MXPA00000745A - Produccion de eritropoyetina mediante activacion de genes endogenos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a células humanas, las cuales son capaces, en las bases de una activación del gen EPO humano genómico, de producir EPO en una suficiente cantidad y pureza para hacer posible una producción de costo efectivo del EPO humano como una preparación farmacéutica. La invención además se refiere a un método para la preparación de tales células humanas que producen EPO humano, constructos ADN para la activación del EPO endogénico en células humanas y un método para la producción técnica a gran escala de EPO en células humanas.

Description

PRODUCCIÓN DE ERITOPOYETINA MEDIANTE ACTUACIÓN DE GENES ENDÓGENOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a células humanas las cuales son capaces, en las bases de una activación del gen EPO humano endogénico, de producir EPO en suficiente cantidad y pureza, para permitir la preparación económica del EPO como una preparación farmacéutica. La invención además, se refiere a un método de preparación de tales células que producen EPO humano. Los constructos de ADN para la activación del gen endogénico en células humanas, y métodos para la producción a gran escala de EPO en células 'humanas .

La eritropoietina (EPO) es una glicoproteína humana, la cual estimula la producción de las células de glóbulos rojos. La EPO ocurre en el plasma de la sangre de personas sanas solamente en muy bajas concentraciones, de manera que la preparación en grandes cantidades no es posible de esta manera. Los documentos EP-B-0148 605 y EP- B-0205 564, describen la preparación del EPO humano recombinante en células CHO. La EPO descrita en el documento EP-B-01 48 605 tiene un peso molecular más aleo REF.: 32518 que la EPO urinaria y sin O-glicosilación. Mientras tanto, la EPO a partir de células CHO, descrita en el documento EP-B-0 205 564 está disponible en grandes cantidades y en forma pura, pero se origina a partir de células no humanas. Sin embargo, la capacidad de las células CHO para producirlas es a menudo, relativamente limitada.

Además, se conocen las recolecciones de EPO humano a partir de la orina de pacientes con anemia plástica (Miyake et al., J. Biol. Chem. 252 (1977), 5558-5564) . Aqui se describe un proceso de siete etapas, el cual incluye cromatografía de intercambio de iones, precipitación de etanol, filtración por gel y cromatografía de adsorción. Una preparación EPO con una actividad específica de aproximadamente 70.000 U/mg de proteína, se obtiene en un rendimiento de 21%. Las desventajas de este proceso y otros métodos para obtener la EPO urinaria consisten en el procedimiento del material iniciador en cantidades suficientes y en cantidades repetibles. Además, la purificación a partir de la orina es difícil y aún un producto purificado no está libre de contaminantes urinarios.

El documento GB-A-2085 887 describe un método para la preparación de células linfoblastoides humanas, las cuales son capaces de producir la EPO en cantidades pequeñas . La producción económica de un farmacéutico con estas células no es posible.

El documento WO 91/06667 describe un método para la preparación recombiante de EPO. En una primera etapa del proceso, en embriones de células de riñon humano, el gen EPO endogénico se lleva mediante recombinación homologa dentro del enlace operativo con un promotor viral y el ADN se aisla a partir de estas células. En una segunda etapa, el ADN asi aislado se transforma en células CHO no humanas, y se analiza la expresión del EPO en estas células. No se encuentra mención de que sea posible la producción de EPO en células humanas.

El documento WO 93/09222 describe la producción de EPO en células humanas, en donde la producción de EPO relativamente alta de hasta 960.620 mU/106 células/24 horas, se encuentra en fibroblastos humanos, los cuales han sido transfectados con un vector que contiene el gen EPO completo. Estas células contienen un gen EPO exogénico, el cual no es el sitio o locus correcto del GEN, de manera que se esperan problemas con respecto a la estabilidad de la línea celular. No se encuentra información en la producción constitutiva de EPO en el documentos WO 93/092222. Además, no hay información alguna de si el EPO producido se puede obtener en una calidad suficiente para los propósitos farmacéuticos.

Además, en la WO 93/09222 se describe una activación del gen EPO endogénico en células HT1080 humanas. En una producción EPO, se encuentran de solamente 2.500 mU/106 células en 24 horas (que corresponden a aproximadamente 16 ng/106 células /24 horas) . Tal producción baja es completamente inadecuada para la producción económica de una preparación farmacéutica.

El documento WO94/12650 y WO 95/31560 describe como una célula humana con un gen EPO endogénico activado mediante un promotor viral es viable, después de la amplificación del gen EPO endogénico, para producir hasta aproximadamente 100.000 mU/106 células/24 horas (que corresponden hasta aproximadamente 0.6 µg/106 células/24 horas) . Esta cantidad también no es suficiente aún para la producción económica de un farmacéutico.

El problema en el cual se basa la presente invención, consiste así, en la eliminación de al menos parcialmente, las desventajas descritas anteriormente del estado de la técnica y ofrecer un método tecnológicamente mejor para la preparación de EPO en células humanas. Especialmente, se hace posible, obtener un producto en una cantidad y pureza suficiente para permitir la producción económica para propósitos farmacéuticos.

Este problema se resuelve mediante la activación del gen EPO endogénico en células humanas y opcionalmente mediante amplificación subsecuente del gen EPO humano activado. De esta manera, ha sido sorprendentemente posible, mediante la selección de células iniciales adecuadas, constructos de ADN y estrategias de selección, para proporcionar células humanas las cuales son capaces de producir EPO en suficiente cantidad, calidad y pureza para permitir la producción económica de preparaciones farmacéuticas. Especialmente después de la amplificación del gen EPO endogénico activado, las células que pueden obtenerse tienen un rendimiento de producción definitivamente más alto que la producción de células CHO usadas previamente para la preparación de EPO recombinante.

Un tema de la invención, es una célula humana, la cual contiene copias de un gen EPO endogénico en un enlace operativo con una secuencia de control de expresión heterólogo activo en la célula humana y es capaz sin previa amplificación del gen, de producir al menos, 200 ng de células EPO/105 por 24 horas. Preferiblemente, la célula humana, de conformidad con la invención, es capaz de la producción de 200 hasta 3000 ng de EPO/106 células/24 horas, y más preferiblemente, para la producción de 1000 hasta 3000 ng EPO/células 10d/24 horas.

Otro tema de la presente invención es una célula humana, la cual se obtiene mediante la amplificación del gen a partir de la célula previamente declarada y contiene varias copias de un gen EPO endogénico, cada uno en un enlace operativo con una secuencia de control de expresión heterólogo activo en la célula humana, y es capaz de la producción de al menos 1.000 ng EPO/células 106/24 horas.

Con preferencia especial, la línea celular humana obtenible mediante amplificación del gen, es capaz de producir 1.000 hasta 25.000 ng EPO/células 10d/24 horas.

La célula humana es cualquier célula, proporcionada que se puede cultivar in vitro. Son especialmente preferidas, las células humanas, las cuales pueden ser cultivadas en un medio libre de suero, y especialmente en suspensión. De esta manera, la producción de EPO se puede realizar en un fermentador grande con una capacidad de cultivo de, por ejemplo, 1.000 litros Especialmente preferida, es una célula humana, la cual es una célula inmortalizada, por ejemplo, una célula HT1080 (Rasheed et al., Cáncer 33(1974), 1027-1033), una célula HeLaS3 (Puck et al., J. Exp. Med. 103(1956), 273-286), una célula Na alwa (Nadkarmi et al., Cáncer 23 (1969), 64-79) o una célula derivada a partir de ahí .

Un ejemplo de una célula de conformidad con la invención es el clon "Aladin" el cual se deposito el 15 de Julio de 1997, de conformidad con las prescripciones del Tratado de Budapest, en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) , Mascherorder Weg Ib, 38124 Breunsch eig, bajo el número DMS ACC 2320.

En las células de conformidad con la invención, el gen endogénico EPO está ligado con una secuencia de control de expresión heteróloga, la cual está activa en la célula humana. La secuencia de control de expresión comprende un promotor y preferiblemente, además, las secuencias de mejoramiento de la expresión, por ejemplo, un incrementador. El promotor puede ser un promotor regulable o constitutivo. Preferiblemente, el promotor es un promotor viral fuerte, por ejemplo, un promotor SV40 o CMV. El promotor/incrementador CMV es especialmente preferido.

Además, para optimizar la expresión EPO, puede ser preferido el gen EPO endogénico en las células humanas, las cuales están en una asociación operativa con el promotor heterólogo, para tener señal de secuencia que codifica al péptido, el cual es diferente de la secuencia qué codifica al péptido, y codifica preferiblemente para una señal del péptido con una secuencia de aminoácido modificada. Especialmente preferido, es una señal que codifica al péptido, la cual codifica para una señal de secuencia de péptido modificada en el área de los primeros cuatro aminoácidos, los cuales se seleccionan a partir de Met-X?-X2-X3 En donde Xi es Gly o Ser, X2 es Ala, Val, Leu, lie, Ser o Pro, y X3 es Pro, Arg, Cys o His, siempre que X1-X2-X3 no sean la secuencia Gly-Val-His, y especialmente de (a) Met-Gly-Ala-His, (b) Met-Ser-Ala-His, (c) Met-Gly, Val-Pro o, (d) Met-Ser-Val-His.

Con especial preferencia la secuencia de los primeros cuatro aminoácidos de la señal de péptido es Met-Ser-Ala-His .

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para la preparación de una célula que produce EPO humano, como se declaró previamente, comprende las etapas: (a) Proporcionar células iniciales humanas, las cuales contienen al menos, una copia de un gen EPO endogénico, (b) Transfectar las células con un constructo de ADN, que comprende : (i) dos secuencias ADN de flanqueo, las cuales son homologas con regiones del locus o sitio del gen EPO humano, para permitir una recombinación homologa, (ii) un gen marcador de selección positivo, y (iii) una secuencia de control de expresión heterólogo, la cual es activa en la célula humana, (c) Cultivar las células transfectadas bajo condiciones en las cuales, una selección toma lugar para la presencia del gen marcador de selección positivo, (d) Analizar las células seleccionables de conformidad con la etapa (c) ; y (e) Identificar las células que producen EPO.

El constructo ADN usado en la preparación de las células que producen EPO humano contienen dos secuencias de ADN de flanqueo, las cuales son homologas con áreas del sitio o locus del gen EPO humano para permitir una recombinación homologa. Se realiza la selección de la secuencia de flanqueo adecuada, por ejemplo, mediante métodos descritos en los documentos WO 90/11 354 y WO 91/09 955. Preferiblemente las secuencias de flanqueo tienen cada una, una longitud de al menos 150 bp. Con especial preferencia, las secuencias de AND homologas se seleccionan a partir del área de las secuencias 5' -sin traducir, exon 1 e intron 1 del gen EPO. Es especialmente preferido, usar una secuencia de ADN modificada en el área del exón 1, la cual codifica para una señal péptida modificada en los primeros aminoácidos. Las modificaciones en el área del exon 1 son preferiblemente como se declaran anteriormente .

El gen marcador de selección puede ser cualquier gen marcador de selección adecuado para las células eucarióticas, las cuales, después de la expresión, conducen a un fenotipo seleccionable, por ejemplo, resistencia de antibióticos, auxotrofía, etc. Un gen marcador de selección positivo, especialmente preferido es el gen fosfotransferasa de neomicina.

Opcionalmente, un gen marcador de selección negativo, tal como, se dice, el gen cinasa HSV-timidina, pueden también estar presente, mediante cuyas células de expresión se destruyen en la presencia de un agente de selección.

Si se desea una amplificación del gen EPO endógenamente activado en la célula humana, el constructo ADN contiene un gen de amplificación. Los ejemplos de amplificación del gen adecuados son la reductasa dihidrofolato, adenosina de aminasa, ornitina descarboxilasa, etc. Una amplificación del gen especialmente preferido, es el gen reductasa dihidrofolato, especialmente un mutante de arginina reductasa hidrofolato, el cual tiene una sensibilidad inferior al agente selectivo (metotrexato) que el gen de tipo silvestre o nativo (Simonsen et al., Proc. Nati.

Acad. Sci. USA 80 ( 1983) ; 2495) .

Si una amplificación del gen está presente en el constructo de ADN para la activación del gen EPO, el método de la invención pueden también comprender las siguientes etapas: (f) Una amplificación de la secuencia de AND que codifica para la EPO, y (g) Obtener las células que producen el EPO, las cuales contienen un números de copias, mayores en comparación con la célula inicial, de una secuencia de ADN endogénico que codifica para la EPO madura en un enlace operativo con una secuencia heteróloga de control de expresión.

Los constructos de ADN apropiados para la activación del gen EPO endogénico presente en la célula inicial humana, son los plasmidos listados en los ejemplos: pl87, pl89, pl90, y pl92 o un plasmido derivado del mismo. Especialmente preferido es el plasmido pl89, el cual se deposito en el DSMZ de conformidad con las provisiones del Tratado de Budapest, el 16 de Julio de 1997, bajo el acceso Número DSM 11661 o un plasmido derivado a partir de ahi. Preferiblemente, los constructos ADN son moléculas de plasmido circulares, las cuales son usadas para la transfección de las células humanas en una forma linealizada.

Un tema adicional de la presente invención es un constructo de ADN para la activación del gen EPO endogénico en una célula humana, que comprende: (h) dos secuencias ADN de flanqueo, las cuales son homólogos seleccionados a regiones del sitio o locus del gen EPO humano seleccionado a partir de las secuencias 5' -sin traducir, exon 1 e intron 1, para permitir una recombinación homologa, una secuencia modificada está presente en la región del exon 1 que codifica para los aminoácidos: Me-X?-X2-X3 en donde, Xi es Gly o Ser, X , es Ala, Val, Leu, lie, Ser o Pro y X5 es Pro, Arg, Cys o His, siempre que Xi- X2-X3 no es la secuencia Gly-Val-His, y especialmente para los aminoácidos (a) Met-Gly-Ala-His (b) Met-Ser-Ala-His (c) Met-Gly-Val-Pro o (d) Met-Ser-Val-His, (ii) un gen marcador de selección positiva, (iv) una secuencia de control de expresión heteróloga, el cual es activo en una célula humana, y (v) opcionalmente, una amplificación del gen.

Aún otro objeto de la presente invención es un constructo de ADN, para la activación de un gen EPO endógeno en una célula humana, que comprende: (i) dos secuencias de ADN de flanqueo las cuales son homologas a las regiones del lucus o sitio de gen EPO humano, seleccionado a partir de las secuencias 5'- sin traducir, exon 1 e intron 1, para permitir una recombinación homologa, (ii) un gen marcador de selección positivo, (iii) una secuencia heteróloga de control de expresión la cual está activa en una célula humana, la distancia entre la secuencia heteróloga de control de expresión y el inicio de traducción del gen EPO no es mayor que 1100 bp, y (iv) opcionalmente, una amplificación del gen.

De manera sorprendente, se ha encontrado que, en el caso de una modificación de la secuencia de señal EPO y/o un acortamiento de la distancia entre la secuencia heteróloga de control de expresión y el inicio del gen EPO, se obtiene una expresión optimizada. Preferiblemente, la distancia entre el promotor de la secuencia heteróloga de control de expresión y el inicio de traducción del gen EPO no es mayor que 1100 bp, con especial preferencia no más de 150 bp, y más preferencialmente, no más de 100 bp. Un ejemplo especialmente preferido de un constructo de ADN para ser usado de conformidad con la invención es el plasmido pl89 (DSM 11661) o un plasmido derivado a partir de allí.

Aún otro aspecto de la presente invención, es un método para preparar EPO humana, en donde una célula humana, de conformidad con la invención, es cultivada en un medio adecuado bajo condiciones en la cual una producción de EPO toma lugar y la EPO es cosechada a partir del medio de cultivo. Se usa de manera preferencial, un medio libre de suero. Las células son preferiblemente cultivadas a partir del medio de cultivo. Un medio libre de suero se usa de manera preferencial. Las células son preferiblemente cultivadas en suspensión. El cultivo se realiza especialmente de manera preferente en un fermentador, especialmente en un fermentador grande con una capacidad de, por ejemplo, 10 -50.000 litros.

La cosecha de EPO humano a partir del medio de cultivo de líneas celulares comprende, preferiblemente las siguientes etapas: (a) Pasar el sobrenadante celular sobre un medio de cromatografía de afinidad y cosechar las fracciones que contienen EPO. (b) Opcionalmente, pasar las fracciones que contienen EPO sobre un medio de cromatografía de interacción hidrófobo, y cosechar las fracciones que contienen EPO, (c) Pasar las fracciones que contienen EPO, sobre hidroxiapatito y cosechar las fracciones que contienen EPO, y (d) Concentrar y/o pasar sobre un medio HPLC (RP) de fase inversa.

La etapa (a) del proceso de purificación incluye, pasar el sobrenadante celular, el cual, en algunos casos, puede ser pre-tratado, sobre un medio de cromatografía de afinidad. Preferiblemente, el medio de cromatografía de afinidad, es aquel al cual está acoplado un tinte azul. Un ejemplo especialmente preferido es la sefarosa azul.

Después de la elución a partir del medio de cromatografía de afinidad, el eluato que contiene EPO, se pasa opcionalmente sobre un medio de cromatografía de interacción hidrófoba. Esta etapa es conveniente si se usa un medio de cultivo con un suero contiene >2% (v/v) . Si se usa un medio de cultivo con un contenido de suero bajo por ejemplo, 1% (v/v), o un medio libre de suero, esta etapa puede omitirse. Un medio de cromatografía de interacción hidrofóbica preferido es la butil-sefarosa.

El eluato a partir de la etapa (a) o, si se usa, la etapa (b) , se pasa en la etapa (c) , del método de la invención sobre hidroxiapatito y el eluato que contiene EPO es sometido a una etapa de concentración y/o una etapa de purificación por cromatografía HPLC de fase inversa. La concentración se realiza preferiblemente mediante cromatografía de exclusión, por ejemplo, filtración de membrana, el uso de un medio, tal como una membrana con un tamaño de exclusión de 10 kD que tiene deseable comprobación .

Mediante el método de conformidad con la invención, se obtiene una EPO humana aislada con una actividad especifica de la menos 100.000 U/mg de proteína in vivo (ratón normocitémico) , el cual está libre de contaminantes urinarios y puede diferir en su glicosilación a partir del EPO recombinante de células CHO. Preferiblemente, la EPO de la invención tiene una actividad especifica de al menos 175.000, y con preferencia especial, al menos 200.000 hasta 400.000 o 450.000 IU/ g de proteina. La EPO humana obtenible mediante el método de la invención, puede contener residuos de ácido siálico a-2, 3- y a-2, 6-enlazados. En estudios de EPO a partir de células, las cuales contienen un gen EPO endigénicamente activado, en las bases de los resultados preliminares presentes, se encontró la presencia de residuos de ácido siálico a-2, 3- y a-2, 6-enlazados. Además, se ha encontrado en las bases de los resultados preliminares presentes, que la EPO humana de la invención, tiene un contenido de menos de 0.2% de ácido N-glicol neurámico, basado en el contenido de ácido N-acetil neurámico.

La pureza del EPO humano de las cantidades de la invención, son preferiblemente al menos 90%, con especial preferencia al menos 95% y más preferiblemente al menos 98% del contenido total de proteína. La determinación del contenido total de proteína puede realizarse mediante HPLC de fase inversa, por ejemplo, con una columna POROS R/2H.

Además, mediante el método de la invención, se obtienen las especies EPO, las cuales difieren en su secuencia de aminoácido. Así, se encuentra mediante análisis espectrométrico de masas (MALDI-MS) que un EPO humano puede aislarse a partir de células HeLa S3, las cuales son principalmente un polipéptido con una longitud de 165 aminoácidos, el cual se forma mediante el procesamiento C-terminal de un residuo arginina, y en algunos casos, incluye hasta 15% de un EPO con 166 aminoácidos. También, un EPO humano es obtenible, el cual incluye un EPO con una longitud de 166 aminoácidos, es decir, un EPO no procesado. A partir de células Namalwa, por ejemplo, se han aislado EPO humanas, las cuales comprenden una mezcla de polipéptidos con una longitud de 165 y 166 aminoácidos.

Este EPO humano puede usarse como una substancia activa para una preparación farmacéutica la cual puede contener substancias activas adicionales, así también como adyuvantes, vehículos y aditivos farmacéuticamente comunes.

En aún otro aspecto, la presente invención se refiere a un ADN aislado, el cual codifica para un EPO humano con una secuencia modificada en la región de los primeros aminoácidos de la señal del peptido, el cual se selecciona a partir de: Met-X?-X2-X3. en donde Xi es Gly o Ser, X2 es Ala, Val, Leu, lié, Ser o Pro, y X3 es Pro, Arg, Cys o His, siempre que X1-X2-X3- no sea la secuencia Gly-Val-His, y especialmente para los aminoácidos: (a) Met-Gly-Ala-His (b) Met-Ser-Ala-His (c) Met-Gly-Val-Pro o (d) Met-Ser-Val-His.

El ADN puede ser por ejemplo, un ADN genómico o un ADNc.

La invención continuará ejemplificada por los siguientes ejemplos, figuras y listados se secuencias.

Figura 1. Es una representación esquemática de las regiones de homología del gen EPO a partir del área de las secuencias 5' sin traducir, exon 1 e intrón 1.

Figura 2. Es una representación esquemática de un plasmido, el cual contiene las regiones de homología EPO, a partir del área de las secuencias 5' sin traducir, exon 1 e intrón 1.

Figura 3. Es una representación esquemática de una secuencia de activación del gen, la cual contiene el promotor del virus del sarcoma Rous (RSV) , el gen fosfotransferasa de neomicina (NEO) , la región temprana de poliadenilación de SV40 (SVI pA) , el promotor temprano SV40 (SVI), el gen reductasa dihidrofolato (DHFR) , una región temprana de poliadenilación SV40 adicional, y el promotor temprano citomegalovirus inmediato y un incrementador (MCMV) .

FIGURA 4. La preparación del vector pl76 objetivo del gen EPO.

Figura 4b. La preparación de los vectores pl79 y pl87 objetivos del gen EPO.

Figura 4c. La preparación del vector objetivo del gen EPO.

Figura 4d. La preparación del vector pl90 objetivo del gen EPO.

Figura 4e. La preparación del vector 192 objetivo del gen EPO.

Figura 5. Una representación esquemática de la preparación del ADNc EPO con mutaciones de la señal, de secuencia.

Figura ßa. La hibridación del ADN celular con una sonda a partir del área CVM del cásete del gen representado en la figura 3; las líneas 1 a 4, son cada una de ADN de células humanas desdobladas con las enzimas de restricción Agel y AscI; linea 1: células HeLa S3 que producen EPO, amplificadas con 1.000 nM MTX; línea 2: células HeLA S3 que producen EPO, amplificadas con 500 nm, MTX; línea 3: célula HeLa S3 que produce EPO sin amplificación; línea 4: célula HeLa S3 sin gen EPO activado; línea 5: marcador de longitud marcada con digoxigenina; el tamaño del fragmento hibridizante en las líneas 1 hasta 3 es de aproximadamente 5.200 bp, y Figura ßb. La hibridación de una sonda a partir del área que codifica de EPO con ADN a partir de células humanas; línea 1, marcador de longitud marcada con digoxigenina; líneas 2 hasta 4: ADN a partir de células humanas desdobladas con las enzimas de restricción BamHI, HindIII, y Sil; línea 2: célula HeLa S3 que produce EPO, amplificada con 500 nM MTX (longitud de la banda producida mediante el gen endogénico no activado; 3.200 bp; longitud de la copia de este gen activado mediante el gen objetivo: 2.600 bp) ; línea 3: ADN a partir de una célula HeLa S3 que produce EPO, no amplificada; línea 4: ADN a partir de una célula de control HeLa S3.

SEC ID No.l y No. 2. Secuencias de nucleótidos de los cebadores usados para la preparación del Producto 1 PCR (figura 1) .

SEC ID No.3 y No. . Secuencias del cebador usado para la preparación del Producto 2 PCR (FIGURA 1) .

SEC ID NO.5. Secuencia del cebador EPO EX1 SEC ID NO.6. Secuencia del cebador EX2.

SEC ID NO.7. Secuencia del cebador EX3 (Met-Gly-Ala-His) .

SEC ID NO.8. Secuencia del inicio de la señal peptídica modificada codificada mediante el cebador EX3.

SEC ID NO. 9. Secuencia del cebador EX4 (Met-Ser-Ala-His) .

SEC ID NO.10. Secuencia del inicio de la señal peptídica modificada codificada por el cebador EX4.

SEC ID NO.11. Secuencia del cebador EX5 (Met-Gly-Val-Pro) .

SEC ID NO.12. Secuencia del inicio de la señal peptidica modificada codificada por el cebador EX5.

SEC ID NO.13. Secuencia del cebador EX6 (Met-Ser-Val-His) .

SEC ID NO.14. Secuencia del inicio de la señal peptídica modificada codificada por el cebador EX6.

SEC ID NO.15. Secuencia del cebador del genoma 1 EX.

SEC ID NO.16. Secuencia del cebador EX13.

SEC ID NO.17. Secuencia del cebador EX17 DE EPO.

Ejemplos La activación del lucus o sitio del gen EPO para la producción de la proteína en una escala industrial se realizó mediante la integración homologa de una secuencia de activación del gen, la cual contiene el gen de fosfotrasnferasa de neomicina (NEO) , para la selección (resistencia G-418), el gen reductasa hidrofolato murina (DHFR) , (para la amplificación del gen mediante MTX) y el promotor e incrementador temprano inmediato citometagolivurs (CMV) para la activación del gen.

Ejemplo 1 Clonación de las Regiones de Homología EPO Las regiones de homología del gen EPO se amplificaron mediante el uso de un ADN de placenta genómico (Boehringer Mannheim) . Se prepararon dos productos PCR a partir de una región de homología de 6.3 kB de longitud, del área de las secuencias 5' sin traducir del gen EPO, exón 1 e intrón 1 (cotéjese figura 1) . Los cebadores usados para la preparación del producto PCR 1, tienen las siguientes secuencias: 5' -CGC GGC GGA TCC CAG GGA GCT GGG TTG ACC GG-3' (SEC ID No.l) y 5' -GGC CGC GAA TTC TCC GCG CCT GGC CGG GGT CCC TCA GC-3' (SEC ID No .2 ) . Los cebadores usados para la preparación del Producto 2 de PCR tienen las siguientes secuencias: 5' -CGC GGC GGA TTC TCT CCT CCC TCC CA GCT GCA ATC-3' (SEC ID No.3) y 5' -GGC CGC GAA TTC TGA AAG AGA TAG CCA GGC TGA GAG-3' (SEC ID NO.4) . Los segmentos deseados se cortaron de los Productos 1 y 2 PCR mediante el desdoblamiento de restricción (PCR Producto :1 HindIII, Producto 2 PCR: HindIII y Eco RV) y se clonan en el vector pCRII (Invitrogen) el cual ha sido desdoblado con Hind III y Eco RV. El vector recombinante obtenido de esta manera se llamó 5epo per 1000 (cotéjese la figura 2).

Ejemplo 2. Construcciones de los Vectores Objetivos del Gen EPO 2.1 Una secuencia de activación del gen el cual contiene el gen NEO, el gen DHFR, y un promotor/incrementador CMV (cotéjese la figura 3), se insertó en el sitio Agel del sitio del plasmido 5epocr 1000 que contiene la región de homología EPO, y se obtuvo el plasmido pl76 (cotéjese la figura 4a) . Para llevar el Promotor CMV tan cerca como sea posible al sitio o lucus inicial de traducción del gen EPO, un segmento largo de 963, se suprimió entre los sitios de restricción AscI y Agel (desdoblamiento parcial) , sobre el cual se obtuvo el plasmido pl79 (figura 4b) .

Alcanzar una optimización de la expresión, nucleótidos en exón 1, el cual codifica para el comienzo de la secuencia líder EPO Met-Gly-Val-His, se reemplazaron mediante la secuencia sintética Met-Ser-Ala-His (cotéjese también el Ejemplo 6) . Esta secuencia se obtuvo mediante amplificación de una secuencia EPO-ADN genómica, por ejemplo, del plasmido pEP0148, la cual contiene un fragmento de BstEII/EcoRI de 3.5 kB (que incluye los exones 1-5) de la secuencia del gen EPO humano, bajo el control del promotor SV40 (Jacobs et al., Nature 313 81985), 806 y Lee-Huang et al., Gene 128 (1993), 227) como patrón con los cebadores Ex4 (SEC ID NO.9) y Exl7 (SEC ID NO.17) (Tabla I). Así, se obtuvo el plasmido pl87 (figura 4) .

El plasmido pl89 se preparó a partir del plasmido pl87 mediante inserción del gen timidinocinasa del virus del herpes simplex (HSV-TK) el cual se originó a partir del Psvtk-1 (PuvII/NarI) (figura 4c) . El gen HSV-TK está bajo control del promotor SV40 en el extremo 3' del Intron 1 (Eco RV/Clal) en una orientación opuesta relativa al promotor CMV, y deberá servir para la selección negativa de una recombinación homologa.

Para la construcción del plasmido pl90, se subclonó un fragmento Sfil/Bgill de pHEAVY, un plasmido el cual contiene el ADNc de un mutante arginina de DHRF descrito en Simonsen et al. (Proc. Nati. Acad. Sci, USA 80 (1983), 2495) en el corte del plasmido pGenak-1 con Sfil y BglII, el cual contiene el gen NEO bajo el control del promotor RSV y el sitio tardío de poliadenilación SV40 como terminador, el gen DHFR murina bajo el control del promotor temprano SV40 y del sitio temprano de poliadenilación SV40 como terminador (Kaufmmann et al., Mol. Cell. Biol. 2 (1982), 1304; Okayama et al., Mol. Cell. Biol. 3 (1983), 280, y Schimke, J. Biol. Chem. 263 (1988), 5989) y el promotor CMV (Boshart et al., Cell 41 (1995) 5219. Entonces, un fragmento Hpal, el cual contiene el ADNc que codifica para la arginina DHFR mutante, se ligó en el corte del plasmido pl89 con Hpal, sobre el cual se obtuvo el plasmido pl90 (Figura 4d) . 2.5 Para obtener un vector de transfección sin el gen HSV-TK, un fragmento Ascl/Nhel del plasmido pl90, el cual contiene la secuencia de activación del gen, se ligó en un fragmento Ascl/Nhel, que contienen el exon 1, del plasmido pl87. El plasmido resultante se nombró pl92 (Figuras 4c) .

Ejemplo 3. Transfección de células Se seleccionaron varias líneas celulares para la producción de EPO y se transfectaron con vectores objetivo. 3.1 Células Namalwa Las células se cultivaron en botellas o matraces de cultivos de tejidos T150 y se transfectaron mediante electroporación (1 x 107 células/800 µl de amortiguador de electroporación 20 mM Hepes, 138 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 0.7 mM de Na2HP?4, 6mM de monohidrato de D-glucosa pH 7.0, 10 µg de ADN linealizado, 960 µF, 260 V de BioRad Gene Pulser) . Después de la electroporación, las células se cultivaron en RPMI 1640, 10% (v/v) de suero de bovino fetal (FCS) , 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sodio en cuarenta y siete placas de 96 pozos. Después de dos días, las células se cultivaron por 10 hasta 20 días en 1 mg/ml de un medio que contiene G-418. El sobrenadante se valoró en ELISA de fase sólida para la producción de EPO (ver ejemplo 4) . Los clones que producen EPO, se expandieron en placas de 24 pozos y matraces o botellas de cultivo de tejidos T-25. Las alícuotas se refrigeraron y las células se subclonaron mediante FACS (Ventage, Becton Dickinson) . Los subclones se ensayaron repetidamente para la producción de EPO. 3.2 Células HT 1080 Las condiciones fueron como se describe para las células Namalwa, excepto que las células HT1080 se cultivaron en DMEM, 10% (v/v) FCS, 2mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sodio. Para la transfección mediante electroporación, las células se liberaron a partir de las paredes de los recipientes de cultivo mediante tripsinización. Después de la electroporación, las células 1 x 107 se cultivaron en DMEM, 10% (v/v) FCS, 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sodio en cinco placas de 96 pozos. 3.3 Células HeLa S3 Las condiciones fueron como se describe para las células Namalwa, excepto que las células HeLa se cultivaron en RPM 1640, 10% (v/v) FCS, 2 mM de L-glutamina, 1% (v/v) MEM, aminoácidos no esenciales (Sigma), y lmM de piruvato de sodio. Para la transfección mediante electroporación, las células se liberaron a partir de las paredes de los recipientes de cultivo mediante tripsinización. Las condiciones para la electroporación fueron 960 µF/250 V. Después de la electroporación, las células se cultivaron en RMPI 1640, 10% (v/v) FCS, 2mM de L-glutamina, 1% (v/v) MEM, 1 mM de piruvato de sodio en matraces o botellas de cultivo de tejidos T75. 24 oras después de la electroporación las células se tripsinizaron y cultivaron por 10 hasta 15 días, en un medio que contiene 600 µg/ml de G-418 en diez placas de 96 pozos.

Ejemplo 4. Selección para los Clones que producen EPO El sobrenadante de cultivo de células transfectadas se ensayó en ELISA EPO. Todas las etapas se realizaron a temperatura ambiente. Las placas de 96 pozos que se revistieron previamente con estreptavidina, se revistirieron con anticuerpos anti-EPO bioteñidos, (Boehringer Mannheim) . Para el revestimiento, las placas se lavaron primero con 50 mM de fosfato de sodio pH 7.2, y 0.05% (v/v) de Tween 20. Después 0.01 ml del amortiguador de revestimiento (4 µg/ml de anticuerpo bioteñido, 10 mM de fosfato de sodio pH 7.2, 3g/l de albúmina de suero bovina, 20 g/1 de sacarosa, y 9 g/1 NaCl se agregó por pozo, y se incubaron a temperatura ambiente por 3 horas. Después, las placas se lavaron con 50 mM de fosfato de sodio, pH 7.2, se secó y se selló.

Antes del ensayo, después de lavar las placas tres veces con 0.3 ml de solución de sal de fosfato amortiguada (PBS) y 0.05% Tween 20 (Sigma); las placas se incubaron durante la noche con 0.2 mL de PBS y 1% (p/v) Crotein (Boehringer Mannheim) por pozo para bloquear los enlaces no específicos.

Después de la eliminación de la solución de bloqueo, 0.1 mL del sobrenadante de cultivo, se agregó y las placas se incubaron durante la noche. Los pozos individuales se lavaron tres veces con 0.3 ml de PBS y 0.055 de Tween 20 cada vez. Después, se agregó por dos horas 100 µl de peroxidasa (POD) de anticuerpo monoclonal conjugado (Boehringer Mannheim, 150 mU/ml) . Los pozos entonces nuevamente se lavaron tres veces con 0.3 mL de PBS y 0.05% de Tween 20 cada vez. Después la reacción de peroxidasa se realizó usando un substrato ABTSR en un Fotómetro Elermer Perkin a 450 nm. Una curva de calibración que usa un recombinante EPO a partir de células CHO (Boehringer Mannheim, 100-1000 pg/pozo) se usó para calcular las concentraciones EPO.

Ejemplo 5. Amplificación del Gen EPO Para incrementar la expresión EPO, los clones que producen EPO se cultivaron en la presencia de las concentraciones incrementadas (100 pM- 1000 nM) de metotrexato (MTX) . Los clones se ensayaron a cada concentración MTX mediante ELISA (ver Ejemplo 4) para la producción de EPO. Los productores fuerte se subclonaros mediante dilución limitada.

Ejemplo 6. Mutaciones de Señal de Secuencia Para optimizar la secuencia lider de la molécula EPO, los primeros aminoácidos codificados mediante el exon 1 se reemplazaron. Los cebadores con secuencias diferentes (SEC ID NO. 4-17; el cebador 3' que contiene un sitio CelII para la selección de secuencias modificadas) , se usaron para obtener como patrón un fragmento Ascl/Xbal mediante PCR, usando un plasmido pEP0227, el cual contiene un fragmento HindIII/EcoRI de 4 kb (que incluye exones 1-5) de la secuencia del gen EPO humano bajo el control del promotor SV40 (Jacobs et al., Nature 313 (1985), 806; Lee-Huang et al., Gene 128 (1993), 227). Los fragmentos resultantes se clonaron entonces en el plasmido pEP0148 (Ejemplo 2.2), y se obtuvieron los plasmidos pEPO 182, 183, 184, y 185 (figura 5) . La expresión del gen EPO se condujo mediante un promotor SV40. Las células COS-7 se transfectaron temporalmente con los constructos (método DEAE dextran) y las células se ensayaron por 48 después de la transfección para la producción EPO.

La secuencia lider mutada Met-Ser-Ala-His obtenida de esta manera con la mejor expresión EPO se usó para la construcción de los vectores del gen objetivo (cotéjese el Ejemplo 2.2).

Ejemplo 7. Caracterización de las líneas celulares que producen EPO Tres lineas celulares diferentes (Namalwa, HeLa S3 y HT 1080), se seleccionaron para la activación del gen EPO. Los clones que producen EPO, se obtuvieron mediante transfección con los plasmidos pl79, pl87, pl89, pl90 o pl92 (cotéjese los Ejemplos 2 y 3) .

Aproximadamente 160.000 clones NEO resistentes, se ensayaron para la producción EPO, del cual 12 hasta 15 se secretaron reproduciblemente en EPO con rendimiento significante en el sobrenadante celular.

De este total de 7 clones, fueron sorprendentemente identificados los cuales se producen sin la amplificación del gen, mediante MXT, la EPO en suficientes cantidades para una gran producción industrial. La producción EPO de estos clones varía de 200 ng/ml a más de 1000 ng/ml/células 106/24 horas. Un ejemplo de una de tales células es el clon "Aladin" depositado en el DMSZ (DMS ACC 2320), el cual se obtuvo a partir de una células Namalwa.

Después de la amplificación del gen con 500 nM de MTX, la producción EPO de los clones EPO identificados, se incrementó a más de 3000 ng/ml/células 106/24 horas. Un incremento adicional de la concentración MTX a 1000 nM condujo a una producción de hasta más de 7000 ng/ml/células 106/24 horas.

Los clones obtenidos también mostraron la producción EPO bajo condiciones de cultivos libre de suero .

Ejemplo 8. Caracterización del Genoma de los clones que producen EPO. 8.1 Metodología Se aisló el ADN genómico humano a partir de aproximadamente 108 células y se cuantifico (Sambrook et al., 1989). Después del desdoblamiento del ADN genómico con las enzimas de restricción, por ejemplo, Agel y AscI o BamHI, Hnd III y Salí respectivamente, los fragmentos de ADN se separaron de conformidad con su tamaño mediante electroforesis con gel de agarosa, y finalmente, se transfirieron a una membrana de nylón se inmovilizaron.

El ADN inmovilizado se hibridizó con sondas EPO marcados con digoxigenina o sondas de ADN específico de secuencia de activación del gen (DIG 7ADN Equipo de Etiquetación, Boehringer Mannheim) y se lavaron bajo condiciones rígidas. Las señales de hibridación específicas, se detectaron por medio de un procedimiento de luminiscencia química usando películas sensibles a la radiación. 8.2 Resultados El tratamiento de las células con 500 nM de MTX condujo a un incremento de la señal de hibridización al sitio o locus EPO por un factor de 5 hasta 10. Después de un incremento adicional hasta 10 nM MTX, se obtuvo un incremento mediante un factor >10 (figura ßa) .

En el caso de la hibridación con la sonda específica EPO, las copias del cromosoma 7 que no fueron afectadas por la recombinación homologa, también se detectaron. Como se puede observar en la Figura 6b, estos fragmentos ADN que hibridizan similarmente, tienen un tamaño diferente distinguible y no cambian en sus fuerza de señal, mediante el uso de MTX.

Ejemplo 9. Purificación de EPO a partir de sobrenadantes de cultivos de líneas celulares humanas (HeLa S3; Namalwa y HT1080) .

Para la purificación de EPO a partir de los sobrenadantes de cultivos celulares de las lineas de células humanas, básicamente se usaron dos métodos, los cuales difieren en número y principio de las etapas de cromatografía y se usaron dependiendo de la composición del medio y la concentración EPO: Método 1: Ira. Etapa: columna de sefarosa azul 2da. Etapa: columna de sefarosa butilo 3ra. Etapa: columna de hidroxiapatito 4ta. Etapa: reconcentración Método 2: Ira. Etapa: columna de sefarosa azul 2da. Etapa: columna de hidroxiapatito 3ra. Etapa reconcentración (3ra. Etapa alterna: RP-HPLC) .

Ejemplo de purificación de un sobrenadante de cultivo celular HeLaS3 con 2% (v7v) de suero de bovino fetal (FCS) mediante el método I: 1. Columna de Sefarosa azul: Una columna Hi-Trap-Blue de 5 ml (columna lista para usarse de sefarosa azul, Pharmacia) se equilibró con al menos 5 volúmenes de columnas (SV's) de amortiguador A (20 mM Tris-HCl, pH 7.0; 5 mM CaCl3; 100 mM NaCl) . Después, 70 ml de sobrenadante celular HeLa (que contiene aproximadamente 245 µg de EPO y 70-100 mg de la proteína total) se mantuvieron durante la noche a un flujo de 0.5 ml/minuto por el método circulatorio.

La columna se lavó con al menos 5 SV s de amortiguador B (20 mM de Tris-HCl, pH 7.0; 5 mM de CaCl3, 250 mM NaCl) y al menos, 5 SV's de amortiguador C (20 mM Tris-HCl, pH 7.0; 0.2 mM CaCl3; 250 mM NaCl) a 0.5 ml/min. Lo sucesivo del lavado siguió por la medición del contenido proteinico a OD280.

La elución de EPO se realizó con amortiguador D (100 mM de Tris-HCl, pH 7.0; 0.2 mM CaCl3; 2M de NaCl) a un flujo de 0.5 ml/minuto. La solución de elución se colectó en fracciones de 1-2 ml .

El contenido EPO de las fracciones, las soluciones lavadas y el flujo a través de él, se determinó mediante fase inversa (RP)-HPLC mediante la aplicación de una alícuota en una columna POROS R2/H (Boehringer Mannheim) . De manera alterna, se realizó un teñido de mancha inmunológica para la identificación cualitativa de fracciones que contienen EPO.

Las fracciones que contiene EPO (8-12 ml) se vertieron y aplicaron a una columna de sefarosa butilo.

El rendimiento después de la columna de sefarosa azul fue aproximadamente 175 µg de EPO (corresponde a aproximadamente 70%) . En general, el rendimiento después de la sefarosa azul fue entre 50 y 75%. 2. Columna de Sefarosa Butilo (Cromatografía de Interacción Hidrófoba) .

Se equilibró una columna de sefarosa de butilo 2-3 ml semi-elaboradas (material: Toyoperal Butilo S650) , con al menos, 5 SV's de amortiguador D (100 mM de Tris-HCl, pH 7.0; 0.2 mM de CaCl2 y 2M de NaCl) , y después se vertió la sefarosa azul que contiene EPO de 1 (aproximadamente 150 µg de EPO) se mantuvo a un flujo de 0.5 ml/minuto.

La columna se lavó a 0.5 ml/minuto con al menos 5 SV's de amortiguador E (20 mM de Tris-HCl, pH 7.0; 2 M de NaCl e isopropanol al 10%) . El lavado sucesivo seguido por la medición del contenido proteínico a OD280.

La elución de la EPO se realizó con amortiguador F (20 mM de Tris-HCl, pH 7.0; 2M NaCl e isopropanol al 20%) a un flujo de 0.5 ml/minuto. La solución de elución se colectó en fracciones de 1-2 ml.

El contenido EPO de las fracciones, las soluciones lavadas y el flujo de paso, se determinó mediante RP-HPLC por la aplicación de una alícuota a una columna POROS R2/H. De manera alterna, se realizó un teñido de mancha inmunológica para la identificación cualitativa de las fracciones que contienen EPO.

Las fracciones que contienen EPO (10-15 ml), se vertieron y aplicaron a una columna de hidroxiapatito.

El rendimiento de la columna de sefarosa butilo fue de aproximadamente 130 µg de EPO (correspondiente a aproximadamente 85%) . En general, el rendimiento de la sefarosa butilo fue entre 60 y 85% de la cantidad aplicada a partir de la sefarosa azul vertida. 3. Columna de hidroxiapatito Una columna de hidroxiapatito de 5 ml (columna lista para usarse Econo-Pac CHT II de BioRad) , se equilibró con al menos, 5 SV's de amortiguador F (20 mM de Tris-HCl, pH 7.0; 2M de NaCl; 20% de isopropanil) y después la sefarosa butilo vertida que contiene EPO a partir de 2. (aproximadamente, 125 µg de EPO), se mantuvo a un flujo de 0.5 ml/minuto.

La columna se lavó con al menos 5 SV s de amortiguador G (20 mM de Tris-HCl, pH 7.0; 2M de NaCl) a 0.5 ml/minuto. Los lavados sucesivos se siguieron por la medición del contenido proteinico a OD280.

La elución de la EPO se realizó con amortiguador H (10 mM de fosfato de sodio, pH 7.0; 80 mM de NaCl) a un flujo de 0.5 ml/minuto. La solución de elución se colectó en fracciones de 1-2 ml .

El contenido EPO de las fracciones, las soluciones lavadas y el flujo de paso se determinó a través de RP-HPLC mediante la aplicación de una alícuota en una columna POROS R2/H.

Las fracciones que contienen EPO se vertieron (3-6 ml) . El rendimiento de la columna de hidroxiapatito fue de aproximadamente 80 µg de la EPO (que corresponde a aproximadamente 60%) . En general, el rendimiento de la columna de hidroxiapatito se contó entre 50 y 65% de la sefarosa butilo vertida aplicada. 4. Reconcentración Las fracciones EPO vertidas de la etapa de hidroxiapatito, se elevaron a una concentración de 0.1 - 0.5 mg/ml en unidades de centrifugación con un tamaño de exclusión de 10 kD (por ejemplo, Microsep por Fitlron) , 0.01% de Tween 20 se agregó y se apilaron en alícuotas a -20°C.

Tabla de Rendimientos La pureza del EPO aislado fue de aproximadamente >90%, y generalmente aún >95%.

Para incrementar el rendimiento EPO, también se usó el método 2, en el cual, se eliminó la etapa de sefarosa butilo. Este método es especialmente aplicable en el caso de los sobrenadantes de cultivos celulares sin o con 1% (v/v) de FCS de adición, y rendimientos de EPO aislados de aproximadamente pureza igual (90-95%) . La presencia de 5 mM de CaCl2 en el amortiguador de equilibrio (amortiguador F) para la columna de hidroxiapatito condujo en este método al enlace mejorado y así también a una conducta de elución reproducible de EPO en la etapa de hidroxiapatito. Por lo tanto, el Método 2 se practicó con el mismo procedimiento básicamente como en el Método 1, con los siguientes amortiguadores: 1. Columna de Sefarosa Azul: Amortiguador de Equilibrio 20 mM de Tris HCl, pH 7.0 (amortiguador A) 5 mM CaCl2; 100 mM de NaCl Amortiguador de lavado 1 20 mM de TrisHCl, pH 7.0 (amortiguador B) 5 mM de CaCl2; 250 mM de NaCl Amortiguador de lavado 2 20 mM de Tris-HCl, pH 7. 5 (amortiguador C) mm de CaCl2, 250 mM de NaCl Amortiguador de Elución 100 mM de Tris-HCl, pH 7.0 5 (amortiguador D) mM de CaCl2; 2M de NaCl 2. Columna de hidroxiapatito: Amortiguador de Equilibrio 50 mM de Tris HCl, pH 7.0 (amortiguador F) 5 mM CaCl2; 1 mM de NaCl Amortiguador de lavado 1 10 mM de TrisHCl, pH 7.0 (amortiguador G) 5 mM de CaCl2; 80 mM de NaCl Amortiguador de Elución 10 mM de fosfato de sodio, (amortiguador H) pH 7.0 0.5 mM de CaCl2; 80 mM de NaCl Tabla de Rendimientos La adición de 5 mM de CaC12 a los amortiguadores B a G en el Método 1 también resultó en un enlace mejor y una elución más definida de la columna de hidroxiapatito.

Ejemplo 10. Determinación de la Actividad especifica in vivo de EPO a partir de Lineas Celulares Humanas (Bioensayo en el ratón Normositémico) .

La actividad relacionada con las dosis de EPO en la proliferación y diferenciación de las células precursoras de eritrocitos, se determinó in vivo en ratones en las bases del incremento de los reticulocitos en la sangre después de la administración de EPO.

Para este propósito, ocho ratones se trataron parenteralmente con dosis diferentes de las muestras EPO y se analizaron y de un EPO estándar (balanceado contra el EPO estándar WHO) . Los ratones se tomaron bajo condiciones definidas constantes. 4 días después del tratamiento EPO, se tomó sangre a partir de los ratones y los reticulocitos se tiñeron con acridina naranja. La determinación del número de reticulocitos por 30, 000 eritrocitos, se realizó mediante microfluorimetría en el citómetro de flujo por el análisis del histograma rojo fluorescente.

El computo de la actividad biológica se hizo a partir de los valores de los conteos de reticulocito del espécimen y aquellos del estándar a varias dosis mediante el método descrito por Linder de la determinación del contenido en pares con líneas rectas paralelas (A. Linder, Plañan y Ausweten von Vwesuchen, 3ra. Ed., 1969, Birkenháuser Verlag BasI) .

Resultados : LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE (A) NOMBRE: Boehringer Mannheim GmbH (B) DIRECCIÓN: Sandhofer Str. 112-132 (C) CIUDAD: Mannheim (D) PAÍS: Alemania (E) NUMERO DE ZONA POSTAL: 68305 (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Preparación de eritropoietinas mediante la activación del gen endogénico (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 17 ,'iv) VERSIÓN LEGIBLE EN LA COMPUTADORA: (A) MEDIO: DISCO DURO (B) COMPUTADORA: IBM PC Compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patent In Reléase #1.0, Versión #1.30 (EPA) (2) INFORMACIÓN EN LA SEC ID NO.l (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 32 bases pares (B) CLASE: Nucleótido (C) FORMA DE HEBRA: Una sola hebra (D) TOPOLOGÍA: Lineal (xi.) DESCRIPCIÓN DE LA SEC: SEC ID No.l: CGCGGCGCAT CCCAGGGAGC TGGGTTGACC GG 32 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO.:2 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 38 bases pares (B) CLASE: Nucleótido (C) FORMA DE HEBRA: Una sola hebra (D) TOPOLOGÍA: Lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 2: GGCCGCGAAT TCTCCGCGCC TGGCCGGGGT CCCTCAGC 38 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO.3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 36 bases pares (B) CLASE: Nucleótido (C) FORMA DE HEBRA: Una sola hebra (D) TOPOLOGÍA: Lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.3: CGCGGCGGAT CCTCTCCTCC CTCCCAAGCT GCAATC 36 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 36 bases pares (E) CLASE: Nucleótido (F) FORMA DE HEBRA: Una sola hebra (G) TOPOLOGÍA: Lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.4: GGCCGCG AAT TCTAGAACAG ATAGCCAGGC TGAGAG 36 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO.5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 bases pares (B) CLASE: Nucleótido (C) FORMA DE HEBRA: Una sola hebra (D) TOPOLOGÍA: Lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.5: TCACCCGGCG CGCCCCAGGT CGCT 24 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO.6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 61 bases pares (B) CLASE: Nucleótido (C) FORMA DE HEBRA: Una sola hebra (D) TOPOLOGÍA: Lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.6 ATGCTCGAGC GGCCGCCAGT GTGA TGGATA TCTGCAGAGC TCAGCTTGGC CGCGAATTCT 60 A 61 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO. 7 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 78 bases pares (B) CLASE: Nucleótido (C) FORMA DE HEBRA: Una sola hebra (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) POSICIÓN: 49.60 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.7: TCACCCGGCG CGCCCCAGGT CGCTGAGGGGA CCCCGGCCAG GCGCGGAG ATG GGG GCC 57 Met Gly Ala 1 CAG GGTGAGTACT CGCGGGCT 78 His (2) INFORMACIÓN EN LA SEC ID NO. 8 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 4 aminoácidos (B) CLASE: Nucleótido (C) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) CLASE DE MOLÉCULA: Proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.8 Met Gly Ala His 1 (2 ) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO.9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 78 bases pares (B) CLASE: Nucleótido (C) FORMA DE HEBRA: Una sola hebra (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) POSICIÓN: 49., 60 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.9: TCACCCGGCG CGCCCCAGGT CGCTGAGGGA CCCCGGCCAG GCGCGGAG ATG AGC GCC 57 Met Ser Ala 5 CAC GGTGAGTACT CGCGGGCT 78 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO.10 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 4 aminoácido (B) CLASE: Nucleótido (C) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) CLASE DE MOLÉCULA: Proteína (xí) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 10 Met Ser Ala His 1 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO. 11 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 78 bases pares (B) CLASE: Nucleótido (C) FORMA DE HEBRA: Una sola hebra (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDC (B) POSTICION: 49., 60 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.11 TCACCCGGCG CGCCCCAGGT CGCTGAGGGA CCCCGGCCAG GCGCGGAG ATG GGG GTG 57 Met Gly Val 5 CCC GGTGAGTACT CGCGGGCT 78 Pro (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO.12 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 4 bases pares (B) CLASE: Nucleótido (C) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) CLASE DE MOLÉCULA: Proteina (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.12 Met Gly Val Pro 1 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO.13 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 78 bases pares (H) CLASE: Nucleótido (I) FORMA DE HEBRA: Una sola hebra (J) TOPOLOGÍA: Lineal ;ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) POSICIÓN: 49..60 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.: 13 TCACCCGGCG CGCCCCAGGT CGCTGAGGGA CCCCGGCCAG GCGCGGAG ATG AGC GTG 57 Met Ser Val 5 CAG GGTGAGTACT CGCGGGCT 78 His (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO.14 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 4 aminoácidos (B) CLASE: aminoácido (C) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) CLASE DE MOLÉCULA: Proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS: SEC ID NO.14 Met Ser Val His 1 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO. 15: (a) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 59 base pares (B) CLASE: Nucleótido (C) TIPO DE HEBRA: Una sola (D) TOPOLOGÍA: Lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.15: GGACATTCTA GAACAGATAT CCAGGCTGAG CGTCAGGCGG GGAGGGAGAA GGGTGGCTG 59 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC No. 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 48 bases pares (B) CLASE: Nucleótido (C) FORMA DE HEBRA: Una sola hebra (D) TOPOLOGÍA: Lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO.16 GTGATGGATA TCTCTAGAAC AGATAGCCAG GCTGAGAGTC AGGCGGGG 48 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO. 17: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 39 bases pares (B) CLASE: Nucleótido (C) FORMA DE HEBRA: Una sola hebra (D) TOPOLOGÍA: Lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 17 ATGGATATCA TCGATTCTAG AACAGATAGC CAGGCTGAC 39 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.

Claims (58)

REIVINDICACIONES

1. Una célula humana, caracterizada porque, contiene una copia de un gen EPO endogénico en enlace operativo con un promotor heterólogo activo en la célula humana, y es capaz de la producción de al menso 200 ng EPO/106 células/24 horas.

2. Una célula humana, caracterizada porque, es capaz de la producción de 200-3000 ng EPO/células 106/24 horas .

3. Una célula humana, obtenida mediante la amplificación del gen a partir de una célula, de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque contiene varias copias de un gen EPO endogénico, cada uno en enlace operativo con un promotor heterólogo activo en la célula humana y es capaz de producir al menos 1000 ng EPO/células 106/24 horas.

4. Una célula humana, de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque es capaz de la producción de 1000 - 25.000 ng EPO/células 106/24 horas.

5. Una célula humana de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque es una célula inmortalizada.

6. Una célula humana, de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque puede ser cultivada en un medio libre de suero.

7. Una célula humana de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque se selecciona a partir de una célula HT 1080, una célula HeLa S3, una célula Namalwa o una célula derivada a partir de allí.

8. Una célula humana de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque el gen EPO endogénico activado, está bajo el control de un promotor viral, especialmente un promotor CMV.

9. Una célula humana de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque el gen EPO tiene una secuencia de señal que codifica al péptido, la cual es diferente de la señal de secuencia que codifica al péptido natural.

10. Una célula humana, de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el gen EPO, el cual está en enlace operativo con la secuencia heteróloga de control de expresión, tiene una señal de secuencia que codifica al péptido, la cual codifica para una señal de secuencia peptídica modificada en la región de los 4 primeros aminoácidos, los cuales se seleccionan a partir de:. Met-X?-X2-X3 en donde Xi es Gly o Ser, X2 es Ala, Val, Leu, lie, Ser o Pro, y X3 es Pro, Arg, Cys, o His, siempre que X?-X2-X3 no sea la secuencia Gly-Val-His.

11. Una célula humana, de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque, los primeros 4 aminoácidos se seleccionan a partir de: (a) Met-Gly-Ala-His, (b) Met-Ser-Ala-His, (c) Met-Gly, Val-Pro o, (d) Met-Ser-Val-His.

12. Una célula humana de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la secuencia de los primeros 4 aminoácidos de la señal peptídica es Met-Ser-Ala-His.

13. Un método para la preparación de una célula que produce EPO humano, de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque comprende : (a) . proporcionar células iniciales humanas, las cuales contienen al menos, una copia de un gen EPO endogénico, (b) transfectar las células con un constructo de ADN, que comprende : • (i) dos secuencias ADN de flanqueo, las cuales son homologas con regiones del locus o sitio del gen EPO humano, para permitir una recombinación homologa, (ii) un gen marcador de selección positivo, y (iii) una secuencia de control de expresión heterólogo, la cual es activa en la célula humana, (c) cultivar las células transfectadas bajo condiciones en las cuales, una selección toma lugar para la presencia del gen marcador de selección positivo, (d) analizar las células seleccionables de conformidad con la etapa (c) ; e (e) identificar las células que producen EPO.

14. Un método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque las secuencias de ADN homologas se seleccionan a partir de las regiones de las secuencias 5' -sin traducir.

15. Un método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque se usa una secuencia modificada en la región del exon 1.

16. Un método de conformidad con las reivindicaciones 14 o 15, caracterizado porque se usa el gen fosfotransferasa de neomicina como un gen marcador de selección.

17. Un método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 14 o 16, caracterizado porque el constructo ADN adicionalmente comprende un gen de amplificación.

18. Un método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque se usa el gen reductasa dihidrofolato como gen de amplificación.

19. Un método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque se usa el gen de un mutante arginina reductasa dihidrofolato como gen de amplificación.

20. Un método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, caracterizado porque además comprende las etapas: (f) una amplificación del gen EPO y (?) obtener las células que producen el EPO, las cuales contienen un números de copias de un gen EPO endogénico cada uno en un enlace operativo con una secuencia heteróloga de control de expresión.

21. Un método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20, caracterizado porque se usa un promotor/incrementador CMV como una secuencia de control de expresión.

22. Un método de conformación con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 21, caracterizada porque el plasmido pl89 (DSM 116611) o un derivado a partir de ahí, se usa en la forma linealizada como un constructo de ADN.

23. Un constructo de ADN para la activación de un gen EPO endogénico en una célula humana, caracterizado porque comprende: (i) dos secuencias ADN de flanqueo, las cuales son homólogos con regiones del sitio o locus del gen EPO humano seleccionado a partir de las secuencias 5' -sin traducir, exon 1 e intron 1, para permitir una recombinación homologa, una secuencia modificada está presente en la región del exon 1, que codifica para los aminoácidos: Me-X?-X2-X3 en donde, Xi es Gly o Ser, X2, es Ala, Val, Leu, lie, Ser o Pro y X3 es Pro, Arg, Cys o His, siempre que X1-X2-X3 no es la secuencia Gly-Val-His (ii) un gen marcador de selección positiva, (iii) una secuencia de control de expresión heteróloga, la cual es activa en una célula humana, y (iv) si se desea, una amplificación de gen.

24. Un constructo de ADN de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque los aminoácidos se seleccionan a partir de (a) Met-Gly-Ala-His (b) Met-Ser-Ala-His (c) Met-Gly-Val-Pro o (d) Met-Ser-Val-His

25. Un constructo de ADN para la activación de un gen EPO endogénico en una célula humana, caracterizado porque comprende : (i) dos secuencias de ADN de flanqueo las cuales son homologas a las regiones del lucus o sitio de gen EPO humano, seleccionado a partir de las secuencias 5' -sin traducir, exon 1 e intron 1, para permitir una recombinación homologa, (ii) un gen marcador de selección positivo, (iii) una secuencia heteróloga de control de expresión la cual está activa en una célula humana, la distancia entre la secuencia heteróloga de control de expresión y el inicio de traducción del gen EPO no es mayor que 1100 bp, y (iv) si se desea, un gen de amplificación.

26. Plasmido pl89 o un plasmido derivado a partir de ahi.

27. Un método para preparar el EPO humano, caracterizado porque una célula humana, de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, se cultiva en un medio adecuado bajo condiciones en las cuales una producción de EPO ocurre y el EPO se cosecha a partir del medio de cultivo.

28. Un método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque se usa un medio libre de suero.

29. Un método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 17 o 28, caracterizado porque las células se cultivan en suspensión.

30. Un método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 29, caracterizado porque el cultivo se realiza en un fermentador.

31. Un método de conformidad con la reivindicación 30. Caracterizado porque el volumen del fermentador es de 101-50.000 I.

32. Un método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 31, caracterizado porque: la cosecha de EPO humano a partir del medio de cultivo comprende, las siguientes etapas: (e) pasar el sobrenadante celular sobre un medio de cromatografía de afinidad y cosechar las fracciones que contienen EPO. (f) opcionalmente pasar las fracciones que contienen EPO sobre un medio de cromatografía de interacción hidrófobo, y cosechar las fracciones que contienen EPO, (g) pasar las fracciones que contienen EPO, sobre hidroxiapatito y cosechar las fracciones que contienen EPO, y (h) concentrar y/o pasar sobre un medio HPLC (RP) de fase inversa.

33. Un método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque se usa un medio de sefarosa azul en la etapa (a) .

34. Un método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 32 o 33, caracterizado porque se usa un medio de sefarosa butilo en la etapa (b) .

35. Un método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 34, caracterizado porque la concentración se realiza mediante la cromatografía de exclusión.

36. Un método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque se usa un medio con un tamaño de exclusión de 10 Kd.

37. Un método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 36, caracterizado porque se obtiene el EPO humano con una pureza de al menos 90%.

38. Un método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 37, caracterizado porque se obtiene una EPO humana con una actividad específica in vitro (ratón mormocitemico) de al menos 100.000 IU/mg.

39. Un método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque se obtiene un EPO humano con una actividad específica in vitro (ratón normocitémico) de al menos 175.000 IU/mg a 450.000 IU/mg.

40. Un método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 39, caracterizado porque se obtiene un EPO humano con un contenido de menos de 0.2% de ácido N-glicolneuraminico con respecto al contenido de ácido N-acetilneuramínico.

41. Un método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 40, caracterizado porque se obtiene una EPO humano con residuos de ácido siálico a-2, 3-enlazados.

42. Un método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 42, caracterizado porque se obtiene un EPO humano con residuo de ácido siálico a-2, 3-y a-2, 6-enlazados.

43. Un método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 42, caracterizado porque se obtiene un EPO humano, el cual comprende un polipéptido con una longitud de 165 aminoácidos.

44. Un método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 42, caracterizado porque se obtiene un EPO humano, el cual comprende un polipéptido con una longitud de 166 aminoácidos.

45. Un método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 42, caracterizado porque se obtiene un EPO humano, el cual comprende una mezcla de polipeptidos con una longitud de 165 y 166 amino ácidos.

46. El EPO humano aislado, con una actividad específica in vivo de al menos 100.000 U/mg proteína, obtenible mediante el método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 45, el cual está libre de impurezas urinarias.

47. El EPO humano aislado, de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque tiene una pureza de al menos 90%.

48. El EPO humano aislado, de conformidad con la reivindicación 46 o 47, caracterizado porque contiene menos de 0.2% de ácido N-glicolneuramínico, con respecto al contenido de ácido N-acetil-neuramínico.

49. El EPO humano aislado, de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 46 a 48, caracterizado porque porta los residuos de ácido siálico a-2, 3-enlazado.

50. El EPO humano aislado de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 46 a 49, caracterizado porque porta residuo de ácido siálico a-2, 3- y a-2, 6-enlazado.

51. El EPO humano aislado de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 46 a 50, caracterizado porque comprende un polipéptido con una longitud de 165 residuos de aminoácidos.

52. El EPO humano aislado, de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 46 a 50, caracterizado porque comprende un polipéptido con una longitud de 166 residuos de aminoácidos.

53. El EPO humano aislado, de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 46 a 50, caracterizado porque comprende una mezcal de polipétidos con una longitud de 165 y 166 aminoácidos.

54. Un preparación farmacéutica, caracterizada porque contiene un EPO humano de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 46 a 53, como una substancia activa, junto si se desea, con otras substancias activas y vehículos, adyuvantes o substancias aditivas farmacéuticamente comunes.

55. El ADN aislado el cual codifica para un EPO humano, con una secuencia modificada en el área de los primeros 4 aminoácidos de la señal peptídica, caracterizado porque se selecciona a partir de: Met-X?-X2-X3 en donde Xi es Gly o Ser, X2 es Ala, Val, Leu, lie, Ser o Pro, y X3 es Pro, Arg, Cys o His, con la condición de que X?-X2-X3 no es la secuencia Gly-Val-His.

56. El ADN aislado, de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque la secuencia de aminoácido se selecciona a partir de: (b) Met-Gly-Ala-His (c) Met-Ser-Ala-His (d) Met-Gly-Val-Pro o (e) Met-Ser-Val-His.

57. Un ADN de conformidad con la reivindicación 55 o 56, caracterizado porque es un ADN genómico.

58. Un ADN de conformidad con la reivindicación 55 o 56, caracterizado porque es un ADNc.