MXPA00003804A - Seleccion positiva- negativa durante la recombinacion homologa - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un procedimiento para la inserción de un ADN foráneo en el genoma de una célula objetivo por medio de recombinación homóloga, asícomo también a estructuras de ADN apropiadas para la recombinación homóloga.

Description

SELECCIÓN POSITIVA-NEG-ATIVA- DURANTE LA RECOMBINACION HOMOLOGA.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a un procedimiento para la inserción de un ADN foráneo en el genoma de una célula anfitriona por medio de recombinación homologa, asi como también a estructuras de ADN apropiadas para la recombinación homologa. Procedimientos para la inserción de un ADN foráneo en el genoma de células eucarióticas por medio de reocmbinación homologa son conocidos (ver por ejemplo O/11354, WO 91/09955) . Con estos procedimientos una célula de partida es transfectada con una construcción de ADN, que comprende por lo menos uno, preferentemente dos sectores de secuencias de ADN que son homólogos a regiones del genoma de la célula a ser transfectada, un gen marcador de selección positiva, y en caso dado, un gen marcador de selección negativa. Ademas, la estructura de ADN puede comprender una secuencia de control de expresión heteróloga, si se desea activar un gen normalmente silencioso de la célula transfectada. Las células transfectadas son cultivadas bajo condiciones en las cuales se produce una selección por la presencia del gen marcador de selección positiva, el que lleva durante REF.: 119486 la expresión a un fenotipo seleccionable. Para diferenciar células en las cuales tuvo lugar una recombinación homologa de aquellas células en las cuales se produjo solamente una integración casual del vector en el genoma de la célula anfitriona, se efectúa normalmente un segundo paso de selección. Para ello se utiliza un gen marcador de selección negativa, como por ejemplo el gen HSV-timidinaquinasa (HSV-TK), en cuya presencia las células son destruidas en presencia de un medio de selección, por ejemplo Ganciclovir. Durante la recombinación homologa, la célula pierde el gen HSV-timidinaquinasa, de modo que las células son resistentes a Ganciclovir. Las células en cuyo genoma se incorpora el vector de direccionamiento al objetivo por integración casual no homologa no pierden el gen HSV-TK y son por lo tanto sensibles a Ganciclovir. Para este tipo de selección por medio de HSV-TK/Ganciclovir se usan preferentemente células que no contienen ningún gen de timidinaquinasa con capacidad funcional (por ejemplo, CEM tk de Ogden Bioservices Corp., Rockville MD, ÜS, cat. No. 491) . Otras células anfitrionas de recombinación homologa poseen, sin embargo, un gen de timidinaquinasa propio. Este gen de timidinaquinasa celular causa durante la selección negativa, problemas de fondo. Asi por ejemplo, durante la selección puede llegarse a la perdida de clones recombinados homologamente. Problemas semejantes también se producen con otros genes marcadores de selección negativa que codifican a un producto genético contra cuya expresión se debe seleccionar después de la transfección. Se conoce la utilización de polipéptidos localizados en la superficie celular como marcadores de transfección positiva. Asi por ejemplo, la WO95/06723 describe un procedimiento para la marcación de células por medio de la utilización de un gen receptor localizado en la superficie celular de delección parcial. Para evitar los problemas que se producen con los genes marcadores de selección negativa utilizados hasta ahora, de acuerdo con la presente invención se emplea un gen marcador de selección negativa que codifica para un polipéptido localizado en la superficie celular. Un objeto de la presente invención es, por lo tanto, un procedimiento para la inserción de ADN foráneo en una célula anfitriona por medio de recombinación homologa, durante el cual la célula anfitriona es transfectada con un vector recombinante, vector que comprende dos secuencias nucleótidas externas flanqueadoras, homologas a una secuencia objetivo en el genoma de la célula anfitriona, internamente alas cuales se encuentra una secuencia nucleótida que codifica a un marcador de selección positiva, y externamente a las cuales se encuentra una secuencia nucleótida que codifica a un marcador de selección negativa, estando cada una de las secuencias nucleótidas que codifican para el marcador de selección positiva y para el marcador de selección negativa enlazadas operativamente con una secuencia de control de expresión activa en la célula anfitriona, utilizándose como gen marcador de selección negativa al menos una secuencia nucleótida que codifica---- para un polipéptido localizado en la superficie celular de modo que después de una integración de la estructura de ADN en el genoma de la célula por medio de recombinación homologa, el gen marcador de selección negativa no es expresado, y después de una integración casual del vector ene 1 genoma de la célula, el gen marcador de selección negativa es expresado y su producto genético es visualizado sobre la superficie celular. Por lo tanto, para evitar un procedimiento de selección negativa con el cual se trabaja con un medio de selección toxico para la célula, de acuerdo con la invención se inserta en un lugar correspondiente del vector, para la recombinación homologa, un gen arcador de selección negativa que codifica a un polipéptido localizado en la superficie celular. Preferentemente se utiliza un gen marcador de selección negativa que codifica a un polipéptido que normalmente se encuentra en la célula anfitriona. Con el procedimiento de acuerdo con la invención no se producen problemas de toxicidad o con señales de fondo como na sido descritos en el cao de la selección TK. Otra ventaja del procedimiento de acuerdo con la invención es que disminuye nítidamente la cantidad de células transfectadas que deben ser investigadas por la expresión del gen objetivo. La célula anfitriona es preferentemente una célula escarótica, especialmente se prefiere una célula mamifera y mas preferentemente una célula humana. Para la identificación y el aislado de células en las cuales se realizó una recombinación homologa, se realiza de acuerdo on la invención un paso de selección por la presencia del gen marcador de selección positiva y otro paso de selección adicional por la ausencia del gen marcador de selección negativa. El paso de selección por la presencia del gen marcador de selección positiva puede ser realizado del modo usual. Para este paso de selección se puede utilizar cualquier gen marcador de selección positiva, especialmente un gen marcador de selección apropiado para células eucarióticas que conducen durante la expresión a un fenotipo seleccionable, por ejemplo resistencia a antibiótico o auxotrofia. Preferentemente se utilizan genes resistentes a anfibióticos, por ejemplo el gen resistente a neomicina, canamicina, genemicina o higromicina. Un gen marcador de selección positiva especialmente preferido es el gen de neomicina fosfotransferasa . El gen marcador de selección negativa utilizado para el procedimiento de acuerdo con la invención codifica para un producto genético que se presenta en la superficie de la célula anfitriona, especialmente para un polipeptido localizado en la membrana. Ejemplos preferidos para tales polipéptidos localizados en la membrana son, por ejemplo, el receptor LNGF, el receptor CD24, el receptor LD-L o el trk' o un fragmento del receptor que comprende el dominio de enlace del ligando del receptor correspondiente. EN WO 95/06723 se describen fragmentos de receptores apropiados cuyo dominio intracelular ha sido total o parcialmente suprimido o ha sido modificado de modo que el receptor presentado en la superficie no puede efectuar ninguna transfección de señales. Un ejemplo especialmente preferido para un fragmento de receptor tal es un mutante de delección del receptor presentado en la superficie no puede efectuar ninguna transfucción de señales. Un ejemplo especialmente preferido para un fragmento de receptor tal es un mutante de delección del receptor LNGF (dLNGFR) , la que es un fragmento de receptor humano de baja afinidad del factor de crecimiento neuronal, cuyo dominio intracelular y transductor de señales ha sido suprimida (WO 95/06723) . En la figura 1 se representa esquemáticamente el principio de la recombinación homologa bajo selección negativa por dLNGFR. Este principio de selección puede ser transferido también, desde luego a otros genes marcadores de selección que codifican para polipéptidos asociados a la superficie. Como vector recombinante se utiliza un plasmido que comprende dos secuencias externas flanqueadoras de acido nucleico (HR1, HR2 ) , homologas a la secuencia objetivo deseada, y entre las mismas se encuentra el tge marcador de selección positiva, el gen resistente a la neomicina (NeoR) . Fuera de las dos secuencias nucleótidas homologas flanqueadoras está dispuesta sobre el plasmido una secuencia nucleótida que codifica a dLNGFR. En el caso de una recombinación homologa con una secuencia que comprende la región codificadora del gen objetivo (HR) se realiza una integración de las regiones HR1, NeoR y HR2 en el genoma. La secuencia que codifica a dLNGFR, en cambio, no es integrada en el genoma. En el caso de una integración casual del plasmido en el genoma de la célula anfitriona, al contrario el gen dLNGFR se mantiene en forma expresionable. La selección de acuerdo con la invención por la ausencia del gen marcador de selección negativa en la célula anfitriona transfectada comprende preferentemente los pasos de: a) poner en contacto de la célula transfectada con una molécula ligante que se enlaza con el producto genético del gen marcador de selección negativa, y b) separación de las células que comprenden la molécula ligante enlazada. Como moléculas ligantes se utilizan substancias que puedan formar un enlace especifico y preferentemente de lata afinidad con el marcador de selección negativa, Preferentemente se utilizan moléculas ligantes tales que no presenten ninguna actividad cruzada que pueda interferir con otros componentes de la superficie de la célula anfitriona. Ejemplos para moléculas ligantes son anticuerpos, por ejemplo anticuerpos policlonales o monoclonales, fragmentos de anticuerpos, etc., que están dirigidos contra el producto genético del gen marcador de selección negativa. Anticuerpos apropiados contra dLNGFR, por ejemplo de EO 95/06723. Al utilizar un receptor como marcador de selección negativa, desde luego también puede utilizarse como molécula ligante un participante natural del receptor, por ejemplo para un ligado de receptor tal es NGF como ligando de LNGFR. Para facilitar la separación de las células marcadas con el marcador de selección negativa, se puede utilizar una molécula ligante acoplada con una fase sólida, pudiéndose realizar este acoplamiento por medio de adsorción, enlace covalente o a través de un par ligante de alta afinidad (por ejemplo, estreptavidina/biotina) . El tipo de la fase sólida generalmente no es critico para el procedimiento de la invención. Preferentemente se utilizan fases sólidas que posibilitan una fácil separación de las células que presentan el marcador de selección negativa de las células no marcadas. La fase sólida puede estar presente por ejemplo, en la forma de una columna cromatográfica, especialmente preferidas son, sin embargo, las fases sólidas particuladas como por ejemplo microperlas, especialmente microperlas magnéticas, las que permiten una separación especialmente sencilla. Alternativamente, las células transfectadas también pueden ser puestas en contacto con moléculas ligantes libres. En este caso las moléculas ligantes libres llevan preferentemente un grupo de marcado y/o un grupo de acoplamiento con fases sólidas. Ejemplos apropiados para grupos de marcado y/o grupos de acoplamiento con fases sólidas son biotina, derivados de biotina, por ejemplo iminobiotina, aminobiotina o destiobiotina, haptenos, por ejemplo digoxigenina, fluoresceina, enzimas, por ejemplo peroxidasa o fosfatasa alcalina, o colorantes, por ejemplo colorantes de fluorescencia, como por ejemplo fluoresceina, ficoereitrina, rodamina, proteina de peridina-clorofila, rojo Texas o derivados de los mismos. Al utilizar una molécula ligante que lleva un grupo de enlace a la fase sólida, como por ejemplo biotina, un derivado de biotina o un hepteno, la célula marcada como la molécula ligante puede ser acoplada con una fase sólida capaz de reaccionar con el grupo de enlace a la fase sólida de la' molécula ligante. Al utilizar una molécula ligante que lleva un grupo de biotina, se pueden identificar por ejemplo las células que expresan el marcador de selección negativa, acoplándolas con una fase sólida recubierta con avidina o estreptavidina y separarlas de células no marcadas . Al utilizar una molécula ligante que lleva un grupo marcador enzimático, las células que expresan el marcador de selección negativa, después del agregado de un substrato de enzima, pueden ser identificadas por medio de una reacción cromática catalizada por enzima, y eventualmente ser separadas de las células no marcadas. Al utilizar una molécula ligante que lleva un colorante de fluorescencia, las células que expresan el marcador de selección negativa pueden se identificadas por análisis citsmerico de flujo y ser separadas de las células no marcadas. Este procedimiento de separación es rápido y sencillo y puede ser aislado en aparatos FACS usuales que posibilitan la colocación de ventanas de fluorescencia y una clasificación de las células. a) dos secuencias nucleótidas externas flanqueadoras homologas a una secuencia objetivo en una célula, b) una secuencia nucleótida que codifica a un marcador de selección positiva bajo el control de una secuenca de control de expresión activa en la célula, encontrándose dicha secuencia nucleotida internamente a las dos secuencias flanqueadoras de acuerdo con (a) , c) una secuencia nucleótida que codifica a un marcador de selección negativa bajo el control de una secuencia de control de expresión activa en la célula, encontrándose dicha secuencias nucleótida externamente a las secuencias nucleótidas homologas 'flanqueadoras y siendo su producto de expresión un polipéptido localizado en la superficie celular.

Si se desea utilizar el vector recombinante para la activación de un gen presente endógenamente en la célula anfitriona, el vector comprende todavia entre las dos secuencias nucleótidas homologa flanqueadoras una secuencia de control de expresión heteróloga, la que es activa en la célula anfitriona. Esta secuencia de control de expresión comprende un promotor y preferentemente otras secuencias que mejoran la expresión, por ejemplo un intensificador. El promotor puede ser un promotor regulable o constitutivo. Preferentemente el promotor es un promotor viral fuere, por ejemplo un promotor SV40 o CMV. Especialmente preferido, es el promotor/intensificador CMV. Si se desea una amplificación del gen objetivo en la célula anfitriona transfectada, el vector recombinante comprende u gen de amplificación entre las dos secuencias flanqueadoras. Ejemplos de genes amplificadores apropiados son dihidrofolatoreductasa, adenosinadea inasa, ornitinadecarboxilasa, etc. Un gen de amplificación especialmente preferido es el ge dihidroreductasa, especialmente par au gen que codifica a un mutate de arginina de la hidrofolatoreductasa, la que tiene una menor sensibilidad para el agente selectivo (metotrexato) que el polipéptido nativo (Simonsen et al., Proc. Nati. Acad. Sci, US 80 (993), 2495) . Como explicado previamente, la secuencia codificante para el marcador de selección negativa puede ser seleccionada preferentemente de receptores localizados en la membrana o de fragmentos de receptor localizados en la membrana que contienen el dominio de enlace del ligando del receptor respectivo. Las secuencias nucleótidas flanqueadoras, homologas a una secuencia objetivo, pueden ser seleccionadas de regiones cromosomales arbitrarias del genoma de la célula a transfectar, la que es preferentemente una célula eucariótica, especialmente se prefiere una célula mamifera y lo mas preferentemente una célula humana. En el caso de células humanas, las secuencias nucleótidas homologas fl'anqueadoras prevendrán preferentemente del campo de los genes para factores humanos, por ejemplo EPO, Tpa, G-CSF, GM-CSF, TPO, interleucinas, interferones, factores de crecimiento, insulina, factores de crecimiento del tipo de insulina, etc. Las secuencias nucleótidas ( homologas flanqueadoras pueden comprender la región codificante del gen objetivo una parte de la misma. En esta parte las secuencias pueden ser seleccionadas de modo que causan durante la recombinación homologa una mutación en la región codificadora del péptido objeto maduro, con respecto la secuencia presente endógenamente en la célula. Esta mutación puede comprender substituciones, delecciones e inserciones de aminoácidos individuales so secuencias completas de aminoácidos . Otro objeto de la presente invención es el uso de receptores superficiales localizados en la membrana como marcador de selección negativa un procedimiento para la recombinación homologa. A continuación la invención será explicada con los ejemplos y las figuras siguientes. La figura 1 es una representación esquemática del principio de la recombinación homologa con la utilización de acuerdo con la invención de una selección negativa por dLNGFR. La figura 2 representa el mapa de restricción de plasmido pSV-dLNGFR. Las figuras 3a y 3b representan los resultados de un análisis FACS de células que expresan y células que no expresan dLNGFR. La figura 4 representa el mapa de restricción del plasmido p 187-dLNGFR. La figura 5 representa el resultado de un análisis FACS para la diferenciación de células dLNGFR negativas y dLNGFR positivas.

EJEMPLOS Métodos Técnica de ADN recombinante Para la manipulación de ADN se utilizaron métodos estándar como los descritos por Sambrook, J. et. Al. (1989) en. Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York. Los reactivos de biología molecular utilizados fueron utilizados según las indicaciones del fabricante. Transfección. cultivo y clonación de lineas celulares humanas El vector estaba presente en la forma de una solución en agua bidestilada con una concentración de lµg/µl. Para garantizar una eficiencia de transfección elevada, las células fueron transfectadas con ayuda de elecroporacion (BioRad Genepulser™) bajo condiciones determinadas previamente como óptimas (960 µF/260 MV/18-22 µS) . Como linea celular apropiada se utilizó la linea de fbrosarcoma humano HT1080 (ATCC CCL 121) que crece en forma adherente, en una concentración de 107 células/0.8 ml. Antes y después de la transfección, las células fueron mantenidas sobre hielo durante aproximadamente 10 min para reconstituir la membrana celular. Las células transfectadas se inocularon en platos de cultivo T-175 y se cultivaron en la incubadora a 37° y 7% de C02. Después de 24 horas se aplicó presión de selección por agregado de G1418 (0.8 µl/ml) . Después de 14 dias de cultivo se observaron clones resistentes en la cubeta de cultivo. Una ez madurados los focos ms grandes, las células fueron lavadas con PBS, tripsinadas y coloreadas como suspensión de células individuales. Análisis FACS Los pasos de coloración se realizaron sobre hielo con 105 células/carga. El anticuerpo anti-dLNGFR del ratón, agregado como anticuerpo primario, fue detectado por el anticuerpo secundario de cabra (a-mlgG-FITC, 1:25, Caltag). Como control para un enlace no especifico, las células fueron teñidas solamente con el anticuerpo secundario. Las células muertas fueron detectadas por el agregado de yoduro de propidio (19 µg/ml) . Los análisis se realizaron sobre un FACS-Vantage (Firma Becton Dickinson) según las indicaciones del fabricante. La fluorescencia especifica de las células que expresan dLNGFR fue registrada en el canal FL-1, las células muertas fueron registradas en el canal FL-3. Ejemplo 1 Preparación de la estructura de expresión para dLNGFR Se amplificó el gen dLNGFR (WO 95/06723, Boehringer Mannheim GmbH) , que comprende 965 Bp, con ayuda de la técnica PCR. Por medio de los cebadores utilizados se insertaron en los dos sitios de corte extremos par alas enzimas EcoRI, respectivamente Salí. Después de la amplificación, los fragmentos PCR fueron cortados con las dos enzimas. El vector pSVl que contiene el promotor temprano SV40 y la señal SV40 poliA (Okayama y Berg, mol. Cell. Biol. 3 81983), 280-289; Mulligan y Berg, Proc. Nati. Acad. Sci. US 78 (1981), 2072-2076) también fue cortado con EcoRI y Salí. El vector aislado tiene un tamaño de 3490 bp. El fragmento dLNGFR fue ligado en el vector pSVl . El gen para dLNGFR está bajo control de expresión del promotor SV40 temprano y de la poliseñal SV40. Todo el cartucho de expresión comprende 1900 bp. El vector resultante pSV-DLNGR esta representado en la figura 2. Ejemplo 2 Ensayo de la funcionalidad del cartucho de expresión Células de la linea HT1080 fueron transfectadas transientemente con el plasmido pSV-DLNGFR según lo descrito mas adelante. Después de dos dias de crecimiento, las células fueron analizadas por la expresión de dLNGFR con ayuda del anticuerpo monoclonal anti-dLNGFR. El resultado está representado en la figura 3, la que muestra que las células que expresan dLNGFR y las células que no expresan dLNGFR pueden ser diferenciadas por análisis FACS. La figura muestra ademas, que la reacción del anticuerpo anti-dLNGFR es especifica para células transfectadas. Ejemplo 3 Clonación del cartucho de expresión dLNGFR en un vector de direccionamiento genético El cartucho de expresión dLNGFR fue asilado de pSV-DLNGFR con las enzimas de restricción Notl y PVULL. El vector de direccionamiento "pl87" para el gen EPO humano (escrito en EP 97 112 649.5 y EP 97 113 640.5, ver figura 4b) fuer cortado con Notl y EcoRV. El fragmento de vector del tamaño 14551 bp fue aislado y ligado con el cartucho de expresión dLNGFR (figura 4) . El plasmido resultante "P187-DLNGFR" fue transferido a E.coli y propagado por el mismo. Ejemplo 4 Ensayo por selección negativa en el barrido FACS Células HT1800 fueron Transfectadas con P187-DLNGFR y seleccionadas por medio de integración estable, es decir, 24 horas después de la transfección se agregó g418 al medio. El primer análisis FACS se realizo después de aproximadamente 3 semanas de crecimiento, es decir después de la formación de los primeros focos cuyas células se reunieron en un deposito. Como muestra la figura 5, después este tiempo es posible diferenciar células dLNGFR-negativas, aqui el 14% de la población, de las células que expresan dLNGFR por medio del análisis FACS. En esta población celular, ademas del suceso poco frecuente de la recombinación homologa, se encuentran también aquellas células que representan en su superficie una densidad de receptor demasiado pequeña y que por lo tanto no son conocidas por el sistema de detención. Sin embargo, de este modo es posible reducir nítidamente la cantidad de clones que debe ser ensayada después de la expresión del gen objetivo (aqui 14 de 100%) . Si en la carga de transfección no se encuentra ningún clon con la presencia del vector de direccionamiento recombinado homologamente es demostrada por la presencia de una población que reacciona 100% con anticuerpos anti-dLNGFR. Luego puede eliminarse la exploración adicional por la expresión del gen objetivo. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (29)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad las siguientes reivindicaciones: 1.- Un procedimiento para la inserción de ADN foráneo en una célula anfitriona por medio de recombinación homologa, en el cual la célula anfitriona es transfectada con un vector recombinante, vector que comprende dos secuencias nucleótidas externas flanqueadoras, homologas a una secuencia objetivo en el genoma de la célula anfitriona, internamente a las cuales se encuentran una secuencia nucleótida que"codifica a un marcador de selección positiva, externamente a las cuales se encuentra una secuencia nucleótida que codifica a un arcador de selección negativa, estando cada una de las secuencias nucleótidas que codifican para el marcador de selección positiva y para el marcador de selección negativa enlazadas operativamente con una secuencia de control de expresión activa en la célula anfitriona, estando el procedimiento caracterizado porque como gen marcador de selección negativa se utiliza al menos una secuencia nucleótida que codifica a un polipéptido localizado en la superficie celular de modo que después de una integración del vector por recombinación homologa en el genoma de la célula, el gen marcador de selección negativa no es expresado y después de una integración casual del vector en el genoma de la célula, el gen marcador de selección negativa es visualizado y su producto genético es presentado sobre la superficie celular.
2. 2. - Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque se realiza un paso de selección por la presencia del gen marcador de selección positiva y otro paso de selección por la ausencia del gen marcador de selección negativa.
3. 3. - Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque la selección por la ausencia del gen marcador de selección negativa comprende los pasos de: a) poner en contacto de la célula transfectada con una molécula ligante que se enlaza con el producto genético del gen marcador de selección negativa, y b) separación de las células que comprenden la molécula ligante enlazada.
4. 4.- Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la utilización de un gen marcador de selección negativa que codifica para un receptor LNGF, un receptor CD24, un receptor LDL, un receptor trk o para un fragmento de receptor localizado en la membrana que comprende el dominio de enlace del ligando.
5. 5.- Un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 a 4, caracterizado por la utilización como molécula ligante de un anticuerpo dirigido contra el producto genético del gen marcador de selección negativa.
6. 6.- Un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 a 4, caracterizado por la utilización como molécula ligante de un participante natural del marcador de selección negativa o de un análogo del mismo.
7. 7. -Un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 a 6, caracterizado por la utilización de una molécula ligante acoplada con una fase sólida.
8. 8. - Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado por la utilización como fase sólida de microperlas magnéticas.
9. 9. - Un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 a 8, caracterizado por la utilización de una molécula ligante que lleva un grupo de marcado y/o un grupo de enlace con la fase sólida.
10. 10.- Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque el grupo de marcación y/o el grupo de enlace con fase sólida es seleccionado del grupo formado por biotina, derivados de biotina, haptenos, enzimas y colorantes.
11. 11. -Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque se utiliza biotina o un derivado de biotina seleccionado de iminobiotina, aminobiotina y destiobiotina.
12. 12.- Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque como enzima se utiliza una fosfatasa o peroxidasa alcalina.
13. 13.- Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque como colorante se utiliza un colorante fluorescente.
14. 14.- Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado porque se usa como colorante fluorescente, fluoresceina, ficoeritrina, rodamina, proteina de peridina-clorofila o rojo de Texas.
15. 15.- Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado proque las células que expresan el marcador de selección negativa son identificadas por el enlace con una fase sólida recubierta con avidina o estreptavidina.
16. 16.- Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado proque las células que expresan el marcador de selección negativa son identificadas por medio de una reacción cromática catalizada por la enzima.
17. 17.- Un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 13 - o 14, caracterizado porque las células que expresan el marcador de selección negativa son identificadas por medio de un análisis citometrico de flujo.
18. 18.- Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la célula es una sélula eucariótica, preferentemente uan célula mamifera y especialmente se prefiere una célula humana .
19. 19.- Un vector, recombinante, caracterizado porque comprende: a) dos secuencias nucleótidas externas flanqueadoras homologas a una secuencia objetivo en una célula, b) una secuencia nucleótida que codifica a un marcador de selección positiva bajo el control- de una secuencia de control de expresión activa en la célula, encontrándose dicha secuencia nucleótida internamente a las dos secuencias flanqueadoras de acuerdo con (a) , c) una secuencia nucleótida que codifica a un -marcador de selección negativa bajo el control de una secuencia de control de expresión activa en la célula, encontrándose dicha secuencia nucleótida externamente a las secuencias nucleótidas homologas flanqueadoras y siendo su producto de expresión un polipéptido localizado en la superficie celular.
20. 20.- Un vector de acuerdo con la reivindicación 19, caracterizado porque las secuencias nucleótidas homologas flanqueadoras son seleccionadas del grupo formado por un gen para EPO, tPA, G-CSF, GM-CSF, TPO, una interleucina, un interferon, un factor de crecimiento, insulina o un factor de crecimiento del tipo insulina.
21. 21.- Un vector de acuerdo con una de las reivindicaciones 19 o 20, caracterizado porquela secuencia nucleótida que codifica a un marcador de selección positiva es un gen resistente a neomicina, canamicina, geneticina o higromicina.
22. 22. - Un vector de acuerdo con una de las reivindicaciones 19 a 21, caracterizado porque la secuencia nucleótida que codifica al marcador de selección negativa es una secuencia que codifica para un receptor LNGF, CD24, LDL, trk 'o para un fragmento localizado en la membrana que comprende el dominio de enlace del ligando de dicho receptor.
23. 23.- Un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, caracterizado porque ademas comprende dentro de las secuencias flanqueadoras, una secuencia de control de expresión heteróloga.
24. 24.- Un vector de acuerdo con la reivindicación 23, caracterizado porque la secuencia de control de expresión comprende un promotor CMV.
25. 25.- Un vector de acuerdo con una de las reivindicaciones 19 a 24, caracterizado porque comprende ademas dentro de las secuencias flanqueadoras un gen amplificador .
26. 26.- Un vector de acuerdo con una de las reivindicaciones 19 a 25, caracterizado porque las secuencias nucleótidas homologas flanqueadoras comprenden la región codificadora del gen objetivo o una parte de la misma región.
27. 27.- Un vector de acuerdo con la reivindicación 26, caracterizado porque las secuencias nucleótidas homologas flanqueadoras han sido seleccionadas de modo que durante la recombinación homologa se produce una mutación en la región codificadora del polipéptido objetivo maduro.
28. 28.- Uso de un vector de acuerdo con una de las reivindicaciones 19 a 27, caracterizado porque el vector es usado en un procedimiento de recombinación homologa.
29. 29.- Uso de receptores superficiales localizados en la membrana, caracterizado porque los receptores son usados como marcadores de selección negativa en un procedimiento de recombinación homologa. HOMOLOGA RESUMEN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a un procedimiento para la inserción de un ADN foráneo en el genoma de una célula objetivo por medio de recombinación homologa, asi como también a estructuras de ADN apropiadas para la recombinación homologa.