JP2001511342A - 内因性遺伝子の活性化によるヒト蛋白質の生産のためのヒト細胞株の同定 - Google Patents
内因性遺伝子の活性化によるヒト蛋白質の生産のためのヒト細胞株の同定Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、薬学的組成物の生産に適する形態のヒト蛋白質を経済的な収量で生産するために、内因性遺伝子の活性化によってヒト蛋白質を生産するためのヒト細胞の選択方法に関するものである。本発明は、このようにして同定される細胞株において、ヒト蛋白質を生産する方法にも関する。
Description
【０００１】 本発明は、薬学的組成物の生産に適する形態のヒト蛋白質を経済的な収量で生
産するために、内因性遺伝子の活性化によってヒト蛋白質を生産するためのヒト
細胞の選択方法に関するものである。本発明は、このようにして同定される細胞
株において、ヒト蛋白質を調製する方法にも関する。
産するために、内因性遺伝子の活性化によってヒト蛋白質を生産するためのヒト
細胞の選択方法に関するものである。本発明は、このようにして同定される細胞
株において、ヒト蛋白質を調製する方法にも関する。
【０００２】 ヒト細胞株における内因性遺伝子の活性化によるヒト蛋白質の調製は、既知で
ある。例えば、国際公開公報第93/09222号、国際公開公報第94/12650号および国
際公開公報第95/31560号は、内因性遺伝子の活性化によるヒトの細胞株中でのエ
リスロポエチンおよび他のヒト蛋白質の生産を記述している。
ある。例えば、国際公開公報第93/09222号、国際公開公報第94/12650号および国
際公開公報第95/31560号は、内因性遺伝子の活性化によるヒトの細胞株中でのエ
リスロポエチンおよび他のヒト蛋白質の生産を記述している。
【０００３】 しかし、該文献では、ヒト蛋白質の調製に使用される細胞株の選択に、特定の
基準が観察されるという示唆はない。したがって、生産のために選択された細胞
株中で、所望のヒト蛋白質が、所望の収量と形態で、汚染なく得られるという保
証はない。したがって、上述の文書では、一般にヒト蛋白質の収量が低くなって
いる。
基準が観察されるという示唆はない。したがって、生産のために選択された細胞
株中で、所望のヒト蛋白質が、所望の収量と形態で、汚染なく得られるという保
証はない。したがって、上述の文書では、一般にヒト蛋白質の収量が低くなって
いる。
【０００４】 本発明の問題は、現技術水準の不都合を解消し、特に、あらかじめ決められた
標的遺伝子の内因性活性化に適当なヒト出発細胞株の選択の基準を提供すること
であった。
標的遺伝子の内因性活性化に適当なヒト出発細胞株の選択の基準を提供すること
であった。
【０００５】 この問題は、以下のような特徴を持つ、細胞株中に存在する内因性標的遺伝子
の活性化によるヒト蛋白質の調製のためのヒト細胞株の選択方法によって、解決
できる： (a) ヒト細胞株の以下の特徴の存在を試験する： (i) 所望の核酸配列を持つ標的遺伝子、 (ii) 浮遊培養において細胞数が14日以内に少なくとも5回の倍加、および (iii) 無血清培地において細胞数が14日以内に少なくとも5回の倍加、ならびに (b) (i)、(ii)および(iii)の特徴を持つ細胞株を、内因性標的遺伝子の活性化の
出発細胞株として使用する。
の活性化によるヒト蛋白質の調製のためのヒト細胞株の選択方法によって、解決
できる： (a) ヒト細胞株の以下の特徴の存在を試験する： (i) 所望の核酸配列を持つ標的遺伝子、 (ii) 浮遊培養において細胞数が14日以内に少なくとも5回の倍加、および (iii) 無血清培地において細胞数が14日以内に少なくとも5回の倍加、ならびに (b) (i)、(ii)および(iii)の特徴を持つ細胞株を、内因性標的遺伝子の活性化の
出発細胞株として使用する。
【０００６】 本発明に従い、遺伝子ターゲッティングによりヒト細胞株中のヒト標的遺伝子
を活性化し、望ましい形態の標的蛋白質を十分な収量で生産できる細胞を得ると
いう課題に取り組む場合には、後に標的蛋白質を大量生産するために適切な候補
となるためにこの細胞株が所有している必要があるいくつかの特徴の存在につい
て、いくつかの細胞株を試験することになる。非不死化細胞と比較して、培養可
能性の点で重要な利点があるため、好ましくは不死化した細胞株、特に腫瘍細胞
株が試験される。
を活性化し、望ましい形態の標的蛋白質を十分な収量で生産できる細胞を得ると
いう課題に取り組む場合には、後に標的蛋白質を大量生産するために適切な候補
となるためにこの細胞株が所有している必要があるいくつかの特徴の存在につい
て、いくつかの細胞株を試験することになる。非不死化細胞と比較して、培養可
能性の点で重要な利点があるため、好ましくは不死化した細胞株、特に腫瘍細胞
株が試験される。
【０００７】 特徴(i)によると、ヒト細胞株では、実際に標的遺伝子、すなわち内因性遺伝 子活性化によって活性化される遺伝子が、通常は天然の標的遺伝子の核酸配列で
ある所望の核酸配列を持つかどうかを試験する。これは、永久培養される腫瘍細
胞株や他の細胞株は、しばしばそのゲノムに一連の変異を持つためである。した
がって、適当な細胞株の選択の1つの重要な局面は、細胞が所望の産物のために 正しい遺伝子を持つかどうかである。配列の決定は、通常の方法で細胞を培養し
て、標的遺伝子の配列決定をすることによって、実行できる。必要ならば、配列
決定の前に、PCRまたは他の増幅方法によって、標的遺伝子の増幅を行なうこと ができる。
ある所望の核酸配列を持つかどうかを試験する。これは、永久培養される腫瘍細
胞株や他の細胞株は、しばしばそのゲノムに一連の変異を持つためである。した
がって、適当な細胞株の選択の1つの重要な局面は、細胞が所望の産物のために 正しい遺伝子を持つかどうかである。配列の決定は、通常の方法で細胞を培養し
て、標的遺伝子の配列決定をすることによって、実行できる。必要ならば、配列
決定の前に、PCRまたは他の増幅方法によって、標的遺伝子の増幅を行なうこと ができる。
【０００８】 細胞の選択のもう1つの重要な特徴は、浮遊培養の可能性である。懸濁細胞は 、発酵槽培養しやすく、発酵槽培養は、例えば10 l から50,000 l の容量の大型
発酵槽のような大きなサイズに適合させやすい。したがって、選択された細胞は
、懸濁細胞であるか、または懸濁細胞に簡単に適応するものである必要がある。
このために、細胞は連続撹拌して14日間培養する。この期間の間に細胞数が少な
くとも5回の倍加を示せば、細胞は浮遊培養に適すると考えられる。細胞数の倍 加の回数は、例えば、細胞の計数または細胞懸濁液の光学密度の測定によって、
細胞数を定期的に決定することによって、決定できる。
発酵槽のような大きなサイズに適合させやすい。したがって、選択された細胞は
、懸濁細胞であるか、または懸濁細胞に簡単に適応するものである必要がある。
このために、細胞は連続撹拌して14日間培養する。この期間の間に細胞数が少な
くとも5回の倍加を示せば、細胞は浮遊培養に適すると考えられる。細胞数の倍 加の回数は、例えば、細胞の計数または細胞懸濁液の光学密度の測定によって、
細胞数を定期的に決定することによって、決定できる。
【０００９】 ヒト細胞の選択のもう1つの重要な特徴は、無血清培地での培養可能性である 。無血清培養からの蛋白質の精製の方がかなり簡単で、無血清培養ではウイルス
のような動物の病原体の汚染の危険がないため、選択された細胞は、無血清培地
で増殖する必要がある。このために、細胞は無血清培地（例、Boehringer Mannh
eim社のITS添加RPMI 1650）を用いて培養器中で1 mlあたり1〜10 x 105細胞の密
度で14日間培養する。この培養期間に、細胞の計数によって決定される細胞数が
少なくとも5回の倍加を示せば、細胞は無血清培養に適すると考えられる。
のような動物の病原体の汚染の危険がないため、選択された細胞は、無血清培地
で増殖する必要がある。このために、細胞は無血清培地（例、Boehringer Mannh
eim社のITS添加RPMI 1650）を用いて培養器中で1 mlあたり1〜10 x 105細胞の密
度で14日間培養する。この培養期間に、細胞の計数によって決定される細胞数が
少なくとも5回の倍加を示せば、細胞は無血清培養に適すると考えられる。
【００１０】 もう1つの重要な特徴で、本発明によると好ましい特徴は、世代時間(iv)であ る。選択された細胞は、10%ウシ全血清添加DMEMまたは10%ウシ全血清添加RPMI 1
640のような培地中で、高度に増殖する必要がある。すなわち、1週間の培養で、
10〜256、好ましくは64〜128の細胞数の倍加が必要である。このために、1 mlあ
たり0.1〜10 x 105細胞、好ましくは0.5〜2 x 105細胞の濃度で細胞をディッシ ュに播き、トリプシン処理後または処理なしで、細胞チェンバーによって細胞の
計測を行なう。十分に世代時間が短い細胞は、内因性遺伝子の活性化によるヒト
蛋白質の大量生産に特に適している。
640のような培地中で、高度に増殖する必要がある。すなわち、1週間の培養で、
10〜256、好ましくは64〜128の細胞数の倍加が必要である。このために、1 mlあ
たり0.1〜10 x 105細胞、好ましくは0.5〜2 x 105細胞の濃度で細胞をディッシ ュに播き、トリプシン処理後または処理なしで、細胞チェンバーによって細胞の
計測を行なう。十分に世代時間が短い細胞は、内因性遺伝子の活性化によるヒト
蛋白質の大量生産に特に適している。
【００１１】 もう1つの好ましい特徴は、標的遺伝子の検出可能な内因性発現、すなわち転 写および翻訳がないことである(v)。好ましくは、内因性遺伝子の活性化には、 標的遺伝子の内因性発現が基本的に存在しない細胞株が選択される。このために
、0.01〜2 x 106細胞/ml、好ましくは培地 1 mlあたり0.5〜1 x 106細胞の細胞 密度で24時間、細胞を播くことができる。例えば24時間のような所定の時間後に
、細胞の上清を取り出し、細胞を破棄し、例えばELISAのような既知の試験方法 によって細胞上清中の標的蛋白質の含有量を決定する。EPOの場合は、検出限界 は例えば10 pg/EPO/mlである。106細胞/mlの播種で蛋白質を10 pg未満しか合成 しない細胞は、生産しないと見なされ、特に適している。
、0.01〜2 x 106細胞/ml、好ましくは培地 1 mlあたり0.5〜1 x 106細胞の細胞 密度で24時間、細胞を播くことができる。例えば24時間のような所定の時間後に
、細胞の上清を取り出し、細胞を破棄し、例えばELISAのような既知の試験方法 によって細胞上清中の標的蛋白質の含有量を決定する。EPOの場合は、検出限界 は例えば10 pg/EPO/mlである。106細胞/mlの播種で蛋白質を10 pg未満しか合成 しない細胞は、生産しないと見なされ、特に適している。
【００１２】 もう1つ別の重要で好ましい特徴は、選択される細胞中での標的遺伝子の多染 色体性である(vi)。細胞中に標的遺伝子のコピーが2つよりも多ければ、相同組 換えにおける収量が大幅に上昇する。7番染色体に遺伝子があるEPOの生産では、
7番染色体を3対持つNamalwa (Nadkarniら、Cancer 23 (1969), 64-79)またはHeL
a S3 (Puckら、J. Exp. Med. 103 (1956), 173-284)の細胞が、特に適している ことが示された。7番染色体のコピー数が増加している他の細胞株の例には、結 腸腺癌細胞株SW-480 (ATCC CCL-228; Leibovitzら、Cancer Res. 36 (1976), 45
62-4567)、悪性メラノーマ細胞株SK-MEL-3 (ATCC HTB 69; FoghおよびTremp、「
インビトロのヒト腫瘍細胞(Human Tumor Cells in vitro)」, pp115-159、J. Fo
gh編、Plenum Press, New York 1975)、結腸腺癌細胞Colo-320 (ATCC CCL-220;
Quinnら、Cancer Res. 39 (1979), 4914-4924)、メラノーマ細胞株MEL-HO (DSM
ACC 62; Holzmannら、Int. J. Cancer 41 (1988), 542-547)および腎臓癌細胞A-
498 (DSM ACC 55; Giardら、J. Natl. Cancer Inst. 51 (1973), 1417-1423)が ある。
7番染色体を3対持つNamalwa (Nadkarniら、Cancer 23 (1969), 64-79)またはHeL
a S3 (Puckら、J. Exp. Med. 103 (1956), 173-284)の細胞が、特に適している ことが示された。7番染色体のコピー数が増加している他の細胞株の例には、結 腸腺癌細胞株SW-480 (ATCC CCL-228; Leibovitzら、Cancer Res. 36 (1976), 45
62-4567)、悪性メラノーマ細胞株SK-MEL-3 (ATCC HTB 69; FoghおよびTremp、「
インビトロのヒト腫瘍細胞(Human Tumor Cells in vitro)」, pp115-159、J. Fo
gh編、Plenum Press, New York 1975)、結腸腺癌細胞Colo-320 (ATCC CCL-220;
Quinnら、Cancer Res. 39 (1979), 4914-4924)、メラノーマ細胞株MEL-HO (DSM
ACC 62; Holzmannら、Int. J. Cancer 41 (1988), 542-547)および腎臓癌細胞A-
498 (DSM ACC 55; Giardら、J. Natl. Cancer Inst. 51 (1973), 1417-1423)が ある。
【００１３】 細胞株のゲノム中の染色体数の確認は、特定の染色体および/または標的遺伝 子の遺伝子座に特異的なDNAプローブを用いて行なうことができる。
【００１４】 内因性遺伝子の活性化に使用する出発細胞株のもう1つの好ましい特徴は、所 望の標的蛋白質の正しくグリコシル化されていることである(vii)。好ましくは 、特にシアル酸残基の数について、天然に存在する標的蛋白質に匹敵するグリコ
シル化パターンを持つ標的蛋白質を合成するヒト細胞株が使用される。正しいグ
リコシル化の存在は、好ましくは、細胞中で活性なプロモーターの制御下に所望
の標的遺伝子を持つ染色体外ベクターによって、細胞を一時的にトランスフェク
トすることによって、試験できる。標的遺伝子の一時的な発現後に、細胞上清お
よび/または細胞抽出物を、等電点電気泳動によって分析する。EPOの例では、正
しいグリコシル化の存在は、非常に明らかである。例えば大腸菌細胞の組換えEP
Oのような非グリコシル化EPOは、インビトロの実験ではグリコシル化EPOに匹敵 する活性を持つ。しかし、インビボの実験では、非グリコシル化EPOは、効率が かなり低い。出発細胞株が正しいグリコシル化を持つEPOを生産できるかどうか を決定するために、尿のEPOと比較できるが、またヒトで活性なグリコシル化の 型を持つことが知られており、尿のEPOとほぼ同一のグリコシル化を持つCHO細胞
由来の組換えEPOと比較することもできる。グリコシル化の比較は、好ましくは 等電点電気泳動によって行なう。
シル化パターンを持つ標的蛋白質を合成するヒト細胞株が使用される。正しいグ
リコシル化の存在は、好ましくは、細胞中で活性なプロモーターの制御下に所望
の標的遺伝子を持つ染色体外ベクターによって、細胞を一時的にトランスフェク
トすることによって、試験できる。標的遺伝子の一時的な発現後に、細胞上清お
よび/または細胞抽出物を、等電点電気泳動によって分析する。EPOの例では、正
しいグリコシル化の存在は、非常に明らかである。例えば大腸菌細胞の組換えEP
Oのような非グリコシル化EPOは、インビトロの実験ではグリコシル化EPOに匹敵 する活性を持つ。しかし、インビボの実験では、非グリコシル化EPOは、効率が かなり低い。出発細胞株が正しいグリコシル化を持つEPOを生産できるかどうか を決定するために、尿のEPOと比較できるが、またヒトで活性なグリコシル化の 型を持つことが知られており、尿のEPOとほぼ同一のグリコシル化を持つCHO細胞
由来の組換えEPOと比較することもできる。グリコシル化の比較は、好ましくは 等電点電気泳動によって行なう。
【００１５】 ヒト細胞株の選択のためのもう1つの好ましい特徴は、研究される細胞株に、 例えば感染性ウイルス粒子やマイコプラズマの汚染がないことである(vii)。ウ イルスの汚染の存在は、細胞培養、インビボ分析、および/または特定のウイル ス蛋白質の検出によって、調べられる。
【００１６】 本発明は、ヒト細胞株における内因性遺伝子の活性化によるヒト蛋白質の調製
方法にも関するもので、上述の(i)、(ii)および(iii)特徴を満足し、さらに上述
の(iv)、(v)、(vi)および(vii)の特徴のうちの少なくとも1つも満足する細胞株 を使用するという特徴を持つものである。
方法にも関するもので、上述の(i)、(ii)および(iii)特徴を満足し、さらに上述
の(iv)、(v)、(vi)および(vii)の特徴のうちの少なくとも1つも満足する細胞株 を使用するという特徴を持つものである。
【００１７】 本発明の方法は、EPO、トロンボポエチン(TPO)、G-CSFまたはGM-CSFのような コロニー刺激因子、tPAのような血液凝固に影響を与える蛋白質、IFN-α、IFN- βまたはIFN-γのようなインターフェロン、IL-1からIL-18のようなインターロ イキン、MIPのようなケモカイン、NGFまたはBDNFのような神経栄養因子、IFG-BP
のような骨成長に影響を与える蛋白質、ヘッジホッグ蛋白質、TGF-βのような腫
瘍増殖因子、HGHのような成長ホルモン、ACTH、エンセファリン、エンドルフィ ン、可溶性および/または膜結合型のインターロイキンまたはインスリン受容体 のような受容体、および他の蛋白質結合蛋白質のような、ヒトの因子の調製に特
に使用される。特に好ましいのは、EPOの調製プロセスである。
のような骨成長に影響を与える蛋白質、ヘッジホッグ蛋白質、TGF-βのような腫
瘍増殖因子、HGHのような成長ホルモン、ACTH、エンセファリン、エンドルフィ ン、可溶性および/または膜結合型のインターロイキンまたはインスリン受容体 のような受容体、および他の蛋白質結合蛋白質のような、ヒトの因子の調製に特
に使用される。特に好ましいのは、EPOの調製プロセスである。
【００１８】 内因性遺伝子の活性化自体は既知の方法によって行なうことができ、好ましく
は以下の段階を含む： (a) 所望の核酸配列を持つ内因性の標的遺伝子を少なくとも1コピー持ち、本発 明 の選択基準によって標的遺伝子の発現に適すると同定されたヒト出発細胞株の調
製。 (b) 以下を含むDNAコンストラクトによる、細胞のトランスフェクション： (i) 相同組換えを可能にするために、標的遺伝子座の領域に相同な2つのDNAフ
ランキング配列、 (ii) ポジティブ選択マーカー遺伝子、 (iii) 必要ならばネガティブ選択マーカー遺伝子、 (iv) 必要ならば増幅遺伝子、および (v) ヒト細胞で活性な、異種発現制御配列。 (c) ポジティブ選択マーカー遺伝子の存在下と、選択的にネガティブマーカー遺
伝子の非存在下で選択が起きる条件のもとでの、トランスフェクトされた細胞の
培養、 (d) 段階にしたがった選択可能な細胞の分析、 (e) 所望の標的蛋白質を生産する細胞の同定、ならびに (f) 必要ならば選択された細胞中での標的遺伝子の増幅。
は以下の段階を含む： (a) 所望の核酸配列を持つ内因性の標的遺伝子を少なくとも1コピー持ち、本発 明 の選択基準によって標的遺伝子の発現に適すると同定されたヒト出発細胞株の調
製。 (b) 以下を含むDNAコンストラクトによる、細胞のトランスフェクション： (i) 相同組換えを可能にするために、標的遺伝子座の領域に相同な2つのDNAフ
ランキング配列、 (ii) ポジティブ選択マーカー遺伝子、 (iii) 必要ならばネガティブ選択マーカー遺伝子、 (iv) 必要ならば増幅遺伝子、および (v) ヒト細胞で活性な、異種発現制御配列。 (c) ポジティブ選択マーカー遺伝子の存在下と、選択的にネガティブマーカー遺
伝子の非存在下で選択が起きる条件のもとでの、トランスフェクトされた細胞の
培養、 (d) 段階にしたがった選択可能な細胞の分析、 (e) 所望の標的蛋白質を生産する細胞の同定、ならびに (f) 必要ならば選択された細胞中での標的遺伝子の増幅。
【００１９】 所望のヒト蛋白質を生産する細胞の調製に使用するDNAコンストラクトは、標 的遺伝子座の領域に相同な2つのフランキングDNA配列を含む。適切なフランキン
グ配列は、例えば国際公開公報第90/11354号および国際公開公報第91/09955号に
記載される方法によって選択される。好ましくは、フランキング配列は各々少な
くとも150 bpの長さを持つ。
グ配列は、例えば国際公開公報第90/11354号および国際公開公報第91/09955号に
記載される方法によって選択される。好ましくは、フランキング配列は各々少な
くとも150 bpの長さを持つ。
【００２０】 特に好ましくは相同DNA配列は、標的遺伝子の5'領域、例、5'非翻訳配列、シ グナル配列をコードするエクソン、およびこの領域に存在するイントロンから、
選択される。
選択される。
【００２１】 ポジティブ選択マーカー遺伝子は、発現されると選択可能な表現型、例、抗生
物質耐性、栄養要求性等を示す、真核細胞に適した任意の選択マーカー遺伝子で
あり得る。特に好ましいポジティブ選択マーカーは、ネオマイシンホスホトラン
スフェラーゼ遺伝子である。
物質耐性、栄養要求性等を示す、真核細胞に適した任意の選択マーカー遺伝子で
あり得る。特に好ましいポジティブ選択マーカーは、ネオマイシンホスホトラン
スフェラーゼ遺伝子である。
【００２２】 選択的に、選択薬剤の存在下でそれを発現する細胞が破壊される、例えばHSV チミジンキナーゼ遺伝子のような、ネガティブ選択マーカー遺伝子も存在し得る
。ネガティブ選択マーカー遺伝子は、2つのフランキング相同配列領域の外側に 位置する。
。ネガティブ選択マーカー遺伝子は、2つのフランキング相同配列領域の外側に 位置する。
【００２３】 ヒト細胞中で活性化される内因性標的遺伝子の増幅が望ましい場合、DNAコン ストラクトには増幅遺伝子が含まれる。適切な増幅遺伝子の例には、ジヒドロ葉
酸レダクターゼ遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、およびオルニチンデカ
ルボキシラーゼ遺伝子等がある。特に好ましい増幅遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダ
クターゼ遺伝子で、特に、野生型遺伝子よりも選択薬剤（メトトレキセート）に
対する感受性が高いジヒドロ葉酸レダクターゼ-アルギニン変異（Simonsenら、P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 2495）をコードする遺伝子である。
酸レダクターゼ遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、およびオルニチンデカ
ルボキシラーゼ遺伝子等がある。特に好ましい増幅遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダ
クターゼ遺伝子で、特に、野生型遺伝子よりも選択薬剤（メトトレキセート）に
対する感受性が高いジヒドロ葉酸レダクターゼ-アルギニン変異（Simonsenら、P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 2495）をコードする遺伝子である。
【００２４】 さらに、内因性遺伝子の活性化に使用されるDNAコンストラクトには、ヒト細 胞で活性な、異種発現制御配列が含まれる。発現制御配列には、プロモーターと
、好ましくは、例えばエンハンサーのような、別の発現改善配列が含まれる。プ
ロモーターは、コントロール可能または構成性のプロモーターで良い。好ましく
は、プロモーターは強力なウイルスプロモーター、例、SV40またはCMVプロモー ターである。特に好ましいのは、CMVプロモーター/エンハンサーである。
、好ましくは、例えばエンハンサーのような、別の発現改善配列が含まれる。プ
ロモーターは、コントロール可能または構成性のプロモーターで良い。好ましく
は、プロモーターは強力なウイルスプロモーター、例、SV40またはCMVプロモー ターである。特に好ましいのは、CMVプロモーター/エンハンサーである。
【００２５】 さらに本発明は、活性化標的遺伝子にコードされるポリペプチドを得るため、
好ましくは例えば大型発酵槽を用いた大量プロセスでポリペプチドを得るために
、細胞に内在的に存在する標的遺伝子を活性化した後に、上述の方法によって同
定されるヒト細胞株の使用することにも関する。
好ましくは例えば大型発酵槽を用いた大量プロセスでポリペプチドを得るために
、細胞に内在的に存在する標的遺伝子を活性化した後に、上述の方法によって同
定されるヒト細胞株の使用することにも関する。
【００２６】 本発明のさらにもう1つの主題は、ヒト細胞中で活性な異種発現制御配列に機 能的に連結した内因性遺伝子のコピーを含み、あらかじめ遺伝子増幅をしなくて
も、その内因性遺伝子にコードされるポリペプチドを106細胞/24時間にて少なく
とも200 ng生産する能力がある、ヒト細胞である。好ましくは、本発明のヒト細
胞は、106細胞/24時間にて200〜3000 ngのポリペプチドの生産能力があり、最も
好ましくは106細胞/24時間にて1000〜3000 ngのポリペプチドの生産能力がある 。
も、その内因性遺伝子にコードされるポリペプチドを106細胞/24時間にて少なく
とも200 ng生産する能力がある、ヒト細胞である。好ましくは、本発明のヒト細
胞は、106細胞/24時間にて200〜3000 ngのポリペプチドの生産能力があり、最も
好ましくは106細胞/24時間にて1000〜3000 ngのポリペプチドの生産能力がある 。
【００２７】 最後に、本発明のもう1つの主題は、上述の細胞から遺伝子増幅によって得ら れるヒト細胞で、各々がヒト細胞中で活性な異種発現制御配列に機能的に連結し
た内因性遺伝子のコピーをいくつか含み、その内因性遺伝子にコードされるポリ
ペプチドを106細胞/24時間にて少なくとも1000 ng生産する能力のある、ヒト細 胞である。特に好ましくは、遺伝子増幅によって得られるヒト細胞株は、106細 胞/24時間にて1000〜25000 ngのポリペプチド、および最も好ましくは106細胞/2
4時間にて5000〜25000のポリペプチドを生産する能力がある。
た内因性遺伝子のコピーをいくつか含み、その内因性遺伝子にコードされるポリ
ペプチドを106細胞/24時間にて少なくとも1000 ng生産する能力のある、ヒト細 胞である。特に好ましくは、遺伝子増幅によって得られるヒト細胞株は、106細 胞/24時間にて1000〜25000 ngのポリペプチド、および最も好ましくは106細胞/2
4時間にて5000〜25000のポリペプチドを生産する能力がある。
【００２８】 本発明に記載される細胞の例は、EPO生産クローン「Aladin」であり、これは ブダペスト条約の規定に従い、1997年7月15日に、ファイル番号DSM ACC 2320と してDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)（Masch
eroder Weg 1b, 38124 Brunswick）に寄託された。
eroder Weg 1b, 38124 Brunswick）に寄託された。
【００２９】 本発明は以下の実施例および図および配列によってさらに説明される。
【００３０】 実施例 実施例1. 選択方法 1.1 世代時間の決定 試験された細胞株は、それぞれ10% FCS添加DMEMまたは10% FSC添加RPMI 1640 中に1 mlあたり0.1〜5 x 105細胞、好ましくは1 mlあたり0.5〜2 x 105細胞の濃
度で培養ディッシュに播種し、例えばATCCによりその特定の細胞に推奨される培
地中で、適切な条件下で培養し、細胞数は、例えばNeubauerのような計数チャン
バーを用いて、トリプシン処理ありまたは処理なしで2〜3日ごとに決定した。培
養後1週間以内に細胞数が16〜256に倍加した細胞、好ましくは64〜128に倍加し た細胞は、陽性（＋、＋＋または＋＋＋）と評価された。
度で培養ディッシュに播種し、例えばATCCによりその特定の細胞に推奨される培
地中で、適切な条件下で培養し、細胞数は、例えばNeubauerのような計数チャン
バーを用いて、トリプシン処理ありまたは処理なしで2〜3日ごとに決定した。培
養後1週間以内に細胞数が16〜256に倍加した細胞、好ましくは64〜128に倍加し た細胞は、陽性（＋、＋＋または＋＋＋）と評価された。
【００３１】 1.2. 浮遊培養の可能性 浮遊培養の可能性を決定するために、細胞を対応する付属装置を装着したBeli
co Spinner中で、37℃および7% CO2として、培地（1.1参照、例えばウシ胎仔血 清のような血清の添加ありまたはなし）中で、連続的に撹拌しながら14日間培養
した。この間に少なくとも5回の倍加をした細胞は、浮遊培養に適する（＋）と 評価された。
co Spinner中で、37℃および7% CO2として、培地（1.1参照、例えばウシ胎仔血 清のような血清の添加ありまたはなし）中で、連続的に撹拌しながら14日間培養
した。この間に少なくとも5回の倍加をした細胞は、浮遊培養に適する（＋）と 評価された。
【００３２】 1.3. 無血清培地での培養可能性 無血清培地での細胞の培養可能性を決定するために、細胞を1.1と同じ条件下 で、ATCCによってその特定の細胞に推奨される基礎培地（すなわち血清の添加な
し）およびITS（Boehringer Mannheim社、カタログ番号1074547）添加で、培養 器中で1〜10 x 105細胞/mlの密度で14日間培養した。この間に少なくとも5回の 倍加（細胞の計数によって決定）をした細胞は、無血清培養に適すると評価され
た。
し）およびITS（Boehringer Mannheim社、カタログ番号1074547）添加で、培養 器中で1〜10 x 105細胞/mlの密度で14日間培養した。この間に少なくとも5回の 倍加（細胞の計数によって決定）をした細胞は、無血清培養に適すると評価され
た。
【００３３】 1.4. 標的遺伝子の内因性発現の決定 標的蛋白質が選択された細胞株中で内在的に生産されるかどうかを決定するた
めに、細胞を0.01〜2 x 106細胞/ml培地、好ましくは0.5〜1 x 106細胞/mlの密 度で24時間まいた。24時間後に細胞上清を取り出し、細胞を破棄し、例えば特定
の蛋白質に特異的な免疫アッセイのような既知の試験方法によって、細胞上清中
の細胞蛋白質の含有量を決定した。
めに、細胞を0.01〜2 x 106細胞/ml培地、好ましくは0.5〜1 x 106細胞/mlの密 度で24時間まいた。24時間後に細胞上清を取り出し、細胞を破棄し、例えば特定
の蛋白質に特異的な免疫アッセイのような既知の試験方法によって、細胞上清中
の細胞蛋白質の含有量を決定した。
【００３４】 EPOの場合、含有量はELISAによって決定された。このためにストレプトアビジ
ンでコートしたマイクロタイタープレートをビオチン化抗EPO抗体（Boehringer
Mannheim）でコートし、蛋白質を含む溶液（1% w/v）とインキュベートして非特
異的結合をブロックした。その後、培養上清0.1 mlを添加し、一晩インキュベー
トした。洗浄後、ペルオキシダーゼ結合抗EPOモノクローナル抗体（Boehringer
Mannheim）を2時間添加した。ペルオキシダーゼ反応は基質としてABTS（登録商 標）を用いてPerkin-Elmerフォトメーターで405 nmで測定した。
ンでコートしたマイクロタイタープレートをビオチン化抗EPO抗体（Boehringer
Mannheim）でコートし、蛋白質を含む溶液（1% w/v）とインキュベートして非特
異的結合をブロックした。その後、培養上清0.1 mlを添加し、一晩インキュベー
トした。洗浄後、ペルオキシダーゼ結合抗EPOモノクローナル抗体（Boehringer
Mannheim）を2時間添加した。ペルオキシダーゼ反応は基質としてABTS（登録商 標）を用いてPerkin-Elmerフォトメーターで405 nmで測定した。
【００３５】 この試験におけるEPOの検出限界は10 pg EPO/mlだった。106細胞/mlの播種で1
0 pg EPO/ml未満しか生産しない細胞は、非生産であり、適する（＋）と評価さ れた。
0 pg EPO/ml未満しか生産しない細胞は、非生産であり、適する（＋）と評価さ れた。
【００３６】 1.5. 標的遺伝子のコピー数の決定 細胞株中の標的遺伝子のコピー数を決定するため、約108細胞からヒトゲノムD
NAを単離し、定量した（Sambrookら、「分子クローニング：実験室マニュアル（
Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」(1989) Cold Spring Harbor Labo
ratory Press）。それぞれ例えばAgeIおよびAscIまたはBamHI、HindIIIおよびSa
lIのような制限酵素でDNAを切断した後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片
をサイズによって分別し、最後にナイロンメンブレンに移して固定した。
NAを単離し、定量した（Sambrookら、「分子クローニング：実験室マニュアル（
Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」(1989) Cold Spring Harbor Labo
ratory Press）。それぞれ例えばAgeIおよびAscIまたはBamHI、HindIIIおよびSa
lIのような制限酵素でDNAを切断した後、アガロースゲル電気泳動によりDNA断片
をサイズによって分別し、最後にナイロンメンブレンに移して固定した。
【００３７】 固定したDNAに、標的遺伝子座または標的遺伝子が存在する染色体に特異的な ジゴキシゲニン標識DNAプローブをハイブリダイズさせ、厳密な条件下で洗浄し た。特異的なハイブリダイゼーションシグナルは、感光性フィルムを用いて化学
ルミネセンスを用いて検出した。
ルミネセンスを用いて検出した。
【００３８】 1.6. 標的遺伝子の核酸配列の決定 ゲノムDNAは、DNA単離キット（例、QIAGEN血液および細胞培養DNAキット）を 用いて約107細胞から単離された。
【００３９】 標的遺伝子の増幅には、1対のPCRプライマーが使用された。プライマーの配列
は、標的遺伝子のコード領域に隣接する配列に相補的だった。したがって、標的
遺伝子のコード領域全体を増幅することができた。
は、標的遺伝子のコード領域に隣接する配列に相補的だった。したがって、標的
遺伝子のコード領域全体を増幅することができた。
【００４０】 PCR産物は、直接に配列分析を行なうか、ベクターにクローニングしてから配 列決定をした。標的遺伝子のイントロン領域の配列に相補的な配列を持つシーケ
ンシングプライマーを使用し、標的遺伝子のエクソン領域の配列が完全に得られ
るようにした。配列決定は、例えば「プリズム・レディ・リアクション・ダイ・
ターミネーター・サイクル・シークエンス（Prism（登録商標） Ready Reaction Dye Terminator Cycle Sequencing）」キット（PE/ABI、米国フォレストシティ
）を用いて、製造元の指示にしたがって、PE/ABI自動シーケンサーで行なった。
ンシングプライマーを使用し、標的遺伝子のエクソン領域の配列が完全に得られ
るようにした。配列決定は、例えば「プリズム・レディ・リアクション・ダイ・
ターミネーター・サイクル・シークエンス（Prism（登録商標） Ready Reaction Dye Terminator Cycle Sequencing）」キット（PE/ABI、米国フォレストシティ
）を用いて、製造元の指示にしたがって、PE/ABI自動シーケンサーで行なった。
【００４１】 1.7. グリコシル化パターンの決定 EPOのグリコシル化パターンを決定するために、試験する細胞株に、ヒトEPO遺
伝子配列の4 kbのHindIII/EcoRI断片をSV40プロモーターの制御下に含むプラス ミドpEPO227をトランスフェクトした（Jacobsら、Nature 313 (1985), 806; Lee
-Huangら、Gene 128 (1993), 272）。細胞は、市販の試薬キットを用いて、製造
元の指示に従って、リポフェクタミンの存在下でトランスフェクトした。2〜5日
後に得られた細胞上清のEPO含有量をELISAで決定した。
伝子配列の4 kbのHindIII/EcoRI断片をSV40プロモーターの制御下に含むプラス ミドpEPO227をトランスフェクトした（Jacobsら、Nature 313 (1985), 806; Lee
-Huangら、Gene 128 (1993), 272）。細胞は、市販の試薬キットを用いて、製造
元の指示に従って、リポフェクタミンの存在下でトランスフェクトした。2〜5日
後に得られた細胞上清のEPO含有量をELISAで決定した。
【００４２】 細胞上清を濃縮し、等電点電気泳動法によって既知のEPO産物と比較した（Rig
hetti, P.G., 「等電点電気泳動：理論、方法および応用(Isoelectric Focusing
: Theory, Methodology and Applications)」Work, T.S., Burdon, R.H.編、Els
evier Biomedical Press, Amsterdam (1983)）。尿EPOのような既知のEPO産物に
匹敵するグリコシル化を示したヒト細胞は、適する（＋）と評価された。
hetti, P.G., 「等電点電気泳動：理論、方法および応用(Isoelectric Focusing
: Theory, Methodology and Applications)」Work, T.S., Burdon, R.H.編、Els
evier Biomedical Press, Amsterdam (1983)）。尿EPOのような既知のEPO産物に
匹敵するグリコシル化を示したヒト細胞は、適する（＋）と評価された。
【００４３】 1.8. ウイルス汚染の決定 1.8.1. 細胞培養による分析 試験するヒト細胞株の感染性ウイルス汚染を検出するため、細胞溶解物を、細
胞変性効果を検出するために検出細胞株とインキュベートした。さらに、血球吸
着分析も行なった。
胞変性効果を検出するために検出細胞株とインキュベートした。さらに、血球吸
着分析も行なった。
【００４４】 溶解物を調製するために、1 mlの緩衝液に106細胞を入れた懸濁液を、急速な 凍結融解によって溶解させた。細胞残渣を遠心によって分離し、上清を検出細胞
株に加えた。使用した検出細胞株はHepG2 (ATCC HB-8065; Nature 282 (1979),
615-616)、MRC-5 (ATCC-1587)およびVero (ATCC CCL-171; Jacobs, Nature 227
(1970), 168-170)だった。ポリオSVおよびインフルエンザタイプのウイルスが、
陽性対照として使用された。陰性対照は、溶解物なしで培養した検出細胞株だっ
た。細胞変性効果を検出するために、検出細胞株は少なくとも14日間、定期的に
調べた。
株に加えた。使用した検出細胞株はHepG2 (ATCC HB-8065; Nature 282 (1979),
615-616)、MRC-5 (ATCC-1587)およびVero (ATCC CCL-171; Jacobs, Nature 227
(1970), 168-170)だった。ポリオSVおよびインフルエンザタイプのウイルスが、
陽性対照として使用された。陰性対照は、溶解物なしで培養した検出細胞株だっ
た。細胞変性効果を検出するために、検出細胞株は少なくとも14日間、定期的に
調べた。
【００４５】 血球吸着分析のためには、細胞溶解物および対照とインキュベートされていた
Vero細胞を、7日後にニワトリ、ブタ、ヒトの赤血球で処理した。培養細胞の単 層に赤血球が接着すれば、培養物にウイルス汚染があることを示す。
Vero細胞を、7日後にニワトリ、ブタ、ヒトの赤血球で処理した。培養細胞の単 層に赤血球が接着すれば、培養物にウイルス汚染があることを示す。
【００４６】 1.8.2. インビボ分析 試験する細胞株の溶解物を1.8.1.のようにして調製し、0.1 mlを新生マウスの
腹腔内または大脳半球間に注射した。14日間にわたり、マウスの罹患率と死亡率
を観察した。
腹腔内または大脳半球間に注射した。14日間にわたり、マウスの罹患率と死亡率
を観察した。
【００４７】 1.8.3. ウイルス蛋白質の特異的検出 エプスタイン・バーウイルス蛋白質（核蛋白質またはキャプシド抗原）のよう
な特定のウイルス蛋白質の存在は、EBV陽性バンドのヒト血清を、試験する細胞 株の固定化細胞に与えて試験した。その後、補体および対応する抗ヒト補体C3フ
ルオレセイン結合体（核抗原の検出用）および抗ヒトグロブリンフルオレセイン
（キャプシド抗原の検出用）を投与して、ウイルス抗原の検出を行なった。
な特定のウイルス蛋白質の存在は、EBV陽性バンドのヒト血清を、試験する細胞 株の固定化細胞に与えて試験した。その後、補体および対応する抗ヒト補体C3フ
ルオレセイン結合体（核抗原の検出用）および抗ヒトグロブリンフルオレセイン
（キャプシド抗原の検出用）を投与して、ウイルス抗原の検出を行なった。
【００４８】 実施例2. 選択結果 第1項に述べた方法によって、ヒト細胞株HepG2、HT1080、Namalwa、HeLaおよ びHeLaS3が試験された。結果は以下の表1に示されている。
【００４９】
【表１】
【００５０】 表1から、細胞株HT1080、NamalwaおよびHeLaS3は、EPOの内因性遺伝子活性化 に適すると考えられることが分かる。NamalwaおよびHeLaS3は特に適している。
【００５１】 実施例3. EPO相同性領域のクローニング EPO遺伝子の相同性領域は、胎盤のゲノムDNA（Boehringer Mannheim）を用い てPCRによって、増幅された。EPO遺伝子の5'非翻訳配列、エクソン1およびイン トロン1の領域からの長さ6.3 kbの相同性領域から、2つのPCR産物が調製された （図1）。PCR産物1の作製に使用されたプライマーは、以下の配列を持っていた ：5'-CGC GGC GGA TCC CAG GGA GCT GGG TTG ACC GG-3'（配列番号：1）および5
'-GGC CGC GAA TTC TCC GCG CCT GGC CGG GGT CCC TCA GC-3'（配列番号：2）。
PCR産物2の調製に使用されたプライマーは、以下の配列を持っていた：5'-CGC G
GC GGA TCC TCT CCT CCC TCC CAA GCT GCA ATC-3'（配列番号：3）および5'-GGC CGC GAA TTC TAG AAC AGA TAG CCA GGC TGA GAG-3'（配列番号：4）。
'-GGC CGC GAA TTC TCC GCG CCT GGC CGG GGT CCC TCA GC-3'（配列番号：2）。
PCR産物2の調製に使用されたプライマーは、以下の配列を持っていた：5'-CGC G
GC GGA TCC TCT CCT CCC TCC CAA GCT GCA ATC-3'（配列番号：3）および5'-GGC CGC GAA TTC TAG AAC AGA TAG CCA GGC TGA GAG-3'（配列番号：4）。
【００５２】 望ましい部分は、制限切断（PCR産物1：HindIII、PCR産物2：HindIIIおよびEc
oRV）によってPCR産物1および2から切り出し、HindIIIおよびEcoRVで切断された
ベクターpCRII (Invitrogen) にクローニングした。このようにして得られた組 換えベクターは、5epopcr1000と呼ばれた（図2参照）。
oRV）によってPCR産物1および2から切り出し、HindIIIおよびEcoRVで切断された
ベクターpCRII (Invitrogen) にクローニングした。このようにして得られた組 換えベクターは、5epopcr1000と呼ばれた（図2参照）。
【００５３】 実施例4. EPO遺伝子ターゲッティングベクターの作製 4.1. NEO遺伝子、DHFR遺伝子およびCMVプロモーター/エンハンサーを含む遺伝子
活性化配列（図3参照）が、EPO相同性領域を含むプラスミド5epocr1000のAgeI部
位に挿入され、プラスミドp176が得られた（図4a参照）。CMVプロモーターをEPO
遺伝子の翻訳出発部位にできるだけ近付けるために、制限部位AscIおよびAgeIの
間の長さ963 bpの部分が除去され（部分切断）、プラスミドp179が得られた（図
4b）。
活性化配列（図3参照）が、EPO相同性領域を含むプラスミド5epocr1000のAgeI部
位に挿入され、プラスミドp176が得られた（図4a参照）。CMVプロモーターをEPO
遺伝子の翻訳出発部位にできるだけ近付けるために、制限部位AscIおよびAgeIの
間の長さ963 bpの部分が除去され（部分切断）、プラスミドp179が得られた（図
4b）。
【００５４】 4.2. 発現を最適化するために、EPOリーダー配列の出発Met-Gly-Val-Hisをコー ドするエクソン1のヌクレオチドが、合成配列Met-Ser-Ala-Hisによって置換され
た。この配列は、例えばSV40の制御下にヒトEPO遺伝子配列（Jacobsら、Nature
313 (1985), 806、およびLee-Huangら、Gene 128 (1993), 227）の3.5 kbのBstE
II/EcoRI断片（エクソン1〜5を含む）を含むプラスミドpEPO148のようなゲノムE
PO DNA配列を鋳型として、対応するプライマーを用いて、増幅して得られた。こ
のようにして、プラスミドp187が得られた（図4b）。
た。この配列は、例えばSV40の制御下にヒトEPO遺伝子配列（Jacobsら、Nature
313 (1985), 806、およびLee-Huangら、Gene 128 (1993), 227）の3.5 kbのBstE
II/EcoRI断片（エクソン1〜5を含む）を含むプラスミドpEPO148のようなゲノムE
PO DNA配列を鋳型として、対応するプライマーを用いて、増幅して得られた。こ
のようにして、プラスミドp187が得られた（図4b）。
【００５５】 4.3. プラスミドp189は、Psvtk-1 (PvuII/NarI断片)から得られた単純ヘルペス ウ イルスチミジンキナーゼ遺伝子（HSV-TK）を、プラスミド-187に挿入して、調製
された（図４c）。HSV-TK遺伝子は、CMVプロモーターに対して逆方向で、イント
ロン１（EcoRV/ClaI）の3'末端にあるSV40プロモーターの制御下にあり、相同組
換えのネガティブ選択になるはずである。
された（図４c）。HSV-TK遺伝子は、CMVプロモーターに対して逆方向で、イント
ロン１（EcoRV/ClaI）の3'末端にあるSV40プロモーターの制御下にあり、相同組
換えのネガティブ選択になるはずである。
【００５６】 4.4. プラスミドp190の作製のために、Simonsenら（Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 80 (1983) 2495）に記述されたDHFRのアルギニン変異のcDNAを含むプラスミド
pHEAVYのSfiI/BglII断片が、SfiIおよびBglIIで切断されたプラスミドpGenak-1 にサブクローニングされた。pGenak-1は、RSVプロモーターおよびターミネータ ーとしてSV40後期ポリアデニル化部位の制御下にあるNEO遺伝子、SV40初期プロ モーターおよびターミネーターとしてSV40初期ポリアデニル化部位の制御下にあ
るマウスDHFR遺伝子（Kaufmannら、Mol. Cell. Bio.. 2 (1982), 1304；Okayama
ら、Mol. Cell. Biol. 3 (1983), 280、およびSchimke, J. Biol. Chem. 263 (1
988), 5989）、およびCMVプロモーター（Boshartら、Cell 41(1995) 521）を含 む。その後、DHFRアルギニン変異をコードするcDNAを含むHpaI断片が、HpaIで切
断されたプラスミドp189に連結され、プラスミドp190が得られた（図4d）。
A 80 (1983) 2495）に記述されたDHFRのアルギニン変異のcDNAを含むプラスミド
pHEAVYのSfiI/BglII断片が、SfiIおよびBglIIで切断されたプラスミドpGenak-1 にサブクローニングされた。pGenak-1は、RSVプロモーターおよびターミネータ ーとしてSV40後期ポリアデニル化部位の制御下にあるNEO遺伝子、SV40初期プロ モーターおよびターミネーターとしてSV40初期ポリアデニル化部位の制御下にあ
るマウスDHFR遺伝子（Kaufmannら、Mol. Cell. Bio.. 2 (1982), 1304；Okayama
ら、Mol. Cell. Biol. 3 (1983), 280、およびSchimke, J. Biol. Chem. 263 (1
988), 5989）、およびCMVプロモーター（Boshartら、Cell 41(1995) 521）を含 む。その後、DHFRアルギニン変異をコードするcDNAを含むHpaI断片が、HpaIで切
断されたプラスミドp189に連結され、プラスミドp190が得られた（図4d）。
【００５７】 4.5. HSV-TK遺伝子を持たないトランスフェクションベクターを得るために、遺 伝子活性化配列を含むプラスミドp190のAscI/NheI断片が、エクソン1を含むプラ
スミドp187のAscI/NheI断片に連結された。得られたプラスミドはp192と命名さ れた（図4e）。
スミドp187のAscI/NheI断片に連結された。得られたプラスミドはp192と命名さ れた（図4e）。
【００５８】 実施例5. 細胞のトランスフェクション EPOの生産のために種々の細胞株が選択され、ターゲッティングベクターでト ランスフェクトされた。
【００５９】 5.1. Namalwa細胞 細胞はT150組織培養ボトル中で増殖させ、エレクトロポレーション（1 x 107 細胞/800μlエレクトロポレーション緩衝液20 mM Hepes、138 mM NaCl、5 mM KC
l、0.7 mM Na2HPO4、6 mM D-グルコース1水和物pH 7.0、10μg線状DNA、960μF 、260 V BioRad Gene Pulser）によってトランスフェクトした。エレクトロポレ
ーション後、RPMI 1640、10% (v/v)ウシ胎仔血清（FCS）、2 mM L-グルタミン、
1 mMピルビン酸ナトリウム中で、40枚の96ウェルプレート中で細胞を培養した。
2日後に、G-418を含む培地1 mg/ml中で細胞を10〜20日間培養した。上清は、固 相ELISAによってEPOの生産を試験した（実施例1.4参照）。EPOを生産するクロー
ンは24ウェルプレートおよびT-25組織培養ボトルで増殖させた。一部を凍結し、
細胞はFACSによってサブクローニングされた（Ventage、Becton Dickinson）。 サブクローンは、EPO生産について試験を繰り返した。
l、0.7 mM Na2HPO4、6 mM D-グルコース1水和物pH 7.0、10μg線状DNA、960μF 、260 V BioRad Gene Pulser）によってトランスフェクトした。エレクトロポレ
ーション後、RPMI 1640、10% (v/v)ウシ胎仔血清（FCS）、2 mM L-グルタミン、
1 mMピルビン酸ナトリウム中で、40枚の96ウェルプレート中で細胞を培養した。
2日後に、G-418を含む培地1 mg/ml中で細胞を10〜20日間培養した。上清は、固 相ELISAによってEPOの生産を試験した（実施例1.4参照）。EPOを生産するクロー
ンは24ウェルプレートおよびT-25組織培養ボトルで増殖させた。一部を凍結し、
細胞はFACSによってサブクローニングされた（Ventage、Becton Dickinson）。 サブクローンは、EPO生産について試験を繰り返した。
【００６０】 5.2. HT 1080細胞 HT 1080細胞はDMEM、10% (v/v) FCS、2 mM L-グルタミン、1 mMピルビン酸ナ トリウム中で培養されたという以外は、条件はNamalwa細胞で記述されたとおり である。エレクトロポレーションによるトランスフェクションのために、細胞を
トリプシン処理によって培養器の壁からはがした。エレクトロポレーション後、
1 x 107細胞は、5枚の96ウェルプレート上で、DMEM、10% (v/v) FCS、2 mM L-グ
ルタミン、1 mMピルビン酸ナトリウム中で培養された。
トリプシン処理によって培養器の壁からはがした。エレクトロポレーション後、
1 x 107細胞は、5枚の96ウェルプレート上で、DMEM、10% (v/v) FCS、2 mM L-グ
ルタミン、1 mMピルビン酸ナトリウム中で培養された。
【００６１】 5.3. HeLa S3細胞 HeLaS3細胞はRPMI 1640、10% (v/v) FCS、2 mM L-グルタミン、1% (v/v) NEM 非必須アミノ酸（Sigma社）、および1 mMピルビン酸ナトリウム中で培養された という以外は、条件はNamalwa細胞で記述されたとおりである。エレクトロポレ ーションによるトランスフェクションのために、細胞をトリプシン処理によって
培養器の壁からはがした。エレクトロポレーションの条件は960μF/250 Vだった
。エレクトロポレーション後、細胞は、RPMI 1640、10% (v/v) FCS、2 mM L-グ ルタミン、1% (v/v) NEM、および1 mMピルビン酸ナトリウム中で、T75組織培養 ボトルで培養された。エレクトロポレーションの24時間後、細胞をトリプシン処
理して、10枚の96ウェルプレート上で、600μg/mlのG-418を含む培地中で10〜15
日培養した。
培養器の壁からはがした。エレクトロポレーションの条件は960μF/250 Vだった
。エレクトロポレーション後、細胞は、RPMI 1640、10% (v/v) FCS、2 mM L-グ ルタミン、1% (v/v) NEM、および1 mMピルビン酸ナトリウム中で、T75組織培養 ボトルで培養された。エレクトロポレーションの24時間後、細胞をトリプシン処
理して、10枚の96ウェルプレート上で、600μg/mlのG-418を含む培地中で10〜15
日培養した。
【００６２】 実施例6. EPO遺伝子増幅 EPO発現を増加させるために、EPO生産クローンは、メトトレキセート（MTX） の濃度を上昇させながら（100 pM〜100 nM）、培養した。各MTX濃度で、クロー ンのEPO生産はELISAによって確認された（実施例1.4参照）。強い生産細胞は、 限界希釈によってサブクローニングした。
【００６３】 実施例7. EPO生産細胞株の解析 EPO遺伝子の活性化には、3つの細胞株（Namalwa、HeLa S3、およびHT 1080） が選択された。EPO生産クローンは、プラスミドp179、p187、p189、p190またはp
192のトランスフェクションによって得られた（実施例2および3参照）。
192のトランスフェクションによって得られた（実施例2および3参照）。
【００６４】 約160,000のNEO耐性クローンのEPO生産が試験され、そのうち12から15が細胞 上清にかなりの収量でEPOを繰り返し分泌していた。
【００６５】 これらのうち、7つのEPOクローンが、驚くべきことにMTXによる遺伝子増幅な しに同定され、大量の産業用生産に十分な量のEPOを生産していた。これらのク ローンのEPO生産は、24時間で106細胞あたり、200 ng/mlから1000 ng/ml以上ま での範囲だった。
【００６６】 500 nMのMTXによる遺伝子増幅後、同定されたEPOクローンのEPO生産は、24時 間で106細胞あたり3000 ng/ml以上に増加した。MTX濃度を1000 nMまでさらに増 加させると、生産は24時間で106細胞あたり7000 ng/ml以上に増加した。
【００６７】 得られたクローンは、無血清培養条件およびMTXの非存在下でも、EPO生産を示
した。
した。
【配列表】
【図１】 5'非翻訳配列、エクソン1、およびイントロン1の領域からのEPO遺伝子の相同 領域の増幅を模式的に表した図である。
【図２】 5'非翻訳配列、エクソン1、およびイントロン1の領域からの相同領域を含むプ
ラスミドを模式的に表した図である。
ラスミドを模式的に表した図である。
【図３】 ラウス肉腫ウイルスプロモーター(RSV)、ネオマイシンホスホトランスフェラ ーゼ遺伝子(NEO)、SV40の初期ポリアデニル化領域（SVI pA）、ジヒドロ葉酸レ ダクターゼ遺伝子（DHFR）のSV40初期プロモーター、およびサイトメガロウイル
スの極初期プロモーターおよびエンハンサー（MCMV）を含む遺伝子活性化配列を
模式的に表した図である。
スの極初期プロモーターおよびエンハンサー（MCMV）を含む遺伝子活性化配列を
模式的に表した図である。
【図４ａ】 EPO遺伝子ターゲッティングベクターp176の生産。
【図４ｂ】 EPO遺伝子ターゲッティングベクターp179およびp187の生産。
【図４ｃ】 EPO遺伝子ターゲッティングベクターp189の生産。
【図４ｄ】 EPO遺伝子ターゲッティングベクターp190の生産。
【図４ｅ】 EPO遺伝子ターゲッティングベクターp192の生産。
【配列番号：1および配列番号：2】 PCR産物1の作製に使用したプライマーのヌクレオチド配列（図1）。
【配列番号：3および配列番号：4】 PCR産物2の作製に使用したプライマーの配列（図1）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ０９／１１３，６９２ (32)優先日 平成10年７月10日(1998．7．10) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ペサラ ウルリッチ ドイツ国 エイルヘイム バレンムフル １ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA21 CA04 DA02 EA04 FA02 GA11 HA01 HA11 4B065 AA93X AA93Y AB01 BA03 CA24 CA44 CA46
Claims (15)
- 【請求項１】 (a) ヒト細胞株を以下の特徴の存在について試験する： (i) 所望の核酸配列を持つ標的遺伝子、 (ii) 浮遊培養で細胞数が14日以内に少なくとも5回の倍加、および (iii) 無血清培地で細胞数が14日以内に少なくとも5回の倍加、ならびに (b) (i)、(ii)および(iii)の特徴を満たす細胞株を、内因性標的遺伝子の活性
化の出発細胞株として使用する ことを特徴とする、細胞中に存在する標的遺伝子を内因性的に活性化することに
よるヒト蛋白質の調製のための、ヒト細胞株の選択方法。 - 【請求項２】 (iv) 培地中で1週間に16から256の細胞数の倍加をするよう な世代時間を有するヒト細胞株を用いることを特徴とする、請求項1記載の方法 。
- 【請求項３】 培地中で1週間に64から128の細胞数の倍加をするヒト細胞株
を用いることを特徴とする、請求項2記載の方法。 - 【請求項４】 (v) 標的遺伝子の内因性発現が実質的にないヒト細胞株を用
いることを特徴とする、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項５】 (vi) 標的遺伝子の染色体上のコピー数が2を超えるヒト細胞
株を用いることを特徴とする、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項６】 (vii) 天然に存在する標的蛋白質に匹敵するグリコシル化パ
ターンを持つ細胞蛋白質を合成するヒト細胞株を用いることを特徴とする、上記
請求項のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項７】 (viii) 検出可能な感染性汚染を持たないヒト細胞株を用い ることを特徴とする、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 【請求項８】 請求項1で定義された特徴(i)、(ii)および(iii)を満たす細 胞株を用いることを特徴とする、ヒト細胞株中の内因性遺伝子活性化によるヒト
蛋白質の調製方法。 - 【請求項９】 請求項2、4、5、6および7のいずれか一項に定義される特徴(
iv)、(v)、(vi)、(vii)および(viii)の少なくとも1つをさらに満たす細胞株を用
いることを特徴とする、請求項8記載の方法。 - 【請求項１０】 EPO、TPO、コロニー刺激因子、血液凝固に影響を与える蛋
白質、インターフェロン、インターロイキン、ケモカイン、神経栄養因子、骨成
長に影響を与える蛋白質、ヘッジホッグ蛋白質、腫瘍増殖因子、成長ホルモン、
ACTH、エンセファリン、エンドルフィン、受容体、および他の蛋白質結合蛋白質
から選択されるヒトの因子の調製のための、上記請求項のいずれか一項に記載の
方法。 - 【請求項１１】 EPOの調製のための、請求項10記載の方法。
- 【請求項１２】 活性化標的遺伝子にコードされるポリペプチドを得るため
に、細胞中に内因性的に存在する標的遺伝子の活性化の後における、請求項1か ら11のいずれか一項に記載の方法によって同定されるヒト細胞株の使用。 - 【請求項１３】 大型発酵槽中でポリペプチドを得るための、請求項12記載
の使用。 - 【請求項１４】 ヒト細胞で活性な異種プロモーターに機能的に連結した内
因性遺伝子を1コピー含み、内因性遺伝子にコードされるポリペプチドを、106細
胞/24時間にて少なくとも200 ng生産する能力を持つことを特徴とするヒト細胞 株。 - 【請求項１５】 ヒト細胞中で活性な異種プロモーターにそれぞれが機能的
に連結した内因性遺伝子を数コピー含み、内因性遺伝子にコードされるポリペプ
チドを、106細胞/24時間にて少なくとも1000 ng生産する能力を持つことを特徴 とする、請求項14記載の細胞の遺伝子増幅によって得られるヒト細胞株。
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|---|---|---|---|
| EP97112640 | 1997-07-23 | ||
| EP97121073 | 1997-12-01 | ||
| US09/113,692 | 1998-07-10 | ||
| US09/113,692 US6548296B1 (en) | 1997-07-23 | 1998-07-10 | Methods for identifying human cell lines useful for endogenous gene activation, isolated human lines identified thereby, and uses thereof |
| US97112640.4 | 1998-07-10 | ||
| US97121073.7 | 1998-07-10 | ||
| PCT/EP1998/004584 WO1999005267A1 (de) | 1997-07-23 | 1998-07-22 | Identifizierung humaner zellinien zur produktion humaner proteine durch endogene genaktivierung |
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