ES2090297T5

ES2090297T5 - Produccion de proteinas que utilizan recombinacion homologa.

Info

Publication number: ES2090297T5
Application number: ES91900640T
Authority: ES
Inventors: Arthur I. Skoultchi
Original assignee: Cell Genesys Inc
Current assignee: Cell Genesys Inc
Priority date: 1989-11-06
Filing date: 1990-11-06
Publication date: 2005-03-01
Anticipated expiration: 2010-11-06
Also published as: DE69027526T3; AU7740791A; DK0452484T3; EP0747485B1; EP0452484A4; ATE139574T1; EP0452484B2; KR100233781B1; NO912642D0; DE69032809T2; EP0945515A2; DE69027526T2; SG88714A1; US6015708A; CA2045175C; EP0452484A1; ES2127458T3; JPH04505104A; ES2090297T3; DK0747485T3

Abstract

SE SUMINISTRAN METODOS Y COMPOSICIONES PARA LA EXPRESION DE GENES DE UN MAMIFERO EN UN CULTIVO. UN GEN AMPLIFICABLE SE INTRODUCE MEDIANTE RECOMBINACION HOMOLOGA EN YUXTAPOSICION A UN GEN DE INTERES, LA COMBINACION RESULTANTE SE TRANSFIERE A UN ANFITRION CONVENIENTE Y EL GEN OBJETIVO SE AMPLIFICA POR MEDIO DEL GEN AMPLIFICABLE. EL ANFITRION DE EXPRESION RESULTANTE PUEDE ENTONCES SER CULTIVADO EN UN CULTIVO CON UNA EXPRESION MEJORADA DEL GEN BUSCADO.

Description

Producción de proteínas que utilizan recombinación homóloga.

El campo de la presente invención es la expresión de proteínas de mamíferos.

El descubrimiento de los enzimas de restricción, del clonaje, de la secuenciación, de la retrotranscriptasa y de los anticuerpos monoclonales ha provocado una mejora extraordinaria en la capacidad de aislar, identificar y manipular secuencias de ácidos nucleicos. Como resultado de estas mejoras, se han identificado y manipulado numerosos genes y sus elementos de control transcripcional. Los genes se han utilizado para producir grandes cantidades de una proteína determinada en huéspedes heterólogos (sistemas celulares huésped bacterianos y eucariotas).

En muchos casos, el proceso de obtener secuencias codificantes y conseguir su expresión ha sido largo y trabajoso. Frecuentemente, la identificación de la secuencia codificante, sea ADNc ó ADN genómico, ha implicado la construcción de librerías, identificación de fragmentos de la pauta de lectura, análisis de la regiones flanqueantes y similares. En genes de mamíferos, en los que frecuentemente existen intrones, la región codificante ha resultado ser en muchos casos sólo una pequeña fracción del ácido nucleico total asociado con el gen. En otros casos, la existencia de pseudogenes o familias multigénicas ha entorpecido el aislamiento de un determinado gen de interés. No obstante, a medida que las técnicas han ido mejorando, los casos de identificación y aislamiento de genes de interés se han sucedido sin cesar.

En muchos casos uno está principalmente interesado en la obtención de un producto proteico determinado. El tipo celular en el organismo que produce la proteína es frecuentemente una fuente inadecuada, sea porque la proteína puede producirse en cantidades pequeñas, la proteína puede producirse sólo en una célula huésped diferenciada cuyo crecimiento en cultivo es difícil, o la célula huésped para la producción del producto, en especial de células humanas, no es suficientemente eficiente ni económicamente rentable en un proceso de cultivo. Por este motivo, existe un considerable interés en desarrollar técnicas alternativas para la producción de proteínas de interés a partir del cultivo de células que produzcan la proteína deseada de manera eficiente y rentable económicamente y, cuando sea posible, que procesen adecuadamente el producto proteico.

En la técnica anterior, Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988), describen una estrategia general para introducir mutaciones en genes no seleccionables. Weidle et al., Gene, 66:193-203, (1988), describen la amplificación del activador de plasminógeno específico de tejido con un gen DHFR y la pérdida de amplificación en ausencia de presión selectiva. Murnane y Yezzi, Somatic Cell and Molecular Genetics, 14:273-286, (1988), describen la transformación de una línea celular humana con un marcador génico seleccionable integrado al que le falta un promotor transcripcional, con una duplicación en tándem y amplificación del marcador génico. Thomas y Capecchi, Cell, 51:503-512, (1987), describen la mutagénesi dirigida a un gen diana en células madre derivadas de embrión de ratón. Song et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:6820-6824, (1987), describen la recombinación homóloga en células humanas mediante una integración en dos pasos. Liskay et al., "Homologous Recombination Between Repeated Chromosomal Sequences in Mouse Cells" Cold Spring Harbor, Symp. Quant. Biol. 49:13-189, (1984), describen la integración de dos mutaciones diferentes en el mismo gen y la recombinación homóloga entre los genes mutados. Rubnitz y Subramani, Mol. and Cell. Biol. 4:2253-2258, (1984), definen la homología mínima necesaria para la recombinación homóloga en células de mamíferos. Kim y Smithies, Nucl. Acids Res. 16:8887-8903, (1988), describen un ensayo para la recombinación homóloga mediante la utilización de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

En esta invención, la expresión de proteínas de mamíferos de interés se consigue mediante la utilización de la recombinación homóloga para la integración de un gen amplificable y de otras secuencias reguladoras próximas a un gen de interés sin que se interrumpa la producción de un transcrito correcto. Es posible la amplificación de la región que comprende el gen amplificable y el gen de interés, la fragmentación del genoma y su transferencia directa o indirecta a un huésped de expresión para la expresión de la proteína diana. Entonces la región diana se amplifica, caso de no haberse amplificado previamente, y se seleccionan las células de la población que producen la proteína diana. Las células que producen niveles altos y estables de la proteína se cultivan y se utilizan para la expresión de la proteína diana.

En las Figuras:

Fig. 1 es una representación esquemática del plásmido pCG.1 mostrando la secuencia de la región de clonación múltiple modificada;

Fig. 2 es una representación esquemática de la construcción del plásmido pCG.HR1;

Fig. 3 es una representación esquemática del resultado de marcar el locus EPO por recombinación homóloga con el ADN del pCG.HR1 cortado con NotI;

Fig. 4 es una representación esquemática del fragmento de amplificación mediante la PCR que se origina a partir de células en las que ha tenido lugar un acontecimiento de recombinación homóloga.

En concreto, los procedimientos y composiciones se proporcionan para la producción de proteínas de interés de mamíferos en cultivos. El procedimiento utiliza la recombinación homóloga en una célula huésped para la integración de un gen amplificable en las proximidades de un gen diana, el cual codifica para la proteína de interés. La región que comprende tanto el gen amplificable como el gen diana se llamará la región amplificable. Se aplicaran condiciones a las células primarias transformadas resultantes que permitan seleccionar para la amplificación, o bien la amplificación se realizará a continuación. "Transformadas" incluye transformadas, transfectadas, transducidas, conjugación, fusión, electroporación o cualquier otra técnica para introducir ADN en una célula viable. Los cromosomas o ADN de las células transformadas se utilizan entonces para transferir la región amplificable al genoma de células huésped de expresión secundarias, donde la región diana, si no se ha amplificado previamente suficientemente o en absoluto, se amplifica más. Se analizan las líneas celulares resultantes para la producción de la proteína diana y se seleccionan las líneas celulares secundarias para niveles de producción deseados, cuyas células pueden cultivarse y utilizarse para la producción de la proteína deseada en cultivo.

La célula primaria puede ser cualquier célula de mamíferos de interés, especialmente células de mamíferos que no crecen fácilmente en cultivo, más especialmente células de primates, en especial células humanas, donde las células humanas pueden ser células normales, incluyendo células embrionarias o neoplásticas, especialmente células normales. Pueden utilizarse varios tipos celulares como células primarias, incluyendo fibroblastos, especialmente fibroblastos de piel diploides, linfocitos, células epiteliales, neuronas, células endoteliales, u otras células somáticas, o células germinales. Especialmente interesantes son los fibroblastos de la piel, que pueden propagarse fácilmente para proporcionar grandes cantidades de células normales, células de riñón embrionarias y similares. Estas células pueden expresar o no el gen de interés. En aquellos casos en que el gen diana es inducible o solamente se expresa en determinadas células diferenciadas, uno puede seleccionar células que expresen el gen diana, con lo cual es posible que se necesiten células inmortalizadas capaces de crecer en cultivo.

Existen varios casos de genes amplificables, en los que, mediante la utilización de un agente de selección apropiado, un gen integrado en el genoma se amplificará juntamente con ADN flanqueante adyacente. Entre los genes amplificables se incluyen la reductasa de dihidrofolato, las metalotioneinas I y II, preferiblemente genes de metalotioneinas de primates, la desaminasa de adenosina, la descarboxilasa de ornitina, etc. El gen amplificable tendrá señales de regulación transcripcional que sean funcionales en el huésped secundario o de expresión y será deseable que sean funcionales en el huésped primario, especialmente en aquellos casos en que la amplificación se realiza en el huésped primario o en que el gen amplificable se utiliza como marcador.

El gen diana puede ser cualquier gen de interés, habiéndose identificado y asislado ya un gran número de proteínas de interés, cuya lista crece continuamente. Proteínas de interés incluyen citoquinas, como las interleuquinas 1-10; factores de crecimiento como el EGF, FGF, PDGF y TGF; somatotropinas; hormonas de crecimiento; factores estimuladores de colonias, como el G-CSF, M-CSF y GM-CSF; la eritropoyetina; activadores de plasminógeno, como de tejido y orina; enzimas, como la dismutasa de superóxido; interferones; receptores de células T; proteínas de membrana de superficie; insulina; lipoproteínas; antitripsina á_{1}; proteínas CD, como CD3, 4, 8 y 19; factores de coagulación, por ejemplo el factor VIIc y el factor de von Willebrand; factores de anticoagulación, como la Proteína C; el factor atrial naturético; el factor de necrosis tumoral; proteínas de transporte; receptores de blancos; adresinas; proteínas reguladoras; etc.

Para la recombinación homóloga se prepararán construcciones en las cuales el gen amplificable estará flanqueado por un lado o por los dos con ADN homólogo al ADN de la región diana. El ADN homólogo será generalmente de menos de 100 Kb, normalmente de menos de 50 Kb y preferiblemente de menos de aproximadamente 25 Kb, de la región que se transcribe del gen diana, más preferiblemente de menos de 2 Kb del gen diana. Por gen se entiende la región codificante y las secuencias necesarias para la transcripción de un ARNm maduro. Es posible que el ADN homólogo incluya la región 5' más allá del gen, que comprenda cualquier secuencia activadora, secuencia de inicio de la transcripción, la región 5' de estas secuencias, o similares. Es posible que la región homóloga incluya un fragmento de la región codificante, en cuyo caso es posible que la región codificante comprenda sólo la pauta de lectura codificante o bien una combinación de exones e intrones. Es posible que la región homóloga comprenda un intrón entero o un fragmento de éste, en cuyo caso es posible que comprenda también uno o más exones o bien un fragmento de uno o más exones. Por otra parte, es posible que la región homóloga comprenda la región 3', de manera que comprenda toda la región de terminación de la transcripción o un fragmento de ésta, o la región 3' de esta región. Es posible que las regiones homólogas comprendan todo el gen diana o un fragmento de éste, o que se encuentren fuera del gen diana y comprendan todas las regiones de regulación de la transcripción y/o todo el gen estructural o sólo un fragmento de éstos. La región homóloga se unirá en su mayor parte al gen amplificable, de manera proximal o distal. Generalmente se utilizará una secuencia que no sea la secuencia salvaje que está normalmente asociada al gen diana para separar la secuencia homóloga del gen amplificable en al menos un lado del gen amplificable. Es posible que una parte de esta secuencia sea la secuencia 5' o 3' que está asociada con el gen amplificable, como consecuencia de las manipulaciones en relación al gen amplificable.

No es necesario que las regiones homólogas que flanquean el gen amplificable sean idénticas a la región diana si se desea realizar mutagénesis in vitro. Es posible, por ejemplo, que uno desee cambiar la región de inicio de la transcripción del gen diana, de manera que una parte de la región homóloga comprenda nucleótidos que sean diferentes de los de la región 5' salvaje del gen diana. Por otra parte, uno podría provocar la inserción de una región de inicio de la transcripción diferente de la región de inicio salvaje entre la región de inicio salvaje y el gen estructural. De manera parecida, es posible que uno desee introducir varias mutaciones dentro del gen estructural, de manera que la región homóloga comprenda desapareamientos, lo que provocará un cambio en la proteína que se codifique. Podría introducirse, por ejemplo, una secuencia de péptido señal en la pauta de lectura adecuada del gen diana para posibilitar la secreción del producto de expresión proteico diana. Por otra parte, uno podría cambiar la región 3', por ejemplo la región no traducida, el dominio de poliadenilación, etc., del gen diana. Es posible por tanto, mediante recombinación homóloga, mantener la integridad del gen diana, de manera que la proteína salvaje se exprese conforme a la regulación de la transcripción del promotor salvaje, o bien modificar la regulación de la transcripción, procesamiento o secuencia del gen diana. En algunos casos es posible que uno desee introducir un activador que afecte a la región de inicio de la transcripción, lo que puede realizarse por ejemplo mediante la integración del gen amplificable asociado con el activador en una región 5' más allá de la región de regulación del inicio de la transcripción o en un intrón o incluso en la región 3' más allá del gen diana.

Para preparar las construcciones sujeto de la presente invención será necesario conocer la secuencia diana de la recombinación homóloga. Aunque se ha publicado que es posible que una secuencia de 14 bases complementaria a una secuencia en el genoma sea suficiente para la recombinación homóloga, normalmente cada secuencia flanqueante será de al menos 150 pares de bases (pb), y es posible que sea de 12 Kb o más, generalmente no más de aproximadamente 8 Kb. El tamaño de las regiones flanqueantes se determinará en base al tamaño de la secuencia conocida, al número de secuencias en el genoma que podrían tener homología con la región de integración, a si se realiza mutagénesis y al grado de separación entre las regiones a mutagenizar, a la región de integración en concreto, o similares.

Las construcciones a integrar pueden prepararse conforme a procedimientos convencionales, en los cuales las secuencias pueden sintetizarse, aislarse de fuentes naturales, manipularse, clonarse, unirse, someterse a mutagénesis in vitro, modificación mediante oligonucleótidos, o similares. En diferentes pasos las secuencias que se han unido pueden clonarse y analizarse mediante análisis de restricción, secuenciación o similares. Generalmente la construcción se realizará en un vector de clonaje que comprenda un sistema de replicación funcional en un huésped procariota, por ejemplo E.coli, y un marcador para selección, por ejemplo resistencias a biocidas, complementaciones a un huésped auxotrófico, etc. Es posible que haya también otras secuencias funcionales, como regiones de clonaje múltiple, para facilitar la introducción y excisión de la construcción o fragmentos de ésta, o similares. Numerosos vectores de clonaje se encuentran disponibles, como el pBR322, la serie de pUC, etc.

Cuando la construcción esté ya preparada es posible utilizarla para la recombinación homóloga en las células diana primarias. Pueden utilizarse varias técnicas para la integración de la construcción en el genoma de las células primarias sin que sea necesario un sistema de replicación funcional en el huésped primario. Véase por ejemplo la patente americana U.S. 4.319.216, así como las referencias que se citan en el apartado "Relevant Literature". Por otra parte, la construcción puede insertarse en un vector apropiado, que generalmente tendrá un sistema de replicación viral, como el SV40, el virus del papiloma bovino, el adenovirus, o similares. El vector de secuencia de ADN lineal puede tener también un marcador seleccionable para la identificación de las células transfectadas. Entre los marcadores seleccionables se incluyen el gen neo, que posibilita la selección mediante G418, el gen tk del herpes para la selección mediante el medio HAT, el gen gpt mediante ácido micofenólico, la complementación de un huésped auxotrófico, etc.

El vector puede ser capaz o incapaz de mantenerse de forma estable en el huésped. Si el vector es capaz de mantenerse de forma estable las células se seleccionaran en base a la integración homóloga del vector en el genoma del huésped, en cuyo caso pueden utilizarse diferentes técnicas para mantener vivas las células. Si el vector no es capaz de mantenerse de forma estable, por ejemplo cuando se utiliza un sistema de replicación sensible a la temperatura, la temperatura puede cambiarse de la temperatura permisiva a la no permisiva, de manera que el vector no perjudique a las células. En este caso, sólo aquellas células en las cuales se haya integrado la construcción que comprenda el gen amplificable y, cuando esté presente, el marcador seleccionable, serán capaces de sobrevivir a la selección.

Si la construcción contiene un marcador seleccionable es posible seleccionar por su presencia mediante el marcador seleccionable. Si la construcción no contiene el marcador seleccionable es posible seleccionar por su presencia mediante el gen amplificable. En el caso de los genes neo y tk del herpes es posible utilizar un medio de crecimiento para los transformantes de aproximadamente 0,1 a 1 gr/ml de medio G418 o HAT respectivamente. Cuando el gen amplificable es DHFR el medio de selección puede incluir de aproximadamente 0,01 a 0,25 \muM metotrexato.

En el procedimiento para la recombinación homóloga el ADN se introducirá en las células primarias. Entre las técnicas que se pueden utilizar se incluyen coprecipitados de fosfato cálcico y ADN, microinyección de ADN dentro del núcleo, electroporación, fusión de protoplastos bacterianos con células enteras, transfección, policationes, por ejemplo polibreno, poliornitina, etc, o similares. El ADN puede ser de cadena simple o doble, lineal o circular. Se describen diversas técnicas para la transformación de células de mamíferos en Keown et al., Methods in Enzymology (1989), Keown et al., Methods in Enzymology (1990) Vol. 185, pp. 527-537 y Mansour et al., Nature, 336:348-352, (1988).

Es posible que en una posición 3' o 5' más allá de la región diana se halle un gen que permita determinar si ha tenido lugar un entrecruzamiento doble. Para este fin puede utilizarse el gen de la timidinquinasa del virus herpes simplex ya que es posible detectar el gen de la timidinquinasa mediante la utilización de análogos de nucleósidos, como el aciclovir o ganciclovir, a causa de sus efectos citotóxicos en células que contengan un gen HSV-tk funcional. La falta de sensibilidad a estos análogos de nucleósidos indica que la timidinquinasa no está presente y, por tanto, que si ha tenido lugar una recombinación homóloga también ha ocurrido un acontecimiento de entrecruzamiento doble.

La presencia de un gen marcador, que viene indicada por la resistencia a un biocida o por el crecimiento en un medio de selección para el gen marcador, sirve para determinar la presencia e integración de la construcción diana en el genoma del huésped. No es necesaria una segunda selección en este punto, ya que la selección se hará en el huésped de expresión secundario, en el cual es posible detectar la expresión del gen diana amplificado. Si uno lo desea, es posible determinar si la recombinación homóloga ha tenido lugar mediante la utilización de la PCR y secuenciación de las secuencias de ADN amplificadas resultantes. Si se desea, la amplificación puede realizarse en este punto, sometiendo las células primarias a un reactivo causante de amplificación adecuado, de manera que se obtengan múltiples copias del gen diana. Por otro lado, la amplificación puede realizarse más tarde en las células huésped de expresión secundarias.

Se prepara ADN de alto peso molecular, de más de 20 Kb, preferiblemente de más de 50 Kb o preferiblemente cromosomas metafásicos, a partir de una línea celular primaria en la que el vector de amplificación se haya integrado de manera correcta. Se describen técnicas de preparación y aislamiento en Nelson y Housman, en Gene Transfer (ed. R. Kucherlapati), Plenum Press, 1986. Es posible entonces introducir el ADN en las células huésped de expresión secundarias tal como se ha descrito anteriormente, mediante la utilización de las mismas o de diferentes técnicas que para las células primarias. Diferentes huéspedes de expresión de mamíferos se hallan disponibles y pueden utilizarse. Entre estos huéspedes se incluyen las células CHO, las células de riñón de mono, los fibroblastos de ratón C127, las células de ratón 3T3, las células Vero, etc. Será deseables que los huéspedes tengan un fondo negativo para el gen amplificable o un gen que responda significativamente menos al agente causante de amplificación.

Las células transformadas se cultivan en un medio selectivo que contenga aproximadamente 0,01-0,5 \muM de metotrexato y, cuando haya otro marcador, por ejemplo el gen neo, el medio puede contener de aproximadamente 0,1 a 1 mgr/ml de G418. Se aíslan las colonias resistentes y la presencia de la construcción en yuxtaposición al gen diana puede entonces analizarse. Esto puede realizarse mediante la detección de la expresión del producto génico diana en donde normalmente no se expresaría, mediante la PCR, hibridación de tipo "Southern" o similares.

Entonces las células que contienen la construcción se cultivan y se someten a selección y amplificación en medios que contienen concentraciones cada vez más altas del reactivo causante de amplificación, por ejemplo de 0,5-200 \muM de metotrexato en el caso del gen DHFR, y la producción del producto diana puede analizarse en cada paso de la selección. La multiplicación incluye una duplicación al menos, y pueden originarse al menos 5 copias, preferiblemente 10 copias o más en una disposición en tándem. Por tanto la producción de la proteína incrementará en al menos 1,5 veces en relación a la expresión a partir de una sola copia, generalmente al menos 3 veces, preferiblemente al menos 5 veces.

Los diferentes clones pueden entonces seleccionarse para la producción estable del producto diana más óptima y éstos multiplicarse y utilizarse comercialmente para la producción en cultivo. De esta manera puede obtenerse una alta producción del producto diana, sin que sea necesario aislar el mensajero y realizar las diferentes manipulaciones asociadas a la ingeniería genética o aislar el gen genómico, en cuyo caso genes muy grandes pueden suponer un gran esfuerzo de investigación y desarrollo.

Se presentan los siguientes casos a modo de ejemplo y no de limitación.

Experimental Células

Se cultivan fibroblastos diploides de piel humana normales ("receptores primarios") en medio EEMEM suplementado con un 20% de suero de feto de ternera. Se cultivan células DUKX-BII de ovario de hámster chino (CHO) deficientes en reductasa de dihidrofolato (DHFR) ("receptores secundarios") (Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 (1980)) en medio alfa suplementado con un 10% de suero bovino fetal dializado.

Vector de ADN

Se construye el vector de amplificación a partir de pUC19 (Yanisch-Perron et al., Gene 33:103-119 (1985)). Se aísla un fragmento HaeII de 1,8 Kb que contiene un gen de la fosfotransferasa de higromicina B (hph), cuya expresión está controlada por el promotor de la timidinquinasa del virus del herpes simplex (HSV tk), a partir de pHyg (Sugden et al, Mol. Cell. Biol. 5:410-413 (1985)) mediante digestión con HaeII y electroforesis en gel. Se añaden adaptadores sintéticos a este fragmento para convertir los extremos HaeII en extremos HindIII y el fragmento resultante se une a pUC19 digerido con HindIII. El plásmido resultante, pUCH, contiene el cassette de la higromicina de manera que hph y la beta-lactamasa se transcriben en orientaciones opuestas. Se aísla un fragmento SalI de 1,3 Kb que contiene un gen de la DHFR, cuya expresión está controlada por señales transcripcionales de SV40, a partir de pTND (Connors et al., DNA 7:651-661 (1988)) mediante digestión con SalI y electroforesis en gel. Este fragmento se une al pUCH digerido con SalI. El plásmido resultante, pUCD, contiene el cassette de la DHFR de manera que la DHFR y se transcriben en la misma orientación. Se aísla un fragmento BamH1 de 1,76 Kb a partir del fago F15 (Friezner Degen et al., J. Biol. Chem. 261:6972-6985 (1986)) que contiene 1,45 Kb de ADN flanqueante del inicio de transcripción del activador del plasminógeno tisular humano (t-PA), además del primer exón y parte del primer intrón de este gen, mediante digestión con BamH1 seguida de electroforesis en gel. Este fragmento se une a pUCD después de haber digerido el último con BamH1. El plásmido resultante, pUCG, contiene el promotor del fragmento t-PA en una orientación opuesta al cassette de la DHFR. El fragmento t-PA contiene un único dominio NcoI, que no es único en pUCG. Se realiza una digestión parcial con NcoI y se inserta un elemento enlazante NotI. El plásmido resultante, pCG, contiene un único dominio NotI en el fragmento t-PA, lo que posibilita la linerarización del plásmido antes de la transformación de los fibroblastos diploides humanos primarios, aumentando así la frecuencia de recombinación homóloga (Kucherlapati et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3153-3157 (1984)).

Preparación de los receptores primarios

Se introduce el plásmido pCG linearizado con NotI en los receptores primarios mediante electroporación y utilizando ADN a 10 nM. Las células resultantes se cultivan entonces en medio selectivo (EEMEM con 200 \mugr/ml de higromicina B). Se aíslan las colonias resistentes y se analizan mediante la PCR (Kim and Smithies, Nucleic Acids Res. 16:8887-8903 (1988)) utilizando como oligonucleótidos las secuencias GCGGCCTCGGCCTCTGCATA y CATCTCCCCTCTGGAGTGGA para distinguir entre las integraciones homólogas y las ocurridas al azar. La amplificación de ADN celular mediante la PCR utilizando estos dos oligonucleótidos origina un fragmento de 1,9 Kb sólo cuando ha ocurrido una integración homóloga en el ADN de las células diana. Se cultivan células que contengan el gen DHFR integrado en la región t-PA y se utilizan como fuente de material genético para la preparación de los receptores secundarios.

Preparación de los receptores secundarios

Se preparan cromosomas metafásicos (Nelson et al., J. Appl. Genet. 2:563-577 (1984)) a partir de receptores en los que se haya demostrado que ha ocurrido una recombinación homóloga con la DHFR y se utilizan entonces para transformar células CHO deficientes en DHFR mediante transferencia génica mediada por fosfato cálcico (Nelson et al., J. Appl. Genet. 2:563-577 (1984)). Se crecen las células en medio selectivo (medio alfa que contiene 200 \mugr/ml de higromicina B). Se aíslan las colonias resistentes y se analiza la expresión del t-PA humano (Kaufman et al., Mol Cell. Biol. 5:1750-1759 (1985)). Los clones de células se cultivan entonces en un medio selectivo que contiene concentraciones cada vez más altas de metotrexato (0,02-80 \muM, con aumentos de 4 veces la concentración). Después de este proceso de amplificación se recolectan las células y se analiza el t-PA humano mediante un ensayo ELISA con un anticuerpo monoclonal específico para el t-PA (Weidle and Buckel, Gene 51:31-41 (1987)). Se almacenan clones que proporcionen niveles de expresión altos del t-PA para su utilización posterior.

Aislamiento de un clon genómico que contenga secuencias para la utilización de la eritropoyetina como diana

Se obtuvo un clon a partir de la selección de una librería genómica de ADN de placenta humana en EMBL 3-SP6/T7 utilizando como sondas dos oligonucleótidos de 36 pb, 5'-CTGGGTTGCTGAGTTCCGCAAAGTAGCTGGG
TCTGG-3' y 5'- GGGGGTCGGGGCTGTTATCTGCATGTGTGCGTGCG-3', de la supuesta región promotora de la eritropoyetina humana. A partir de este clon se crearon dos subclones en pSP72 (Krieg and Melton (1987) Meth. Enzymol. 155, 397-415), uno con un fragmento BamHI-HindIII de 5 Kb de la región 5' más allá de la región codificante de EPO (pTD.1) y otro con un fragmento HindIII-BamHI de 5 Kb de la región codificante de EPO (pTD.2).

Construcción de un fragmento de ADN para la utilización de la eritropoyetina como diana

Se construyó un plásmido, pCG.1, mediante la sustitución de la región de clonación múltiple del pBluescript SK(-) (Stratagene) entre los dominios SacI y KpnI con un fragmento de ADN de cadena doble sintético de 72 pares de bases (Fig. 1). En relación a la Fig.2, se clonó entre los dominios HindIII y XbaI de pCG.1 un fragmento de 678 pb que contenía el activador y promotor del gen de expresión inmediatamente temprana del citomegalovirus humano (CMV, Boshart et al (1985) Cell 41, 521-530), que se obtuvo mediante una amplificación por la PCR del plásmido pUCH.CMV (obsequio de M. Calos, U. de Stanford) utilizando los oligonucleótidos 5'-CGCCAAGCTTGGCCATTGCATACGTT-3' y 5'-GAGGTCTAGACGGTTCACTAAACGAGCTCT-3' para crear dominios HindIII y XbaI respectivamente en los extremos del fragmento resultante. El plásmido resultante, pCG.CMV, se utilizó para construcciones posteriores.

El fragmento BstEII-XbaI de 620 pb del pTD.2 se unió, mediante un adaptador BstEII-XbaI, al pCG.CMV digerido con XbaI para crear el plásmido pCG.CMV/EPO, en el que el dominio BstEII del fragmento EPO se encuentra al lado del extremo del promotor del fragmento CMV. A continuación se clonó en el pCG.CMV/EPO un fragmento de 1,94 Kb que codificava para la resistencia a metotrexato a partir del plásmido pSV2dhfr (Subramani et al (1981) Mol. Cell. Biol. 1, 854-864) y un fragmento de 1,15 Kb que codificava para la resistencia a G418 a partir del plásmido pMClneo polyA (Thomas and Capecchi (1987) Cell 51, 503-512). El gen neo se obtuvo a partir de un fragmento XhoI-SalI y el gen dhfr se obtuvo mediante amplificación por la PCR utilizando los oligonucleótidos 5'-GGACGCGTGGATCCAGACATGATAAGATA-3' y 5'-GGACGCGTCAGCTGTGGAATGTGTGTCAG-3' diseñados para añadir dominios MluI en los extremos del fragmento resultante. Los genes neo y dhfr se clonaron en los dominios XhoI y MluI respectivamente del pCG.CMV/EPO para originar los plásmidos pCG.CMV/EPO/DHFR y pCG.CMV/EPO/Neo/DHFR de manera que se transcribieran en la misma orientación que el CMV. Finalmente se añadió el fragmento BamHI-HindIII de 5 Kb del pTD.1, mediante adaptadores ClaI, al dominio ClaI del pCG.CMV/EPO/Neo/DHFR para originar el pCG.HR1. En el pCG.HR1 el 5' del fragmento EPO de 5Kb se encuentra en la misma orientación que el 5' del fragmento BstEII-XbaI de 620 pb en relación al clon landa original.

Un fragmento de 9,54 Kb que contiene el fragmento 5' de 5Kb del fragmento EPO BamHI-HindIII, los marcadores dhfr y G418, el activador/promotor del CMV y el fragmento EPO BstEII-XbaI de 620 pb puede liberarse del pCG.HRI como un fragmento NotI o SacII. Este fragmento NotII puede utilizarse para la recombinación homóloga ya que ha sido diseñado para que sirva de estructura omega en la recombinación y contiene fragmentos homólogos de 5 Kb y 620 pb para facilitar el acontecimiento (Fig. 3).

Para la electroporación el ADN se corta primero con NotI, se extrae entonces con fenol/cloroformo y se precipita mediante la adición de etanol antes de la centrifugación. El precipitado de ADN resultante se resuspende a una concentración de 2 mgr/ml en un volumen (10 \mul) de 10 mM Tris-Hcl, 1 mM EDTA (TE).

Introducción del ADN dentro de las células

Se cultivan células de riñón embrionarias 293 humanas primarias transformadas (ATCC CRL 1573) en Cellgro DMEM H16 (Mediatech) suplementado con un 10% de suero de ternera, glutamina (2mM) y penicilina (100 U/ml)/estreptomicina (0,1 mgr/ml), a 37ºC con un 5% de CO_{2}. A una confluencia del 90% las células se preparan para la electroporación mediante la adición de tripsina, se concentran mediante una centrifugación breve y se resuspenden en PBS a una concentración de 10^{7} células/0,8 ml. Las células se equilibran a 4ºC y se añade el ADN (50 \mugr) digerido con NotI (como se ha descrito anteriormente). Se realiza la electroporación de la muestra a 960 \muF y 260 V con un Biorad Gene Pulser y se dejan las células otra vez en hielo durante 10 minutos antes de plaquearlas en una placa de 10 cm. Después de una incubación a 37ºC durante 48 horas, las células de una placa de 10 cm se distribuyen equitativamente en 5 placas de 24 pocillos en un medio que contiene G418 a 0,6 mgr/ml (concentración efectiva). En estas condiciones de electroporación 4-10 colonias/pocillo sobreviven a la selección con la droga al cabo de 2 semanas.

Detección de la recombinación homóloga mediante análisis por la PCR

Mediante la utilización del fragmento de ADN del pCG.HR1 digerido con NotI se obtiene una recombinación homóloga correcta, con la inserción de la construcción de 3,8 Kb en el locus EPO diana y la delección simultánea de 1,2 Kb de la secuencia genómica (Fig. 3). La PCR se utiliza para diferenciar los acontecimientos únicos de recombinación homóloga en el gen diana de las integraciones del ADN al azar, tal como se esquematiza en la Fig. 4. Se sintetizan dos oligonucleótidos, uno para el extremo 3' del CMV y el otro para la región 3' del dominio XbaI que se utiliza para el fragmento BstEII-XbaI de 620 pb en el ADN de la construcción. Un acontecimiento de recombinación homóloga introduce un ADN diana en el genoma a partir del cual estos oligonucleótidos originan un producto de amplificación de 860 pb.

Para llevar a cabo la identificación del acontecimiento de recombinación homóloga se utilizaron grupos de clones (de las células 293 que habían estado sometidas a electroporación), a partir de 4 pocillos cada uno (representando aproximadamente 16 colonias), mediante el tratamiento con tripsina de los pocillos y utilizando el 90% de cada pocillo. El 10% restante de cada pocillo se sembró otra vez en el pocillo. Se preparó entonces ADN genómico a partir de cada grupo de la manera que sigue. Se obtuvieron precipitados de las células de cada grupo mediante centrifugación durante 2 minutos en tubos de microcentrifugación de 1,5 ml, se resuspendieron en PBS (20 \mul), y se trataron durante 1 hora a 37ºC con una solución (400 \mul) que contenía 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, un 1% de SDS y RNAse A (40 \mugr/ml). Entonces se añadió proteinasa K (10 \mul, 10 mgr/ml) y las muestras se incubaron durante 4 horas a 50ºC. A continuación se aisló el ADN mediante extración con fuerte agitación con fenol/cloroformo (200 \mul cada uno), a continuación con cloroformo (400 \mul), adición de etanol (800 \mul) y centrifugación a 25ºC durante 10 minutos. Los precipitados de ADN se lavaron con un 70% de etanol, se secaron y se resuspendieron en tampón TE. Se obtuvo una media de 40 \mugr de ADN genómico a partir de cada muestra.

Se utilizó aproximadamente 1 \mugr de cada muestra de ADN genómico para el análisis mediante la PCR. El ADN se hirvió en un volumen (10 \mul) de TE durante 10 minutos previamente a la adición de la mezcla de la PCR (40 \mul). La reacción (50 \mul) contenía 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 a 25ºC), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl_{2}, un 0,01% de gelatina, un 0,1% de Triton X-100, 200 \muM dNTPs, 1 \muM de cada uno de los oligonucleótidos 5'-AAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCG-3' y 5'-TGAGCGTGAGTTCTGTGGAATGTG-3', y 1,5 U de la polimerasa de ADN Taq (Promega). Después de una incubación inicial a 94ºC durante 3 minutos, las muestras se sometieron a 45 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 1 minuto, hibridación a 66ºC durante 1,5 minutos y polimerización a 72ºC durante 2 minutos. Después de los 45 ciclos las muestras se incubaron otros 5 minutos a 72ºC. Una parte (20 \mul) de cada muestra se analizó en un gel del 1% de agarosa, que se corrió en TBE y se tiñó con bromuro de etidio. A partir de los 90 grupos analizados provenientes de 3 electroporaciones se identificaron 2 muestras que presentaban el fragmento del tamaño correcto según la tinción con bromuro de etidio. Se recuperó el ADN de la reacción de la PCR y se sometió a mapaje de restricción con XbaI. El producto de amplificación correcto debería, después de la digestión con XbaI, originar dos fragmentos de 669 pb y 191 pb. Las muestras de los dos grupos originaron fragmentos del tamaño correcto. Además, la muestra del grupo 1 originó otras bandas en el material no cortado.

Según el procedimiento descrito anteriormente, los cromosomas metafásicos se preparan a partir de los receptores en los que se demuestra que se ha dado recombinación homóloga con la DHFR en células CHO deficientes en DHFR. Después de aislar colonias resistentes y analizar la expresión de EPO, los clones de células se crecen en un medio selectivo que contiene concentraciones cada vez mayores de metotrexato (0,02-80 \muM), con aumentos de 4 veces la concentración. Entonces las células se recolectan, se clonan y se seleccionan en base a la producción de EPO. Se aíslan los clones que producen una cantidad al menos dos veces mayor de EPO.

Es evidente a partir de los resultados anteriores que el procedimiento sujeto de la presente invención proporciona un enfoque novedoso para la expresión de una gran variedad de genes de mamíferos de interés. El procedimiento es sencillo, sólo se necesita conocer una secuencia de aproximadamente 300 pb o más en la región del gen diana, y uno puede entonces utilizar técnicas básicamente convencionales para transferir la región amplificable a un huésped de expresión y obtener el producto génico en cantidades altas.

A pesar de que la presente invención ha sido descrita en cierto detalle a modo de ejemplo con el propósito de hacerla más comprensible, los expertos en la materia se darán fácilmente cuenta, a partir de lo que se desprende de esta invención, de que pueden realizarse ciertos cambios y modificaciones de la misma.

Claims

1. Procedimiento para la producción de proteínas de mamíferos que comprende:

producción de células huésped de expresión de mamíferos secundarias que comprenden varias copias de una región amplificable que comprende un gen diana heterólogo a dicho huésped de expresión secundario y que expresan una proteína de interés y un gen amplificable;

mediante el procedimiento que comprende:

la transformación de las células de mamíferos primarias que comprenden dicho gen diana con una construcción que comprende un gen amplificable y al menos una región flanqueante de un total de al menos aproximadamente 150 pb homológa a una secuencia de ADN del locus de la región codificante de dicho gen diana para proporcionar la amplificación de dicho gen diana, donde dicho gen amplificable está situado de manera que no interfiere con la expresión de dicho gen diana, donde dicha construcción se integra de manera homóloga en el genoma de dichas células primarias para definir una región amplificable;

la selección de células primarias que comprenden dicha construcción por medio de dicho gen amplificable u otro marcador presente en dicha construcción;

el aislamiento de fragmentos del ADN de dicho genoma a partir de dichas células primarias, donde dichos fragmentos son suficientemente grandes para incluir toda dicha región amplificable;

la transformación de células huésped de expresión secundarias con dichos fragmentos de ADN de las células primarias y el clonaje de dichas células huésped de expresión secundarias transformadas para producir clones de dichas células huésped de expresión secundarias que son distintas en dichos fragmentos de ADN presentes en dichas células huésped de expresión secundarias;

la selección de clones de dichas células huésped de expresión secundarias de mamíferos que comprenden dicha región amplificable;

el crecimiento de dichas células huésped de expresión secundarias de mamífero en donde dicho gen diana se expresa y dicha proteína es producida; y

la amplificación de dicha región amplificable por medio de un agente de amplificación, donde dicha amplificación es anterior a dicho aislamiento o posterior a dicha selección y anterior a dicho crecimiento.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, donde al menos una región flanqueante tiene dicha homología con una secuencia de ADN dentro de 50 Kb de la región codificante de dicho gen diana.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde dichos fragmentos son cromosomas metafásicos.

4. Procedimientos según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde dichos fragmentos son fragmentos de restricción.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, donde dicha construcción comprende un marcador biocida que proporciona resistencia a un biocida para dichas células huésped primarias.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, donde dicha construcción comprende además un marcador génico que está separado de dicha región amplificable por una región flanqueante homóloga.

7. Procedimiento para la producción de células para la expresión de una proteína heteróloga en cultivo, comprendiendo dicho procedimiento:

la transformación de células primarias de mamíferos que comprenden dicho gen diana con una construcción que comprende un gen amplificable y al menos una región flanqueante de al menos aproximadamente 150 pb homóloga a una secuencia de ADN dentro de 10 Kb de la región codificante de dicho gen diana, donde dicho gen amplificable está en una parte que no interfiere con la expresión de dicho gen diana, donde dicha construcción se integra de manera homóloga en el genoma de dichas células primarias para definir una región amplificable que comprende dicho gen amplificable y dicho gen diana en dicho genoma;

la transformación de células huésped de expresión secundarias con dichos fragmentos de ADN de las células primarias, donde dichas células huésped de expresión secundarias son de una especie diferente que las dichas células huésped primarias, y el clonaje de dichas células huésped de expresión secundarias transformadas para producir clones de dichas células huésped de expresión secundarias que son distintas en dichos fragmentos de ADN presentes en dichas células huésped de expresión secundarias;

la selección de clones de dichas células huésped de expresión secundarias de mamíferos que comprenden dicha región amplificable; y la amplificación de dicha región amplificable por medio de un agente de amplificación, donde dicha amplificación es anterior a dicho aislamiento o posterior a dicha selección.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha amplificación es con dichas células huésped de expresión secundarias.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dichas células primarias son células humanas.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dichas células humanas son fibroblastos diploides.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el gen amplificable es un gen de la DHFR de mamíferos.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, donde dicho gen amplificable es un gen de la DHFR mutado que tiene una Km superior a la del gen salvaje.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, donde dicha célula huésped de expresión secundaria es deficiente en DHFR.