JP5389882B2 - Dnaインサート増殖およびファージディスプレイ法のためのタンパク質発現の切り離し - Google Patents
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Description
本発明は、ファージコートタンパク質および異種ポリペプチドをコードする核酸配列を含む融合核酸構築物の発現に基づくファージディスプレイ技術の改善に関する。このような核酸構築物が発現されると融合タンパク質が産生される。融合タンパク質は、構築物を増殖し、粒子表面に異種ポリペプチドを提示するファージ粒子に組み立てられる。本発明は、ファージコートタンパク質および異種ポリペプチドをコードする配列の増殖と、異種ポリペプチドの発現および提示を切り離すのに使用することができる核酸構築物およびその使用方法を提供する。
ファージディスプレイ法は生物科学および生物工学において公知であり、広範囲に適用されている(米国特許第5,223,409号(特許文献1);同第5,403,484号(特許文献2);同第5,4571,698号(特許文献3);同第5,766,905号(特許文献4);ならびにこれらに引用された参考文献を参照のこと)。この手法では、関心対象の外来ポリペプチドをバクテリオファージ粒子の表面に提示するために、外来ポリペプチドをコードする核酸配列とファージコートタンパク質をコードする配列の融合を利用する。この技術の応用には、親和性相互作用を使用して、ポリペプチドライブラリー(ライブラリーのメンバーは個々のファージ粒子の表面に提示される)から特定のクローンを選択することが含まれる。ポリペプチドの提示は、ポリペプチドをコードする配列が挿入されているファージベクターから、ポリペプチドをコードする配列が発現された結果である。従って、関心対象のポリペプチドのスクリーニングに使用できるファージライブラリーを形成するために、ポリペプチドをコードする配列のライブラリーが個々のディスプレイファージベクターに導入される。
本発明は、ファージディスプレイを実施している間は連関している増殖とファージ表面タンパク質および異種ポリペプチドの発現とを切り離す能力を提供する。この切り離しは制御可能であり、異種ポリペプチドを発現することなくファージディスプレイ融合構築物を増殖できるという利点をもたらす。好ましい態様では、ファージディスプレイ融合構築物の増殖は、コードされる異種ポリペプチドの発現から切り離されている。
本発明のファージ由来核酸構築物は、プロモーターおよび/または調節領域がファージ表面タンパク質のコード配列に作動可能に連結され、ファージ表面タンパク質のコード配列が終止コドンを含む配列にインフレームに連結され、終止コドンを含む配列が異種ポリペプチドをコードする配列にインフレームに連結されている核酸分子を含む。本明細書で使用する「ファージ由来」とは、ファージ遺伝子産物をコードする天然に生じるポリヌクレオチドに見出される1つまたは複数の核酸配列を含む構築物を意味する。「作動可能に連結された」という用語は、連結されたプロモーターおよび/または調節領域がコード配列の発現を機能的に制御するような、核酸配列間の機能的連結を意味する。「作動可能に連結された」という用語はまた、同じ列に並んだプロモーターおよび/または調節領域がコード配列を制御できるような、コード配列間の連結も意味する。このようなコード配列間の連結はまた、コード配列によりコードされるアミノ酸を含む融合タンパク質が発現されるようにインフレームに連結している、または同じ読み枠内にあると言うこともできる。
本明細書で使用する「ベクター」という用語は、連結されている別の核酸を運ぶことができる核酸分子を意味する。この用語は、ファージに基づくベクターを含む。ファージに基づくベクターとして、ファージに基づくプラスミドおよび「ファージミド」などがあるが、これに限定されない。ベクターの一種がエピソーム、すなわち、染色体外複製が可能な核酸分子である。ベクターはまた、細胞ゲノムへ組み込むために核酸分子を細胞に送達するのに使用することもできる。本発明の実施に好ましいベクターは、ベクターを含むファージ粒子のパッケージングに必要な遺伝子産物を発現することができる、ファージゲノムに由来するベクターである。
ファージ構築物および細胞株
代表例としてT7を用いて、T7ゲノムに由来するファージディスプレイ構築物が本発明に従って構築された。T7ゲノムの全配列は当技術分野において公知である。この構築物は、野生型T7プロモーター(
を含む)およびシャイン-ダルガルノリボソーム進入部位(
を含む)の制御下にあるgene 10によりコードされるコートタンパク質を有する。これらの配列は両方ともgene 10のATG開始コドンの上流(5')にある。gene 10は、前記および本明細書に記載の異種ポリペプチドをコードする配列との融合を容易に可能にする制限部位を含むように3'末端で改変されている。この構築物を「ATV」ファージまたはATVファージ構築物と名付けた。
アンバー抑制によるファージディスプレイの誘導
2つの異なるcDNA配列を、アンバーコドンを含むATVファージ構築物に挿入した。これらのcDNAは、FK506結合タンパク質(FKBP)およびp38マイトジェン活性化プロテイン(MAP)キナーゼ(MAPK)をコードする。pBAD-tRNAAla /TAGを含むBL21細胞を対数期まで増殖させ、サプレッサーtRNAAla/TAGを発現させるために2つの異なる濃度のL-アラビノースを用いて30分間誘導した。誘導後、細胞に、gene 10コートタンパク質との融合体としてFKBPまたはp38 MAPKのいずれかをコードするcDNAインサートを含むATVファージを感染させた。結果として得られたファージタンパク質のウエスタンブロットの結果を図1に示す。図1から、L-アラビノースの非存在下では融合タンパク質の発現は全くといってよいくらい検出されないことがはっきりと分かる。使用した2種類の濃度のL-アラビノースの添加によって、融合タンパク質の発現がアラビノース濃度依存的に増大する。
アラビノース濃度に対する抑制活性の依存性
対数期まで増殖させ、5つの異なる濃度(最終濃度0.2%〜0.002%)のL-アラビノースを用いて30分間誘導したBL21細胞に感染させるために、ATV-FKBPファージを使用した。同じ実験において、融合タンパク質の発現レベルを、同じFKBP cDNAを含むNovagenT7 10-3(高発現)株およびT7 1-1(低発現)ファージ株と比較した。ファージタンパク質のウエスタンブロット分析の結果を図3に示す。図3から、産生された融合タンパク質の量は、誘導に使用した漸増量のL-アラビノースによって増大することが分かる。ATV株において産生され、観察された融合タンパク質の濃度は、T7 1-1で観察されたものより高いが、T7 10-3ファージで観察されたものより低い。細胞培地に含まれるグルコース量を減らすことによって、ATV株を用いた発現をさらに高めることができる。グルコース濃度が低いほど、BADプロモーターの誘導が大きくなる。
ATVファージにおけるクローン収集物の改善
ATVファージが、異種ポリペプチドをコードする配列の変異率を小さくできることを図4に示す。6種類のタンパク質をコードするcDNAをNovagen10-3 T7株またはATVファージに導入し、その後、1回の増殖(growth)(繁殖(propagation))および発現を行った。10-3株またはATV株を使用した、変異cDNA配列に対する野生型cDNA配列の数を示す。6種類全てのcDNAについて、ATV株を使用した時には変異配列は観察されなかったが、10-3株では、6種類のcDNAのうち4種類について変異配列が観察された。特に、10-3ファージを使用した時に、CamK IVおよびグリセロールキナーゼをコードする全てのcDNAが変異したと観察された。
Claims (9)
- 5'→3'方向において、作動可能に連結されている次の要素:(1)T7コートタンパク質をコードするgene 10核酸配列と、(2)インフレーム終止コドンと、(3)異種ポリペプチドをコードする核酸配列のインフレーム挿入のためのクローニング部位と、を含む核酸分子を含む改良されたT7ファージゲノムを含むベクターであって、前記異種ポリペプチドの発現がサプレッサーtRNAの発現を条件とするベクター。
- 前記gene 10核酸配列の5’に作動可能に連結されている野生型T7プロモーター核酸配列をさらに含む、請求項1記載のベクター。
- 前記T7プロモーター核酸配列の3’および前記gene 10核酸配列の5’に作動可能に連結されている野生型T7シャイン-ダルガルノ核酸配列をさらに含む、請求項2記載のベクター。
- 前記終止コドンの3’および前記クローニング部位の5‘に作動可能に連結されているインフレームリンカーをコードする核酸配列をさらに含む、請求項1〜3のいずれかに記載のベクター。
- 前記リンカーが酵素切断部位を含む、請求項4記載のベクター。
- 前記酵素切断部位がタバコエッチウイルス(TEV)プロテアーゼにより認識され切断される、請求項5記載のベクター。
- 前記終止コドンの3’に作動可能に連結されている異種ポリペプチドをコードするインフレーム核酸配列をさらに含む、請求項1〜6のいずれかに記載のベクター。
- 前記異種ポリペプチドがプロテインキナーゼである、請求項7記載のベクター。
- 請求項3記載のベクターを含む改変されたT7ファージ。
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