산을 갖는 EPO의 15% 이하를 포함하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 166개 아미노산의 길이를 갖는 폴리펩티드를 포함하는 사람 EPO, 즉 비처리 EPO가 수득될 수 있다. 예를 들어, 나말와 세포로부터, 165개 및 166개 아미노산의 길이를 갖는 폴리펩티드의 혼합물을 포함하는 사람 EPO가 단리된다.
상기 사람 EPO는 추가의 활성 성분, 및 약제학적으로 통상적인 보조제, 비히클 및 첨가제를 함유할 수 있는 약제 제조물에 대한 활성 성분으로서 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 아미노산 Met-X1-X2-X3(여기에서, X1은 Gly 또는 Ser이고, X2는 Ala, Val, Leu, Ile, Ser 또는 Pro이고, X3는 Pro, Arg, Cys 또는 His이며, 단, X1-X2-X3는 서열 Gly-Val-His가 아니다), 및 특히 하기 아미노산으로부터 선택되는 시그널 펩티드의 첫번째 4개의 아미노산의 영역에서 개질된 서열을 갖는 사람 EPO를 코드화하는 단리된 DNA에 관한 것이다 :
(a) Met-Gly-Ala-His,
(b) Met-Ser-Ala-His,
(c) Met-Gly-Val-Pro 또는
(d) Met-Ser-Val-HIs),
DNA는 예를 들어 게놈 DNA 또는 cDNA일 수 있다.
본 발명은 하기의 실시예, 도면 및 서열표에 의해 계속 설명될 것이다.
대규모로 단백질을 생성시키기 위한 EPO 유전자좌의 활성화를 선택용 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제(NEO) 유전자 (G-418 저항성), 쥐과동물 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 유전자 (MTX에 의한 유전자 증폭용) 및 유전자 활성화용의 시토메갈로바이러스(CMV) 중간 초기 프로모터 및 인핸서를 함유하는 유전자 활성화 서열의 상동성 통합에 의해 달성하였다.
실시예 1 : EPO 상동 영역의 클로닝
EPO 유전자의 상동 영역을 게놈 태반 DNA(뵈링거 만하임)를 사용하여 증폭시켰다. 2개의 PCR 생성물을 EPO 유전자의 5'-비번역 서열, 엑손 1 및 인트론의 영역으로부터 6.3kB 거리의 상동 영역으로부터 제조하였다 (도 1 참조). PCR 생성물 1의 제조에 사용되는 프라이머는 서열 5'-CGC GGC GGA TCC CAG GGA GCT GGG TTG ACC GG-3' (서열 번호 1) 및 5'-GGC CGC GAA TTC TCC GCG CCT GGC CGG GGT CCC TCA GC-3' (서열 번호 2)을 갖는다. PCR 생성물 2의 제조에 사용되는 프라이머는 서열 5'-CGC GGC GGA TCC TCT CCT CCC TCC CAA GCT GCA ATC-3' (서열 번호 3) 및 5'-GGC CGC GAA TTC TAG AAC AGA TAG CCA GGC TGA GAG-3' (서열 번호 4)을 갖는다.
원하는 절편을 제한 절단에 의해 PCR 생성물 1 및 2로부터 절단하고(PCR 생물 1 : HindIII, PCR 생성물 2 : HindIII 및 Eco RV), HindIII 및 Eco RV에 의해 절단한 벡터 pCRII(인비트로겐) 내로 클로닝시켰다. 이러한 방식으로 수득된 재조합 벡터를 5epopcr로 명명하였다 (도 2 참조).
실시예 2 : EPO 유전자 표적화 벡터의 구성
2.1 NEO 유전자, DHFR 유전자 및 CMV 프로모터/인핸서를 함유하는 유전자 활성화 서열(도 3 참조)을 EPO 상동 영역을 함유하는 플라스미드 5epocr 1000의 AgeI 자리 내에 삽입하고, 플라스미드 p176을 수득하였다 (도 4a 참조). CMV 프로모터를 EPO 유전자의 번역 출발 자리에 가능한 한 근접시키도록, 963 bp 길이의 절편을 제한 자리 AscI와 AgeI 사이에서 결실시켰으며(부분 절단), 이 때 플라스미드 p179를 수득하였다 (도 4b).
2.2 발현을 최적화시키기 위해, EPO 리더 서열 Met-Gly-Val-His의 앞부분을 코드화시키는 엑손 1 내의 누클레오티드를 합성 서열 Met-Ser-Ala-His로 치환시켰다 (실시예 6 참조). 상기 서열은 프라이머 EX4(서열 번호 9) 및 EX17(서열 번호 17)을 갖는 템플레이트로서 SV40[Jacobs et al., Nature 313 (1985), 806 and Lee-Huang et al., Gene 128 (1993), 227]의 조절하에 사람 EPO 유전자 서열의 3,5 kB BstEII/EcoRI 단편(엑손 1-5 포함)을 함유하는 게놈 EPO-DNA 서열, 예를 들어 플라스미드 pEPO148의 증폭에 의해 수득하였다 (표 1). 플라스미드 p187이 수득되었다 (도 4b).
2.3 플라스미드 p189를 Psvtk-1(PvuII/NarI 단편)으로부터 기원하는 단순포진 바이러스 티미딘키나아제 유전자(HSV-TK)의 삽입에 의해 플라스미드 p187로부터 제조하였다 (도 4c). HSV-TK 유전자는 CMV 프로모터에 대해 반대 배향으로 있는 인트론 1(EcoRV/ClaI)의 3' 말단에서 SV40 프로모터의 조절하에 있고, 상동성 재조합을 위한 네거티브 선택용으로 작용해야 한다.
2.4 플라스미드 p190의 구성을 위해, 지몬젠(Simonsen) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci, USA 80 (1983), 2495]에 기술된 DHFR의 아르기닌 변이체의 cDNA를 함유하는 플라스미드인 pHEAVY의 SfiI/BglII 단편을, RSV 프로모터 및 종단제로서의 후기 SV40 폴리아데닐화 자리의 조절하에 있는 NEO 유전자, 초기 SV40 프로모터 및 종단제로서의 초기 SV40 폴리아데닐화 자리의 조절하에 있는 쥐과동물 DHFR 유전자[Kaufmann et al., Mol. Cell. Biol. 2 (1982), 1304; Okayama et al., Mol. Cell. Biol. 3 (1983), 280, and Schimke, J. Biol. Chem. 263 (1988), 5989] 및 CMV 프로모터[Boshart et al., Cell 41 (1995) 521]함유하는, SfiI 및 BglII로 절단시킨 플라스미드 pGenak-1 내로 서브클로닝시켰다. 그 다음, DHFR 아르기닌 변이체를 코드화하는 cDNA를 함유하는 HpaI 단편을 HpaI로 절단시킨 플라스미드 p189 내로 결찰시켰으며, 이 때 플라스미드 p190이 수득되었다 (도 4d).
2.5 HSV-TK 유전자 없이 형질전환 벡터를 얻기 위해, 유전자 활성화 서열을 함유하는 플라스미드 p190의 AscI/NheI 단편인 HSV-TK 유전자를 엑손 1을 함유하는플라스미드의 AscI/NheI 단편 내로 결찰시켰다. 생성된 플라스미드를 p192로 명명하였다 (도 4e).
실시예 3 : 세포의 형질전환
바이러스 세포를 EPO의 생성을 위해 선택하고, 표적화 벡터에 의해 형질전환시켰다.
3.1 나말와 세포
세포를 T150 조직 배양병 내에서 배양시키고, 전기영동에 의해 형질전환시켰다 (1x107세포/800㎕의 전기영동 완충액 10 mM Hepes, 138 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.7 mM Na2HPO4, 6 mM D-글루코오스 1수화물 pH 7.0, 10㎍의 선형화된 DNA, 960 ㎌, 260 V 바이오래드 유전자 펄서). 전기영동 후, 세포를 RPMI 1640, 10%(v/v) 소 태아 혈청(FCS), 2 mM L-글루타민, 1 mM 피루브산 나트륨 중에서, 46개의 96-웰 플레이트에서 배양시켰다. 2일 후에, 세포를 10 내지 20일 동안 G-148을 함유하는 배지 1㎎/㎖ 중에서 배양시켰다. 상청액을 EPO의 생성에 대해 고체상 ELISA로 시험하였다 (실시예 4 참조). EPO 생성 클론을 24-웰 플레이트 및 T-25 조직 배양병에서 팽창시켰다. 분취량을 동결시키고, 세포를 FACS에 의해 서브클로닝시켰다 (참조 : Ventage, Becton Dickinson). 서브클론을 EPO 생성에 대해 반복적으로 시험하였다.
3.2 HT 1080 세포
HT1080 세포를 DMEM, 10%(v/v) FCS, 2 mM L-글루타민, 1 mM 피부르산 나트륨 중에서 배양시키는 것을 제외하고는, 조건은 나말와 세포에 대해 기술된 바와 같다. 전기영동에 의한 형질전환을 위해, 세포를 배양 용기의 벽으로부터 트립신 처리에 의해 방출시켰다. 전기영동 후에, 1x107개의 세포를 DMEM, 10%(v/v) FCS, 2 mM L-글루타민, 1 mM 피부르산 나트륨 중에서 배양시켰다.
3.3 HeLa S3 세포
HeLa 세포를 RPM 1640, 10%(v/v) FCS, 2 mM L-글루타민, 1%(v/v) MEM 비필수 아미노산(Sigma) 및 1 mM 피부르산 나트륨 중에서 배양시키는 것을 제외하고는, 조건은 나말와 세포에 대해 기술된 바와 같다. 전기영동에 의한 형질전환을 위해, 세포를 배양 용기의 벽으로부터 트립신 처리에 의해 방출시켰다. 전기영동에 대한 조건은 960㎌/250 V이다. 전기영동 후에, 세포를 RPM 1640, 10%(v/v) FCS, 2 mM L-글루타민, 1%(v/v) MEM 및 1 mM 피부르산 나트륨 중에서, T75 조직 배양병 에서 배양시켰다. 전기영동 24시간 후에, 세포를 트립신 처리하고, 10 내지 15일 동안 10개의 96-웰 플레이트 중에서 600㎍/ml의 G-418을 함유하는 배지 중에서 배양시켰다.
실시예 4 : EPO 생성 클론에 대한 선택
형질전환된 세포의 배양 상청액을 EPO ELISA로 시험하였다. 모든 단계를 실온에서 수행하였다. 스트렙트아비딘으로 사전에 피복시킨 96-웰 플레이트를 비오틴일화된 항-EPO 항체로 피복시켰다 (뵈링거 만하임). 피복을 위해, 플레이트를 머저 50 mM 인산 나트륨(pH 7.2) 및 0.05%(v/v) 트윈 20으로 세척하였다. 그 다음, 웰 1개당 0.01 ml의 피복 완충액(4㎍의 비오틴일화된 항체, 10 mM의 인산 나트륨(pH 7.2), 3 g/l의 소혈청 알부민, 20 g/l의 사카로오스), 및 9 g/l의 NaCl을 첨가하고, 실온에서 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음, 플레이트를 50 mM 인산 나트륨(pH 7.2)로 세척하고, 건조시키고, 밀봉시켰다.
시험 전에, 플레이트를 0.3 ml의 인산염 완충된 염 용액(PBS) 및 0.05% 트윈 20(Sigma)으로 3회 세척한 후, 플레이트를 웰 1개당 0.2 ml PBS 및 1%(w/v) 크로테인(뵈링거 만하임)과 밤새 인큐베이션시켜서, 비특이 결합을 블록킹시켰다.
블록킹 용액을 제거한 후, 0.1 ml의 배양 상청액을 첨가하고, 플레이트를 밤새 인큐베이션시켰다. 각각의 웰을 매회 0.3 ml의 PBS 및 0.05% 트윈 20으로 3회 세척하였다. 그 다음, 100㎕의 퍼옥시다아제(POD) 콘쥬게이트된 단클론성 항체(뵈링거 만하임, 150 mU/ml)를 2시간 동안 첨가하였다. 웰을 다시 매회 0.3 ml의 (PBS) 및 0.05% 트윈 20으로 3회 세척하였다. 그 다음, 퍼옥시다아제 반응을 405 nm에서 퍼어킨 엘머 광도계에서 기판으로서 ABTS(등록상표)을 사용하여 수행하였다. CHO 세포로부터의 재조합 EPO(뵈링거 만하임, 100-1000 pg/웰)을 사용하는 표준 보정 곡선을 사용하여 EPO 농도를 보정하였다.
실시예 5 : EPO 유전자 증폭
EPO 발현을 증가시키기 위해, EPO 생성 클론을 증가 농도(100 pM - 1000 nM)의 메토트렉세이트(MTX)의 존재하에 배양시켰다. 클론을 EPO 생성에 대해 각각의 MTX 농도에서 ELISA(실시예 4 참조)에 의해 시험하였다. 강한 생성자를 제한된 희석에 의해 서브클로닝시켰다.
실시예 6 : 시그널 서열 변이체
EPO 분자의 리더 서열을 최적화시키기 위해, 엑손 1에 의해 코드화된 제 1 아미노산을 대체시켰다. 여러 서열을 갖는 프라이머(서열 번호 4-17; 개질된 서열의 선택을 위한 CelII 자리를 함유하는 3' 프라이머)를 사용하여, SV40 프로모터의 조절하에 사람 EPO 유전자 서열의 4 kb HindIII/EcoRI 단편(엑손 1-5 포함)을 함유하는 플라스미드 pEPO227을 사용하는 PCR에 의해 AscI/XbaI 단편을 템플레이트로서 수득하였다 [참조 : Jacobs et al., Nature 313 (1985), 806; Lee-Huang et al., Gene 128 (1993), 227]. 생성된 단편을 플라스미드 pEPO148 내로 클로닝시키고(실시예 2.2), 플라스미드 pEPO 182, 183, 184 및 185를 수득하였다 (도 5). EPO 유전자 발현을 SV40 프로모터에 의해 유도하였다. COS-7 세포를 구성물로 일시적으로 형질전환시키고(DEAE 덱스트란 방법), 세포를 형질전환 48시간 후에 EPO 생성에 대해 시험하였다.
가장 우수한 EPO 발현으로 상기 방식으로 수득된 변이된 리더 서열 Met-Ser-Ala-His를 유전자 표적화 벡터를 구성하기 위해 사용하였다 (실시예 2.2 참조).
실시예 7 : EPO 생성 세포주의 특징화
세개의 상이한 세포주(나말와, HeLa S3 및 HT1080)를 EPO 유전자 활성화를 위해 선택하였다. EPO 생성 클론을 플라스미드 p179, p187, p189, p190 또는 p192에 의해 형질전환시킴으로써 수득하였다 (실시예 2 및 3 참조).
약 160,000개의 NEO 저항성 클론을 EPO 생성에 대해 시험하였으며, 이 중 12개 내지 15개는 상당한 수율로 세포 상청액 내로 재생적으로 EPO를 분비하였다.
이들 중에서 총 7개의 EPO 클론은 놀랍게도, 대량 생성을 위해 충분한 양으로 MTX,EPO에 의해 유전자 증폭 없이 생성되는 것으로 확인되었다. 이들 클론의 EPO 생성율은 200 ng/ml/106세포/24h 내지 100 ng/ml/106세포/24h이었다. 하나의 이러한 세포의 일례는 나말와 세포로부터 수득되는, DSMZ에 수탁 번호 DSM ACC 2320으로 기탁된 클론 "알라딘"이다.
500 nM의 MTX에 의한 유전자 증폭 후에, 확인된 EPO 클론의 EPO 생성율은 3000 ng/ml/106세포/24h보다 높게 증가하였다. 1000 nM까지의 MTX 농도의 추가의 증가는 생성율을 7000 ng/ml/106세포/24h보다 높게 유도하였다.
수득된 클론은 혈청 비함유 배양 조건하에 EPO 생성을 나타내었다.
실시예 8 : EPO 생성 클론의 게놈의 특징화
8.1 사람 게놈 DNA를 약 108개 세포로부터 단리시키고 정량화시켰다 [참조 : Sambrook et al., 1989]. 게놈 DNA를 제한 효소, 예를 들어 AgeI 및 AscI, 또는 BamHI, HindIII 및 SalI로 각각 절단시킨 후에, DNA 단편을 아가로오스 겔 전기영동에 의해 크기에 따라 분리하고, 최종적으로 나일론막으로 운반하고, 부동화시켰다.
부동화된 DNA를 디콕시게닌 표지화 EPO 프로브 또는 유전자 활성화 서열 특이적 DNA 프로브(DIG DNA Labeling Kit, 뵈링거 만하임)과 혼성시키고, 엄격한 조건하에 세척하였다. 특이적 혼성화 시그널을 방사선 민감성 필름을 사용하는 화학발광 방법에 의해 검출하였다.
8.2 결과
500 nM의 MTX에 의한 세포의 처리는 EPO 자리에서 5 내지 10의 팩터까지 혼성화 시그널을 증가시켰다. 1000 nM MTX까지의 추가의 증가시에, 10보다 큰 팩터까지의 증가가 얻어졌다 (도 6a).
EPO 특이적 프로브와의 혼성화의 경우에, 상동성 재조합에 의해 영향받지 않는 염색체 7의 복제물이 또한 검출되었다. 도 6b에서 알 수 있는 바와 같이, 이들 혼성화된 DNA 단편은 상이하고 명백히 구별되는 크기를 갖고, MTX의 사용에 의해 시그널 강도는 변하지 않았다.
실시예 9 : 사람 세포주(HeLa S3; 나말와 및 HT1080)의 배양 상청액으로부터의 EPO의 정제
사람 세포주의 세포 배양 상청액으로부터의 EPO의 정제를 위해서는, 기본적으로 2가지 방법이 사용되는데, 이들 방법은 크로마토그래피 단계의 수 및 원리가 상이하고, 배지의 조성 및 EPO 농도에 의존하여 사용된다.
방법 1 : 1단계 : 블루 세파로오스 칼럼
2단계 : 부틸 세파로오스 칼럼
3단계 : 히드록시아파타이트 칼럼
4단계 : 재농축.
방법 2 : 1단계 : 블루 세파로오스 칼럼
2단계 : 히드록시아파타이트 칼럼
3단계 : 재농축 (교호적 3단계 : RP-HPLC).
방법 1에 의한 2%(v/v) 소 태아 혈청(FCS)을 갖는 HeLaS3 세포 배양 상청액의 정제의 실시예 :
1. 블루 세파로오스 칼럼 :
5 ml 하이-트랩-블루(Hi-Trap-Blue) 칼럼(파마시아의 블루 세파로오스 기존 칼럼)을 5 칼럼-체적(SV) 이상의 완충액 A(20 mM Tris-HCl, pH 7.0; 5 mM CaCl2; 100 mM NaCl)과 평형화시켰다. 그 다음, 70 ml의 HeLa 세포 상청액(약 245㎍ EPO 및 70-100 mg의 총단백질을 함유함)을 순환 방법에 의해 0.5 ml/분의 유속으로 밤새 배출시켰다.
칼럼을 0.5 ml/분으로, 5 SV 이상의 완충액 B(20 mM Tris-HCl, pH 7.0; 5 mM CaCl2; 250 mM NaCl) 및 5 SV 이상의 완충액 C(20 mM Tris-HCl, pH 7.0; 0.2 mM CaCl2; 250 mM NaCl)로 세척하였다. 연속적인 세척 후에, OC280에서 단백질 함량을 측정하였다.
EPO의 용리를 0.5 ml/분의 유속으로 완충액 D(100 mM Tris-HCl, pH 7.0; 0.2 mM CaCl2; 2 M NaCl)로 수행하였다. 용리 용액을 1-2 ml 분획으로 수집하였다.
분획, 세척 용액 및 흐름 중의 EPO 함량을 POROS R2/H 칼럼(뵈링거 만하임)에 분취량을 도포시킴으로써 역상 (RP)-HPLC에 의해 측정하였다. 대안적으로, 면역학적 도트 블롯을 EPO를 함유하는 분획의 정성적 확인에 대해 수행하였다.
EPO(8-12 ml)를 함유하는 분획을 푸울링시키고, 부틸 세파로오스 칼럼에 도포하였다.
블루 세파로오스 칼럼 후의 수율은 약 175㎍ EPO(약 70%에 상응함)이었다. 일반적으로, 블루 세파로오스 후의 수율은 50 내지 75%이다.
2. 부틸 세파로오스 칼럼 (소수성 상호작용 크로마토그래피)
자체 제조된 2-3 ml 부틸 세파로오스 칼럼[재료 : 토요퍼얼 부틸(Tpyopearl Butyl) S650]을 5 SV 이상의 완충액 D(100 mM Tris-HCl, pH 7.0; 2 mM CaCl2; 2 M NaCl)와 평형시킨 후, 상기 1로부터의 EPO(약 150㎍의 EPO)를 함유하는 블루 세파로오스 푸울을 0.5 ml/분의 유속으로 배출시켰다.
칼럼을 0.5 ml/분으로 5 SV 이상의 완충액 E(20 mM Tris-HCl, pH 7.0; 2 M NaCl 및 10% 이소프로판올)로 세척하였다. 연속 세척 후에, OD280에서 단백질 함량을 측정하였다.
EPO의 용리를 0.5 ml/분의 유속으로 완충액 F(20 mM Tris-HCl, pH 7.0; 2 M NaCl 및 20% 이소프로판올)로 수행하였다. 용리 용액을 1-2 ml 분획으로 수집하였다.
분획, 세척 용액 및 흐름 중의 EPO 함량을 POROS R2/H 칼럼에 분취량을 도포시킴으로써 RP-HPLC에 의해 측정하였다. 대안적으로, 면역학적 도트 블롯을 EPO 함유 분획의 정성적 확인을 위해 수행하였다.
EPO(10-15 ml)를 함유하는 분획을 푸울링시키고, 히드록시아파타이트 칼럼에 도포하였다.
부틸 세파로오스 칼럼의 수율은 약 130㎍ EPO(약 85%에 상응함)이었다. 일반적으로, 부틸 세파로오스의 수율은 블루 세파로오스 푸울로부터 유도된 양의 60 내지 85%이다.
3. 히드록시아파타이트 칼럼
5 ml 히드록시아파타이트 칼럼(바이오래드로부터의 Econo-Pac CHT II 기존 칼럼)을 5 SV 이상의 완충액 F(20 mM Tris-HCl, pH 7.0; 2 M NaCl 및 20% 이소프로판올)와 평형시킨 후, 상기 2로부터의 EPO(약 125㎍의 EPO)를 함유하는 부틸 세파로오스 푸울을 0.5 ml/분의 유속으로 배출시켰다.
칼럼을 0.5 ml/분으로 5 SV 이상의 완충액 G(20 mM Tris-HCl, pH 7.0; 2 M NaCl)로 세척하였다. 연속 세척 후에, OD280에서 단백질 함량을 측정하였다.
EPO의 용리를 0.5 ml/분의 유속으로 완충액 H(20 mM Tris-HCl, pH 7.0; 2 M NaCl)로 수행하였다. 용리 용액을 1-2 ml 분획으로 수집하였다.
분획, 세척 용액 및 흐름 중의 EPO 함량을 POROS R2/H 칼럼에 분취량을 도포시킴으로써 RP-HPLC에 의해 측정하였다.
EPO(3-6 ml)를 함유하는 분획을 푸울링시켰다. 히드록시아파타이트 칼럼의 수율은 약 80㎍ EPO(약 60%에 상응함)이었다. 일반적으로, 히드록시아파타이트 칼럼의 수율은 부틸 세파로오스 푸울로부터 유도된 양의 50 내지 65%이다.
4. 재농축
히드록시아파타이트 칼럼으로부터 푸울링된 EPO 분획의 농도를 10kD의 배제 크기를 갖는 원심 유닛(예를 들어, 필트론(Filtron)사의 Microsep)에서 0.1 내지 0.5 mg/ml으로 증가시키고, 0.01%의 Tween 20을 첨가하고, -20℃에서 분취량 중에 저장하였다.
수율 표
EPO (㎍) 수율 (%)
출발 245 100
블루 세파로오스 175 70
부틸 세파로오스 칼럼 130 53
히드록시아파타이트 칼럼 80 33
재농축 60 25
단리된 EPO의 순도는 약 90%보다 높고, 일반적으로 95%보다 높다.
EPO 수율을 증가시키기 위해, 방법 2를 또한 사용하였으며, 여기에서는 부틸 세파로오스 단계를 생략하였다. 이 방법은 특히, 1%(v/v) FCS가 첨가되거나 첨가되지 않은 세포 배양 상청액의 경우에 적용될 있으며, 거의 동일한 순도(90-95%)의 단리된 EPO를 생성시킨다. 이 방법에서, 히드록시아파타이트 칼럼에 대한 평형 완충액(완충액 F) 중의 5 mM CaCl2의 존재는 개선된 결합을 유도하고, 또는 히드록시아파타이트 단계에서 EPO의 재생성 용리 작용을 유도하였다. 따라서, 방법 2는 기본적으로 방법 1에서와 동일한 방법으로 실행되며, 하기의 완충액을 사용하였다 :
1. 블루 세파로오스 칼럼 :
평형 완충액 (완충액 A) 20 mM Tris-HCl, pH 7.0
5 mM CaCl2; 100 mM NaCl
세척 완충액 1 (완충액 B) 20 mM Tris-HCl, pH 7.0
5 mM CaCl2; 250 mM NaCl
세척 완충액 2 (완충액 C) 20 mM Tris-HCl, pH 7.0
5 mM CaCl2; 250 mM NaCl
용리 완충액 (완충액 D) 100 mM Tris-HCl, pH 7.0
5 mM CaCl2; 2 M NaCl.
2. 히드록시아파타이트 칼럼 :
평형 완충액 (완충액 F) 50 mM Tris-HCl, pH 7.0
5 mM CaCl2; 1 M NaCl
세척 완충액 (완충액 G) 10 mM Tris-HCl, pH 7.0
5 mM CaCl2; 80 mM NaCl
용리 완충액 (완충액 H) 10 mM 인산 나트륨, pH 7.0
0.5 mM CaCl2; 80 mM NaCl.
수율 표
EPO (㎍) 수율 (%)
출발 600 100
블루 세파로오스 450 75
히드록시아파타이트 칼럼 335 55
재농축 310 52
방법 1에서의 완충액 B 내지 G에 5 mM CaCl2를 첨가하면, 또한 결합이 더 양호해지고, 히드록시아파타이트 칼럼의 더 많은 규정된 용리가 유도된다.
실시예 10 : 사람 세포주로부터의 EPO의 생체내 특이 활성의 결정
적혈구 전구 세포의 증식 및 분화에 대한 EPO의 용량 관련 활성을 EPO 투여 후의 혈중 망상 적혈구의 증가를 기준으로 하여 생체내에서 측정하였다.
이를 위해, 8마리의 마우스를 상이한 분석하려는 EPO 샘플 및 EPO 표준물질(WHO의 표준 EPO에 대해 균형을 이룸)로 비경구적으로 처리하였다. 마우스를 일정하게 규정된 조건하에 유지시켰다. EPO 처리 4일 후에, 혈액을 마우스로부터 채혈하고, 망상 적혈구를 아크리딘 오렌지로 염색시켰다. 30,000개의 적혈구에 대한 망상 적혈구의 수의 측정을 적색 형광 히스토그램을 분석함으로써 세포흐름학으로 마이크로형광법에 의해 수행하였다.
평행한 직선으로 쌍을 이룬 함량 측정에 대해 린더(Linder)에 의해 설명된 방법에 의해, 다양한 용량에서 시편의 망상 적혈구의 수 및 표준물질의 망상 적혈구의 수로부터 생물학적 활성을 계산하였다 [참조 : A. Linder, Planen und Auswerten von Versuchen, 3rd ed., 1969, Birkenhaeuser Verlag Basel].
결과
세포주로부터의 EPO 특이 활성 U/mg
HeLa S3 (샘플 1) 100,000
HeLa S3 (샘플 2) 110,000

Claims (58)

  1. 사람 세포에서 활성인 이종성 프로모터와 조작적으로 결합되어 있는 내인성 EPO 유전자의 복제물을 함유하고, 200 ng EPO/106세포/24h 이상을 생성시킬 수 있는 사람 세포.
  2. 200-3,000 ng EPO/106세포/24h를 생성시킬 수 있는 사람 세포.
  3. 각각 사람 세포에서 활성인 이종성 프로모터와 조작적으로 결합되어 있는 내인성 EPO 유전자의 수개의 복제물을 함유하고, 1,000 ng EPO/106세포/24h 이상을 생성시킬 수 있는, 제1항 또는 제2항에 따르는 세포로부터 유전자 증폭에 의해 수득할 수 있는 사람 세포.
  4. 제3항 에 있어서, 1,000-25,000 ng EPO/106세포/24h를 생성시킬 수 있는 사람 세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 부동화된 세포인 사람 세포.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 혈청 비함유 배지 중에서 배양될 수 있는 사람 세포.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, HT1080 세포, HeLa S3 세포, 나말와 세포, 또는 이들로부터 유도된 세포로부터 선택되는 사람 세포.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화된 내인성 EPO 유전자가 바이러스 프로모터, 특히 CMV 프로모터의 조절하에 있는 사람 세포.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, EPO 유전자가 천연 시그널 펩티드 코드화 서열과는 상이한 시그널 펩티드 코드화 서열을 갖는 사람 세포.
  10. 제9항에 있어서, 이종 발현 조절 서열과 조작적으로 결합되어 있는 EPO 유전자가 Met-X1-X2-X3(여기에서, X1은 Gly 또는 Ser이고, X2는 Ala, Val, Leu, Ile, Ser 또는 Pro이고, X3는 Pro, Arg, Cys 또는 His이며, 단, X1-X2-X3는 서열 Gly-Val-His가 아니다)으로부터 선택되는 첫번째 4개의 아미노산의 영역에서 개질된 시그널 펩티드 서열을 코드화하는 단일 펩티드 코드화 서열을 갖는 사람 세포.
  11. 제10항에 있어서, 첫번째 4개의 아미노산이 하기 아미노산으로부터 선택되는 사람 세포 :
    (a) Met-Gly-Ala-His,
    (b) Met-Ser-Ala-His,
    (c) Met-Gly-Val-Pro 또는
    (d) Met-Ser-Val-HIs.
  12. 제11항에 있어서, 시그널 펩티드의 첫번째 4개의 아미노산의 서열이 Met-Ser-Ala-His인 사람 세포.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따르는 사람 EPO 생성 세포를 제조하는 방법으로서,
    (a) 내인성 EPO 유전자의 하나 이상의 복제물을 함유하는 사람 출발 세포를 제공하는 단계,
    (b) 세포를,
    (i) 상동성 재조합이 가능하도록 사람 EPO 유전자좌의 영역과 상동인 2개의 플랭킹 DNA 서열,
    (ii) 포지티브 선택 마아커 유전자, 및
    (iii) 사람 세포에서 활성인 이종 발현 조절 서열을 포함하는 DNA 구성물로 형질전환시키는 단계,
    (c) 형질전환된 세포를 포지티브 선택 마아커 유전자가 존재함으로써 선택이 이루어지는 조건하에 배양시키는 단계,
    (d) 단계(c)에 따라 선택성인 세포를 분석하는 단계, 및
    (e) EPO 생성 세포를 확인하는 단계를 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상동성 DNA 서열이 EPO 유전자의 5'-비번역 서열, 엑손 1 및 인트론 1의 영역으로부터 선택되는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 엑손 1의 영역에서 개질된 서열이 사용되는 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 선택 마아커 유전자로서 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자가 사용되는 방법.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 구성물이 증폭 유전자를 추가로 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 증폭 유전자로서 디하이드로폴레이트 환원효소가 사용되는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 증폭 유전자로서 디하이드로폴레이트 환원효소 아르기닌 변이체의 유전자가 사용되는 방법.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    (f) EPO 유전자를 증폭시키는 단계; 및
    (g) 각각 이종 발현 조절 서열과 조작적으로 결합되어 있는 내인성 EPO 유전자의 수개의 복제물을 함유하는 EPO 생성 세포를 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  21. 제13항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 조절 서열로서 CMV 프로모터/인핸서가 사용되는 방법.
  22. 제13항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스미드 p189(DSM 11661) 또는 이로부터 유도된 플라스미드가 DNA로서 선형 형태로 사용되는 방법.
  23. 사람 세포에서 내인성 EPO 유전자를 활성화시키는 데에 사용되는 DNA 구성물로서,
    (i) 상동성 재조합이 가능해지도록 5'-비번역 서열, 엑손 1 및 인트론 1로부터 선택된 사람 EPO 유전자좌의 영역에 상동인 선택된 2개의 플랭킹 DNA 서열 (개질된 서열이 아미노산 Met-X1-X2-X3(여기에서, X1은 Gly 또는 Ser이고, X2는 Ala, Val, Leu, Ile, Ser 또는 Pro이고, X3는 Pro, Arg, Cys 또는 His이며, 단, X1-X2-X3는 서열 Gly-Val-His가 아니다)을 코드화하는 엑손 1의 영역 중에 존재한다),
    (ii) 포지티브 선택 마아커 유전자,
    (iii) 사람 세포에서 활성인 이종 발현 조절 서열 및
    (iv) 원하는 경우, 증폭 유전자를 포함하는 DNA 구성물.
  24. 제23항에 있어서, 아미노산이 하기 아미노산으로부터 선택되는 DNA 구성물 :
    (a) Met-Gly-Ala-His,
    (b) Met-Ser-Ala-His,
    (c) Met-Gly-Val-Pro 또는
    (d) Met-Ser-Val-HIs.
  25. 사람 세포에서 내인성 EPO 유전자를 활성화시키는 데에 사용되는 DNA 구성물로서,
    (i) 상동성 재조합이 가능해지도록 5'-비번역 서열, 엑손 1 및인트론 1로부터 선택된 사람 EPO 유전자좌의 영역에 상동인 2개의 플랭킹 DNA 서열,
    (ii) 포지티브 선택 마아커 유전자,
    (iii) 사람 세포에서 활성인 이종 발현 조절 서열(이종 발현 조절 서열과 EPO 유전자의 번역 출발점 사이의 거리는 1100 bp 이하이다) 및
    (iv) 원하는 경우, 증폭 유전자를 포함하는 DNA 구성물.
  26. 플라스미드 p189 또는 이로부터 유도된 플라스미드.
  27. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따르는 사람 세포를 EPO의 생성이 일어나는 조건하에 적합한 배지 중에서 배양시키고, 배지로부터 EPO를 수득함으로써, 사람 EPO를 제조하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 혈청 비함유 배지가 사용되는 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 세포가 현탁액 중에서 배양되는 방법.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 배양이 발효기에서 수행되는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 발효기의 부피가 10 내지 50,000ℓ인 방법.
  32. 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 배지로부터 EPO를 수득하는 것이,
    (a) 세포 상청액을 친화성 크로마토그래피 배지 상으로 통과시키고, EPO를 함유하는 분획을 수득하는 단계,
    (b) 원하는 경우, EPO를 함유하는 분획을 소수성 상호작용 크로마토그래피 배지 상으로 통과시키고, EPO 함유 분획을 수득하는 단계,
    (c) EPO 함유 분획을 히드록시아파타이트 상으로 통과시키고, EPO 함유 분획을 수득하는 단계 및
    (d) 수득된 분획을 농축시키고/시키거나 역상 HPLC 배지 상으로 통과시키는 단계를 포함하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 단계(a)에서 부틸 세파로오스 배지가 사용되는 방법.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 단계(b)에서 부틸 세파로오스 배지가 사용되는 방법.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 농축이 배제 크로마토그래피에 의해 수행되는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 배제 크기가 10kD인 배지가 사용되는 방법.
  37. 제27항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 순도가 90% 이상인 사람 EPO가 수득되는 방법.
  38. 제27항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 생체(규정 이세포혈증 마우스)내에서의 특이 활성이 100,000 IU/mg 이상인 사람 EPO가 수득되는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 생체(규정 이세포혈증 마우스)내에서의 특이 활성이 175,000 IU/mg 내지 450,000 IU/mg인 사람 EPO가 수득되는 방법.
  40. 제27항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, N-아세틸 뉴라민산의 함량에 대해 0.2% 미만의 N-글리콜뉴라민산의 함량을 갖는 사람 사람 EPO가 수득되는 방법.
  41. 제27항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, α-2,3-결합 시알산 잔기를 갖는 사람 EPO가 수득되는 방법.
  42. 제27항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, α-2,3- 및 α-2,6-결합 시알산 잔기를 갖는 사람 EPO가 수득되는 방법.
  43. 제27항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 165개 아미노산의 길이를 갖는 폴리펩티드를 포함하는 사람 EPO가 수득되는 방법.
  44. 제27항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 166개 아미노산의 길이를 갖는 폴리펩티드를 포함하는 사람 EPO가 수득되는 방법.
  45. 제27항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 165개 및 166개 아미노산의 길이를 갖는 폴리펩티드의 혼합물을 포함하는 사람 EPO가 수득되는 방법.
  46. 제27항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따르는 방법에 의해 수득되며, 요 불순물을 함유하지 않는, 생체내 특이 활성이 100,000 U/mg 단백질인 단리된 사람 EPO.
  47. 제46항에 있어서, 순도가 90% 이상인 단리된 사람 EPO.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, N-아세틸 뉴라민산의 함량에 대해 0.2% 미만의 N-글리콜뉴라민산의 함량을 갖는 단리된 사람 EPO.
  49. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, α-2,3-결합 시알산 잔기를 갖는 단리된 사람 EPO.
  50. 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, α-2,3- 및 α-2,6-결합 시알산 잔기를 갖는 단리된 사람 EPO.
  51. 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 165개 아미노산 잔기의 길이를 갖는 폴리펩티드를 포함하는 단리된 사람 EPO.
  52. 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 166개 아미노산 잔기의 길이를 갖는 폴리펩티드를 포함하는 단리된 사람 EPO.
  53. 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 165개 및 166개 아미노산의 길이를 갖는 폴리펩티드의 혼합물을 포함하는 단리된 사람 EPO.
  54. 활성 성분으로서 제46항 내지 제53항 중 어느 한 항에 따르는 사람 EPO를, 원하는 경우, 다른 활성 성분 및 약제학적으로 통상적인 비히클, 보조제 및 첨가제 성분과 함께 함유하는 약제 조성물.
  55. Met-X1-X2-X3(여기에서, X1은 Gly 또는 Ser이고, X2는 Ala, Val, Leu, Ile, Ser 또는 Pro이고, X3는 Pro, Arg, Cys 또는 His이며, 단, X1-X2-X3는 서열 Gly-Val-His가 아니다)로부터 선택되는 시그널 펩티드의 첫번째 4개의 아미노산의 영역에서 개질된 서열을 갖는 사람 EPO를 코드화시키는 단리된 DNA.
  56. 제55항에 있어서, 아미노산이 하기 아미노산으로부터 선택되는 단리된 DNA :
    (a) Met-Gly-Ala-His,
    (b) Met-Ser-Ala-His,
    (c) Met-Gly-Val-Pro 또는
    (d) Met-Ser-Val-HIs.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, 게놈 DNA인 단리된 DNA.
  58. 제55항 또는 제56항에 있어서, cDNA인 단리된 DNA.
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