JP4541539B2 - 内因性遺伝子活性化によるエリスロポエチンの製造 - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明は、内因性ヒトEPO遺伝子の活性化を基に、薬学的製剤としてのヒトEPOの経済的製造に十分な量および純度でEPO産生が可能なヒト細胞に関する。本発明は更に、このようなヒトEPO-産生細胞の製造法、ヒト細胞における内因性EPO遺伝子の活性化のためのDNA構築物、およびヒト細胞におけるEPOの大規模製造法に関する。
【０００２】
エリスロポエチン(EPO)は、赤血球産生を刺激するヒト糖タンパク質である。EPOは、健常なヒトの血漿中に非常に低い濃度でのみ生じ、そのため大量の調製はこの方法では不可能である。EP-B 0148 605およびEP-B 0205 564は、CHO細胞における組換えヒトEPOの製造を開示している。EP-B 0148 605号に開示されているEPOは、尿EPOよりも大きい分子量を有するが、O-グリコシル化は受けない。一方、EP-B 0205 564に開示されているように、CHO細胞由来のEPOは、大量かつ純粋な形状で得ることができるが、これはヒト以外の細胞に由来している。更にCHO細胞の産生能は比較的限定的であることが多い。
【０００３】
更に再生不良性貧血患者の尿からヒトEPOが回収できることがわかっている（Miyakeら、J.Biol.Chem., 252:5558-5564(1977)）。この論文では、イオン交換クロマトグラフィー、エタノール沈殿、ゲル濾過および吸着クロマトグラフィーを含む、７工程の方法が示されている。比活性が約70,000U/mgタンパク質であるEPO調製物が収率21％で得られる。尿EPOを得るこの方法および他の方法の欠点は、十分量の出発材料の調達と、品質の再現性の点である。更に尿からの精製は困難であり、たとえ精製された生成物であっても尿の混入を避けることができない。
【０００４】
GB-A 2085 887は、少量のEPO産生が可能なヒトリンパ芽球細胞の調製法を開示している。これらの細胞の医薬としての経済的製造は不可能である。
【０００５】
国際公開公報第91/06667号は、EPOの組換え調製法を開示している。ヒト初期胚の腎細胞における第一の工程において、内因性EPO遺伝子は、相同組換えによって、ウイルスプロモーターにより機能的な連結となり、かつDNAがこれらの細胞から単離される。第二の工程において、このようにして単離されたDNAは、非ヒトのCHO細胞に形質転換され、かつこれらの細胞におけるEPOの発現が分析される。ヒト細胞におけるEPOの調製が可能であるかについては言及されていない。
【０００６】
国際公開公報第93/09222号は、ヒト細胞におけるEPOの調製を開示しており、ここでは完全なEPO遺伝子を含むベクターによりトランスフェクションされたヒト繊維芽細胞において、960,620mU／106細胞／24時間までの比較的多量のEPOの産生が認められている。これらの細胞は、正確なEPO遺伝子座にはない外因性EPO遺伝子を含んでおり、その結果細胞株の安定性に関する問題点が予想される。国際公開公報第93/09222号には、構成性EPOの製造に関する情報はない。更に、産生されたEPOが薬学的目的にかなう品質で得ることができるかどうかに関する情報もない。
【０００７】
更に国際公開公報第93/09222号においては、ヒトHT1080細胞における内因性EPO遺伝子の活性化が開示されている。その中では、EPO-産生が、24時間でわずかに2,500mU／106細胞（およそ16ng／106細胞／24時間に相当）であることが認められている。このような緩徐な生成は、薬学的製剤の経済的製造には全く適していない。
【０００８】
国際公開公報第94/12650号および第95/31560号は、ウイルスプロモーターによって活性化された内因性EPO遺伝子を有するヒト細胞が、どのようにして内因性EPO遺伝子の増幅後に、およそ100,000mU／106細胞／24時間（約0.6μg／106細胞／24時間に相当）ものEPOを産生するかを開示している。この量は医薬品を経済的に製造するには依然不十分である。
【０００９】
従って本発明の基本となる問題点は、当技術分野の前述の欠点を少なくとも部分的になくし、かつヒト細胞におけるEPOの調製に関する技術的により良い方法を提供することである。特にこれは、薬学的目的での経済的製造を可能にするのに十分な量および純度の生成物を得ることを可能にする。
【００１０】
この問題点は、ヒト細胞における内因性EPO遺伝子の活性化によって、場合によってはそれに続く活性化されたヒトEPO遺伝子の増幅によって解決される。この方法においては、驚くべきことに、適当な出発細胞、DNA構築物および選択戦略を選択することによって、薬学的製剤の経済的製造を可能にするのに十分な量、質および純度でのEPO産生が可能であるようなヒト細胞を提供することが可能になった。特に活性化された内因性EPO遺伝子の増幅後に、組換えEPOの調製のためにこれまで使用されてきたCHO産生細胞よりも明確に多い産生量を有する細胞を得ることができる。
【００１１】
本発明のひとつの主題は、ヒト細胞において活性のある異種発現調節配列と機能的に連結した内因性EPO遺伝子のコピーを含み、かつ先の遺伝子増幅を伴わずともEPOの少なくとも200ng／106細胞／24時間の産生が可能であるようなヒト細胞である。本発明に係るヒト細胞は、EPOの200〜3000ng／106細胞／24時間の産生が可能であることが好ましく、1000〜3000ng EPO／106細胞／24時間の産生が最も好ましい。
【００１２】
本発明の別の主題は、前述の細胞の遺伝子増幅によって得ることが可能であり、かつ各々がヒト細胞において活性のある異種発現調節配列と機能的に連結している内因性EPO遺伝子を数コピー含み、かつEPOの少なくとも1,000ng／106細胞／24時間の産生が可能であるようなヒト細胞である。
【００１３】
特に好ましいのは、遺伝子増幅によって得ることが可能なヒト細胞株が、EPOを1,000〜25,000ng／106細胞／24時間で産生できること、最も好ましくはEPOを5,000〜25,000ng／106細胞／24時間で産生できることである。
【００１４】
ヒト細胞は、インビトロにおいて培養することができるものであればいかなる細胞でもよい。特に好ましいのは、無血清培地において、特に浮遊液において培養することができるヒト細胞である。この方法において、EPOの生成は、例えば培養容積が1,000Lといった巨大な発酵槽において行うことができる。
【００１５】
特に好ましいのは、不死化された細胞、例えばHT1080細胞（Rasheedら、Cancer、33:1027-1033(1974)）、HeLaS3細胞（Puckら、J.Exp.Med.、103:273-286(1956)）、Namalwa細胞（Nadkarniら、Cancer、23:64-79(1969)）、またはそれらに由来する細胞のような、ヒト細胞である。
【００１６】
本発明の細胞の例は、ブダペスト条約の規定に従いDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)（Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig）に、1997年7月15日に寄託され、寄託番号がDSM ACC 2320である、クローン「Aladin」である。
【００１７】
本発明の細胞において、内因性EPO遺伝子は、ヒト細胞において活性がある異種発現調節配列に連結している。この発現調節配列は、プロモーター、および好ましくは例えばエンハンサーのような追加の発現促進配列を含んでいる。このプロモーターは、調節可能なまたは構成性のプロモーターであることができる。好ましくは、プロモーターは、強力なウイルスプロモーター、例えばSV40またはCMVプロモーターなどである。CMVプロモーター／エンハンサーが特に好ましい。
【００１８】
更にEPO発現を最適化するためには、異種プロモーターと機能的に結合しているヒト細胞中の内因性EPO遺伝子が、天然のシグナルペプチド−コード配列とは異なり、かつ好ましくは修飾されたアミノ酸配列を伴うシグナルペプチドをコードしているようなシグナルペプチド−コード配列を有することが好ましい。特に好ましいのは、下記から選択されるような、最初の４個のアミノ酸領域が修飾されたシグナルペプチド配列をコードしているシグナルペプチド−コード配列であり：
Met-X1-X2-X3
（式中、X1はGlyまたはSer、X2はAla、Val、Leu、Ile、SerまたはPro、およびX3はPro、Arg、CysまたはHisであるが、但しX1-X2-X3は配列Gly-Val-Hisではない。）、特に(a)Met-Gly-Ala-His
(b)Met-Ser-Ala-His
(c)Met-Gly-Val-Pro、または
(d)Met-Ser-Val-Hisから選択される配列である。
【００１９】
特に好ましいのは、シグナルペプチドの最初の４個のアミノ酸配列が、Met-Ser-Ala-Hisである。
【００２０】
別の局面において、本発明は、以下の段階を含む、前述のヒトEPO-産生細胞の製造法に関する：
(a)内因性EPO遺伝子の少なくとも1個のコピーを含むヒト出発細胞を提供する段階、
(b)下記を含む、DNA構築物により該細胞をトランスフェクションする段階：
(i)相同組換えを可能にするための、ヒトEPO遺伝子座の領域と相同な2個のフランキングDNA配列、
(ii)ポジティブ選択マーカー遺伝子、および
(iii)ヒト細胞において活性がある異種発現調節配列、
(c)トランスフェクションされた細胞を、ポジティブ選択マーカー遺伝子の存在について選択が行われるような条件下で培養する段階、
(d)段階(c)で選択可能な細胞を分析する段階、および
(e)EPO-産生細胞を同定する段階。
【００２１】
ヒトEPO産生細胞の調製において使用されたDNA構築物は、相同組換えを可能にするための、ヒトEPO遺伝子座の領域と相同な２個のフランキングDNA配列を含む。適当なフランキング配列の選択は、例えば国際公開公報第90/11354号および第91/09955号に開示された方法によって行われる。好ましくはこれらのフランキング配列は、各々少なくとも150bpの長さを有する。特に好ましいのは、相同なDNA配列が、EPO遺伝子の5'-非翻訳配列、エクソン1およびイントロン1の領域から選択されることである。最初のアミノ酸が修飾されたシグナルペプチドをコードしている、エクソン1の領域が修飾されたDNA配列を使用することが特に好ましい。好ましくは、前述のようなエクソン1領域の修飾である。
【００２２】
選択マーカー遺伝子は、真核細胞に適した任意の選択マーカー遺伝子であってよく、これは発現時に選択可能な表現型、例えば抗生物質耐性、栄養要求性などをもたらす。特に好ましいポジティブ選択マーカー遺伝子は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子である。
【００２３】
選択的に、いわゆるHSV-チミジンキナーゼ遺伝子のような、ネガティブ選択マーカー遺伝子が存在していてもよく、これによって選択剤の存在下で発現細胞が破壊される。
【００２４】
ヒト細胞において内因性的に活性化されたEPO遺伝子の増幅が望ましい場合は、DNA構築物は増幅遺伝子を含む。適当な増幅遺伝子の例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどである。特に好ましい増幅遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子であり、特に野生型遺伝子よりも選択剤（メトトレキセート）に対して比較的低い感受性を有するジヒドロ葉酸レダクターゼアルギニン変異体である（Simonsenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、80：2495（1983））。
【００２５】
EPO遺伝子活性化のために使用されるDNA構築物中に増幅遺伝子が存在する場合は、本発明の方法は更に下記の段階も含むことができる：
(f)EPOをコードしているDNA配列を増幅する段階、および
(g)異種発現調節配列と機能的に連結している成熟EPOをコードする内因性DNA配列の多くのコピーを、出発細胞と比較してより多く含むEPO-産生細胞を得る段階。
【００２６】
ヒト出発細胞中に存在する内因性EPO遺伝子の活性化に適したDNA構築物は、実施例に列記されたプラスミドであり；p187、p189、p190およびp192、またはそれらに由来するプラスミドである。特に好ましいのは、ブダペスト条約の規定に従い、1997年7月16日にDSMZに寄託された、寄託番号がDSM 11661であるプラスミドp189、またはそれに由来するプラスミドである。好ましくはDNA構築物は、線状化された形でヒト細胞のトランスフェクションに使用される環状プラスミド分子である。
【００２７】
本発明の別の主題は、下記を含む、ヒト細胞における内因性EPO遺伝子の活性化のためのDNA構築物である：
(i)相同組換えを可能にするための、5'-非翻訳配列、エクソン1およびイントロン1から選択されたヒトEPO遺伝子座の領域と相同であるように選択された２個のフランキングDNA配列で、修飾された配列は下記アミノ酸をコードしているエクソン1領域に存在し：
Met-X1-X2-X3
（式中、X1はGlyまたはSer、X2はAla、Val、Leu、Ile、SerまたはPro、およびX3はPro、Arg、CysまたはHisであるが、但しX1-X2-X3は配列Gly-Val-Hisではない。）、特にアミノ酸が、
(a)Met-Gly-Ala-His
(b)Met-Ser-Ala-His
(c)Met-Gly-Val-Pro、または
(d)Met-Ser-Val-Hisであるもの、
(ii)ポジティブ選択マーカー遺伝子、
(iii)ヒト細胞において活性がある異種発現調節配列、および
(iv)選択的に、増幅遺伝子。
【００２８】
本発明の更に別の主題は、下記を含む、ヒト細胞における内因性EPO遺伝子の活性化のためのDNA構築物である：
(i)相同組換えを可能にするための、5'-非翻訳配列、エクソン1およびイントロン1から選択されたヒトEPO遺伝子座の領域と相同な２個のフランキングDNA配列、
(ii)ポジティブ選択マーカー遺伝子、
(iii)ヒト細胞において活性がある異種発現調節配列であり、異種発現調節配列とEPO遺伝子の翻訳開始点との間の距離が1100bpを超えることのない配列、および
(iv)選択的に、増幅遺伝子。
【００２９】
驚くべきことに、EPOシグナル配列の修飾および／または異種発現調節配列とEPO遺伝子の開始点との距離の短縮が生じた場合に、最適化された発現が得られることが判明した。好ましくは異種発現調節配列のプロモーターとEPO遺伝子の翻訳開始点との間の距離は、1100bpよりも大きくなく、特に好ましいのは150bpを超えず、最も好ましいのは100bpを超えないものである。本発明で使用されるDNA構築物の特に好ましい例は、プラスミドp189(DSM 11661)またはそれに由来するプラスミドである。
【００３０】
更に別の本発明の局面は、ヒトEPOの調製法であり、ここでは本発明のヒト細胞は、適当な培地において、EPOの産生が行われるような条件下で培養され、かつEPOが培地から回収される。優先的に無血清培地が使用される。細胞は好ましくは浮遊液において培養される。培養は、特に優先的に発酵槽、特に例えば容積が10L〜50,000Lであるような巨大な発酵槽において行われる。
【００３１】
ヒト細胞株の培地からのヒトEPOの回収には、好ましくは以下の段階が含まれる：
(a)細胞上清をアフィニティークロマトグラフィー媒質上を通過させ、EPOを含有する分画を回収する段階、
(b)選択的に、EPO含有分画を疎水性相互作用クロマトグラフィー媒質上を通過させ、EPO含有分画を回収する段階、
(c)EPO含有分画をヒドロキシアパタイト上を通過させ、EPO含有分画を回収する段階、および
(d)濃縮するおよび／または逆相(RP)-HPLC媒質上を通過させる段階。
【００３２】
前述の精製法の段階(a)は、場合によっては前処理することができる細胞上清を、アフィニティクロマトグラフィー媒質上を通過させることを含む。好ましいアフィニティクロマトグラフィー媒質は、それに青色色素が組み合わされたものである。特に好ましい例はブルーセファロースである。
【００３３】
アフィニティークロマトグラフィー媒質からの溶離後、EPOを含有する溶離液を、選択的に疎水性相互作用クロマトグラフィー媒質上を通過させる。この工程は、血清含量が≧2容量％の培地を使用する場合の便宜的方法である。例えば1容量％のような低い血清含量の培地を使用する場合、もしくは、無血清培地を使用する場合は、この工程は省略することができる。好ましい疎水性相互作用クロマトグラフィー媒質は、ブチルセファロースである。
【００３４】
段階(a)、または使用される場合は段階(b)の溶離液を、本発明の方法の工程(c)において、ヒドロキシアパタイト上を通過させ、EPO含有溶離液を、濃縮工程および／または逆相HPCL精製工程に供する。濃縮は、好ましくは例えば排除サイズが10kDであることが証明された膜のような媒質を使用する膜ろ過などの排除クロマトグラフィーによって行われる。
【００３５】
本発明の方法によって、インビボ（正赤血球マウス）での比活性が少なくとも100,000U/タンパク質mgであるような単離されたヒトEPOを得ることができ、これは尿の混入がなく、かつCHO細胞由来の組換えEPOとは、そのグリコシル化が異なり得る。好ましくは本発明のEPOは、比活性が少なくとも175,000の、及び特に好ましいのは少なくとも200,000〜400,000または450,000IU/タンパク質mgを持つ。本発明の方法で得ることができるヒトEPOは、α-2,3-および／またはα-2,6-結合したシアル酸残基を含むことができる。内因性に活性化されたEPO遺伝子を含む細胞からのEPOの研究において、本発明の予備的結果を基に、α-2,3-およびα-2,6-結合したシアル酸残基の存在が認められた。更に、本発明の予備的結果を基に、本発明のヒトEPOが、N-アセチルノイラミン酸含量に対しN-グリコリルノイラミン酸の含量が0.2％未満であることが判明した。
【００３６】
本発明のヒトEPOの純度は、好ましくは総タンパク質含量の少なくとも90％、特に好ましくは少なくとも95％、および最も好ましくは少なくとも98％である。総タンパク質含量の決定は、例えばPoros R/2Hカラムのような逆相HPLCによって行うことができる。
【００３７】
更に本発明の方法によって、アミノ酸配列が異なるヒトEPO種を得ることが可能である。従って、ヒトEPOをHeLa S3細胞から単離することができ、これは主に長さが165個のアミノ酸のポリペプチドであり、アルギニン残基のC末端処理によって形成され、かつ一部の場合では166個のアミノ酸を持つEPOを15％まで含むことが、質量スペクトル分析(MALDI-MS)によって判明した。更に長さ166個のアミノ酸を持つポリペプチドを含むヒトEPO、すなわち未処理のEPOを得ることができる。Namalwa細胞からは、例えば長さ165および166個のアミノ酸のポリペプチドの混合物を含むヒトEPOが単離された。
【００３８】
このヒトEPOは、薬学的に一般的な補助剤、賦形剤および添加剤に加えて更に別の活性物質を含むことができる薬学的製剤の活性物質として使用することができる。
【００３９】
本発明の更に別の局面においては：
Met-X1-X2-X3
（式中、X1はGlyまたはSer、X2はAla、Val、Leu、Ile、SerまたはPro、およびX3はPro、Arg、CysまたはHisであるが、但しX1-X2-X3は配列Gly-Val-Hisではない。）から選択され、特にアミノ酸が：
(a)Met-Gly-Ala-His
(b)Met-Ser-Ala-His
(c)Met-Gly-Val-Pro、または
(d)Met-Ser-Val-Hisから選択される、シグナルペプチドの最初の４個のアミノ酸の領域が修飾された配列を伴うヒトEPOをコードする単離されたDNAに関する。
【００４０】
このDNAは、例えばゲノムDNAまたはcDNAであることができる。
【００４１】
本発明は下記の実施例ならびに図面および配列表により更に説明される。
【００４２】
実施例
工業的規模でのタンパク質製造のためのEPO遺伝子座の活性化は、選択のためのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(NEO)遺伝子（G-418耐性）、マウスのジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子（MTXによる遺伝子増幅のため）、ならびに遺伝子活性化のためのサイトメガロウイルス(CMV)前初期プロモーターおよびエンハンサーを含む遺伝子活性化配列の相同組込みによって達成された。
【００４３】
実施例１ EPO相同領域のクローニング
EPO遺伝子の相同領域を、ゲノム胎盤DNA（ベーリンガー・マンハイム社）を用いて増幅した。２種のPCR産物を、EPO遺伝子の5'-非翻訳配列、エキソン1およびイントロン1の領域からの長さ6.3kBの相同領域から調製した（図１参照）。PCR産物１の調製に使用したプライマーは、下記の配列を有した：5'-CGC GGC GGA TCC CAG GGA GCT GGG TTG ACC GG-3'（配列番号：１）および5'-GGC CGC GAA TTC TCC GCG CCT GGC CGG GGT CCC TCA GC-3'（配列番号：２）。PCR産物２の調製に使用したプライマーは、下記の配列を有した：5'-CGC GGC GGA TCC TCT CCT CCC TCC CAA GCT GCA ATC-3'（配列番号：３）および5'-GGC CGC GAA TTC TAG AAC AGA TAG CCA GGC TGA GAG-3'（配列番号：４）。
【００４４】
所望のセグメントを、制限酵素による切断によりPCR産物１および２から切り出し（PCR産物１：HindIII、PCR産物２：HindIIIおよびEcoRV）、かつHindIIIおよびEcoRVで切断したベクターpCRII（インビトロゲン社）にクローン化した。この方法で得られた組換えベクターを5epopcr1000と称した（図２参照）。
【００４５】
実施例２ EPO遺伝子ターゲティングベクターの構築
2.1 NEO遺伝子、DHFR遺伝子およびCMVプロモーター／エンハンサーを含む遺伝子活性化配列（図３参照）を、EPO相同領域を含むプラスミド5epocr1000のAgeI部位に挿入し、プラスミドp176を得た（図4a参照）。CMVプロモーターをEPO遺伝子の翻訳開始座にできるだけ近接させるために、長さ963bpのセグメントを、制限部位AscIとAgeIの間で欠失し（部分的切断）、これによりプラスミドp179を得た（図4b）。
【００４６】
2.2 発現を最適化するために、EPOリーダー配列Met-Gly-Val-Hisの開始部をコードしているエクソン1のヌクレオチドを、合成配列Met-Ser-Ala-Hisで置換した（実施例６も参照のこと）。この配列は、鋳型としてのSV40プロモーター（Jacobsら、Nature、313:806(1985)およびLee-Huangら、Gene、128:227(1993)）の制御下での、プライマーEx4（配列番号：９）およびEx17（配列番号：17）による、ゲノムEPO-DNA配列、例えばヒトEPO遺伝子配列の3.5kB BstEII／EcoRI断片（エクソン1-5を含む）を含むプラスミドpEPO148などの増幅によって得た（表１）。こうしてプラスミドp187を得た（図4b）。
【００４７】
2.3 プラスミドp189は、プラスミドp187に、Psvtk-1に由来する単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子(HSV-TK)（PvuII／NarI断片）を挿入することにより得た（図4c）。HSV-TK遺伝子は、CMVプロモーターに対して逆向きのイントロン1（EcoRV／ClaI）の3'末端側がSV40プロモーターの制御下にあり、かつ相同組換えに関するネガティブ選択に利用されなければならない。
【００４８】
2.4 プラスミドp190の構築のために、Simonsenらの論文（Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 80:2495(1983)）に記されたDHFRのアルギニン変異体のcDNAを含むプラスミドであるpHEAVYのSfiI／BglII断片を、RSVプロモーターおよび転写終結信号としての後期SV40ポリアデニル化部位制御下にあるNEO遺伝子、初期SV40プロモーターおよび転写終結信号としての初期SV40ポリアデニル化部位の制御下にあるマウスのDHFR遺伝子（Kaufmannら、Mol.Cell Biol.、2:1304(1982)；Okayamaら、Mol.Cell Biol.、3:280(1983)）、およびSchimke、J.Biol.Chem.、263:5989(1988)）、ならびにCMVプロモーター（Boshartら、Cell、41:521(1995)）を含んでいるプラスミドpGenak-1のSfiIおよびBglII切断断片にサブクローニングした。その後DHFRアルギニン変異体をコードしているcDNAを含むHpaI断片を、HpaIで切断したプラスミドp189にライゲーションし、プラスミドp190を得た（図4d）。
【００４９】
2.5 HSV-TK遺伝子を持たないトランスフェクションベクターを得るために、遺伝子活性化配列を含むプラスミドp190のAscI／NheI断片を、プラスミドp187のエクソン1を含むAscI／NheI断片にライゲーションした。得られたプラスミドをp192と称した（図4e）。
【００５０】
実施例３ 細胞のトランスフェクション
EPO産生のために、様々な細胞株を選択し、かつターゲティングベクターでトランスフェクションした。
【００５１】
3.1 Namalwa細胞
細胞を、T150組織培養ボトル中で培養し、かつ電気穿孔により（1x107細胞／800μlの電気穿孔用バッファー、20mM Hepes、138mM NaCl、5mM KCl、0.7mM Na2HPO4、6mM D-グルコース一水和物、pH7.0、10μg線状化したDNA、960μF、260V、バイオラド社、ジーンパルサー）トランスフェクションした。電気穿孔後、細胞を、46個の96ウェルプレートを用いて、RPMI 1640、10容量％ウシ胎仔血清(FCS)、2mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム中で培養した。２日たった後、細胞を1mg/mlのG-418含有培地中で10〜20日間培養した。EPO産生を調べるために、上清を固相ELISAで試験した（実施例４参照のこと）。EPO産生クローンは、24ウェルプレートおよびT-25組織培養ボトル中で増殖(expand)した。アリコートを凍結し、細胞を蛍光標示式細胞分取器(FACS)（Ventage、ベクトン・ディキンソン社）によってサブクローニングした。これらのサブクローンを、EPO産生について再度調べた。
【００５２】
3.2 HT1080細胞
条件は、HT1080細胞をDMEM、10容量％FCS、2mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム中で培養した以外は、Namalwa細胞について記したものと同様であった。電気穿孔によるトランスフェクションのために、細胞をトリプシン処理により培養容器の壁からはずした。電気穿孔後、1x107細胞を、５個の96ウェルプレートを用いて、DMEM、10容量％FCS、2mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウムの中で培養した。
【００５３】
3.3 HeLa S3細胞
条件は、HeLa細胞をRPM 1640、10容量％FCS、2mM L-グルタミン、1容量％MEM非必須アミノ酸（シグマ社）、および1mMピルビン酸ナトリウム中で培養した以外は、Namalwa細胞について記したものであった。電気穿孔によるトランスフェクションのために、細胞をトリプシン処理により培養容器の壁からはずした。電気穿孔の条件は、960μF/250Vであった。電気穿孔後、細胞を、T75組織培養容器を用いて、RPM 1640、10容量％FCS、2mM L-グルタミン、1容量％MEM、1mMピルビン酸ナトリウム中で培養した。電気穿孔の24時間後、細胞をトリプシン処理し、かつ10個の96ウェルプレートにおいて、G-418を600μg/ml含有する培地中で10〜15日間培養した。
【００５４】
実施例４ EPO-産生クローンの選択
トランスフェクションした細胞の培養液の上清を、EPO ELISAにより調べた。全ての工程は室温で行った。あらかじめストレプトアビジンで被覆した96ウェルプレートを、ビオチン化した抗EPO抗体（ベーリンガー・マンハイム社）で被覆した。被覆のために、プレートを最初に50mMリン酸ナトリウムpH7.2、および0.05容量％Tween20で洗浄した。その後被覆バッファー（4μg/mlビオチン化した抗体、10mMリン酸ナトリウムpH7.2、3g/Lウシ血清アルブミン、20g/Lサッカロース、および9g/L NaCl）0.01mlを、各ウェルに添加し、かつ室温で３時間インキュベーションした。その後プレートを50mMリン酸ナトリウムpH7.2で洗浄し、乾燥し、かつ密封した。
【００５５】
試験前に、前述のプレートをリン酸バッファー塩類溶液(PBS)0.3mlおよび0.05％Tween20（シグマ社）で３回洗浄した後；非特異的結合を阻害するために、プレートを、１ウェルにつき0.2ml PBSおよび1重量／容量％Crotein（ベーリンガー・マンハイム社）と共に、一晩インキュベーションした。
【００５６】
阻害液を除去した後、培養液上清0.1mlを添加し、かつプレートを一晩インキュベーションした。個々のウェルを、各回0.3ml PBSおよび0.05％Tween20で３回洗浄した。その後モノクローナル抗体（ベーリンガー・マンハイム社、150mU/ml）に結合したペルオキシダーゼ(POD)100μlを２時間添加した。次にウェルを、再度各回0.3ml PBSおよび0.05％Tween20で３回洗浄した。その後基質としてABTS（登録商標）を用いてペルオキシダーゼ反応を進行させ、パーキンエルマーホトメーターを用い405nmで調べた。CHO細胞からの組換えEPO（ベーリンガー・マンハイム社、100〜1000pg／ウェル）を用いて作成した標準較正曲線を用いて、EPO濃度を求めた。
【００５７】
実施例５ EPO遺伝子増幅
EPO発現を増すために、EPO-産生クローンを、漸増濃度（100pM〜1000nM）のメトトレキセート(MTX)存在下で培養した。EPOの産生について、これらのクローンを、ELISAにより各MTX濃度で試験した（実施例４参照）。強力な産生体は、限定された希釈でサブクローニングされた。
【００５８】
実施例６ シグナル配列の突然変異
EPO分子のリーダー配列を最適化するために、エクソン1によってコードされた最初のアミノ酸を置換した。異なる配列のプライマー（配列番号：４〜17；修飾された配列の選択のためにCelII切断部位を含んだ3'プライマー）を用いて、SV40プロモーター（Jacobsら、Nature、313:806(1985)；Lee-Huangら、Gene、128:227(1993)）の制御下で、ヒトEPO遺伝子配列の4kbのHindIII／EcoRI断片（エクソン1〜5を含む）を含むプラスミドpEPO227を用いるPCRにより、鋳型としてAscI／XbaI断片を得た。その後得られた断片を、プラスミドpEPO148（実施例2.2）にクローン化し、その後プラスミドpEPO 182、183、184および185を得た（図５）。EPO遺伝子発現は、SV40プロモーターによって起動された。COS-7細胞を、前述の構築物で一過性にトランスフェクションし（DEAEデキストラン法）、この細胞をトランスフェクション後のEPO産生について48時間調べた。
【００５９】
この方法で得られた変異リーダー配列Met-Ser-Ala-Hisで最良のEPO発現を示すものを用いて、遺伝子ターゲティングベクターを構築した（実施例2.2参照）。
【００６０】
実施例７ EPO-産生細胞株の特徴
３種の異なる細胞株（Namalwa、HeLaS3およびHT1080）をEPO遺伝子活性化のために選択した。EPO-産生クローンを、プラスミドp179、p187、p189、p190またはp192によるトランスフェクションにより得た（実施例２および３を参照のこと）。
【００６１】
およそ160,000 NEO-耐性クローンをEPO産生について試験し、その中の12〜15は再現性をもって細胞上清に顕著な収量のEPOを分泌した。
【００６２】
これらの中の合計７種のEPOクローンは、遺伝子増幅をすることなく、MTXによりEPOを大規模工業的製造に十分な量で産生したことが驚くべきことに確定された。これらのクローンのEPO産生は、200ng/mlから1000ng/ml/106細胞/24時間以上までの範囲であった。このような細胞のひとつの例は、Namalwa細胞から得られたクローン「Aladin」であり、これはDSMZ(DSM ACC 2320)に寄託されている。
【００６３】
500nM MTXで遺伝子を増幅した後、同定されたEPOクローンのEPO産生は、3000ng/ml/106細胞/24時間以上まで増大していた。MTXの濃度を1000nMに更に増やすと、7000ng/ml/106細胞/24時間にも及ぶ産生がもたらされた。
【００６４】
得られたクローンは、無血清培養条件下でのEPO産生も示した。
【００６５】
実施例８ EPO-産生クローンのゲノムの特徴
8.1 方法
ヒトゲノムDNAを、約108細胞から単離し、定量した（Sambrookら、1989）。このゲノムDNAを、各々、例えばAgeIおよびAscI、またはBamHI、HindIIIおよびSalIのような制限酵素で切断した後、アガロースゲル電気泳動により、DNA断片を大きさに従って分離し、最後にナイロン膜に移し、固定化した。
【００６６】
固定化したDNAを、ジゴキシゲニンで標識したEPOプローブまたは遺伝子活性化配列に特異的なDNAプローブ（DIG DNA標識キット、ベーリンガー・マンハイム社）でハイブリダイゼーションし、かつストリンジェントな条件下で洗浄した。特異的なハイブリダイゼーションシグナルを、放射線感光フィルムを用いる化学発光法により検出した。
【００６７】
8.2 結果
細胞の500nM MTXによる処理は、EPO座におけるハイブリダイゼーションシグナルの5〜10倍までの増大をもたらした。1000nM MTXに更に増すと10倍以上の増大が得られた（図6a）。
【００６８】
EPOに特異的なプローブとのハイブリダイゼーションの場合は、相同組換えによって影響を受けない染色体７のコピーも検出された。図6bに認められるように、これらの同様にハイブリダイゼーションしているDNA断片は、異なる明確に区別できるサイズを有し、かつMTXの使用によりそれらのシグナル強度は変化しなかった。
【００６９】
実施例９ ヒト細胞株の培養液上清からのEPOの精製（HeLa S3、NamalwaおよびHT1080）
ヒト細胞株の細胞培養液上清からEPOを精製するために、基本的には２種の方法を用いたが、これらはクロマトグラフィー工程の数および原理が異なり、培地の組成およびEPO濃度に応じて使用した：
方法１：第一工程：ブルーセファロースカラム
第二工程：ブチル−セファロースカラム
第三工程：ヒドロキシアパタイトカラム
第四工程：再濃縮
方法２：第一工程：ブルーセファロースカラム
第二工程：ヒドロキシアパタイトカラム
第三工程：再濃縮
（代わりの第三工程：RP-HPLC）
【００７０】
方法１による2容量％ウシ胎仔血清(FCS)を含むHeLa S3細胞培養液上清の精製の例：
1.ブルーセファロースカラム
Hi-トラップ-ブルーカラム（ファルマシア社のブルーセファロースのそのまま使用できるカラム）5mlを、少なくともカラム容量（SV'）の５倍のバッファーA（20mM Tris-HCl、pH7.0；5mM CaCl2；100mM NaCl）で平衡化した。その後HeLa細胞の上清70ml（およそ245μgのEPOおよび70〜100mgの総タンパク質を含有する）を、循環法(circulatory method)により、一晩かけて0.5ml／分の流量で流出した。
【００７１】
このカラムを、少なくとも5SV'のバッファーB（20mM Tris-HCl、pH7.0；5mM CaCl2；250mM NaCl）およびで少なくとも5SV'のバッファーC（20mM Tris-HCl、pH7.0；0.2mM CaCl2；250mM NaCl）で、0.5ml／分で洗浄した。洗浄がうまくいった後に、OD280でタンパク質含量を測定した。
【００７２】
EPOの溶離を、バッファーD（100mM Tris-HCl、pH7.0；0.2mM CaCl2；2M NaCl）で、流量0.5ml／分で行った。1〜2mlの分画で溶離液を収集した。
【００７３】
これらの分画、洗浄液および流出液(flow through)のEPO含量を、アリコートをPOROS R2/Hカラム（ベーリンガー・マンハイム社）に施用することにより、逆相(RP)-HPLCにより測定した。あるいは、EPOを含有する分画の定性的同定のために、イムノドットブロット法を行った。
【００７４】
EPO含有分画（8〜12ml）をプールし、かつブチル−セファロースカラムに施用した。
【００７５】
ブルーセファロースカラム後の収量は、およそ175μg EPOであった（約70％に相当する）。一般にブルーセファロース後の収率は50〜75％の間であった。
【００７６】
2. ブチル−セファロースカラム（疎水性相互作用クロマトグラフィー）
自分で作成した2〜3mlのブチルセファロースカラム（材料：Toyopearl Butyl S650）を、少なくとも5SV'のバッファーD（100mM Tris-HCl、pH7.0；0.2mM CaCl2；2M NaCl）で平衡化し、その後１で得たEPOを含有するブルーセファロースのプール（およそ150μg EPO）を、0.5ml／分の流量で流出した。
【００７７】
このカラムを、少なくとも5SV'のバッファーE（20mM Tris-HCl、pH7.0；2M NaClおよび10％イソプロパノール）で、0.5ml／分で洗浄した。洗浄がうまくいった後に、OD280でタンパク質含量を測定した。
【００７８】
EPOの溶離を、バッファーF（20mM Tris-HCl、pH7.0；2M NaClおよび20％イソプロパノール）で、流量0.5ml／分で行った。1〜2mlの分画で溶離液を収集した。
【００７９】
これらの分画、洗浄液および流出液のEPO含量を、アリコートをPOROS R2/Hカラムに施用することにより、逆相(RP)-HPLCにより測定した。あるいは、EPOを含有する分画の定性的同定のために、イムノドットブロット法を行った。
【００８０】
EPO含有分画（10〜15ml）をプールし、かつヒドロキシアパタイトカラムに施用した。
【００８１】
ブチルセファロースカラムの収量は、約130μg EPOであった（約85％に相当する）。一般にブチルセファロース後の収率は、ブルーセファロースプールの施用した量の60〜85％の間であった。
【００８２】
3. ヒドロキシアパタイトカラム
ヒドロキシアパタイトカラム（バイオラド社のEcono-Pac CHT IIのそのまま使用できるカラム）5mlを、少なくとも5SV'のバッファーF（20mM Tris-HCl、pH7.0；2M NaClおよび20％イソプロパノール）で平衡化し、その後２で得たEPOを含有するブチルセファロースプール（およそ125μg EPO）を、0.5ml／分の流量で流出した。
【００８３】
このカラムを、少なくとも5SV'のバッファーG（20mM Tris-HCl、pH7.0；2M NaCl）で、0.5ml／分で洗浄した。洗浄がうまくいった後に、OD280でタンパク質含量を測定した。
【００８４】
EPOの溶離を、バッファーH（10mM リン酸ナトリウム、pH7.0；80mM NaCl）で、流量0.5ml／分で行った。1〜2mlの分画で溶離液を収集した。
【００８５】
これらの分画、洗浄液および流出液のEPO含量を、アリコートをPOROS R2/Hカラムに施用することにより、RP-HPLCにより測定した。
【００８６】
EPO含有分画（3〜6ml）をプールした。ヒドロキシアパタイトカラムの収量は、約80μg EPOであった（約60％に相当する）。一般にヒドロキシアパタイトカラムの収率は、ブチルセファロースプールの施用した量の50〜65％の間であった。
【００８７】
4. 再濃縮
ヒドロキシアパタイトの工程から得たプールしたEPO分画を、排除サイズ10kD（例えばフィルトロン社のMicrosep）の遠心分離ユニット中で、0.1〜0.5mg/mlの濃度に濃縮し、0.01％Tween20を添加し、アリコートとして−20℃で保管した。
【００８８】
【表】
収率の表
【００８９】
単離されたEPOの純度は、ほぼ＞90％であり、一般には＞95％でさえもあった。
【００９０】
EPO収量を増すために、方法２も使用したが、ここではブチルセファロース工程が省略されている。この方法は、特にFCSを添加しない、または1容量％添加した細胞培養液上清の場合に適用することが可能であり、ほぼ同じ純度の単離EPOが得られる（90〜95％）。この方法において、ヒドロキシアパタイトカラムの平衡化バッファー（バッファーF）中の5mM CaCl2の存在は、結合の改善をもたらし、その結果ヒドロキシアパタイト工程において、再現性があるEPO溶離の挙動をもたらす。従って方法２は、基本的に下記のバッファーを用いて、方法１と同じ方法で実践した：
1. ブルーセファロースカラム
平衡化バッファー（バッファーA）：20mM Tris-HCl、pH7.0；5mM CaCl2；100mM NaCl
洗浄バッファー1（バッファーB）：20mM Tris-HCl、pH7.0；5mM CaCl2；250mM NaCl
洗浄バッファー2（バッファーC）：20mM Tris-HCl、pH7.0；5mM CaCl2；250mM NaCl
溶離バッファー（バッファーD）：100mM Tris-HCl、pH7.0；5mM CaCl2；2M NaCl2. ヒドロキシアパタイトカラム
平衡化バッファー（バッファーF）：50mM Tris-HCl、pH7.0；5mM CaCl2；1M NaCl
洗浄バッファー（バッファーG）：10mM Tris-HCl、pH7.0；5mM CaCl2；80mM NaCl
溶離バッファー（バッファーH）：10mM リン酸ナトリウム、pH7.0；0.5mM CaCl2；80mM NaCl。
【００９１】
【表】
収率の表
【００９２】
方法1のバッファーBからGへの5mM CaCl2の添加も、ヒドロキシアパタイトカラムのより良い結合およびより限定された溶離をもたらした。
【００９３】
実施例10 ヒト細胞株由来のEPOのインビボ比活性の測定（正赤血球マウスにおけるバイオアッセイ）
赤血球前駆細胞の増殖および分化に対するEPOの用量相関した活性を、マウスを用いてインビボにおいて、EPO投与後の血中の網状赤血球の増加を基に決定した。
【００９４】
この目的のために、８匹のマウスに、異なる用量のEPO試料を非経口投与し、分析のためにEPO標準（WHOの標準EPOとの比較）についても行った。その後マウスを一定の限定的な条件下で飼育した。EPO投与の4日後、マウスから採血し、網状赤血球をアクリジンオレンジで染色した。フローサイトメトリー中での顕微鏡蛍光測光装置により、赤色蛍光のヒストグラムを分析することによって、赤血球30,000個あたりの網状赤血球の数を決定した。
【００９５】
生体活性のコンピュータ処理を、平行な直線の対における含量決定に関するLinderの記した方法により、様々な用量での試料の網状赤血球の数値および標準の数値から行った（A.Linder、Planen und Auswerten von Versuchen、第３版、1969年、Birkenhauser Verlag Basel）。
【００９６】
【表】
結果
【図面の簡単な説明】
【図１】 5'-非翻訳配列、エクソン1およびイントロン1の領域からのEPO遺伝子の相同領域の増幅を表す概略図である。
【図２】 5'-非翻訳配列、エクソン1およびイントロン1の領域からのEPO相同領域を含むプラスミドの概略図である。
【図３】 ラウス肉腫ウイルスプロモーター(RSV)、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(NEO)、SV40の初期ポリアデニル化領域(SVI pA)、初期SV40プロモーター(SVI)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子(DHFR)、別の初期SV40ポリアデニル化領域、ならびにサイトメガロウイルス前初期プロモーターおよびエンハンサー(MCMV)を含む、遺伝子活性化配列の概略図である。
【図４ａ】 EPO遺伝子ターゲティングベクターp176の調製法。
【図４ｂ】 EPO遺伝子ターゲティングベクターp179およびp187の調製法。
【図４ｃ】 EPO遺伝子ターゲティングベクターp189の調製法。
【図４ｄ】 EPO遺伝子ターゲティングベクターp190の調製法。
【図４ｅ】 EPO遺伝子ターゲティングベクターp192の調製法。
【図５】 シグナル配列変異によるEPO cDNAの調製の概略図。
【図６ａ】 細胞DNAの図３に示された遺伝子カセットのCMV領域由来のプローブによるハイブリダイゼーション；レーン１から４は、各々制限酵素AgeIおよびAscIで切断されたヒト細胞由来のDNAである；レーン１：1,000nM MTXで増幅されたEPO産生HeLa S3細胞；レーン２：500nM MTXで増幅されたEPO産生HeLa S3細胞；レーン３：増幅しないEPO産生HeLa S3細胞；レーン４：活性化されたEPO遺伝子を伴わないHeLa S3細胞；レーン５：ジゴキシゲニンで標識した長さマーカー；レーン１から３のハイブリダイゼーションした断片のサイズはおよそ5,200bpであった。
【図６ｂ】 ヒト細胞由来のDNAとEPOのコード領域由来のプローブのハイブリダイゼーション；レーン１：ジゴキシゲニンで標識した長さマーカー；レーン２〜４：制限酵素BamHI、HindIIIおよびSalIで切断されたヒト細胞由来のDNA；レーン２：500nM MTXで増幅されたEPO産生HeLa S3細胞（活性化されない内因性遺伝子によって産生されたバンドの長さ：3,200bp；遺伝子ターゲティングによって活性化されたEPO遺伝子のコピーの長さ：2,600bp）；レーン３：増幅されないEPO-産生HeLa S3細胞由来のDNA；レーン４：HeLa S3対照細胞由来のDNA。
【配列番号：１および２】
PCR産物1（図１）の調製において使用されたプライマーのヌクレオチド配列。
【配列番号：３および４】
PCR産物2（図１）の調製において使用されたプライマーの配列。
【配列番号：５】
プライマーEPO EX1の配列。
【配列番号：６】
プライマーEX2の配列。
【配列番号：７】
プライマーEX3(Met-Gly-Ala-His)の配列。
【配列番号：８】
プライマーEX3によってコードされた修飾されたシグナルペプチドの最初の配列。
【配列番号：９】
プライマーEX4(Met-Ser-Ala-His)の配列。
【配列番号：１０】
プライマーEX4によってコードされた修飾されたシグナルペプチドの最初の配列。
【配列番号：１１】
プライマーEX5(Met-Gly-Val-Pro)の配列。
【配列番号：１２】
プライマーEX5によってコードされた修飾されたシグナルペプチドの最初の配列。
【配列番号：１３】
プライマーEX6(Met-Ser-Val-His)の配列。
【配列番号：１４】
プライマーEX6によってコードされた修飾されたシグナルペプチドの最初の配列。
【配列番号：１５】
プライマーEXゲノム1の配列。
【配列番号：１６】
プライマーEX13の配列。
【配列番号：１７】
プライマーEPO EX17の配列。
【配列表】
本発明は、内因性ヒトEPO遺伝子の活性化を基に、薬学的製剤としてのヒトEPOの経済的製造に十分な量および純度でEPO産生が可能なヒト細胞に関する。本発明は更に、このようなヒトEPO-産生細胞の製造法、ヒト細胞における内因性EPO遺伝子の活性化のためのDNA構築物、およびヒト細胞におけるEPOの大規模製造法に関する。
【０００２】
エリスロポエチン(EPO)は、赤血球産生を刺激するヒト糖タンパク質である。EPOは、健常なヒトの血漿中に非常に低い濃度でのみ生じ、そのため大量の調製はこの方法では不可能である。EP-B 0148 605およびEP-B 0205 564は、CHO細胞における組換えヒトEPOの製造を開示している。EP-B 0148 605号に開示されているEPOは、尿EPOよりも大きい分子量を有するが、O-グリコシル化は受けない。一方、EP-B 0205 564に開示されているように、CHO細胞由来のEPOは、大量かつ純粋な形状で得ることができるが、これはヒト以外の細胞に由来している。更にCHO細胞の産生能は比較的限定的であることが多い。
【０００３】
更に再生不良性貧血患者の尿からヒトEPOが回収できることがわかっている（Miyakeら、J.Biol.Chem., 252:5558-5564(1977)）。この論文では、イオン交換クロマトグラフィー、エタノール沈殿、ゲル濾過および吸着クロマトグラフィーを含む、７工程の方法が示されている。比活性が約70,000U/mgタンパク質であるEPO調製物が収率21％で得られる。尿EPOを得るこの方法および他の方法の欠点は、十分量の出発材料の調達と、品質の再現性の点である。更に尿からの精製は困難であり、たとえ精製された生成物であっても尿の混入を避けることができない。
【０００４】
GB-A 2085 887は、少量のEPO産生が可能なヒトリンパ芽球細胞の調製法を開示している。これらの細胞の医薬としての経済的製造は不可能である。
【０００５】
国際公開公報第91/06667号は、EPOの組換え調製法を開示している。ヒト初期胚の腎細胞における第一の工程において、内因性EPO遺伝子は、相同組換えによって、ウイルスプロモーターにより機能的な連結となり、かつDNAがこれらの細胞から単離される。第二の工程において、このようにして単離されたDNAは、非ヒトのCHO細胞に形質転換され、かつこれらの細胞におけるEPOの発現が分析される。ヒト細胞におけるEPOの調製が可能であるかについては言及されていない。
【０００６】
国際公開公報第93/09222号は、ヒト細胞におけるEPOの調製を開示しており、ここでは完全なEPO遺伝子を含むベクターによりトランスフェクションされたヒト繊維芽細胞において、960,620mU／106細胞／24時間までの比較的多量のEPOの産生が認められている。これらの細胞は、正確なEPO遺伝子座にはない外因性EPO遺伝子を含んでおり、その結果細胞株の安定性に関する問題点が予想される。国際公開公報第93/09222号には、構成性EPOの製造に関する情報はない。更に、産生されたEPOが薬学的目的にかなう品質で得ることができるかどうかに関する情報もない。
【０００７】
更に国際公開公報第93/09222号においては、ヒトHT1080細胞における内因性EPO遺伝子の活性化が開示されている。その中では、EPO-産生が、24時間でわずかに2,500mU／106細胞（およそ16ng／106細胞／24時間に相当）であることが認められている。このような緩徐な生成は、薬学的製剤の経済的製造には全く適していない。
【０００８】
国際公開公報第94/12650号および第95/31560号は、ウイルスプロモーターによって活性化された内因性EPO遺伝子を有するヒト細胞が、どのようにして内因性EPO遺伝子の増幅後に、およそ100,000mU／106細胞／24時間（約0.6μg／106細胞／24時間に相当）ものEPOを産生するかを開示している。この量は医薬品を経済的に製造するには依然不十分である。
【０００９】
従って本発明の基本となる問題点は、当技術分野の前述の欠点を少なくとも部分的になくし、かつヒト細胞におけるEPOの調製に関する技術的により良い方法を提供することである。特にこれは、薬学的目的での経済的製造を可能にするのに十分な量および純度の生成物を得ることを可能にする。
【００１０】
この問題点は、ヒト細胞における内因性EPO遺伝子の活性化によって、場合によってはそれに続く活性化されたヒトEPO遺伝子の増幅によって解決される。この方法においては、驚くべきことに、適当な出発細胞、DNA構築物および選択戦略を選択することによって、薬学的製剤の経済的製造を可能にするのに十分な量、質および純度でのEPO産生が可能であるようなヒト細胞を提供することが可能になった。特に活性化された内因性EPO遺伝子の増幅後に、組換えEPOの調製のためにこれまで使用されてきたCHO産生細胞よりも明確に多い産生量を有する細胞を得ることができる。
【００１１】
本発明のひとつの主題は、ヒト細胞において活性のある異種発現調節配列と機能的に連結した内因性EPO遺伝子のコピーを含み、かつ先の遺伝子増幅を伴わずともEPOの少なくとも200ng／106細胞／24時間の産生が可能であるようなヒト細胞である。本発明に係るヒト細胞は、EPOの200〜3000ng／106細胞／24時間の産生が可能であることが好ましく、1000〜3000ng EPO／106細胞／24時間の産生が最も好ましい。
【００１２】
本発明の別の主題は、前述の細胞の遺伝子増幅によって得ることが可能であり、かつ各々がヒト細胞において活性のある異種発現調節配列と機能的に連結している内因性EPO遺伝子を数コピー含み、かつEPOの少なくとも1,000ng／106細胞／24時間の産生が可能であるようなヒト細胞である。
【００１３】
特に好ましいのは、遺伝子増幅によって得ることが可能なヒト細胞株が、EPOを1,000〜25,000ng／106細胞／24時間で産生できること、最も好ましくはEPOを5,000〜25,000ng／106細胞／24時間で産生できることである。
【００１４】
ヒト細胞は、インビトロにおいて培養することができるものであればいかなる細胞でもよい。特に好ましいのは、無血清培地において、特に浮遊液において培養することができるヒト細胞である。この方法において、EPOの生成は、例えば培養容積が1,000Lといった巨大な発酵槽において行うことができる。
【００１５】
特に好ましいのは、不死化された細胞、例えばHT1080細胞（Rasheedら、Cancer、33:1027-1033(1974)）、HeLaS3細胞（Puckら、J.Exp.Med.、103:273-286(1956)）、Namalwa細胞（Nadkarniら、Cancer、23:64-79(1969)）、またはそれらに由来する細胞のような、ヒト細胞である。
【００１６】
本発明の細胞の例は、ブダペスト条約の規定に従いDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)（Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig）に、1997年7月15日に寄託され、寄託番号がDSM ACC 2320である、クローン「Aladin」である。
【００１７】
本発明の細胞において、内因性EPO遺伝子は、ヒト細胞において活性がある異種発現調節配列に連結している。この発現調節配列は、プロモーター、および好ましくは例えばエンハンサーのような追加の発現促進配列を含んでいる。このプロモーターは、調節可能なまたは構成性のプロモーターであることができる。好ましくは、プロモーターは、強力なウイルスプロモーター、例えばSV40またはCMVプロモーターなどである。CMVプロモーター／エンハンサーが特に好ましい。
【００１８】
更にEPO発現を最適化するためには、異種プロモーターと機能的に結合しているヒト細胞中の内因性EPO遺伝子が、天然のシグナルペプチド−コード配列とは異なり、かつ好ましくは修飾されたアミノ酸配列を伴うシグナルペプチドをコードしているようなシグナルペプチド−コード配列を有することが好ましい。特に好ましいのは、下記から選択されるような、最初の４個のアミノ酸領域が修飾されたシグナルペプチド配列をコードしているシグナルペプチド−コード配列であり：
Met-X1-X2-X3
（式中、X1はGlyまたはSer、X2はAla、Val、Leu、Ile、SerまたはPro、およびX3はPro、Arg、CysまたはHisであるが、但しX1-X2-X3は配列Gly-Val-Hisではない。）、特に(a)Met-Gly-Ala-His
(b)Met-Ser-Ala-His
(c)Met-Gly-Val-Pro、または
(d)Met-Ser-Val-Hisから選択される配列である。
【００１９】
特に好ましいのは、シグナルペプチドの最初の４個のアミノ酸配列が、Met-Ser-Ala-Hisである。
【００２０】
別の局面において、本発明は、以下の段階を含む、前述のヒトEPO-産生細胞の製造法に関する：
(a)内因性EPO遺伝子の少なくとも1個のコピーを含むヒト出発細胞を提供する段階、
(b)下記を含む、DNA構築物により該細胞をトランスフェクションする段階：
(i)相同組換えを可能にするための、ヒトEPO遺伝子座の領域と相同な2個のフランキングDNA配列、
(ii)ポジティブ選択マーカー遺伝子、および
(iii)ヒト細胞において活性がある異種発現調節配列、
(c)トランスフェクションされた細胞を、ポジティブ選択マーカー遺伝子の存在について選択が行われるような条件下で培養する段階、
(d)段階(c)で選択可能な細胞を分析する段階、および
(e)EPO-産生細胞を同定する段階。
【００２１】
ヒトEPO産生細胞の調製において使用されたDNA構築物は、相同組換えを可能にするための、ヒトEPO遺伝子座の領域と相同な２個のフランキングDNA配列を含む。適当なフランキング配列の選択は、例えば国際公開公報第90/11354号および第91/09955号に開示された方法によって行われる。好ましくはこれらのフランキング配列は、各々少なくとも150bpの長さを有する。特に好ましいのは、相同なDNA配列が、EPO遺伝子の5'-非翻訳配列、エクソン1およびイントロン1の領域から選択されることである。最初のアミノ酸が修飾されたシグナルペプチドをコードしている、エクソン1の領域が修飾されたDNA配列を使用することが特に好ましい。好ましくは、前述のようなエクソン1領域の修飾である。
【００２２】
選択マーカー遺伝子は、真核細胞に適した任意の選択マーカー遺伝子であってよく、これは発現時に選択可能な表現型、例えば抗生物質耐性、栄養要求性などをもたらす。特に好ましいポジティブ選択マーカー遺伝子は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子である。
【００２３】
選択的に、いわゆるHSV-チミジンキナーゼ遺伝子のような、ネガティブ選択マーカー遺伝子が存在していてもよく、これによって選択剤の存在下で発現細胞が破壊される。
【００２４】
ヒト細胞において内因性的に活性化されたEPO遺伝子の増幅が望ましい場合は、DNA構築物は増幅遺伝子を含む。適当な増幅遺伝子の例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどである。特に好ましい増幅遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子であり、特に野生型遺伝子よりも選択剤（メトトレキセート）に対して比較的低い感受性を有するジヒドロ葉酸レダクターゼアルギニン変異体である（Simonsenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、80：2495（1983））。
【００２５】
EPO遺伝子活性化のために使用されるDNA構築物中に増幅遺伝子が存在する場合は、本発明の方法は更に下記の段階も含むことができる：
(f)EPOをコードしているDNA配列を増幅する段階、および
(g)異種発現調節配列と機能的に連結している成熟EPOをコードする内因性DNA配列の多くのコピーを、出発細胞と比較してより多く含むEPO-産生細胞を得る段階。
【００２６】
ヒト出発細胞中に存在する内因性EPO遺伝子の活性化に適したDNA構築物は、実施例に列記されたプラスミドであり；p187、p189、p190およびp192、またはそれらに由来するプラスミドである。特に好ましいのは、ブダペスト条約の規定に従い、1997年7月16日にDSMZに寄託された、寄託番号がDSM 11661であるプラスミドp189、またはそれに由来するプラスミドである。好ましくはDNA構築物は、線状化された形でヒト細胞のトランスフェクションに使用される環状プラスミド分子である。
【００２７】
本発明の別の主題は、下記を含む、ヒト細胞における内因性EPO遺伝子の活性化のためのDNA構築物である：
(i)相同組換えを可能にするための、5'-非翻訳配列、エクソン1およびイントロン1から選択されたヒトEPO遺伝子座の領域と相同であるように選択された２個のフランキングDNA配列で、修飾された配列は下記アミノ酸をコードしているエクソン1領域に存在し：
Met-X1-X2-X3
（式中、X1はGlyまたはSer、X2はAla、Val、Leu、Ile、SerまたはPro、およびX3はPro、Arg、CysまたはHisであるが、但しX1-X2-X3は配列Gly-Val-Hisではない。）、特にアミノ酸が、
(a)Met-Gly-Ala-His
(b)Met-Ser-Ala-His
(c)Met-Gly-Val-Pro、または
(d)Met-Ser-Val-Hisであるもの、
(ii)ポジティブ選択マーカー遺伝子、
(iii)ヒト細胞において活性がある異種発現調節配列、および
(iv)選択的に、増幅遺伝子。
【００２８】
本発明の更に別の主題は、下記を含む、ヒト細胞における内因性EPO遺伝子の活性化のためのDNA構築物である：
(i)相同組換えを可能にするための、5'-非翻訳配列、エクソン1およびイントロン1から選択されたヒトEPO遺伝子座の領域と相同な２個のフランキングDNA配列、
(ii)ポジティブ選択マーカー遺伝子、
(iii)ヒト細胞において活性がある異種発現調節配列であり、異種発現調節配列とEPO遺伝子の翻訳開始点との間の距離が1100bpを超えることのない配列、および
(iv)選択的に、増幅遺伝子。
【００２９】
驚くべきことに、EPOシグナル配列の修飾および／または異種発現調節配列とEPO遺伝子の開始点との距離の短縮が生じた場合に、最適化された発現が得られることが判明した。好ましくは異種発現調節配列のプロモーターとEPO遺伝子の翻訳開始点との間の距離は、1100bpよりも大きくなく、特に好ましいのは150bpを超えず、最も好ましいのは100bpを超えないものである。本発明で使用されるDNA構築物の特に好ましい例は、プラスミドp189(DSM 11661)またはそれに由来するプラスミドである。
【００３０】
更に別の本発明の局面は、ヒトEPOの調製法であり、ここでは本発明のヒト細胞は、適当な培地において、EPOの産生が行われるような条件下で培養され、かつEPOが培地から回収される。優先的に無血清培地が使用される。細胞は好ましくは浮遊液において培養される。培養は、特に優先的に発酵槽、特に例えば容積が10L〜50,000Lであるような巨大な発酵槽において行われる。
【００３１】
ヒト細胞株の培地からのヒトEPOの回収には、好ましくは以下の段階が含まれる：
(a)細胞上清をアフィニティークロマトグラフィー媒質上を通過させ、EPOを含有する分画を回収する段階、
(b)選択的に、EPO含有分画を疎水性相互作用クロマトグラフィー媒質上を通過させ、EPO含有分画を回収する段階、
(c)EPO含有分画をヒドロキシアパタイト上を通過させ、EPO含有分画を回収する段階、および
(d)濃縮するおよび／または逆相(RP)-HPLC媒質上を通過させる段階。
【００３２】
前述の精製法の段階(a)は、場合によっては前処理することができる細胞上清を、アフィニティクロマトグラフィー媒質上を通過させることを含む。好ましいアフィニティクロマトグラフィー媒質は、それに青色色素が組み合わされたものである。特に好ましい例はブルーセファロースである。
【００３３】
アフィニティークロマトグラフィー媒質からの溶離後、EPOを含有する溶離液を、選択的に疎水性相互作用クロマトグラフィー媒質上を通過させる。この工程は、血清含量が≧2容量％の培地を使用する場合の便宜的方法である。例えば1容量％のような低い血清含量の培地を使用する場合、もしくは、無血清培地を使用する場合は、この工程は省略することができる。好ましい疎水性相互作用クロマトグラフィー媒質は、ブチルセファロースである。
【００３４】
段階(a)、または使用される場合は段階(b)の溶離液を、本発明の方法の工程(c)において、ヒドロキシアパタイト上を通過させ、EPO含有溶離液を、濃縮工程および／または逆相HPCL精製工程に供する。濃縮は、好ましくは例えば排除サイズが10kDであることが証明された膜のような媒質を使用する膜ろ過などの排除クロマトグラフィーによって行われる。
【００３５】
本発明の方法によって、インビボ（正赤血球マウス）での比活性が少なくとも100,000U/タンパク質mgであるような単離されたヒトEPOを得ることができ、これは尿の混入がなく、かつCHO細胞由来の組換えEPOとは、そのグリコシル化が異なり得る。好ましくは本発明のEPOは、比活性が少なくとも175,000の、及び特に好ましいのは少なくとも200,000〜400,000または450,000IU/タンパク質mgを持つ。本発明の方法で得ることができるヒトEPOは、α-2,3-および／またはα-2,6-結合したシアル酸残基を含むことができる。内因性に活性化されたEPO遺伝子を含む細胞からのEPOの研究において、本発明の予備的結果を基に、α-2,3-およびα-2,6-結合したシアル酸残基の存在が認められた。更に、本発明の予備的結果を基に、本発明のヒトEPOが、N-アセチルノイラミン酸含量に対しN-グリコリルノイラミン酸の含量が0.2％未満であることが判明した。
【００３６】
本発明のヒトEPOの純度は、好ましくは総タンパク質含量の少なくとも90％、特に好ましくは少なくとも95％、および最も好ましくは少なくとも98％である。総タンパク質含量の決定は、例えばPoros R/2Hカラムのような逆相HPLCによって行うことができる。
【００３７】
更に本発明の方法によって、アミノ酸配列が異なるヒトEPO種を得ることが可能である。従って、ヒトEPOをHeLa S3細胞から単離することができ、これは主に長さが165個のアミノ酸のポリペプチドであり、アルギニン残基のC末端処理によって形成され、かつ一部の場合では166個のアミノ酸を持つEPOを15％まで含むことが、質量スペクトル分析(MALDI-MS)によって判明した。更に長さ166個のアミノ酸を持つポリペプチドを含むヒトEPO、すなわち未処理のEPOを得ることができる。Namalwa細胞からは、例えば長さ165および166個のアミノ酸のポリペプチドの混合物を含むヒトEPOが単離された。
【００３８】
このヒトEPOは、薬学的に一般的な補助剤、賦形剤および添加剤に加えて更に別の活性物質を含むことができる薬学的製剤の活性物質として使用することができる。
【００３９】
本発明の更に別の局面においては：
Met-X1-X2-X3
（式中、X1はGlyまたはSer、X2はAla、Val、Leu、Ile、SerまたはPro、およびX3はPro、Arg、CysまたはHisであるが、但しX1-X2-X3は配列Gly-Val-Hisではない。）から選択され、特にアミノ酸が：
(a)Met-Gly-Ala-His
(b)Met-Ser-Ala-His
(c)Met-Gly-Val-Pro、または
(d)Met-Ser-Val-Hisから選択される、シグナルペプチドの最初の４個のアミノ酸の領域が修飾された配列を伴うヒトEPOをコードする単離されたDNAに関する。
【００４０】
このDNAは、例えばゲノムDNAまたはcDNAであることができる。
【００４１】
本発明は下記の実施例ならびに図面および配列表により更に説明される。
【００４２】
実施例
工業的規模でのタンパク質製造のためのEPO遺伝子座の活性化は、選択のためのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(NEO)遺伝子（G-418耐性）、マウスのジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子（MTXによる遺伝子増幅のため）、ならびに遺伝子活性化のためのサイトメガロウイルス(CMV)前初期プロモーターおよびエンハンサーを含む遺伝子活性化配列の相同組込みによって達成された。
【００４３】
実施例１ EPO相同領域のクローニング
EPO遺伝子の相同領域を、ゲノム胎盤DNA（ベーリンガー・マンハイム社）を用いて増幅した。２種のPCR産物を、EPO遺伝子の5'-非翻訳配列、エキソン1およびイントロン1の領域からの長さ6.3kBの相同領域から調製した（図１参照）。PCR産物１の調製に使用したプライマーは、下記の配列を有した：5'-CGC GGC GGA TCC CAG GGA GCT GGG TTG ACC GG-3'（配列番号：１）および5'-GGC CGC GAA TTC TCC GCG CCT GGC CGG GGT CCC TCA GC-3'（配列番号：２）。PCR産物２の調製に使用したプライマーは、下記の配列を有した：5'-CGC GGC GGA TCC TCT CCT CCC TCC CAA GCT GCA ATC-3'（配列番号：３）および5'-GGC CGC GAA TTC TAG AAC AGA TAG CCA GGC TGA GAG-3'（配列番号：４）。
【００４４】
所望のセグメントを、制限酵素による切断によりPCR産物１および２から切り出し（PCR産物１：HindIII、PCR産物２：HindIIIおよびEcoRV）、かつHindIIIおよびEcoRVで切断したベクターpCRII（インビトロゲン社）にクローン化した。この方法で得られた組換えベクターを5epopcr1000と称した（図２参照）。
【００４５】
実施例２ EPO遺伝子ターゲティングベクターの構築
2.1 NEO遺伝子、DHFR遺伝子およびCMVプロモーター／エンハンサーを含む遺伝子活性化配列（図３参照）を、EPO相同領域を含むプラスミド5epocr1000のAgeI部位に挿入し、プラスミドp176を得た（図4a参照）。CMVプロモーターをEPO遺伝子の翻訳開始座にできるだけ近接させるために、長さ963bpのセグメントを、制限部位AscIとAgeIの間で欠失し（部分的切断）、これによりプラスミドp179を得た（図4b）。
【００４６】
2.2 発現を最適化するために、EPOリーダー配列Met-Gly-Val-Hisの開始部をコードしているエクソン1のヌクレオチドを、合成配列Met-Ser-Ala-Hisで置換した（実施例６も参照のこと）。この配列は、鋳型としてのSV40プロモーター（Jacobsら、Nature、313:806(1985)およびLee-Huangら、Gene、128:227(1993)）の制御下での、プライマーEx4（配列番号：９）およびEx17（配列番号：17）による、ゲノムEPO-DNA配列、例えばヒトEPO遺伝子配列の3.5kB BstEII／EcoRI断片（エクソン1-5を含む）を含むプラスミドpEPO148などの増幅によって得た（表１）。こうしてプラスミドp187を得た（図4b）。
【００４７】
2.3 プラスミドp189は、プラスミドp187に、Psvtk-1に由来する単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子(HSV-TK)（PvuII／NarI断片）を挿入することにより得た（図4c）。HSV-TK遺伝子は、CMVプロモーターに対して逆向きのイントロン1（EcoRV／ClaI）の3'末端側がSV40プロモーターの制御下にあり、かつ相同組換えに関するネガティブ選択に利用されなければならない。
【００４８】
2.4 プラスミドp190の構築のために、Simonsenらの論文（Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 80:2495(1983)）に記されたDHFRのアルギニン変異体のcDNAを含むプラスミドであるpHEAVYのSfiI／BglII断片を、RSVプロモーターおよび転写終結信号としての後期SV40ポリアデニル化部位制御下にあるNEO遺伝子、初期SV40プロモーターおよび転写終結信号としての初期SV40ポリアデニル化部位の制御下にあるマウスのDHFR遺伝子（Kaufmannら、Mol.Cell Biol.、2:1304(1982)；Okayamaら、Mol.Cell Biol.、3:280(1983)）、およびSchimke、J.Biol.Chem.、263:5989(1988)）、ならびにCMVプロモーター（Boshartら、Cell、41:521(1995)）を含んでいるプラスミドpGenak-1のSfiIおよびBglII切断断片にサブクローニングした。その後DHFRアルギニン変異体をコードしているcDNAを含むHpaI断片を、HpaIで切断したプラスミドp189にライゲーションし、プラスミドp190を得た（図4d）。
【００４９】
2.5 HSV-TK遺伝子を持たないトランスフェクションベクターを得るために、遺伝子活性化配列を含むプラスミドp190のAscI／NheI断片を、プラスミドp187のエクソン1を含むAscI／NheI断片にライゲーションした。得られたプラスミドをp192と称した（図4e）。
【００５０】
実施例３ 細胞のトランスフェクション
EPO産生のために、様々な細胞株を選択し、かつターゲティングベクターでトランスフェクションした。
【００５１】
3.1 Namalwa細胞
細胞を、T150組織培養ボトル中で培養し、かつ電気穿孔により（1x107細胞／800μlの電気穿孔用バッファー、20mM Hepes、138mM NaCl、5mM KCl、0.7mM Na2HPO4、6mM D-グルコース一水和物、pH7.0、10μg線状化したDNA、960μF、260V、バイオラド社、ジーンパルサー）トランスフェクションした。電気穿孔後、細胞を、46個の96ウェルプレートを用いて、RPMI 1640、10容量％ウシ胎仔血清(FCS)、2mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム中で培養した。２日たった後、細胞を1mg/mlのG-418含有培地中で10〜20日間培養した。EPO産生を調べるために、上清を固相ELISAで試験した（実施例４参照のこと）。EPO産生クローンは、24ウェルプレートおよびT-25組織培養ボトル中で増殖(expand)した。アリコートを凍結し、細胞を蛍光標示式細胞分取器(FACS)（Ventage、ベクトン・ディキンソン社）によってサブクローニングした。これらのサブクローンを、EPO産生について再度調べた。
【００５２】
3.2 HT1080細胞
条件は、HT1080細胞をDMEM、10容量％FCS、2mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム中で培養した以外は、Namalwa細胞について記したものと同様であった。電気穿孔によるトランスフェクションのために、細胞をトリプシン処理により培養容器の壁からはずした。電気穿孔後、1x107細胞を、５個の96ウェルプレートを用いて、DMEM、10容量％FCS、2mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウムの中で培養した。
【００５３】
3.3 HeLa S3細胞
条件は、HeLa細胞をRPM 1640、10容量％FCS、2mM L-グルタミン、1容量％MEM非必須アミノ酸（シグマ社）、および1mMピルビン酸ナトリウム中で培養した以外は、Namalwa細胞について記したものであった。電気穿孔によるトランスフェクションのために、細胞をトリプシン処理により培養容器の壁からはずした。電気穿孔の条件は、960μF/250Vであった。電気穿孔後、細胞を、T75組織培養容器を用いて、RPM 1640、10容量％FCS、2mM L-グルタミン、1容量％MEM、1mMピルビン酸ナトリウム中で培養した。電気穿孔の24時間後、細胞をトリプシン処理し、かつ10個の96ウェルプレートにおいて、G-418を600μg/ml含有する培地中で10〜15日間培養した。
【００５４】
実施例４ EPO-産生クローンの選択
トランスフェクションした細胞の培養液の上清を、EPO ELISAにより調べた。全ての工程は室温で行った。あらかじめストレプトアビジンで被覆した96ウェルプレートを、ビオチン化した抗EPO抗体（ベーリンガー・マンハイム社）で被覆した。被覆のために、プレートを最初に50mMリン酸ナトリウムpH7.2、および0.05容量％Tween20で洗浄した。その後被覆バッファー（4μg/mlビオチン化した抗体、10mMリン酸ナトリウムpH7.2、3g/Lウシ血清アルブミン、20g/Lサッカロース、および9g/L NaCl）0.01mlを、各ウェルに添加し、かつ室温で３時間インキュベーションした。その後プレートを50mMリン酸ナトリウムpH7.2で洗浄し、乾燥し、かつ密封した。
【００５５】
試験前に、前述のプレートをリン酸バッファー塩類溶液(PBS)0.3mlおよび0.05％Tween20（シグマ社）で３回洗浄した後；非特異的結合を阻害するために、プレートを、１ウェルにつき0.2ml PBSおよび1重量／容量％Crotein（ベーリンガー・マンハイム社）と共に、一晩インキュベーションした。
【００５６】
阻害液を除去した後、培養液上清0.1mlを添加し、かつプレートを一晩インキュベーションした。個々のウェルを、各回0.3ml PBSおよび0.05％Tween20で３回洗浄した。その後モノクローナル抗体（ベーリンガー・マンハイム社、150mU/ml）に結合したペルオキシダーゼ(POD)100μlを２時間添加した。次にウェルを、再度各回0.3ml PBSおよび0.05％Tween20で３回洗浄した。その後基質としてABTS（登録商標）を用いてペルオキシダーゼ反応を進行させ、パーキンエルマーホトメーターを用い405nmで調べた。CHO細胞からの組換えEPO（ベーリンガー・マンハイム社、100〜1000pg／ウェル）を用いて作成した標準較正曲線を用いて、EPO濃度を求めた。
【００５７】
実施例５ EPO遺伝子増幅
EPO発現を増すために、EPO-産生クローンを、漸増濃度（100pM〜1000nM）のメトトレキセート(MTX)存在下で培養した。EPOの産生について、これらのクローンを、ELISAにより各MTX濃度で試験した（実施例４参照）。強力な産生体は、限定された希釈でサブクローニングされた。
【００５８】
実施例６ シグナル配列の突然変異
EPO分子のリーダー配列を最適化するために、エクソン1によってコードされた最初のアミノ酸を置換した。異なる配列のプライマー（配列番号：４〜17；修飾された配列の選択のためにCelII切断部位を含んだ3'プライマー）を用いて、SV40プロモーター（Jacobsら、Nature、313:806(1985)；Lee-Huangら、Gene、128:227(1993)）の制御下で、ヒトEPO遺伝子配列の4kbのHindIII／EcoRI断片（エクソン1〜5を含む）を含むプラスミドpEPO227を用いるPCRにより、鋳型としてAscI／XbaI断片を得た。その後得られた断片を、プラスミドpEPO148（実施例2.2）にクローン化し、その後プラスミドpEPO 182、183、184および185を得た（図５）。EPO遺伝子発現は、SV40プロモーターによって起動された。COS-7細胞を、前述の構築物で一過性にトランスフェクションし（DEAEデキストラン法）、この細胞をトランスフェクション後のEPO産生について48時間調べた。
【００５９】
この方法で得られた変異リーダー配列Met-Ser-Ala-Hisで最良のEPO発現を示すものを用いて、遺伝子ターゲティングベクターを構築した（実施例2.2参照）。
【００６０】
実施例７ EPO-産生細胞株の特徴
３種の異なる細胞株（Namalwa、HeLaS3およびHT1080）をEPO遺伝子活性化のために選択した。EPO-産生クローンを、プラスミドp179、p187、p189、p190またはp192によるトランスフェクションにより得た（実施例２および３を参照のこと）。
【００６１】
およそ160,000 NEO-耐性クローンをEPO産生について試験し、その中の12〜15は再現性をもって細胞上清に顕著な収量のEPOを分泌した。
【００６２】
これらの中の合計７種のEPOクローンは、遺伝子増幅をすることなく、MTXによりEPOを大規模工業的製造に十分な量で産生したことが驚くべきことに確定された。これらのクローンのEPO産生は、200ng/mlから1000ng/ml/106細胞/24時間以上までの範囲であった。このような細胞のひとつの例は、Namalwa細胞から得られたクローン「Aladin」であり、これはDSMZ(DSM ACC 2320)に寄託されている。
【００６３】
500nM MTXで遺伝子を増幅した後、同定されたEPOクローンのEPO産生は、3000ng/ml/106細胞/24時間以上まで増大していた。MTXの濃度を1000nMに更に増やすと、7000ng/ml/106細胞/24時間にも及ぶ産生がもたらされた。
【００６４】
得られたクローンは、無血清培養条件下でのEPO産生も示した。
【００６５】
実施例８ EPO-産生クローンのゲノムの特徴
8.1 方法
ヒトゲノムDNAを、約108細胞から単離し、定量した（Sambrookら、1989）。このゲノムDNAを、各々、例えばAgeIおよびAscI、またはBamHI、HindIIIおよびSalIのような制限酵素で切断した後、アガロースゲル電気泳動により、DNA断片を大きさに従って分離し、最後にナイロン膜に移し、固定化した。
【００６６】
固定化したDNAを、ジゴキシゲニンで標識したEPOプローブまたは遺伝子活性化配列に特異的なDNAプローブ（DIG DNA標識キット、ベーリンガー・マンハイム社）でハイブリダイゼーションし、かつストリンジェントな条件下で洗浄した。特異的なハイブリダイゼーションシグナルを、放射線感光フィルムを用いる化学発光法により検出した。
【００６７】
8.2 結果
細胞の500nM MTXによる処理は、EPO座におけるハイブリダイゼーションシグナルの5〜10倍までの増大をもたらした。1000nM MTXに更に増すと10倍以上の増大が得られた（図6a）。
【００６８】
EPOに特異的なプローブとのハイブリダイゼーションの場合は、相同組換えによって影響を受けない染色体７のコピーも検出された。図6bに認められるように、これらの同様にハイブリダイゼーションしているDNA断片は、異なる明確に区別できるサイズを有し、かつMTXの使用によりそれらのシグナル強度は変化しなかった。
【００６９】
実施例９ ヒト細胞株の培養液上清からのEPOの精製（HeLa S3、NamalwaおよびHT1080）
ヒト細胞株の細胞培養液上清からEPOを精製するために、基本的には２種の方法を用いたが、これらはクロマトグラフィー工程の数および原理が異なり、培地の組成およびEPO濃度に応じて使用した：
方法１：第一工程：ブルーセファロースカラム
第二工程：ブチル−セファロースカラム
第三工程：ヒドロキシアパタイトカラム
第四工程：再濃縮
方法２：第一工程：ブルーセファロースカラム
第二工程：ヒドロキシアパタイトカラム
第三工程：再濃縮
（代わりの第三工程：RP-HPLC）
【００７０】
方法１による2容量％ウシ胎仔血清(FCS)を含むHeLa S3細胞培養液上清の精製の例：
1.ブルーセファロースカラム
Hi-トラップ-ブルーカラム（ファルマシア社のブルーセファロースのそのまま使用できるカラム）5mlを、少なくともカラム容量（SV'）の５倍のバッファーA（20mM Tris-HCl、pH7.0；5mM CaCl2；100mM NaCl）で平衡化した。その後HeLa細胞の上清70ml（およそ245μgのEPOおよび70〜100mgの総タンパク質を含有する）を、循環法(circulatory method)により、一晩かけて0.5ml／分の流量で流出した。
【００７１】
このカラムを、少なくとも5SV'のバッファーB（20mM Tris-HCl、pH7.0；5mM CaCl2；250mM NaCl）およびで少なくとも5SV'のバッファーC（20mM Tris-HCl、pH7.0；0.2mM CaCl2；250mM NaCl）で、0.5ml／分で洗浄した。洗浄がうまくいった後に、OD280でタンパク質含量を測定した。
【００７２】
EPOの溶離を、バッファーD（100mM Tris-HCl、pH7.0；0.2mM CaCl2；2M NaCl）で、流量0.5ml／分で行った。1〜2mlの分画で溶離液を収集した。
【００７３】
これらの分画、洗浄液および流出液(flow through)のEPO含量を、アリコートをPOROS R2/Hカラム（ベーリンガー・マンハイム社）に施用することにより、逆相(RP)-HPLCにより測定した。あるいは、EPOを含有する分画の定性的同定のために、イムノドットブロット法を行った。
【００７４】
EPO含有分画（8〜12ml）をプールし、かつブチル−セファロースカラムに施用した。
【００７５】
ブルーセファロースカラム後の収量は、およそ175μg EPOであった（約70％に相当する）。一般にブルーセファロース後の収率は50〜75％の間であった。
【００７６】
2. ブチル−セファロースカラム（疎水性相互作用クロマトグラフィー）
自分で作成した2〜3mlのブチルセファロースカラム（材料：Toyopearl Butyl S650）を、少なくとも5SV'のバッファーD（100mM Tris-HCl、pH7.0；0.2mM CaCl2；2M NaCl）で平衡化し、その後１で得たEPOを含有するブルーセファロースのプール（およそ150μg EPO）を、0.5ml／分の流量で流出した。
【００７７】
このカラムを、少なくとも5SV'のバッファーE（20mM Tris-HCl、pH7.0；2M NaClおよび10％イソプロパノール）で、0.5ml／分で洗浄した。洗浄がうまくいった後に、OD280でタンパク質含量を測定した。
【００７８】
EPOの溶離を、バッファーF（20mM Tris-HCl、pH7.0；2M NaClおよび20％イソプロパノール）で、流量0.5ml／分で行った。1〜2mlの分画で溶離液を収集した。
【００７９】
これらの分画、洗浄液および流出液のEPO含量を、アリコートをPOROS R2/Hカラムに施用することにより、逆相(RP)-HPLCにより測定した。あるいは、EPOを含有する分画の定性的同定のために、イムノドットブロット法を行った。
【００８０】
EPO含有分画（10〜15ml）をプールし、かつヒドロキシアパタイトカラムに施用した。
【００８１】
ブチルセファロースカラムの収量は、約130μg EPOであった（約85％に相当する）。一般にブチルセファロース後の収率は、ブルーセファロースプールの施用した量の60〜85％の間であった。
【００８２】
3. ヒドロキシアパタイトカラム
ヒドロキシアパタイトカラム（バイオラド社のEcono-Pac CHT IIのそのまま使用できるカラム）5mlを、少なくとも5SV'のバッファーF（20mM Tris-HCl、pH7.0；2M NaClおよび20％イソプロパノール）で平衡化し、その後２で得たEPOを含有するブチルセファロースプール（およそ125μg EPO）を、0.5ml／分の流量で流出した。
【００８３】
このカラムを、少なくとも5SV'のバッファーG（20mM Tris-HCl、pH7.0；2M NaCl）で、0.5ml／分で洗浄した。洗浄がうまくいった後に、OD280でタンパク質含量を測定した。
【００８４】
EPOの溶離を、バッファーH（10mM リン酸ナトリウム、pH7.0；80mM NaCl）で、流量0.5ml／分で行った。1〜2mlの分画で溶離液を収集した。
【００８５】
これらの分画、洗浄液および流出液のEPO含量を、アリコートをPOROS R2/Hカラムに施用することにより、RP-HPLCにより測定した。
【００８６】
EPO含有分画（3〜6ml）をプールした。ヒドロキシアパタイトカラムの収量は、約80μg EPOであった（約60％に相当する）。一般にヒドロキシアパタイトカラムの収率は、ブチルセファロースプールの施用した量の50〜65％の間であった。
【００８７】
4. 再濃縮
ヒドロキシアパタイトの工程から得たプールしたEPO分画を、排除サイズ10kD（例えばフィルトロン社のMicrosep）の遠心分離ユニット中で、0.1〜0.5mg/mlの濃度に濃縮し、0.01％Tween20を添加し、アリコートとして−20℃で保管した。
【００８８】
【表】
収率の表
単離されたEPOの純度は、ほぼ＞90％であり、一般には＞95％でさえもあった。
【００９０】
EPO収量を増すために、方法２も使用したが、ここではブチルセファロース工程が省略されている。この方法は、特にFCSを添加しない、または1容量％添加した細胞培養液上清の場合に適用することが可能であり、ほぼ同じ純度の単離EPOが得られる（90〜95％）。この方法において、ヒドロキシアパタイトカラムの平衡化バッファー（バッファーF）中の5mM CaCl2の存在は、結合の改善をもたらし、その結果ヒドロキシアパタイト工程において、再現性があるEPO溶離の挙動をもたらす。従って方法２は、基本的に下記のバッファーを用いて、方法１と同じ方法で実践した：
1. ブルーセファロースカラム
平衡化バッファー（バッファーA）：20mM Tris-HCl、pH7.0；5mM CaCl2；100mM NaCl
洗浄バッファー1（バッファーB）：20mM Tris-HCl、pH7.0；5mM CaCl2；250mM NaCl
洗浄バッファー2（バッファーC）：20mM Tris-HCl、pH7.0；5mM CaCl2；250mM NaCl
溶離バッファー（バッファーD）：100mM Tris-HCl、pH7.0；5mM CaCl2；2M NaCl2. ヒドロキシアパタイトカラム
平衡化バッファー（バッファーF）：50mM Tris-HCl、pH7.0；5mM CaCl2；1M NaCl
洗浄バッファー（バッファーG）：10mM Tris-HCl、pH7.0；5mM CaCl2；80mM NaCl
溶離バッファー（バッファーH）：10mM リン酸ナトリウム、pH7.0；0.5mM CaCl2；80mM NaCl。
【００９１】
【表】
収率の表
方法1のバッファーBからGへの5mM CaCl2の添加も、ヒドロキシアパタイトカラムのより良い結合およびより限定された溶離をもたらした。
【００９３】
実施例10 ヒト細胞株由来のEPOのインビボ比活性の測定（正赤血球マウスにおけるバイオアッセイ）
赤血球前駆細胞の増殖および分化に対するEPOの用量相関した活性を、マウスを用いてインビボにおいて、EPO投与後の血中の網状赤血球の増加を基に決定した。
【００９４】
この目的のために、８匹のマウスに、異なる用量のEPO試料を非経口投与し、分析のためにEPO標準（WHOの標準EPOとの比較）についても行った。その後マウスを一定の限定的な条件下で飼育した。EPO投与の4日後、マウスから採血し、網状赤血球をアクリジンオレンジで染色した。フローサイトメトリー中での顕微鏡蛍光測光装置により、赤色蛍光のヒストグラムを分析することによって、赤血球30,000個あたりの網状赤血球の数を決定した。
【００９５】
生体活性のコンピュータ処理を、平行な直線の対における含量決定に関するLinderの記した方法により、様々な用量での試料の網状赤血球の数値および標準の数値から行った（A.Linder、Planen und Auswerten von Versuchen、第３版、1969年、Birkenhauser Verlag Basel）。
【００９６】
【表】
結果
【図面の簡単な説明】
【図１】 5'-非翻訳配列、エクソン1およびイントロン1の領域からのEPO遺伝子の相同領域の増幅を表す概略図である。
【図２】 5'-非翻訳配列、エクソン1およびイントロン1の領域からのEPO相同領域を含むプラスミドの概略図である。
【図３】 ラウス肉腫ウイルスプロモーター(RSV)、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(NEO)、SV40の初期ポリアデニル化領域(SVI pA)、初期SV40プロモーター(SVI)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子(DHFR)、別の初期SV40ポリアデニル化領域、ならびにサイトメガロウイルス前初期プロモーターおよびエンハンサー(MCMV)を含む、遺伝子活性化配列の概略図である。
【図４ａ】 EPO遺伝子ターゲティングベクターp176の調製法。
【図４ｂ】 EPO遺伝子ターゲティングベクターp179およびp187の調製法。
【図４ｃ】 EPO遺伝子ターゲティングベクターp189の調製法。
【図４ｄ】 EPO遺伝子ターゲティングベクターp190の調製法。
【図４ｅ】 EPO遺伝子ターゲティングベクターp192の調製法。
【図５】 シグナル配列変異によるEPO cDNAの調製の概略図。
【図６ａ】 細胞DNAの図３に示された遺伝子カセットのCMV領域由来のプローブによるハイブリダイゼーション；レーン１から４は、各々制限酵素AgeIおよびAscIで切断されたヒト細胞由来のDNAである；レーン１：1,000nM MTXで増幅されたEPO産生HeLa S3細胞；レーン２：500nM MTXで増幅されたEPO産生HeLa S3細胞；レーン３：増幅しないEPO産生HeLa S3細胞；レーン４：活性化されたEPO遺伝子を伴わないHeLa S3細胞；レーン５：ジゴキシゲニンで標識した長さマーカー；レーン１から３のハイブリダイゼーションした断片のサイズはおよそ5,200bpであった。
【図６ｂ】 ヒト細胞由来のDNAとEPOのコード領域由来のプローブのハイブリダイゼーション；レーン１：ジゴキシゲニンで標識した長さマーカー；レーン２〜４：制限酵素BamHI、HindIIIおよびSalIで切断されたヒト細胞由来のDNA；レーン２：500nM MTXで増幅されたEPO産生HeLa S3細胞（活性化されない内因性遺伝子によって産生されたバンドの長さ：3,200bp；遺伝子ターゲティングによって活性化されたEPO遺伝子のコピーの長さ：2,600bp）；レーン３：増幅されないEPO-産生HeLa S3細胞由来のDNA；レーン４：HeLa S3対照細胞由来のDNA。
【配列番号：１および２】
PCR産物1（図１）の調製において使用されたプライマーのヌクレオチド配列。
【配列番号：３および４】
PCR産物2（図１）の調製において使用されたプライマーの配列。
【配列番号：５】
プライマーEPO EX1の配列。
【配列番号：６】
プライマーEX2の配列。
【配列番号：７】
プライマーEX3(Met-Gly-Ala-His)の配列。
【配列番号：８】
プライマーEX3によってコードされた修飾されたシグナルペプチドの最初の配列。
【配列番号：９】
プライマーEX4(Met-Ser-Ala-His)の配列。
【配列番号：１０】
プライマーEX4によってコードされた修飾されたシグナルペプチドの最初の配列。
【配列番号：１１】
プライマーEX5(Met-Gly-Val-Pro)の配列。
【配列番号：１２】
プライマーEX5によってコードされた修飾されたシグナルペプチドの最初の配列。
【配列番号：１３】
プライマーEX6(Met-Ser-Val-His)の配列。
【配列番号：１４】
プライマーEX6によってコードされた修飾されたシグナルペプチドの最初の配列。
【配列番号：１５】
プライマーEXゲノム1の配列。
【配列番号：１６】
プライマーEX13の配列。
【配列番号：１７】
プライマーEPO EX17の配列。
【配列表】
Claims (44)
- 以下を含む、ヒト細胞において内因性EPO遺伝子を活性化するためのDNA構築物がトランスフェクトされたヒト細胞であって、該ヒト細胞において活性な異種プロモーターと機能的に連結している内因性EPO遺伝子のコピーを含み、かつEPOの少なくとも200ng／106細胞／24時間の産生が可能であることを特徴とするヒト細胞であって、EPO遺伝子が、最初の４個のアミノ酸の領域がMet-Ser-Ala-Hisであるシグナルペプチド配列をコードしているシグナルペプチド−コード配列を有することを特徴とする、前記ヒト細胞：
(i)相同組換えを可能にするための、5'-非翻訳配列、エクソン1およびイントロン1から選択されたヒトEPO遺伝子座の領域と相同である２個のフランキングDNA配列、
(ii)ポジティブ選択マーカー遺伝子、
(iii)ヒト細胞において活性な異種発現調節配列であり、異種発現調節配列とEPO遺伝子の翻訳開始点との間の距離が1100bpを超えない配列、および
(iv)必要に応じて、増幅遺伝子。 - EPOの200〜3000ng／106細胞／24時間の産生が可能であることを特徴とする、請求項１記載のヒト細胞。
- 各々がヒト細胞において活性な異種プロモーターと機能的に連結している、内因性EPO遺伝子を数コピー含み、かつEPOの少なくとも1000ng／106細胞／24時間の産生が可能であることを特徴とする、請求項1または２記載の細胞の遺伝子増幅によって得られるヒト細胞。
- EPOの1000〜25,000ng／106細胞／24時間の産生が可能であることを特徴とする、請求項３記載のヒト細胞。
- 不死化された細胞であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項記載のヒト細胞。
- 無血清培地において培養することができることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項記載のヒト細胞。
- HT1080細胞、HeLa S3細胞、Namalwa細胞またはそれらに由来する細胞から選択されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項記載のヒト細胞。
- 活性化された内因性EPO遺伝子が、ウイルスプロモーターの制御下にあることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項記載のヒト細胞。
- ウイルスプロモーターが、CMVプロモーターである、請求項８記載のヒト細胞。
- (a)内因性EPO遺伝子の少なくとも１個のコピーを含むヒト出発細胞を提供する段階、
(b)下記を含むDNA構築物による該細胞のトランスフェクションの段階：
(i)相同組換えを可能にするための、ヒトEPO遺伝子座の領域と相同な２個のフランキングDNA配列、
(ii)ポジティブ選択マーカー遺伝子、および
(iii)ヒト細胞において活性な異種発現調節配列、
(c)トランスフェクションされた細胞を、ポジティブ選択マーカー遺伝子の存在について選択が行われるような条件下で培養する段階、
(d)段階(c)において選択可能な細胞を分析する段階、および
(e)EPO-産生細胞を同定する段階を含む、請求項１〜９のいずれか一項記載のヒト細胞の調製法。 - 相同なDNA配列が、EPO遺伝子の5'-非翻訳配列、エクソン1およびイントロン1の領域から選択されることを特徴とする、請求項１０記載の方法。
- エクソン1の領域が修飾された配列が使用されることを特徴とする、請求項１１記載の方法。
- 選択マーカー遺伝子として、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子が使用されることを特徴とする、請求項１１または１２記載の方法。
- DNA構築物が増幅遺伝子をさらに含むことを特徴とする、請求項１１〜１３のいずれか一項記載の方法。
- 増幅遺伝子として、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子が使用されることを特徴とする、請求項１４記載の方法。
- 増幅遺伝子として、ジヒドロ葉酸レダクターゼアルギニン−変異体の遺伝子が使用されることを特徴とする、請求項１５記載の方法。
- (f)EPO遺伝子を増幅する段階、および
(g)各々が異種発現調節配列と機能的に連結した内因性EPO遺伝子を数コピー含むEPO-産生細胞を得る段階をさらに含む、請求項１４〜１６のいずれか一項記載の方法。 - 発現調節配列として、CMVプロモーター／エンハンサーが使用されることを特徴とする、請求項１０〜１７のいずれか一項記載の方法。
- DNA構築物として、プラスミドp189(DSM 11661)またはそれに由来するプラスミドが線状化された形態で使用されることを特徴とする、請求項１０〜１８のいずれか一項記載の方法。
- 下記を含む、ヒト細胞において内因性EPO遺伝子を活性化するためのDNA構築物：
(i)相同組換えを可能にするための、5'-非翻訳配列、エクソン1およびイントロン1から選択されたヒトEPO遺伝子座の領域と相同な２個のフランキングDNA配列であり、修飾された配列がエクソン1領域に存在し、下記のアミノ酸をコードしている配列：
Met-Ser-Ala-His、
(ii)ポジティブ選択マーカー遺伝子、
(iii)ヒト細胞において活性な異種発現調節配列、および
(iv)必要に応じて、増幅遺伝子。 - 異種発現調節配列とEPO遺伝子の翻訳開始点との間の距離が1100bpを超えないことを特徴とする、請求項２０記載のDNA構築物。
- プラスミドp189（DSM11661）。
- 請求項１〜９のいずれか一項記載のヒト細胞を、適当な培地において、EPO産生が生じるような条件下で培養し、かつEPOを培地から回収することを特徴とする、ヒトEPOの製造法。
- 無血清培地を使用することを特徴とする、請求項２３記載の方法。
- 細胞を浮遊液中で培養することを特徴とする、請求項２３または２４のいずれか一項記載の方法。
- 培養を発酵槽中で行うことを特徴とする、請求項２３〜２５のいずれか一項記載の方法。
- 発酵槽の容積が10L〜50,000Lであることを特徴とする、請求項２６記載の方法。
- (a)細胞上清をアフィニティークロマトグラフィー媒質上を通過させ、EPO含有分画を回収する段階、
(b)必要に応じて、EPO含有分画を疎水性相互作用クロマトグラフィー媒質上を通過させ、EPO含有分画を回収する段階、
(c)EPO含有分画をヒドロキシアパタイト上を通過させ、EPO含有分画を回収する段階、および
(d)濃縮するおよび／または逆相HPLC媒質上を通過する段階を含む、培地からEPOを回収することを特徴とする、請求項２３〜２７のいずれか一項記載の方法。 - 段階(a)において、ブルーセファロース媒質を使用することを特徴とする、請求項２８記載の方法。
- 段階(b)において、ブチルセファロース媒質を使用することを特徴とする、請求項２８または２９のいずれか一項記載の方法。
- 濃縮が、排除クロマトグラフィーによって行われることを特徴とする、請求項２８〜３０のいずれか一項記載の方法。
- 排除サイズが10kDである媒質を使用することを特徴とする、請求項３１記載の方法。
- ヒトEPOが少なくとも90％の純度で得られることを特徴とする、請求項２３〜３２のいずれか一項記載の方法。
- 少なくとも100,000IU/mgのインビボ比活性（正赤血球マウス）を持つヒトEPOが得られることを特徴とする、請求項２３〜３３のいずれか一項記載の方法。
- 少なくとも175,000IU/mg〜450,000IU/mgのインビボ比活性（正赤血球マウス）を持つヒトEPOが得られることを特徴とする、請求項３４記載の方法。
- N-アセチルノイラミン酸含量に対するN-グリコリルノイラミン酸含量が0.2％未満であるヒトEPOが得られることを特徴とする、請求項２３〜３５のいずれか一項記載の方法。
- α-2,3-結合したシアル酸残基を持つヒトEPOが得られることを特徴とする、請求項２３〜３６のいずれか一項記載の方法。
- α-2,3-およびα-2,6-結合したシアル酸残基を持つヒトEPOが得られることを特徴とする、請求項２３〜３７のいずれか一項記載の方法。
- 長さ165個のアミノ酸のポリペプチドを含むヒトEPOが得られることを特徴とする、請求項２３〜３８のいずれか一項記載の方法。
- 長さ166個のアミノ酸のポリペプチドを含むヒトEPOが得られることを特徴とする、請求項２３〜３８のいずれか一項記載の方法。
- 長さ165個および166個のアミノ酸のポリペプチドの混合物を含むヒトEPOが得られることを特徴とする、請求項２３〜３８のいずれか一項記載の方法。
- シグナルペプチドの最初の4個のアミノ酸領域に修飾された配列を持つヒトEPOをコードする単離DNAであって、該配列がMet-Ser-Ala-Hisであることを特徴とする、単離DNA。
- ゲノムDNAであることを特徴とする、請求項４２記載のDNA。
- cDNAであることを特徴とする、請求項４２記載のDNA。
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