JP2005534333A - Dnaインサート増殖およびファージディスプレイ法のためのタンパク質発現の切り離し - Google Patents
Dnaインサート増殖およびファージディスプレイ法のためのタンパク質発現の切り離し Download PDFInfo
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Abstract
Description
本発明は、ファージコートタンパク質および異種ポリペプチドをコードする核酸配列を含む融合核酸構築物の発現に基づくファージディスプレイ技術の改善に関する。このような核酸構築物が発現されると融合タンパク質が産生される。融合タンパク質は、構築物を増殖し、粒子表面に異種ポリペプチドを提示するファージ粒子に組み立てられる。本発明は、ファージコートタンパク質および異種ポリペプチドをコードする配列の増殖と、異種ポリペプチドの発現および提示を切り離すのに使用することができる核酸構築物およびその使用方法を提供する。
ファージディスプレイ法は生物科学および生物工学において公知であり、広範囲に適用されている(米国特許第5,223,409号;同第5,403,484号;同第5,4571,698号;同第5,766,905号;ならびにこれらに引用された参考文献を参照のこと)。この手法では、関心対象の外来ポリペプチドをバクテリオファージ粒子の表面に提示するために、外来ポリペプチドをコードする核酸配列とファージコートタンパク質をコードする配列の融合を利用する。この技術の応用には、親和性相互作用を使用して、ポリペプチドライブラリー(ライブラリーのメンバーは個々のファージ粒子の表面に提示される)から特定のクローンを選択することが含まれる。ポリペプチドの提示は、ポリペプチドをコードする配列が挿入されているファージベクターから、ポリペプチドをコードする配列が発現された結果である。従って、関心対象のポリペプチドのスクリーニングに使用できるファージライブラリーを形成するために、ポリペプチドをコードする配列のライブラリーが個々のディスプレイファージベクターに導入される。
本発明は、ファージディスプレイを実施している間は連関している増殖とファージ表面タンパク質および異種ポリペプチドの発現とを切り離す能力を提供する。この切り離しは制御可能であり、異種ポリペプチドを発現することなくファージディスプレイ融合構築物を増殖できるという利点をもたらす。好ましい態様では、ファージディスプレイ融合構築物の増殖は、コードされる異種ポリペプチドの発現から切り離されている。
本発明のファージ由来核酸構築物は、プロモーターおよび/または調節領域がファージ表面タンパク質のコード配列に作動可能に連結され、ファージ表面タンパク質のコード配列が終止コドンを含む配列にインフレームに連結され、終止コドンを含む配列が異種ポリペプチドをコードする配列にインフレームに連結されている核酸分子を含む。本明細書で使用する「ファージ由来」とは、ファージ遺伝子産物をコードする天然に生じるポリヌクレオチドに見出される1つまたは複数の核酸配列を含む構築物を意味する。「作動可能に連結された」という用語は、連結されたプロモーターおよび/または調節領域がコード配列の発現を機能的に制御するような、核酸配列間の機能的連結を意味する。「作動可能に連結された」という用語はまた、同じ列に並んだプロモーターおよび/または調節領域がコード配列を制御できるような、コード配列間の連結も意味する。このようなコード配列間の連結はまた、コード配列によりコードされるアミノ酸を含む融合タンパク質が発現されるようにインフレームに連結している、または同じ読み枠内にあると言うこともできる。
本明細書で使用する「ベクター」という用語は、連結されている別の核酸を運ぶことができる核酸分子を意味する。この用語は、ファージに基づくベクターを含む。ファージに基づくベクターとして、ファージに基づくプラスミドおよび「ファージミド」などがあるが、これに限定されない。ベクターの一種がエピソーム、すなわち、染色体外複製が可能な核酸分子である。ベクターはまた、細胞ゲノムへ組み込むために核酸分子を細胞に送達するのに使用することもできる。本発明の実施に好ましいベクターは、ベクターを含むファージ粒子のパッケージングに必要な遺伝子産物を発現することができる、ファージゲノムに由来するベクターである。
ファージ構築物および細胞株
代表例としてT7を用いて、T7ゲノムに由来するファージディスプレイ構築物が本発明に従って構築された。T7ゲノムの全配列は当技術分野において公知である。この構築物は、野生型T7プロモーター(
を含む)およびシャイン-ダルガルノリボソーム進入部位(
を含む)の制御下にあるgene 10によりコードされるコートタンパク質を有する。これらの配列は両方ともgene 10のATG開始コドンの上流(5')にある。gene 10は、前記および本明細書に記載の異種ポリペプチドをコードする配列との融合を容易に可能にする制限部位を含むように3'末端で改変されている。この構築物を「ATV」ファージまたはATVファージ構築物と名付けた。
アンバー抑制によるファージディスプレイの誘導
2つの異なるcDNA配列を、アンバーコドンを含むATVファージ構築物に挿入した。これらのcDNAは、FK506結合タンパク質(FKBP)およびp38マイトジェン活性化プロテイン(MAP)キナーゼ(MAPK)をコードする。pBAD-tRNAAla /TAGを含むBL21細胞を対数期まで増殖させ、サプレッサーtRNAAla/TAGを発現させるために2つの異なる濃度のL-アラビノースを用いて30分間誘導した。誘導後、細胞に、gene 10コートタンパク質との融合体としてFKBPまたはp38 MAPKのいずれかをコードするcDNAインサートを含むATVファージを感染させた。結果として得られたファージタンパク質のウエスタンブロットの結果を図1に示す。図1から、L-アラビノースの非存在下では融合タンパク質の発現は全くといってよいくらい検出されないことがはっきりと分かる。使用した2種類の濃度のL-アラビノースの添加によって、融合タンパク質の発現がアラビノース濃度依存的に増大する。
アラビノース濃度に対する抑制活性の依存性
対数期まで増殖させ、5つの異なる濃度(最終濃度0.2%〜0.002%)のL-アラビノースを用いて30分間誘導したBL21細胞に感染させるために、ATV-FKBPファージを使用した。同じ実験において、融合タンパク質の発現レベルを、同じFKBP cDNAを含むNovagenT7 10-3(高発現)株およびT7 1-1(低発現)ファージ株と比較した。ファージタンパク質のウエスタンブロット分析の結果を図3に示す。図3から、産生された融合タンパク質の量は、誘導に使用した漸増量のL-アラビノースによって増大することが分かる。ATV株において産生され、観察された融合タンパク質の濃度は、T7 1-1で観察されたものより高いが、T7 10-3ファージで観察されたものより低い。細胞培地に含まれるグルコース量を減らすことによって、ATV株を用いた発現をさらに高めることができる。グルコース濃度が低いほど、BADプロモーターの誘導が大きくなる。
ATVファージにおけるクローン収集物の改善
ATVファージが、異種ポリペプチドをコードする配列の変異率を小さくできることを図4に示す。6種類のタンパク質をコードするcDNAをNovagen10-3 T7株またはATVファージに導入し、その後、1回の増殖(growth)(繁殖(propagation))および発現を行った。10-3株またはATV株を使用した、変異cDNA配列に対する野生型cDNA配列の数を示す。6種類全てのcDNAについて、ATV株を使用した時には変異配列は観察されなかったが、10-3株では、6種類のcDNAのうち4種類について変異配列が観察された。特に、10-3ファージを使用した時に、CamK IVおよびグリセロールキナーゼをコードする全てのcDNAが変異したと観察された。
Claims (43)
- 異種ポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結されている終止コドンを含む配列に作動可能に連結されているファージ表面タンパク質をコードする配列に作動可能に連結されている第1のプロモーターおよび/または調節領域を5'→3'方向に含む、第1の核酸分子を含むファージ由来核酸構築物、ならびに第2の誘導性プロモーターおよび/または調節領域が、該終止コドンに対応するサプレッサーtRNAをコードする配列に作動可能に連結されているサプレッサー構築物を含む、発現系。
- 構築物が、改変されたファージゲノムである、請求項1記載の系。
- ゲノムがT7ファージゲノムである、請求項2記載の系。
- 第1のプロモーターおよび/または調節領域が、ファージ由来核酸構築物を調製するのに用いられるファージに内因性のものである、請求項1記載の系。
- 第1のプロモーターおよび/または調節領域がT7プロモーターである、請求項1記載の系。
- 第2の誘導性プロモーターおよび/または調節領域がアラビノースBADプロモーターおよびaraC調節遺伝子である、請求項1記載の系。
- 終止コドンを含む配列が、酵素切断部位をコードする配列をさらに含む、請求項1記載の系。
- ファージ表面タンパク質が、溶菌性ファージのファージコートタンパク質、繊維状バクテリオファージのgene IIIキャプシドタンパク質、繊維状ファージのgene VIIIキャプシドタンパク質、およびバクテリオファージλのキャプシドDタンパク質(gpD)から選択される、請求項1記載の系。
- 溶菌性ファージのファージコートタンパク質がλ、T4、およびT7から選択される、請求項8記載の系。
- ファージコートタンパク質がT7に由来する、請求項9記載の系。
- ファージコートタンパク質がgene 10によりコードされる、請求項10記載の系。
- サプレッサー構築物が、クロラムフェニコール耐性をコードする発現可能な配列をさらに含む、請求項1記載の系。
- 終止コドンがUAG、UAA、およびUGAから選択される、請求項1記載の系。
- 終止コドンがUAGである、請求項13記載の系。
- サプレッサーtRNAがtRNAAlaまたはtRNAGluである、請求項1記載の系。
- サプレッサーtRNAがtRNAAlaである、請求項1記載の系。
- 以下の段階を含む、試験化合物と相互作用するポリペプチドを同定する方法:
請求項1記載の系を細胞に導入し、異種ポリペプチドをコードする配列の発現を誘導し、該ポリペプチドを、該細胞により産生されたファージ粒子の表面に提示させる段階;
該ファージ粒子と該試験化合物とを接触させる段階;および
該ポリペプチドの提示によるファージ粒子と該試験化合物との相互作用を検出することによって、該ポリペプチドが該試験化合物と相互作用することを確かめる段階。 - 細胞が大腸菌細胞である、請求項17記載の方法。
- 細胞がBL21の誘導体である、請求項18記載の方法。
- 細胞がBLT5615である、請求項19記載の方法。
- 以下の段階を含む、試験化合物と相互作用するポリペプチドを同定する方法:
請求項3記載の系を細胞に導入し、異種ポリペプチドをコードする配列の発現を誘導し、該ポリペプチドを、該細胞により産生されたファージ粒子の表面に提示させる段階;
該ファージ粒子と該試験化合物とを接触させる段階;および
該ポリペプチドの提示によるファージ粒子と該試験化合物との相互作用を検出することによって、該ポリペプチドが該試験化合物と相互作用することを確かめる段階。 - 以下の段階を含む、試験化合物と相互作用するポリペプチドを同定する方法:
請求項5記載の系を細胞に導入し、異種ポリペプチドをコードする配列の発現を誘導し、該ポリペプチドを、該細胞により産生されたファージ粒子の表面に提示させる段階;
該ファージ粒子と該試験化合物とを接触させる段階;および
該ポリペプチドの提示によるファージ粒子と該試験化合物との相互作用を検出することによって、該ポリペプチドが該試験化合物と相互作用することを確かめる段階。 - 以下の段階を含む、試験化合物と相互作用するポリペプチドを同定する方法:
請求項6記載の系を細胞に導入し、異種ポリペプチドをコードする配列の発現を誘導し、該ポリペプチドを、該細胞により産生されたファージ粒子の表面に提示させる段階;
該ファージ粒子と該試験化合物とを接触させる段階;および
該ポリペプチドの提示によるファージ粒子と該試験化合物との相互作用を検出することによって、該ポリペプチドが該試験化合物と相互作用することを確かめる段階。 - 以下の段階を含む、試験化合物と相互作用するポリペプチドを同定する方法:
請求項11記載の系を細胞に導入し、異種ポリペプチドをコードする配列の発現を誘導し、該ポリペプチドを、該細胞により産生されたファージ粒子の表面に提示させる段階;
該ファージ粒子と該試験化合物とを接触させる段階;および
該ポリペプチドの提示によるファージ粒子と該試験化合物との相互作用を検出することによって、該ポリペプチドが該試験化合物と相互作用することを確かめる段階。 - 以下の段階を含む、試験化合物と相互作用するポリペプチドを同定する方法:
終止コドンがUAGであり、サプレッサーtRNAがtRNAAlaである請求項1記載の系を細胞に導入し、異種ポリペプチドをコードする配列の発現を誘導し、該ポリペプチドを、該細胞により産生されたファージ粒子の表面に提示させる段階;
該ファージ粒子と該試験化合物とを接触させる段階;および
該ポリペプチドの提示によるファージ粒子と該試験化合物との相互作用を検出することによって、該ポリペプチドが該試験化合物と相互作用することを確かめる段階。 - ポリペプチドをコードする配列を単離する段階をさらに含む、請求項17記載の方法。
- 単離がPCR増幅によって行われる、請求項26記載の方法。
- 単離が、ポリペプチドをコードする配列を別の核酸分子に直接サブクローニングすることによって行われる、請求項26記載の方法。
- ポリペプチドをコードする配列を単離する段階をさらに含む、請求項21記載の方法。
- 単離がPCR増幅によって行われる、請求項29記載の方法。
- 単離が、ポリペプチドをコードする配列を別の核酸分子に直接サブクローニングすることによって行われる、請求項29記載の方法。
- ポリペプチドをコードする配列を単離する段階をさらに含む、請求項22記載の方法。
- 単離がPCR増幅によって行われる、請求項32記載の方法。
- 単離が、ポリペプチドをコードする配列を別の核酸分子に直接サブクローニングすることによって行われる、請求項32記載の方法。
- ポリペプチドをコードする配列を単離する段階をさらに含む、請求項23記載の方法。
- 単離がPCR増幅によって行われる、請求項35記載の方法。
- 単離が、ポリペプチドをコードする配列を別の核酸分子に直接サブクローニングすることによって行われる、請求項35記載の方法。
- ポリペプチドをコードする配列を単離する段階をさらに含む、請求項24記載の方法。
- 単離がPCR増幅によって行われる、請求項38記載の方法。
- 単離が、ポリペプチドをコードする配列を別の核酸分子に直接サブクローニングすることによって行われる、請求項38記載の方法。
- ポリペプチドをコードする配列を単離する段階をさらに含む、請求項25記載の方法。
- 単離がPCR増幅によって行われる、請求項41記載の方法。
- 単離が、ポリペプチドをコードする配列を別の核酸分子に直接サブクローニングすることによって行われる、請求項41記載の方法。
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