JPH04505104A - 相同組換え法を用いてのタンパク質の生成 - Google Patents
相同組換え法を用いてのタンパク質の生成Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
17、前記細胞が悪性細胞である請求の範囲第15項記載のヒト細胞。
18、前記増幅可能な遺伝子がDHFR遺伝子である請求の範囲第15項記載の
ヒト細胞。
19、培養における哺乳類タンパク質の発現のためのヒト細胞以外の哺乳類細胞
であって、タンパク質を発現する10kbのヒト野生型遺伝子以内に増幅可能な
遺伝子を含んで成る増幅可能領域を含んで成り、ここで前記2種の遺伝子が前記
標的遺伝子に関係する実質的に単独でのヒト野生型配列及び前記増幅可能な遺伝
子に関係するフランキング配列により分離されることを特徴とする哺乳類細胞。
20、培養における異種タンパク質の発現のための細胞を生成するための方法で
あって:
増幅可能な遺伝子及び前記標的遺伝子の10kbのコード領域内のDNA配列と
相同の少なくとも約150bpの少なくとも1つのフランキング領域を含んで成
る構造体により、前記標的遺伝子を含んで成る一次哺乳類細胞を形質転換し、こ
こで前記増幅可能な遺伝子が前記標的遺伝子の発現を妨害しない部位で存在し、
それによって前記構造体がゲノムにおける前記増幅可能な遺伝子及び前記標的遺
伝子を含んで成る増幅可能な領域を定義するために前記−次細胞の前記ゲノム中
に相同的に組込まれるようになり:
前記構造体に存在する前記増幅可能な遺伝子又は他のマーカーにより、前記構造
体を含んで成る一次細胞について選択し:
前記−次細胞から前記ゲノムのDNA部分を単離し、ここで前記部分は前記増幅
可能な領域のすべてを含むのに十分な大きさであり;
前記−次細胞DNAR分により哺乳類二次発現宿主細胞を形質転換し、ここで前
記二次発現宿主細胞が前記−次宿主細胞の種とは異なる種のものであり、そして
前記二次発現宿主細胞に存在する前記DNA部分とは異なる前記二次発現宿主細
胞のクローンを生成するために前記形質転換された発現宿主細胞をクローン化し
;
前記増幅可能な領域を含んで成る前記哺乳類二次発現宿主細胞のクローンを選択
し;そして
増幅剤により前記増幅可能な領域を増幅し、ここで前記増幅が前記単離の前又は
前記選択の後に存在することを含んで成る方法。
21、前記増幅が前記二次発現宿主細胞によるものである請求の範囲第20項記
載の方法。
22、前記−次細胞がヒト細胞である請求の範囲第20項記載の方法。
23、前記ヒト細胞が二倍体繊維芽細胞である請求の範囲第22項記載の方法。
24、前記増幅可能な遺伝子が野生型遺伝子よりも高いKmを有する突然変異化
されたDHPR遺伝子である請求の範囲第20項記載の方法。
25、前記二次宿主発現細胞がDHFRHF性である請求の範囲第24項記載の
方法。
明 細 書
相同組換え法を用いてのタンパク質の生成本発明の分野は、哺乳類タンパク質の
発現である。
背景
制限酵素、クローニング、配列決定、逆転写酵素及びモノクローナル抗体の発見
は、核酸配列の単離、同定及び操作にふける高い能力をもたらした。これらの能
力の結果として、多くの遺伝子及びそれらの転写制御要素が同定され、そして操
作されて来た。遺伝子は、異種宿主(細菌及び真核生物宿主細胞系)において所
望する多量のタンパク質を生成するために使用されて来た。
多くの場合、コード配列を得、そしてそれらの発現を誘発する方法は長く且つ困
難な方法であった。コード配列、すなわちcDNA又はゲノムDNAの同定は、
時々、ライブラリーの構成、読み取り枠のフラグメントの同定、末端配列の試験
及び同様のものを包含する。イントロンが時々存在する哺乳類遺伝子において、
多くの場合、コード領域は、遺伝子に関係する全体の核酸のたった小さな画分で
ある。他の場合、偽遺伝子又は複数メンバーの遺伝子種類が、対象の特定遺伝子
を単離する能力を不明瞭にして来た。それにもかかわらず、技法が改良されるに
つれて、対象の遺伝子の好都合な同定及び単離の連続したバレートが存在して来
た。
多くの情況において、主にタンパク質生成の源に興味の対象が存在する。タンパ
ク質を生成する本体における細胞タイプは時々、不適切な源である。なぜならば
、タンパク質は低い量で生成され、タンパク質は培養において増殖されにくい分
化された宿主細胞においてのみ生成され得、又は宿主細胞、特にヒト細胞は生成
物の産生のための培養方法において経済的でなく又は効果的でないからである。
従って、所望するタンパク質の経済的且つ効果的な産生及び可能な場合、タンパ
ク質生成物の適切なプロセッシングを提供する細胞による培養にふいて対象のタ
ンパク質を産生ずるための代用の技法を開発することに有意な興味が存在する。
択可能な遺伝子に突然変異を誘発する一般的な方法を記載する。Weidle久
ff、、 Gene、 66: 193〜203(198g)は、DHFR遺伝
子による組織タイプのプラスミノーゲン活性化因子の増幅及び選択高圧力の不在
下での増幅の損失を記載する。Murnane及びYezzi、 Somati
c Ce1l and Mo1ecular Genetics。
旦:273〜286 (1988)は、転写プロモーターを欠く組込まれた選択
可能な遺伝子マーカーによるヒト細胞系の形質転換及び遺伝子マーカーのタンデ
ム重複及び増幅を記載する。Thom由来の幹細胞における標的遺伝子による特
定部位の突然変異誘発を記載する。Songなど、、 Proc、Natl、A
cad、Sci、LISA、 84:6820〜6824 (1987)は、2
段階組込みによるヒト細胞における相同組換えを記載する。Li5kayなど、
、 ’Homologous Recombi口ation Between
Repeated Chromosomal 5equences jn Mo
use Ce1ls、” Co1d Spring Harbor、Symp、
Quant、Biol、 49 : 13〜189 (1984)は、同じ遺伝
子の2種の異なった突然変異の組込み及び突然変異遺伝子間の相同組換えを記載
する。Rubnit2及びSubramani、 Mol、and Ce1l、
Biol、4 : 225:3−2258(1984)は、哺乳類細胞における
相同組換えのために必要とされる最少量の相同性を記載する。Kim and
Sm1thies、 Nucl、Ac1ds。
ての相同組換えのためのアッセイを記載する。
発明の要約
対象の哺乳類タンパク質の発現は、適切な転写物の産生の妨害を伴わないで、対
象の遺伝子付近への増幅可能な遺伝子及び他の調節配列の組込みのために相同組
換えを用いることによって達成される。増幅可能な遺伝子及び対象の遺伝子を含
んで成る領域は増幅され得、そのゲノムはフラグメント化され、そして標的のタ
ンパク質の発現のために発現宿主に直接的又は間接的にトランスファーされ得る
。前もって増幅されていない場合、標的領域は増幅され、そして細胞集団が標的
タンパク質を生成する細胞についてスクリーンされる。標的タンパク質を高く且
つ安定したレベルで産生ずる細胞が拡張され、そして標的タンパク質の発現のた
めに使用される。
図面の簡単な説明
第1図は、変性されたポリリンカーの配列を示すプラスミドpCG、1の図であ
り;
CG、HRIからのDNAによる相同組換えによりEPO遺伝子座の標的決定の
結果の図であり;
第4図は、相同組換え出来事が生じた細胞から産生されたPCR増幅フラグメン
トの図である。
特定の態様の記載
培養において対象の哺乳類タンパク質を産生ずるための方法及び組成物が提供さ
れる。その方法は、対象のタンパク質をコードする標的遺伝子の付近に増幅可能
な遺伝子を組込むために宿主細胞における相同組換えを利用する。増幅可能な遺
伝子及び標的遺伝子の両者を含む領域は、増幅可能領域として言及されるであろ
う。得られた形質転換された一次細胞は、増幅のために選択する条件にゆだねら
れ、又はその増幅が続いて行なわれ得る。“形質転換”とは、形質転換、トラン
スフェクト、形質導入、接合、融合、エレクトロポレーション又は活性細胞中に
DNAを導入するためのいづれか他の技法を包含する。次に、形質転換された細
胞の染色体又はDNAが、増幅可能な領域を二次発現宿主細胞のゲノム中にトラ
ンスファーするために使用され、ここで前もって十分に又はまったく増幅されて
いない場合、標的領域はさらに増幅される。得られた細胞系は標的タンパク質の
産生のためにスクリーンされ、そして二次細胞系が所望する産生レベルのために
選択され、そしてこの細胞は拡張され、そして培養にふいて所望するタンパク質
の産生のために使用され得る。
−次細胞は、いづれかの対象の哺乳類細胞、特に培養において容易に増殖しない
哺乳類細胞、より特別には霊長類細胞、特定にはヒト細胞(ここでヒト細胞は正
常な細胞、たとえば胚又は悪性細胞、特に正常な細胞である)であり得る。種々
の細胞タイプ、たとえば繊維芽細胞、特に二倍体皮膚繊維芽細胞、リンパ球、上
皮細胞、ニューロン、内皮細胞又は他の体細胞又は生殖細胞が一次細胞として使
用され得る。皮膚繊維芽細胞が特に興味の対象であり、これは多数の正常細胞、
胎児の腎細胞及び同様のものを提供するために容易に増殖され得る。これらの細
胞は対象の遺伝子を発現することができ又は発現することができなくても良い。
標的遺伝子が誘発可能であり、又は一定の分化された細胞に単に発現される場合
、標的遺伝子が発現される細胞を選択することができ、これは培養において増殖
できる固定化された細胞を要する。
選択料の適切な使用により、ゲノムに組込まれた遺伝子が隣接するフランキング
DNAにより増幅されるであろう多くの増幅可能遺伝子が存在する。増幅可能遺
伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、メタロチオネイン−■及び■、好ましくは
霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボ
キシラーゼ、等を包含する。増幅可能遺伝子は、特に増幅が一次宿主で使用され
又は増幅可能遺伝子がマーカーとして使用される場合、二次又は発現宿主におい
て機能し、そして所望には一次宿主において機能する転写シグナルを有するであ
ろう。
標的遺伝子は、前記列挙遺伝子への連続した添加により同定され、そして単離さ
れた多くの対象のタンパク質をすでに有する対象のいづれかの遺伝子であり得る
。対象のタンパク質は、シトキン(cytokines) 、たとえばインター
ロイキン1−10;成長因子、たとえばEGF、FGF、PDGF、 及びTG
F ;ソマトトロピン;成長ホルモン;コロニー刺激因子:たとえばG−、M−
、及びGM−C3F;エリトロポエチン:プラスミノーゲン活性化因子;たとえ
ば組織及び尿;酵素、たとえばスーパーオキシドジスムターゼ;インターフェロ
ン;T−細胞受容体;表面膜タンパク質:インシュリン;リポタンパク質;α1
−抗トリブシン;CDタンパク質、たとえばCD3,4.8.19;血餅因子、
たとえば第■C因子及びvon Willebrands因子:抗血餅因子、た
とえばプロティンC:心房ナチュレチック(naturetic)因子:腫瘍壊
死因子;輸送タンパク質;回帰受容体(homing receptors);
アトレシン(addressins);調節タンパク質:等を包含する。
相同組換えのためには、増幅可能遺伝子が標的領域のDNAと相同のDNAを1
端又は両端上に有するであろう構造体が調製されるであろう。相同DNAは標的
遺伝子の転写された領域の100 kb、通常50kb、好ましくは約25kb
以内であり、より好ましくは標的遺伝子の2kb以内であろう。遺伝子とは、成
熟mRNAの転写のために必要とされるコード領域及びそれらの配列を意味する
。相同DNAは、エンハンサ−配列、転写開始配列、これらの配列の5′領域又
は同様のものを含んで成る5′−上流領域を含むことができる。相同領域は、コ
ード領域の一部を含むことができ、ここで前記コード領域は読み取り枠又はエキ
ソン及びイントロンの組合せのみから成る。相同領域はイントロンのすべて又は
一部を含んで成り、ここで1又は複数のエキソンのすべて又は一部がまた存在す
ることができる。他方、相同領域は、転写終結領域のすべて又は一部、又はこの
領域の3′領域を包含するために3′−領域を含むことができる。相同領域は標
的遺伝子のすべて又は一部にわたって拡張し、又は転写調節領域及び/又は構造
遺伝子のすべて又は一部を含んで成る標的遺伝子の外側に存在することができる
。大部分、相同配列は増幅可能遺伝子に近い方で又は末端の方で連結されるであ
ろう。通常、標的遺伝子に通常関係する野生型配列以外の配列が、増幅可能遺伝
子の少なくとも片側上増幅可能遺伝子から相同配列を分離するために使用される
であろう。その配列のある部分は、増幅可能遺伝子に関係する操作の結果として
、その増幅可能遺伝子に関係する5′又は3′配列であり得る。
増幅可能遺伝子を両端に有する相同領域は、標的領域と同される。たとえば、標
的遺伝子のための転写開始領域を変えることが所望され、その結果、相同領域の
一部は、標的遺伝子の野生型5′領域とは異なるヌクレオチドを含む。他方、野
生型開始領域と構造遺伝子との間に野生型開始領域とは異なる転写開始領域の挿
入を提供することができる。同様に、構造遺伝子中に種々の突然変異体を導入す
ることが所望され、その結果、相同領域は、コードされたタンパク質における変
化をもたらすミスマツチを含んで成る。たとえば、シグナルリーダー配列は、標
的タンパク質発現生成物の分泌を提供するために標的遺伝子と読み枠を整合して
導入されるであろう。
他方、標的遺伝子の3′領域、たとえば未翻訳領域、ポリアデニル化部位、等を
変えることができる。従って、相同組換えにより、野生型プロモーターの転写調
節下で野生型タンパク質を発現するために、標的遺伝子の組込み性の維持を提供
することができ、又は標的遺伝子の転写調節、プロセッシング又は配列の変化を
提供することができる。多くの場合、転写開始領域に対してシンハンサーを導入
することが所望され、これは、たとえば転写開始調節領域から上流の領域に又は
イントロン又は標的遺伝子からさらに下流に前記エンハンサ−に関係する増幅可
能遺伝子を組込むことによって提供され得る。
本発明の構造体を調製するためには、相同組換えのために標的とされる配列を知
ることが必要であろう。ゲノムにおける配列に相補的な14個の塩基の配列が相
同組換えのために提供することができることが報告されているが、通常、個々の
両端配列は少なくとも約150bpであり、そして12kb又はそれ以上、通常
約8kb以下である。その両端領域の大きさは、既知配列の大きさ、突然変異誘
発が関与したとしても、組込みのための部位に対して相同性を有するゲノム中の
配列の数及び突然変異誘発のための領域の分離の程度、組込みのための特定の部
位又は同様のものにより決定されるであろう。
組込み構造体は従来の手段に従って調製され得、ここで配列が合成され、天然源
から単離され、操作され、クローン化され、連結され、インビトロ突然誘発にゆ
だねられ、プライマー修復し、又は同様に処理され得る。種々の段階で、その連
結された配列はクローン化され得、そして制限分析、配列決定又は同様のものに
より分析され得る。通常、その構造体は、原核生物宿主、たとえばE、 コリに
おいて機能する複製システム及び選択のためのマーカー、たとえば耐殺生物剤、
栄養要求宿主への相補性、等を含んで成るクローニングベクター上に担持される
であろう。他の機能的な配列、たとえば前記構造体又はその一部の導入及び切り
出しを容易にするためのボ+J IJンカー又は同様のものがまた存在する。多
くのクローニングベクター、たとえばpBR322、pUCシリーズ、等が利用
できる。
構造体が調製された後、次にそれは、−次細胞標的における相同組換えのために
使用され得る。種々の技法が、−次宿主において機能的な複製システムに連結さ
れないで、−次細胞のゲノム中にその構造体を組込むために使用され得る。たと
えば、アメリカ特許第4.319.216号並びに関連文献セクションにおいて
引用された文献を参照のこと。他方、構造体は、通常ウィルス複製システムを有
する適切なベクター、たとえばSV40、ウシ乳頭腫ウィルス、アデノウィルス
又は同様のウィルス中に挿入され得る。線状DNA配列のベクターはまた、トラ
ンスフェクトされた細胞を同定するために選択可能なマーカーを有する。選択可
能なマーカーは、G418による選択を可能にするネオ遺伝子、HAT媒体によ
る選択のる。
ベクターは宿主において安定して維持され得ても、又はされ得なくても良い。ベ
クターが安定して維持される場合、細胞は、宿主のゲノム中へのベクターの相同
組込みのためにスクリーンされ、ここで細胞を治癒するための種々の技法が使用
され得る。ベクターが安定して維持され得ない場合、たとえば温度感受性複製シ
ステムが用いられる場合、細胞がベクターにより治癒され得るように許容温度か
ら非許容温度に温度を変えることができる。この場合、増幅可能遺伝子及び存在
する場合、選択可能マーカーを含んで成る構造体の組込みを有するそれらの細胞
のみが選択を生存することができる。
選択可能なマーカーが存在する場合、その選択可能なマーカーにより構造体の存
在について選択することができる。選択可能なマーカーが存在しない場合、増幅
可能な遺伝子により構造体の存在について選択することができる。ネオ遺伝子/
m LのG418又はHAT培地の形質転換体の増殖のだめの培地を使用する
ことができる。DHFRが増殖可能遺伝子である場合、選択培地は約0.01〜
0.25−のメ2−レキセードを含むことができる。
相同組換えを実施する場合、DNAが一次細胞中に導入されるであろう。使用さ
れ得る技法は、リン酸カルシウム/DNA同時沈殿物、核中へのDNAのマイク
ロインジェクション、エレクトロポレーション、損なわれていない細胞との細菌
性プロトプラストの融合、トランスフェクション、ポリカチオン、たとえばポリ
ブレン、ポリオルニチン、等、又は同様のものを包含する。DNAは一本鎖又は
二本鎖、線状又は環状のものであり得る。哺乳類細胞を形質転換するための種々
の技法のためには、Keownなど、、 Method in Enzynol
ogy(1989)、 Keownなど、、 Methods and f!n
zyno1ogy(1990)第185巻、527〜537ページ及びMans
ourなど、、 Nature、 336 :348〜352 (1988)を
参照のこと。
標的領域から上流及び又は下流で、構造体は二重交差が生じたかの同定を提供す
る遺伝子であり得る。このためには、ヘルペス単純ウィルスのチミジンキナーゼ
遺伝子が、使用され得る。なせならば、チミジンキナーゼ遺伝子の存在は、機能
的なH5V−tk遺伝子を含む細胞上への細胞毒性効果のためにヌクレオシド類
似体、たとえばアシクロバー(a c yclovir)又はガンシクロバー(
gancyclovir)の使用により検出され得るからである。これらのヌク
レオシド類似体への感受性の不在は、チミジンキナーゼの不在を示し、そして従
って、相同組換えが生じた場合、二重交差がまた生じたことを示す。
殺生物剤への耐性又はマーカー遺伝子の存在のために選択する培地においての増
殖により明らかなようにマーカー遺伝子の存在は、標的構造体の存在及び宿主ゲ
ノム中へのその組込みを確立する。この時点でさらに選択は行なわれる必要がな
い。なぜならばその選択は、増幅された標的遺伝子の発現が検出され得る場合、
二次発現宿主において行なわれるであろうからである。所望により、相同組換え
がPCRを用い、そしてその得られた増幅されたDNA配列を配列決定すること
によって生じたかどうかを決定することができる。所望により、増幅は、適切な
増幅用試薬により一次細胞をストレスすることによって、この時点で行なわれ得
、その結果、複数コピーの標的遺伝子が得られる。他方、増幅は二次細胞発現宿
主へのトランスファーを待つことができる。
約20kb以上、好ましくは約50kb以上の高分子量DNA又は好ましくは中
期染色体は、増幅ベクターの適切な組込みを有する一次受容細胞株から調製され
る。調製及び単離技法は、Ne1son及びHousman、 Gene Tr
ansfer(R,Kuct+erlapati)PIenum Press、
1986により記載される。次に、DNAは、−次細胞のために使用されるの
と同じ又は異なった技法を用いて、二次宿主発現細胞中に上記と同じ態様で導入
され得る・種々の哺乳類発現宿主が利用でき、そして使用され得る。これらの宿
主は、CHO細胞、サル腎細胞、C127マウス繊維芽細胞、3T3マウス細胞
、Vero細胞、等を包含する。所望には、宿主は、増幅可能な遺伝子、又は増
幅剤に実質的にほとんど応答しない遺伝子のために負のバックグラウンドを有す
るであろう。
形質転換された細胞は約0.01〜0.5−のメトトレキセートを含む選択培地
で増殖され、そして他のマーカー、たとえばネオ遺伝子が存在する場合、その培
地は約0.1〜lll1g/mlのG418を含むことができる。耐性コロニー
が単離され、そして次に、標的遺伝子に対して並置しての構造体の存在について
分析され得る。これは、標的遺伝子生成物の発現の検出の結果として存在し、こ
こで通常、標的遺伝子生成物、PCHの使用、サザンハイプリダイゼーション又
は同様のものに対して負のバックグラウンドが存在するであろう。
次に、その構造体を含む細胞が拡張され、そして漸進的に高濃度の増幅試薬、た
とえばDHPR遺伝子のために0.5〜200−のメトトレキセートを含む培地
による選択及び増幅にゆだねられ、そして個々の選択段階で、標的生成物の産生
について分析され得る。拡張は、少なくとも重複を包含し、そして少なくとも5
個のコピー、好ましくは10個のコピー又はそれ以上のコピーをタンデム関係で
もたらすことができる。従って、タンパク質生成は、単一のコピーからの発現か
ら少なくとも185倍、通常少なくとも3倍、好ましくは少なくとも5倍に高め
られるであろう。
次に種々のクローンが標的生成物の最適な安定した産生のためにスクリーンされ
得、そして次にこれらのクローンが拡張され、そして培養での産生のために商業
的に使用され得る。
この態様においては、高い収率の生成物を、そのメツセージを単離する必要性を
伴わないで及び遺伝子工学に関する種々の操作を行なわないで又はゲノム遺伝子
を単離しないで得ることができ、ここでひじょうに大きな遺伝子が主要研究及び
開発努力であり得る。
次の例は例示的であって、本発明を限定するものではない。
正常なヒト二倍体皮膚繊維芽細胞(“−次受容体”)を、20%ウシ胎児血清に
より補充されたEEMEM培地中で増殖する。ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DH
FR)欠失性チャイニーズハムスター卵巣(CHO)PUKK−B11細胞(U
rlaub及びChasin、 Proc、 Natl、 Acad、5ci−
USA 77 : 4216〜4220 (1980) ) (“二次受容体”
)を、10%の透析されたウシ胎児血清により補充されたα−培地中で増殖する
。
DNAベクター
増幅ベクターを、POCl2 (Yan 1sch−Perronなど、、 G
ene 33 :103〜119 (1985) )から構成する。ヘルペス単
純ウィルスのチミジンキナーゼ(H3V tk)プロモーターにより誘導された
ヒグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ遺伝子(hph)を含む1.8 k
bのHaeIIフラグメントを、pHyg (Sugdenなど、、 Mol、
Ce11.Biol、5 : 410〜413(1985))からHae■によ
る消化及びゲル電気泳動により単離する。合成アダプターとこのフラグメント上
に付加し、)(aeII末端をHindIII末端に転換し、そして得られたフ
ラグメントをHind■により消化されたPOCl2に連結する。その得られた
プラスミドpUCHは、hph及びβ−ラクタマーゼの転写が反対方向で存在す
るようなヒグロマイシンカセットを含む。
SV40転写シグナルにより誘導されたDHFR遺伝子を含ル電気泳動により単
離する。得られたプラスミドpUCDは、DHPRが同じ方向に転写されるよう
にDHFRカセットを含む。第1エキソン及びその第4イントロンの一部の他に
、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子(t−PA)の転写開始を両端に有する
L45kbのDNAを含むファージF15(Friezner Degenなど
+I J、Rial、Chem、 261 : 6972〜6985(1986
)からの1.76kbのHamHIyラグメントを、HamHI消化の後、ゲル
電気泳動により単離する。このフラグメントを、BarnHrによりpUCDを
消化した後、それに連結する。
得られたプラスミドpUCGは、DHFRカセットの反対の方向に配向されたt
−PAフラグメントのプロモーターを有する。そのt−PAフラグメントは、p
UCGに対して独得でない単一のNco1部位を含む。NcoIによる部分消化
を行ない、そしてNotIリンカ−を挿入する。その得られたプラスミドpCG
は、相同組換えの頻度を高めるために一次ヒト二倍体繊維芽細胞の形質転換の前
、そのプラスミドの線状化を可能にするt−PAフラグメントにおけるユニーク
NotI部位を含む(Kucherlapatiなど、、 Proc、Natl
、Acad。
でDNAを用いてのエレクトロポレーションにより一次受容体中に導入する。次
にその得られた細胞を選択培地(200IIIl/IIIIのヒグロマイシンB
を有するEEMEM)中で増殖する。耐性コロニーを単離し、そしてランダム組
込み体と相同組込み体とを区別するために、プライマーとして配列GCGGCC
TCGGCCTCTGCATA及びCATCTCCCCT(1’TGGAGTG
GAを用いてPCR(Kjay及びSa+1thies、 Nucleic A
c1ds Res、 16 : 8887〜8903(1988))により分析
する。これらの2種のプライマーを用いてのPCRによる細胞DNAの増幅は、
正しく標的決定された細胞からのDNAが存在する場合のみ、1.9kbのフラ
グメントを生成する。t−FA領域中に組込まれたDHFR遺伝子を含む細胞を
拡張し、そして二次受容体の調製のための遺伝子材料の源として使用する。
二次受容体の調製
中期染色体を、DHFRを有する、相同組換えを示す受容体から調製しくNe1
sonなど、、 J、Mo1.Appl、Genet、2 : 563〜577
(1984) )、そして次に、リン酸カルシウム介在遺伝子トランスファー
によりDHFR−欠失CHO細胞中で形質転換する(Nelsonなど、、 J
、Mo1.Appl、Genet、2 : 563〜577(1984) )。
次にその細胞を、選択培地(200層/mlのヒグロマイシンBを含むα−培地
)中で増殖する。耐性コロニーを単離し、そしてヒ)t−PAの発現について分
析する(KaufmanfLζ、、 Mol、Ce11.Biol、5 : 1
750〜1759(1985)) 、次にその細胞クローンを、漸進的に高い濃
度のメトトレキセート(0,02〜80JI?11段階により4倍に濃度が上昇
する)を含む選択培地中で増殖する。この増殖工程の後、細胞を収穫し、そして
ヒトt−PAを、t−PAに対して特異的なモノクローナル抗体によるEL I
SAアッセイを用いて分析する(Weidie及びBucket、 Gene
51 : 31〜401987)) 、高レベルのt−PAの発現を提供する
クローンを、続く使用のために貯蔵する。
クローンを、ヒトエリトロポエチンの推定されるプロモーター領域に対する2種
の36bpのオリゴヌクレオチドプローブ
5 ’ −CTGGGTTGCTGAGTTCCGCAAAGTAGCTGGG
TCTGG −3’及び5 ’ −CGGGGGTCGGGGCTGTTATC
TGCATGTGTGCGTGCG−3’を用いて、EMBLにおけるヒト胎盤
DNAゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得る。このクロー
ンから2つのサブクローンをpSP72 (Kr ieg及びMelton(1
987)Meth、 Enzymol、 155397〜415)に創造し、こ
こで1つのサブクローンは、EPO(pTD、1)のコード領域の上流の領域が
らの5kbのBarnHI−HindIIIフラグメントを含み、そして他の1
つのサブクローンはEPO(pTD、2)をコードする5kbのHindIII
−BamHIフラグメントを含む。
エリトロポエチンを標的化するためのDNAフラグメントの構成
プラスミドpCG、1を、5acIとKpn 1部位との間のpBluescr
ipt SK (−) (Stratagene)のポリリンカーと合成二本鎖
の72塩基対DNAフラグメント(第1図)とを置換することによって構成した
。第2図に関しては、得られたフラグメントの末端上にそれぞれHindIII
及び、XbaI部位を構成するためにオリゴヌクレオチドプライマー5 ’ −
CGCCAAGCTTGGCCATTGCATACGTT−3’及び5 ’ −
GAGGT[:TAGACGGTTCACTAAACGAGCTCT−3’を用
いて、プラスミドpUcH0CMV(M、(1:alos、 5tanford
口、のギフト)のPCR増幅により得られたヒトサイトメガロウィルス(CMV
、 Boshartなど、、(1985) Ce1l 41.521〜530)
の初期遺伝子のエンハンサ−及びプロモーターを含む678bpのフラグメント
が、pCG、1中のHindIIIとXba1部位との間にクローン化された。
得られたプラスミドpCG、CMVを、追加の構成のために使用した。
pTD、2からの620bpのBs tEII −Xba Iフラグメントを、
Bs tEII−Xba Iアダプターの使用によりXbaIにより制限された
pCG−CMVに連結し、プラスミドpCG、CMV/EPOを創造し、ここで
EPOフラグメントのBstEII部位はCMVVフラグメントのプロモータ一
端の次に存在する。pcc、CMV/EPO中に、プラスミドpsV2dhfr
(Sabrama旧など(1981)Mol、Ce1l、Biol、1.854
〜864)からの耐メトトレキセート性をコードする1、 94 kbのフラグ
メント及びプラスミドpMc1neoポリA (Thomas及びCapecc
hi(1987)Cell 51.503〜512)からの耐G418性をコー
ドするL15kbのフラグメントを連続的にクローン化した。
ネオ遺伝子をXhoT−3al■フラグメントとして得、そしてdhfr遺伝子
を、得られるフラグメントの末端でMluI部位を付加するように企画されたプ
ライマー5 ’ −GGACGCGTGGATCCAGACATGATAAGA
TA −3’及びMV/EPOのそれぞれのXhoI及びM I u I部位中
にクローンし、それらの転写がCMVの方向と同じ方向で存在するようにブ5
スミ)’pCG、CMV /EPO/ DHPR及びp[:G、CMV / E
PO/ Neo /DHPRを得た。最後に、pTD、1からの5kbのBam
HI −Hi n dII[7ラグメントを、pCG、CMV /EPO/Ne
o/DHPRのClaI部位でC1aIアダプターを通して付加し、pCG、H
RIを得た。pCG、HRIにおいては、5′の5kbのEPOフラグメントは
、起源のλクローンに関して、620bpのBstEII−XbaIフラグメン
トの配向と同じ配向で存在する。
5′の5kbのBarnHI−HindIIIEPOフラグメント、dhfr及
びG41 g?−カー、CMVxンハンサー/プロモーター及び620bpのB
s tEII−Xba IEPO7ラグメントを含む9.54 kbのフラグメ
ントを、NotI又は5acIIフラグメントとしてpcc、HRIから放した
。このNotIフラグメントは、それが出来事(第3図)を促進するために5k
b及び620bpの相同性を有するオメガ構造体として組換えで作用するように
企画される場合、相同組換えのために使用され得る。
エレクトロポレーションに関しては、まずDNAをNotIにより切断し、次に
フェノール/クロロホルムによす抽出し、そして遠心分離の前、エタノールの添
加により沈殿せしめた。得られたDNAペレットを、100Mのトリス−HCl
。
1mMのEDTA (TE)の体積(10it1)中に2mg/a+1の濃度で
再懸濁した。
細胞中にDNAの導入
形質転換された一次ヒト293胎児腎細胞(ATCCCRL 1573)を、1
0%ウシ血清、グルタミン(2mM>及びペニシリン(100U/ml) /ス
トレプトマイシン(0,1mg/ml)により補充されたCellgro DM
EM HI3(Mediatech)中に培養し、そして5%CO2中で37℃
で増殖した。90%の集密度で、細胞を、トリプシン処理、短い遠心分離による
濃縮及び107細胞10.8mlでPBS中への再懸濁よりエレクトロポレーシ
ョンのために調製した。その細胞を4℃で平衡化し、そしてNotIにより制限
されたDNA (50g)(上記のようにして)を添加した。その混合物を、B
io Rad Gene Pu1serによリ960μF及び260Vでエレク
トロボレート処理し、そして次に10cmの皿上にプレートする前、10分間再
び氷で冷却した。37℃で48時間のインキュベーションの後、10cmの皿か
らの細胞を、0.6 mg/+nl (有効濃度)で0418を含む培地中の5
種の24−ウェルプレートにそって平等に分けた。これらのエレクトロポレーシ
ョン条件下で、4〜lO個のコロニーが2週間の薬物選択後、ウェル当り生存す
る。
PCR分析による相同組換えの検出
pCG、HRIからのNotl制限DNAを用いて、好結果をもたらす相同組換
えを、1.2kbのゲノム配列(第3図)を同時に欠失しながら、標的EPO遺
伝子座での3.8kbの構造体の挿入により得る。PCRを用いて、第4図に示
されるように、独得の標的出来事対DNAのランダム組込みを検出する。2種の
プライマーを合成し、ここで1つのプライマーはCMVの3′末端に合成され、
そして他のプライマーは標的DNAにおける620bpのBs tEII−Xb
a Iフラグメントのために使用されるXba I部位の方での領域3′に合成
される。相同組換え出来事は、ゲノムにDNA標的を生成し、これからこれらの
プライマーが860bpの増幅生成物を生成する。
標的出来事を検出するために、4個のウェルのそれぞれ(約16個のコロニーを
示す)からのクローン(エレクトロボレートされた293個の細胞からの)のプ
ールを、ウェルをトリプシン処理し、そしてプールのために個々の90%のウェ
ルを用いることによって生成した。残る10%の個々のウェルを、前記ウェル中
に再接種した。次にゲノムDNAを次の通りに個々のプールから調製した。個々
のプール中の細胞を、1.5mlのマイクロ遠心分離管で2分間の遠心分離によ
りペレット化し、PBS (20IXI)中に再懸濁し、そして10IoMのト
リス−ICl (pH7,5) 、100mMのNaC1,5mMのEDTA、
1%のSDS及びR,N、、@A (40ag/ml>を含む溶液(400d)
により37℃で1時間処理した。次に、プロティナーゼK (104,10mg
/ml)を添加し、そしてサンプルを50℃で4時間インキュベートし、その後
、フェノール/クロロホルム(それぞれ200I!l)、次にクロロホルム(4
00,d)と共に激しく撹拌することにより抽出し、エタノール(800d)を
添加し、そして25℃で1゜分間撹拌した。DNAベレットを70%エタノール
により洗浄し、乾燥せしめ、そしてTE(20itl)中に再懸濁した。
平均40gのゲノムDNAを個々のサンプルから一部た。
ゲノムDNAの個々のサンプル約IRをPCR分析のために使用した。TEの1
0I!1体積中、DNAを10分間煮沸し、その後PCR混合物(40d)を添
加した。その反応物(501!1)は、10mM(7) トIJ ス−HC1(
25℃でpH9,0)、50mMのKCI、1.5mMのMgCL 、0.01
%のゼラチン、0.1%TritonX−100,200MのdNTP、それぞ
れ1声のプライマー:
5 ’ −AAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCG−3’及び5
’ −TGAGCGTGAGTTCTGTGGAATGTG−3’ 、及び1.
5Uの4℃で3分間の初期インキュベーションの後、サンプルを、94℃で1分
間の変性、66℃で1.5分間のアニーリング及び72℃で2分間の拡張の45
回のサイクルにゆだねた。45回のサイクルの最後で、サンプルを72℃でさら
に5分間インキュベートした。個々のサンプルの一部(20m)を、TBE中で
作動される1%アガロースゲル上で分析し、そしてエチジウムプロミドにより染
色した。3回のエレクトロポレーションから分析された90個のプールのうち、
正しいサイズのフラグメントを示した2種のサンプルをエチジウムプロミド染色
により同定した。PCR反応からのDNAを回収し、そしてXba Iによる制
限マツピングにゆだねた。正しい増幅生成物は、)(ba Iによる処理に基づ
いて、2種のフラグメント、669bp及び191bpを生成する。2種のプー
ルからのサンプルは両者とも、正しいサイズのフラグメントを生成した。さらに
、プール1かのサンプルは末カット材料で他のバンドを示す。
前記方法に従って、中期染色体を、DHFHによる相同組換えを示す受容体から
調製し、そしてDHFR欠失CHO細胞中で形質転換する。耐性コロニーを単離
し、そしてEPOの発現について分析した後、細胞クローンを、濃度で4倍の上
昇の段階を伴って、漸進的に高い濃度のメトトレキセート(0,02〜80−)
を含む選択培地中で増殖する。次に細胞を収穫し、クローン化し、そしてEPO
の産生のためにスクリーンする。少なくとも2倍のEPO産生の増強を提供する
クローンを単離する。
本発明の方法は対象の広範囲の種類の哺乳類遺伝子の発現への新規アプローチを
提供することは、上記結果から明らかである。その方法は、単純であり、標的遺
伝子の領域における約300bp又はそれ以上の配列の知識を要するのみであり
、そして次に発現宿主に増幅可能な領域をトランスファーするために実質的に従
来の技法を使用することができ、そして高い収率で所望する生成物の産生ずるこ
とができる。
本明細書に引用されるすべての出版物及び特許は、それぞれ個々の出版物又は特
許出願が引用により導入されていることを特別に及び個々に示しているかのよう
に、引用により本明細書に組込まれる。
前述の発明は、明確に理解するために例示的及び測的い゛くらか詳細に記載され
ているけれども、特許請求の範囲内で修飾及び変更を行なうことができる。
FIG、 4
国際調査報告
Claims (25)
- 1.哺乳類タンパク質を生成するための方法であって:二次発現宿主に相同の標 的遺伝子を含んで成り、そして対象のタンパク質及び増幅可能な遺伝子を発現す る増幅可能な領域の複数コピーを含んで成る哺乳類の二次発現宿主細胞を増殖す ることを含んで成り、それによって前記標的遺伝子が発現され、そして前記タン パク質が生成され;ここで前記二次宿主発現細胞が: 前記標的遺伝子の増幅を提供するために、増幅可能な遺伝子及び前記標的遺伝子 のコード領域の遺伝子座でのDNA配列と相同の合計少なくとも約150bpの 少なくとも1つのフランキング領域を含んで成る構造体により前記標的遺伝子を 含んで成る一次哺乳類細胞を形質転換し、ここで前記増幅可能な遺伝子が前記標 的遺伝子の発現を妨害しない部位で存在し、それによって前記構造体が増幅可能 な領域を定義するために前記一次細胞のゲノム中に相同的に組込まれるようにな り; 前記構造体に存在する前記増幅可能な遺伝子又は他のマーカーにより、前記構造 体を含んで成る一次細胞について選択し; 前記一次細胞から前記ゲノムのDNA部分を単離し、ここで前記部分は前記増幅 可能な領域のすべてを含むのに十分な大きさであり; 前記一次細胞DNA部分により二次発現宿主細胞を形質転換し、そして前記二次 発現宿主細胞に存在する前記DNA部分とは異なる前記二次発現宿主細胞のクロ ーンを生成するために前記形質転換された発現宿主細胞をクローン化し;前記増 幅可能な領域を含んで成る前記哺乳類二次発現宿主細胞のクローンを選択し;そ して 増幅剤により前記増幅可能な領域を増幅し、ここで前記増幅が前記単離の前又は 前記選択の後及び前記増殖の前に存在することを含んで成る方法により生成され ることを特徴とする方法。
- 2.前記増幅可能な遺伝子が哺乳類DHFR遺伝子である請求の範囲第1項記載 の方法。
- 3.前記部分が中期染色体である請求の範囲第1項記載の方法。
- 4.前記部分が制限フラグメントである請求の範囲第1項記載の方法。
- 5.前記一次細胞がヒト細胞である請求の範囲第1項記載の方法。
- 6.前記ヒト細胞が繊維芽細胞である請求の範囲第5項記載の方法。
- 7.前記構造体が前記一次宿主細胞のために殺生物剤に対する耐性を提供する殺 生物性マーカーを含んで成る請求の範囲第1項記載の方法。
- 8.哺乳類タンパク質を生成するための方法であって:増幅可能な遺伝子及び前 記標的遺伝子の50kbのコード領域内のDNA配列と相同の少なくとも約15 0bpの少なくとも1つのフランキング領域を含んで成る構造体により、前記標 的遺伝子を含んで成る一次哺乳類細胞を形質転換し、ここで前記増幅可能な遺伝 子が前記標的遺伝子の発現を妨害しない部位で存在し、それによって前記構造体 がゲノムにおける前記増幅可能な遺伝子及び前記標的遺伝子を含んで成る増幅可 能な領域を定義するために前記一次細胞の前記ゲノム中に相同的に組込まれるよ うになり; 前記構造体に存在する前記増幅可能な遺伝子又は他のマーカーにより、前記構造 体を含んで成る一次細胞について選択し; 前記一次細胞から前記ゲノムのDNA部分を単離し、ここで前記部分は前記増幅 可能な領域のすべてを含むのに十分な大きさであり; 前記一次細胞DNA部分により哺乳類二次発現宿主細胞を形質転換し、ここで前 記二次発現宿主細胞が前記一次宿主細胞の種とは異なる種のものであり、そして 前記二次発現宿主細胞に存在する前記DNA部分とは異なる前記二次発現宿主細 胞のクローンを生成するために前記形質転換された発現宿主細胞をクローン化し ; 前記増幅可能な領域を含んで成る前記哺乳類二次発現宿主細胞のクローンを選択 し; 増幅剤により前記増幅可能な領域を増幅し、ここで前記増幅が前記単離の前又は 前記選択の後に存在し;そして前記増幅可能な領域の複数のコピーを含んで成る 前記二次発現宿主細胞を増殖し、これによって前記標的遺伝子が発現され、そし て前記タンパク質が生成されることを含んで成る方法。
- 9.前記増幅が前記二次発現宿主細胞によるものである請求の範囲第8項記載の 方法。
- 10.前記一次細胞がヒト細胞である請求の範囲第8項記載の方法。
- 11.前記ヒト細胞が二倍体繊維芽細胞である請求の範囲第10項記載の方法。
- 12.前記増幅可能な遺伝子が野生型遺伝子よりも高いKmを有する突然変異化 されたDHFR遺伝子である請求の範囲第8項記載の方法。
- 13.前記二次宿主発現細胞がDHFR欠失性である請求の範囲第12項記載の 方法。
- 14.前記構造体が相同フランキング領域により前記増幅可能な領域から分離さ れたマーカー遺伝子をさらに含んで成る請求の範囲第8項記載の方法。
- 15.ヒト細胞であって、標的遺伝子の増幅を提供するためにヒトゲノムにおけ るその野生型部位以外の部位で及びタンパク質を発現する標的遺伝子の遺伝子座 内に増幅可能な遺伝子を含んで成るヒト細胞。
- 16.前記細胞が正常な細胞である請求の範囲第15項記載のヒト細胞。
- 17.前記細胞が悪性細胞である請求の範囲第15項記載のヒト細胞。
- 18.前記増幅可能な遺伝子がDHFR遺伝子である請求の範囲第15項記載の ヒト細胞。
- 19.培養における哺乳類タンパク質の発現のためのヒト細胞以外の哺乳類細胞 であって、タンパク質を発現する10kbのヒト野生型遺伝子以内に増幅可能な 遺伝子を含んで成る増幅可能領域を含んで成り、ここで前記2種の遺伝子が前記 標的遺伝子に関係する実質的に単独でのヒト野生型配列及び前記増幅可能な遺伝 子に関係するフランキング配列により分離されることを特徴とする哺乳類細胞。
- 20.培養における異種タンパク質の発現のための細胞を生成するための方法で あって: 増幅可能な遺伝子及び前記標的遺伝子の10kbのコード領域内のDNA配列と 相同の少なくとも約150bpの少なくとも1つのブランキング領域を含んで成 る構造体により、前記標的遺伝子を含んで成る一次哺乳類細胞を形質転換し、こ こで前記増幅可能な遺伝子が前記標的遺伝子の発現を妨害しない部位で存在し、 それによって前記構造体がゲノムにおける前記増幅可能な遺伝子及び前記標的遺 伝子を含んで成る増幅可能な領域を定義するために前記一次細胞の前記ゲノム中 に相同的に組込まれるようになり; 前記構造体に存在する前記増幅可能な遺伝子又は他のマーカーにより、前記構造 体を含んで成る一次細胞について選択し; 前記一次細胞から前記ゲノムのDNA部分を単離し、ここで前記部分は前記増幅 可能な領域のすべてを含むのに十分な大きさであり; 前記一次細胞DNA部分により哺乳類二次発現宿主細胞を形質転換し、ここで前 記二次発現宿主細胞が前記一次宿主細胞の種とは異なる種のものであり、そして 前記二次発現宿主細胞に存在する前記DNA部分とは異なる前記二次発現宿主細 胞のクローンを生成するために前記形質転換された発現宿主細胞をクローン化し ; 前記増幅可能な領域を含んで成る前記哺乳類二次発現宿主細胞のクローンを選択 し;そして 増幅剤により前記増幅可能な領域を増幅し、ここで前記増幅が前記単離の前又は 前記選択の後に存在することを含んで成る方法。
- 21.前記増幅が前記二次発現宿主細胞によるものである請求の範囲第20項記 載の方法。
- 22.前記一次細胞がヒト細胞である請求の範囲第20項記載の方法。
- 23.前記ヒト細胞が二倍体繊維芽細胞である請求の範囲第22項記載の方法。
- 24.前記増幅可能な遺伝子が野生型遺伝子よりも高いKmを有する突然変異化 されたDHFR遺伝子である請求の範囲第20項記載の方法。
- 25.前記二次宿主発現細胞がDHFR欠失性である請求の範囲第24項記載の 方法。
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