TW574372B - Preparation of erythropoietin by endogenic gene activation - Google Patents

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574372 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（I 本發明係關於人類的細胞，該細胞經活化人類的內 全it卡產足~~ 效益的生產人類E P. ◦作爲藥學的製劑。本發明更關於製 備此人類E P ◦的生產細胞及活化人類細胞中內生性 E P ◦的D N A構築體之方法，及使用人類細胞大量生產 E P ◦的方法。 紅血球生成素（E P〇）是人類的糖類蛋白質，能 刺激紅血球細胞的產生。健康人的血漿中E P〇之濃度非 常低，因此EPO不能從血漿中製備。EP — B — 0 1 4 8 605 及 EPB — 0205 564 描述於 C Η〇細胞中製備重組的人類E P 0。描述於E P - B -0148 605之ΕΡΟ其分子量較尿液的Ερ〇高且 無〇—糖基化作用。同時描述於EP — Β — 0 205 5 6 4來自C Η〇細胞之Ε Ρ 0雖能有效的量產高純度的 形式，但與人類細胞的產物形式不同。此外，C Η ◦細胞 之產量通常不高。 此外，從不能再生性貧血之病人的尿液中收集人類 的 Ε Ρ 〇是已知的方法（Miyake et al·，J. Biol. C hem. 252 (1977) ，5558 — 5564)。揭示的製 程有七個步驟，包括：離子交換色層分析法、乙醇沈澱反 應、凝膠過濾及吸附層析術。製備之Ε P〇其比活性大約 爲70 ，000U/mg之蛋白質，產率爲21%。此製 程及其他方法得到尿液的Ε P 0其缺點是不易取得足量之 起始材料以及其品質不穩定。此外從尿液中純化困難，其 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) --$ · 、τ Γ 574372 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印奴 五、發明説明（3 至純化產物會含尿液的污染物。 -㈣--A - 2-^-8-5 細胞之方法，該細胞能少量的生產Ε . ρ〇。因此不能用此 細胞經濟的生產製藥的材料。 W0 9 1/06667描述製備重組ΕΡΟ之方法 。此製程之第一個步驟是將人類胚胎細胞的內生性Ε Ρ〇 基因經同源的重組與病毒的啓動子連結並將D Ν Α從此細 胞中分離。第二步驟是將分離之D N A轉形至非人類的 C Η ◦細胞並在此類細胞中分析Ε P〇之表現。因此不說 也知，在人類的細胞中可以生產Ε Ρ〇。 W 0 93/09222描述在人類的細胞中生產 Ε Ρ〇，其中於含完整Ε Ρ〇基因之載體轉染的人類之纖 維母細胞中ΕΡΟ產量高達960，620mU/106 細胞/ 2 4小時。此類細胞含外生性Ε P〇基因（不位於 正確的Ε P〇基因基因座），所以在細胞株中之穩定性不 佳。而WO 93/092222中無EP◦持續生產之 資料。此外，生產之Ε P 0亦無任何資料足以說明其品質 以達製藥標準。 此外於W〇9 3 / 0 9 2 2 2中描述活化人類 HT1〇80細胞中之內生性EPO基因。其EPO之產 量僅爲2，5 0 0 m U / 1 0 6細胞/ 2 4小時（大約 1 6 n g / 1 〇 6細胞/ 2 4小時）。如此低的產量也不 適於作爲藥學的製劑。 W〇 94/12650 及W〇 95/31560 描 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X1297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -if. 、-口 i— 574372 A7 B7 五、發明説明（3 述如何利用病毒的啓動子活化人類細胞的內生性E p〇基 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) m U / 1 Ο 6細胞/ 2 4小時（大約爲Ο · 6 // g / 1 Ο 6細胞/ 2 4小時）。此產量仍不適於作爲藥學的製 劑。 因此本發明的目的至少是解決上述部份的缺點’並提 供較佳之技藝方法於人類的細胞中以製備E P〇。尤其是 得到足量及高純度之產物作爲藥學的製劑。 本發明中解決問題的方式是活化人類細胞的內生性 E P〇基因，並選擇性的放大活化的人類E P〇基因。此 方法經選擇適當的起始細胞、D N A構築體及選擇策略， 製備能生產足量及高純度E P ◦作爲藥學的製劑之人類細 胞。尤其是放大活化的內生性E P 0基因後，得到之細胞 較前述CH ◦製備重組E P〇之產量高。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明重點之一是一種人類的細胞，該細胞含一個 內生性E P ◦基因的拷貝，於人類的細胞中該基因與表現 非同源的活性的控制序列連結，不須經基因放大即能生產 至少2 Ο Ο n g之E P〇/ 1 〇 6細胞/ 2 4小時。根據 本發明較佳之人類細胞能生產2 0 〇至3 Ο Ο 〇 n g EP 0/1 〇6細胞/2 4小時，最佳者生產1 〇 〇 〇至 3〇〇〇n g E P〇/ 1 〇 6細胞/ 2 4小時。 本發明另一重點是一種人類的細胞，該細胞爲前述 細胞經基因放大的細胞，含許多內生性E P〇基因拷貝， 於人類的細胞內各與表現非同源的活性的控制序列連結， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 574372 A7 ____ _B7 _ 五、發明説明（4 能生產至少l，〇〇〇ng EPO/106細胞/24 -------- 特佳的人類細胞株得自基因放大，能產生 1，000至25，00011忌已？〇/1〇6細胞/ 24小時，更佳者生產5 ，000至25 ，0〇〇ng E P〇/ 1 〇 6細胞/ 2 4小時。人類的細胞可爲任何能 在離體培養之細胞。特佳之人類細胞可在不含血淸的培養 液中培養，尤其是在懸浮液中培養。此培養方式可用大醱 酵槽（例如，1 ，0 0 0升）大量生產E P〇。特佳之人 類細胞是不朽的細胞，例如Η T 1 0 8 0細胞（Rasheed etal.，Cancer 33 (1974) ，1027— 1033 )、H e L a S 3 細胞（Pucketal.，J.Exp.Mcd· 10 3 ( 1 9 5 6 ) ，273 — 286)、Namalwa 細胞 (NadRarni et al·，Cancer 2 3 ( 1 9 6 9 ) ，6 4 — 7 9 或其衍生的細胞。H 丁 — 1 〇 8 0、H e 1 a S 3細胞 及 N a n 1 a 1 w a 細胞於 1 9 9 4 保存於 A m e r i c a η T y p e C u 11 u l· e C o 11 e c t i ο n，其辨識號碼分別爲 A T C C C C L -121、ATCC CCL — 2.2、及 ATCC C R L - 1 4 3 2。 根據本發明之細胞，其內生性E P〇基因在人類的 細胞中與表現非同源的活性的控制序列聯結。控制序列包 括啓動子且較佳者含附加的表現序列（例如增強子）。啓 動子爲可調控的或持續表現之啓動子。較佳的啓動子是強 效的病毒啓動子（例如：S V 4 0或C Μ V啓動子）。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、\呑 豢 經濟部智慈財產局員工消費合作社印賢 574372 經濟部智慧財產局員工消費合作社印紫 A7 B7 五、發明説明（9 C Μ V啓動子/增強子尤佳。此外’內生性E P〇基因於 啓動子聯結作用，具有與自然信號胜肽不同之信號胜肽編 碼序列及有胺基酸序列修飾之編碼較佳之信號胜肽。特佳 之信號胜肽編碼序列編碼修飾的信號胜肽序列區域前四個 胺基酸係選自

Me t — Χι — X2 — X3 其中 Χι 是 Gly 或 Ser ’X2 是 A1 a、Va 1 、 Leu、I le、Ser 或 Pro’ 而 X3 是 Pro、 Arg、Cys 或 His， 其條件爲Χι — χ2 — X3不能爲G 1 y — V a 1 -H i s序列，最好是 (a ) Μ 6 t — Gly — A1 a— Hi s ’ (b) Me t— Ser— A1 a— Hi s (c) Me t— Gly — Va 1— Pr 0 或 (d) Me t— Ser— Va 1— HiS〇 信號胜肽特佳之前四個胺基酸序列是M e t - S e r -A 1 a — H i s 〇 此外，本發明係關於製備人類生產E P〇細胞之方 法，如前述包括以下步驟： (a )提供人類的起始細胞，該細胞至少含一個內生性 E P〇基因的拷貝， (b )用D N A構築體轉染細胞，該D N A構築體含： (i )兩個側接之D N A序列，與人類E P 0基因基 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -8 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

574372 ‘ Α7 Β7 五、發明説明（6) 因座部位同源，可進行同源的重組， _陽件撰擇標記某因，及___ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (i i i )非同源的表現控制序列’該序列於人類的 細胞中具有活性， (c )在陽性選擇標記基因之選擇條件下.，培養轉染的細 胞， (d )依據步驟（c )分析可選擇的細胞’及 (e )確認產生E P〇之細胞。 用於製備人類產生E P〇的細胞D N A構築體含兩 個側接的D N A序列，該序列與人類的E P ◦基因基因座 區域同源，因此可進行同源重組。選擇適當的側接序列之 方法，例如描述於W〇9 0 / 1 1 3 5 4及W 0 91 / 0 9 9 5 5。較佳之側接序列長度至少各爲1 5 0 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 bp。特佳之同源的DNA序列選自EPO基因之5’ 一 未轉譯的序列區域，表現序列1及不表現序列。尤佳者使 用之D N A序列爲修飾之表現序列1區域’修飾其編碼信 號胜肽之第一個胺基酸。較佳之表現序列1區域之修飾如 上述。 選擇標記基因可爲任何適於真核細胞的選擇標記基 因，其可表現可擇標的表現型，例如，抗生素抗性，營養 缺陷性等。特佳之陽性選擇標記基因是新黴素磷酸轉移酶 基因。 另外，亦可含陰性的選擇標記基因，例如：H S V -腦腺核磷激酶基因，在選擇試劑存在下摧毀表現細胞。 -9- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2;CX 297公釐） 574372 A7 B7 五 發明説明（ 右須要放大人類的細胞中活化的內生性E P〇基因 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ir^rr^ 實施例是二氫葉酸去氫酶、腺嘌呤核苷去氨酶、鳥胺酸脫 竣酶等。特佳之放大基因是二氫葉酸去氫酶基因，尤其是 二氫葉酸去氫酶精胺酸突變，較之野生型基因能降低對選 擇試劑（胺基甲基葉酸）之敏感性 (Simonsen et a 1 ·，Proc Natl. Acad. Sci. USA 8 0 ( 1 9 8 3 ) :2495) 0 若DNA構築體中含放大基因以活化EP〇基因， 則本發明之方法亦可包含以下步驟： (f )放大E P〇之編碼D N A序列，及 (g )得到含許多拷貝（多於起始細胞）與非同源的表現 控制序列連結之成熟的E P〇內生性D N A序列編碼之產 生E P〇的細胞。 於人類的起始細胞中，活化內生性E P〇基因的適 當DNA構築體是質體，例如：pl87、Pi 89、 P 1 9 0及p 1 9 2或其衍生之質體。較佳之DNA構築 體爲圓形的質體分子，用直線的型式轉染人類的細胞。 此外，本發明之另一主題爲在人類的細胞中活化內 生性E P〇基因之D N A構築體，包括： (i )兩個側接D N A序列，選自人類的E P〇基因基因 座5 ’ -未轉譯序列、表現序列I及不表現序列1的同源 部位，以進行同源的重組，表現序列1部位編碼胺基酸的 修飾序列爲： Me t-Xi~X2-X3 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事 項 再 奢 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -10- 574372 A7 B7 五、發明説明（❼ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 其中Χι是G1 y或Se r ，又2是八1 a、Va 1 ^^^Tr^e~u~^~ί~]—e~> ~§ -β—γ-^Ρ-^-θί—〇_^. Arg、Cys或Hi s，其條件爲Xi — Χ2 — Χ3不能 爲序列G 1 y — V a 1 - Η i s，尤佳的胺基酸是： (a) Me t — Gly— A1 a— Hi s ， (b) Met — Ser— Ala— Hi s ， (c) Me t—Gly — Va 1— Pr o 或 (d) Met — Ser—Va 1— Hi s 5 (i i ) 一個陽性選擇標記基因， (i i i ) 一個於人類的細胞活化的非同源的表現控制序 列，及 (i v )視須要一個放大基因。 本發明之另一主題是於人類的細胞中活化之內生性 EP〇基因之DNA構築體，包括： (i )兩個側接D N A序列，選自人類的E P〇基因基因 ® 5 ’ -未轉譯序列、表現序列I及不表現序列1的同源 部位，以進行同源的重組， 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (i i ) 一個陽性選擇標記基因， C i i i ) 一個於人類的細胞活化的非同源的表現控制序 列’非同源的表現控制序列與E P〇基因轉譯起點間之距 離不大於llOObp，及 (i v )視須要一個放大基因。 另人驚異的發現，將E P〇信號序列修飾及/或縮 短非同源的表現控制序列及E P〇基因轉譯起點間之距離 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -11 _ 574372 A7 B7 五、發明説明（合 ，能得到最適之表現。非同源的表現控制序列啓動子與 更佳者不大於150bp，而最佳者不太於；L〇〇bp。 根據本發明特佳D N A構築體之實施例是質體p 1 8 9或 其衍生之質體。 本發明之另一主題是製備人類E P〇的方法，其中根 據本發明人類的細胞在適當的培養液中，生產E P〇的條 件下培養而從培養液中收集E P 〇。不含血淸之培養液較 佳。較佳之細胞培養於懸浮液中。轉佳之培養在醱酵槽中 進行，尤其是大的醱酵槽容量爲，例如：1 〇公升-5 0，0 0 0 公升。 從人類的細胞株培養液中收條之人類的E P ◦包括 以下較佳之步驟： (a )將細胞上淸液通入親合性色層分析介質並收集含 E P〇之部份， (b )視須要將含E P〇之部份通入疏水性交互作用色層 分析介質並收集含E P 0之部份， (c )將含E P〇-之部份通入羥基磷灰石並收集含 E P〇之部份，及 (d)濃縮及/或通入逆相（RP) HPLC介質。 步驟（a )之純化過程包括將細胞上淸液（某些情 況下經前處理）通入親合性色層分析介質。較佳之親合性 色層分析介質爲偶合藍色染料之介質。特佳之實施例是藍 色的瓊脂糖。從親合性色層分析介質中溶析後，將含 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） _ 12 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 574372 A7 ____B7_ 五、發明説明（Do E P ◦之溶析液視須要通入疏水性交互作用色層分析介質 。若培養液血淸含量低，例如，1 % ( ν / ν )，或不含 血淸則此步驟可省略。較佳之疏水性交互作用色層分析介 質是丁基瓊脂糖。 步驟（a )之溶析液經步驟（b )後通入本發名步 驟（c )磷灰石之方法，而含E P〇之溶析液可進行濃縮 步驟及/或逆相Η P L C純化之步驟。進行凝膠色層分析 (例如，膜過濾）較佳之濃度爲培養液之濃度，而適當之 膜排除大小爲1 0 k D。 根據本發明之方法在活體（正常溶血的老鼠）中分離 之人類的E P〇其比活性其至少爲1 〇 〇 ，〇 〇 〇 ϋ / m g蛋白質，不含尿液的污染與c Η〇細胞之重組的 Ε Ρ〇糖化形式不同。本發明較佳Ε Ρ〇比活性至少爲 175 ，0〇〇，特佳者至少爲200 ，000至 400 ，00〇或450 ，00〇IU/mg蛋白質。本 發明方法得到之人類的EP0含α - 2，3 -及/或α -2 ’ 6 -連接的唾液酸殘基。硏究形成Ε Ρ 0之細胞，該 細胞含活化的內生性Ε Ρ〇基因，基於前置硏究顯示的結 果，發現具α - 2，3 —及α — 2，6連接的唾液酸殘基 。此外，基於前置硏究顯示的結果，發現本發名的人類 Ε Ρ ◦含量少於〇 · 2 % Ν —乙二醇神經胺酸（以Ν -乙 醯基神經胺酸爲準）。 本發明的人類Ε Ρ 0純度含量，較佳者至少爲9 0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣 -訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨ΟΧ297公釐） Γΐ3 - 574372 A7 B7 五、發明説明（如 % ’更佳者至少爲9 5 %，而最佳者至少爲9 8 %之總蛋 P〇rosR/2H)管柱進行。 此外，本發明方法得到的人類E P〇其胺基酸序列 有所不同。質譜儀分析（MALD I - MS)顯示 H e L a S 3細胞分離之人類E P ◦形式，經C端處理 精胺酸殘基後主要之多胜肽長度爲1 6 5胺基酸，某些情 況下包括多至15% 16 6個胺基酸之£?〇。同時得 到之人類E P ◦包括長度爲1 6 6胺基酸之多胜肽，即未 處理之E P〇。來自N a m a 1 w a細胞，例如··分離之 人類E P〇含長度爲1 6 5及1 6 6胺基酸之多胜肽混合 物。 此人類的E P〇能作爲藥學製劑的活性物質，其中 可含附加的活性物質及醫藥學的共同佐劑、賦形劑及添加 劑。 本發明之另一主題係關於分離之DNA，該DNA 編碼人類的E P 0，其信號胜肽部位的前四個胺基酸序列 經過修飾的，係選自：

Me t-Xi-X2-X3 其中 Xi 是 Gly 或 Ser ，X2 是 A1 a、Va 1 、

Leu、I le、Ser 或 Pro，而 X3 是 Pro、

Ar g、Cy s或Hi s ，其條件爲Xi - X2 — X3不爲 序列Gly — Va 1— Hi s，而較佳之胺基酸爲： (a)Met— Gly— Ala— His ， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -14- 574372 A7 _____B7___—__ 五、發明説明（1)2 (b)Met-Ser-Al a-Hi s (c ) M~~e ~~ t=~G—i ~y — V a—i—~r ~~o-o —r (d)Met-Ser-Val-HiS. D N A可爲例如：基因組D N A或c D N A。 本發明將會用以下之實施例及圖形及表列之序列繼續加以 說明。 圖1 :從5 7 -不轉譯序列、表現序列1及不表現序列1 中放大E P〇基因同源區域的圖示。 圖2 :含5 ^ -不轉譯序列、表現序列1及不表現序列1 之E P〇基因同源區域的質體。 圖3 ··基因活化作用序列，含路氏肉瘤病毒啓動子（ R S V )、新黴素磷酸轉移酶基因（ΝΕΟ) ' S V 4 0 早期聚腺苷酸化作用部位（s V I p A )、及早期 SV40啓動子（SVI)、二氫葉酸去氫酶基因（ D H F R )、及附加的早期S V 4 0聚腺苷酸化作用部位 ，及細胞巨大型病毒立即早期啓動子及增強子（M C Μ V )° 圖4a :製備EP〇基因標定之載體P176。 圖4b:製備EP◦基因標定之載體P179及P187 〇 圖4c :製備EPO基因標定之載體P189 ° 圖4d :製備EPO基因標定之載體Pl9〇。 圖4e :製備EPO基因標定之載體Pl92° 圖5:製備含突變信號序列之£?0 cDNA。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公t ) - 15 - 574372 A7 B7 五、發明説明（妇 圖6 a :細胞的D N A與來自C Μ V區域之基因卡匣（如 D N A，用限制酶A g e I及A s c I切割；行1 :用 1 ，OOOnM MTX放大後產生EP〇之HeLa S3細胞；行2:500nM MTX放大後產生EP〇 之H e L a S 3細胞；行3 ;不經放大產生E P〇之 HeLa S 3細胞；行4 :不經活化E P〇基因之 HeLa S 3細胞，行5 :毛地黃毒苷配基標記之長度 標記；行1至3之雜交片段大小大約爲5，2 0 0 b p， 圖6 b :來自E P〇編碼區域之探針與來自人類細胞的 D N A雜交；1 :毛地黃毒苷配基標記之長度標記；行2 至4 :來自人類細胞的D N A用限制酶B a m Η I ， H i n d I I I 及 S a 1 I 切割；行 2 : 5 0 Ό η Μ Μ Τ X放大後產生Ε Ρ〇之Η e L a S 3細胞（非活化 的內生性基因產生之環帶長度：3，2 0 0 b p ;標定基 因活化的EP ◦基因長度爲：2，600bp):行3: 不經放大來自產生EPO之HeLa S3細胞DNA; 行4 :來自控制組細胞H e L a S 3之D N A。 序列確認號碼N 0 _ 1及N〇· 2 :用於製備P C R產物 1 (圖1 )之引子的核酸序列。 序列確認號碼N〇· 3及N〇· 4 :用於製備P C R產物 2 (圖1 )之引子的核酸序列序列。 序列確認號碼N〇· 5 ·· Ε Ρ〇 Ε X 1引子之序列。 序列確認號碼N〇· 6 ·· Ε X 2引子之序列。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣.

、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -16 - 574372 A7 B7 五、發明説明（私

序列確認號碼N Α~Ί~~a 序列確認 號胜狀序 7 ： E X 3 ( M e t - G 1 y "His； ^rr^rw~n° 號碼N〇· 8 :引子E X 3起始編碼之修飾的信

列。 序列確認號碼N EX4(Met-Ser A 1 a — H i s )引子之序列。 號碼Ν ο · 1 〇 :引子E X 4起始編碼之修飾的 序列確認 信號胜肽序列序列。 序列確認號碼Ν 〇 ·

ll：EX5(Met-G 7 --------钃裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} V a 1 -序列確認 信號胜肽 P r 〇 )引子之序列。 號碼Ν〇· 1 2 :引子E X 5起始編碼之修飾的 序列序列。 序列確認號碼N〇. ：E X 6 ( Μ t — S e r 訂 V a 1 — H i s )引子之序列。 序列確認號碼Ν〇· 1 4 :引子E X 6起始編碼之修飾的 信號胜肽序列序列。 序列確認號碼Ν Ο · 1 5 : E X基因組1之引子序列。 序列確認號碼Ν〇· 1 6 : E X 1 3之引子序列。 序列確認號碼Ν〇· 1 7 : E P〇 E X 1 7之引子序列 實施例 活化E P ◦基因基因座大量產生蛋白質可用同源的 整合基因活化作用序列達成，該序列含新黴素磷酸轉移_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210'〆297公釐） -17 -

F 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 574372 A7 B7 五、發明説明（拓 (N E〇）基因進行選擇（G 一 4 1 8抗性）、鼠類的一 - 細胞巨大型病毒（C Μ V )立即早期啓動子及增強子活化 基因。 實施例1選殖E P ◦之同源部位 E P〇基因之同源部位可利用胎盤基因組D N A ( Boehringei. Mannheim )放大。兩個P C R之產物可用 6·3kB長來自EP〇基因之5’ 一不轉譯序列、表現 序列1及不表現序列1同源部位區域（如圖1 )製備。製 備P C R產物1使用的引子序列如下： 5’ -CGCGGCGGATCCCAGGGAGCTGGGTTGACCGG-3’ （序 列確認號碼N 0 · 1 )及 -GGCCGCGAATTCTCCGCGCCTGGCCGGGGTCCCTCAGC-31序列確認號碼N〇.2 )。製備 P C R產物2使用的引子序列如下： 5'-CGCGGCGGATCCTCTCCT CCC CCCAAGCTGCAATC-3* ( 序列確認號碼N 0 . 3 )及 5，GGCCGCGAATTCTAGAACAGATAGCCAGGCTGAGAG-3’（ 序列確認號碼N 0 · 4 )。 從P C R產物1及2中用限制酶水解成適當之片段 (PCR產物l:Hind III，PCR產物2: 11111〇1111及已〇:〇 RV)並選殖至用Hind III及Eco RV 水解之載體 PCRII( Invitrogen (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

LJ — 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -18- 574372 A7 B7 五、發明説明（1)6 )。此方法得到之重組的載體稱爲 5 e ρ 〇 p c r"""3τ_θΓ_θΓ_θ ~~ --- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 實施例2構建E P 0基因標定之載體 2 · 1將含ΝΕΟ基因、DHFR基因及CMV啓動子/ 增強子之基因活化序列（參見圖3 )插入含Ε Ρ〇同源部 位質體5 c ρ 〇 c r 1〇〇〇之Ag e I位點，得到質體 ρ 1 7 6 (參見圖4 a )。爲了使CMV啓動子盡量接近 Ε P ◦基因的轉翻譯起始基因座，將限制酶切點a s c I 及A g e I之間9 6 3 b ρ之片段切除（部分水解），得 到質體P179 (圖4b)。 2 · 2爲了使表現最適化，將表現序列1之核酸（編碼 EP ◦前導序列 Me t— G1 y— Va 1— Hi s)用合 成的序列Me t—Se i·— A1 a— Hi s替代（參見實 施例 6 )。此序列以基因組Ε Ρ〇一 D N A序列（例如 :質體PEP0148，含3，5kB BstEII/ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 E c o R I片段（包括表現序列1 一 5 )之人類的Ε Ρ〇 基因序列，該序列在S V 4 0啓動子控制下（Jacobs et al·，Nature 313 (1985) ，806 及 Lee-Huang et al·，Gene 128 (1993) ，227))作模板，用 引子Ε x 4 (序列確認號碼N Ο · 9 )及Ε x 1 7 (序列 確認號碼Ν〇.1 7 )放大得之（表1 )。得到質體 Ρ 1 8 7 (圖 4 b )。 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 574372 A7 B7 五、發明説明（打 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 酶基因（HSV — TK，來自PSV tk — 1之 Pvul I/Nar I片段）製備質體ρ189 (圖4c )°HSV—TK基因用位於不表現序列1(Eco RV/C 1 a I ) 3’端之SV40啓動子控制，其方向 與C Μ V啓動子相反並作爲同源重組的陰性選擇。 2 . 4構建質體Ρ190，將Sf i I/Bgl I I片段 之pH EAVY (含精胺酸突變之DHFR的cDNA 質體，描述於 Simon sen et al. (P roc· Natl· Acad. Sci，USA 80 (1983) ，2495 )次選殖入8!11及 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Bgl I I水解之質體pGenak — 1，該 p G e n a k — 1質體含RSV啓動子控制之NE ◦基因 及早期S V 4 0聚腺苷酸化作用點作爲終止子、早期 S V 4 0啓動子控制之鼠類的D H F R基因及早期 S V 4 0聚腺苜酸化作用點作爲終止子（K a u b m a η n e t a 1.， Mol. Cell. Biol. 2 ( 1 9 8 2 ) ，1 3 0 4 ; Okayama et al., Mol. Cell. Biol. 3(1983)，280，及 Schimke, J. Biol. Chem. 2 6 3 ( 1 9 8 8 )， 5989)以及 CMV 啓動子（Boshart etal.，Cell 4 1 (1 9 9 5 ) 5 2 1 )。然後聯結H p a I片段（含精胺 酸突變之D H F R的c D N A編碼）至用H p a I水解之 質體Pl89，得到質體Pl90 (圖4d)。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX297公釐） _ 2〇 _ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 574372 A7 B7 五、發明説明（細

2 _ 5得到不含HSV — TK基因之轉染載體，將質體 s—c I 聯結至含表現序列1之質體p 1 8 7的A s c I / Nhel片段。產生的質體稱爲p192(圖4e)。 實施例3 轉染細胞 選擇各種生產E P 0之細胞株並轉染標定之載體。 3.1 Namalwa 細胞 將細胞培養於T 1 5 0組織培養瓶並用電穿透作用 轉染（1 X 1 〇 7細胞/ 8 0 0 # 1之電穿透作用緩衝液 2 0 m M Hepes、138mM N a C 1 - 5 m M KCl、〇.7mM Na2HP〇4、6mM D —葡 萄糖單水合物P H 7 · 0，1 0 // g直線的D N A， 9 6 0 1 IF，2 6 0V BioRad Gene Pulser )。電 穿透作用後將細胞培養在R P Μ I 1 6 4 0、1 〇 % (v/v)之小牛血淸（FCS) 、2mM之L一麩胺醯 胺酸、1 m M之丙酮酸鈉的4 6個9 6孔培養盤。兩天後 將細胞培養在含1 m g /m 1之G - 4 1 8的培養液中 1 0至20天。上淸液用固相之EL I SA測定EP〇之 生產（參見實施例4 )。產生E P〇之選殖細胞在2 4孔 之培養盤及T - 2 5組織培養瓶中放大。取出一部份細胞 冷凍，其餘的細胞用F A C S (Ventage，Becton Dickinson)進行次選殖。次選殖後重覆測試E P〇之產 生。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -21 - 574372 A7 B7 五、發明説明（柏 Η Τ 1 〇 8 0細胞 —KA,~~-U_or%_ r\ r\ Am rtA— t ^ t ‘ < -r-i tv _O_Ol>/_ \W m II 1 1 ' 丄 U to (v/v) FCS、2mM之L 一麩胺醯胺酸、ImM之 丙酮酸鈉之外，與描述於Namalwa細胞的條件相同。用 電穿透作用轉染溶於胰蛋白酶作用來自培養容器壁之細胞 。電穿透作用後將1 X 1 0 7細胞培養在含D Μ E Μ、 10%(v/v)FCS、2mM L —麩胺醯胺酸、1 m Μ丙酮酸鈉之五個9 6孔之培養盤。 3 . 3 H e L a S 3 細胞 除除將H e L a細胞掊養在R P Μ 1 6 4 0、1 0 %(V/V)FCS、2mM L-麩胺醯胺酸、1%( v / v ) Μ E M非必須胺基酸（Sigma)，及1 mM丙酮酸 鈉之外，與描述於Namalwa細胞的條件相同。用電穿透 作用轉染溶於胰蛋白酶作用來自培養容器壁之細胞。電穿 透作用（電穿透作用之條件爲9 6 Op F/2 5 0V)後 將細胞培養在含RPMI 1640、10% (v/v) FCS、2mM L —麩胺醯胺酸、1% (v/v) Μ Ε Μ、1 m Μ丙酮酸鈉之T 7 5組織培養瓶。電穿透作 用2 4小時後將細胞用胰蛋白酶處理並培養於含6 0 〇 β g /m I G — 4 1 8之培養液的十個9 6孔掊養盤中 1 0至1 5天。 實施例4 選擇產生Ε P〇之選殖細胞 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Γ — 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -22 - 574372 A7 —B7 五、發明説明（如 將轉染細胞的培養上淸液用E L I S A進行E P〇 測1 式。^湄fF 進行 ^ 將預—鏈 菌素的9 6孔培養盤包覆生物素化的抗Ε Ρ 0抗體（ Boehringer Mannheim )。包覆時，先培養盤用5〇mM之 磷酸鈉 PH7 · 2，及 0 · 05%(v/v)之 Tween 2 0淸洗。然後每孔中加入0 · 0 1 m 1之包覆緩衝液（

4 //g /ml生物素化的抗體，l〇mM磷酸鈉pH 7 . 2 ’ 3g/l牛血淸白蛋白、20g/l蔗糖、及9 g/1 N a C 1 )，在室溫下反應3h。然後培養盤用 5 0 m Μ磷酸鈉ρ Η 7 · 2淸洗，乾燥及結合。 測試前用0 . 3 m 1磷酸鹽緩衝溶液（p B S )及 0-05% Twee η 20 (Sigma)淸洗培養盤三次；培養 盤之每孔與〇.2ml PBS及l%(w/v) C r o t e i η ( B o e h ι· i n g e r M a η n h e i m )反應過夜以阻塞非專一 的結合。 去除阻塞溶液後，培養盤加入0 . 1 m 1之培養上 淸液後反應過夜。各孔用0.3ml之PBS及〇·05 % Tween 20淸洗三次。然後加入1 〇 〇 // 1過氧化氫酶 (P 0 D )連接之單株抗體（Boehringer Mannheim， 1 5 0 m U /m 1 )反應兩小時。培養孔用〇 · 3 m 1之 PBS及〇 · 05% Tween 20淸洗三次。然後利用 A B T S ©作爲受質進行過氧化氫酶反應，用Perkin Elmer光密度計於4 0 5 n m測定。利用來自C Η〇細胞 (Boeh ringer Mannheim， 1 0 0 — 1 〇 0 0 p g/ 孔）之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -23 _ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部智慧財產局D貝工消費合作社印製 574372 A7 B7 五、發明説明（> 重組的E P〇製作標準的校正曲線並估算E P〇之濃度。 實施例5 E P 0基因放大 爲了增加產生E P〇之選殖細胞E P〇之表現，將 細胞在胺基甲基葉酸（Μ T X )、濃度（1 〇 〇 p Μ -1 Ο Ο Ο η Μ )下培養。各Μ Τ X濃度處理之選殖細胞用 E L I S Α (參見實施例4 )測試Ε Ρ〇之產生。產量高 者經有限稀釋後進行次選殖。 實施例6 信號序列之突變 爲了最適化Ε P 0分子的前導序列，將表現序列I 第一個胺基酸替代。使用不同序列的引子（序列確認號碼 NO . 4 — 17 ; 3’引子含Ce 1 I I基因座用以選擇 修飾的序列）、質體ρ Ε P 0 2 2 7作模板，該質體含人 類EPO基因的4仟鹼基對之Hi nd I I 1/ EcoRI片段（包括表現序列1一5)，該基因受 SV 4 0 啓動子之控制（Jacobsetal.，Nature 3 1 3 ( 1 9 8 5 ) ，8 0 6 ; Lee-Huang et al.5 Gene 12 8( 1993) ，227)，經PCR得到AscI/

XbaI之片段。將此片段選殖至質體pEp〇i48( 實施例2 · 2)，並得到質體pEP〇182，183， 184及185(圖5)。用SV40啓動子趨動EP〇 基因之表現。將C 0 S - 7細胞用此構築體進行短暫的轉 染（D E A E聚葡萄糖方法）並於細胞轉染後4 8小時測 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -24 - 574372 A7 B7 五、發明説明（妇 定E P〇之產生。 ~-—S e r -A 1 a - H i s有最佳之EP〇表現可用於構建基因標定 載體（參見實施例2 · 2 )。 竇施例7 特徵化產生E P〇的細胞株 選用三種不同的細胞株（Namalwa，HeLa S 3及Η T 1 Ο 80)進行ΕΡ ◦基因活化作用。轉染質體Ρ 1 79 ’ ρ187 ’ ρ189 ’ Ρ — 190 或 ρ192 後生 Ε Ρ ◦之選殖細胞（參見實施2及）。 大約用1 6 0 ，0 0 0個抗Ν Ε ◦之選殖細胞測試 Ε Ρ〇之產生，其中1 2至1 5種細胞分泌至細胞上淸液 的Ε Ρ〇產率具顯著的重現性。 其中7種Ε Ρ〇選殖細胞不必經Μ Τ X放大基因即 能產生足以工業量產之Ε Ρ ◦。此類選殖細胞Ε Ρ〇之產 量介於 200ng/ml 至 l〇〇〇ng/ml/l〇6 細胞/ 2 4小時。 用5 0 0 nM之MTX放大基因後，EPO選殖細 胞生產之EP ◦增至多於3 0 0 0 ng/m 1/1 〇6細 胞/ 2 4小時以上。將Μ Τ X濃度增至1 〇 〇 〇 n Μ後生 產增至7 0 0 0 n g /m 1 / 1 〇 6細胞/ 2 4小時以上 〇 選殖細胞亦可在不含血淸的培養條件下產生Ε P〇 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、\呑

i I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -25 - 574372 Α7 Β7 五、發明説明（23) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2;C x297公釐） -26- 574372 A7 B7_______ 五、發明説明（扣

HeLa S3; Namalwa 及 Η T 1 〇 8 0 ) 可用兩種方法，其使用之色層分析法步驟之原理及數目不 同’視培養液之成分及E P〇之濃度而定： 方法1 : 第一步驟：藍瓊脂糖管柱 第二步驟：丁基-瓊脂糖管柱 弟二步驟：憐灰石管柱 第四步驟：再濃縮 方法2 : 第一步驟：藍瓊脂糖管柱 第二步驟：磷灰石管柱 第三步驟：再濃縮 (替代的第三步驟：RP一HPLC) 從培養的H e L a S 3細胞的上淸液（含2 % ( v / v )胎牛血淸（f C S ))進行純化之實施例的方法 1爲： 1 ·藍瓊脂糖管柱：

將 5 ml Hi— Trap — Blue 管柱（ Pharmacia’s藍瓊脂糖即用型管柱）用至少爲5倍管柱體 積（S V ’ s )之緩衝液 A ( 2 0 m M Tris-HCl，pH7.0;5mM C a C 1 2 ; 1 〇 〇 m M 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) -27 - " (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 『裝.

、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 574372 A7 B7 五、發明説明（於 N a C 1 )平衡。然後以〇 · 5 m 1 /分鐘之流速循環方 Ε Ρ〇及7〇一1 0 〇 m g總蛋白質）。 管柱用至少爲5 S V ’ s之緩衝液B ( 2 0 m Μ Tris-HCl JpH7.〇；5mM CaCl2，

2 5 0 m Μ N a C 1 )及至少爲5 s V，s之緩衝液c ( 2 〇 m M Tris-HCl ^pH7.〇；〇.2mM C a C 1 2 ； 2 5 0 m M NaCl)以 〇.5ml /分 鐘之流速淸洗。淸洗後於〇D 2 8 0下測定蛋白質含量。 使用緩衝液 D ( 1 〇 〇 r η Μ T r i s — H C 1 ， pH7.〇；〇.2mM C a C 1 2 ； 2 M NaCl) ，以0 . 5 m 1 /分鐘之流速溶析e P〇。每1 — 2 m 1 分層收集溶析溶液。 分層、淸洗溶液及未結合之部份之Ε P〇含量用逆 相（RP) — HPLC測定，將一部分通入p〇R〇S R 2 / Η 管柱（Boehringer Mannheim)。此外，亦使用免 疫墨點法定性識別含Ε P ◦之分層。 集中含EPO之分層（8 — 1 2m 1 )並通入丁基瓊 脂糖管柱。 藍瓊脂糖管柱之產率大約爲1 7 5 // g Ε P〇（相 對於大約70%)。藍瓊脂糖之一般產率爲50至75% 2 · 丁基瓊脂糖管柱（疏水性交互作用色層分析） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· -訂· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -28 - 574372 B7 - 五、發明説明（靼 自製的2 — 3 m 1 丁基瓊脂糖管柱（材料：T〇y〇pearl m Μ Τ r i s HCl，pH7.〇;〇.2mM CaCl2 及 2M Na Cl)平衡後以 〇.5rni /分 鐘之流速通入來自步驟1藍瓊脂糖之E P〇。（大約 150//gEP〇）。 管柱用至少爲5SV’s之緩衝液E (2〇mM Tris-HCl，pH7.〇;2M NaCl 及 1〇 %異丙醇），〇 . 5 m 1 /分鐘之流速淸洗。淸洗後在 〇D 2 8 0下測定蛋白質含量。

用緩衝液 F (2〇mMTr i s— HC1 ，pH 7 . 0 ； 2 M NaCl及20%異丙醇）在流速爲 0.5ml/分鐘下溶析EPO。每1一2ml分層收集 溶析溶液。 分層、淸洗溶液及未結合之部份之E P ◦含量用逆 相（RP) — HPLC測定，將一部分通入P〇R〇S R 2 / Η管柱。此外，亦使用免疫墨點法定性識別含 Ε Ρ〇之分層。 集中含ΕΡΟ之分層（1 0 — 1 5m 1 )並通入磷灰 石管柱。 丁基瓊脂糖管柱之產率大約爲130//g Ε P 0 ( 相對於大約8 5 % ) 。丁基瓊脂糖之一般產率爲6 0至 8 5%。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） · 29 574372 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（汆 3 .磷灰石管柱 CHT II即用型管柱，BioRAD)用至少爲5 s V ’ 之緩衝液 F ( 2 0 m Μ T r i s - H C 1， p H 7 . 0 ； 2 M NaCl;20%異丙醇）平衡。然 後以0 · 5 m 1 /分鐘之流速通入來自步驟2 丁基瓊脂糖 之EP〇（約含125//g之EP〇）。 管柱用至少爲5 S V ’ s之緩衝液G ( 2 0 m Μ Tris-HCl，pH7.0;2M NaCl)以 0 _ 5 m 1 /分鐘之流速淸洗。淸洗後於〇d 2 8 0下測 定蛋白質含量。 使用緩衝液Η ( 1 〇 m Μ磷酸鈉，p Η 7 · 0 ; 8 0 m Μ Ν a C 1 )，以〇 . 5 m 1 /分鐘之流速溶析 E P ◦。每1 一 2 m 1分層收集溶析溶液。 分層、淸洗溶液及未結合之部份之E P ◦含量用逆 相（R P ) — Η P L C測定，將一部分通入P〇R〇S R 2 / Η管柱。 集中含ΕΡ〇之分層（3 - 6ml)。磷灰石管柱 之產率大約爲8 〇 ；/ g E P〇（相對於大約6 0 % )。 一般而言磷灰石管柱的產率爲通入丁基瓊脂糖產物之5 〇 至 6 5 % 〇 4 ·再濃縮 將來自磷灰石步驟集中的E P〇分層，用排除大小爲1 〇 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐Ί -30:~ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣·

、1T 梦 574372 A7 ____ B7 五、發明説明（昶 k D的肖隹心裝置（例如：ρ丨11 r 〇 n出品之μ i c ι· o s e ρ )濃縮 至 〇·1 — 0_5mg/ml，加入 0.01% 之 Tween 20並在—2 Q°C下分裝儲存。 產率表 Ε Ρ 0 ( μ g ) 產率（％ ) 起始 2 4 5 1〇0 藍瓊脂糖 17 5 7 0 丁基瓊脂糖管柱 13 0 5 3 磷灰石管柱 8 0 3 3 再濃縮 6 0 2 5 分離之EPO其純度大約>90%，一般基至>9 5%。 爲了增加EPO產率，使用方法2，其中去除丁基 ί复脂糖步驟。此方法尤適於不含血淸或1 % ( v / v ) F C S之細胞培養上淸液，分離之ε ρ〇產品純度大約相 等（9 0 - 9 5 % )。磷灰石管柱之平衡緩衝液（緩衝液 F)中含5mM CaCl2可改進本方法之結合及於磷 灰石步驟溶析Ε P〇之一致性。因此在實用上方法2基本 上與方法1相同，使用以下緩衝液： 1 ·藍瓊脂糖管柱： 平衡緩衝液（緩衝液A):20mM Tris-HCl，pH7.0 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -31 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 574372 A7 ------------B7_ 五、發明説明（加 5mM CaCh;100mM NaCl 洗滌緩衝液1(緩衝液B):20mM Tris-HCl，pH7.0 5mM CaCh;250mM NaCl 洗滌緩衝液2(緩衝液C):2〇mM Tris-HCl，pH7.0 5mM CaCl2,2 50mM NaCl 溶析緩衝液（緩衝液D):100mM Tris-HCl，pH7.0 5mM CaCl2；2M NaCl 2 ·磷灰石管柱： 平衡緩衝液（緩衝液F):50mM Tris-HCl，pH7.0 5mM CaCh，lM NaCl 洗滌緩衝液（緩衝液G):10mM Tris-HCl，pH7.0 5mM CaCl2;80mM NaCl 溶析緩衝液（緩衝液H):10mM磷酸鈉，pH7.0 Ο . 5mM CaCh;80mM NaCl 產率表： (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) C· 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 E P 0 ( β g ) 產率（％ ) 起始 6 0 0 10 0 藍瓊脂糖 4 5 0 7 5 磷灰石管柱 3 3 5 5 5 再濃縮 3 10 5 2 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 ox297公釐） -32- 574372 A7 B7 五、發明説明（扣 於方法1之緩衝液B至G中加入5 m M C a C 1 2使樣 品對磷灰石管柱具更佳之結合及溶析。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 實施例1 0 在活體中測定來自人類細胞株的E P〇之專 ~的活性（正常溶血的老鼠中進行生物測定） E P〇處理後，活體中劑量相關的E P〇活性增加 ，血液中網狀細胞增加，老鼠血血球前身細胞開始分化及 增力口。 將八隻老鼠用非經腸的方法給予不同劑量之標準品 及E P〇樣品並進行分析（與W Η〇之標準E P〇平衡） 。將老鼠保持在衡定之狀況下。Ε Ρ 0處理4天後從老鼠 採血，網狀細胞用啶橙染色。用微螢光分析（microfluor-imetry )以流動細胞計（flow cytometer)分析紅色螢光， 測定每3 0，0 0 0個紅血球中網狀細胞之數目。 用來自樣品之網狀細胞計數計算生物活性並於不同 劑量之標準品下，用Linder描述之含量測定進行駢對平 行測定（A. Linder, Plan en und Auswerten von Ver sue hen， 3rd ea., 1969，Birkenhauser Verl ag Basel)0 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 生產Ε P〇之細胞株 比活性U /m g H e L a S3 (樣品 1) 1 0 0，0 0 0 H e L a S 3 (樣品 2 ) 1 1 0，0 0 0 尺度適用國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公董) -33- 574372 附忏ίΑ 弟 87116028 號専利甲請g ㈣說羽雜CTn 民國89年1月修正 倐正 .At含

五、發明説明（31 ) 89.L郎補充 (1 1 1 )序列數目：1 7 (1 v )電腦可讀的版本： (A )資料介質‘:軟碟

(B )電腦：I B Μ相容的P C

(C)作業系統：PC—D〇S/MS—DOS (D )軟體：Patent in Release # 1 · 0 ，版本 # 1 · 3 ◦ ( E P A ) (2 )序列確認號碼N〇· ： 1之資料 (i )序列之特徵： (A)長度：32個鹼基對 .(B )種類：核酸 (C )股型：單股 、 （D )拓撲學構形：線性的 (X 1 ) DESCRIPTION〇F序歹:序列確認號碼N〇.1 ·· CGCGGCGGAT CCCAGGGAGC TGGGTTGACC GG 32 (2 )序列確認號碼N〇· ： 2之資料 (1 )序列之特徵： (A)長度：38個鹼基對 (B )種類‘·核酸 (lilM^·背面之>1意事硕再Μ巧本頁)

本紙乐尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4说格（210X 297公釐） -34- 574372 T厂曰料 補充 Α7 Β7 五、發明説明（32 ) (c_)股型：單股 (D)拓撲學構形：線性的 (X 1 ) DESCRIPTION OF序歹f]:序列確認號碼N〇 2

GGCCGCGAAT TCTCCGCGCC TGGCCGGGGT CCCTCAGC 38 (2 )之資料序列確認號碼N〇· 3 (i )序列之特徵： (A )長度：3 6個鹼基對 (B )種類：核酸 (C )股型：單股 (D)拓撲學構形：線性的 (X i )序列之描述：序列確認號碼N〇·

CGCGGCGGAT CCTCTCCTCC CTCCCAAGCT GCAATC 36

料之長種股拓 資列 } } } } 之序AB c D 4 〇 N 碼 認 確 列 序 徵 特 對 的 基 性. 鹼 線 1^1 : 6 酸股形 3 核單構 ......0 度類型撲 (却先閲讀背面之>i意事項再蛾巧本頁)

本紙張尺度適爪中國國家標率（CNS) A4規格（2】〇X 297公釐） -35- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 574372 A7 B7______ 五、發明説明（41 ) (i )序列之特徵： (A)長度：38個鹼基對 (B )種類：核酸 (C )股型：單股 (D )拓撲學構形：線性的 (X i ) DESCRIPTION〇F序列：序列確認號碼N 〇 · 2 · GGCCGCGAAT TCTCCGCGCC TGGCCGGGGT CCCTCAGC 38 (2 )之資料序列確認號碼N 〇 · 3 (i )序列之特徵： (A)長度：36個鹼基對 (B )種類：核酸 (C )股型：單股 (D )拓撲學構形：線性的 (X i )序列之描述：序列確認號碼N 0 · : 3 CGCGGCGGAT CCTCTCCTCC CTCCCAAGCT GCAATC 36 (2 )之資料序列確認號碼N〇· 4 (i )序列之特徵： (A) 長度：36個鹼基對 (B) 種類：核酸 (C )股型：單股 (D )拓撲學構形：線性的 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -44 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) «- 訂 574372 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（42 ) (X 1 )序列之描述：序列確認號碼N〇.：4 GGCCGCGAAT TCTAGAACAG ATAGCCAGGC TGAGAG ； 36 (2 )序列確認號碼N〇· 5之資料 (i )序列之特徵： (A)長度：24個鹼基對 (B )種類：核酸 (C )股型：單股 (D )拓撲學構形：線性的 (X 1 )序列之描述：序列確認號碼N〇· ： 5 TCACCCGGCG CGCCCCAGGT CGCT 24 (2 )序列確認號碼N〇· 6之資料 (i )序列之特徵： (A )長度：6 1個鹼基對 (B )種類：核酸 (C )股型：單股 (D )拓撲學構形：線性的 (X 1 )序列之描述：序列確認號碼N〇· ： 6 ATGCTCGAGC GGCCGCCAGT GTGATCGATA TCTCCAGAGC TCAGCTTCGC CGCGAATTCT 60 A 61 (2 )序列確認號碼N〇· 7之資料 (i )序列之特徵： (A)長度：78個鹼基對 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -45 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) C-

、1T .¾ 574372 Α7 Β7 五、發明説明（43) (B) 種類：核酸 (C) 股型：單股 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (D) 拓撲學構形：線性的 (i X )特徵· (A )名稱/關鍵：C D S (B)位置：49_ .60 (X i )序列之描述：序列確認號碼N〇.：7 TCACCCGGCGCGCCCCAGGT CGCIOACGGA· CCCCGGCCAG CGCGGAGATG GGG GCC 57

Met Giy Ala 1 CAC GGTGAGTACT CGCGGGCT 78

His (2 )之資料序列確認號碼N〇_ 8 (i )序列之特徵： (A )長度：4胺基酸 (B)種類：胺基酸 (D )拓撲學構形：線性的 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (1 i )分子的種類：蛋白質 (X 1 )序列之描述：序列確認號碼N〇· ： 8

Met Gly Ala His 1 (2 )序列確認號碼N Ο · 9 :之資料 -46- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210>< 297公釐） 574372 A7 B7 五、發明説明（44 ) (1 )序列之特徵： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (A )長度：7 8個鹼基對 (B )種類：核酸 (C )股型：單股 (D )拓撲學構形：線性的 (i X )特徵： (A )名稱/關鍵：C D S (B)位置：49..60 (X i )序列之描述：序列確認號碼N〇· ： 9 TCACCCGGCG CGCCCCAGGT CGCTGAGGGA CCCCGGCCAG GCGCGGAG ATG AGC GCC 57

Met Scr Ala 5 CAC GGTGAGTACT CGCGGGCT 78

His (2 )序列確認號碼N〇.1 0之資料 (i )序列之特徵： 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (A )長度：4胺基酸 (B )種類：胺基酸 (D )拓撲學構形：線性的 (i 1 )分子的種類：蛋白質 (X 1 )序列之描述：序列確認號碼N〇· ： 1 0 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210>< 297公釐） -47 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 574372 A7 B7 五、發明説明（45 )

Met Ser Ala His 1 (2 )序列確認號碼N 1 1之資料 (i )序列之特徵： (A )長度：7 8個鹼基對 (B )種類：核酸 (C )股型：單股 (D )拓撲學構形：線性的 (1 X )特徵： (A )名稱/關鍵：C D S (B )位置：4 9 · · 6〇

(X i )序列之描述：序列確認號碼N〇· ： II TCACCCGGCG CGCCCCAGGT CGCTGAGGGA CCCCGGCCAG GCGCGGAG ATG GGG GTG 57

Met Gly Val 5 CCC GGTGAGTACT CGCGGGCT 78

Pro (2 )序列確認號碼N〇· 1 2之資料 (i )序列之特徵： (A )長度：4胺基酸 (B )種類：胺基酸 (D )拓撲學構形：線性的 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -48- 574372 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 _B7__五、發明説明（46 ) (1 1 )分子的種類：蛋白質 (X i .)序列之描述：序列確認號碼N〇.1 2 Met Gly Val Pro 1 (2 )序列確認號碼N〇.1 3之資料 (i )序列之特徵： (A )長度：7 8個鹼基對 (B)種類：核酸 (C )股型：單股 (D )拓撲學構形：線性的 (1 X )特徵： (A )名稱/關鍵：C D S (B)位置：49..60 (X i )序列之描述：序列確認號碼N〇· ： 1 3 TCACCCGGCG CGCCCCAGGT CGGTGAGGGA CCCCGGCCAG GCGCGGAG ATG AGC GTG ' Met Scr Val 5 CAC GGTGAGTACT CGCGGGCT His (2 )序列確認號碼N〇.1 4之資料 (1)序列之特徵： (A )長度：4胺基酸 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐) =49 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

574372 A7 B7 五、發明説明（47) (B)種類：胺基酸 (D )拓撲學構形：線性的 (i i )分子的種類：蛋白質 (X i )序列之描述：序列確認號碼N〇.：1 4

Met Ser Val His 1 (2 )序列確認號碼N〇.1 5之資料 (a )序列之特徵： (A )長度：5 9個鹼基對 (B )種類：核酸 (C )股型：單股 (D )拓撲學構形：線性的 (X i )序列之描述：序列確認號碼N ◦ . 1 5 : GGACATTCTA GAACAGATAT CCAGGCTCAG CGTCAGGCGG GGAGGGAGAA GGGTGGCTG 59 (2 )序列確認號碼N〇.1 6之資料 (1 )序列之特徵： (A )長度：4 8個鹼基對 (B )種類：核酸 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） -50- 574372 A7 B7 五、發明説明（48 ) (C )股型：單股 (D )拓撲學構形：線性的 C X i )序列之描述：序列確認號碼N〇· ： 1 6 GTGATGGATA TCTCTAGAAC AGATAGCCAG GCTGAGAGTC AGGCGGGG 48 (2 )序列確認號碼N〇· 1 7之資料 (1 )序列之特徵： (A)長度：39個鹼基對 (B )種類：核酸 (C )股型：單股 (D )拓撲學構形：線性的 (X i )序列之描述：序列確認號碼N 0 · : 1 7 : ATGGATATCA TCGATTCTAG AACAGATAGC CAGGCTGAG 39 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -51 -

Claims (1)

1. 574372· 修正 補充 公告本 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 六、申請專利範圍 隱2·· 第87] 1 602 8號專利申請案 修正後無劃線之中文申請專利範圍替換本 民國9 2年11月28日修正 1 · 一種製備生產人類紅血球生成素（e p〇）細胞 的方法’該細胞含一套內生性E P 〇基因，於人類細胞中 與非同源的啓動子操作性連結，且該細胞能生產至少 2〇Ο n g E P〇/ 1 〇 6細胞/ 2 4小時，此方法包括 下列步驟： (a )提供起始人類細胞，該細胞至少含一套內生性 E P〇基因，該細胞係選自 Nama] wa、HT 1 0 8 0 及 H e L a S 3細胞株； (b )用D N A構築體轉染細胞，該構築體含： (1 )兩個側接D N A序歹I」，該D N A序列係選自 E P〇基因的5 ’未轉譯序列、表現序列1 、表現序列1 中經修飾的序列、及不表現序列1區域， (1 1 )陽性選擇標記基因，及_ (i 1 1 )非同源的表現控制序列，該序列可於人 類細胞中活化； (c )在陽性選擇標記基因存在下會發生選擇的條件下， 培養轉染的細胞； (d )分析可由步驟（c )挑選出來的細胞；及 (e )鑑別產生E P〇的細胞。 (讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

   2 .如申請專利範園第1項之方法，其特徵爲使用新

   574372 ABCD 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 六、申請專利範圍 黴素磷酸轉移酶基因作爲陽性選擇標記基_。 3 ·如申請專利範圍第1項之方法，其特徵爲D N A 構築體含附加的放大基因。 4 ·如申請專利範圍第3項之方法，其特徵爲使用二 氫葉酸去氫酶基因作爲放大基因。 5 ·如申請專利範圍第4項之方法’其特徵爲使用精 胺酸突變之二氫葉酸去氫酶基因作爲放大_因。、 6 ·如申請.專利範圍第3項之方法，其另包括以下步 驟： (f )放大E P〇基因，及 (g )得到生產E P〇的細胞，該細胞含多套內生性 E P〇基因，其各自與非同源的表現控制序列連結並能生 產至少1 0 0 0 n g E P〇/ 1 〇 6細胞/ 2 4小時。 7 ·如申請專利範圍第1項之方法，其特徵爲使用 C Μ V啓動子/增強子作爲表現控制序列。 8 ·如申請專利範圍第1項之方法，其特徵爲使用直 線型式的質體ρ 1 8 9作爲D Ν Α構築體。 9 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中該D N A構 築體，包括： (1 )兩個D Ν A側接序列，該序列與人類的E P〇基因 座落區同源，該座落區係選自5 ’不轉譯序列、表現序列 1及不表現序列1 ，可進行同源重組，編碼信號胜肽序列 之首4個胺基酸經過修飾，該等胺基酸係選自 (a)Me t— Gly — A1 a — Hi s ， ^¾------訂---- Li (請先閱囀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度適用中國國家標皁（CNS ) AUL格（210X297公慶） -2 _ 574372 A8 B8 C8 D8 、申請專利範圍 (t) ) Μ (c ) Μ (d ) Μ (i 1 ) (i i i 中活化， (i v ) 10 橇築體， (i )兩 落區同源 及不表現 (i 1 ) (i i i 中活化， 距離不大 A 1 a - Η 1 -G 1 y - V a 1 一 P t 〜S e r -陽性選擇標記基 )非同源的表現 及 λ，a 1 - Η 因， 控制序列， r 〇 ，及 1 S ， 該序列可於人類細胞 視須要， •如申請 包括：. 個D N A ，此座落 序列1 ， 陽性選擇 )非同源 非伺源的 於1 1〇 視須要， • 一種製 一個放大基因。 專利範圍第1項之方法，其中該D N A 側接序 區係選 可進行 標記基 的表現 表現控 0 b ρ 一個放 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 像 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 養基及條 項之方法 養基中回 12 徵在於人 選自下列 備人類 可由申 人類細 收該E P〇。 修飾之 之信號 件下培養 所得到之 種經 類E P〇 之胺基酸 列，該序列與人類E P〇基因座 自5 ’不轉譯序列、表現序列· 1 同源重組， 因， 控制序列， 制序列與E ，及 大基因。 E P〇之方法，其中於適當之培 請專利範圍第1至1 〇項中任一 胞，並藉此產製E ρ ◦且自該培 該序列可於人類細胞 P 〇基因轉譯起點之 、1T 編碼人類E 胜肽之首4 p〇之DNA ，其特 個胺ί酸係經修飾爲 2} 0X 297^$ ) -3 - 574372 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 ( b ) Μ e t - -G 1 y - -A 1 a — H 1 s ? ( C ) Μ e t - -S e r - -A 1 a — H i s ? ( d ) Μ e t - -G 1 y - -V a 1 — P r 〇 ? 及 ( e ) Μ e t - -S e r - - V a 1 — H i S 〇 1 3 如申請 專 利範圍 第 1 2 項 之 D N A ，其 特 徵 爲 基 因 組 D N A ( ) 1 4 • 如申請 專 利範圍 第 1 2 項 之 D N A ，其 特 徵 爲 C D N A 〇 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製