PT986644E

PT986644E - Preparação de eritropoietina por activação genética endógena com promotores virais

Info

Publication number: PT986644E
Application number: PT98941401T
Authority: PT
Inventors: Konrad Honold; Anne Stern; Michael Brandt; Johannes Auer; Hans Koll
Original assignee: Roche Diagnostics Gmbh
Priority date: 1997-07-23
Filing date: 1998-07-22
Publication date: 2007-01-31
Also published as: US7186529B2; KR20010022107A; KR100641969B1; US6391633B1; US20030166275A1; AR016537A1; US6544748B2; US20020110913A1; CO4790181A1

Description

DESCRIÇÃO

"PREPARAÇÃO DE ERITROPOIETINA POR ACTIVAÇÃO GENÉTICA ENDÓGENA COM PROMOTORES VIRAIS" A invenção refere-se a células humanas, que graças a uma activação do gene humano endógeno da EPO têm a capacidade de produzirem EPO numa quantidade e pureza suficientes para possibilitar uma preparação económica de EPO humana sob a forma de preparado farmacêutico. Além disso, a invenção refere-se a um processo para a preparação destas células humanas produtoras de EPO, a construções de ADN para a activação do gene endógeno da EPO em células humanas bem como a processos para a produção à escala industrial de EPO em células humanas. A eritropoietina (EPO) é uma glicoproteina humana, que estimula a produção de glóbulos vermelhos sanguíneos. A EPO ocorre no plasma sanguíneo de indivíduos saudáveis apenas em concentrações muito reduzidas, de tal modo que não é possível uma disponibilidade em grandes quantidades deste modo. Os documentos EP-B-0148605 e EP-B-0205564 descrevem a preparação de EPO humana recombinante em células CHO. A EPO descrita no documento EP-B-0148605 apresenta um peso molecular mais elevado do que a EPO urinária e nenhuma glicosilação em 0. A EPO descrita no documento EP-B-0 205 564 de células CHO está entretanto disponível em grandes quantidades e sob forma pura, no entanto tem origem em células não humanas. Além disso, também a carga de produção de células CHO é frequentemente apenas relativamente limitada. 1

Além disso, é conhecida a obtenção de EPO humana a partir da urina de doentes com anemia aplástica (Miyake et al., J. Biol. Chem. 252 (1977), 5558 - 5564). Neste caso é divulgado um processo em sete passos, o qual abrange cromatografia de permuta iónica, precipitação por etanol, filtração por gel e cromatografia de adsorção. Neste caso obtem-se com um rendimento de 21% um preparado de EPO com uma actividade específica de cerca de 70.000 U/mg de proteína. Os inconvenientes deste processo e de outros processos para a obtenção de EPO urinária consistem no aprovisionamento de material de partida em quantidades suficientes e com qualidade reprodutível. Além disso, a purificação a partir de urina é difícil e mesmo um produto purificado não está isento de impurezas urinárias. O documento GB-A-2085887 descreve um processo para a preparação de células linfoblastóides humanas, que permitem preparar EPO em pequenas quantidades. A produção económica de um medicamento com estas células não é possível. O documento WO 91/06667 descreve um processo para a preparação recombinante de EPO. Neste processo é inserido, num primeiro passo processual, o gene endógeno da EPO em células de rim embrionárias primárias humanas por meio de recombinação homóloga em associação operativa com um promotor virai e o ADN é isolado a partir destas células. Num segundo passo, o ADN assim isolado é transformado em células CHO não humanas e a expressão de EPO é analisada nestas células. Não se encontra qualquer indicação de que seja possível uma produção de EPO em células humanas. 2 0 documento WO 93/09222 descreve a produção de EPO em células humanas. Neste caso, verifica- se uma produção de EPO relativamente elevada, de até 960.620 mU/106 células/24 h, em

fibroblastos humanos que foram transfectados com um vector que contém o gene completo da EPO. Estas células contêm um gene da EPO exógeno, que não se encontra no local genético da EPO correcto, de modo que são de esperar problemas no que se refere à estabilidade da linha de células. Não se encontram no documento WO 93/092222 dados sobre uma produção de EPO constitutiva. Além do mais, também não se encontram quaisquer dados se a EPO produzida pode ser obtida numa qualidade suficiente para fins farmacêuticos.

Além disso, descreve-se no documento WO 93/09222 uma activação do gene da EPO endógeno em células humanas HT1080.

Neste caso, verifica-se uma produção de EPO de apenas 2.500 mU/106 células/24 h (correspondente a cerca de 16 ng/106 células/24 h) . Uma produção tão reduzida é completamente inadequada para uma produção económica de um preparado farmacêutico.

Os documentos WO94/12650 e WO 95/31560 descrevem que uma célula humana com um gene da EPO endógeno activado por meio de um promotor virai tem capacidade, após amplificação do gene EPO endógeno, de produzir EPO numa quantidade de até cerca de 100.000 mU/106 células/24 h (correspondente a cerca de 0,6 pg/106 células/24 h). Também esta quantidade não é ainda suficiente para a produção económica de um medicamento. O objectivo de base da presente invenção consistiu deste modo em remover pelo menos parcialmente os inconvenientes do estado da técnica acima citados e proporcionar um processo 3 tecnológico melhor para a preparação de EPO em células humanas. Em especial deve poder ser obtido por este processo um produto numa quantidade e pureza suficientes, a fim de possibilitar a preparação económica para fins farmacêuticos.

Este objectivo foi atingido por meio da activação do gene da EPO endógeno em células humanas e eventualmente por meio de amplificação subsequente do gene da EPO humana activado. Deste modo, foi conseguido surpreendentemente, por meio de selecção de células de partida, construções de ADN e estratégias de selecção apropriadas, preparar células humanas que possuem a capacidade de produzir EPO numa quantidade, qualidade e pureza suficientes para permitir uma preparação economicamente conveniente de preparados farmacêuticos. Em especial após amplificação do gene da EPO endógeno activado, é possível obter células que apresentam uma carga de produção nitidamente mais elevada do que as células produtoras CHO utilizadas até agora para a preparação de EPO recombinante.

Um objecto da invenção é uma célula humana, com a condição de que a célula humana não é uma célula portadora de germens, em que a célula contém uma cópia de um gene da EPO endógeno em associação operativa com uma sequência de controlo de expressão heteróloga activa na célula humana e que possui a capacidade, sem prévia amplificação genética, de produzir pelo menos 200 ng de EPO/IO6 células/ 24 h, em que a distância entre a sequência de controlo de expressão heteróloga e o início de tradução do gene da EPO não é maior do que 1100 pb. De um modo preferido, a célula humana de acordo com a invenção possui a capacidade de produzir de 200 a 3000 ng de EPO/IO6 células /24 h e de modo especialmente preferido de produzir de 1000 a 3000 ng de EPO/IO6 células/24 h. 4

Um outro objecto da presente invenção é uma célula humana, com a condição de que esta não é uma célula portadora de germens, em que a mesma obtenível por meio de amplificação genética a partir da célula anteriormente citada e contém várias cópias de um gene da EPO endógeno, em qualquer caso, em associação operativa com uma sequência de controlo de expressão heteróloga activa na célula humana e possui a capacidade de produzir pelo menos 1.000 ng de EPO/IO6 células/24 h. De modo especialmente preferido, a linha de células humana obtenível por meio de amplificação genética possui a capacidade de produzir de 1.000 a 25.000 ng de EPO/IO6 células/24 h e de um modo muito especialmente preferido de produzir de 5.000 a 25.000 ng de EPO/IO6 células/24 h. A célula humana é uma célula qualquer, com a condição de que não é uma célula portadora de germens, presumindo-se que a mesma pode ser cultivada in vitro. São especialmente preferidas células humanas que sejam cultiváveis em meio isento de soro e especialmente em suspensão. Deste modo, a produção de EPO pode ser efectuada num fermentador de grandes dimensões com, por exemplo, 1.000 L de volume de cultura.

De um modo especialmente preferido, a célula humana é uma célula imortalizada, por exemplo uma célula HT 1080 (Rasheed et al.r Câncer 33 (1974), 1027-1033), uma célula HeLa S3 (Puck et al., J. Exp. Med. 103 (1956), 273-284), uma célula Namalwa (Nadkarni et al., Câncer 23 (1969), 64-79) ou uma célula derivada destas. Um exemplo para uma célula de acordo com a invenção é o clone "Aladino", que foi depositado em 1997.07.15 de acordo com os procedimentos do Tratado de Budapeste na Colecção Alemã de Microrganismos e de Culturas Celulares (DSMZ), 5

Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, sob a referência DSM ACC 2320.

Na célula de acordo com a invenção, o gene da EPO endógeno está associado a uma sequência de controlo de expressão heteróloga que é activa na célula humana. A sequência de controlo de expressão abrange um promotor virai forte e de um modo preferido outras sequências de melhoramento de expressão, p. ex. um intensif icador. O promotor pode ser um promotor regulável ou constitutivo. De um modo preferido, o promotor é um promotor SV40 ou CMV. De um modo especialmente preferido, é o promotor/intensificador CMV.

Além disso, pode ser preferível, para a optimização da expressão da EPO, que o gene da EPO endógeno na célula humana, que está em associação operativa com o promotor heterólogo, apresente uma sequência que codifique para um peptídeo de sinal, que seja diferente da sequência que codifica para o peptídeo de sinal natural e de um modo preferido codifique para um peptídeo de sinal com uma sequência de aminoácidos modificada. De um modo especialmente preferido, é uma sequência que codifica para um peptídeo de sinal, que codifica para uma sequência modificada de um peptídeo de sinal no domínio dos primeiros quatro aminoácidos, que é seleccionada de entre Met-Xi-X2-X3 em que Xi é Gly ou Ser, X2 é Ala, Vai, Leu, Ile, Ser ou Pro, X3 e Pro é Arg, Cys ou His, com a condição de que X2-X2-X3 não é a sequência Gly-Val-His, e em especial de entre (a) Met-Gly-Ala-His, (b) Met-Ser-Ala-His, (c) Met-Gly-Val-Pro ou 6 (d) Met-Ser-Val-His.

De um modo especialmente preferido, a sequência é os primeiros quatro aminoácidos do peptídeo de sinal Met-Ser-Ala-His.

Num outro aspecto, a presente invenção refere-se a um processo para a preparação de uma célula humana que produz EPO, como anteriormente citado, abrangendo os passos de: (a) proporcionar células de partida humanas, que contêm pelo menos uma cópia de um gene da EPO endógeno, com a condição de que as células de partida humanas não são células portadoras de germens, (b) transfecção das células com uma construção de ADN que compreende: (i) duas sequências de ADN de flanco, que são homólogas a domínios do local do gene da EPO humana, a fim de permitir uma recombinação homóloga, (ii) um gene marcador de selecção positivo e (iii) uma sequência de controlo de expressão heteróloga, que é activa na célula humana, em que a sequência de controlo de expressão heteróloga abrange um promotor virai forte e a distância entre o promotor heterólogo e o início de tradução do gene da EPO não é maior do que 1100 pb, (c) cultivar as células transfectadas sob condições nas quais tem lugar uma selecção relativamente à presença do gene marcador de selecção positivo, 7 (d) analisar as células seleccionáveis de acordo com o passo (c) e (e) identificar as células produtoras de EPO. A construção de ADN utilizada para a preparação da célula produtora de EPO humana contém duas sequências de ADN de flanco, que são homólogas a domínios do local do gene da EPO humana, a fim de possibilitar uma recombinação homóloga. A selecção de sequências de flanco apropriadas é efectuada, por exemplo, de acordo com os métodos descritos nos documentos WO 90/11354 e WO 91/09955. De um modo preferido, as sequências de flanco têm em cada caso um comprimento de pelo menos 150 pb. De um modo especialmente preferido, as sequências de ADN homólogas são seleccionadas do domínio das sequências a 5' não traduzidas, exão 1 e intrão 1 do gene da EPO. Neste caso é especialmente preferido utilizar uma sequência de ADN modificada no domínio do exão 1, que codifica para o peptídeo de sinal modificado nos primeiros aminoácidos. As modificações no domínio do exão 1 são, de um modo preferido, como anteriormente descritas. O gene marcador de selecção pode ser qualquer gene marcador de selecção apropriado para células eucarióticas, o qual, por expressão, leve a um fenótipo seleccionável, p. ex. resistência a um antibiótico, auxotrofia, etc.. Um gene marcador de selecção positivo especialmente preferido é o gene da fosfotransferase da neomicina.

Eventualmente, pode também estar presente um gene marcador de selecção negativo como possivelmente o gene da cinase de timidina HSV, por meio de cuja expressão são destruídas células na presença de um agente de selecção. 8

Quando se pretende uma amplificação do gene da EPO activado endógeno na célula humana, a construção de ADN contém um gene de amplificação. São exemplos para genes de amplificação apropriados a redutase de di-hidrofolato, a desaminase de adenosina, a descarboxilase de ornitina, etc.. Um gene de amplificação especialmente preferido é o gene da redutase de di--hidrofolato, em especial um mutante de arginina da redutase de di-hidrofolato que possui uma sensibilidade mais reduzida para o agente selectivo (metotrexato) do que o gene do tipo selvagem (Simonsen et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA 80 (1983); 2495).

Na presença de um gene de amplificação na construção de ADN utilizada para a activação do gene da EPO, o processo de acordo com a invenção pode ainda compreender os passos adicionais de: (f) amplificação da sequência de ADN que codifica para a EPO e (g) obtenção de células produtoras de EPO, que contêm um número de cópias de uma sequência de ADN endógeno, que codifica para a EPO madura aumentado em comparação com a célula de partida, em associação operativa com uma sequência de controlo de expressão heteróloga. São construções de ADN apropriadas para a activação do gene da EPO endógeno presente na célula de partida humana os plasmideos listados nos exemplos, pl87, pl89, pl90 e pl92. É especialmente preferido o plasmideo pl89, que foi depositado na DSMZ de acordo com as determinações do Tratado de Budapeste em 1997.07.16 sob a referência DSM 11661, ou um plasmideo derivado deste. As construções de ADN são de um modo preferido moléculas plasmidicas circulares, que são utilizadas para a transfecção da célula humana numa forma linearizada. 9

Um outro objecto da presente invenção é uma construção de ADN para a activação de um gene da EPO endógeno numa célula humana, que compreende: (i) duas sequências de ADN de flanco, que são homólogas a dominios do local do gene da EPO humana seleccionadas de entre sequências a 5' não traduzidas, exão 1 e intrão 1, a fim de possibilitar uma recombinação homóloga, em que no dominio do exão 1 está presente uma sequência modificada que codifica para os aminoácidos: Met-Ser-Ala-His, (ii) um gene marcador de selecção positivo, (iii) uma sequência de controlo de expressão heteróloga, que é activa numa célula humana, em que a sequência de controlo de expressão heteróloga abrange um promotor virai forte e a distância entre o promotor heterólogo e o inicio de tradução do gene da EPO não é maior do que 1100 pb, e (iv) eventualmente um gene de amplificação. É ainda um outro objecto da presente invenção uma construção de ADN para a activação de um gene da EPO endógeno numa célula humana com a condição de que a célula humana não é uma célula portadora de germens, em que a construção compreende: (i) duas sequências de ADN de flanco, que são homólogas a dominios do local do gene da EPO humana seleccionadas de sequências a 5' não traduzidas, exão 1 e intrão 1, a fim de permitir uma recombinação homóloga, (ii) um gene marcador de selecção positivo, 10 (iii) uma sequência de controlo de expressão heteróloga, que é activa numa célula humana, em que a sequência de controlo de expressão heteróloga abrange um promotor virai forte e a distância entre a sequência de controlo de expressão heteróloga e o inicio de tradução do gene da EPO não é maior do que 1100 pb, e (iv) eventualmente um gene de amplificação.

Surpreendentemente, verificou-se que com uma modificação da sequência de sinal da EPO ou/e com um encurtamento da distância entre a sequência de controlo de expressão heteróloga e o inicio de tradução do gene da EPO se obtém uma expressão optimizada. A distância entre o promotor da sequência de controlo de expressão heteróloga e o inicio de tradução do gene da EPO não é superior a 1100 pb, de um modo preferido não é superior a 150 pb e de um modo especialmente preferido não é superior a 100 pb. Um exemplo especialmente preferido para uma construção de ADN a utilizar de acordo com a invenção é o plasmídeo pl89 (DSM 11661) ou um plasmideo derivado deste.

Ainda um outro aspecto da presente invenção é um processo para a preparação de EPO humana, em que se cultiva uma célula humana de acordo com a invenção sob condições num meio apropriado, no qual tem lugar uma produção de EPO e a EPO é obtida a partir do meio de cultura. Como meio utiliza-se de um modo preferido um meio isento de soro. As células são de um modo preferido cultivadas em suspensão. De um modo especialmente preferido, a cultura é efectuada num fermentador, em especial num fermentador de grandes dimensões com um volume de, por exemplo, 10 L - 50.000 L. 11 A obtenção de EPO humana a partir do meio de cultura de linhas de células humanas abrange de um modo preferido os seguintes passos: (a) fazer passar o sobrenadante celular através de um meio de cromatografia de afinidade e recolher as fracções que contêm a EPO, (b) eventualmente fazer passar as fracções que contêm a EPO através de um meio de cromatograf ia de interacção hidrófobo e recolher as fracções que contêm a EPO, (c) fazer passar as fracções que contêm a EPO através de hidroxiapatite e recolher as fracções que contêm a EPO e (d) concentrar ou/e fazer passar através de um meio de HPLC-(RP) de fase invertida. 0 passo (a) do processo de purificação compreende fazer passar o sobrenadante celular, que eventualmente pode ser previamente tratado, através de um meio de cromatografia de afinidade. São meios de cromatografia de afinidade preferidos os em que está acoplado um corante azul. Um exemplo especialmente preferido é a Blue-Sepharose.

Após eluição do meio de cromatografia de afinidade, o eluido que contém a EPO é eventualmente feito passar através de um meio de cromatografia de interacção hidrófobo. Este passo é conveniente quando se utiliza um meio de cultura com um teor de soro > a 2% (v/v) . Na utilização de um meio de cultura com um teor de soro mais reduzido, p. ex. 1% (v/v) ou de um meio isento de soro, este passo pode ser dispensado. Um meio de cromatografia de interacção hidrófobo preferido é a butil--Sepharose. 12 0 elvato do passo (a) ou - desde que utilizado - do passo (b) é feito passar no passo (c) do processo de acordo com a invenção através de hidroxiapatite e o elvato que contém a EPO é submetido a um passo de concentração ou/ e um passo de purificação por HPLC de fase invertida. A concentração é efectuada de um modo preferido por meio de cromatografia de exclusão, p. ex. filtração por membrana, em que se verificou ser conveniente a utilização de um meio, p. ex. uma membrana com uma dimensão de exclusão de 10 kD.

Por meio do processo de acordo com a invenção, é possivel obter uma EPO humana isolada com uma actividade especifica de pelo menos 100.000 U/mg de proteina in vivo (ratinhos normocitémicos) , a qual está isenta de impurezas urinárias e se pode distinguir na sua glicosilação de EPO recombinante de células CHO. De um modo preferido, a EPO de acordo com a invenção tem uma actividade especifica de pelo menos 175.000, de um modo especialmente preferido de pelo menos 200.000 a 400.000 ou 450.000 Ul/mg de proteina. A EPO humana, obtenível por meio do processo de acordo com a invenção, pode conter resíduos de ácido siálico acoplados em cx-2,3 ou/e a-2,6. Durante investigações de EPO de células, que continham um gene da EPO endógeno activado, descobriu-se, com base nos resultados preliminares apresentados, a presença de resíduos de ácido siálico acoplados em cx-2,3 e a-2,6. Para além disso, com base nos resultados preliminares apresentados, determinou-se que a EPO humana de acordo com a invenção apresenta um teor inferior a 0,2% de ácido N-glicolneuramínico, relativamente ao teor de ácido N-acetilneuramínico. A pureza da EPO humana de acordo com a invenção perfaz, de um modo preferido, pelo menos 90%, com especial preferência pelo 13 menos 95% e de modo muito especialmente preferido pelo menos 98% relativamente ao teor total de proteina. A determinação do teor total de proteina pode ser realizada por HPLC de fase invertida, p. ex. com uma coluna Poros R/2H.

Além disso, por meio do processo de acordo com a invenção podem-se obter espécies de EPO humana que diferem quanto às suas sequências de aminoácidos. Assim, descobriu-se, por exemplo, por meio de análise por espectrometria de massa (MALDI-MS), que se pode isolar a partir de células HeLa S3 uma EPO humana que compreende principalmente um polipeptídeo com um comprimento de 165 aminoácidos, que é originado por meio de processamento C-terminal de um residuo de arginina, e compreende eventualmente até 15% de uma EPO com 166 aminoácidos. Além disso, pode-se também obter uma EPO humana que compreende um polipeptídeo com um comprimento de 166 aminoácidos, isto é, uma EPO não processada. A partir de células Namalwa foi possível isolar, por exemplo, uma EPO humana que compreende uma mistura de polipeptídeos com um comprimento de 165 e 166 aminoácidos.

Esta EPO humana pode ser empregue como substância activa para um preparado farmacêutico, que pode conter eventualmente outras substâncias activas bem como adjuvantes, veiculos e aditivos farmacêuticos habituais.

Em mais um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um ADN isolado que codifica para uma EPO humana com uma sequência modificada no domínio dos primeiros 4 aminoácidos do peptídeo de sinal Met-Ser-Ala-His. 0 ADN pode ser, por exemplo, um ADN genómico ou um ADNc. 14

Além disso, a invenção é esclarecida por meio dos exemplos e figuras e protocolos de sequências seguintes.

Estas mostram:

Figura 1: Uma representação esquemática da amplificação de regiões de homologia do gene da EPO do dominio das sequências não traduzidas a 5' , do exão 1 e do intrão 1; Figura 2. Uma representação esquemática de um plasmideo que contém regiões de homologia da EPO do dominio das sequências não traduzidas a 5' , do exão 1 e do intrão 1; Figura 3: Uma representação esquemática de uma sequência de activação genética que contém o promotor do virus do sarcoma de Rous (RSV) , o gene da fosfotransferase de neomicina (NEO) , a região de poliadenilação precoce de SV40 (SVI pA) , o promotor precoce de SV40 (SVI), o gene da redutase de di-hidrofolato (DHFR), uma outra região de poliadenilação precoce de SV40 e o Immediate-early-Promotor e intensificador do citomegalovirus (MCMV); Figura 4a: A preparação do vector de targeting genético da EPO p17 6; Figura 4b: A preparação dos vectores de targeting genético da EPO pl79 e pl87; 15

Figura 4c: A preparação do vector de targeting genético da EPO pl89 (DSM 11661) ; Figura 4d: A preparação do vector de targeting genético da EPO pl90; Figura 4e: A preparação do vector de targeting genético da EPO p192; Figura 5: Uma representação esquemática da preparação de ADNc da EPO com mutações da sequência de sinal; Figura 6a: A hibridação de ADN celular com uma sonda do dominio CMV da cassete genética representada na Fig. 3; as pistas 1 a 4 são, cada uma, com ADN de células humanas cindido por enzimas de restrição Agel e Asei; Pista 1: Célula HeLa S3 produtora de EPO amplificada com MTX 1.000 nM; Pista 2: Célula HeLa S3 produtora de EPO amplificada com MTX 500 nM; Pista 3: célula HeLa S3 produtora de EPO sem amplificação; Pista 4: célula HeLa S3 sem gene EPO activado; Pista 5: marcador de comprimento marcado com digoxigenina; a dimensão do fragmento a hibridar nas pistas 1 a 3 é de cerca de 5.200 pb e Figura 6b: A hibridação de uma sonda do dominio de codificação de EPO com ADN de células humanas; Pista 1: marcador de comprimento marcado com digoxigenina; Pistas 2 a 4: ADN de células humanas cindidas com as enzimas de restrição 16

BamHI, HindIII e Sall; Pista 2: célula HeLa S3 produtora de EPO amplificada com MTX 500 nM (comprimento da banda gerada pelo gene endógeno não activado: 3.200 pb; comprimento da cópia do gene da EPO activado por meio de targeting genético: 2.600 pb) ; Pista 3: ADN de uma célula HeLa S3 produtora de EPO não amplificada; Pista 4: ADN de uma célula de controlo HeLa S3; SEQ ID N.° 1 e N.° 2 Sequências de nucleótidos do iniciador utilizado para a preparação do produto de PCR 1 (Fig. 1); SEQ ID N.° 3 e N.° 4 Sequências do iniciador utilizado para a preparação do produto de PCR 2 (Fig. 1); SEQ ID N.° 5: SEQ ID N.° 6: SEQ ID N.° 7: SEQ ID N.° 8 : SEQ ID N.° 9: SEQ ID N.° 10: SEQ ID N.° 11:

Sequência do iniciador EPO EX1; Sequência do iniciador EX2;

Sequência do iniciador EX3 (Met-Gly-Ala-His);

Sequência do inicio do peptídeo de sinal modificado, codificado pelo iniciador EX3;

Sequência do iniciador EX4 (Met-Ser-Ala-His);

Sequência do inicio do peptídeo de sinal modificado, codificado pelo iniciador EX4;

Sequência do iniciador EX5 (Met-Gly-Val-Pro); 17 SEQ ID N.° 12:

Sequência do início do peptídeo de sinal modificado, codificado pelo iniciador EX5; SEQ ID N.° 13: Sequência do iniciador EX6 (Met-Ser-Val-His)/ SEQ ID N.° 14: Sequência do início do peptídeo de sinal modificado, codificado pelo iniciador EX6; SEQ ID N.° 15: SEQ ID N.° 16: SEQ ID N.° 17:

Sequência do iniciador EX genoma 1;

Sequência do iniciador

Sequência do iniciador EX13 e EPO EX 17.

Exemplos A activação do local genético da EPO para a produção de proteínas à escala industrial foi atingida por meio de integração homóloga de uma sequência de activação genética que contém o gene da fosfotransferase de neomicina (NEO) para a selecção (resistência a G-418), o gene da redutase de di--hidrofolato (DHFR) de murino (para amplificação genética por meio de MTX) e o Immediate-early-Promotor e intensificador do citomegalovírus (CMV) para a activação genética.

Exemplo 1 Clonagem de regiões de homologia de EPO

As regiões de homologia do gene da EPO foram amplificadas por meio de PCR, recorrendo a um ADN genómico de placenta (Boehringer Mannheim) . Nesta operação, foram preparados, a 18

partir de uma região homóloga com 6,3 kb de comprimento do dominio das sequências não traduzidas a 5' do gene da EPO, do exão 1 e do intrão 1, dois produtos de PCR (cf. Figura 1) . Os iniciadores utilizados para a preparação do produto de PCR 1 tinham as seguintes sequências: 5' -CGC GGC GGA TCC CAG GGA GCT

GGG TTG ACC GG-3' (SEQ ID N.° 1) e 5'-GGC CGC GAA TTC TCC GCG CCT GGC GGG GGT CCC TCA GC-3' (SEQ ID N.° 2). Os iniciadores

utilizados para a preparação do produto de PCR 2 tinham as seguintes sequências: 5'-CGC GGC GGA TCC TCT CCT CCC TCC CAA GCT GCA ATC-3' (SEQ ID N.° 3) e 5'-GGC CGC GAA TTC TAG AAC AGA TAG CCA GGC TGA GAG-3' (SEQ ID N.° 4). A partir dos produtos de PCR 1 e 2 recortaram-se os segmentos pretendidos por meio de clivagem de restrição (produto PCR 1: HindIII, produto PCR 2: HindIII e Eco RV) e clonaram-se no vector pCRII (Invitrogen) que foi cindido com Hind III e Eco RV. O vector recombinante obtido desta forma foi designado como SepopcrlOOO (cf. Figura 2).

Exemplo 2 Construção de vectores de targeting do gene da

EPO 2.1 Uma sequência de activação genética, que contém o gene ΝΕΟ, o gene DHFR e um promotor/intensificador CMV (cf. Fig. 3) foi inserida no local Agel do plasmideo 5epocrl000, que contém a região de homologia da EPO, obtendo-se deste modo o plasmideo pl76 (cf. Fig. 4a) . A fim de aproximar o mais possivel o promotor CMV do local de inicio da tradução do gene da EPO, eliminou-se um segmento com 963 pb de comprimento entre os locais de restrição Asei e Agel 19 (clivagem parcial), tendo-se obtido o plasmídeo pl79 (Fig. 4b) . 2.2 A fim de se atingir uma optimização da expressão, os

nucleótidos no exão 1, que codificam para o inicio da sequência lider da EPO Met-Gly-Val-His, foram substituídos pela sequência sintética Met-Ser-Ala-His (cf. também exemplo 6). Esta sequência foi obtida por amplificação de uma sequência de ADN da EPO genómico, p. ex. do plasmideo pEP0148, que contém um fragmento BstEII/EcoRI de 3,5 kb (incluindo os exões 1 - 5) da sequência genética da EPO humana sob controlo do promotor de SV40 (Jacobs et al., Nature 313 (1985), 806 e Lee-Huang et al., Gene 128 (1993), 227), como matriz com os iniciadores Ex4 (SEQ ID N.° 9) e EX17 (SEQ ID N.° 17) (Quadro 1). Nesta operação obteve-se o plasmideo pl87 (Fig. 4b). 2.3 O plasmideo pl89 foi preparado a partir do plasmideo pl87 por inserção do gene da cinase de timidina do virus de Herpes simplex (HSV-TK), o qual era originário de Psvtk-1 (fragmento PvuII/Narl) (Fig. 4c). O gene HSV-TK encontra-se sob o controlo do promotor de SV40 no terminal 3' do intrão 1 (Eco RV/Clal) na orientação oposta relativamente ao promotor de CMV e deveria servir para uma selecção negativa de uma recombinação homóloga. 2.4 Para a construção do plasmideo pl90, subclonou-se um fragmento Sfil/BglII de pHEAVY, um plasmideo que contém o ADNc de um mutante de arginina de DHFR descrito por Simonsen et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80 (1983), 2495) no plasmídeo pGenak-1 cortado com Sfil e BglII, que contém o gene NEO sob controlo do promotor de RSV e dos locais de 20 poliadenilação de SV40 tardios como terminador, o gene DHFR de murino sob controlo do promotor de SV40 precoce e os locais de poliadenilação de SV40 precoces como terminador (Kaufmann et al., Mol. Cell. Biol. 2 (1982), 1304; Okayama et al., Mol. Cell. Biol. 3 (1983), 280 e Schimke, J. Biol. Chem. 263 (1988), 5989) e o promotor de CMV (Boshart et al., Cell 41 (1995), 521). Em seguida, ligou-se um fragmento Hpal que continha o ADNc que codifica para o mutante de arginina de DHFR, ao plasmideo pl89 cortado com Hpal, tendo-se obtido o plasmideo pl90 (Fig. 4d). 2.5 A fim de se obter um vector de transfecção sem o gene HSV-TK, ligou-se um fragmento Ascl/Nhel do plasmideo pl90, o qual continha a sequência de activação do gene, num fragmento Ascl/Nhel do plasmideo pl87, que continha o exão 1. O plasmideo resultante foi designado pl92 (Fig. 4e).

Exemplo 3 Transfecção de células

Seleccionaram-se várias linhas de células quanto à produção de EPO e transfectaram-se com vectores de targeting. 3.1 Células de Namalwa

As células foram cultivadas em frascos de cultura de tecidos T150 e transfectadas por meio de electroporação (1 x 107 células/800 pL tampão de electroporação Hepes 20 mM, NaCl 138 mM, KC1 5 mM, Na2HP04 0,7 mM, mono-hidrato de D-glucose 6 mM a pH 7,0, 10 pg de ADN linearizado, 960 pF, 260 V BioRad Gene Pulser). Após a electroporação, as células foram cultivadas em 21 RPMI 1640, 10% (v/v) de soro fetal de vitela (FCS), L-glutamina 2 mM, piruvato de sódio 1 mM em quarenta placas de 96 poços. Passados dois dias, as células foram cultivadas durante 10 a 20 dias em 1 mg/mL de meio contendo G-418. O sobrenadante foi ensaiado numa ELISA em fase sólida quanto à produção de EPO (ver Exemplo 4) . Os clones produtores de EPO foram expandidos em placas de 24 poços e frascos de cultura de tecidos T-25. Liofilizaram-se aliquotas e as células foram subclonadas por meio de FACS (Ventage, Beckton Dickinson) . Os subclones foram novamente ensaiados quanto à produção de EPO. 3.2 Células HT 1080

As condições foram como descritas para as células Namalwa, com excepção de que as células HT1080 foram cultivadas em DMEM, 10% (v/v) de FCS, L-glutamina 2 mM, piruvato de sódio 1 mM. Para a transfecção por meio de electroporação, as células foram soltas das paredes dos recipientes de cultura por meio de tripsinização. Após a electroporação, cultivaram-se 1 x 107 células em DMEM, 10% (v/v) de FCS, L-glutamina 2 mM, piruvato de sódio 1 mM em 5 placas de 96 poços. 3.3 Células HeLa S3

As condições foram como descritas para as células Namalwa, com excepção de que as células HeLa foram cultivadas em RPM 1640, 10% (v/v) de FCS, L-glutamina 2 mM, 1% (v/v) de aminoácidos não essenciais MEM (Sigma), piruvato de sódio 1 mM. Para a transfecção por meio de electroporação, as células foram soltas das paredes dos recipientes de cultura por meio de 22 tripsinização. As condições para a electroporação eram 960 pF/250 V. Após a electroporação, as células foram cultivadas em RPMI 1640, 10% (v/v) de FCS, L-glutamina 2 mM, 1 % (v/v) de MEM, piruvato de sódio 1 mM em frascos de cultura de tecidos T75. 24 horas depois da electroporação, as células foram tripsinizadas e cultivadas durante 10 a 15 dias num meio que continha 600 pg/mL de G-418 em 10 placas de 96 poços.

Exemplo 4 Selecção dos clones produtores de EPO O sobrenadante de cultura das células transfectadas foi ensaiado numa ELISA de EPO. Todas os passos foram realizados à temperatura ambiente. Placas de 96 poços previamente revestidas com estreptavidina foram revestidas com anticorpos anti-EPO (Boehringer Mannheim) biotinilados. Para o revestimento, as placas foram em primeiro lugar lavadas com fosfato de sódio 50 mM a pH 7,2, 0,05% (v/v) de Tween 20. Em seguida, adicionou-se por poço 0,01 mL de tampão de revestimento (4 pg/mL de anticorpos biotinilados, fosfato de sódio 10 mM a pH 7,2, 3 g/L de albumina de soro de bovino, 20 g/L de sacarose, 9 g/L de NaCl) e incubou-se durante 3 h à temperatura ambiente. Em seguida as placas foram lavadas com fosfato de sódio 50 mM a pH 7,2, secas e seladas.

Antes do ensaio, as placas, após lavagem por três vezes com 0,3 mL de solução salina tamponizada com fosfato (PBS), 0,05% de

Tween 20 (Sigma), foram incubadas durante a noite com 0,2 mL de PBS, 1% (p/v) de croteina (Boehringer Mannheim) por poço, a fim de bloquear ligações não especificas. 23

Depois da remoção da solução de bloqueio, adicionaram-se 0,1 mL de sobrenadante da cultura e as placas foram incubadas durante a noite. Cada um dos poços foi lavado por três vezes com 0,3 mL de PBS, 0,05% de Tween 20 de cada vez. Em seguida, adicionaram-se 100 pL de anticorpos monoclonais conjugados de peroxidase (POD) (Boehringer Mannheim, 150 mU/mL) durante duas horas. Os poços foram em seguida de novo lavados por três vezes com 0,3 mL de PBS, 0,05% de Tween 20 de cada vez. Em seguida realizou-se a reacção de peroxidase com utilização de ABTS® como substrato num fotómetro Perkin Elmer a 405 nm. Utilizou-se uma curva de calibração normalizada recorrendo a EPO recombinante de células CHO (Boehringer Mannheim, 100 - 1000 pg/poço) para o cálculo das concentrações de EPO.

Exemplo 5 Amplificação genética de EPO

Para o aumento da expressão de EPO, cultivaram-se os clones produtores de EPO em presença de concentrações crescentes (100 pM - 1000 nM) de metotrexato (MTX) . A cada concentração de MTX ensaiaram-se os clones por meio de uma ELISA (ver Exemplo 4) quanto à produção de EPO. Os produtores mais fortes foram subclonados por meio de diluição limitante.

Exemplo 6 Mutações da sequência de sinal A fim de optimizar a sequência lider da molécula de EPO, substituiram-se os primeiros aminoácidos codificados pelo exão 1. 24

Utilizaram-se iniciadores com diferentes sequências (SEQ ID N.° 4-17; o iniciador 3' continha um local CelII para a selecção de sequências modificadas) a fim de se obter um fragmento Ascl/Xbal por meio de PCR, com utilização do plasmideo pEP0227, que contém um fragmento de 4 kb HindIII/EcoRI (inclusive os exões 1 - 5) da sequência genética da EPO humana sob controlo do promotor de SV40 (Jacobs et al., Nature 313 (1985), 806; Lee-Huang et al., Gene 128 (1993), 227), como matriz. Os fragmentos resultantes foram em seguida clonados no plasmideo pEP0148 (Exemplo 2.2), obtendo-se deste modo os plasmídeos pEPO 182, 183, 184 e 185 (Figura 5) . A expressão genética de EPO foi accionada por um promotor de SV40. Transfectaram-se células COS-7 temporariamente com as construções (método DEAE-dextrano) e as células foram ensaiadas quanto à produção de EPO 48 h depois da transfecção. A sequência lider mutada, obtida desta forma, Met-Ser-Ala-His com a melhor expressão de EPO foi utilizada para a construção dos vectores de targeting genético (cf. Exemplo 2.2).

Exemplo 7 Caracterização de linhas de células produtoras de

EPO

Três linhas de células diferentes (Namalwa, HeLa S3 e HT 1080) foram seleccionadas para activação genética de EPO. Os clones produtores de EPO foram obtidos por meio de transfecção com os plasmídeos pl79, pl87, pl89, pl90 ou pl92 (cf. Exemplos 2 e 3) .

Ensaiaram-se cerca de 160.000 clones resistentes a NEO no que se refere à produção de EPO, dos quais 12 - 15 segregavam 25 EPO com rendimento significativo reprodutível no sobrenadante das células.

Destes foi possível, surpreendentemente sem amplificação genética por meio de MTX, identificar um total de 7 clones de EPO, que produziam EPO em quantidades suficientes para uma produção à escala industrial. A produção de EPO destes clones situou-se na gama de 200 ng/mL até mais de 1000 ng/mL/106 células/24 h. Um exemplo de uma célula destas é o clone "Aladin" depositado na DSMZ (DSM ACC 2320), que foi obtido a partir de uma célula Namalwa.

Após a amplificação genética com 500 nM de MTX, foi possível aumentar a produção de EPO do clone de EPO identificado para até mais do que 3000 ng/mL/106 células/24 h. Um aumento adicional da concentração de MTX para 1000 nM conduziu a uma produção de até mais de 7000 ng/mL/106 células/24 h.

Os clones obtidos mostravam uma produção de EPO mesmo em condições de cultura isentas de soro.

Exemplo 8 Caracterização do genoma dos clones produtores de

EPO 8.1 Metodologia

Isolou-se ADN genómico humano de cerca de 108 células e quantificou-se (Sambrook et al., 1989). Após clivagem do ADN genómico com enzimas de restrição, p. ex. Agel e Asei ou BamHI, Hind III e Sall, os fragmentos de ADN foram separados pelo seu 26 tamanho por meio de electroforese em gel de agarose e, por fim, foram transferidos e imobilizados numa membrana de nylon.

0 ADN imobilizado foi hibridado com sondas de ADN especificas da EPO ou da sequência de activação genética marcadas com digoxigenina (DIG DNA Labeling Kit, Boehringer

Mannheim) e lavado sob condições rigorosas. Os sinais de hibridação específicos foram detectados com auxílio de um processo de quimioluminescência com utilização de películas sensíveis à radiação. 8.2 Resultados 0 tratamento de células com MTX 500 nM conduziu a uma intensificação do sinal de hibridação no local da EPO por um factor de 5 a 10. Com um aumento adicional para MTX 1000 nM obteve-se uma intensificação por um factor > 10 (Figura 6a).

No caso da hibridação com as sondas específicas de EPO, detectaram-se também as cópias do cromossoma 7 que não tinham sido encontradas por meio da recombinação homóloga. Conforme se pode ver na Figura 6b, estas apresentam igualmente fragmentos de ADN de hibridação com uma outra dimensão, nitidamente diferente, e a sua intensidade de sinal não é alterada por meio da utilização de MTX. 27

Exemplo 9 Purificação de EPO a partir de sobrenadantes de cultura de linhas de células humanas (HeLa S3, Namalwa e HT1080)

Essencialmente, foram utilizados para a purificação de EPO a partir de sobrenadantes de culturas de células de linhas de células humanas dois métodos que diferem quanto ao número e principio dos passos de cromatoqrafia e são utilizados conforme a composição do meio e a concentração de EPO: Método 1: 1° passo: Coluna de Blue-Sepharose 2o passo: Coluna de butil-Sepharose 3o passo: Coluna de hidroxiapatite 4° passo: Concentração Método 2: 1° passo: Coluna de Blue-Sepharose 2o passo: Coluna de hidroxiapatite 3o passo: Concentração (3 ° passo alternativo: RP-HPLC)

Exemplo para uma purificação de um sobrenadante da cultura de células HeLaS3 com 2% (v/v) de soro fetal de vitela (SFV) segundo o método 1: 1. Coluna de Blue-Sepharose:

Uma coluna de 5 mL de Hi-Trap-Blue (Coluna pronta de Blue-Sepharose de Pharmacia) foi equilibrada com pelo menos 5 volumes de coluna (VC) de tampão A (Tris-HCl 20 mM, pH 7,0; CaCl2 5 mM; NaCl 100 mM) . Em seguida, fizeram-se passar 70 mL de sobrenadante de células HeLa (contendo cerca de 245 pg de EPO e 70 - 100 mg de proteína total) durante a noite, com um caudal de 0,5 mL/min em circuito fechado. 28 A coluna foi lavada com pelo menos 5 VC de tampão B (Tris-HC1 20 mM, pH 7,0; CaCl2 5 mM; NaCl 250 mM) e pelo menos 5 VC de tampão C (Tris-HCl 20 mM, pH 7,0; CaCl2 0,2 mM, NaCl 250 mM) a 0,5 mL/min. O decurso da lavagem foi seguido por meio da medição do teor de proteinas a DO280. A eluição de EPO foi realizada com tampão D (Tris-HCl 100 mM, pH 7,0; CaCl2 0,2 mM; NaCl 2 M) com um caudal de 0,5 mL/min. A solução de eluição foi recolhida em fracções de 1 - 2 mL. O teor de EPO das fracções, das soluções de lavagem e do fluxo de passagem foi determinado através de Reverse-Phase (RP)-HPLC por meio de aplicação de uma aliquota numa coluna POROS R2/H (Boehringer Mannheim). Em alternativa, para uma identificação qualitativa das fracções que continham EPO, realizou-se uma dotblot imunológica.

As fracções que continham EPO (8 - 12 mL) foram reunidas e aplicadas numa coluna de butil-Sepharose. O rendimento depois da coluna de Blue-Sepharose perfez cerca de 175 pg de EPO (corresponde a cerca de 70%). Em geral, o rendimento depois do Blue-Sepharose perfez entre 50 - 75%. 2. Coluna de butil-Sepharose (Cromatografia de interacções hidrófobas)

Uma coluna de butil-Sepharose de 2 - 3 mL, feita no laboratório (material: Toyopearl Butyl S650) foi equilibrada com pelo menos 5 VC de tampão D (Tris-HCl 100 mM, pH 7,0; CaCl2 0,2 29 mM; NaCl 2M) e em seguida aplicou-se o pool de Blue-Sepharose que continha EPO de 1. (cerca de 150 pg de EPO) com um caudal de 0,5 mL/min. A coluna foi lavada com pelo menos 5 VC de tampão E (Tris-HC1 20 mM, pH 7,0; NaCl 2 M e 10% de isopropanol) a 0,5 mL/min. O decurso da lavagem foi seguido por meio da medição do teor de proteínas a DO280. A eluição de EPO foi realizada com tampão F (Tris-HCl 20 mM, pH 7,0; NaCl 2 M e 20% de isopropanol) com um caudal de 0,5 mL/min. A solução de eluição foi recolhida em fracções de 1 - 2 mL. O teor de EPO das fracções, das soluções de lavagem e do fluxo de passagem foi determinado através de RP-HPLC por meio de aplicação de uma alíquota numa coluna POROS R2/H. Em alternativa, para uma identificação qualitativa das fracções que continham EPO, realizou-se uma dotblot imunológica.

As fracções que continham EPO (10 - 15 mL) foram reunidas e aplicadas numa coluna de hidroxiapatite. O rendimento da coluna de butil-Sepharose perfez cerca de 130 pg de EPO (corresponde a cerca de 85%). Em geral, o rendimento da butil-Sepharose perfez entre 60 - 85% da aplicação dos pools de Blue-Sepharose. 30 3, Coluna de hidroxiapatite

Uma coluna de hidroxiapatite de 5 mL (coluna pronta da Econo-Pac CHT II da BioRAD) foi equilibrada com pelo menos 5 VC de tampão F (Tris-HCl 20 mM, pH 7,0/ NaCl 2 M; 20% de isopropanol) e em seguida aplicou-se o pool de butil-Sepharose que continha EPO de 2. (cerca de 125 pg de EPO) com um caudal de 0,5 mL/min. A coluna foi lavada com pelo menos 5 VC de tampão G (Tris-HCl 20 mM, pH 7,0; NaCl 2 M) a 0,5 mL/min. O decurso da lavagem foi seguido por meio da medição do teor de proteinas a DO280. A eluição de EPO foi realizada com tampão H (fosfato Na 10 mM, pH 7,0; NaCl 80 mM) com um caudal de 0,5 mL/min. A solução de eluição foi recolhida em fracções de 1 - 2 mL. O teor de EPO das fracções, das soluções de lavagem e do fluxo de passagem foi determinado através de RP-HPLC por meio de aplicação de uma aliquota numa coluna POROS R2/H.

As fracções que continham EPO (3-6 mL) foram reunidas. O rendimento da coluna de hidroxiapatite perfez cerca de 80 pg de EPO (corresponde a cerca de 60%) . Em geral, o rendimento da coluna de hidroxiapatite perfez entre 50 - 65% da aplicação dos pools de butil-Sepharose. 4. Concentração

As fracções de EPO reunidas do passo de hidroxiapatite foram concentradas em unidades de centrifugação com uma dimensão 31 de exclusão de 10 kD (p. ex. Microsep da Filtron) para uma concentração de 0,1 - 0,5 mg/mL, tratadas com 0,01% de Tween 20 e guardadas em aliquotas a -20 °C.

Esquema do rendimento: EPO (pg) Rendimento (%) Partida 245 100 Blue-Sepharose 175 70 Coluna de butil-Sepharose 130 53 Coluna de hidroxiapatite 80 33 Concentração 60 25 A pureza da EPO isolada era > que cerca de 90%, em regra mesmo > 95%.

Para aumentar o rendimento da EPO, utilizou-se também o método 2, em que faltou o passo de butil-Sepharose. Este método é utilizável principalmente com sobrenadantes de culturas de células sem ou com 1% (v/v) de adição de SFV e permite obter EPO isolada com pureza sensivelmente igual (90 - 95%). A presença de CaCl2 5 mM no tampão de equilíbrio (tampão F) para a coluna da hidroxiapatite conduziu com este método a uma ligação melhorada e portanto, também a um comportamento de eluição reprodutível de EPO no passo de hidroxiapatite. Por este motivo, no método 2 procedeu-se com um decurso fundamentalmente igual ao do método 1 com os seguintes tampões: 32 1. Coluna de Blue-Sepharose:

Tampão de equilíbrio (tampão A): Tris-HCl 20 mM, PH 7, 0; CaCl2 5 mM; NaCl 100 mM Tampão de lavagem 1 (tampão B): Tris-HCl 20 mM, PH 7, 0; CaCl2 5 mM; NaCl 250 mM Tampão de lavagem 2 (tampão C): Tris-HCl 20 mM, PH 7, 0; CaCl2 5 mM; NaCl 250 mM Tampão de eluição (tampão D): Tris-HCl 100 mM, pH 7 ,0; CaCl 2 mM; NaCl 2 M 2. Coluna de hidroxiapatite

Tampão de equilíbrio (tampão F)

Tampão de lavagem (tampão G):

Tampão de eluição (tampão H):

Tris-HCl 50 mM, pH 7,0; CaCÍ2 5 mM; NaCl 1 M Tris-HCl 10 mM, pH 7,0; CaCl2 5 mM; NaCl 80 mM Fosfato de Na 10 mM, pH 7,0; CaCl2 0,5 mM; NaCl 80 mM

Esquema do rendimento: EPO (pg) Rendimento (%) Partida 600 100 Blue-Sepharose 450 75 Coluna de hidroxiapatite 335 55 Concentração 310 52 33 A adição de CaCl2 5 mM aos tampões B a G no método 1 conduziu igualmente a uma melhor ligação e uma eluição mais definida da coluna de hidroxiapatite.

Exemplo 10 Determinação da actlvidade especifica in vivo de EPO de linhas de células humanas (bioensaio em ratinhos normocitémicos) A actividade dependente da dose de EPO na multiplicação e diferenciação das células precursoras dos eritrócitos foi determinada in vivo em ratinhos, por meio do aumento dos reticulócitos no sangue depois da administração de EPO.

Para este fim, por cada oito ratinhos foram administradas diferentes doses da amostra de EPO a analisar e um padrão de EPO (ajustado frente a um padrão EPO da WHO) por via parentérica. Os ratinhos foram depois mantidos em condições constantes, definidas. 4 dias depois da administração de EPO, recolheu-se sangue dos ratinhos e os reticulócitos foram coloridos com laranja de acridina. A determinação do número de reticulócitos por 30000 eritrócitos foi realizada por microfluorometria em citómetro de fluxo por meio da análise do histograma de fluorescência vermelha. A avaliação da actividade biológica foi realizada a partir dos valores para os números de reticulócitos da sonda e do padrão às diferentes doses, segundo o processo descrito por Linder de determinação de teor aos pares com rectas paralelas (A. Linder, Planen und Auswerten von Versuchen, 3.a Edição, 1969, Birkenhàuser Verlag Basileia). 34

Resultado : EPO de linhas de células actividade específica U/mg HeLa S3 (amostra 1) 100.000 HeLa S3 (amostra 2) 110.000 35

PROTOCOLO DE SEQUÊNCIAS

(1) DADOS GERAIS

(i) REQUERENTE

(A) NOME: Boehringer Mannheim GmbH (B) RUA: Sandhofer Str. 112-132 (C) LOCALIDADE: Mannheim (E) PAÍS: Alemanha (F) CÓDIGO POSTAL: 68305 (ii) EPÍGRAFE DA INVENÇÃO: Preparação de eritropoietina por meio de activação genética endógena (iii) NÚMERO DAS SEQUÊNCIAS: 17 (iv) VERSÃO PARA LEITURA POR COMPUTADOR: (A) SUPORTE DE DADOS: Disquete

(B) COMPUTADOR: Compatível IBM PC

(C) SISTEMA OPERATIVO PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA Patentln Release #1.0, Versão #1.30 (EPA) (2) DADOS PARA SEQ ID N.°: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 32 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) FORMA DE CADEIA: cadeia simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N.°: 1: CGCGGCGGAT CCCAGGGAGC TGGGTTGACC GG 32 36 (2) DADOS PARA SEQ ID N.°: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 38 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) FORMA DE CADEIA: cadeia simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N.°: 2: GGCCGCGAAT TCTCCGCGCC TGGCCGGGGT CCCTCAGC 38 (2) DADOS PARA SEQ ID N.°: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 36 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) FORMA DE CADEIA: cadeia simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N.°: 3: CGCGGCGGAT CCTCTCCTCC CTCCCAAGCT GCAATC 36 (2) DADOS PARA SEQ ID N.°: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 36 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) FORMA DE CADEIA: cadeia simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N.°: 4: CGCCGCGAAT TCTAGAACAG ATAGCCAGGC TGAGAG 36 37 (2) DADOS PARA SEQ ID N.°: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) FORMA DE CADEIA: cadeia simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N.°: 5: TCACCCGGCG CGCCCCAGGT CGCT 24 (2) DADOS PARA SEQ ID N.°: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 61 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) FORMA DE CADEIA: cadeia simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N.°: 6: ATGCTCGAGC GGCCGCCAGT GTGATGGATA TCTGCAGAGC TCAGCTTGGC CGCGAATTCT 60 A 61 (2) DADOS PARA SEQ ID N.°: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 78 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) FORMA DE CADEIA: cadeia simples (D) TOPOLOGIA: linear 38 (ix) CARACTERÍSTICAS:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) POSIÇÃO: 49..60 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N.°: 7: TCACCCGGCG CGCCCCAGGT CGCTGAGGGA CCCCGGCCAG GCGCGGAG ATG GGG GCC 57

Met Gly Ala 1 CAC GGTGAGTACT CGCGGGCT 78

HÍS (2) DADOS PARA SEQ ID N.°: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 4 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N.°: 8:

Met Gly Ala His 1 (2) DADOS PARA SEQ ID N.°: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 78 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) FORMA DE CADEIA: cadeia simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICAS: 39

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) POSIÇÃO: 49..60 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N.°: 9: TCACCCGGCG CGCCCCAGCT CGCTGAGGGA CCCCGGCCAG GCGCGGAG ATG AGC GCC 57

Met Ser Ala 5 CAC GGTGAGTACT CGCGGGCT 78

His (2) DADOS PARA SEQ ID N.°: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 4 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N.°: 10:

Met Ser Ala His 1 (2) DADOS PARA SEQ ID N.°: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 78 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) FORMA DE CADEIA: cadeia simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICAS:

(A) NOME/CHAVE: CDS 40 57 (B) POSIÇÃO: 49..60 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N.°: 11:

TCACCCGGCG CGCCCCAGGT CGCTGAGGGA CCCCGGCCAG GCGCGGAG ATG GGG GTG

Met Gly Vai 5 78 CCC GGXGAGTACT CGCGGGCT Pro (2) DADOS PARA SEQ ID N.°: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 4 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N.°: 12:

Met Gly Vai Pro 1 (2) DADOS PARA SEQ ID N.°: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 78 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) FORMA DE CADEIA: cadeia simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICAS:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) POSIÇÃO: 49..60 41 57 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N.°: 13:

TCftCCCGGCG CGCCCCAGGT ÍgCTGAGGGA CCCCGGCCAG GCGCGGAG ATG AGC GTG

Met Ser Vai 5 78 CAC GGTGAGTACT CGCGGGCT Kis (2) DADOS PARA SEQ ID N.°: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 4 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N.°: 14:

Met Ser Vai His 1 (2) DADOS PARA SEQ ID N.°: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 59 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) FORMA DE CADEIA: cadeia simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N.°: 15: GGACATTCTA GAACAGATAT CCAGGCTGAG CGTCAGGCGG GGAGGGAGAA GGGTGGCTG 59 (2) DADOS PARA SEQ ID N.°: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 42 (Δ) COMPRIMENTO: 48 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) FORMA DE CADEIA: cadeia simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N.°: 16: GTGATGGATA TCTCTAGAAC AGATAGCCAG GCTGAGAGTC AGGCGGGG 48 (2) DADOS PARA SEQ ID N.°: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 39 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) FORMA DE CADEIA: cadeia simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N.°: 17: ATGGATATCA TCGATTCTAG AACAGATAGC CAGGCTGAG 39

Lisboa, 23 de Novembro de 2006 43

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Célula humana, caracterizada por conter uma cópia de um gene da EPO endógeno em ligação operativa com um promotor heterólogo activo nas células humanas e ter a capacidade de produzir pelo menos 200 ng de EPO/IO6 células/24 h, em que a distância entre o promotor heterólogo e o inicio da tradução do gene da EPO não é superior a 1100 pb, que pode ser obtida por meio de um processo que inclui os passos de: (a) proporcionar células de partida humanas, que contêm pelo menos uma cópia do gene da EPO endógeno, com a condição de que as células de partida humanas não são células portadoras de germens, (b) transfectar as células com uma construção de ADN que compreende: (i) duas sequências de ADN de flanco, que são homólogas a dominios do local do gene da EPO humana, a fim de permitir uma recombinação homóloga, (ii) um gene marcador de selecção positivo e (iii) uma sequência de controlo de expressão heteróloga, que é activa na célula humana, em que a sequência de controlo de expressão heteróloga abrange um promotor virai forte e a distância entre o promotor heterólogo e o inicio de tradução do gene da EPO não é maior do que 1100 pb, (c) cultivar as células transfectadas sob condições nas quais tem lugar uma selecção relativamente à presença do gene marcador de selecção positivo, 1 (d) analisar as células seleccionáveis de acordo com o passo (c) e (e) identificar as células produtoras de EPO.
2. Célula humana de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por possuir a capacidade de produzir de 200 - 3000 ng de EPO/IO1 células/24 h.
3. Célula humana de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada por ser a célula DSM ACC 2320.
4. Célula humana obtenível por meio de amplificação genética a partir de uma célula de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por conter várias cópias de um gene de EPO endógeno, cada uma em ligação operativa com um promotor heterólogo activo nas células humanas e possuir a capacidade para a produção de pelo menos 1000 ng de EPO/IO1 células/24 h, gue pode ser obtida por meio de um processo que inclui os passos de: (f) amplificação do gene da EPO e (g) obtenção de células produtoras de EPO, que contêm várias cópias de um gene da EPO endógeno cada uma em ligação operativa com uma sequência heteróloga de controlo de expressão.
5. Célula humana de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por possuir a capacidade de produzir de 1000 - 25000 ng de EPO/IO1 células/24 h. 2 1 Célula humana de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada por ser uma célula imortalizada.
7. Célula humana de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada por poder ser cultivada em meio isento de soro.
8. Célula humana de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada por ser seleccionada de entre uma célula HT 1080, uma célula HeLa S3, uma célula Namalwa ou uma célula derivada destas.
9. Célula humana de acordo com uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada por o gene da EPO endógeno activado estar sob o controlo de um promotor de CMV.
10. Célula humana de acordo com uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada por o gene da EPO apresentar uma sequência que codifica para um peptideo de sinal diferente da sequência que codifica para o peptideo de sinal natural.
11. Célula humana de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por o gene da EPO, que está em ligação operativa com a sequência de controlo de expressão heteróloga, apresentar uma sequência que codifica para um peptideo de sinal que codifica para uma sequência do peptideo de sinal modificada no dominio dos 4 primeiros aminoácidos, que é seleccionada de: Met-Xi~X2_X3 em que Xi é Gly ou Ser, X2 é Ala, Vai, Leu, Ile, Ser ou Pro, X3 e Pro é Arg, Cys ou His, com a condição de X1-X2-X3 não ser a sequência Gly-Val-His. 3 reivindicação 11
12. Célula humana de acordo com a caracterizada por os 4 primeiros aminoácidos serem seleccionados de entre: (a) Met-Gly-Ala-His, (b) Met-Ser-Ala-His, (c) Met-Gly-Val-Pro ou (d) Met-Ser-Val-His.
13. Célula humana de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por a sequência dos primeiros quatro aminoácidos do peptideo de sinal ser Met-Ser-Ala-His.
14. Processo para a preparação de uma célula produtora de EPO humana de acordo com uma das reivindicações 1 a 13, que compreende os passos de: (a) proporcionar células de partida humanas, que pelo menos contêm uma cópia de um gene da EPO endógeno, com a condição de que as células de partida humanas não são células portadoras de germens. (b) transfectar as células com uma construção de ADN que compreende: (i) duas sequências de ADN de flanco, que são homólogas a domínios do local do gene da EPO humana, a fim de permitir uma recombinação homóloga, (ii) um gene marcador de selecção positivo e (iii) uma sequência de controlo de expressão heteróloga, que é activa na célula humana, em que a sequência de controlo de expressão heteróloga abrange um promotor virai forte e a distância entre o promotor 4 heterólogo e o início de tradução do gene da EPO não é maior do que 1100 pb, (c) cultivar as células transfectadas sob condições nas quais tem lugar uma selecção relativamente à presença do gene marcador de selecção positivo, (d) analisar as células seleccionáveis de acordo com o passo (c) e (e) identificar as células produtoras de EPO.
15. Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por as sequências de ADN homólogas serem seleccionadas do domínio das sequências a 5' não traduzidas, exão 1 e intrão 1 do gene da EPO.
16. Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por se utilizar uma sequência modificada no domínio do exão 1.
17. Processo de acordo com as reivindicações 15 ou 16, caracterizado por se utilizar o gene de fosfotransferase de neomicina como gene marcador de selecção.
18. Processo de acordo com uma das reivindicações 15 a 17, caracterizado por a construção de ADN compreender adicionalmente um gene de amplificação.
19. Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por se utilizar um gene de reductase de di-hidrofolato como gene de amplificação. 5
20. Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por se utilizar o gene de um mutante de arginina de reductase de di-hidrofolato como gene de amplificação.
21. Processo de acordo com uma das reivindicações 16 a 18, que compreende adicionalmente os passos de: (f) amplificação do gene da EPO e (g) obtenção de células produtoras de EPO que contêm várias cópias de um gene da EPO endógeno cada uma em ligação operativa com uma sequência de controlo de expressão heteróloga.
22. Processo de acordo com uma das reivindicações 14 a 21, caracterizado por se utilizar um promotor/intensificador de CMV como sequência de controlo da expressão.
23. Processo de acordo com uma das reivindicações 14 a 22, caracterizado por se utilizar como construção de ADN o plasmideo pl89 (DSM 11661) ou um plasmideo derivado deste na forma linearizada.
24. Construção de ADN para a activação de um gene da EPO endógeno numa célula humana, que compreende: (i) duas sequências de ADN de flanco, que são homólogas a domínios do local do gene da EPO humana seleccionadas de entre sequências a 5' não traduzidas, exão 1 e intrão 1, a fim de possibilitar uma recombinação homóloga, em que no domínio do exão 1 está presente uma sequência modificada que codifica para os aminoácidos: Met-Xi-X2-X3 6 em que Xi é Gly ou Ser, X2 é Ala, Vai, Leu, Ile, Ser ou Pro, X3 e Pro é Arg, Cys ou His, com a condição de X1-X2-X3 não ser a sequência Gly-Val-His, (ii) um gene marcador de selecção positivo, (iii) uma sequência de controlo de expressão heteróloga, que é activa numa célula humana, em que a sequência de controlo de expressão heteróloga abrange um promotor virai forte e a distância entre o promotor heterólogo e o inicio de tradução do gene da EPO não é maior do que 1100 pb, e (iv) eventualmente um gene de amplificação.
25. Construção de ADN de acordo com a reivindicação 24, caracterizada por os aminoácidos serem seleccionados de: (a) Met-Gly-Ala-His, (b) Met-Ser-Ala-His, (c) Met-Gly-Val-Pro ou (d) Met-Ser-Val-His.
26. Utilização de uma construção de ADN para a activação de um gene da EPO endógeno numa célula humana para a preparação de uma célula de acordo com a reivindicação 1, com a condição de que a célula humana não é uma célula portadora de germens, em que a construção compreende: (i) duas sequências de ADN de flanco, que são homólogas a domínios do local do gene da EPO humana seleccionadas de sequências a 5' não traduzidas, exão 1 e intrão 1, a fim de permitir uma recombinante homóloga, (ii) um gene marcador de selecção positivo, 7 (iii) uma sequência de controlo de expressão heteróloga, que é activa numa célula humana, em que a sequência de controlo de expressão heteróloga abrange um promotor virai forte e a distância entre a sequência de controlo de expressão heteróloga e o inicio de tradução do gene da EPO não é maior do que 1100 pb, e (iv) eventualmente um gene de amplificação.
27. Plasmideo pl89 (DSM 11661) ou um plasmideo derivado deste.
28. Processo para a preparação de EPO humana, caracterizado por se cultivar uma célula humana de acordo com uma das reivindicações 1 a 13 sob condições num meio apropriado, nas quais tem lugar uma produção de EPO e a EPO é obtida a partir do meio de cultura.
29. Processo de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por se utilizar um meio de cultura isento de soro.
30. Processo de acordo com uma das reivindicações 28 ou 29, caracterizado por se cultivarem as células em suspensão.
31. Processo de acordo com uma das reivindicações 28 a 30, caracterizado por se realizar a cultura num fermentador.
32. Processo de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por o volume do fermentador perfazer 10 L - 50000 L.
33. Processo de acordo com uma das reivindicações 28 a 32, caracterizado por a obtenção da EPO a partir do meio de cultura compreender os passos de: 8 (a) fazer passar o sobrenadante celular através de um meio de cromatografia de afinidade e recolher as fracções que contêm a EPO, (b) eventualmente fazer passar as fracções que contêm a EPO através de um meio de cromatograf ia de interacção hidrófobo e recolher as fracções que contêm a EPO, (c) fazer passar as fracções que contêm a EPO através de hidroxiapatite e recolher as fracções que contêm a EPO e (d) concentrar ou/e fazer passar através de um meio de HPLC de fase invertida.
34. Processo de acordo com a reivindicação 33, caracterizado por se utilizar no passo (a) um meio de Blue-Sepharose.
35. Processo de acordo com uma das reivindicações 33 ou 34, caracterizado por se utilizar no passo (b) um meio de butil-Sepharose.
36. Processo de acordo com uma das reivindicações 33 a 35, caracterizado por se realizar a concentração por meio de cromatografia de exclusão.
37. Processo de acordo com a reivindicação 36, caracterizado por se utilizar um meio com uma dimensão de exclusão de 10 kD.
38. Processo de acordo com uma das reivindicações 28 a 37, caracterizado por se obter uma EPO humana com uma pureza de pelo menos 90%.
39. Processo de acordo com uma das reivindicações 28 a 38, caracterizado por se obter uma EPO humana com uma 9 actividade específica in vivo (ratinhos normocitémicos) de pelo menos 100000 Ul/mg.
40. Processo de acordo com a reivindicação 39, caracterizado por se obter uma EPO humana com uma actividade específica in vivo (ratinhos normocitémicos) de pelo menos 175.000 UI/mg até 450.000 UI/mg.
41. Processo de acordo com uma das reivindicações 28 a 40, caracterizado por se obter uma EPO humana com um teor inferior a 0,2% de ácido N-glicolneuramínico, relativamente ao teor de ácido N-acetilneuramínico.
42 . Processo de acordo com uma das reivindicações 28 a 41, caracterizado por se obter uma EPO humana com resíduos de ácido siálico acoplados em a-2,3. 43. Processo de acordo com uma das reivindicações 28 a 42, caracterizado por se obter uma EPO humana com resíduos de ácido siálico acoplados em a-2,3 e a-2,6. 44 . Processo de acordo com uma das reivindicações 28 a 43, caracterizado por se obter uma EPO humana que compreende um polipeptídeo com um comprimento de 165 aminoácidos. 45. Processo de acordo com uma das reivindicações 28 a 43, caracterizado por se obter uma EPO humana que compreende um polipeptídeo com um comprimento de 166 aminoácidos. 46. Processo de acordo com uma das reivindicações 28 a 43, caracterizado por se obter uma EPO humana que compreende 10 uma mistura de polipeptídeos com um comprimento de 165 e 166 aminoácidos. uma dos ser ser
47. ADN isolado que codifica para uma EPO humana com sequência Met-Ser-Ala-His modificada no dominio primeiros 4 aminoácidos do peptídeo de sinal.
48. ADN de acordo com a reivindicação 47, caracterizado por um ADN genómico.
49. ADN de acordo com a reivindicação 47, caracterizado por um ADNc. Lisboa, 23 de Novembro de 2006 11