WO2004096860A1 - 目的蛋白質の製造方法、融合蛋白質及びその遺伝子、インテインの部分配列蛋白質及びその遺伝子、発現ベクター、並びに形質転換体 - Google Patents

目的蛋白質の製造方法、融合蛋白質及びその遺伝子、インテインの部分配列蛋白質及びその遺伝子、発現ベクター、並びに形質転換体 Download PDF

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WO2004096860A1
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WO
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protein
fusion protein
intin
target protein
peptide bond
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PCT/JP2004/006191
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Akiko Togi
Masahiro Furutani
Original Assignee
Sekisui Chemical Co., Ltd.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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    • C07K2319/92—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification containing an intein ("protein splicing")domain

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a target protein, a fusion protein and its gene, a partial distribution protein of intin and its gene, an expression vector, and a transformant. More specifically, the present invention relates to a method for producing a target protein by excising a target protein from a fusion protein of a molecular chaperone and an intervening protein having peptide bond cleavage activity and the target protein by the action of the intervening protein, the fusion protein and the fusion protein
  • the present invention relates to a gene, an intin partial sequence protein having peptide bond cleavage activity, a gene thereof, an expression vector, and a transformant. According to the present invention, a target protein can be efficiently obtained as a normal protein even if it is a protein that is difficult to be expressed by ordinary gene recombination techniques. Background art
  • the expressed target protein may not be properly folded, and the target protein may not be obtained as an abnormal protein having an incorrect three-dimensional structure.
  • abnormal proteins often form insoluble aggregates called inclusion bodies. Then, it is very difficult to refold the abnormal protein that has once become an inclusion body to become a normal protein, and it is often unsuccessful.
  • the target protein can be combined with glutathione-S-transferase (GST), thioredoxin, maltose binding protein, etc.
  • GST glutathione-S-transferase
  • thioredoxin thioredoxin binding protein
  • a method for expressing the protein as a fusion protein has been proposed. With this method, it is difficult to eliminate the formation of inclusion bodies with high efficiency (for example, Smith, DB, et al., Gene, 1988, Vol.
  • a target protein as a normal protein having a correct three-dimensional structure by the action of a molecular chaperone, which is a protein that supports a protein folding reaction.
  • a molecular chaperone which is a protein that supports a protein folding reaction.
  • a target protein is co-expressed with a molecular chaperone in a host, and the target protein is expressed as a normal protein by the action of the molecular chaperone.
  • the amount of the target protein obtained as a normal protein has not been drastically increased (Nishihara et al., Applied and Enviromental Mental Bio Mouth Sea. ⁇ Applieaande nv iro nme ntal mi crobiology), 1998, Vol. 64, p. 1694—1699).
  • a porphyrin ninsubunit linking body in which subunits of chaperonin, a kind of molecular chaperone, are connected to each other. That is, a target protein is produced and used as a fusion protein with a linked Shanin nin subunit in which 1 to 20 Shanin nin subunits are connected in series. At this time, the target protein is stored inside the solid structure of shanin as well as forming a complex with natural shanin. As a result, the target protein is easily obtained as a correctly folded normal protein, and the formation of inclusion bodies can be suppressed.
  • the target protein can be protected from attack by a host-derived protease (see WO02Z052029 A1). That is, according to this method, it is possible to express various viruses, various antibodies, seven-transmembrane receptors (G protein-coupled receptors), cytokines, and the like, which have toxicity to the host. In this method, it is necessary to excise the target protein from the S-mating protein as in the conventional method used for fusion proteins such as GST, thioredoxin, and maltose binding protein.
  • the target protein is cut out by allowing a limited-degraded protease to act on the fusion protein. That is, a recognition sequence for a restricted angle-digested proteinase is included in advance between the target protein and the conjugate of the ninth subunit, and the target protein is cut out by allowing the protease to act.
  • thrombin, FXa (active blood factor X), enterokinase, precision protease, and the like are used as limited-degradation proteases.
  • the target protein itself may be protected by the protease, depending on the 'I.
  • the target protein is a hepatitis c virus antigen
  • its hydrophobicity is so high that the strictness of the recognition sequence of the limited-degraded protease is lost, and the portion other than the recognition sequence is cleaved, resulting in the hepatitis c virus antigen itself. ⁇ will be done.
  • Other high hydrophobicity A similar problem exists with proteins that have a region, a region, a transmembrane region, and the like.
  • the cleavage efficiency of protease varies depending on the type of target protein. Therefore, in this method, the protease may not be effective depending on the type of the target protein, and the target protein may not be cut out in some cases.
  • An object of the present invention is to provide a fusion protein of an intervening protein having molecular chaperone and peptide bond cleavage activity with an objective protein and a gene thereof, a method for producing an objective protein which cleaves the objective protein from the fusion protein by the action of the intervening protein, and a peptide. It is an object of the present invention to provide an intin partial sequence protein having a bond cleavage activity, a gene thereof, an expression vector, and a transformant.
  • the present inventors have conducted intensive studies and found that by combining a protein having peptide bond cleavage activity represented by intin with a molecular chaperone, even a protein that is difficult to be expressed by ordinary genetic recombination techniques It has been found that the protein can be efficiently produced as a normal protein. Furthermore, a fusion protein of a target protein and a molecular chaperone and an intervening protein having peptide bond cleavage activity, which is useful in the present production method, was isolated. Further, a partial sequence protein of intin having peptide bond cleavage activity was isolated. Furthermore, the genes encoding them were isolated, and an expression vector containing the gene and a transformant containing the expression vector were isolated, thereby completing the present invention.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • a molecular protein or its subunit is linked to one end of an intervening protein having peptide bond cleavage activity by a peptide bond, and a target protein is attached to the other end.
  • a fusion protein characterized by being linked by a peptide bond.
  • the intervening protein having peptide bond cleavage activity is linked to a single speronin subunit or a spermnin ninsubunit conjugation; 2.
  • the intervening protein having peptide bond cleavage activity is the N-terminus of a single Siaguchi ninsubunit or a conjugate of a Siaguchi ninsubunit, or the N-terminal of a single Siaguchi-subunit or a conjugate of a Siaguchi ninsubunit.
  • fusion protein according to any one of (1) to (7), wherein the molecular chaperone is derived from Pacteria, archaea, or eukaryote.
  • the intin is derived from Syn ec ho cystiss p.
  • the fusion protein according to any one of (9) to (12), which is characterized in that:
  • a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a protein in which one or several amino acids have been deleted, substituted, added or inserted in SEQ ID NO: 1 The fusion protein according to (12), which is a protein having a sequence and having a peptide cleavage activity.
  • the partial sequence protein of intin is a protein having at least 50% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having a peptide cleavage activity (12) ).
  • a method for producing a target protein characterized in that the target protein is excised from the fusion protein according to any one of (1) to (17) by the action of an intervening protein having peptide-cleaving activity.
  • (24) a step of preparing an expression vector incorporating the gene encoding the fusion protein, a step of introducing the expression vector obtained in the previous step into a host to express the fusion protein, and a step of expressing the fusion protein.
  • (19) The method for producing a target protein according to (19), further comprising a step of cutting out the target protein from the fusion protein.
  • the method for producing a target protein according to (19).
  • the fusion protein is expressed in a host, wherein the host is a bacterium, a yeast, an animal cell, a plant cell, an insect cell, an animal individual, a plant individual or an insect individual. (19) to (26) The method for producing a target protein according to any one of the above.
  • the molecular protein is a chaperonin, and 5 to 10 cell mouth ninth stubs are assembled in a ring to form a protein mouth ring, and the target protein is (19) to (29), which are housed inside the sash opening nin ring 3.
  • the method for producing a target protein according to 1.
  • (31) An intin partial sequence protein comprising 20 to 120 amino acid residues from the C-terminus of intin.
  • the partial sequence protein of intin is a protein having at least 50% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having a peptide cleavage activity (31) ) A partial sequence protein of the intin according to (1).
  • Step 1 of preparing a ligated first fusion protein, wherein a molecular chaperone or a submit thereof is ligated to one end of the remaining partial sequence protein of the intin with a peptide bond, and to the other end.
  • step 1 Is obtained in step 1 by the step 2 of preparing a second fusion protein in which the second precursor of the target protein is linked by a peptide bond, and the function of cleaving the partial sequence protein of the intin and the remaining partial sequence protein of the intin.
  • step 3 of cutting out the first precursor of the target protein from the first fusion protein thus obtained, and further cutting out a second precursor of the target protein from the second fusion protein obtained in the step 2;
  • a step 4 of assembling a second precursor of the target protein is
  • a partial sequence protein of intin is linked to one end of the molecular chaperone, and the remaining partial sequence protein of the intin is linked to the other end via a peptide bond;
  • the target protein first precursor and the target protein second precursor are cut out by the function of cleaving the protein and the remaining partial sequence protein of the intin, and the partial sequence protein of the intin and the remaining partial sequence protein of the intin are cut out.
  • a method for producing a target protein comprising assembling a first precursor of a target protein and a second precursor of a target protein by an assembly function.
  • the target protein even if the target protein is difficult to be expressed by ordinary gene recombination techniques, it can be expressed as a part of the fusion protein. Furthermore, the target protein is easily and safely cut out by the action of an intervening protein having peptide bond cleavage activity contained in the fusion protein.
  • the molecular weight of the fusion protein of the molecular chaperone and the target protein can be reduced. Therefore, the fusion protein can be more easily expressed by gene recombination technology. be able to.
  • the partial sequence protein of intin can be expressed by a genetic recombination technique.
  • a gene encoding a fusion protein of a target protein and an intervening protein having a molecular chaperone and peptide bond cleavage activity can be prepared only by introducing a gene of the target protein,
  • the gene of the fusion protein can be easily introduced into a host.
  • the gene for the partial sequence protein of intin can be easily introduced into the host.
  • a fusion protein of a target protein and an intervening protein having a molecular chaperone and peptide 'bond cleavage activity can be produced.
  • a partial protein of intin can be produced.
  • FIG. 1 is a block diagram showing a main part of an expression vector pETDH (TCP] 3) 4 I .
  • (TCPj3) 4 is a gene coding for a conjugate of the i3 subunit 4 of Spermonin
  • S sp I is a gene coding for intin
  • 6 His is a gene coding for 6 histidine residues
  • the end is Shows the stop codon.
  • FIG. 2 is a photograph showing the results of western blotting analysis of the supernatant of the disrupted cells obtained in Example 1 and Comparative Example 1 using an antibody that recognizes an antibody light chain.
  • FIG. 3 (a) is a photograph showing the result of Western blot analysis of the supernatant of the disrupted cells obtained in Example 2 using an antibody that recognizes the hepatitis C virus core antigen.
  • FIG. 3 (b) is a photograph showing the results of Western blot analysis of the supernatant of the disrupted cells obtained in Comparative Example 2 using an antibody that recognizes the hepatitis C virus core antigen.
  • FIG 4 is a block diagram showing a main part of an expression vector pT (Gr oEL) 7 I.
  • (GroEL) 7 is a gene encoding a Gro EL subunit 7 linkage
  • NS sp I is a gene encoding an intin sequence modified so that only the N-terminus can be cleaved
  • FLA G is FLA The gene encoding the G peptide, and the end indicates the stop codon.
  • FIG. 5 shows the results of Western blotting analysis using the anti-FLA G peptide antibody for the cell disrupted supernatants obtained in Example 3 and Comparative Example 3 (1: the bacterial cells of Comparative Example 3).
  • Fig. 2 is a photograph showing a disrupted supernatant (2: supernatant of disrupted cells of Example 3).
  • FIG. 6 is a block diagram showing a main part of the expression vector pET TPP Iase I.
  • TPP Iase represents a gene encoding a TPP Iase sequence
  • Ssp I represents a gene encoding intin
  • 6His represents a gene encoding 6 histidine residues
  • the end represents a termination codon.
  • Fig. 7 shows the results of ⁇ ⁇ ⁇ -estane blotting analysis using the histidine-recognizing antibody on the bacterial cell supernatant obtained in Example 4 and Comparative Example 4. ⁇ , 2: Photograph showing the supernatant of the disrupted cells of Comparative Example 4, and 3: GFP-6His standard product.
  • Fig. 8 shows the results of Western blotting analysis in Example 5 and Comparative Example 5 (1: control without SspI gene, control by solid butter, 2: supernatant of cell lysate from Example 5). 3: Photograph showing the cell supernatant of Comparative Example 5).
  • FIG. 9 shows the results of SDS-PAGEZCBB analysis in Example 5 and Comparative Example 5 (1: the supernatant of the disrupted cell of Comparative Example 5, the fraction of the FLAG column purified from the supernatant of the disrupted cell of Comparative Example 5, 3 is a photograph showing a control using a vector not containing the SspI gene and 4: a FLAG column purified fraction of the control using a vector not containing the SspI gene.
  • FIG. 10 is a photograph showing the results of estan blotting analysis in Example 6 and Comparative Example 6 (1: the supernatant of the disrupted cells of Comparative Example 6, 2: the supernatant of the disrupted cells of Example 6).
  • Example 7 Western blotting analysis results in Example 7 and Comparative Example 7 (1: GFP-6His standard, 2: Cell disruption supernatant of Example 7; 3: Cell disruption supernatant of Comparative Example 7) It is a photograph showing Qing.
  • FIG. 12 is a configuration diagram showing a main part of the expression vector pETDH (TCP / 3) 4 I-2.
  • (TCP) 4 is a gene encoding a 4-chaperone subunit linked product
  • SspI is a gene encoding intin
  • 6His is a gene encoding 6 histidine residues
  • the end is a stop codon.
  • FIG. 13 is a configuration diagram showing a main part of the expression vector pETDH (TCP 3) 4 MMI-2.
  • (TCP) 3) 4 is a gene encoding a 4-linked chaperone subunit
  • MMI is a gene encoding MMI
  • 6His is a gene encoding 6 histidine residues
  • the end is a stop codon.
  • Fig. 14 shows the results of Western blotting analysis of the supernatant of the cell lysate obtained in Example 8 and Comparative Example 8 (1: the pETDH (TCP i3) 4 MM I 'AbL_2-introduced cell lysate of Example 8).
  • Fig. 15 (a) is a photograph showing the results of analysis of SDS-PAGE and CBB staining of the cell lithotripsy supernatant obtained in Example 9 (1: the cell lysate supernatant of Example 9). It is.
  • Fig. 15 (b) shows the results of analysis of the cell lithotripsy supernatant obtained in Comparative Example 9 by SDS-PAGE and CBB staining (2: the bacterial cell crushed supernatant of Comparative Example 9; 3: host cell disruption supernatant).
  • FIG. 16 is a photograph showing a result of Western blotting analysis of Example 9 (1: a supernatant of cell disruption of Example 9, 2: a supernatant of host disruption).
  • FIG. 17 is a configuration diagram showing a main part of the expression vector pGEX MMI.
  • GST indicates a gene encoding daltathione-S-transferase
  • MMI indicates a gene encoding MMI
  • 6His indicates a gene encoding six histidine residues
  • the end indicates a termination codon. .
  • FIG. 18 shows the results of western blotting analysis of the supernatant of the cell lysate obtained in Example 10 and Comparative Example 10 (1: the cell supernatant of Example 10-1; 2: the example 10-2).
  • 7 is a photograph showing a cell crushed supernatant (3: cell crushed supernatant of Comparative Example 10).
  • FIG. 19 is a block diagram showing a main part of the expression vector pET TPP ISE MMI.
  • TPP ISE represents a gene encoding TPP ISE
  • MMI represents a gene encoding MMI
  • 6His represents a gene encoding six histidine residues
  • the termination codon is a codon for the coding of a gene encoding six histidine residues.
  • FIG. 20 shows the results of Western blotting analysis in Example 11 and Comparative Example 11 (1: GFP-6His standard, 2: Cell disrupted supernatant of Comparative Example 11-1, 3: Cell bacterium of Example 11).
  • 4 is a photograph showing a cell homogenate supernatant, 4: the cell homogenate supernatant of Comparative Example 1-2.
  • the fusion protein of the present invention comprises an intervening protein having peptide bond cleavage activity, a molecular protein, and a target protein.
  • the target protein can be obtained by cutting out the target protein from the fusion protein by the action of an intervening protein having peptide bond cleavage activity.
  • Intermediate proteins that have peptide bond-cleaving activity include those that act on other proteins, such as proteases, to cleave peptide bonds in the protein, and those that are themselves, such as intin. Both those that act and autocatalytically cleave peptide bonds are included.
  • Examples of the intervening protein having peptide bond cleavage activity contained in the fusion protein of the present invention include protease, intin, hedgehog protein, and self-splicing protein.
  • Intin is a protein splicing protein found in eukaryotes, archaea, and eubacteria.
  • the intervening protein having the peptide bond-cleaving activity constituting the fusion protein of the present invention is intin
  • the fusion protein is cleaved by the autocatalytic action of intin, and the target protein is cut out.
  • Natural intin has the activity of cleaving its own N-terminal and C-terminal peptide bonds, and has the activity of connecting the cleaved ends with peptide bonds.
  • the intein for constructing the fusion protein of the present invention is preferably a modified intin having only peptide bond cleavage activity and lacking the activity of connecting the both ends of the cleavage by peptide bonds.
  • the modified intin can be obtained by substituting a part of the amino acid residue of the natural intin. For example, by modifying the N-terminal cysteine of natural intin to alanine, a modified intin having no C-terminal cleavage activity but only C-terminal cleavage activity (hereinafter, referred to as "C-intin”) Can be obtained.
  • C-intin a modified intin having no C-terminal cleavage activity but only C-terminal cleavage activity
  • ⁇ -rhintin a modified intin having no N-terminal cleavage activity without C-terminal cleavage activity (hereinafter referred to as ⁇ -rhintin) Can be obtained.
  • ⁇ -rhintin N-terminal cleavage activity without C-terminal cleavage activity
  • Examples of the origin of intin for constructing the fusion protein of the present invention include, for example, Syn echocystissp. 0 [in the case of 'Cyanocteria Synocystitis p. Examples include My cobacteri um xenopi G yrase A inine), S acchar omy cescerevisiae (S acchar omy cescerevisiaevacuolar membrane ATP intin) and the like.
  • Syn echocystiss p. PCC6803 strain DnaBhe1 icase The cleavage activity is maintained even if the central domain having the protease activity is deleted and modified to include only the N-terminal domain and the C-terminal domain.
  • any intin other than those listed here can be employed as an intervening protein having peptide-cleaving activity that constitutes the fusion protein of the present invention, as long as it has peptide-bond-cleaving activity. Confuse.
  • C intin (hereinafter, referred to as “SspI”) in which the N-terminal amino acid is replaced with alanine except for the endonuclease region of Synechnocystissp.
  • PC strain 680 strain DnaBhe1 icase intin The amino acid sequence corresponding to the base sequence of the encoded gene is shown in SEQ ID NO: 3, and only the corresponding amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 4.
  • the intervening protein having peptide bond cleavage activity may not be full-length intin but may be a partial sequence protein of intin and may have the same activity as full-length intin.
  • the partial sequence protein of intin in the fusion protein of the present invention is selected from the group of proteins consisting of 20 to 120 amino acid residues from the C-terminus of intin. These partial proteins of the intin have the same protein splicing function as the full-length intin, and have the activity of cleaving the C-terminal peptide bond of itself.
  • the protein consisting of 20 to 120 amino acid residues from the C-terminus of the amino acid sequence of Ssp I represented by SEQ ID NO: 4 has the same functions as the full-length S sp I, Applies to the fusion protein of the present invention. More preferably, a protein consisting of 48 amino acid residues from the C-terminus of the amino acid sequence of SspI represented by SEQ ID NO: 4 (hereinafter referred to as “MMI”), the fusion protein of the present invention It is suitable as a component of.
  • the amino acid sequence of MMI is shown in SEQ ID NO: 32.
  • a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32 has been deleted, substituted, added or inserted, and having peptide cleavage activity is also suitable as a component of the fusion protein of the present invention.
  • a protein having at least 60% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32 preferably a protein with 80% or more homology, more preferably a 90% or more homology.
  • the partial sequence protein of intin other than the above examples has peptide bond cleavage activity, it can be a component of the fusion protein of the present invention.
  • examples of the gene encoding MMI include an isolated DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 31.
  • a DNA that can hybridize to the DNA shown in SEQ ID NO: 31 under stringent conditions and encodes a protein having a peptide cleavage activity encodes a protein substantially identical to MMI.
  • the hybridizable DNA means a DNA detected by using a certain DNA as a probe and using a colony hybridization method, a plaque hybridization method or a Southern blot hybridization method, or the like. I do.
  • the stringent conditions are as follows: 0.1 XSSC solution (1X concentration of SSC solution is 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate), 1% SDS, 65 ° C, 24 hours Say. DNA that hybridizes under these conditions is DNA substantially identical to the MMI gene shown in SEQ ID NO: 31. Hybridization is based on Molecular 'Cloning 2nd Edition, Current Procalls' in Molecular Biology, DNACloning 1: Core Technich, AP ractica 1 Ap proach, This can be performed according to the method described in S econd Edition, O ford University (1995) and the like.
  • the intervening protein having a peptide bond cleavage activity is other than intin, for example, in the case of a protease, an amino acid sequence recognized by the protease is inserted between the protease and the target protein, whereby the action of the protease
  • the fusion protein can be cleaved.
  • the hedgehog protein is an extracellular secretory signal transmitter of Drosophila and has the activity of cleaving peptide bonds for its own processing.
  • This hedgehog protein is also a fusion protein of the present invention. Can make up proteins.
  • the protease ⁇ hedgehog protein also Not only those but also partial proteins having the same activity can constitute the fusion protein of the present invention.
  • the term “protease ⁇ hedgehog protein” also includes a protein having a partial sequence protein having an activity similar to that of a full-length natural protein.
  • the target protein constituting the fusion protein of the present invention is not particularly limited, and is a disease-related gene product derived from a higher animal such as a human or a mouse, or any of a group of enzymes effective for a chemical process, or the disease-related gene product.
  • useful proteins such as enzymes. Specifically, coat proteins, core proteins, proteases, reverse transcriptases, integrases encoded by pathogenic viral genomes such as hepatitis B virus, hepatitis C virus, HIV, influenza virus, and coronavirus And other proteins (viral antigens).
  • proteins serving as antibodies against these pathogenic viruses heavy chains of mammalian antibodies, light chains of mammalian antibodies, constant regions of mammalian antibodies, Fv region single-chain antibodies of mammalian antibodies (sc FV ) Or a partial protein thereof having 6 or more residues, Fab (antigen-binding fragment), (Fab ') 2 fragment, CH1-CH2-CH3 fragment, CH1-CH2 fragment, CH2-CH3 fragment, CH1 fragment, CH2 fragment, CH3 fragment, 'CL fragment, and therapeutic / diagnostic antibody which is a complete antibody type.
  • G protein-coupled receptors G protein-coupled receptors
  • platelet growth factor blood stem cell growth factor
  • hepatocyte growth factor transforming growth factor
  • nerve growth and nutrition factor fibroblast growth factor
  • Growth factors such as insulin-like growth factor; tumor necrosis factor, interferon, erythropoietin, condyle granulocyte colony stimulating factor, macrophage colony stimulating factor, granulocyte macrophage colony stimulating factor, interleukin 3 and interleukin 5 Cytolein such as interleukin, ⁇ / levumin, human growth hormone, and the like.
  • a green fluorescent protein (hereinafter, referred to as "GFP") which can be used as a fluorescent label of a functional protein in a cell to observe a phenomenon in a living cell can be mentioned.
  • GFP green fluorescent protein
  • an artificial protein obtained by linking two or more proteins selected from these proteins can also be applied as the target protein constituting the fusion protein of the present invention.
  • the molecular chaperone or its subunit constituting the fusion protein of the present invention is not particularly limited, as long as it has an action of assisting protein folding. You. Examples thereof include shanin, which is a complex of a plurality of shanin subunits, and beptidyl prolyl cis trans isomerase (hereinafter, referred to as PPIase).
  • shanin which is a complex of a plurality of shanin subunits
  • PPIase beptidyl prolyl cis trans isomerase
  • the molecular chaperone includes a molecular chaperone that acts as a single molecule and a molecular chaperone that forms a complex composed of a plurality of subunits.
  • the fusion protein of the present invention includes the former molecular chaperone, the molecular protein of the single molecule is linked to the intervening protein.
  • the latter contains a molecular chaperone, the subunit is linked to the intervening protein.
  • An example of the former is PP ISE, and an example of the latter is Shakonin.
  • Sharpen is a complex of about 1 to about 20 subunits of about 60 kDa (chadronin subunits). Sharp nin is also known as a type of heat shock protein induced by applying stress such as heat shock to cells. Chaperone port Nin, bacteria (e.g., E. coli, etc.), Archaea (e.g., Th e rmo coccuss p. N Py rococcusorikoshil ⁇ Ae ropyrumpernix etc.) and eukaryotic (e.g., yeast, mouse, human, etc.) All such It has functions of supporting protein folding and preventing degeneration.
  • bacteria e.g., E. coli, etc.
  • Archaea e.g., Th e rmo coccuss p. N Py rococcusorikoshil ⁇ Ae ropyrumpernix etc.
  • eukaryotic e.g., yeast, mouse, human, etc. All such It has
  • An artificial protein in which a plurality of sugar mouth subunits are connected in series via peptide bonds also forms a complex in the same manner as natural sugar mouth subunits. It is known to form. At this time, it is known that from 2 to about 10 sap mouth ninth subunits have a linear or ring-like structure (hereinafter, also referred to as sham mouth nin ring) as in the case of natural sap mouth nin. ing.
  • a chaperonin supplement that is not linked via a peptide bond to another sharonin subunit is referred to as a “single sharonin subunit”. Unit.
  • the target protein is the N-terminal of a single Shah Nin Subunit or a Shah Nin Subunit conjugate, the C terminal of a single Shah Nin Subunit or a Sharonin Subunit conjugate, a Shah mouth It is linked to one or more sites selected from the linking portion of the ninsubunit linked bodies between the chaperonin subunits via an intervening protein having peptide bond cleavage activity.
  • the target protein is a cavity composed of a plurality of spore ninth subunits, ie, one layer or It is preferable to select a binding site of the target protein so that it is stored inside two or more layers of the scallop nin ring.
  • Shaguchinin which is an example of a molecular chaperone that constitutes the fusion protein of the present invention, has a two-layered ring structure composed of 10 to 20 sugar mouth subunits, that is, 5 to 10 sharonins. What forms a two-layer structure in which the sub-unit shunt mouth rings are non-covalently associated via the ring surface (hereinafter, the two-layer ring structure is also referred to as a chaperonin complex) It is suitable.
  • Escherichia coli Shaguchinin GroEL having a cavity (cavity) having an inner diameter of 4.5 nm and a height of 14.5 nm is suitable.
  • the fusion protein When using Shakonin as a molecular chaperone, it is preferable to configure the fusion protein such that the target protein is housed inside the Shakonin ring.
  • chaperonin derived from bacteria or archaebacteria can be easily expressed in a host, and is therefore particularly suitable for producing the fusion protein of the present invention.
  • not only wild-type but also amino acid mutants can be used as the above-mentioned porphyrin as long as the ability to self-assemble into a ring structure is maintained.
  • the stored target protein can be more easily recovered.
  • expression of Shanin nin subunit derived from the same bacteria as the host often increases the expression level. As a result, the production efficiency of the target protein is often improved.
  • the number of Shakonin nin subunits constituting Shakonin varies depending on the organism from which it is derived.
  • the number of subunits is usually seven in bacterial mouthnin from bacteria.
  • the number is usually 8 to 9 for archaea-derived Shakonin, and usually 8 for eukaryotic Shanin. Therefore, the optimal number of scharinnin submits of the chaperonin constituting the fusion protein of the present invention can be selected depending on its origin.
  • the ratio of the number of Shaunjun unit for forming a ring structure to the target protein is usually 1: 1 to 10: 1, and preferably 1: 1 :! to 9: 1.
  • the ratio of the number of spore mouth ninsubunits is larger than 10: 1, the actual production amount of the target protein to be expressed decreases, and it becomes difficult to form the ring structure of the spore mouth ninsubunit.
  • the sperm nin subunit the target protein is used because of the low structural formation of the speromin complex.
  • the ratio of the numbers is preferably 1: 1 or 7: 1.
  • the scherichia coli nin subunit is composed of: The ratio of the numbers is preferably 1: 1, 2: 1, 4: 1 or 8: 1.
  • PPIase is one of the protein folding factors involved in protein folding. Among amino acids in the target protein that is undergoing intracellular folding, PPIase binds to the N-terminal peptide bond of the proline residue. It has the activity of catalyzing the trans isomerization reaction (PPase activity).
  • PPlase is classified into three types, FK506BindngProtein type (FKBP type), cyclophilin type, and perpurin type, based on its sensitivity to the inhibitor.
  • FKBP type FK506BindngProtein type
  • Cyclophilin-type PPlase is PPlase or a homologue thereof that is sensitive to another immunosuppressant, cyclosporin.
  • parbulin-type PPlase does not show sensitivity to any immunoinhibitors, and its activity is inhibited by juglone (jug1one).
  • juglone jug1one
  • the PPIase constituting the fusion protein of the present invention is not particularly limited, and any of the above three types of PPIases may be used.
  • the FKBP-type PPIase include archaebacterial-derived FKBP-type PPIase, trigger factor one type PPIase (Hu ang, Protein Sci., Vol. 9, p. 1254, 2000), F kp A type PPI ase (Arie, MoI. Microbiol., Vol. 39, p. 199, 2001), FKBP 52 type PPI ase (Bose, Science, Vol. 274, p. 1715, 1996).
  • cyclophilin-type PPIase include CyP40-type PPIase (Pirkl, J.
  • examples of the purpurin-type PPIase include SurA-type PPIase (Behrens, EMBO J., p. 20, p. 285, 2001).
  • these PPases have very similar amino acid sequences.
  • Molecular chaperone activity is an activity that was originally found in a protein chaperone known as one of the molecular chaperones and the DnaDnaJ / GrpE protein folding system. These serve to support the polypeptide synthesized in the cell so that it is folded into the correct shape. At that time, it requires the addition of high-energy substances such as ATP; On the other hand, the archaeon-derived FKBP-type PPlase differs in that it does not require the above-mentioned high-energy substance hydrolysis reaction when exerting its molecular chaperone activity. Archaeal origin! ⁇ type? Iase is particularly suitable as a PPIase that constitutes the fusion protein of the present invention because it can fold the target protein more correctly than PPIase without molecular chaperone activity.
  • any PP Iase having the molecular chaperone activity in the present invention can be suitably used.
  • the method for producing a target protein of the present invention is a method for cleaving a fusion protein by the action of an intervening protein having a peptide bond-cleaving activity, such as intin, and excising the target protein from the S-mating protein. More specifically, a step of isolating the fusion protein, a step of inducing a peptide bond cleavage activity of an intervening protein having peptide bond cleavage activity contained in the isolated fusion protein, and a step of having peptide bond cleavage activity Cleaving a part of the fusion protein by the action of the intervening protein, cutting out the target protein from the fusion protein and releasing it.
  • an intervening protein having a peptide bond-cleaving activity such as intin
  • a target protein that is insoluble or the like by itself is subjected to molecular shaping.
  • the protein can be expressed as a normal protein by the action of the protein, and the target protein can be cut out without adding protease or the like.
  • the expression of the fusion protein may be performed in a host or a cell-free translation system. .
  • the gene of the fusion protein is introduced into the host.
  • a gene encoding the fusion protein is introduced into an appropriate vector to construct an expression vector, and then introduced into an appropriate host to obtain a transformant.
  • the transformant is cultured to express the fusion protein, and the fusion protein is isolated from the transformant.
  • the fusion protein is expressed in a cell-free translation system, fusion is performed in a reaction mixture containing a nucleotide-free phosphate or various amino acids in a cell-free extract of, for example, Escherichia coli, wheat germ, or egret reticulocytes. The protein can be expressed.
  • the isolated fusion protein is subjected to a treatment for inducing the peptide cleavage activity of the intervening protein, and the target protein is cut out from the fusion protein and released.
  • the treatment for inducing the peptide cleavage activity of the intervening protein include pH control, temperature control, and addition of a trigger substance if the intervening protein is intin.
  • the peptide bond cleavage activity of intin can be induced by changing the hydrogen ion concentration so that the pH is in the range of 6 to 8, preferably around 7. Further, by changing the temperature so as to be in the range of 20 to 37 ° C., the peptide bond cleavage activity of intin can be induced.
  • thiol such as dithiothreitol or j8-mercaptoethanol
  • the peptide bond cleavage activity of intin can be induced.
  • thiols are effective in inducing N-intin cleavage activity.
  • preventing the peptide bond cleavage activity of intin from being induced before isolating the fusion protein, that is, in the host or in a test tube is also effective in increasing the yield of the target protein.
  • the method include setting the culture temperature of the host at less than 20 ° C and performing cell-free protein synthesis at less than 20 ° C.
  • peptide bond cleavage activity can be induced by controlling the optimal buffer conditions, temperature, pH, etc., depending on the type of protease. ,
  • the host for expressing the gene encoding the fusion protein in the host is not particularly limited, and includes, for example, bacterium such as Escherichia coli, other prokaryotic cells, yeast, insect cells, cultured mammalian cells, cultured plant cells, and the like. ⁇ Transgenic animals and plants.
  • Pacteria such as Escherichia coli and yeast are particularly preferable because they have a high cell proliferation characteristic, the culturing operation is simple, and the cost of nutrient sources used for culturing is low.
  • the fusion protein may be expressed either in the host cytoplasm or extracellularly, but if it is to be expressed in large amounts, it is more preferable to express it in the cell.
  • the expression level can be prevented from decreasing by means for co-expressing the fusion protein in the same host.
  • the same gene that synthesizes the same fusion protein is introduced into vectors such as two types of plasmids having different replication regions and drug resistance genes, and these two types are used in the presence of two types of drugs.
  • two different plasmids capable of coexisting and replicating a gene encoding a fusion protein and a gene encoding only a molecular chaperone in the same host are used. And may be co-expressed in the same host. For example, when the number ratio of the Shanin nin subunit to the target protein is small, the gene encoding the fusion protein and the gene encoding only the Shanin nin subunit can coexist and replicate in the same host. It is advisable to introduce two types of plasmids to co-express the fusion protein and the ninja ninsubunit.
  • the partial sequence protein of intin and the remaining protein obtained by removing the partial sequence protein from the full-length intin are so-called trans-splicing (WuH).
  • WH trans-splicing
  • the partial protein of intin and the residual protein of intin have a function of assembling two types of proteins (assembly function). Using this assembly function, two types of target proteins can be assembled. For example, two types of proteins When it is a precursor of a target protein, the target protein can be produced by assembling / reassembling these precursors.
  • the target protein is immunoglobulin and the precursor is an antibody light chain and an antibody heavy chain
  • the first example is that the C-terminal partial sequence protein of intin is placed at the c-terminal of the molecular chain.
  • a fusion protein in which the antibody heavy chains are linked via the is prepared. Then, the two fusion proteins are brought close to each other to cause assembly, and an immunoglobulin in which an antibody heavy chain and an antibody light chain are linked by a disulfide bond can be produced.
  • the antibody heavy chain is linked to the C-terminus of the molecular chaperone via the C-terminal partial sequence protein of intin
  • the residual protein of intin is linked to the N-terminal of the molecular chaperone.
  • the antibody heavy chain and the antibody light chain are assembled using one function of intin assembly, and an immunoglobulin in which the antibody heavy chain and the antibody light chain are linked by a disulfide bond can be produced.
  • the residual protein of the intin may contain an end nuclease active portion. Examples-Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
  • SEQ ID NO: 3 shows the amino acid sequence corresponding to the nucleotide sequence
  • SEQ ID NO: 4 shows only the amino acid sequence.
  • S spl is a modified intin in which the N-terminal amino acid is substituted with alanine except for the endonuclease region of the DnaBhel1 icase intin derived from the Cyanobacteria Synechocystissp PCC 6803 strain.
  • Genome D from Th e rmo c o c c u s KS— 1 strain JCM No. 11816
  • TCP3 4 a gene of a TCP] 34 ligated product
  • oligonucleotides having complementary nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 36 and 37 were synthesized, and annealed to obtain double-stranded DNA having a multiple cloning site.
  • This double-stranded DNA encodes a histidine tag (6His, SEQ ID NO: 8) consisting of 6 residues of histidine downstream of the NcoI, BamHI, Spel, and Hpal sites. Gene, a stop codon and a NotI site.
  • this double-stranded DNA was introduced into the NcoI-NotI site of the pET21d plasmid (Novagen).
  • the (TCP) 4 gene isolated in this example was introduced into the BamHI site of this plasmid to construct pETDH (TCP j3) 4 . Furthermore, the SspI gene isolated in this example was inserted downstream of the (TCPi3) 4 gene of pETDH (TCP j3) 4 to construct the expression vector pETDH (TCPi3) 4 I.
  • FIG. 1 shows the structure of a p ETDH (TCP j3) 4 I . That is, pE TDH (TCP j3) 4 I has a T7 promoter, and the (TCPi3) 4 gene, the Sspl gene, and the 6HIs gene are arranged downstream thereof. Further, by a child inserts a stop codon to a gene encoding a desired protein between the p ETDH (TCP] 3) 4 I S pe I Sa I doo and Hp a I sites, having 6H IS to C-terminus, A vector that expresses a fusion protein of (TCP / 3) 4 , SspI, and a target protein can be constructed.
  • the DNA fragment containing the light chain (AbL) gene of the human anti-HBs (hepatitis B virus surface protein) antibody shown in SEQ ID NO: 9 was prepared by synthesizing long chain DNA.
  • the DNA fragment had a Spe I site at the 5 'end and a Hpa An I site has been set up.
  • This DNA fragment was treated with S pe I and H pa I, were incorporated into expression previously treated with the same restriction enzymes downy compactors p ETDH (TCP ⁇ ) 4 I .
  • an expression vector p ETDH (TCP i3) 4 I ′ Ab L for synthesizing a fusion protein of (TCP; 3) 4 , S sp I and Ab L was constructed.
  • the resulting expression vector p ETDH the (TCP i3) 4 I '1 ) tooth was introduced into E. coli 81 ⁇ 2 1 (DE 3) strain (S tratagene Co.), to obtain a transformant.
  • the cells were suspended in 5 OmM Tris HC1 buffer 0.2 mM EDTA ( ⁇ 70 ⁇ 0), and the cells were disrupted by ultrasonic treatment in the presence of protease inhibitors (Nakarai Testa). Thereafter, the supernatant of the cell lysate was obtained by centrifugation.
  • FIG. 3 (a) (Example 2) and FIG. 3 (b) (Comparative Example 2).
  • lane 1 is the sample of Example 2
  • lane 2 is a control using only the host.
  • Lane 3 in FIG. 3B is the sample of Comparative Example 2.
  • HCc was detected at a molecular weight of about 21 kDa, and HCc was cut out from the fusion protein without degradation. confirmed.
  • Fig. 3 (b) in the cell lysate of Comparative Example 2, signals were detected around 18 kDa, 15 kDa and around 12 kDa in addition to the signal around 21 kDa in molecular weight. c turned out to be: ⁇ ⁇ . This is because HCc has particularly high hydrophobicity, and the strictness of the recognition sequence by the limited-degrading protease is lost. It is probable that a break occurred inside C.
  • PCR was carried out using pTWINl (New England Bio 1 abs) as type I, oligonucleotides shown in SEQ ID NOS: 12 and 13 as primers, and modified so that only the N-terminal shown in SEQ ID NO: 6 could be cleaved.
  • a DNA fragment containing a gene encoding spI (hereinafter, referred to as “NS spI”) was isolated.
  • NS sp I is a modified intin (N intin) in which the C-terminal amino acid is substituted with alanine except for the endonuclease region of the Dna Bhe1 icasse intin derived from the cyanobacterium Synecstispssp PCC 6803 strain.
  • Genomic DNA was extracted from E. coli HMS 174 (DE3) strain (Novagen). Using this genomic DNA as type III, PCR was carried out using the oligonucleotides shown in SEQ ID NOS: 15 and 16 as primers, and a DNA fragment containing the Gro EL subunit gene shown in SEQ ID NO: 17 was isolated. On the other hand, oligonucleotides having base sequences complementary to each other as shown in SEQ ID NOs: 38 and 39 were synthesized, and annealed to obtain double-stranded DNA having a multicloning site.
  • NcoI, XbaI, Bg1II, and XhoI sites are arranged in order, and a gene encoding the FLAG peptide (SEQ ID NO: 18) and the downstream are located downstream. Has codons.
  • this double-stranded DNA was introduced into the NcoI-HindIII site of plasmid pTrc99A (Amersham Bioscience). Furthermore, the DNA fragment containing the Glo EL subunit gene amplified above was introduced into the introduced XbaI site.
  • the gene of a 7-fold Glo EL subunit in which seven Glo EL subunit genes are linked in tandem (hereinafter, referred to as “(GroEL) 7 ”) is inserted.
  • PT (GroEL) 7 was constructed.
  • Figure 4 shows the pT (Gr o EL) of 7 NI structure.
  • pT (GroEL) 7 NI has a trc promoter, and 7 Gr o
  • the gene of the Gro EL subunit 7-fold ((Gro EL) 7 ) gene in which the EL subunit genes are arranged in tandem, the NS sp I gene, and the gene encoding the FLAG peptide are arranged in this order.
  • a fusion protein of (GroEL) 7 , NSspI and the target protein should be expressed by inserting a gene encoding the target protein between the Bg1II site and the XhoI site. Can be built.
  • a DNA fragment containing the acetylcholine musculin force receptor (MR) gene shown in SEQ ID NO: 19 was isolated by long-chain DNA synthesis. Incorporating the DNA fragment between pT (Gr oEL) 7 NI B g 1 II ⁇ Pi Xh o I site. As a result, an expression vector pT (Gro EL) 7 NI ⁇ ⁇ R for synthesizing a fusion protein of (GroEL) 7 , NS sp I, and MR was constructed. Using PT (GroEL) 7 NI'MR, perform the transformation and culture of the transformant in the same manner as in Example 1 except that the culture temperature is 25 ° C. Obtained.
  • the supernatant of the bacterial cell clot was purified with a column carrying an anti-FLAG peptide antibody, and dithiothreitol (DTT) at a final concentration of 4 OmM was added to cleave the N-terminal peptide bond of NSspI.
  • DTT dithiothreitol
  • Western blotting using an anti-FLAG peptide antibody was performed. The result is shown in lane 2 in Fig. 5.
  • Example 3 After 4 hours of purification of the supernatant obtained in Example 3 using the FLAG peptide antibody-carrying capacity column, Western blotting using an anti-FLAG peptide antibody was performed without adding DTT. . The results are shown in lane 1 in FIG. In Example 3, a signal of the fusion protein of NS sp I and MR was detected at a molecular weight of around 52 kDa, confirming that MR was excised from the fusion protein (lane 2). On the other hand, in Comparative Example 3, no signal near the molecular weight of 52 kDa was detected, and it was confirmed that MR was not cut out from the fusion protein (lane 1). Thus, the cleavage activity of intin was triggered by DTT. (Example 4) 1. Construction of a fusion protein expression system with PPI ase
  • Genomic DNA was extracted from ThermococcusKS-1 strain (JCM No. 11816). Using this genomic DNA as type III, PCR was performed using the oligonucleotides shown in SEQ ID NOS: 20 and 21 as primers, and contained the PTPase (TPP Iase) gene derived from the hyperthermophilic archaea shown in SEQ ID NO: 22 The DNA fragment was isolated.
  • PTPase TPP Iase
  • PETDH (TCP) 4 ⁇ I prepared in Example 1 was treated with BamHI and NotI to isolate a DNA fragment containing the SspI gene, the His tag and the stop codon.
  • an oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 35 and an oligonucleotide having a nucleotide sequence complementary thereto were synthesized and annealed to obtain a double-stranded DNA fragment.
  • This double-stranded DNA fragment was introduced into the NcoI site of pET21d plasmid (Novagen).
  • the DNA fragment containing the TP PIase gene amplified in this example was inserted into the NcoI_SpEl site contained in the introduced DNA fragment.
  • FIG. 6 shows the structure of pETTPPase I. That is, pETPPPIase I has a T7 promoter, and a TPPIase gene, an SspI gene, and a 6His gene are arranged downstream thereof in this order.
  • GFP green fluorescent protein
  • GFP WT (Roche Diagnostics) was type III, PCR was performed using the primers of SEQ ID NOS: 23 and 24 as a primer, and the green fluorescent protein represented by SEQ ID NO: 25 was obtained.
  • a DNA fragment containing the (GFP) gene was isolated. The DNA fragment was provided with a SpeI site at the 5 and terminus and an HpaI site at the 3 and terminus, respectively, from the primer. This DNA fragment was treated with SpeI and HpaI and incorporated into an expression vector PETTPPaseI, which had been treated with the same restriction enzymes in advance. As a result, it is possible to obtain PP Iase (TPP Iase) derived from hyperthermophilic archaea.
  • An expression vector pETTPPIaseI ⁇ GFP for synthesizing a fusion protein of SspI and GFP was constructed.
  • the resulting expression vector pETTPPIaseIGFP was introduced into E. coli strain BL21 (DE3) to obtain a transformant.
  • 25. Transformants in 2X ⁇ . ⁇ medium containing carbenicillin (100 ⁇ g ZmL). C, and cultured for 24 hours to express a fusion protein of TPPIase, Ssppl, and GFP.
  • the cells were suspended in 50 mM Tris / HC1 buffer (pH 7.0), disrupted by sonication in the presence of a protease inhibitor cocktail, and then centrifuged. The supernatant was obtained. (Comparative Example 4)
  • pET TP PIase I shown in Fig. 1
  • pET was introduced between the BamHI site and the SpeI site, instead of the gene encoding SspI, a gene encoding a recognition sequence for precision protease was introduced.
  • TPP Iase P was constructed.
  • Example 4 In the cell lysate of Example 4 (lane 1), GFP was detected at a molecular weight of around 27 kDa, and it was confirmed that GFP was excised from the fusion protein.
  • the signal in the vicinity of 62 kDa in lane 1 is a fusion protein of TPPIase, Sspl, and GFP.
  • lane 2 On the other hand, in the cell lysate of Comparative Example 4 (lane 2), a signal was detected only around the molecular weight of 45 kDa of the fusion protein of TPPIase and GFP, and GFP excision was not confirmed.
  • Lane 3 is a sample of GFP. (Example 5) 1. Expression and cleavage of endothelin receptor
  • pT (GroEL) 7 I was constructed in the same manner as in Example 3 at around jl.
  • pT (Gr oEL) 7 I is a vector incorporating the S sp I gene in place of the NS sp I gene pT (Gr oEL) 7 NI shown in FIG.
  • the human cDNA library (Takarabay Saisha) was type III, PCR was performed using the oligonucleotides shown in SEQ ID NOs: 26 and 27 as primers, and the endoselin A receptor (ETAR) shown in SEQ ID NO: 28 was obtained. A DNA fragment containing the gene was isolated.
  • the supernatant of the cell lysate was purified using a column carrying an anti-FLAG peptide antibody, and the presence or absence of cleavage of the C-terminal peptide bond of SspI was determined by using an anti-FLAG peptide antibody (SI GMA anti-FLAG M 2 monoclonal antibody). The results are shown in lane 2 in FIG.
  • the culture was carried out in the same manner as in Example 5 except that the culture temperature of the transformant of Example 5 was changed to 25 ° C. instead of 18 ° C., and a supernatant of the disrupted bacterial cells was obtained.
  • the supernatant of the cell lysate was purified by a column carrying an anti-FLAG peptide antibody, and the presence or absence of cleavage of the C-terminal peptide bond of SspI was confirmed by Western blotting using an anti-FLAG peptide antibody.
  • the results are shown in lane 3 in FIG.
  • an ETAR signal was detected at a molecular weight of around 42 kDa, confirming that ETAR was cut out from the fusion protein (lane 2).
  • Lane 1 is a control using a vector that does not contain the SspI ⁇ gene. Further, the fraction obtained by purifying the supernatant of the disrupted cells obtained in Comparative Example 5 using a column carrying an anti-FLAG peptide antibody was subjected to SDS-PAGE and CBB staining to confirm the presence or absence of a band. As a control, SDS-PAGE was also performed on the fraction that had been similarly cultured, disrupted, and purified of the fusion protein of SET-free (Gro EL) 7 and ETAR.
  • Figure 9 shows the results.
  • lane 1 is the supernatant of the disrupted bacterial cell obtained in Comparative Example 5
  • lane 2 is the FLAG column-purified fraction of the supernatant
  • lane 3 is the supernatant of the disrupted bacterial cell of the control
  • lane 4 is This is the FLAG column purified fraction of the supernatant.
  • the fusion protein of Ssp I-free (GroEL) 7 and ETAR a band was detected in the fraction purified by the anti-FLAG peptide antibody-bearing column (lane 4).
  • Example 5 a DNA fragment containing the endothelin A receptor (ETAR) gene shown in SEQ ID NO: 28 was isolated.
  • EDR endothelin A receptor
  • the supernatant of the cell lysate was purified using an anti-FLAG peptide antibody-supporting column, and DTT at a final concentration of 40 mM was added to cleave the N-terminal peptide bond of NSspI.
  • the result of stamp lotting using an anti-FLAG peptide antibody is shown in lane 2 of FIG. (Comparative Example 6)
  • the supernatant of the cell lysate of Example 6 was purified using a FLAG peptide antibody-supporting column, and the result of Western blotting using an anti-FLAG peptide antibody without adding DTT was used. Shown in the cell homogenate of Example 6, the signal of the fusion protein of NS sp I and ETAR was detected at a molecular weight of around 59 kDa, confirming that ETAR was cut out from the fusion protein (lane 2). On the other hand, in the cell lysate of Comparative Example 6, no signal near the molecular weight of 59 kDa was detected, and it was confirmed that ETAR was not cut out from the fusion protein (lane 1). Thus, the intact cleavage activity was triggered by DTT.
  • Protein synthesis was carried out in the same manner as in Example 4 except that cell-free protein expression (using Roche Diagnostics RTS 500) was performed instead of culturing E. coli.
  • Protein synthesis was performed in the same manner as in Comparative Example 4 except that cell-free protein expression (using Roche Diagnostics RTS 500) was performed instead of culturing E. coli.
  • the reaction solution after protein synthesis prepared in Example 7 and Comparative Example 7 was purified by Ni-NTA agarose gel (Qiagen) and treated at room temperature for 2 hours.
  • Western blotting analysis was performed using a Nore antibody (Santa Cruz Biotechnology) to examine whether GFP was cleaved from TPP Iase. The results are shown in FIG. Lane 1 is the control with GFP-6His.
  • PCR was performed using p TWI N1 (New England Bio 1 abs) as a type III, oligonucleotides shown in SEQ ID NOs: 29 and 30 as primers, and MM, which is the C-terminal partial sequence of SspI
  • SEQ ID NO: 31 shows the amino acid sequence corresponding to the nucleotide sequence
  • SEQ ID NO: 32 shows only the amino acid sequence. That is, MMI corresponds to the portion from the C-terminus of S sp I to the 48th amino acid.
  • oligonucleotides represented by SEQ ID NOS: 40 and 41 Two types of oligonucleotides represented by SEQ ID NOS: 40 and 41 were synthesized, and annealed to prepare a double-stranded DNA encoding 6His.
  • the double-stranded DN A was introduced into N co I site upstream of Example 1 with the prepared expression vector p ETDH (TCP ⁇ ) on 4 I of (TCP) 4 gene, the expression vector p ETDH (TCP ⁇ 4 ) I-2 was constructed. Shows the structure of a p ETDH (TCP j3) 4 I- 2 1 2.
  • p ETDH (TCP j8) 4 I _ 2 has a T 7 promoter, downstream thereof, 6H IS gene, (TCP) 4 gene, and S S p I gene are arranged in this order. Further, by inserting a gene encoding a desired protein between the p ETDH (TC P j3) 4 1 _ 2 of S pe I site and Hp a I sites, with the H IS tag at the N-terminus, (TCP ; 8) A vector that expresses a fusion protein of 4 , SspI, and a target protein can be constructed.
  • p ETDH instead of (TCP j3) 4 I- 2 of S sp I, was constructed MM I gene introduced expression vector p ETDH (TCP j3) 4 MM I _ 2.
  • Figure 13 shows the configuration of p ETDH (TCP j8) 4 MMI-2. That is, the configuration of the p ETDH (TCP j8) 4 MM I- 2 is substantially the same as p ETDH (TCP ⁇ ) 4 I- 2, only in that S sp I gene is replaced by a MM I gene are different.
  • the resulting expression vectors p ETDH (TCP ⁇ ) 4 I Ab L_ 2 and p ETDH (T CP j3) 4 MMI 'Ab L-2 were each introduced into E. coli strain BL 21 (DE 3) to form Transformant was obtained. These transformants were cultured in a 2XY.T. medium containing carbenicillin (100 / g / mL) at 30 ° C for 24 hours, and (TCP jS) 4 , SspI and AbL And a fusion protein of (TCP) 4 with MMI and Ab L was expressed.
  • Example 8 p ETDH (TCP) 3) 4 MMI ′ Ab L—2 (lane 1) and p ETDH (TCP jS) 4 I
  • the molecular weight was detected around 25 kDa, and it was confirmed that AbL was excised from each fusion protein.
  • the band around 250 kDa is the fusion protein of (TCP i3) 4 with MMI and Ab L (lane 1) or the fusion protein of (TCP ⁇ ) 4 with S s ⁇ I and Ab L (lane 2).
  • Comparative Example 8 In (lane 3) the molecular weight was detected only around 250 kDa, and Ab L was not excised from each fusion protein.
  • the signal intensities of lane 1 and lane 2 were compared, they were almost the same. That is, the activity of cleaving the target protein was comparable between MMI and SspI.
  • the resulting expression vector p ETDH the (TC P] 3) 4 MM I ⁇ A b H- 2 was introduced into E. coli BL 2 1 (DE 3) strain to obtain a transformant.
  • the transformant was cultured in a 2XY.II. medium containing carbenicillin (100 ⁇ g / mL) at 30 ° C for 24 hours, and a fusion protein of (TCP 3) 4 with MMI and AbH Was expressed.
  • the cells were collected, suspended in 50 mM Tris / HCl buffer, 0.2 mM EDTA (pH 7.0), and disrupted by sonication in the presence of protease inhibitor. The supernatant of the cell suspension was obtained by centrifugation.
  • Comparative Example 9 On the other hand, in lane 2 (Comparative Example 9), a very thin band was formed around 300 kDa, and no force was detected. That is, the expression level of Comparative Example 9 was considerably lower than that of Example 9. As described above, when the target protein is AbH of about 50 kDa, in the fusion protein of (TCP i3) 4 prepared in Comparative Example 9, SspI and AbH, SspI and AbH It was considered that expression did not occur or the expression level decreased drastically because it could not fit into the mouth cavity. On the other hand, when the partial sequence MMI was introduced instead of SspI as in Example 9, the fusion protein could be expressed without any particular problem. This was thought to be due to the fact that MMI and Ab H fit into the Shaw Nin's cavity.
  • the supernatant of the cell lysate from the expression vector pETDH (TCP ⁇ ) 4 MMI ⁇ AbH obtained in Example 9 was treated at room temperature for 2 hours to cut out AbH from the fusion protein.
  • AbH is excised from the fusion protein by Western blotting analysis using an antibody that recognizes the antibody heavy chain (PI ERCE Goat anti-human IgG F (ab ') 2 antibody _HRP conjugate) I checked my strength.
  • the results are shown in FIG. As a result, a signal was detected at a molecular weight of around 50 kDa, confirming that AbH was excised from the fusion protein.
  • the band at around 290 kDa is a fusion protein of MMI and AbH, a TCP tetramer of Siaguchinin subunit.
  • a fusion protein expression system with daltathione-S-transferase (GST) pGEX-4T-1 vector B commercially available from Amersham Pharmaremacio Biotech
  • the double-stranded DNA shown in SEQ ID NO: 34 was inserted into the amHI-NotI site, and the Spell site, HpaI site and 6His gene were introduced. Further, the MMI gene obtained in Example 8 was introduced between the BamHI site and the SpeI site.
  • This expression vector was named pGEX MMI.
  • Figure 17 shows the configuration of p GEX MMI. That is, pGEX MMI has a tac promoter, and a GST gene, an MMI gene, and a 6His gene are arranged downstream thereof in this order. Then, by inserting the gene of the target protein between the Spel site and the Hpal site, a vector that expresses a fusion protein of GST, MMI and the target protein can be constructed. 2. Expression and cleavage of GFP
  • pI VEX2.3-GFP WT vector (Roche's Diagnostics) was used as type I, PCR was performed using the oligonucleotides shown in SEQ ID NOS: 23 and 24 as primers, and the GFP gene shown in SEQ ID NO: 25 was obtained. The containing DNA fragment was isolated. The DNA fragment was provided with an SpeI site at the 5 'end and an HpaI site at the 3' end, respectively, derived from the primers. This DNA fragment was inserted between the SpeI and HpaI sites of pGEXMMI constructed in this example. As a result, an expression vector pGEX MMI'GFP for synthesizing a fusion protein of GST, MMI and GFP was constructed. Similarly, an expression vector pGEXI ⁇ GFP into which the S spI gene prepared in Example 1 was introduced instead of the MMI gene was constructed.
  • pGEX MMI • GFP (Example 10-1) and pGEX I-GFP (Example 10-1) were each introduced into E. coli BL21 (DE3) strain to obtain a transformant. These transformants were cultured in a 2XY.T. medium containing carbenicillin (100 ⁇ g / mL) at 25 ° C for 24 hours, and a fusion protein of GST, SspI and GFP, and GST The fusion protein of MMI and GFP was expressed. The cells were collected, suspended in 50 mM TrisZHCl buffer (pH 7.0), disrupted by sonication in the presence of a protease inhibitor cocktail, and centrifuged. The supernatant of the cell suspension was obtained.
  • TrisZHCl buffer pH 7.0
  • pGEXP was constructed in which a gene encoding a recognition sequence for precision protease was introduced between the BamHI site and the SpeI site instead of the gene encoding MMI. Then, except that pGEXP was used instead of pGEX MMI, the expression vector was constructed, transformed, and the transformant was cultured in the same manner as in Example 10. Got.
  • Each of the bacterial cell lithotriptor night supernatants prepared in Example 10 and Comparative Example 10 was purified by Ni-NT A agarose gel (Qiagen) and treated at room temperature for 2 hours, and the histidine tag was added.
  • Plasmid pETTPPPaseMMI in which the MMI gene was inserted in place of the SspI gene, from pETTPPPaseaseI prepared in Example 4, was constructed (FIG. 19).
  • the DNA fragment containing the GFP gene shown in SEQ ID NO: 25 prepared in Example 10 was treated with SpeI and HpaI, and incorporated into an expression vector pETTPPIaseMMI treated with the same restriction enzymes.
  • an expression vector pET TPPIase MMI • GFP for synthesizing a fusion protein of TPPIase, MMI and GFP was constructed.
  • Cell-free protein expression (using Roche Diagnostics RTS 500) was performed on the resulting expression vector pET TPP ISE MMI 'GFP.
  • PET TPP Iase I constructed in Example 4 was used (Comparative Example 11-1). Furthermore, pET TPP Iase P was constructed between the BamHI site and Spe I site of pET TPP Iase MMI, which is a gene encoding a recognition sequence of a precision protease instead of MMI (Comparative Example 11). I 2). Protein synthesis was carried out in the same manner as in Example 11 except that pET TPP Iase MMI • GFP was changed to pET TPP Iase I • 0 or pET TPP Iase P • GFP.
  • Example 11 Each of the reaction solutions prepared in Example 11 and Comparative Example 11 was purified by Ni-NTA agarose gel (manufactured by QIAGEN) and treated at room temperature for 2 hours, and an anti-GFP mouse monoclonal antibody (Santa Cr) Perform estamplotting analysis using uz Biotec hnology) to determine whether GFP is cleaved from TPP Iase. The force was tested. The results are shown in FIG. In pET TPP Iase MMI • GFP of Example 11 (lane 3), GFP was observed at a molecular weight of around 27 kDa, confirming that GFP was cleaved from TPP Iase.
  • the signal near 50 kDa is a fusion protein of TPPIas6, ⁇ : 1 ⁇ 1, and GFP.
  • GFP was observed at a molecular weight of around 27 kDa, confirming that GFP was cleaved from TPP Iase.
  • the signal around 62 kDa is a fusion protein of TPPIase, SspI and GFP.

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Abstract

　通常の遺伝子組換え技術によっては発現が難しい蛋白質であっても、効率的に正常型蛋白質として目的蛋白質を得ることができる技術を提供することを課題とする。　分子シャペロンとペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質と目的蛋白質との融合蛋白質を調製し、該融合蛋白質から該ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の作用によって目的蛋白質を切り出す。ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の例として、インテイン及びその部分配列蛋白質が挙げられる。

Description

目的蛋白質の製造方法、 融合蛋白質及びその遺伝子、 インティンの部分配列蛋白質及び その遺伝子、 発現ベクター、 並びに形質転換体 技術分野
本発明は、 目的蛋白質の製造方法、 融合蛋白質及びその遺伝子、 インティンの部分配 列蛋白質及ぴその遺伝子、 発現ベクター、 並びに形質転換体に関する。 さらに詳細には 、 本発明は、 分子シャペロンとペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質と目的蛋白質 との融合蛋白質から該介在蛋白質の作用によって目的蛋白質を切り出す目的蛋白質の製 造方法、 該融合蛋白質及びその遺伝子、 ペプチド結合切断活性を有するインティンの部 分配列蛋白質及びその遺伝子、 発現ベクター、 並びに形質転換体に関する。 本発明によ れば、 通常の遺伝子組換え技術によっては発現が難しい蛋白質であっても、 効率的に正 常型蛋白質として目的蛋白質を得ることができる。 背景技術
これまでにバクテリア、 酵母、 昆虫、 動植物細胞又はトランスジエニック動植物など の多くの宿主における蛋白質発現系、 さらに無細胞翻訳系など、 種々の蛋白質発現系が 開発されている。 特に近年、 種々の生物でのゲノムが次々と解読され、 遺伝子から組換 え蛋白質を生産し解析するニーズは益々高まっている。 しかしながら、 目的とする全て の蛋白質がこれらの蛋白質発現系で容易に得られるわけではない。 例えば、 宿主に対す る毒性を有する蛋白質、 不溶化しやすい蛋白質などは、 依然として組換え蛋白質として 得ることが困難である。 具体的には、 目的蛋白質が宿主に対して毒性を有する場合、 宿 主内においてその蛋白質の合成が抑制され、 発現量が低下することがある。 また、 発現 した目的蛋白質が正しく折り畳まれず、 目的蛋白質が間違つた立体構造を有する異常型 蛋白質としてし力得られない場合がある。 特に、 異常型蛋白質は封入体と呼ばれる不溶 性の凝集体を形成することが多い。 そして、 いったん封入体となった異常型蛋白質を折 り畳み直して正常型蛋白質とすることは非常に困難であり、 成功しないことが多レ、。 目的蛋白質が封入体を形成しないようにする方法としては、 目的蛋白質をグルタチォ ン一 S—トランスフェラーゼ （G S T)、 チォレドキシン、マルトース結合蛋白質等との 融合蛋白質として発現させる方法が提案されている。 し力、し、 この方法では、 封入体の 形成を高効率で解消することは難しい （例えば、 スミス 'ディ ·ビ （Smi t h, D. B.) ら、 ジーン （Ge n e)、 1988年、 第 67卷、 p. 31—40)。 一方、 蛋白質 の折り畳み反応を支援する蛋白質である分子シャペロンの作用によって、 目的蛋白質を 正しい立体構造を有する正常型蛋白質として発現させる試みもある。 例えば、 目的蛋白 質を分子シャペロンと宿主内で共発現させ、 その分子シャペロンの作用によって目的蛋 白質を正常型蛋白質として発現させる方法もある。 し力 し、 この方法においても正常型 蛋白質として得られる目的蛋白質の量を飛躍的に增カ卩させるには至っていない （二シハ ラ (N i s h i h a r a) ら、 アプライド ·アンド ·ェンビ口メンタル ·ミクロバイオ 口シー. {A p p l i e a a n d e nv i r o nme n t a l mi c r o b i o l o g y), 1998年、 第 64卷、 p. 1694— 1699)。
分子シャペロンの作用を利用する別の方法として、 分子シャペロンの一種であるシャ ぺロニンのサブュニット同士を連結したシャぺ口ニンサブュニット連結体を利用する試 みもある。 すなわち、 目的蛋白質を 1〜20個のシャぺ口ニンサブユニットが直列に連 結されたシャぺ口ニンサブユニット連結体との融合蛋白質を作製して利用する。 この際 、 目的蛋白質は天然のシャぺ口ニンと複合体を形成するのと同様に、 シャぺ口ニンの立 体構造内部に格納される。 その結果、 目的蛋白質は正しく折り畳まれた正常型蛋白質と して得られやすくなり、 封入体の形成を抑制することができる。 さらに、 目的蛋白質が 宿主に対する毒性を有する場合でも、 シャぺ口ニンの内部に格納されているので毒性を 抑えることができる。 さらに、 宿主由来のプロテアーゼによる攻撃から目的蛋白質を守 ることもできる （WO02Z052029 A1参照）。 すなわち、 この方法によると、 宿主に対する毒性を有する種々のウィルス 、 種々の抗体、 7回膜貫通型受容体 （G 蛋白質共役型受容体)、 あるいはサイトカイン類などを発現することが可能である。 この方法では、 従来の GST、 チォレドキシン、 マルトース結合蛋白質などの融合蛋 白質で用いられている方法と同様に、 S虫合蛋白質から目的蛋白質を切り出す必要がある 。 具体的には、 融合蛋白質に限定分解型プロテアーゼを作用させて、 目的蛋白質を切り 出す。 すなわち、 目的蛋白質とシャぺ口ニンサブユニット連結体の間に限定分角 ¥型プロ テアーゼの認識配列をあらかじめ含めておき、 当該プロテアーゼを作用させて目的蛋白 質を切り出す。 なお、 限定分解型プロテアーゼとして、 トロンビン、 FX a (活性型血 液第 X因子）、 ェンテロカイネース、 プレシジョンプロテアーゼなどが用いられている。 しかしながら、 この方法では、 目的蛋白質の' I·生質によっては、 目的蛋白質自体がプロ テアーゼで^^されてしまうことがある。 例えば、 目的蛋白質が c型肝炎ウィルス抗原 の場合は、 その疎水性が高いため、 限定分解型プロテアーゼの認識配列の厳密性が崩れ 、 認識配列以外の部分が切断されて c型肝炎ウィルス抗原自体が^^されてしまう。 そ の他の疎水性が高！、領域、 膜貫通領域などをもつ蛋白質にぉレ、ても同様の問題がある。 また、 プロテアーゼの切断効率は目的蛋白質の種類によって異なる。 したがって、 こ の方法では、 目的蛋白質の種類によってはプロテアーゼが効かず、 目的蛋白質を切り出 すことができない場合がある。 この切断効率の違いは、 限定分解型プロテアーゼが切断 部位に接近し認識配列を切断する際の、 限定分解型プロテアーゼの入り込みやすさ、 接 近しやすさの違いに起因するものと考えられる。 さらに、 この方法では、 切り出した目 的蛋白質を精製する際に、 添加した限定分解型プロテアーゼを除去する必要がある。 し たがって、 目的蛋白質の精製が煩雑となるという問題点も有している。 発明の開示
本発明の目的は、 分子シャペロンとペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質と目的 蛋白質との融合蛋白質及びその遺伝子、 該融合蛋白質から該介在蛋白質の作用によって 目的蛋白質を切り出す目的蛋白質の製造方法、 ぺプチド結合切断活性を有するィンティ ンの部分配列蛋白質及びその遺伝子、 発現ベクター、 並びに形質転換体を提供すること にある。
本発明者らは、 鋭意研究の結果、 インティンに代表されるペプチド結合切断活性を有 する蛋白質と、 分子シャペロンとを組み合わせることにより、 通常の遺伝子組換え技術 によっては発現が難しい蛋白質であっても、 効率的に正常型蛋白質として製造すること ができることを見出した。 さらに、 本製造方法に有用な、 分子シャペロンとペプチド結 合切断活性を有する介在蛋白質と目的蛋白質との融合蛋白質を単離した。 さらに、 ぺプ チド結合切断活性を有するインティンの部分配列蛋白質を単離した。 さらに、 それらを コードする遺伝子を単離し、 該遺伝子を含有する発現ベクター及び該発現ベクターを含 有する形質転換体を単離し、 本発明を完成した。
すなわち、 本発明の要旨は以下の通りである。
( 1 ) ぺプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の一方の末端には分子シャぺ口ン又 はそのサブュニットをぺプチド結合で連結させ、 且つ、 他方の末端には目的蛋白質をぺ プチド結合で連結させたことを特徴とする融合蛋白質。
(2) 分子シャペロンが、 複数のシャぺ口ニンサブユニットからなるシャぺ口-ンで あることを特徴とする （1) に記載の融合蛋白質。
(3) ぺプチド結合切断活性を有する介在蛋白質が、 単独のシャぺロニンサブュニッ ト、 又はシャぺ口ニンサブユニット連結体に連結されており、 前記シャぺ口ニンサブュ ニット連結体は、 2〜10個のシャぺロニンサブュニットがぺプチド結合を介して直列 に連結したものであることを特徴とする （2) に記載の融合蛋白質。
(4) ぺプチド結合切断活性を有する介在蛋白質が、 単独のシャぺ口ニンサブュニッ ト又はシャぺ口ニンサブュニット連結体の N末端、 単独のシャぺ口-ンサブュニット又 はシャぺ口ニンサブユニット連結体の C末端、 シャぺ口ニンサブユニット連結体のシャ ベロニンサブュニット同士の連結部、 から選択される 1又は 2以上の部位に連結されて いることを特徴とする （3) に記載の融合蛋白質。
(5) シャぺ口-ンサブユニットと目的蛋白質との数の比が 1 ： 1〜10 ： 1である ことを特 ί敷とする （3) 又は （4) に記載の融合蛋白質。
(6) 分子シャぺ口ンがぺプチジルプロリルシストランスイソメラーゼであることを 特徴とする （1) に記載の融合蛋白質。
(7) ぺプチド結合切断活性を有する介在蛋白質が、 ぺプチジルプロリルシストラン スイソメラーゼの Ν末端及び/又は C末端に連結されていることを特徴とする （6) に 記載の融合蛋白質。
(8) 分子シャペロンが、 パクテリア、 古細菌又は真核生物に由来することを特徴と する （1) 〜 （7) のいずれかに記載の融合蛋白質。
( 9 ) ぺプチド結合切断活性を有する介在蛋白質がィンティン又はィンティンの部分 配列蛋白質であることを特徴とする （1) 〜 （8) のいずれかに記載の融合蛋白質。
(10) インティンが、 Ν末端を切断するが C末端を切断しないものであることを特 徴とする （9) に記載の融合蛋白質。
(11) インティンが、 C末端を切断するが Ν末端を切断しないものであること特徴 とする （9) に記載の融合蛋白質。 '
(12) ィンティンの部分配列蛋白質が、 インティンの C末端から 20〜120個の アミノ酸残基からなることを特徴とする （9) に記載の融合蛋白質。
(13) インティンが、 Syn e c ho c y s t i s s p. 由来のものであること を特徴とする （9) 〜 （12) のいずれかに記載の融合蛋白質。
14 ) Λ ンアイン力 My c o b a c t e r i um x e n o p i、 S a c c h a r omy c e s c e r e v i s i a e^ Ha l o b a c t e r i um s p . 力 ら選 択される由来のものであることを特徴とする (9) 〜 (12) のいずれかに記載の融合 蛋白質。
(15) インティンの部分配列蛋白質が、 配列番号 1に示されるアミノ酸配列を有す る蛋白質、 又は配列番号 1において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 付加若 しくは挿入されたアミノ酸配列を有し、 且つぺプチド切断活性を有する蛋白質であるこ とを特徴とする (12) に記載の融合蛋白質。
(16) ィンティンの部分配列蛋白質が、 配列番号 1に示されるァミノ酸配列と少な くとも 50 %以上の相同性を有し、 且つべプチド切断活性を有する蛋白質であることを 特徴とする （12) に記載の融合蛋白質。
(17) ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質がプロテアーゼであることを特徴 とする （1) 〜 （16) のいずれかに記載の融合蛋白質。
(18) 上記 (1) 〜 (17) のいずれかに記載の融合蛋白質をコードする単離され た遺伝子。
(19) 上記 (1) 〜 （17) のいずれ力に記載の融合蛋白質から、 目的蛋白質を、 ぺプチド結 断活性を有する介在蛋白質の作用によって切り出すことを特徴とする目 的蛋白質の製造方法。
(20) 上記 (1) 〜 （17) のいずれかに記載の融合蛋白質を調製する工程と、 前 工程で調製した融合蛋白質に含まれるペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質のぺプ チド結^ 0断活性を惹起する工程と、 前工程でぺプチド結合切断活性を惹起したべプチ ド結合切断活性を有する介在蛋白質の作用により、 融合蛋白質の一部を切断し、 融合蛋 白質から目的蛋白質を切り出して遊離させる工程とを含むことを特徴とする （19) に 記載の目的蛋白質の製造方法。
(21) 前記融合蛋白質を 20〜37°Cの温度に曝すことにより前記ペプチド結合切 断活性を惹起することを特徴とする （20) に記載の目的蛋白質の製造方法。
(22) 前記融合蛋白質を pH6〜8の水素イオン濃度に曝すことにより前記べプチ ド結合切断活性を惹起することを特徴とする （20) 又は （21) に記載の目的蛋白質 の製造方法。 (23) チオールを添加することにより前記べプチド結合切断活性を惹起することを 特徴とする （20) 〜 （22) のいずれかに目的蛋白質の製造方法。
(24) 前記融合蛋白質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを作製するェ 程と、 前工程で得られた発現ベクターを宿主に導入して該融合蛋白質を発現する工程と 、 前工程で得られた融合蛋白質から目的蛋白質を切り出す工程とを含むことを特徴とす る （ 19 ) に記載の目的蛋白質の製造方法。
(25) 同一宿主内で共存'複製可能な 2種の異なるプラスミドに、 前記融合蛋白質 をコードする遺伝子を組み込んで 2種類の発現ベクターを作製する工程と、 前工程で得 られた 2種類の発現ベクターを同一宿主に導入し、 該融合蛋白質を発現させる工程と、 前工程で得られた融合蛋白質から、 ぺプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の作用で 目的蛋白質を切り出す工程とを含むことを特徴とする （19) に記載の目的蛋白質の製 造方法。
(26) 同一宿主内で共存 ·複製可能な 2種の異なるプラスミドの、 一方に前記融合 蛋白質をコードする遺伝子を組み込み、 他方に分子シャぺ口ンのみをコードする遺伝子 を組み込んで、 2種類の発現ベクターを作製する工程と、 前工程で得られた 2種類の発 現べクターを同一宿主に導入し、 該融合蛋白質と該分子シャぺ口ンを発現させる工程と 、 前工程で得られた融合蛋白質から、 ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の作用 で目的蛋白質を切り出す工程を含むことを特徴とする （19) に記載の目的蛋白質の製 造方法。
(27) 宿主は、 バクテリア、 酵母、 動物細胞、 植物細胞、 昆虫細胞、 動物個体、 植 物個体又は昆虫個体であることを特徴とする （24) 〜 (26) のいずれかに記載の目 的蛋白質の製造方法。
(28) 宿主内で融合蛋白質を発現させ、 前記宿主はパクテリア、 酵母、 動物細胞、 植物細胞、 昆虫細胞、 動物個体、 植物個体又は昆虫個体であることを特徴とする （19 ) 〜 （26) のいずれかに記載の目的蛋白質の製造方法。
(29) 無細胞翻訳系で行うことを特徴とする （19) に記載の目的蛋白質の製造方 法。
(30) 分子シャぺ口ンがシャぺロニンであり、 5〜10個のシャぺ口ニンサプュ二 ットがリング状に集合してシャぺ口ニンリングを形成しており、 前記目的蛋白質は、 該 シャぺ口ニンリングの内部に収納されていることを特徴とする （19) 〜 （29) のい ずれ力、に記載の目的蛋白質の製造方法。
(31) インティンの C末端から 20〜120個のアミノ酸残基からなることを特徴 とするィンティンの部分配列蛋白質。
(32) インティンが、 Syn e c h o c y s t i s s p. 由来のものであること を特徴とする （31) に記載のインティンの部分配列蛋白質。
(33 ィンァィン力4、 My c o b a c t e r i um x e n o p i、 S a c c h a r omy c e s c e r e v i s i a e^ Ha l o b a c t e r i um s p. 力 択される由来のものであることを特徴とする （31) に記載のインティンの部分配列蛋 白質。
(34) インティンの部分配列蛋白質が、 配列番号 1に示されるアミノ酸配列を有す る蛋白質、 又は配列番号 1において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 付加若 しくは揷入されたアミノ酸配列を有し、 且つべプチド切断活性を有する蛋白質であるこ とを特敷とする （31) に記載のインティンの部分配列蛋白質。
(35) ィンティンの部分配列蛋白質が、 配列番号 1に示されるァミノ酸配列と少な くとも 50 %以上の相同性を有し、 且つべプチド切断活性を有する蛋白質であることを 特徴とする （31) に記載のインティンの部分配列蛋白質。
(36) 上記 （31) 〜 （35) のいずれかに記載のインティンの部分配列蛋白質を コードする単離された遺伝子。
(37) 上記 （18) 又は （36) に記載の遺伝子を含有する発現ベクター。
(38) 上記 （37) に記載の発現ベクターを含有する形質転換体。
(39) ィンティンの部分酉 S列蛋白質の一方の末端には分子シャぺ口ン又はそのサブ ユニットをペプチド結合で連結させ、 且つ、 他方の末端には目的蛋白質第 1前駆体をべ プチド結合で連結させた第 1の融合蛋白質を作製する工程 1と、 該ィンティンの残余の 部分配列蛋白質の一方の末端には分子シャペロン又はそのサブュ-ットをペプチド結合 で連結させ、 且つ、 他方の末端には目的蛋白質第 2前駆体をペプチド結合で連結させた 第 2の融合蛋白質を作製する工程 2と、 インティンの部分配列蛋白質と該インティンの 残余の部分配列蛋白質の切断機能により、 工程 1で得られた第 1の融合蛋白質から目的 蛋白質第 1前駆体を切り出し、 さらに工程 2で得られた第 2の融合蛋白質から目的蛋白 質第 2前駆体を切り出す工程 3と、 ィンティンの部分配列蛋白質と該ィンティンの残余 の部分配列蛋白質のアセンブリー機能により、 工程 3で得られた目的蛋白質第 1前駆体 と目的蛋白質第 2前駆体をアセンブルする工程 4とを含むことを特徴とする目的蛋白質 の製造方法。
(4 0 ) 分子シャペロンの一方の末端にインティンの部分配列蛋白質、 他方の末端に 該ィンティンの残余の部分配列蛋白質がぺプチド結合を介して連結され、 さらに該ィン ティンの部分配列蛋白質に目的蛋白質第 1前駆体がぺプチド結合を介して連結され、 且 っ該ィンティンの残余の部分配列蛋白質に目的蛋白質第 2前駆体がぺプチド結合を介し て連結された融合蛋白質から、 ィンティンの部分配列蛋白質と該ィンティンの残余の部 分配列蛋白質の切断機能により、 目的蛋白質第 1前駆体及び目的蛋白質第 2前駆体を切 り出し、 さらにィンティンの部分配列蛋白質と該ィンティンの残余の部分配列蛋白質の ァセンブリ一機能により、 目的蛋白質第 1前駆体と目的蛋白質第 2前駆体をァセンブル することを特徴とする目的蛋白質の製造方法。
( 4 1 ) 前記融合蛋白質を宿主内で発現させることを特徴とする （3 9 ) 又は （4 0 ) に記載の目的蛋白質の製造方法。
( 4 2 ) 前記宿主が、 パクテリア、 酵母、 動物細胞、 植物細胞、 昆虫細胞、 動物個体 、 植物個体又は昆虫個体であることを特徴とする （4 1 ) に記載の融合蛋白質の製造方 法。
( 4 3 ) 無細胞翻訳系で行うことを特徴とする （3 9 ) 又は （4 0 ) に記載の目的蛋 白質の製造方法。 本発明の目的蛋白質の製造方法によれば、 通常の遺伝子組換え技術によっては発現が 難しい目的蛋白質であっても、 効率的に正常型蛋白質として目的蛋白質を得ることがで きる。 さらに、 融合蛋白質から目的蛋白質を切り出す際においても、 より簡便且つ安全 に目的蛋白質を切り出すことができる。
本発明の融合蛋白質によれば、 通常の遺伝子組換え技術によつては発現が難しい目的 蛋白質であっても、 融合蛋白質の一部として発現することができる。 さらに、 融合蛋白 質に含まれるぺプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の作用によって、 目的蛋白質が 簡便且つ安全に切り出される。
本発明のィンティンの部分配列蛋白質によれば、 天然のィンティンに比べて分子量が 小さいので、 分子シャペロンと目的蛋白質との融合蛋白質の分子量を小さくすることが できる。 したがって、 遺伝子組み換え技術により該融合蛋白質をより容易に発現させる ことができる。
本発明のィンティンの部分配列蛋白質の遺伝子によれば、 遺伝子組み換え技術により ィンティンの部分配列蛋白質を発現することができる。
本発明のベクターによれば、 目的蛋白質の遗伝子を導入するだけで、 分子シャペロン とぺプチド結合切断活性を有する介在蛋白質と目的蛋白質との融合蛋白質をコードする 遺伝子を作製することができ、 容易に該融合蛋白質の遺伝子を宿主に導入することがで きる。 また、 本癸明のベクターによれば、 ィンティンの部分配列蛋白質の遣伝子を容易 に宿主に導入することができる。
本発明の形質転換体によれば、 分子シャペロンとぺプチド'結合切断活性を有する介在 蛋白質と目的蛋白質との融合蛋白質を製造することができる。 また、 本発明の形質転換 体によれば、 ィンティンの部分配列蛋白質を製造することができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 発現ベクター pETDH (TCP ]3) 4 Iの主要部を示す構成図である。 図 中、 （TCPj3) 4はシャぺ口ニン i3サブユニット 4連結体をコードする遺伝子、 S s p Iはィンティンをコ一ドする遺伝子、 6 H i sはヒスチジン 6残基をコードする遺伝子 、 終は終止コドンを示す。
図 2は、 実施例 1及び比較例 1で得た菌体破砕上清についての、 抗体軽鎖を認識する 抗体を用いたウェスタンプロッティング解析結果を示す写真である。
図 3 (a) は、 実施例 2で得た菌体破碎上清についての、 C型肝炎ウィルスコア抗原 を認識する抗体を用いたウェスタンプロッティング解析結果を示す写真である。
図 3 (b) は、 比較例 2で得た菌体破砕上清についての、 C型肝炎ウィルスコア抗原 を認識する抗体を用いたウェスタンプロッティング解析結果を示す写真である。
図 4は、 発現ベクター pT (Gr oEL) 7 Iの主要部を示す構成図である。 図中、 （ Gr oEL) 7は G r o E Lサブユニット 7連結体をコードする遺伝子、 N S s p Iは N末端のみが切断できるよう改変してあるィンティン配列をコードする遺伝子、 F LA Gは F LA Gぺプチドをコ一ドする遺伝子、 終は終止コドンを示す。
図 5は、 実施例 3及ぴ比較例 3で得た菌体破碎上清につ!/、ての、 抗 FLA Gぺプチド 抗体を用いたウェスタンブロッティング解析結果 ( 1 ：比較例 3の菌体破碎上清、 2 ： 実施例 3の菌体破碎上清） を示す写真である。 図 6は、 発現ベクター pET TPP I a s e Iの主要部を示す構成図である。 図中 、 TPP I a s eは TPP I a s e配列コードする遺伝子を、 S s p Iはィンティンを コードする遺伝子、 6H i sはヒスチジン 6残基をコードする遺伝子、 終は終止コドン を示す。
図 7は、 実施例 4及ぴ比較例 4で得た菌体破称上清についての、 ヒスチジンを認識す る抗体を用いたゥエスタンブロッティング解析結果 ( 1 ：実施例 4の菌体破碎上淸、 2 ：比較例 4の菌体破砕上清、 3 ： GFP-6H i s標準品） を示す写真である。
図 8は、 実施例 5及ぴ比較例 5におけるウェスタンブロッテイング解析結果 (1 ： S s p I遣伝子を含まなレ、ベタターによるコント口ール、 2 ：実施例 5の菌体破砕上清、 3 ：比較例 5の菌体破碎上清） を示す写真である。
図 9は、 実施例 5及ぴ比較例 5における SDS— PAGEZCBB解析結果 （1 ：比 較例 5の菌体破砕上清、 2 ：比較例 5の菌体破碎上清の F L A Gカラム精製画分、 3 ： S s p I遺伝子を含まないベクターによるコントロール、 4 ： S s p I遺伝子を含まな いベクターによるコント口ールの F L A Gカラム精製画分） を示す写真である。
図 10は、 実施例 6及び比較例 6におけるゥエスタンブロッティング解析結果 ( 1 ： 比較例 6の菌体破碎上清、 2 ：実施例 6の菌体破砕上清） を示す写真である。
図 11、 実施例 7及ぴ比較例 7におけるウェスタンブロッテイング解析結果 (1 ： G FP-6H i s標準品、 2 ：実施例 7の菌体破碎上清、 3 ：比較例 7の菌体破砕上清） を示す写真である。
図 12は、 発現ベクター pETDH (TCP/3) 4 I— 2の主要部を示す構成図であ る。図中、 （TCP )4はシャペロン サブユニット 4連結体をコードする遺伝子、 S s p Iはインティンをコードする遺伝子、 6H i sはヒスチジン 6残基をコードする遺伝 子、 終は終止コドンを示す。
図 13は、 発現ベクター pETDH (TCP 3) 4MM I— 2の主要部を示す構成図 である。 図中、 （TCP ]3)4はシャペロン サブユニット 4連結体をコードする遺伝子、 MM Iは MM Iをコードする遺伝子、 6Hi sはヒスチジン 6残基をコードする遺伝子 、 終は終止コドンを示す。
図 14は、 実施例 8及ぴ比較例 8で得られた菌体破碎液上清のウェスタンプロッティ ング解析結果 （1 ：実施例 8の pETDH (TCP i3) 4MM I ' AbL_2導入菌体 破碎上清、 2 ：実施例 8の pETDH (TCP j3) 4 I - Ab L-2導入菌体破砕上清 、 3 ：比較例 8) を示す写真である。
図 15 (a) は、 実施例 9で得られた菌体破石嫌上清を SDS— PAGE、 CBB染 色を行った解析結果 (1 ：実施例 9の菌体破碎上清） を示す写真である。
図 15 ( b ) は、 比較例 9で得られた菌体破石射夜上清を SDS— PAGE、 CBB染 色を行った解析結果 (2 ：比較例 9の菌体石皮砕上清、 3 ：宿主菌体破砕上清） を示す写 真である。
図 16は、 実施例 9のウェスタンブロッテイング解析結果 ( 1 ：実施例 9の菌体破砕 上清、 2 ：宿主菌体破碎上清） を示す写真である。
図 17は、 発現ベクター pGEX MM Iの主要部を示す構成図である。 図中、 GS Tはダルタチオン一 S—トランスフェラーゼをコ一ドする遗伝子、 MM Iは MM Iをコ 一ドする遺伝子、 6H i sはヒスチジン 6残基をコードする遺伝子、 終は終止コドンを 示す。
図 18は、 実施例 10及び比較例 10で得られた菌体破砕液上清ウェスタンブロッテ ィング解析結果 ( 1 ：実施例 10-1の菌体破枠上清、 2 ：実施例 10-2の菌体破砕 上清、 3 ：比較例 10の菌体破碎上清） を示す写真である。
図 19は、 発現ベクター pET TPP I a s e MM Iの主要部を示す構成図である 。 図中、 TPP I a s eは TPP I a s eをコードする遺伝子、 MM Iは MM Iをコー ドする遺伝子、 6H i sはヒスチジン 6残基をコードする遺伝子、 終は終止コドンを示 す。
図 20は、 実施例 11及び比較例 1 1におけるウェスタンブロッティング解析結果 ( 1 ： GFP-6H i s標準品、 2 ：比較例 1 1— 1の菌体破碎上清、 3 ：実施例 1 1の 菌体破砕上清、 4 ：比較例 1 1—2の菌体破砕上清） を示す写真である。 発明を実施するための最良の形態
本発明の融合蛋白質は、 ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質と、 分子シャぺ口 ンと、 目的蛋白質とから構成される。 本発明の融合蛋白質によれば、 ペプチド結合切断 活性を有する介在蛋白質の作用によつて融合蛋白質から目的蛋白質を切り出し、 目的蛋 白質を得ることができる。
ぺプチド結合切断活性を有する介在蛋白質には、 プロテアーゼのように他の蛋白質に 作用してその蛋白質のペプチド結合を切断するものと、 インティンのように自分自身に 作用して自己触媒的にぺプチド結合を切断するものの両方が含まれる。 本発明の融合蛋 白質に含まれるペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の例としては、 プロテアーゼ 、 インティン、 ヘッジホッグ蛋白質、 セルフスプライシング蛋白質等が挙げられる。 ィンティンは真核動物、 古細菌、 真正細菌のすべてで見つかつているプロティンスプ ライシングを行なう蛋白質である。 そして、 本発明の融合蛋白質を構成するペプチド結 合切断活性を有する介在蛋白質がィンティンの場合は、 ィンティンの自己触媒的作用に よってその融合蛋白質が切断され、 目的蛋白質が切り出される。 天然のインティンは、 自分自身の N末端及び C末端のぺプチド結合を切断する活性を持ち、 さらに切断した両 端をぺプチド結合でつなぐ活性を有する。 本発明の融合蛋白質を構成するためのィンテ インは、 ペプチド結合切断活性のみを有し、 切断した両端をペプチド結合でつなぐ活性 を欠失させた改変型インティンであることが好ましい。 すなわち、 このような改変型ィ ンティンを用いることにより、 目的蛋白質と分子シャぺ口ンが再結合することを防ぐこ とができ、 より簡便に融合蛋白質から目的蛋白質を切り出すことができる。 改変型イン ティンは、 天然型ィンティンの一部のァミノ酸残基を置換することにより得ることがで きる。 例えば、 天然型インティンの N末端のシスティンをァラニンに改変することによ り、 N末端の切断活性を有さず C末端の切断活性のみを有する改変型ィンティン (以下 、 「Cインティン」 と称する) を得ることができる。 また、天然型インティンの C末端の ァスパラギンをァラニンに改変することにより、 C末端の切断活性を有さず N末端の切 断活性のみを有する改変型ィンティン (以下、 ΓΝ-rンティン」 と称する) を得ることが できる。 （Ma t hy s Sら、 Ge n e、 1999年、 第 231巻、 p. 1— 13)。 このような改変型インティンによれば、 その両端ともが切断されることはないので、 分 子シャペロンと目的蛋白質が再結合する恐れはない。
本発明の融合蛋白質を構成するためのィンティンの由来としては、 例えば、 Syn e c h o c y s t i s s p . 0 [列えば'、 シァノノ クテリァ Syn e c h o c y s t i s s p. PCC 6803株 D n a B h e 1 i c a s eィンティン）、 My c o b a c t e r i um x e n o p i (例えは、 My c o b a c t e r i um x e n o p i G y r a s e Aィンアイン)、 S a c c h a r omy c e s c e r e v i s i a e (S a c c h a r omy c e s c e r e v i s i a e v a c u o l a r Memb r a n e ATP a s eィンティン） 等が挙げられる。 特に、 Syn e c h o c y s t i s s p. PCC6803株 Dn aB h e 1 i c a s eインティンは、 エンドヌクレア ーゼ活性を有している中央ドメィンを削除して N末端ドメインと C末端ドメィンのみか らなるように改変しても、 切断活性を保持する。 したがって、 そのようにして改変した ィンティンを用いることにより、 他の由来のィンティンに比べて分子量を小さくするこ とができ、 遗伝子組換え手法によつて発現させる際には好都合である。 なお、 ここに挙 げた以外のィンティンであっても、 ぺプチド結合切断活性を有するものであれば、 本発 明の融合蛋白質を構成するぺプチド結^]断活性を有する介在蛋白質として採用可能で める。
ここで、 S y n e c n o c y s t i s s p . P Cじ 6 8 0 株 D n a B h e 1 i c a s eインティンのエンドヌクレアーゼ領域を除き、 N末端のアミノ酸をァラニン に置換した Cインティン （以下、 「S s p I」 と称する。） をコードする遺伝子の塩基配 列と対応するァミノ酸配列を配列番号 3に、 対応するァミノ酸配列のみを配列番号 4に 示す。
また、 本発明の融合蛋白質においては、 ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質は 、 全長のィンティンではなくィンティンの部分配列蛋白質で全長のィンティンと同様の 活性を有するものでもよい。 本発明の融合蛋白質におけるィンティンの部分配列蛋白質 は、 インティンの C末端から 2 0〜1 2 0個のアミノ酸残基からなる蛋白質群から選択 される。 これらのインティンの部分配列蛋白質は、 全長のインティンと同様の蛋白質ス プライシング機能、 自身の C末端のぺプチド結合を切断する活性を有する。
例えば、 配列番号 4で示される S s p Iの、 アミノ酸配列の C末端から 2 0〜 1 2 0 個のアミノ酸残基からなる蛋白質は全長の S s p Iと同様の各機能を有しており、 本発 明の融合蛋白質に適用される。 より好ましくは、 配列番号 4で示される S s p Iの、 了 ミノ酸配列の C末端から 4 8個のアミノ酸残基からなる蛋白質（以下、 「MM I」 と称す る） 、 本発明の融合蛋白質の構成要素として好適である。 MM Iのアミノ酸配列を配 列番号 3 2に示す。 さらに、 配列番号 3 2で示されるァミノ酸配列の 1もしくは数個の アミノ酸が欠失、 置換、 付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、 且つペプチド切 断活性を有する蛋白質、 すなわち、 MM Iと実質同一の蛋白質も、 本発明の融合蛋白質 の構成要素として好適である。 さらに、 配列番号 3 2で示されるアミノ酸配列と少なく とも 6 0 %以上の相同性を有する蛋白質、 好ましくは 8 0 %以上の相同性を有する蛋白 質、 より好ましくは 9 0 %以上の相同性を有する蛋白質、 さらに好ましくは 9 5 %以上 の相同性を有する蛋白質であって、 且つペプチド切断活性を有する蛋白質も、 本発明の 融合蛋白質の構成要素となりうる。 さらに、 上記の例示以外のインティンの部分配列蛋 白質でも、 ペプチド結合切断活性を有するものであれば、 本発明の融合蛋白の構成要素 となりうる。
なお、 上記した MM Iをコードする遺伝子としては、 配列番号 31に示される塩基配 列を有する単離された D N Aが挙げられる。 さらに、 配列番号 31に示される DNAに ストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能で、 且つべプチド切断活性を有する蛋白 質をコードする DNAは、 MM Iと実質同一の蛋白質をコードする。 ここで、 ハイブリ ダイズ可能な D N Aとは、 ある DNAをプローブとして、 コロニー 'ハイブリダィゼー シ 3ン法、 プラーク ·ハイブリダイゼーション法ぁるいはサザンブロットハイブリダイ ゼーシヨン法などを用いることにより検出される DNAを意味する。 また、 ストリンジ ェントな条件とは、 0. 1 X S S C溶液 ( 1倍濃度の S S C溶液の組成は、 150 mM 塩化ナトリウム、 15 mMクェン酸ナトリウム）、 1%SDS、 65°C、 24時間の条件 をいう。 この条件下でハイブリダイズする D N Aは、 配列番号 31で示される MM I遺 伝子と実質同一の DNAである。 なお、 ハイブリダィゼーシヨンは、 モレキュラー'ク ローニング第 2版、 カレント ·プロコールズ'イン ·モレキュラー ·バイオロジー、 D N A C l on i n g 1 ： C o r e T e c hn i qu e s, A P r a c t i c a 1 Ap p r o a c h, S e c o n d Ed i t i o n, O f o r d Un i v e r s i t y (1995) などに記載されている方法に準じて行うことができる。
また、 ストリンジェントな条件でハイブリダィズ可能力否かを問わず、 配列番号 31 に示される塩基配列と少なくとも約 60%以上の相同性を有する DNA、 好ましくは約 80 %以上の相同性を有する D N A、 さらに好ましくは約 95 %以上の相同性を有する DNAで、 ペプチド結合切断活性を有する蛋白質をコードするものについては、 その産 物が本発明の融合蛋白質構成要素となりうる。
ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質がインティン以外の場合、 例えば、 プロテ ァーゼの場合は、 そのプロテアーゼが認識するアミノ酸配列をプロテアーゼと目的蛋白 質の間に挿入しておくことによって、 該プロテアーゼの作用によって融合蛋白質を切断 することができる。 また、 ヘッジホッグ蛋白質はショウジョゥバエの細胞外分泌性のシ グナル伝達因子であり、 自身のプロセシングのためにぺプチド結合を切断する活性を持 つものであるが、 このヘッジホッグ蛋白質も本発明の融合蛋白質を構成することができ る。 また、 プロテアーゼゃヘッジホッグ蛋白質においても、 その全長を有する天然型の ものだけではなく、 その部分配列蛋白質で同様の活性をもつものも本発明の融合蛋白質 を構成することができる。 本発明においては、 プロテアーゼゃヘッジホッグ蛋白質とい う語には、 その部分配列蛋白質であって全長を有する天然型のものと同様の活性を有す る蛋白質も含むものとする。
本発明の融合蛋白質を構成する目的蛋白質としては特に限定されず、 ヒト、 マウスな どの高等動物由来の疾病関連遺伝子産物や、 化学プロセスに有効な酵素群の全て、 ある いは前記疾病関連遺伝子産物や酵素群などの有用な蛋白質が挙げられる。 具体的には、 B型肝炎ウィルス、 C型肝炎ウィルス、 H I V、 インフルエンザウイルス、 コロナウイ ルスなどの病原性ウィルスゲノムにコードされる、 外被蛋白質、 コア蛋白質、 プロテア ーゼ、 逆転写酵素、 インテグラーゼなどの蛋白質 （ウィルス抗原） が挙げられる。 さら に、 これら病原性ウィルスに対する抗体となる蛋白質、 哺乳動物由来抗体の重鎖、 哺乳 動物由来抗体の軽鎖、 哺乳動物由来抗体の定常領域、 哺乳動物由来抗体の Fv領域単鎖 抗体 （s c FV) の全長、 又はそれらの 6残基以上の部分蛋白質、 F a b (抗原結合フ ラグメント）、 (Fa b') 2フラグメント、 CH1— CH2—CH3フラグメント、 CH 1—CH2フラグメント、 CH2—CH3フラグメント、 CH 1フラグメント、 CH2 フラグメント、 CH 3フラグメント、 'CLフラグメント、 及ぴ、 完全抗体型である治療 •診断用抗体が挙げられる。 さらに、 7回貫通型受容体（G蛋白質共役型受容体)、血小 板増殖因子、 血液幹細胞成長因子、 肝細胞増殖因子、 トランスフォーミング成長因子、 神経成長 ·栄養因子、 線維芽細胞増殖因子、 インスリン様増殖因子などの成長因子 （G r o w t h f a c t o r)；腫瘍壊死因子、インターフェロン、 エリスロポエチン、顆 粒球コロニー刺激因子、 マクロファージコロニー刺激因子、 顆粒球マクロファージコロ ニー刺激因子、 インターロイキン 3やインターロイキン 5などのインターロイキン、 ァ /レブミン、 ヒト成長ホルモンなどのサイト力イン類、 などが挙げられる。 また、 例えば 、 生きた細胞内における現象を観察するために細胞内の機能蛋白質の蛍光標識として使 用できる緑色蛍光蛋白質 （G r e e n F l u o r e s c e n t P r o t e i n、 以 下 「GFP」 と称する） なども挙げられる。 さらに、 これらの蛋白質から選ばれる 2以 上の蛋白質を連結させた人工蛋白質も、 本発明の融合蛋白質を構成する目的蛋白質とし て適用可能である。
本発明の融合蛋白質を構成する分子シャペロン又はそのサブュニットとしては特に限 定はなく、 蛋白質の折り畳みを助ける作用を有するものであれば、 すべて適用可能であ る。 例としては、 複数のシャぺ口ニンサブユニットによる複合体であるシャぺ口ニン、 又はべプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ（以下、 PP I a s eという。）など が挙げられる。
なお、 分子シャペロンには、 単一分子で作用する分子シャペロンと、 複数のサブュニ ットからなる複合体を形成する分子シャペロンとがある。 そして、 本発明の融合蛋白質 において、 前者の分子シャペロンを含む場合は、 その単一分子の分子シャぺ口ンと介在 蛋白質が連結されている。 —方、 後者の分子シャペロンを含む場合は、 そのサブュニッ トと介在蛋白質が連結されている。 前者の例としては、 PP I a s eがあり、 後者の例 としてはシャぺ口ニンが挙げられる。
シャぺ口-ンは、 約 60 kD aのサブユニット （シャぺロニンサブユニット） が 1〜 約 20個程度集まつた複合体である。 シャぺ口ニンは、 細胞に熱ショックなどのストレ スを与えることにより誘導されるヒートショック蛋白質の一種としても知られている。 シャぺ口ニンは、 バクテリア （例えば、 大腸菌など）、 古細菌 （例えば、 Th e rmo c o c c u s s p.N Py r o c o c c u s o r i k o s h i l^ Ae r o p y r u m p e r n i xなど） 及び真核生物 （例えば、 酵母、 マウス、 ヒトなど)などの全ての 生物に存在し、 蛋白質の折り畳み支援や変性防御の機能を有している。
複数のシャぺ口ニンサブュニット同士がぺプチド結合を介して直列に連結された人工 蛋白質（以下、 「シャぺロニンサブユニット連結体」 と称する） も、天然のシャぺ口ニン と同様に複合体を形成することが知られている。 この際、 2〜約 10個のシャぺ口ニン サプユニットは、 天然のシャぺ口ニンと同様に直線状あるいはリング状 （以下、 シャぺ 口ニンリングともいう。） の構造をとることが知られている。 なお、 「シャぺロニンサブ ユニット連結体」 という用語に対比して、 他のシャぺ口ニンサブユニットとはペプチド 結合を介して連結されていないシャぺロニンサプュ-ットを 「単独のシャぺ口ニンサブ ユニット」 と呼ぶこととする。
本発明の融合蛋白質において、 目的蛋白質は、 単独のシャぺ口ニンサブユエット又は シャぺ口ニンサブュニット連結体の N末端、 単独のシャぺ口ニンサブュニット又はシャ ぺロニンサブュニット連結体の C末端、 シャぺ口ニンサブュニット連結体のシャぺロニ ンサブユエット同士の連結部、 から選択される 1又は 2以上の部位に、 ぺプチド結合切 断活性を有する介在蛋白質を介して連結される。 いずれの場合も、 目的蛋白質が複数の シャぺ口ニンサブュニット間によつて構成される空洞（キヤビティ）、すなわち 1層又は 2層以上のシャぺ口ニンリングの内部に格納されるよう、 目的蛋白質の結合部位を選択 することが好ましい。
本発明の融合蛋白質を構成する分子シャペロンの例であるシャぺ口ニンは、 1 0〜2 0個のシャぺ口ニンサブュニットからなる 2層のリング構造、 すなわち 5〜1 0個のシ ャぺロニンサブュニットからなるシャぺ口ユンリングが、 リング面を介して非共有結合 的に会合した 2層構造 (以下、 2層のリング構造をシャぺロニン複合体ともいう。) を形 成するものが好適である。 例えば、 内径 4 . 5 n m、 高さ 1 4 . 5 n mの空洞 (キヤビ ティ） を有する大腸菌シャぺ口ニン G r o E Lが好適である。 シャぺ口ニンを分子シャ ペロンとして用いる場合は、 目的蛋白質はシャぺ口ニンリングの内部に収納されるよう 融合蛋白質を構成することが好ましい。 なお、 バクテリア又は古細菌由来のシャぺロニ ンは、 宿主内で容易に発現させることができるので、 本発明の融合蛋白質を製造する際 には特に好適である。
また、 上記シャぺ口ニンとしては、 リング構造への自己集合能が維持されていれば、 野生型のみならずアミノ酸変異体も使用可能である。 例えば、 各シャぺ口ニンサブュニ ットの会合力が弱められた変異体を用いた場合、 格納された目的蛋白質の回収がより容 易になる。 また、 宿主としてバクテリアを用いてシャぺ口ニンを発現させる場合、 宿主 と同じバクテリア由来のシャぺ口ニンサブュニットを発現させると、 その発現量が多く なることが多い。 その結果、 目的蛋白質の生産効率が向上することが多い。
なお、 シャぺ口ニンを構成するシャぺ口ニンサブユニットの数は、 その由来生物によ つて異なる。 例えば、 バクテリア由来のシャぺ口ニンではシャぺ口ニンサブユニットの 数は通常 7個である。 一方、 古細菌由来のシャぺ口ニンでは通常 8〜 9個、 真核生物由 来のシャぺ口ニンでは通常 8個である。 したがって、 本発明の融合蛋白質を構成するシ ャぺロニンのシャぺ口ニンサブュ-ットの数は、 その由来によって最適の数を選択する ことができる。
また、 分子シャペロンにシャぺ口ニンを使用した本発明の融合蛋白質において、 リン グ構造を形成するためのシャぺ口ユンサブュニットと目的蛋白質の数比については、 通 常 1 ： 1〜： 1 0 ： 1の範囲内であり、 好ましくは 1 ： ：!〜 9 ： 1である。 なお、 1 0 ： 1よりもシャぺ口ニンサブュニットの数の比が大きくなると、 発現する目的蛋白質の実 質的な生産量が少なくなるとともに、 シャぺ口ェンのリング構造の形成が困難となるこ とがある。 具体的には、 シャぺ口ニンサブュニットの構成数が 7個であるバクテリア由来のシャ ぺロニンを用いる場合には、 シャぺロニン複合体の構造形成のしゃすさからシャぺロニ ンサブユニット ： 目的蛋白質の数の比は、 1 ： 1又は 7 ： 1であることが好ましレ、。 ま た、 シャぺ口ニンサブュニットの構成数が 8個である古細菌由来のシャぺ口ニンを用い る場合には、 シャぺ口ニン複合体の構造形成のしゃすさからシャぺ口ニン： 目的蛋白質 の数の比は、 1 ： 1、 2 : 1、 4 ： 1又は 8 ： 1であることが好ましい。
分子シャペロンの他の例として、 PP I a s eが挙げられる。 P P I a s eは、 蛋白 質のフォールデイングに関与する蛋白質折り畳み因子の 1つであり、 細胞内でフォール ディング途上のターゲット蛋白質中のァミノ酸のうち、 プロリン残基の N末端側ぺプチ ド結合のシストランス異性化反応を触媒する活性 (PP I a s e活性） を有する。
PP I a s eはその阻害剤に対する感受性から、 FK506 B i n d i n g P r o t e i n型（FKBP型)、シクロフィリン型及ぴパーブリン型の 3種類に分類される 。 ]6?型？？ 1 a s eは免疫阻害剤の 1つである FK506により活性が阻害され る PP I a s e及びそのホモログである。 シクロフィリン型 PP I a s eは、 別の免疫 阻害剤であるシクロスポリンに対して感受性を持つ PP I a s e又はそのホモログであ る。 一方、 パーブリン型 PP I a s eは、 いずれの免疫阻害剤に対しても感受性を示さ ず、 ジュグロン （j u g 1 on e) によりその活性が阻害される。 この 3種類の PP I a s eは、 ァミノ酸一次配列上の相同性はほとんどなレ、。
本発明の融合蛋白質を構成する PP I a s eとしては特に限定されず、 上記の 3種類 の PP I a s eのうち、 いずれのタイプの PP I a s eであってもよい。 FKBP型 P P I a s eとしては、 例えば、 古細菌由来 FKBP型 PP I a s e、 トリガーファクタ 一タイプ PP I a s e (Hu a ng, P r o t e i n S c i., 第 9卷、 p. 1254 ， 2000年）、 F k p Aタイプ P P I a s e (Ar i e， Mo l . Mi c r o b i o l ., 第 39卷， p. 199, 2001年）、 F KB P 52タイプ P P I a s e (B o s e ， S c i e n c e, 第 274卷， p. 1715, 1996年） が挙げられる。 また、 シ クロフイリンタイプ PP I a s eとしては、 CyP40タイプ PP I a s eなどが挙げ られる （P i r k l , J. Mo 1. B i o l.， 第 308巻， p. 795, 2001年） 。 さらに、 パープリンタイプ PP I a s eとしては、 S u r Aタイプ PP I a s e (B e h r e n s, EMBO J., p. 第 20卷， p. 285, 2001年） が挙げられる 。 なお、 本発明において、 これらの PP I a s eには、 アミノ酸配列が極めて似ており 、 且つ同様の作用を有する実質的に同等のポリペプチド、 少なくともこれらの PP I a s eの一部分を含み、 且つ同様の作用を有するポリペプチド、 及び、 これらの PP I a s eの一部のアミノ酸が他のアミノ酸に改変され、 且つ同様の作用を有するポリべプチ ドも含まれる。
上記古細菌由来 FKBP型 PP I a s eの機能については、 興味深いことに、 PP I a s e活性だけでなく、 蛋白質の不可逆的凝集を抑制すると同時に、 変性蛋白質のリフ オールデイングを促進させる分子シャペロン活性を有することが見出されている (Fu r u t a n 1 , B ι o c h emi s t r y, 第 39巻， p. 453, 2000年； I d e n o， Eu r. J . B i o c h em.， 第 267巻, p. 3139, 2000年； I d e n o, B i o c h em. J . , 第 357卷， p. 465, 200 ； I d e n o, A p 1. Env. Mi c r o b i o l .， 第 68， p. 464, 2002年）。 分子シャ ペロン活性は、 本来、 分子シャペロンの 1つとして知られるシャぺ口ニンや Dn a Dn a J/Gr p E系の蛋白質折り畳みシステムに見いだされた活性である。 これらは 、 細胞内で合成されたポリペプチドが正しい形に折り畳まれるよう、 サポートする機能 を果たしている。 その際、 AT Pなどの高エネルギー物質の加水; ^率を必要とする。 一 方、 古細菌由来 FKBP型 PP I a s eは、 その分子シャペロン活性を発揮する際、 上 記高エネルギー物質の加水分解反応を必要としない点でその性質が異なる。 古細菌由来 ！^^ 型？ I a s eは、 分子シャペロン活性を有しない P P I a s eに比べて、 目 的蛋白質をより正しく折り畳むことができるので、 本発明の融合蛋白質を構成する P P I a s eとして、 特に好適である。
本発明における分子シャペロン活性を有する PP I a s eとしては上記例示のもの以 外であっても、 同等の分子シャペロン活性を有する PP I a s eであれば、 好適に用い ることができる。
本発明の目的蛋白質の製造方法は、 ィンティン等のぺプチド結合切断活性を有する介 在蛋白質の作用によって、 融合蛋白質を切断し、 S虫合蛋白質から目的蛋白質を切り出す ものである。 さらに具体的には、 融合蛋白質を単離する工程と、 単離した融合蛋白質に 含まれるぺプチド結合切断活性を有する介在蛋白質のぺプチド結合切断活性を惹起する 工程と、 ペプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の作用により、 融合蛋白質の一部を 切断し、 融合蛋白質から目的蛋白質を切り出して遊離させる工程とを含む。 本発明の目 的蛋白質の製造方法によれば、 単独では不溶ィ匕等してしまう目的蛋白質を分子シャぺ口 ンの作用で正常型蛋白質として発現することができ、 さらに、 プロテア一ゼ等を加える ことなく目的蛋白質を切り出すことができる。 この際、 融合蛋白質の発現は、 宿主内で 行ってもよいし、 無細胞翻訳系で行ってもよい。 .
宿主内で融合蛋白質の発現を行って目的蛋白質を製造する場合は、 まず、 融合蛋白質 の遺伝子を宿主内に導入する。 例えば、 適宜のベクターに融合蛋白質をコードする遺伝 子を導入して発現ベクターを構築し、 適宜の宿主に導入して形質転換体を得る。 そして 、 この形質転換体を培養して融合蛋白質を発現させ、 該形質転換体から融合蛋白質を単 離する。 一方、 無細胞翻訳系において融合蛋白質の発現を行う場合は、 例えば大腸菌、 小麦胚芽、 ゥサギ網状赤血球等の無細胞抽出液に、 ヌクレオチド 3リン酸や各種アミノ 酸を加えた反応液中で、 融合蛋白質を発現させることができる。
次に、 単離された融合蛋白質に対して、 介在蛋白質のペプチド切断活性を惹起する処 理を行い、 融合蛋白質から目的蛋白質を切り出して遊離させる。 介在蛋白質のペプチド 切断活性を惹起する処理としては、 介在蛋白質がインティンであれば、 p Hの制御、 温 度の制御、 トリガー物質の添加等が挙げられる。 例えば、 p Hが 6〜8の範囲、 好まし くは 7付近になるように水素イオン濃度を変ィ匕させることにより、 インティンのぺプチ ド結合切断活性を惹起することができる。 また、 2 0〜 3 7 °Cの範囲になるように温度 を変化させることにより、 ィンティンのぺプチド結合切断活性を惹起することができる 。 また、 トリガー物質としてジチオスレィトールや j8—メルカプトエタノールのような チオールを添加することにより、 ィンティンのぺプチド結合切断活性を惹起することが できる。 特に、 チオールは Nインティンの切断活性を惹起するのに有効である。
逆に、 インティンのペプチド結合切断活性が融合蛋白質を単離する前、 すなわち宿主 内又は試験管内で惹起されないようにすることも、 目的蛋白質の収量を増カ卩させるため には有効である。 そのための方法としては、 例えば、 宿主の培養温度を 2 0 °C未満にし たり、 無細胞蛋白合成を 2 0 °C未満で行うことが挙げられる。
また介在蛋白質がプロテアーゼであれば、 プロテアーゼの種類に応じて、 至適緩衝液 条件、 温度、 p Hなどを制御することにより、 ペプチド結合切断活性を惹起することが できる。 ，
宿主内で融合蛋白質をコードする遺伝子を発現させる際の宿主としては特に限定され ず、 例えば、 大腸菌等のパクテリア、 その他の原核細胞、 酵母、 昆虫細胞、 哺乳動物培 養細胞、 植物培養細胞、 及ぴトランスジエニック動 '植物等が挙げられる。 なかでも、 高い細胞増殖特生を有し、 培養操作が簡便で且つ培養に用いる栄養源等のコストが安価 であることから、 大腸菌等のパクテリアや酵母等が特に好適である。 また、 融合蛋白質 は宿主の細胞質内、 細胞外のいずれに発現させてもよいが、 大量に発現させる場合には 細胞内に発現させる方が望ましい。
なお、 宿主が大腸菌の場合は、 導入されたプラスミドの大きさが 10 k b p以上にな るとプラスミドのコピー数が減少し、 結果的に融合蛋白質の合成量が低下することがあ る。 このときは、 融合蛋白質を同一の宿主内で共発現させる手段により発現量の低下を 防ぐことができる。 例えば、 同一の融合蛋白質を合成する同一遗伝子を、 異なる複製領 域及び薬剤耐性遺伝子を有する 2種類のプラスミドなどのベクターに導入し、 これら 2 種類のベタタ一で 2種の薬剤の存在下で大腸菌を形質転換し、 融合蛋白質の合成を行う ことで、 高発現をもたらすことが可能である。
また、 本発明の目的蛋白質の製造方法では、 融合蛋白質をコードする遺伝子と、 分子 シャペロンのみをコードする遺伝子とをそれぞれ、 同一の宿主内で共存させ、 複製する ことが可能な 2種類の異なるプラスミドなどのベクターに導入し、 同一の宿主内で共発 現させてもよい。 例えば、 目的蛋白質に対するシャぺ口ニンサブユニットの数比が小さ い場合は、 融合蛋白質をコードする遺伝子とシャぺ口ニンサブュニットのみをコードす る遺伝子とをそれぞれ、 同一宿主内で共存 ·複製可能な 2種類のプラスミドに導入して 、 融合蛋白質とシャぺ口ニンサブュニットを共発現させるとよい。
ィンティンの部分配列蛋白質と、 全長のィンティンから該部分配列蛋白質を除いた残 余の蛋白質（以下、 「インティンの残余の部分配列蛋白質」 と称する） は、 いわゆる t r a n s— s p l i c i n g (ウイ 'ェイチ （Wu H) ら、 バイオケミカ ·エト 'バイ オフィシカ，ァクタ (B i o c h imi c a e t b i o phy s i c a a c t a )、 1998年、 第 1387卷、 p. 422— 432) を行う.ことが知られている。 イン ティンの部分配列蛋白質とインティンの残余の部分配列蛋白質が互いに近くに存在する 場合は、 隣接する蛋白質同士をアセンブルしやすいと考えられる。 ここで、 2種類の蛋 白質をアセンブルするとは、 これらの蛋白質同士を接近させ、 共有結合又は非共有結合
(水素結合、 疎水性相互作用、 分子間力等） によって結合又は会合させることをいう。 そして、 ィンティンの部分配列蛋白質とインティンの残余蛋白質は、 2種類の蛋白質を アセンブルする機能 （アセンブリー機能） を有している。 このアセンブリー機能を利用 して、 2種類の目的蛋白質をアセンブルすることができる。 例えば、 2種類の蛋白質が ある目的蛋白質の前駆体となるものであるとき、 これらの前駆体をァセンブ /レして目的 蛋白質を製造することができる。
目的蛋白質が免疫グロプリン、 前駆体が抗体軽鎖及び抗体重鎖である場合を例に挙げ ると、 第 1の例は、 分子シャぺ口ンの c末端にィンティンの C末端側部分配列蛋白質を 介して抗体重鎖を連結させた融合蛋白質を作製する。 一方、 別の分子シャペロンの N末 端にィンティンの残余蛋白質を介して抗体軽鎖を連結させた融合蛋白質を作製する。 そ して、 これら 2つの融合蛋白質を接近させてアセンブリーを起こさせ、 抗体重鎖と抗体 軽鎖がジスルフィド結合によって結合した免疫グロブリンを作製することができる。 ま た、 第 2の例は、 分子シャペロンの C末端にィンティンの C末端側部分配列蛋白質を介 して抗体重鎖を連結させ、 且つ分子シャぺ口ンの N末端側にィンティンの残余蛋白質を 介して抗体軽鎖を連結させた融合蛋白質を作製する。 そして、 インティンのアセンブリ 一機能を利用して抗体重鎖と抗体軽鎖をァセンブリーし、 抗体重鎖と抗体軽鎖がジスル フイド結合によって結合した免疫グロブリンを作製することができる。 なお、 インティ ンの残余蛋白質には、 ェンドヌクレアーゼ活性部分を含んでいてもよい。 実施例 - 以下に、 実施例をもって本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施例に限 定されるものではない。
(実施例 1)
1. S s p I遺伝子の単離
p TW I N 1 (New En g l a n d B i o l a b s社） を錄型とし、 配列番号 1と 2に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして PCR (P o 1 yme r a s e c h a i n r e a c t i o n) を行い、 S s ρ Iをコードする遺伝子を含む DN A断片を単離した。 配列番号 3にその塩基配列と対応するアミノ酸配列、 配列番号 4に アミノ酸配列のみを示す。 なお、 S s p lは、 シァノパクテリア S y n e c h o c y s t i s s p PCC 6803株由来の Dn a B h e 1 i c a s eインティンのェン ドヌクレアーゼ領域を除き、 N末端アミノ酸をァラニンに置換した改変型インティン ( である。 2. 古細菌由来シャぺ口ニンサブュ-ット連結体の発現系構築
Th e rmo c o c c u s KS— 1株 （J CM No. 11816) からゲノム D
NAを抽出した。 このゲノム DNAを ,とし、 配列番号 5と 6に示されるオリゴヌク レオチドをプライマーとして PC Rを行い、 配列番号 7に示されたシャぺ口ニン サブ ュニット（以下、 「TCPjS」 と称する。）の遗伝子を含む DNA断片を単離した。 さらに 、 増幅した TCP 遺伝子を含む DNA断片をタンデムに 4回連結して、 TCP ]34回 連結体 （以下、 「 （TCP3) 4」 と称する。） の遺伝子を作製した。
一方、 配列番号 36と 37で示される互いに相補的な塩基配列を有するオリゴヌタレ ォチドを合成し、 これらをアニーリングさせてマルチクローニングサイトを有する 2本 鎖 DNAを得た。 この 2本鎖 DNAは、 N c o I、 B a mH I、 S p e l、 Hp a lの 各サイトが順に配置され、 その下流にヒスチジン 6残基からなるヒスチジンタグ （6H i s、 配列番号 8) をコードする遺伝子、 終始コドン及び No t Iサイトを有する。 次 に、 この 2本鎖 DNAを p ET 21 dプラスミド （N o v a g e n社） の N c o I— N o t Iサイトに導入した。 このプラスミ ドの B a mH Iサイトに、 本実施例で単離した （TCP ） 4遺伝子を 導入し、 pETDH (TCP j3) 4を構築した。 さらに、 pETDH (TCP j3) 4の （ TCPi3) 4遺伝子の下流に、 本実施例で単離した S s p I遺伝子を揷入し、 発現べク ター pETDH(TCPi3)4Iを構築した。
図 1に p ETDH(TCP j3)4 Iの構造を示す。 すなわち、 p E TDH (T C P j3 ) 4 I は T7プロモーターを有し、 その下流に、 （TCPi3) 4遺伝子、 S s p l遺伝子、 及ぴ 6H I s遺伝子が順に配置されている。 また、 p ETDH(TCP ]3)4 Iの S p e Iサ ィトと Hp a Iサイトの間に目的蛋白質をコードする遺伝子と終始コドンを挿入するこ とにより、 C末端に 6H i sを有する、 （TCP/3) 4と S s p Iと目的蛋白質との融合 蛋白質を発現するベクターを構築することができる。
3. 抗体軽鎖の発現及び切り出し
長鎖 DN A合成を行い、 配列番号 9に示されるヒト由来抗 HB s (B型肝炎ウィルス 表層蛋白） 抗体の軽鎖 （AbL) 遺伝子を含む DNA断片を調製した。 なお、 この DN A断片にはプライマーに由来して 5' 末端には S p e Iサイトを、 3' 末端には Hp a Iサイトが設けられた。 この DNA断片を S p e I及び H p a Iで処理し、 あらかじめ 同制限酵素で処理した発現べクター p ETDH (TCP ^)4 Iに組込んだ。 これにより 、 （TCP ;3) 4と S s p Iと Ab Lとの融合蛋白質を合成する発現ベクター p ETDH (TCP i3)4 I ' Ab Lを構築した。
得られた発現ベクター p ETDH (TCP i3) 4 I ' 1)しを大腸菌81^ 2 1 (DE 3) 株 （S t r a t a g e n e社） に導入し、 形質転換体を得た。 この形質転換体を、 カルべニシリン (I 00 μ g/mL) を含む 2 XY. T. 培地 (パクトトリプトン 1 6 g、 酵母エキス 1 0 g、 Na C 1 5 g/L) で 30°C、 24時間培養し、 （TCP 3) 4 と S s p Iと Ab Lとの融合蛋白質を発現させた。 次いで、 菌体を 5 OmM T r i s ノ HC 1緩衝液 0. 2mM EDTA (ρΗ7 · 0) に懸濁し、 プロテアーゼインヒ ビタ一力クテル （ナカライテスタ社） 存在下、 超音波処理にて菌体を破碎後、 遠心によ り菌体破碎液上清を得た。
(比較例 1 )
図 1に示す p ETDH (TCP i3)4 Iの B a mH Iサイトと S p e Iサイトの間に、 S s p Iをコードする遺伝子の代わりに、 プレシジョンプロテアーゼの認識配列をコー ドする遺伝子 （配列番号 10 ) を導入し、 p ETDH (TCP j3)4Pを構築した。 p E TDH (TCP )4 Iの代わりに pETDH (T C P ]3 ) 4 Pを用いる以外は全て実施例 1と同様にして、 発現ベクター p ETDH (TCP ]3)4Ρ · Ab Lを構築した。 さらに 、 実施例 1と同様にして、 形質転換、 及び形質転換体の培養を行い、 菌体破石嫌上清を 得た。 実施例 1と比較例 1で調製したそれぞれの菌体破碎液上清を室温で 2時間処理したも のにつき、 抗体軽鎖を認識する抗体 (P I ERCE社 ャギ抗ヒト I gG F(a b') 2 抗体 _HRP c o n j u g a t e)を用いたウェスタンブロッテイング解析を行い、 A b Lがシャぺ口ニンから切断されている力否かを試験した。 結果を図 2に示す。 実施例 1の菌体破砕液では Ab Lが分子量 25 kD a付近に検出され、 Ab Lが融合蛋白質か ら切断されていることが確認された （レーン 1)。 なお、 250 kD a付近のバンドは ( TCP β) 4と S s p lと Ab Lとの融合蛋白質である。 一方、 比較例 1の菌体破砕液 では分子量 250 kD a付近にのみ検出され、 A b Lは融合蛋白質から切り出されてい なかった （レーン 2)。 (実施例 2)
1. C型肝炎ウィルス抗原の発現及び切出し
長鎖 DNA合成を行い、 配列番号 11に示される C型肝炎ウィルスコア抗原 (HCc ) 遣伝子を含む DNA断片を調製した。 実施例 1と同様にして、 この DNA断片を発現 ベクター p ETDH (TCP j3)4 Iに組み込み、 (TCP ) 4と S s ρ Iと HC cとの 融合蛋白質を合成する発現ベクター pETDH (TCPj8)4 I ' HCcを構築した。 得 られた発現ベクター pETDH (TCP j3)4 I · HC cを大腸菌 BL 21 (DE3) 株 に導入し、 形質転換体を得た。 この形質転換体を実施例 1と同様にして培養し、 菌体破 碎液上清を得た。
(比較例 2)
p ETDH (TCP 3)4 Iの代わりに p ETDH (T C P ） 4 Pを用いる以外は全て 実施例 2と同様にして、 発現べクターの構築、 形質転換、 及び形質転換体の培養を行レヽ 、 菌体破碎液上清を得た。 実施例 2の菌体破碎液上清を室温で 2時間処理した。 一方、 比較例 2の菌体破碎液上 、凊をプレシジョンプロテアーゼ (Ame r s h a m B i o s c i e n c e社) によつ て処理 （4°C、 20時間） した。 処理後の反応液それぞれにっき、 C型肝炎ウィルスコ ァ抗原を認識する抗体 （ABR社 抗 HCVマウスモノクローナル抗体） を用いたゥェ スタンプロッテイング解析を行った。 結果を図 3 (a) (実施例 2) 及び図 3 (b) (比 較例 2) に示す。 図 3 (a) のレーン 1が実施例 2のサンプルで、 レーン 2は宿主のみ のコントロールである。 図 3 (b) のレーン 3が比較例 2のサンプルである。
すなわち、 図 3 (a) に示すように、 実施例 2の菌体破砕液では H C cが分子量 21 k Da付近に検出され、 融合蛋白質から HC cが分解されることなく切り出されている ことが確認された。 一方、 図 3 (b) に示すように、 比較例 2の菌体破碎液では分子量 21 kD a付近のシグナル以外に 18 kDa、 15 kD a及ぴ 12 kD a付近にシグナ ルが検出され、 HC cが:^军されていることがわかった。 これは、 HCcが特に疎水性 が高く、 限定分解型プロテアーゼによる認識配列の厳密性が崩れ、 認識配列以外の HC Cの内部で切断が起こったものと考えられる。
(実施例 3)
1. N末端のみを切断する改変型 S s p Iをコードする遺伝子の単離
pTWINl (New En g l a n d B i o 1 a b s社） を鎵型とし、 配列番号 12と 13に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして PCRを行い、 配列番号 6に示される N末端のみが切断できるよう改変された S s p I (以下、 「NS s p I」 と 称する。） をコードする遺伝子を含む DNA断片を単離した。 すなわち、 NS s p Iは、 シァノバクテリア S y n e c h o c y s t i s s p PCC 6803株由来の Dn a B h e 1 i c a s eインティンのエンドヌクレアーゼ領域を除き、 C末端アミノ酸を ァラニンに置換した改変型インティン （Nインティン） である。
2. 大腸菌シャぺロェンサブユニット連結体の発現系構築
大腸菌 HMS 174 (DE3) 株 （No v a g e n社） からゲノム DNAを抽出した 。 このゲノム DNAを鎵型とし、 配列番号 15と 16に示されるオリゴヌクレオチドを プライマーとして PCRを行い、 配列番号 17に示された Gr o ELサブュニット遺伝 子を含む DNA断片を単離した。 一方、 配列番号 38と 39に示される互いに相補的な 塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、 これらをアニーリングさせてマルチク ローニングサイトを有する 2本鎖 DNAを得た。 この 2本鎖 DNAは、 Nc o I、 Xb a I、 B g 1 I I , Xh o I、 の各サイトが順に配置され、 その下流に FLAGぺプチ ド （配列番号 18) をコードする遺伝子と終始コドンを有する。 次に、 この 2本鎖 DN Aをプラスミド pTr c 99A (Am e r s h am B i o s c i e n c e社） の N c o I— H i n d I I Iサイトに導入した。 さらに、 導入された Xb a Iサイトに、 上記 で増幅した G r o E Lサブュニット遺伝子を含む DN A断片を導入した。 同様の操作を 繰り返すことにより、 Gr oELサブユニット遺伝子がタンデムに 7個連結された Gr o ELサブユニット 7回連結体 （以下、 「 （Gr oEL) 7」 と称する。） の遺伝子を揷 入し、 pT(Gr oEL)7を構築した。 さらに、 （G r o E L) 7遺伝子の下流の X b a I 一 B g 1 I Iサイトに、 本実施例で得られた NS s p I遺伝子を挿入し、 発現ベクター p T(G r o EL)7N Iを構築した。 図 4に pT(Gr o EL)7N Iの構造を示す。 すな わち、 pT(Gr oEL)7NIは t r cプロモーターを有し、 その下流に、 7個の Gr o E Lサブュニット遺伝子がタンデムに並んだ G r o E Lサブュニット 7回連結体 （（ G r o EL) 7) の遺伝子、 NS s p I遺伝子、 及ぴ F LAGペプチドをコードする遺 伝子が順に配置されている。 また、 B g 1 I Iサイトと Xh o Iサイトの間に目的蛋白 質をコードする遺伝子を揷入することにより、 （Gr oEL) 7と NS s p Iと目的蛋白 質との融合蛋白質を発現するべクターを構築することができる。
3. ァセチルコリンムス力リンレセプターの発現及び切断
長鎖 D N A合成により配列番号 19に示されるァセチルコリンムス力リンレセプター (MR) 遺伝子を含む DN A断片を単離した。 この DNA断片を pT(Gr oEL)7N Iの B g 1 I I及ぴ Xh o Iサイトの間に組み込んだ。 これにより、 （Gr oEL) 7と NS s p Iと MRとの融合蛋白質を合成する発現ベクター pT(Gr o EL)7N I ·Μ Rを構築した。 PT(Gr oEL)7N I 'MRを用い、 培養温度が 25 °Cである以外は 実施例 1と同様にして、 形質転換、 形質転換体の培養を行い、 菌体破石 夜上清を得た。 菌体破枠液上清を抗 FLAGペプチド抗体担持カラムで精製後、 最終濃度 4 OmMの ジチオスレィトール (DTT) を添加し、 NS s p Iの N末端のぺプチド結合を切断し た。 抗 F LAGぺプチド抗体を用いたウェスタンブロッティングを行なった。 その結果 を図 5のレーン 2に示す。
(比較例 3)
実施例 3で得られた菌体破辟 4夜上清を F L A Gぺプチド抗体担持力ラムにて精製後、 DTTを添加せず、 抗 F LAGぺプチド抗体を用いたウェスタンプロッティングを行な つた。 その結果を図 5のレーン 1に示す。 実施例 3では、 NS s p Iと MRの融合蛋白質のシグナルが分子量 52 kD a付近に 検出され、融合蛋白質から MRが切り出されていることが確認された（レーン 2)。一方 、 比較例 3では、 分子量 52 kD a付近のシグナルは検出されず、 融合蛋白質から MR が切り出されていないことが確認された (レーン 1)。 このように、ィンティンの切断活 性が DTTによつて惹起された。 (実施例 4) 1. P P I a s eとの融合蛋白質発現系構築
Th e rmo c o c c u s KS— 1株 （J CM No. 11816) からゲノム D NAを抽出した。 このゲノム DNAを铸型とし、 配列番号 20と 21に示されるオリゴ ヌクレオチドをプライマーとして PC Rを行い、 配列番号 22に示される超好熱性古細 菌由来 PP I a s e (TPP I a s e) 遺伝子を含む DNA断片を単離した。
実施例 1で調製した P ETDH (TCP ） 4 · Iを B amH Iと No t Iで処理し て S s p I遺伝子と Hi sタグと終始コドンを含む DNA断片を単離した。 一方、 配列 番号 35に示されるオリゴヌクレオチドと、 それに相補的な塩基配列を有するォリゴヌ クレオチドを合成し、 これらをアニーリングさせて 2本鎖 DN A断片を得た。 この 2本 鎖 DNA断片を pET21 dプラスミド （No v a g e n社） の N c o Iサイトに導入 した。 さらに、 導入した DNA断片に含まれる Nc o I _Sp e Iサイトに、 本実施例 で増幅した TP P I a s e遺伝子を含む DNA断片を揷入した。 さらに、 挿入したオリ ゴヌクレオチドに含まれる B amH Iサイトと p E T 21 dのマルチクローニングサイ ト内にある No t Iサイトの間の DNA断片を除去し、 代わりに、 上記で単離した S s p I遺伝子と H i sタグと終始コドンを含む DNA断片を揷入し、 p ET TPP I a s e Iを構築した。図 6に p ET TPP I a s e Iの構造を示す。すなわち、 p E T T PP I a s e Iは T 7プロモーターを有し、その下流に、 TPP I a s e遺伝子、 S s p I遺伝子、 及ぴ 6 H i s遺伝子が順に配置されている。 また、 S p e Iサイトと Hp a Iサイトの間に目的蛋白質をコードする遺伝子を揷入することにより、 TPP I a s eと S s p Iと目的蛋白質との融合蛋白質を発現するベクターを構築することができる
2. 緑色蛍光蛋白質 （GFP) の発現、 切断
p i VEX 2. 3— GFP WT (ロシュ ·ダイァグノスティックス社) を錶型とし 、 配列番号 23と 24に示される才リゴヌクレオチドをプライマーとして PCRを行い 、 配列番号 25に示される緑色蛍光蛋白質 （GFP) 遺伝子を含む DNA断片を単離し た。 なお、 この DNA断片にはプライマーに由来して 5， 末端には S p e Iサイトを、 3， 末端には Hp a Iサイトがそれぞれ設けられた。 この DNA断片を S p e I及ぴ H p a I処理し、 あらかじめ同制限酵素で処理した発現ベクター P ET TPP I a s e Iに組み込んだ。 これにより、 超好熱性古細菌由来 PP I a s e (TPP I a s e) と S s p Iと GF Pとの融合蛋白質を合成する発現ベクター p ET TP P I a s e I · GFPを構築した。
得られた発現ベクター p ET TP P I a s e I · G F Pを大腸菌 B L 2 1 (DE 3 ) 株に導入し、 形質転換体を得た。 この形質転換体をカルべニシリン (1 00 μ gZm L) を含む 2 X Υ· Τ. 培地で 2 5。C、 24時間培養し、 TP P I a s eと S s p lと GF Pとの融合蛋白質を発現させた。 次レ、で、 菌体を 5 0 mM T r i s/HC 1緩衝 液 （pH7 · 0) に懸濁し、 プロテアーゼインヒビターカクテル存在下、 超音波処理に て菌体を破碎後、 遠心により菌体破碎液上清を得た。 (比較例 4)
図 1に示す p ET TP P I a s e Iについて、 B a mH Iサイトと S p e Iサイト の間に S s p Iをコードする遺伝子の代わりに、 プレシジョンプロテアーゼの認識配列 をコードする遺伝子を導入した p ET TPP I a s e Pを構築した。
p ET TP P I a s e Iの代わりに p ET TP P I a s e Pを用いる以外は全て 実施例 4と同様にして、 発現ベクターの構築、 形質転換、 及び形質転換体の培養を行い 、 菌体破砕液上清を得た。 実施例 4と比較例 4で調製したそれぞれの菌体破枠液上清を N i—NTAァガロース ゲル （キアゲン社） で精製した後、 室温で 2時間処理したものにつき、 ヒスチジンタグ を認識する抗体 (Ame r s h am B i o s c i e n c e s社 饥 H i sマウスモノ クローナル抗体） を用いたウェスタンプロッティング解析を行い、 GF Pが TP P I a s eから切断されているカゝ否かを試験した。 結果を図 7に示す。 実施例 4の菌体破碎液 (レーン 1) では、 GFPが分子量 2 7 kD a付近に検出され、 GF Pが融合蛋白質か ら切り出されていることが確認された。 なお、 レーン 1の 6 2 kD a付近のシグナルは TP P I a s eと S s p lと GF Pとの融合蛋白質である。 一方、 比較例 4の菌体破碎 液 （レーン 2) では、 TP P I a s eと GF Pとの融合蛋白質の分子量 4 5 kD a付近 にのみシグナルが検出され、 GFPの切り出しは確認されなかった。 なおレーン 3は G F Pの標品である。 (実施例 5 ) 1. エンドセリンレセプターの発現及ぴ切断
実施例 1で調製した S s p I遺伝子を用い、実施例 3と同様の手 jl頃で、 pT(Gr o E L)7 Iを構築した。 pT(Gr oEL)7 Iは、 図 4に示される pT(Gr oEL)7N Iの NS s p I遺伝子の代わりに S s p I遺伝子を導入したベクターである。 一方、 ヒ ト c DNAライプラリー (タカラバィ才社) を錄型とし、 配列番号 26と 27に示されるォ リゴヌクレオチドをプライマーとして PCRを行レ、、 配列番号 28に示されるェンドセ リン Aレセプター （ETAR) 遺伝子を含む DN A断片を単離した。 この DNA断片を pT(G r o EL)7 Iの B g 1 I I及ぴ X h o Iサイトの間に組み込んだ。 これにより 、 （G r o EL)7と S s p Iと E TARとの融合蛋白質を合成する発現ベクター p T (G r oEL)7 I ' ETARを構築した。 この発現ベクターを用い、 実施例 1と同様にして 、 形質転換体を作製した。 形質転換体を、 温度 18°C、 110 r pmの条件で培養し、 菌体を回収した。 この菌体から実施例 1と同様にして菌体破碎液上清を得た。 この菌体 破 !液上清を抗 FLAGペプチド抗体担持カラムで精製後、 S s p Iの C末端のぺプチ ド結合の切断の有無を、 抗 F LAGぺプチド抗体 （S I GMA社 a n t i -FLAG M 2モノクローナル抗体） を用いたウェスタンブロッテイングで確認した。 結果を図 8 のレーン 2に示す。
(比較例 5)
実施例 5の形質転換体の培養温度を 18 °Cでなく、 25 °Cで行なった以外は、 実施例 5と同様に培養を行い、 菌体破砕液上清を得た。 菌体破碎液上清を抗 FLAGペプチド 抗体担持カラムで精製後、 S s p Iの C末端のペプチド結合の切断の有無を、 抗 FLA Gぺプチド抗体を用いたウェスタンブロッティングで確認した。 結果を図 8のレーン 3 に示す。 実施例 5の菌体破砕液では E TARのシグナルが分子量 42 k D a付近に検出され、 融合蛋白質から ETARが切り出されていることが確認された（レーン 2)。一方、比較 例 5の菌体破砗液では分子量 42 kD a付近にパンドは検出されず、 融合蛋白質から E TARは切り出されていなかった（レーン 3)。 なお、 レーン 1は S s p I遗伝子を含ま ないベクターによるコントローノレである。 また、 比較例 5で得た菌体破碎上清を抗 F LAGぺプチド抗体担持カラムで精製した 画分について SDS— PAGE及び CBB染色を行い、 バンドの有無を確認した。 対照 として、 S s p Iが入っていない（Gr o EL) 7と ETARとの融合蛋白質について、 同様に培養、 破砕、 精製を行なった画分についても SDS— PAGEを行なった。 結果 を図 9に示す。 図 9で、 レーン 1は比較例 5で得られた菌体破碎液上清、 レーン 2はそ の上清の F L A Gカラム精製画分、 レーン 3は対照の菌体破砕液上清、 レーン 4はその 上清の FLAGカラム精製画分である。その結果、 S s p Iが入っていない（Gr oEL ) 7と E T A Rとの融合蛋白質の場合、 抗 F L A Gぺプチド抗体担持力ラムで精製した画 分にはバンドが検出された (レーン 4)。 —方、 S s p Iが入っている（Gr oEL)7と S s p Iと ETARとの融合蛋白質の場合、 抗 FLAGペプチド抗体担持カラムで精製 した画分には、 どこにもバンドが検出されなかった （レーン 2)。すなわち、 レーン 2の サンプルには、 抗 F LAGぺプチド抗体担持カラムと結合する蛋白質は検出されなかつ た。 このことは、 レーン 1で検出されたバンドは （Gr oEL) 7のみの蛋白質で、 F LAGペプチドがついていないということを示す。 これは、 25°C培養をすることによ り、 S s p Iの作用により F LAGぺプチドをつけた ETAR部分が切断されて、 さら に 军されてしまっていることを示唆する。
(実施例 6)
1. エンドセリンレセプターの発現及び切断 （2)
実施例 5と同様に、 配列番号 28に示されるエンドセリン Aレセプター （ETAR) 遺伝子を含む DNA断片を単離した。
この DNA断片を、 実施例 3で調製した p T(G r 0 EL)7N Iの B g 1 I I及び Xh o Iサイトの間に組み込んだ。 これにより、 G r o E Lサブュニット 7回連結体と N S s p Iと ETARとの融合蛋白質を合成する発現ベクター pT(Gr o EL)7N I · E TARを構築した。 pT(Gr oEL)7N I ' ETARを用い、 実施例 1と同様にして 、 形質転換及び形質転換体の培養を行い、 菌体破砕液上清を得た。 この菌体破碎液上清 を抗 F L A Gぺプチド抗体担持力ラムで精製後、 最終濃度 40 mMの D T Tを添加し、 NS s p Iの N末端のぺプチド結合を切断した。 抗 F LAGぺプチド抗体を用いたゥェ スタンプロッティングを行なつた結果を図 10のレーン 2に示す。 (比較例 6)
実施例 6の菌体破碎液上清を F L A Gぺプチド抗体担持力ラムで精製後、 D T Tを添 加せず、 抗 F LAGぺプチド抗体を用いたウェスタンブロッティングを行なった結果を 図 10のレーン 1に示す。 実施例 6の菌体破砕液では N S s p Iと ETARの融合蛋白質のシグナルが分子量 5 9 k D a付近に検出され、 融合蛋白質から ETARが切り出されていることが確認され た (レーン 2)。—方、比較例 6の菌体破砕液では、分子量 59 kD a付近のシグナルは 検出されず、 融合蛋白質から ETARが切り出されていないことが確認された （レーン 1)。 このように、 インティンの切断活"生が DTTによって惹起された。
(実施例 7)
1. GFPの発現及び切断 2 ；無細胞蛋白合成
大腸菌の培養の代わりに、 無細胞蛋白質発現 (ロシュ ·ダイァグノスティック社 R TS 500使用） を行なった以外は実施例 4と同様に蛋白合成を行なった。
(比較例 7)
大腸菌の培養の代わりに、 無細胞蛋白質発現 (ロシュ ·ダイァグノスティック社 R TS 500使用） を行なった以外は比較例 4と同様に蛋白合成を行なった。 実施例 7と比較例 7で調製したそれぞれの蛋白合成後の反応液を、 N i— N T Aァガ ロースゲル (キアゲン社） で精製した後、 室温で 2時間処理したものにつき、 抗 GFP マウスモノクローナノレ抗体 (S a n t a Cr u z B i o t e c hn o l o g y社） を 用いたウェスタンブロッテイング解析を行い、 GFPが TPP I a s eから切断されて いるか否かを試験した。 結果を図 1 1に示す。 レーン 1は GFP— 6H i sによるコン トロールである。 実施例 7 (レーン 2) の pET TPP I a s e I ' GFPでは、 G FPが分子量 27 kDa付近に検出され、 GFPが TPP I a s eから切断されている ことが確認された。 なお、 62 k D a付近のシグナルは T PP I a s eと S s p lと G FPとの融合蛋白質である。 一方、 比較例 7 (レーン 3) では TPP I a s eと GFP との融合蛋白質の分子量 45 kD a付近にのみシグナルが検出され、 GF Pの切断は確 認されなかった。
(実施例 8)
1. MMI遺伝子の単離
p TWI N 1 (N e w En g l a n d B i o 1 a b s社） を铸型とし、 配列番号 2 9と 30に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして PC Rを行い、 S s p I の C末端部分配列である MM Iをコードする遺伝子 （MM I遺伝子） を含む DN A断片 を単離した。 配列番号 3 1にその塩基配列と対応するアミノ酸配列、 配列番号 3 2にァ ミノ酸酉己列のみを示す。 すなわち、 MMIは、 S s p Iの C末端から 48番目のァミノ 酸までの部分に相当する。
2. 古細菌由来シャぺ口ニンサブュニット連結体の発現系構築
配列番号 40と 4 1にそれぞれ示される 2種のオリゴヌクレオチドを合成し、 これら をアニーリングさせ、 6H i sをコードする 2本鎖 DNAを調製した。 この 2本鎖 DN Aを、 実施例 1で調製した発現ベクター p ETDH (TCP ^) 4 I上の （TCP ） 4 遺伝子の上流にある N c o Iサイトに導入し、 発現ベクター p ETDH (TCP β) 4 I— 2を構築した。 図 1 2に p ETDH (TCP j3) 4 I— 2の構成を示す。 すなわち 、 p ETDH (TCP j8) 4 I _ 2は T 7プロモーターを有し、 その下流に、 6H i s 遺伝子、 （TCP ） 4の遺伝子、 及び S S p I遺伝子が順に配置されている。 また、 p ETDH (TC P j3) 41 _ 2の S p e Iサイトと Hp a Iサイトの間に目的蛋白質を コードする遺伝子を挿入することにより、 N末端に H i sタグが付いた、 (TCP ;8) 4 と S s p Iと目的蛋白質との融合蛋白質を発現するベクターを構築することができる。 同様にして、 p ETDH (TCP j3) 4 I— 2の S s p Iの代わりに、 MM I遺伝子 を導入した発現ベクター p ETDH (TCP j3) 4MM I _ 2を構築した。 図 1 3に p ETDH (TCP j8) 4 MM I— 2の構成を示す。 すなわち、 p ETDH (TCP j8) 4 MM I— 2の構成は p ETDH (TCP β) 4 I— 2とほぼ同じであり、 S s p I遺伝 子が MM I遺伝子に置き換わっている点のみが異なる。 p ETDH (TCP j3) 4MM I— 2の S p e Iサイトと Hp a Iサイトの間に目的蛋白質をコードする遺伝子を挿入 することにより、 N末端に H i sタグが付いた、 （TCP j3) 4と MMI Iと目的蛋白質 との融合蛋白質を発現するベクターを構築することができる。 3. 抗体軽鎖の発現、 切断
実施例 1で単離した Ab L遺伝子を含む DNA断片を p ETDH (TCP 41一 2及び p ETDH (TCP ]3) 4MM I― 2にそれぞれ導入し、 p ETDH (TCP β ) 4 I · Ab L— 2及び p ETDH (TCP ;3) 4MM I ' Ab L— 2を構築した。 すな わち、 p ETDH (TCP ) 4 I · Ab L— 2によれば （TCP jS) 4と S s p lと A b Lとの融合蛋白質を、 p ETDH (TCP ]3) 4MM I ' Ab L— 2によれば、 （TC P β) 4とMMIと Ab Lとの融合蛋白質を発現することができる。
得られた発現ベクター p ETDH (TCP β) 4 I · Ab L_ 2及び p ETDH (T CP j3) 4 MM I ' Ab L— 2を、 それぞれ大腸菌 B L 2 1 (DE 3) 株に導入して形 質転換体を得た。 これらの形質転換体を、 カルべニシリン (1 00 / g/mL) を含む 2 XY. T. 培地で 3 0°C、 24時間培養し、 （TCP jS) 4と S s p Iと A b Lとの融 合蛋白質、 及び （TCP ） 4と MM Iと Ab Lとの融合蛋白質を発現させた。 これら の菌体を 5 OmM T r i s/HC l緩衝液 0. 2mM EDTA (pH7 · 0) に それぞれ懸濁し、 プロテアーゼインヒビターカクテル存在下、 超音波処理にて各菌体を 破砕後、 遠心により各菌体破碎液上清を得た。
(比較例 8)
実施例 8で構築した p ETDH (TCP i3) 4 I · A b L— 2の S s p I遺伝子の代 わりにプレシジョンプロテアーゼの認識ァミノ酸配列をコードする遺伝子を導入した発 現ベクター p ET (TCP ;3) 4P · Ab L— 2を構築した。 実施例 8と比較例 8で調製した各菌体破碎液上清を室温で 2時間処理したものにつき 、 軽鎖抗体を認識する抗体を用いたウェスタンブロッテイング解析を行い、 Ab Lがシ ャぺロニンから切断されている力否かを試験した。 結果を図 1 4に示す。 すなわち、 実 施例 8の p ETDH (TCP ]3) 4MM I ' Ab L— 2 (レーン 1) 及ぴ p ETDH ( TCP jS) 4 I · Ab L- 2 (レーン 2) では A b Lが分子量 2 5 k D a付近に検出さ れ、 A b Lが各融合蛋白質から切り出されていることが確認された。 なお、 2 50 kD a付近のバンドは （TCP i3) 4と MMIと Ab Lとの融合蛋白質 （レーン 1)、 又は （ TCP β) 4と S s ρ Iと Ab Lとの融合蛋白質 （レーン 2) である。 一方、 比較例 8 (レーン 3) では分子量 2 5 0 kD a付近にのみ検出され、 Ab Lは各融合蛋白質から 切り出されていなかった。 また、 シグナルの強度をレーン 1とレーン 2とで比較すると 、 これらは同程度であった。 すなわち、 MMIと S s p Iとでは、 目的蛋白質を切断す る活性は同程度であった。
(実施例 9)
1. 抗体重鎖の発現
長鎖 DN A合成を行い、 配列番号 3 3に示されるヒト由来抗 HB s抗体の重鎖 （Ab H) 遺伝子を含む DN A断片を調製した。 なお、 この DNA断片にはプライマーに由来 して 5， 末端には S p e Iサイトを、 3， 末端には H p a Iサイトがそれぞれ設けられ た。 この DNA断片を、 実施例 8に示した p ETDH (TCP j3 ) 4MM I— 2の S p e I及び H p a Iサイトの間に組み込んだ。 これにより、 N末端に 6 H i sを有する、 (TCP /3) 4と MM Iと AbHとの融合蛋白質を合成する発現ベクター p ETDH ( TCP j3) 4 MM I ' AbH— 2を構築した。
得られた発現ベクター p ETDH (TC P ]3) 4 MM I · A b H— 2を大腸菌 B L 2 1 (DE 3) 株に導入し、 形質転換体を得た。 この形質転換体を、 カルべニシリン （1 00 μ g/mL) を含む 2 XY. Τ. 培地で 3 0°C、 24時間培養し、 （TCP 3) 4と MM Iと AbHとの融合蛋白質を発現させた。 菌体を回収し、 菌体を 50mM T r i s/HC l緩衝液 0. 2mM EDTA (pH7 · 0) に懸濁し、 プロテアーゼイン ヒビタ一力クテル存在下、 超音波処理にて菌体を破砕後、 遠心により菌体破碎液上清を 得た。
(比較例 9)
p ETDH (TCP ]3) 4MMI— 2をの代わりに p ETDH (TCP j3) 4 I一 2を 用いる以外は全て実施例 9と同様にして、 発現ベクターの構築、 形質転換、 及び形質転 換体の培養を行い、 菌体 ΐ皮碎液上清を得た。 実施例 9と比較例 9で調製した各菌体破石 夜上清を SD S— PAGEに供し、 CBB 染色を行った。 結果を図 1 5に示す。 すなわち、 レーン 1 (実施例 9) では 2 90 kD a付近に （TC P jS) 4と MM Iと AbHとの融合蛋白質に由来するバンドが検出され た。 一方、 レーン 2 (比較例 9) では、 300 kD a付近に非常に薄いバンドし力検出 されなかった。 すなわち、 比較例 9の方は実施例 9に比べて発現量がかなり低かつた。 以上より、 目的蛋白質が 50 k D a程度の A b Hである場合、 比較例 9で調製した （ TCP i3) 4と S s p Iと AbHとの融合蛋白質では、 S s p Iと AbHがシャぺ口- ンのキヤビティに入りきらないため、 発現しなくなるか、 発現量が激減したと考えられ た。 一方、 実施例 9のように、 S s p Iの代わりにその部分配列である MM Iを導入し た場合は、 特に問題なく融合蛋白質を発現させることができた。 これは、 MMIと Ab Hがシャぺ口ニンのキヤビティに納まるためと考えられた。
実施例 9で得られた発現べクタ一 pETDH (TCP β) 4 MM I · AbHからの菌 体破碎液上清を室温で 2時間処理し、 融合蛋白質から AbHを切り出した。 抗体重鎖を 認識する抗体 （P I ERCE社 ャギ抗ヒト I gG F(a b') 2抗体 _HRP c o n j ug a t e) を用いたウェスタンブロッテイング解析を行い、 AbHが融合蛋白質か ら切り出されている力否かを確認した。 結果を図 16に示す。 その結果、 シグナルが分 子量 50 kDa付近に検出され、 融合蛋白質から AbHが切り出されていることが確認 された。 なお、 290 kD a付近のパンドはシャぺ口ニン サブユニット TCP 4量 体と MMIと AbHとの融合蛋白質である。
(実施例 10)
1. ダルタチオン一 S—トランスフ ラーゼ （GST) との融合蛋白質発現系構築 アマシャムファノレマシァノくィォテク (Am e r s h am Ph a rma c i a B i o t e c h) 社から市販されている pGEX— 4T—1ベクターの B amHI— No t Iサイトに、 配列番号 34に示される 2本鎖 DN Aを揷入し、 Sp e lサイト、 Hp a Iサイト及ぴ 6 H i s遺伝子を導入した。 また、 B a mH Iサイトと上記 S p e Iサイ トの間に実施例 8で得られた MM I遺伝子を導入した。この発現べクタ一を pGEX M MIと命名した。 図 17に p GEX MMIの構成を示す。 すなわち、 pGEX MMI は t a cプロモーターを有し、 その下流に、 GST遺伝子、 MMI遺伝子、 6H i s遺 伝子が順に配置されている。 そして、 Sp e lサイトと Hp a lサイトの間に目的蛋白 質の遺伝子を揷入することにより、 GSTと MMIと目的蛋白質との融合蛋白質を発現 するベクターを構築することができる。 2. GFPの発現、 切断
p I VEX2. 3—GFP WTベクター （ロシュ 'ダイァグノスティックス社） を 鎳型とし、 配列番号 23と 24に示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして P C Rを行い、 配列番号 25に示される GFP遺伝子を含む DNA断片を単離した。 なお、 この DNA断片にはプライマーに由来して 5' 末端には S p e Iサイトを、 3' 末端に は Hp a Iサイトがそれぞれ設けられた。 この DN A断片を、 本実施例で構築した pG EX MM Iの S p e I及び H p a Iサイトの間に組み込んだ。これにより、 GSTと M Mlと GFPとの融合蛋白質を合成する発現ベクター pGEX MMI 'GFPを構築し た。 同様にして、 MM I遺伝子の代わりに実施例 1で調製した S s p I遺伝子を導入し た発現ベクター pGEX I · GFPを構築した。
pGEX MM I · GFP (実施例 10— 1) 及ぴ p GEX I - GFP (実施例 10 -1) をそれぞれ大腸菌 BL 21 (DE3) 株に導入し、 形質転換体を得た。 これらの 形質転換体を、 カルべニシリン (100^ g/mL) を含む 2 XY. T. 培地で 25°C 、 24時間培養し、 GSTと S s p Iと GFPとの融合蛋白質、 及び GSTと MMIと G F Pとの融合蛋白質を発現させた。 それぞれの菌体を回収し、 各菌体を 50 mM T r i sZHC l緩衝液 (pH7. 0) に懸濁し、 プロテアーゼインヒビターカクテル存 在下、 超音波処理にて各菌体を破碎後、 遠心により各菌体破碎液上清を得た。
(比較例 10)
図 17に示す pGEX MM Iについて、 B a mH Iサイトと S p e Iサイトの間に M M Iをコードする遺伝子の代わりに、 プレシジョンプロテアーゼの認識配列をコードす る遺伝子を導入した pGEX Pを構築した。 そして、 pGEX MMIの代わりに pG EX Pを用いる以外は全て実施例 10と同様に、発現ベクターの構築、形質転換、形質 転換体の培養を行い、 実施例 10と同様に菌体破碎液上清を得た。 実施例 10と比較例 10で調製したそれぞれの菌体破石 夜上清を、 N i—NT Aァガ ロースゲル （キアゲン社） で精製した後、 室温で 2時間処理したものにつき、 ヒスチジ ンタグを認識する抗体を用いたウェスタンプロッティング解析を行レ \ GFPが各融合 蛋白質から切り出されている力否かを確認した。 結果を図 18に示す。 すなわち、 実施 例 10の pGEX I · GFP (レーン 1)では GFPが分子量 27 kDa付近に検出さ れ、 GFPが融合蛋白質から切り出されていることが確認された。 また、 pGEX MM I . GFP (レーン 2) においても、 GFPが分子量 27 kD a付近に検出され、 GF Pが融合蛋白質から切り出されていることが確認された。 なお、 58 kDa付近のバン ドは G S Tと MM Iと G F Pとの融合蛋白質である。 一方、 比較例 10 (レーン 3 ) で は分子量 53 kD a付近にのみバンドが検出され、 GFPは融合蛋白質から切り出され ていなかった。
(実施例 11 )
1. 無細胞翻訳系における融合蛋白質の発現
実施例 4で調製した p ET TPP I a s e Iで、 S s p I遺伝子に代わって MM I 遺伝子が挿入されたプラスミド p ET TPP I a s e MM Iを構築した（図 19)。実 施例 10で調製した配列番号 25に示される G F P遺伝子を含む D N A断片を、 S p e Iおよび Hp a I処理し、 同制限酵素で処理した発現ベクター p ET TP P I a s e MM Iに組み込んだ。 これにより、 T P P I a s eと MM Iと G F Pとの融合蛋白質を 合成する発現ベクター p ET TPP I a s e MM I · GFPを構築した。
得られた発現ベクター p ET TPP I a s e MM I ' GFPについて、 無細胞蛋白 質発現 （ロシュ ·ダイァグノスティック社 RTS 500使用） を行なった。
(比較例 1 1 )
実施例 4で構築した p ET TPP I a s e Iを使用した（比較例 1 1— 1)。 さらに 、 p ET TPP I a s e MMIのBamHIサィトと Sp e Iサイトの間に、 MM I でなくプレシジョンプロテアーゼの認識配列をコ一ドする遺伝子とした p E T TPP I a s e Pを構築した （比較例 11一 2)。 pET TPP I a s e MM I · G F Pを p ET TPP I a s e I · 0 又は £丁 TPP I a s e P · GFPとする以外 は全て実施例 1 1と同様にして蛋白合成を行なった。 実施例 1 1と比較例 11で調製したそれぞれの反応液を N i一 NT Aァガロースゲル (キアゲン社製） で精製した後、 室温で 2時間処理したものにつき、 抗 GFPマウスモ ノクローナノレ抗体 (S a n t a Cr u z B i o t e c hn o l o g y社） を用いたゥ エスタンプロッティング解析を行い、 GFPが TPP I a s eから切断されている力否 力を試験した。結果を図 20に示す。 実施例 11 (レーン 3) の pET TPP I a s e MM I · GFPでは GFPが分子量 27 kD a付近に観測され、 GFPが TPP I a s eから切断されていることが確認された。 なお、 50 kD a付近のシグナルは TP P I a s 6と^：1^1と GFPとの融合蛋白質である。 また、 比較例 1 1-1 (レーン 2) の p ET TPP I a s e I · GF Pでも GF Pが分子量 27 k D a付近に観測され、 G FPが TPP I a s eから切断されていることが確認された。 なお、 62 k D a付近の シグナルは TP P I a s eと S s p Iと G F Pとの融合蛋白質である。 一方、 比較例 1 1一 2の ρ ET TPP I a s e P · GF P (レーン 4) では TP P I a s eと GFP との融合蛋白質の分子量 45 kD a付近にのみシグナル観測され、 G F Pの切断は確認 されなかった。 これらの結果から、 S s p Iと同様に、 MM Iは無細胞蛋白合成を行な つた場合にも切断活性を有して!/、ることが確認された。

Claims

請求の範囲
1 . ぺプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の一方の末端には分子シャぺ口ン又は そのサブユニットをペプチド結合で連結させ、 且つ、 他方の末端には目的蛋白質をぺプ チド結合で連結させたことを特徴とする融合蛋白質。
2 . 分子シャペロンが、 複数のシャぺ口-ンサプユニットからなるシャぺ口ニンであ ることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の融合蛋白質。
3 . ぺプチド結合切断活性を有する介在蛋白質が、 単独のシャぺ口ニンサブュニット 、 又はシャぺ口ニンサブュニット連結体に連結されており、 前記シャぺ口ニンサブュニ ット連結体は、 2〜 1 0個のシャぺ口ニンサブュニットがぺプチド結合を介して直列に 連結したものであることを特徴とする請求の範囲第 2項に記載の融合蛋白質。
4. ぺプチド結合切断活性を有する介在蛋白質が、 単独のシャぺ口ニンサブュニット 又はシャぺ口ニンサブュ-ット連結体の N末端、 単独のシャぺ口ニンサブュニット又は シャぺ口ニンサブュニット連結体の C末端、 シャぺ口ニンサブュニット連結体のシャぺ 口ニンサブュニット同士の連結部、 から選択される 1又は 2以上の部位に連結されてい ることを特徴とする請求の範囲第 3項に記載の融合蛋白質。
5 . シャぺ口ニンサブユニットと目的蛋白質との数の比が 1 ： 1〜1 0 ： 1であるこ とを特徴とする請求の範囲第 3項又は第 4項に記載の融合蛋白質。
6 . 分子シャぺ口ンがぺプチジルプロリルシストランスィソメラーゼであることを特 徴とする請求の範囲第 1項に記載の融合蛋白質。
7. ぺプチド結合切断活性を有する介在蛋白質が、 ぺプチジルプロリルシストランス ィソメラーゼの N末端及び Z又は C末端に連結されていることを特徴とする請求の範囲 第 6項に記載の融合蛋白質。
8 . 分子シャペロンが、 ノ クテリア、 古細菌又は真核生物に由来することを特徴とす る請求の範囲第 1項〜第 7項のいずれかに記載の融合蛋白質。
9 . ぺプチド結合切断活性を有する介在蛋白質がィンティン又はィンティンの部分配 列蛋白質であることを特徴とする請求の範囲第 1項〜第 8項のいずれかに記載の融合蛋
1 0 . インティンが、 N末端を切断するが C末端を切断しないものであることを特徴 とする請求の範囲第 9項に記載の融合蛋白質。 ；、 C末端を切断するが N末端を切断しなレヽものであること特徴と する請求の範囲第 9項に記載の融合蛋白質。
12. インティンの部分配列蛋白質が、 インティンの C末端から 20〜120個のァ ミノ酸残基からなることを特徴とする請求の範囲第 9項に記載の融合蛋白質。
13. インティンが、 Syn e c h o c y s t i s s p . 由来のものであることを 特徴とする請求の範囲第 9項〜第 12項のいずれかに記載の融合蛋白質。
14. ィンアイ、ノ 、 My c o b a c t e r i u m x e n o p i、 S a c c h a r omy c e s c e r e v i s i a e、 Ha l o b a c t e r i um s p . かり選択 される由来のものであることを特徴とする請求の範囲第 9項〜第 12項の!/、ずれかに記 載の融合蛋白質。
15. インティンの部分配列蛋白質が、 配列番号 1に示されるアミノ酸配列を有する 蛋白質、 又は配列番号 1において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 付加若し くは揷入されたアミノ酸配列を有し、 且つぺプチド切断活性を有する蛋白質であること を特徴とする請求の範囲第 12項に記載の融合蛋白質。
16. インティンの部分配列蛋白質が、 配列番号 1に示されるアミノ酸配列と少なく とも 50 %以上の相同性を有し、 且つべプチド切断活性を有する蛋白質であることを特 徴とする請求の範囲第 12項に記載の融合蛋白質。
17. ペプチド結^]断活性を有する介在蛋白質がプロテアーゼであることを特徴と する請求の範囲第 1項〜第 16項のいずれかに記載の融合蛋白質。
18. 請求の範囲第 1項〜第 17項のいずれかに記載の融合蛋白質をコードする単離 された遺伝子。
19. 請求の範囲第 1項〜第 17項のいずれ力に記載の融合蛋白質から、 目的蛋白質 を、 ぺプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の作用によって切り出すことを特徴とす る目的蛋白質の製造方法。
20. 請求の範囲第 1項〜第 17項のいずれかに記載の融合蛋白質を調製する工程と 、 前工程で調製した融合蛋白質に含まれるぺプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の ぺプチド結合切断活性を惹起する工程と、 前工程でぺプチド結合切断活性を惹起したべ プチド結合切断活性を有する介在蛋白質の作用により、 融合蛋白質の一部を切断し、 融 合蛋白質から目的蛋白質を切り出して遊離させる工程とを含むことを特徴とする目的蛋 白質の製造方法。
2 1 . 前記融合蛋白質を 2 0〜3 7 °Cの温度に曝すことにより前記ペプチド結合切断 活性を惹起することを特徴とする請求の範囲第 2 0項に記載の目的蛋白質の製造方法。
2 2 . 前記融合蛋白質を p H 6〜 8の水素ィオン濃度に曝すことにより前記べプチド 結合切断活性を惹起することを特徴とする請求の範囲第 2 0項又は第 2 1項に記載の目 的蛋白質の製造方法。
2 3 . チオールを添加することにより前記べプチド結合切断活性を惹起することを特 徴とする請求の範囲第 2◦項〜第 2 2項のいずれかに記載の目的蛋白質の製造方法。
2 4. 前記融合蛋白質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを作製する工程 と、 前工程で得られた発現べクタ一を宿主に導入して該融合蛋白質を発現する工程と、 前工程で得られた融合蛋白質から目的蛋白質を切り出す工程とを含むことを特徴とする 請求の範囲第 1 9項に記載の目的蛋白質の製造方法。
2 5 . 同一宿主内で共存 ·複製可能な 2種の異なるプラスミドに、 前記融合蛋白質を コ一ドする遺伝子を組み込んで 2種類の発現べクターを作製する工程と、 前工程で得ら れた 2種類の発現ベクターを同一宿主に導入し、 該融合蛋白質を発現させる工程と、 前 工程で得られた融合蛋白質から、 ぺプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の作用で目 的蛋白質を切り出す工程とを含むことを特徴とする請求の範囲第 1 9項に記載の目的蛋 白質の製造方法。
2 6 . 同一宿主内で共存 ·複製可能な 2種の異なるプラスミドの、 一方に前記融合蛋 白質をコードする遺伝子を組み込み、 他方に分子シャぺ口ンのみをコードする遺伝子を 組み込んで、 2種類の発現ベクターを作製する工程と、 前工程で得られた 2種類の発現 ベクターを同一宿主に導入し、 該融合蛋白質と該分子シャペロンを発現させる工程と、 前工程で得られた融合蛋白質から、 ぺプチド結合切断活性を有する介在蛋白質の作用で 目的蛋白質を切り出す工程を含むことを特徴とする請求の範囲第 1 9項に記載の目的蛋 白質の製造方法。
2 7. 宿主は、 バクテリア、 酵母、 動物細胞、 植物細胞、 昆虫細胞、 動物個体、 植物 個体又は昆虫個体であることを特徴とする請求の範囲第 2 4項〜第 2 6項のいずれかに 記載の目的蛋白質の製造方法。
2 8 . 宿主内で融合蛋白質を発現させ、 前記宿主はバクテリア、 酵母、 動物細胞、 植 物細胞、 昆虫細胞、 動物個体、 植物個体又は昆虫個体であることを特徴とする請求の範 囲第 1 9項〜第 2 6項のいずれかに記載の目的蛋白質の製造方法。
29. 無細胞翻訳系で行うことを特徴とする請求の範囲第 19項に記載の目的蛋白質 の製造方法。
30. 分子シャペロンがシャぺ口ニンであり、 5〜： 10個のシャぺ口ユンサブュニッ トがリング状に集合してシャぺロニンリングを形成しており、 前記目的蛋白質は、 該シ ャぺロニンリングの内部に収納されていることを特徴とする請求の範囲第 19項〜第 2 9項の！/ヽずれかに記載の目的蛋白質の製造方法。
31. インティンの C末端から 20〜120個のアミノ酸残基からなることを特徴と するィンティンの部分配列蛋白質。
32. インティンが、 Syn e c h o c y s t i s s p . 由来のものであることを 特徴とする請求の範囲第 31項に記載のィンティンの部分配列蛋白質。
33. Λ ンティンカ、 My c o b a c t e r i um x e n o p i、 S a c c h a r o my c e s c e r e v i s i a e、 Ha 丄 o b a c t e r i um s p . 力、ら選キ尺 される由来のものであることを特徴とする請求の範囲第 31項に記載のィンティンの部 分配列蛋白質。
34. インティンの部分配列蛋白質が、 配列番号 1に示されるアミノ酸配列を有する 蛋白質、 又は配列番号 1において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 付加若し くは揷入されたァミノ酸配列を有し、 且つべプチド切断活性を有する蛋白質であること を特徴とする請求の範囲第 31項に記載のィンティンの部分配列蛋白質。
35. ィンティンの部分配列蛋白質が、 配列番号 1に示されるァミノ酸配列と少なく とも 50 %以上の相同性を有し、 且つべプチド切断活性を有する蛋白質であることを特 徴とする請求の範囲第 31項に記載のィンティンの部分配列蛋白質。
36. 請求の範囲第 31項〜第 35項のいずれかに記載のィンティンの部分配列蛋白 質をコードする単離された遺伝子。
37. 請求の範囲第 18項又は第 36項に記載の遺伝子を含有する発現べクター。 38. 請求の範囲第 37項に記載の発現べクターを含有する形質転換体。
39. ィンティンの部分配列蛋白質の一方の末端には分子シャぺ口ン又はそのサブュ ニットをペプチド結合で連結させ、 且つ、 他方の末端には目的蛋白質第 1前駆体をぺプ チド結合で連結させた第 1の融合蛋白質を作製する工程 1と、 該ィンティンの残余の部 分配列蛋白質の一方の末端には分子シャペロン又はそのサブュニットをぺプチド結合で 連結させ、 且つ、 他方の末端には目的蛋白質第 2前駆体をペプチド結合で連結させた第 2の融合蛋白質を作製する工程 2と、 インティンの部分配列蛋白質と該- 余の部分配列蛋白質の切断機能により、 工程 1で得られた第 1の融合蛋白質から目的蛋 白質第 1前駆体を切り出し、 さらに工程 2で得られた第 2の融合蛋白質から目的蛋白質 第 2前駆体を切り出す工程 3と、 ィンティンの部分配列蛋白質と該ィンティンの残余の 部分配列蛋白質のアセンブリー機能により、 工程 3で得られた目的蛋白質第 1前駆体と 目的蛋白質第 2前駆体をァセンブルする工程 4とを含むことを特徴とする目的蛋白質の 製造方法。
4 0. 分子シャぺ口ンの一方の末端にィンティンの部分配列蛋白質、 他方の末端に該 ィンティンの残余の部分配列蛋白質がぺプチド結合を介して連結され、 さらに該ィンテ ィンの部分配列蛋白質に目的蛋白質第 1前駆体がぺプチド結合を介して連結され、 且つ 該ィンティンの残余の部分配列蛋白質に目的蛋白質第 2前駆体がぺプチド結合を介して 連結された融合蛋白質から、 ィンティンの部分配列蛋白質と該ィンティンの残余の部分 配列蛋白質の切断機能により、 目的蛋白質第 1前駆体及び目的蛋白質第 2前駆体を切り 出し、 さらにィンティンの部分配列蛋白質と該ィンティンの残余の部分配列蛋白質のァ センブリ一機能により、 目的蛋白質第 1前駆体と目的蛋白質第 2前駆体をァセンブルす ることを特徴とする目的蛋白質の製造方法。
4 1 . 前記融合蛋白質を宿主内で発現させることを特徴とする請求の範囲第 3 9項又 は第 4 0項に記載の目的蛋白質の製造方法。
4 2 . 前記宿主が、 バクテリア、 酵母、 動物細胞、 植物細胞、 昆虫細胞、 動物個体、 植物個体又は昆虫個体であることを特徴とする請求の範囲第 4 1項に記載の融合蛋白質 の製造方法。
4 3 . 無細胞翻訳系で行うことを特徴とする請求の範囲第 3 9項又は第 4 0項に記載 の目的蛋白質の製造方法。
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