JPH1175879A - プロテインジスルフィドイソメラーゼを含有する融合タンパク質をコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 宿主から分泌され正しく再生されたタンパク
質を効率よく製造するための手段の提供。 【解決手段】 選択された異種タンパク質とプロテイン
ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）との融合タンパク
質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含んで成るベクタ
ー、該ベクターにより形質転換された宿主、及び該宿主
を用いての前記融合タンパク質又は選択されたタンパク
質の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、選択された異種タ
ンパク質とプロテインジスルフィドイソメラーゼとの融
合タンパク質をコードするＤＮＡに関する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子組換え技術の発展により、多くの
タンパク質は細菌、真菌、ほ乳類をはじめとする多様な
発現系により遺伝子工学的に発現されるようになってき
た。しかしながら、異種タンパク質の発現に関して細菌
を宿主細胞として使用すると、多くの場合問題が発生す
る。

【０００３】例えば、大腸菌をはじめとする菌体内生産
系を用いた場合、生産された異種タンパク質は菌体内に
蓄積され、多くの場合細胞封入体を形成する。封入体を
形成した異種タンパク質は、その存在状態故に生物学的
あるいは生化学的に不活性であるため、活性型のタンパ
ク質を得るためには、可溶化、再生の操作がさらに必要
となる。すなわち、可溶化、再生の操作が成功しない場
合、活性型のタンパク質はほとんど得られない。しかし
ながら可溶化、再生の条件、操作は未だ確立されておら
ず、技術的に困難な場合が多い。

【０００４】これらの問題を解決するため、異種タンパ
ク質を望ましいタンパク質との融合タンパク質として発
現することが行われる。融合する望ましいタンパク質と
してｌａｃＺ、麦芽糖結合タンパク質、及びグルタチオ
ン−Ｓ−トランスフェラーゼ等が含まれる〔「カレント
・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」
２巻、補遺１０、ジョンウィリーアンドサンズ出版、ニ
ューヨーク及びスミス等「ジーン」６７：３１−４０
（１９８８）〕。

【０００５】また、日本国特許２５１３９７８号では、
チオレドキシンとの融合体を開示している。しかしなが
ら、これらのタンパク質との融合は別の問題を呈するこ
とが多い。たとえばタンパク質の翻訳効率が発現レベル
を大きく左右することが知られている。この翻訳効率
は、開始コドンを含む領域のＤＮＡ配列に依存するが、
この現象を支配する明確なメカニズムは明らかではな
い。

【０００６】このため目的異種タンパク質のＮ末端での
融合は、発現レベルに予想不可能な影響を及ぼすことが
多い。さらに、菌体内に生産、蓄積された異種タンパク
質は、菌体からの抽出およびその抽出液からの精製に多
大の時間と労力を要するだけでなく、目的とするタンパ
ク質を完全な形で純粋に得ることが容易ではない。この
点において、当業界で現在使用されている融合相手タン
パク質の一部は融合タンパク質の精製を容易にするため
の固有の特性を有していない。

【０００７】一方、バチルス属に属する微生物は、古く
から種々の菌体外酵素の生産菌として工業的に利用され
ている。これらの菌体外酵素のうち、バチルス・アミロ
リクイファシエンスのα−アミラーゼ遺伝子〔I.Palva
et.al, Gene, 22, 229 (1983) 〕、バチルス・リケニフ
ォルミスのペニシリナーゼ遺伝子や枯草菌のα−アミラ
ーゼ遺伝子等が既にクローン化され、これらのプロモー
ターおよびシグナルペプチドを利用した異種タンパク質
の菌体外分泌生産系が報告されている。この菌体外分泌
生産系では、上記の菌体内生産系で問題となる封入体形
成はほとんど認められず、可溶化状態での異種タンパク
質の生産を可能にすると共に、菌体からの抽出操作が不
要なため、生産コストを削減できる。

【０００８】しかしながら、分泌生産系により異種タン
パク質を生産する場合、他の不具合を呈することもあ
る。例えば、異種タンパク質の高レベル分泌生産を達成
させるポイントの一つがタンパク質の分泌効率であるこ
とが知られている。タンパク質の分泌効率は、シグナル
ペプチドの配列やこれに続く成熟タンパク質のアミノ酸
配列（特にＮ末端領域のアミノ酸配列）、さらには宿主
細胞の備える分泌装置等の相互の関係に支配されている
と考えられるが、これらの詳細については明らかではな
い。このため、異種タンパク質の分泌発現では、生産レ
ベルが著しく低い場合があるが、この不具合の予測は非
常に困難である。

【０００９】さらに、目的異種タンパク質が相当レベル
菌体外に分泌生産された場合でも、さらに別の問題が生
じる。タンパク質は、立体配座の自由度が高いため、膨
大な数の可能な構造をとりうる。しかし、活性タンパク
質の立体配座は、多くの可能な構造の内の一部のもので
あって、望ましいアミノ酸配列を有する異種タンパク質
が分泌されても、活性が低い場合もありうる。

【００１０】生体内におけるタンパク質の高次構造形成
のメカニズムに関しては、近年、多くの研究がなされ、
好ましい構造形成を助ける分子シャペロンやジスルフィ
ド結合をつなぎ換えるプロテインジスルフィドイソメラ
ーゼ（ＰＤＩ）が、タンパク質の好ましい構造形成に大
きな役割を演じていると考えられている。例えば、バチ
ルス・ブレビス菌には菌体外にジスルフィド交換酵素が
存在しており、分泌タンパク質の高次構造形成に寄与し
ていると考えられる。しかしながら異種タンパク質を高
レベルで発現すると、宿主細胞の有するシャペロン等の
機能が量的に不足することも考えられる。このことは、
異種タンパク質生産系においてタンパク質の高次構造的
な不具合の原因になりうる。

【００１１】また更に、宿主細胞の有するほとんどのタ
ンパク質は菌体内に存在するため、異種タンパク質を菌
体外に分泌生産させる場合、目的異種タンパク質の精製
のプロセスは大幅に合理化されるが、多くの場合、目的
異種タンパク質は精製プロセスをさらに容易にする固有
の特性を有していない。それ故、分泌発現系に於いて
も、生産された異種タンパク質の精製は依然として大き
な問題であることが多い。従って、組換え発現系の技術
分野では、研究、診断、治療および工業材料適用におけ
る使用を目的とする活性型のタンパク質の製造および精
製に関する新規組成物および方法が依然として要望され
ている。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】異種タンパク質の分泌
発現系においては、分泌障害、立体構造的不具合等の問
題で、現在報告されているいずれの分泌生産系も満足で
きるものとはいいがたい。

【００１３】

【課題を解決するための手段】発明者らは、組換え発現
系において安定的に異種タンパク質を培地中に発現でき
る組換え分泌発現系の開発を行ってきた。この際、高温
カビの一種であるフミコラ・インソレンス由来のＰＤＩ
が分泌発現系において高効率で分泌発現されることを見
出した（特開平７−１０７９８０）。一方、分泌効率が
低い異種タンパク質を効率的に分泌発現できる組換え発
現系を作出すべく研究を重ねたところ、目的異種タンパ
ク質に特定の様態でＰＤＩを連結して融合タンパク質と
して発現させることにより、目的異種タンパク質を効率
的に分泌生産できることを見出した。

【００１４】したがって、前記課題は異種タンパク質を
コードするＤＮＡにＰＤＩをコードするＤＮＡを連結し
た組換えＤＮＡの使用により解決される。すなわち、本
発明によれば、通常限られた量のタンパク質が培地中に
蓄積されるある種の宿主細胞において、望ましい立体構
造を有する異種タンパク質を培地中に多量に蓄積させる
ことを可能にする融合タンパク質をコードするＤＮＡ構
成、およびそれらを保持する宿主細胞、およびかかる宿
主細胞を栄養培地に培養することを特徴とする融合タン
パク質の製造方法、さらには、かかる融合タンパク質か
ら目的異種タンパク質を切断することを特徴とする目的
異種タンパク質の製造方法が提供される。

【００１５】

【発明の実施の形態】この発明によると、通常限られた
量のタンパク質が培地中に蓄積されるある種の宿主細胞
において、安定した可溶性の異種タンパク質を培地中に
多量に製造することができる。また、この発明の融合タ
ンパク質は、目的異種タンパク質においてその望ましい
立体構造を達成させ得る。

【００１６】本発明においては異種タンパク質をコード
するＤＮＡ配列は、例えばフミコラ・インソレンス由来
のＰＤＩをコードするＤＮＡ配列に融合された形態で宿
主細胞において発現される。ＰＤＩは真核生物に広く存
在し、生体内では小胞体内腔に分布する分泌タンパク質
であり、その量は小胞体内タンパク質の１０％以上を占
める。この高分泌特性は組換え分泌発現系において、融
合タンパク質の高分泌能の一因となりうる。

【００１７】さらにフミコラ・インソレンス由来のＰＤ
Ｉはヒト、牛等の他起源のＰＤＩに比べ高い熱安定性を
有しており、８０℃においても最適温度の５０％もの活
性が残存している。本発明のＰＤＩの耐熱性は、その構
造が著しく堅く、安定であることに起因するものと考え
られる。この構造的特性は目的異種タンパク質との融合
タンパク質において、融合による構造的な影響を最小限
にしうるとともに、ＰＤＩと異種タンパク質がそれぞれ
固有の構造を有するのに大きく役立つ。さらに上記構造
的理由から融合タンパク質において融合された個々のタ
ンパク質はそれぞれ固有の機能を有しうる。

【００１８】上記の理由により、本発明においてはフミ
コラ・インソレンス由来のＰＤＩが好ましく、このＰＤ
Ｉのアミノ酸配列及びそれをコードするＤＮＡの塩基配
列並びにそのクローニング方法は、例えば特開平６−２
５３８５７に詳細に記載されている。組換え発現系にお
いて、ＰＤＩのリフォールディング活性は好ましくない
ジスルフィド結合の形成を防止し、また、シャペロニン
活性と相まって異種タンパク質の望ましい構造形成を促
すことにより、目的異種タンパク質が不活性化する不具
合を解決するのに役立つ。

【００１９】選択したタンパク質およびＰＤＩのＤＮＡ
配列を含む本発明の融合配列の構築は、当業界における
一般的な遺伝子工学技術を使用する〔サムブルック等、
「モレキュラー・クローニング．ア・ラボラトリー・マ
ニュアル」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー，コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨー
ク（１９８８）参照〕。融合配列は、幾つかの異なる方
法により構築されうる。例えば、選択した異種タンパク
質は、ＰＤＩ分子のアミノ末端に融合されうる。また別
法として、選択した異種タンパク質は、ＰＤＩのカルボ
キシル末端に融合されうる。

【００２０】選択された異種タンパク質に、ＰＤＩを融
合するにあたっては、その融合様式に因らず、融合はい
ずれのタンパク質の天然構造をも不安定にすることなく
行われる。高効率分泌生産に適したＰＤＩへの融合によ
り、目的異種タンパク質の分泌効率は改善される他、Ｐ
ＤＩのジスルフィド交換活性や、シャペロン活性等は目
的異種タンパク質の望ましい構造形成を促進し、目的異
種タンパク質が不活性化する不具合を解決するのに役立
つ。さらに、異種タンパク質に連結されたＰＤＩのジス
ルフィド交換活性や、シャペロン活性等は目的異種タン
パク質の望ましい構造の維持にも効果があり得る。この
ことは、ＰＤＩとの融合により目的異種タンパク質の安
定性を向上させうることを意味する。

【００２１】この発明によるＰＤＩおよび目的異種タン
パク質の融合配列は、所望によりＰＤＩと目的異種タン
パク質との間に挿入されたリンカーペプチドを含みう
る。このリンカー配列には、慣用的に用いられる化学的
または酵素的方法により選択的に開裂または消化可能な
ポリペプチドをコードしていてもよい。例えば酵素的開
裂部位には、タンパク質分解酵素、例えばエンテロキナ
ーゼ、第Ｘａ因子、トリプシン、コラゲナーゼおよびト
ロンビンによる開裂部位がある。別法として、リンカー
におけるかい裂部位は、選択した化学物質、例えば臭化
シアン、ヒドロキシルアミンまたは酸性条件下に暴露し
たときに開裂され得る部位でありうる。さらにリンカー
配列は、インテインのように自己消化により開裂する配
列を有していてもよい。

【００２２】酵素的開裂をもたらす具体的なアミノ酸配
列としては、例えば、エンテロキナーゼについてはＡｓ
ｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ／Ｌｙｓ、第Ｘａ
因子についてはＩｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ／、ト
リプシンについてはＡｒｇ／Ｘ、コラゲナーゼについて
はＸ／Ｇｌｙ、そしてトロンビンについてはＬｅｕ−Ｖ
ａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ／Ｇｌｙ（いずれも／で示した部
分が開裂される）である。また、化学的に開裂（破壊）
されるアミノ酸としては、臭化シアンについてはＭｅｔ
／Ｘ、ヒドロキシルアミンについてはＡｓｎ／Ｇｌｙが
挙げられる。

【００２３】ＰＤＩ融合タンパク質は、選択した開裂部
位での開裂により、異種タンパク質が分離され、成熟型
の異種タンパク質が得られる。次いで成熟異種タンパク
質は、当業界における一般的な手法により、ＰＤＩフラ
グメントを含まない精製された形態で得られる。開裂部
位は、当業界において一般的に知られている望ましい開
裂部位であればいずれのものでもよく、また開裂部位
が、この発明のリンカー部位に挿入されることは、この
発明を制限するものではない。

【００２４】本発明の融合配列に挿入されるリンカー配
列は、上記開裂部位の提供以外の目的にも役立ちうる。
例えば、融合配列に挿入されるリンカーは、ＰＤＩ分子
および選択した異種タンパク質分子間の立体障害を阻止
するのに十分な長さのアミノ酸配列であっても良い。前
記のリンカー配列が必要かどうかは、選択した異種タン
パク質の構造的特徴および生成した融合タンパク質が開
裂せずとも有用であるかどうかにより異なる。例えば、
選択された異種タンパク質が工業的用途に用いられる酵
素である場合、融合タンパク質はそれ自体目的の用途に
対して有用であり得る。また、融合タンパク質が自然開
裂し、目的異種タンパク質が成熟型で得られる場合、リ
ンカーは全く必要ない。

【００２５】従って、この発明の一つの様態として、融
合配列は、そのアミノまたはカルボキシル末端が、選択
したタンパク質の配列へ直接融合したＰＤＩ配列を含
む。この発明は特定の異種タンパク質に限定されるわけ
ではなく、多様な異種遺伝子が本発明の融合配列の形成
には有用である。この発明の組成物および方法は組換え
分泌生産系において非常に少量しか発現されないタンパ
ク質に特に有用であって、異種タンパク質はいずれかの
発現系において治療、診断、研究または工業材料に適用
されるあらゆるタンパク質を含みうる。

【００２６】例えば、抗体、ホルモン、サイトカイン、
成長因子、阻害因子、酵素等の生理活性タンパク質、あ
るいはこれらを修飾したタンパク質はこの発明により細
菌、酵母、ほ乳類または他の真核細胞のそれに適した発
現系により生産されうる。この発明を説明している実施
例には、本発明の対象タンパク質として抗体およびゲラ
ニルゲラニル・ピロフォスフェイト・シンテース（ＥＣ
２．５．１．２９）が例示されている。これらのタンパ
ク質をＰＤＩとの融合なしに酵母あるいはバチルス・ブ
レビス等の細菌を宿主とする分泌生産系で発現すると、
発現量が著しく少ないか、発現されても不活性化してし
まう。

【００２７】上記のようなＰＤＩと目的異種タンパク質
とを連結した融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子
は、この発明による異種タンパク質発現のための他の配
列を伴いうる。すなわち、この発明による望ましいＤＮ
Ａ配列は、所望の宿主細胞における融合タンパク質の発
現を指示しうる発現制御配列を随伴し、その制御下にあ
る上記融合配列を含む。例えば宿主細胞がバチルス・ブ
レビス株である場合、ＤＮＡ分子はバチルス・ブレビス
で機能するプロモーター、リボソーム結合部位を含み、
また融合タンパク質の分泌を指示する分泌シグナル配列
を有する。また所望により、選択可能なマーカー遺伝子
を含んでもよく、さらにＤＮＡ分子が宿主細胞内におい
て染色体外に存在する場合、複製開始点を含んでも良
い。

【００２８】バチルス・ブレビス株で機能する具体的な
前記配列は鵜高ら（Method in Enzymology 217, 73-33)
により公知である。細菌発現に関してそれに使用される
発現ベクターも鵜高（Method in Enzymology 217, 23-3
3)により公知にされているほか、当業界では前記の成分
を含む多くの細菌発現ベクターが知られており、標準的
な分子生物学技術により容易に構築されうる。

【００２９】同様に宿主細胞が酵母やほ乳類をはじめと
する他の真核細胞の場合、公知な酵母やほ乳類をはじめ
とする他の真核細胞のベクターおよびベクター成分が使
用できる。融合配列を含むＤＮＡ分子は、当業界で通常
行われるとおり選択した宿主細胞での発現を最適化する
ようにコドンの選択が修飾されうる。これらのＤＮＡ分
子において融合配列は多コピー存在しても良い。また、
同様にＰＤＩ配列あるいは目的異種タンパク配列が各々
多コピー存在しても良い。

【００３０】本発明に適した宿主細胞は、好ましくは細
菌細胞である。当業界において分泌発現宿主細胞として
よく知られているバチルス・ブレビス４７株あるいはＨ
ＰＤ３１株は鵜高ら（Method in Enzymology 217, 23-3
3)により公知である他、下記実施例で使用されるバチル
ス・ブレビス３１−ＯＫ株は梶野ら（特開平６−２９６
４８５）により工業技術院生命工学技術研究所にＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１３２７４として寄託されている。またバチル
ス・サチルスをはじめとする他のバチルス属やシュード
モナス属等の様々な株もこの発明において使用されう
る。また、酵母細胞も本発明に望ましい宿主細胞であ
る。サッカロマイセス・セレビシアエの様々な株は当該
分野において宿主細胞として常用されている。同様に、
当該分野において知られている他の真核生物細胞や公知
のほ乳類細胞も本発明の宿主細胞として使用されうる。

【００３１】この発明の融合タンパク質を製造するた
め、宿主細胞は好ましくは発現制御配列を有する融合タ
ンパク質をコードするＤＮＡ分子により形質転換される
か、またはそれがゲノムへ組み込まれている。上記の宿
主細胞は製造に適した公知の条件下で培養される。生長
培地中に分泌された融合タンパク質は選択的沈殿、カラ
ムクロマトグラフィー法を含む慣用的方法により精製さ
れうる。また、発明者により公知の抗ＰＤＩ抗体を用い
たアフィニティクロマトグラフィー等の精製手法は、Ｐ
ＤＩ融合タンパク質の精製において他の慣用的手法に比
べ特に有用であり得る。

【００３２】この発明の組成物及び方法の具体的態様で
は、フミコラ・インソレンスのＰＤＩ遺伝子は発明者ら
によりクローニングされている。発現プラスミドｐＮＵ
２１１Ｌ４ＰＤＩはバチルス・ブレビスで機能するプロ
モーター等の発現制御下に分泌シグナルに続くＰＤＩ遺
伝子を有する。このプラスミドはバチルスブレビス宿主
３１−ＯＫ株において、高効率（約１ｇ／ｌ）でＰＤＩ
を生長培地中に分泌しうる。実施例では、このプラスミ
ドを用いて抗体及び菌体内酵素であるＧＧＰＳとのＰＤ
Ｉ融合タンパク質を形成及び発現させる方法を記載して
いる。この発明の方法及び組成物により研究、診断、治
療、工業材料分野に有用なタンパク質の製造が可能にな
る。

【００３３】この発明の融合タンパク質の製造は幾つか
の利点を有する。本発明によれば、従来分泌発現が困難
であった多くの異種タンパク質を容易に菌体外に分泌生
産させ得る。また、生成した融合タンパク質は可溶性で
あり、多くの場合好ましい立体構造を形成しうる。更
に、選択された異種タンパク質の安定性はＰＤＩとの融
合化により向上しうる。

【００３４】

【実施例】次に、実施例により、本発明をさらに具体的
に説明する。実施例１ ．ＰＤＩ−抗体（Ｆａｂ）融合分子 ＰＤＩ様配列としてカビ由来のＰＤＩおよび選択した異
種タンパク質として１１−デオキシコルチゾール（11-d
eoxycortisol）に対するモノクローナル抗体由来のＶκ
ＣκおよびＶ_H Ｃ_H 部位をコードする遺伝子を用いて融
合タンパク質分泌発現系を構築した。１１−デオキシコ
ルチゾールに対するモノクローナル抗体のＤＮＡは黒沢
らの「モレキュラー・イミュノロジー２８：１０６３−
１０７２（１９９１）」記載のハイブリドーマから得
た。

【００３５】すでにクローン化している「バイオサイエ
ンス・バイオテクノロジー・バイオケミストリー５８：
１４２４−１４２９（１９９４）」に記載のフミコラ・
インソレンス由来のＰＤＩを用いて、マニアスらの「モ
レキュラー・クローニング．ア・ラボラトリーマニュア
ル」、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリー，ニューヨーク（１９８９）」により記載され
た標準組換えＤＮＡ技術を用いることにより分泌用発現
プラスミドを構築した。

【００３６】ＰＤＩ−ＶκＣκおよびＶ_H Ｃ_H 融合タン
パク質をコードする遺伝子の構築はＰＤＩのＮ末端から
チオレドキシンと相同性のある活性中心と考えられる配
列の１つを含んだ７０アミノ酸、及び相同性のある配列
の２つを含んだ３００アミノ酸及びＰＤＩ全体にリンカ
ー部位とエンテロキナーゼでの切断部位を有する配列
（例えばＧＳＧＳＧＤＤＤＤＫ）を介し抗体のＶκＣκ
およびＶ_H Ｃ_H 部位さらにはＶκＣκのカルボキシ末端
にプロテインＡを連結させたタンパク質の全アミノ酸配
列を有するＤＮＡをコードする遺伝子を上記記載のマニ
アチスらの方法により構築した（図１参照）。また発現
ベクターはバチルス・ブレビス用に開発されたエリスロ
マイシン耐性遺伝子を含んだｐＮＵ２１２を用い、Ｎｃ
ｏＩ−ＨｉｎｄIII の部位に融合タンパク質遺伝子を導
入して分泌発現が可能となるように設計した。

【００３７】融合タンパク質の発現 形質転換は、鵜高らの「アグリカルチュラル・バイオロ
ジカルケミストリー５３：３０９９−３１１（１９８
９）」に記載の方法によりエレクトロポーレション法に
より行った。バチルス・ブレビスの宿主株としては特願
平５−３２０９０に記載の３１−ＯＫ株を用いて形質転
換した。

【００３８】形質転換用培地は１％Ｗ／Ｖポリペプト
ン、０．５％カツオエキス、０．２％イーストイクスト
ラクト及び１％グルコース（pH７）で構成されるＴ２培
地に１０mg／ｌ ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ、１０mg／ｌ
ＭｎＳＯ₄ ・４Ｈ₂ Ｏ、１mg／ｌmg ＺｎＳＯ₄ ・７Ｈ
₂ Ｏ及び１０μｇ／mlエリスロマイシンを添加した１．
５％Ｗ／Ｖ寒天プレートにおいて形質転換体を選択し
た。

【００３９】得られた形質転換体をＹＣ培地〔３％Ｗ／
ＶポリペプトンＰ１、０．２％Ｗ／Ｖイーストイクスラ
クト、３％Ｗ／Ｖグルコース、０．１ｇ／ｌ塩化カルシ
ウム２水塩、０．１ｇ／ｌ硫酸マグネシウム７水塩、１
０mg／ｌ硫酸鉄・７水塩、１０mg／ｌ硫酸マンガン・４
水塩、１mg／ｌ硫酸亜鉛７水塩；pH７．２〕で３０℃、
６日間培養した。培養上清１０μｌを用いてその中のタ
ンパク質を還元下でジャガーらの「アナリティカル・バ
イオケミストリー」１６６：３６８−３７９（１９８
７）の方法に従い１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離
し、ウエスタンブロットの手法を用いてニトロセルロー
ス膜上に固定した。家禽に免疫して得たマウスＦ（ａ
ｂ）２抗体を一次抗体として用いた。ブロットしたニト
ロセルロースフィルターを第一抗体と反応させた後、第
２抗体としてアルカリフォスファターゼ標識抗ラビット
ＩｇＧ抗体を用いて、バイオラッド社アルカリフォスフ
ァターゼ発色キット）で発色させ、発現している融合タ
ンパク質化した抗体分子を検出した。

【００４０】ＰＤＩのＮ末端から７０アミノ酸、３００
アミノ酸と及び融合タンパク質化したものに関してはＦ
ａｂ抗体と反応を示すタンパク質を発現するクローンは
得られたが、発現量は低く６日の培養によっても５mg／
ｌ以下であった。この量はＰＤＩとの融合タンパク質と
しない場合の発現量と同等以下であった。また、大腸菌
のチオレドキシンと融合タンパク質化したものでも発現
量は５mg／ｌ以下であった。

【００４１】一方、ｎａｔｉｖｅＰＤＩにＶκＣκまた
はＶ_H Ｃ_H を結合し融合タンパク質化したものでは５０
mg／ｌ以上の発現ができるようになった。このことは、
チオレドキシン等との相同性の有る活性中心を含む配列
の部位のみをリーダー配列として用いる場合には、分泌
生産系においては生産量に対する寄与は少なく、ＰＤＩ
分子全体を用いた場合にのみ大幅な生産性の向上が可能
であることを示している。

【００４２】抗体分子の再構築 融合タンパク質を含む１ml培養液を５mM ＥＤＴＡ存在
下、２０単位の牛エンテロキナーゼ「レプリクスら、ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」２５
４：１６７７−１６８３（１９７９）により開裂した。
開裂したＰＤＩを含むＶκＣκおよびＶ_H Ｃ_H を３７℃
で３時間の再構築反応を行った。

【００４３】再構築の確認は非還元下でジャガーらの
「アナリティカル・バイオケミストリー」１６６：３６
８−３７９（１９８７）の方法に従い１２％ ＳＤＳ−
ＰＡＧＥで解析した。その結果、融合タンパク質から開
裂したＶκＣκとＶ_H Ｃ_H を再構築した方がＶκＣκと
Ｖ_H Ｃ_H を単独で再構築したものに比べてＦａｂ型にな
っているものの割合が上昇していることが明らかになっ
た。また培地からカラム法などにより融合タンパク質を
精製してからトリス−塩酸緩衝液などで再構築した場合
も同様の結果であり、さらに再構築している抗体分子の
割合が上昇していた。

【００４４】

【表１】

【００４５】抗体分子の活性の確認 活性の確認はエンザイム・イムノアッセイにより行っ
た。１１デオキシコルチゾールをカルボキシメトキシア
ミン塩酸塩を反応させた後、卵白アルブミンに反応させ
たものをエンザイム・イムノアッセイ用の抗原とした。
この抗原をリン酸緩衝化生理食塩水に溶解したのちヌン
ク社の９６穴プレートに入れて４℃一晩反応して固定し
た。プレートをリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄したの
ち、大日本製薬社のブロックエースで室温で３時間反応
させて非特異的な反応を抑制した。プレートをリン酸緩
衝化生理食塩水で洗浄したのち、リン酸緩衝化生理食塩
水に０．１％のチャップスを加えた溶液に溶かしたハイ
ブリドーマから得た抗体もしくは再構築した抗体を加え
室温で１時間反応させた。

【００４６】プレートをリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄
したのち、家禽に免疫して得た抗マウスＦ（ａｂ）２抗
体を０．１％ツイーン２０を含むリン酸緩衝化生理食塩
水に溶解した溶液で室温で１時間反応した。さらにプレ
ートをリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄したのち、家禽に
免疫して得た抗ウサギＩｇＧ抗体をアルカリフォスファ
ターゼで標識したものを用いて室温で１時間反応させ
た。プレートをリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄したの
ち、バイオラッド社アルカリフォスファターゼ発色キッ
トで発色させた。その結果、本発明の方法で得た抗体は
ハイブリドーマから得られた抗体と同等の反応性を示す
ことが確認された（図２）。

【００４７】実施例２．ＶκＣκをＰＤＩとの融合タン
パク質にすることによる分泌の促進 マウスモノクローナル抗体のＶκＣκを単独あるいはＰ
ＤＩとの融合タンパク質として発現するバチルス・ブレ
ビスをＹＣ培地で３０℃、６日間培養した。培養液を遠
心分離し、培養上清と菌体をそれぞれ得た。菌体は、生
理食塩水に懸濁した後再度遠心する洗浄操作を３回繰り
返し、培養液と等量のリン酸緩衝液（５０mMリン酸ナト
リウム、pH７．０）に懸濁した後、超音波処理（１５０
Ｗ３０秒ｘ６）により菌体を破砕した。破砕液から遠心
分離により残差を除き、この菌体抽出液を菌体画分とし
た。上記で得られた培養上清と菌体画分に存在するＶκ
Ｃκを前記の方法と同様に抗マウスモノクローナル抗体
を用いてウェスタンブロットにより検出した。

【００４８】抗体のＶκＣκを単独で発現させた場合、
培養上清中にはわずかの目的タンパク質しか検出されな
い（図、レーン２）のに対し、菌体画分にはシグナル配
列が切断されていない前駆体が多量に検出されており
（図、レーン１）、抗体ＶκＣκの分泌生産においては
目的タンパク質の分泌過程が障害となり生産量が低くと
どまっていることが判った。一方、ＰＤＩとの融合タン
パク質として発現させた場合は、培養上清に融合タンパ
ク質が多量に検出されたが（図、レーン４）、菌体画分
にはほとんど抗体ＶκＣκは検出されず（図、レーン
３）、融合タンパク質は障害なく分泌されていることが
分かった。このことは、本来分泌されにくい抗体ＶκＣ
κがＰＤＩとの融合化により効率的に分泌できることを
示しており、ＰＤＩとの融合化によりタンパク質の分泌
生産性が向上する一つのメカニズムが明らかになった。

【００４９】実施例３．ＰＤＩ−ＧＧＰＳ（Geranylger
anyl pyrophosphate synthase ；ゲラニルゲラニル２リ
ン酸合成酵素） 高度好熱性古細菌由来のゲラニルゲラニル２リン酸合成
酵素は実施例１に示されたｐＮＵ２１２関連の発現ベク
ターを用いることによってＰＤＩ融合タンパク質として
バチルスブレビスにおいて高レベルで発現された。ゲラ
ニルゲラニル２リン酸合成酵素を発現させるために大沼
らにより示される「ジャーナルオブバイオロジカル・ケ
ミストリー」２６９：１４７９２−１４７９７（１９９
４）に記載の完全長のＧＧＰＳをコードするＤＮＡ配列
に抗体遺伝子の部位を変換した。この酵素の発現に使用
される宿主および発現プロトコールは実施例１に記載の
方法に従った。

【００５０】本酵素においても、チオレドキシン及びＰ
ＤＩのＮ末端から７０および３００アミノ酸とＧＧＰＳ
の融合タンパク質を形成した場合においてはやはり発現
量は上昇せず５mg／ｌ以下であった。しかしながらＰＤ
Ｉ全体との融合タンパク質とした場合においては発現量
は大幅に上昇し１００mg／ｌ以上の発現量を示した。ま
た本酵素の活性および基質特異性を「小倉ら、ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」２６９：２
０５６１−２０５６６（１９８４）記載の方法により測
定したところ、完全長ＰＤＩとの融合タンパク質の場合
においてはもとのＧＧＰＳと完全に一致した。このこと
はＰＤＩが融合タンパク質の状態でもタンパク質の折り
畳みを制御していることを示している。

【００５１】安定性の確認 ＧＧＰＳとＰＤＩとの融合タンパク質をpH７の緩衝液中
で３０日間インキュベーションを行い残存活性の測定を
行った。ＧＧＰＳは７０℃で約５０％低下したのに対し
てＰＤＩとの融合タンパク質は８０℃でも２０％程度の
低下であった。

【表２】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、実施例１において抗体を発現させた場
合に用いた遺伝子の構成を示す図である。

【図２】図２は、本発明に従って、ＰＤＩとの融合タン
パク質を経由して製造された抗体とハイブリドーマから
得られた対象抗体との抗原結合性を比較したグラフであ
る。

【図３】図３は、ＶκＣκを単独で発現させた場合と、
ＰＤＩとの融合タンパク質として発現させた場合との、
分泌効率の比較を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:08） (Ｃ１２Ｎ 9/90 Ｃ１２Ｒ 1:08） (72)発明者 浅見 修 愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41番 地の１ 株式会社豊田中央研究所内 (72)発明者 山田 幸生 愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41番 地の１ 株式会社豊田中央研究所内 (72)発明者 鵜▲高▼ 重三 愛知県名古屋市名東区植園町１丁目24−３

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 選択された異種タンパク質とプロテイン
   ジスルフィドイソメラーゼとの融合タンパク質をコード
   するＤＮＡ。