JP4038555B2 - 組み換え蛋白質の生産方法及び融合蛋白質 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、宿主系での組み換え蛋白質発現、又は、無細胞翻訳系での蛋白質発現において、活性型蛋白質として合成することが困難であった蛋白質の生産を可能とし、また、効率的な蛋白質の合成及び精製を実現する新規な蛋白質の生産方法及び融合蛋白質に関する。
背景技術
これまでに、バクテリア、酵母、昆虫、動植物細胞、トランスジェニック動・植物等の多くの宿主での組み換え蛋白質発現系及び無細胞翻訳系が確立されて来た。中でも哺乳動物の培養細胞による組み換え蛋白質生産は適当な翻訳後修飾が施されることから治療薬製造の標準システムとなりつつある。しかしながら、微生物を宿主とする系よりも蛋白質の合成レベルが低く、より大きな培養槽を必要とし、新薬を手がけるバイオテクノロジー産業では今後、製造設備が不足すると考えらている（Ｇａｒｂｅｒ，Ｋ．，２００１，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９，１８４−１８５）。近年、生産効率の向上が図られているトランスジェニック動・植物を用いる蛋白質生産技術も、全幅の信頼を得るには至っていない（Ｇａｒｂｅｒ，Ｋ．，２００１，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９，１８４−１８５）。
一方、これまでに開発された上記の組み換え蛋白質発現系において活性型蛋白質を大量に得ることが困難な場合が多々ある。上記目的蛋白質が宿主に対するなんらかの毒性を有する場合、その蛋白質の合成は抑制され発現量が低下する。また、目的蛋白質が可溶性蛋白質として発現しても宿主プロテアーゼによって分解されてしまい生産量が極めて少なくなる場合もあった。更に、目的蛋白質が発現しても折り畳みがうまくいかず、封入体を形成してしまう場合もある。この場合、可溶化して再折り畳みを行っても最終的に得られる活性型蛋白質の量は極めて少なくなってしまう。特に、無細胞翻訳系を用いた場合、封入体は形成しやすくなる。
封入体が生成する場合、その解決手段として、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｇｅｎｅ ６７，３１−４０）やチオレドキシン（ＬａＶａｌｌｉｅ，Ｅ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１，１８７−１９３）、マルトース結合蛋白質（Ｇｕａｎ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ６７，２１−３０）等との融合蛋白質として発現させる方法等が用いられるが、封入体形成が高効率で解消される場合は少なかった。また、目的蛋白質を蛋白質の折り畳み反応を支援する蛋白質群である分子シャペロンと共発現させ、目的蛋白質の可溶性画分への発現量を増大させる方法（Ｎｉｓｈｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．１９９８，Ａｐｐｌｙ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４，１６９４−１６９９）もあるが、活性型蛋白質の量を飛躍的に増加させるには至っていないのが現状であった。
また、宿主のプロテアーゼによる目的蛋白質の分解に対する解決法として、例えば、大腸菌では、ｌｏｎ、ｏｍｐＴのようなプロテアーゼ構造遺伝子の一部を欠損させた宿主（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ．１９８４，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５９，２８３−２８７）を用いる方法が考案されているが、プロテアーゼによる分解の影響を回避できる場合は少なく、また、宿主のプロテアーゼを全て欠損させると他の弊害が起こるため、根本的に解決することはできなかった。
以上のように、従来の蛋白質発現技術には、宿主に対する毒性、宿主プロテアーゼによる分解及び封入体形成といった大きな問題点があったため、発現させようとする蛋白質の種類によって発現量が著しく異なってしまい、各蛋白質ごとに発現条件を試行錯誤で検討する必要があった。このため、以上の問題点を根本的に解決する技術の開発が望まれていた。
発明の要約
本発明は、上記に鑑み、目的蛋白質をシャペロニンサブユニット、即ち、約６０ｋＤａ分子シャペロン、ヒートショックプロテイン６０ｋＤａ、又は、サーモゾームとの融合蛋白質として確実にシャペロニンの立体構造内部に納めることにより、目的蛋白質の宿主への毒性発現、封入体形成、及び、プロテアーゼによる分解を抑制し、いかなる蛋白質をも可溶性蛋白質として万能的に大量発現させることができる宿主を用いた組み換え蛋白質の発現系及び無細胞翻訳系を提供することを目的とする。
本発明は、シャペロニンサブユニットをコードする遺伝子及び目的蛋白質をコードする遺伝子を含有する遺伝子を転写・翻訳して、上記目的蛋白質が上記シャペロニンサブユニットとペプチド結合を介して連結している融合蛋白質を合成することを特徴とする蛋白質の生産方法である。
上記融合蛋白質は、互いに連結した１〜２０個のシャペロニンサブユニットと、連結したシャペロニンサブユニットのＮ末端、連結したシャペロニンサブユニットのＣ末端、又は、シャペロニンサブユニット同士の連結部にペプチド結合を介して連結されている目的蛋白質とからなることが好ましい。
本発明においては、シャペロニンサブユニットをコードする遺伝子及び目的蛋白質をコードする遺伝子を含有する遺伝子を、同一の宿主内で共存・複製することが可能な２種の異なるプラスミドのそれぞれに導入し、同一の宿主内で共発現させてもよく、又は、シャペロニンサブユニットをコードする遺伝子及び目的蛋白質をコードする遺伝子を含有する遺伝子と、シャペロニンのみをコードする遺伝子とをそれぞれ、同一の宿主内で共存・複製することが可能な２種の異なるプラスミドに導入し、同一の宿主内で共発現させてもよい。
上記融合蛋白質は、自的蛋白質が、シャペロニンサブユニットとペプチド結合を介して連結した状態で、シャペロニンリングの内部に格納されているものであることが好ましい。
上記シャペロニンリングは、リング面を介して非共有結合的に会合した２層構造を形成していてもよく、又は、リング面又はその側面を介して非共有結合的に連結した繊維状構造を形成していてもよい。
本発明においては、シャペロニンサブユニットと目的蛋白質との連結部に限定分解型プロテアーゼの切断配列を設け、上記目的蛋白質を上記限定分解型プロテアーゼにより融合蛋白質から切り出す工程を有していてもよい。この際、シャペロニンサブユニット同士の連結部にも限定分解型プロテアーゼの切断配列を設けることが好ましい。
本発明においては、シャペロニンサブユニットと目的蛋白質との連結部にメチオニン残基を設け、上記目的蛋白質をＣＮＢｒにより融合蛋白質から切り出す工程を有していてもよい。
本発明において、シャペロニンの由来生物としては、バクテリア、古細菌又は真核生物等が挙げられる。
本発明においては、融合蛋白質を、バクテリア、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体、植物個体、又は、昆虫個体のいずれかの宿主に合成させてもよく、又は、無細胞翻訳系で融合蛋白質を合成してもよい。
本発明において、目的蛋白質をコードする遺伝子は、哺乳動物由来のｃＤＮＡ又は哺乳動物由来のｃＤＮＡの６残基以上のアミノ酸配列をコードする部分遺伝子であることが好ましい。
本発明において、目的蛋白質としては、哺乳動物由来抗体の重鎖、哺乳動物由来抗体の軽鎖、若しくは、哺乳動物由来抗体のＦｖ領域単鎖抗体の全長、又は、それらの６残基以上の部分蛋白質；ウィルス抗原、７回膜貫通型受容体蛋白質、又は、サイトカイン類等が挙げられる。
本発明によれば、シャペロニンサブユニットと目的蛋白質とからなる融合蛋白質であって、上記目的蛋白質が、上記シャペロニンサブユニットとペプチド結合を介して連結した状態で、シャペロニンリングの内部に格納されている融合蛋白質が得られる。得られた融合蛋白質もまた、本発明の１つである。
上記シャペロニンリングは、リング面を介して非共有結合的に会合した２層構造を形成していてもよく、又は、リング面又はその側面を介して非共有結合的に連結した繊維状構造を形成していてもよい。
【図面の簡単な説明】
図１は、大腸菌シャペロニン（ＧｒｏＥＬ）の立体構造を模式的に示す図である。
図２は、サブユニット構成数８個の古細菌由来のシャペロニンと目的蛋白質とからなる融合蛋白質の設計例を示す図である
図３は、発現ベクターｐＥＴＤ（ＴＣＰβ）ｎ（ｎ＝１〜４）の制限酵素地図を示す図である。
図４は、（ＴＣＰβ）ｎ（ｎ＝１〜４）と、ＴＣＰβ４量体と目的蛋白質との融合蛋白質に対して行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
図５は、ＴＣＰβ連結体の透過型電子顕微鏡による観察結果を示す図である。
図６は、実施例５におけるウエスターンブロッティングの結果を示す図である。
図７は、実施例７におけるウエスターンブロッティングの結果を示す図である。
図８は、発現ベクターｐＴｒ（ＧｒｏＥ）ｎ（ｎ＝１〜７）の制限酵素地図を示す図である。
図９は、実施例８において、大腸菌シャペロニンＧｒｏＥＬ連結体を発現させた大腸菌の可溶画分に対して行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
発明の詳細な開示
以下に本発明を詳述する。
本発明においては、シャペロニンサブユニットをコードする遺伝子及び目的蛋白質をコードする遺伝子を含有する遺伝子（以下、融合蛋白質をコードする遺伝子ともいう）を用いて、目的蛋白質とシャペロニンサブユニットとからなる融合蛋白質を生産する。
上記シャペロニンとは、細胞に熱ショック等のストレスを与えると、エネルギー物質であるＡＴＰの存在下又は非存在下で蛋白質の折り畳みを支援したり、構造安定化に貢献したりする一般に分子シャペロンと呼ばれる蛋白質群の発現が誘導されるが、このような分子シャペロンの中でも、サブユニットの分子量が約６０ｋＤａのものをいい、バクテリア、古細菌、及び、真核生物の全ての生物に存在し、蛋白質の折り畳み支援や変性防御の機能を有している。
シャペロニンは１４〜１８個のサブユニットからなり、２層のリングからなる立体構造（以下、リングをシャペロニンリングという）を有し、例えば、大腸菌のシャペロニンは、内径４．５ｎｍ、高さ１４．５ｎｍの空洞（キャビティ）を有する（図１参照）。一層のシャペロニンリングのキャビティは６０ｋＤａの球状蛋白質一つが充分に納まる空間を有する。シャペロニンは、このキャビティに様々な蛋白質の折り畳み中間体や変性蛋白質を一時的に納める機能を有し、蛋白質の折り畳み構造が形成されると、ＡＴＰの分解と共役して、納めていた蛋白質をキャビティから放出する。バクテリア、古細菌由来のシャペロニンは、リング構造を保った状態で大腸菌の細胞質可溶性画分に容易に大量生産させることが可能である。このことは、由来の異なる種々のシャペロニンが大腸菌でも自己集合し、１４〜１８量体からなる２層のリング構造をとりうることを示している。
Ｘ線結晶構造解析によって明らかにされたシャペロニンの立体構造によれば、シャペロニンサブユニットのＮ末端及びＣ末端はともにキャビティ側に位置し、フレキシビリティの高い構造となっている。特にＣ末端の少なくとも２０アミノ酸はフレキシビリティの高い構造を示す（Ｇｅｏｒｇｅら、２０００、Ｃｅｌｌ、１００、Ｐ．５６１−５７３）。
本発明で用いられるシャペロニンとしては特に限定されず、バクテリア、古細菌、及び、真核生物のいずれの由来のものでも使用可能である。また、本発明では、シャペロニンのリング構造への自己集合能が維持されていれば、野生型のみならずアミノ酸変異体を使用することも可能である。例えば、シャペロニンの各サブユニットの会合力が弱められた変異体を用いた場合、格納された目的蛋白質の回収はより容易となる。
本発明における目的蛋白質としては特に限定されず、ヒト、マウス等の高等動物由来の疾病関連遺伝子産物や化学プロセスに有効な酵素群の全てが目的蛋白質となりえるが、例えば、Ｂ型肝炎ウィルス、Ｃ型肝炎ウィルス、ＨＩＶ、インフルエンザ等の病原性ウィルスゲノムにコードされる、外被蛋白質、コア蛋白質、プロテアーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼ等の蛋白質（ウィルス抗原）；哺乳動物由来抗体の重鎖、哺乳動物由来抗体の軽鎖、哺乳動物由来抗体のＦｖ領域単鎖抗体（ｓｃＦＶ）の全長、又は、それらの６残基以上の部分蛋白質、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）２、及び、完全抗体型である治療・診断用抗体；７回膜貫通型受容体（Ｇ蛋白質共役型受容体）；血小板増殖因子、血液幹細胞成長因子、肝細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子、神経成長・栄養因子、線維芽細胞成長因子・インスリン様成長因子等の成長因子；腫瘍壊死因子、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、マクロファージ・コロニー刺激因子、アルブミン、ヒト成長ホルモン等のサイトカイン類等が挙げられる。
シャペロニンの構造は由来生物、組織によって異なる。バクテリア、ミトコンドリア及び葉緑体のシャペロニンの場合、シャペロニンリングを構成するサブユニットの数は７個であるのに対し、真核生物の細胞質及び古細菌シャペロニンの場合は８〜９個である。
本発明では、使用するシャペロニンの由来により、融合蛋白質におけるシャペロニンサブユニットと目的蛋白質の数の比を選択することが好ましい。シャペロニンサブユニット数と目的蛋白質数との比（シャペロニンサブユニット数：目的蛋白質数）は１：１〜１２：１までとりうるが、好ましくは１：１〜９：１である。上記目的蛋白質１個に対するシャペロニンサブユニットの数が９を超えるとシャペロニンリングの形成が困難となる。
具体的には、バクテリア由来のシャペロニンを用いる場合には、シャペロニンのリング構造の形成のしやすさからシャペロニンサブユニット数：目的蛋白質数が１：１又は７：１である融合蛋白質が好ましく、シャペロニンリングを構成するサブユニット数が８個である古細菌由来のシャペロニンを用いる場合には、シャペロニンのリング構造の形成のしやすさからシャペロニンサブユニット数：目的蛋白質数が１：１、２：１、４：１又は８：１のものが好ましい。但し、目的蛋白質の形状や分子量によっては上記以外の数比も適する場合もある。例えば、大腸菌由来のシャペロニンを用いる場合、シャペロニンサブユニット数と目的蛋白質数の比率が３：１である融合蛋白質であっても、これらが２又は３分子会合してリング構造を形成しうる。
例えば、シャペロニンリングを構成するサブユニット数が８個である古細菌由来のシャペロニンを用いた場合、シャペロニンサブユニット数：目的蛋白質数が２：１である融合蛋白質は、発現した融合蛋白質が４つ集まってシャペロニンリングを形成する。シャペロニンサブユニット数：目的蛋白質数が４：１である融合蛋白質では、発現した融合蛋白質が２つ集まってシャペロニンリングを形成する。
よって、シャペロニンサブユニットの比率が高くなればなるほど、シャペロニンのキャビティ内に格納可能な目的蛋白質の分子サイズは大きくなる。上記目的蛋白質が宿主細胞質にさらされる危険性を避けるため、目的蛋白質１個に対しシャペロニンサブユニットが２個以上であることが好ましい。
そもそも、シャペロニンは、目的蛋白質に対して単に外部環境から仕切られたスペースを提供するだけでなく、蛋白質折り畳み機能を有するため、目的蛋白質の折り畳みを正常に行い、かつ、その構造を安定化することもできる。通常シャペロニンの蛋白質折り畳み反応は基質蛋白質であるシングルポリペプチドと１：１で起こるため、本発明においてシャペロニンによる折り畳み機能を発現させるには、シャペロニンリング又はシャペロニンに１個の目的蛋白質が格納されるよう融合蛋白質を設計することが好ましい。しかしながら、目的蛋白質の分子量によっては２分子以上格納させても正常に折り畳まれうる。
上記融合蛋白質におけるシャペロニンサブユニットと目的蛋白質との連結パターンとしては、目的蛋白質がシャペロニンのキャビティ内に納まるように、シャペロニンサブユニットのＮ末端、Ｃ末端、又は、シャペロニンサブユニット同士の連結部に、目的蛋白質を配置することが好ましい。このとき、シャペロニンサブユニットは、サブユニットが１〜２０個連結した連結体を構成していることが好ましい。
また、目的蛋白質の宿主に対する毒性が極めて高いか、又は、宿主プロテアーゼによる消化を極めて受けやすい場合は、目的蛋白質を複数のシャペロニンサブユニットの連結間に配置することが好ましい。図２にサブユニット構成数が８個である古細菌由来のシャペロニンを用いた場合の融合蛋白質の設計例を掲げる。
本発明によれば、融合蛋白質として発現した目的蛋白質はシャペロニンリングのキャビティの内部に格納されているので、生体内環境から保護され、プロテアーゼによる消化を受けにくくなる。シャペロニンリングは更に会合し、リング面を介して非共有結合的に会合した２層構造を形成することが好ましい。
また、目的蛋白質が宿主にとって重要な自然機構を阻害する性質を有するものであっても、目的蛋白質はシャペロニンリングにより生体内環境から隔てられているので、宿主の生理機構に対する阻害作用を発現することがない。また、強力なプロモーターによって発現が誘導されたときにみられるような蛋白質の折り畳み中間体同士が多数会合することはなく、個々にシャペロニンリングのキャビティ内に固定されるため、宿主を用いた発現及び無細胞翻訳系に見られる封入体形成も抑制することができる。シャペロニンは宿主の細胞質又は体液等の可溶性画分へ合成されるため、シャペロニンリングの内部に格納された蛋白質が膜結合性又は膜貫通性の蛋白質であっても膜へ移行し宿主の膜構造を破壊することはなく、宿主に対する毒性を発現しない。また、いかなる蛋白質も同一のシャペロニンリング内に格納すれば、同一の精製条件で融合蛋白質として精製することが可能である。
シャペロニンが１ｍｇ／ｍＬ以上の高濃度で存在する場合、Ｍｇ−ＡＴＰの存在下では、２層のシャペロニンリングが更にリング面を介して可逆的に結合し、繊維状構造を形成する場合がある（Ｔｒｅｎｔ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４，５３８３−５３８８：Ｆｕｒｕｔａｎｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２８３９９−２８４０７）。本発明の融合蛋白質は生体内において高濃度に合成されるため、リング面又はその側面を介して非共有結合的に連結した繊維状構造を形成することがあり、このことにより、目的蛋白質が宿主に対して毒性を有していてもシャペロニンリング内への格納が促進され、目的蛋白質の高度発現を達成しうる。上記融合蛋白質が繊維状構造を形成していても、希釈して蛋白質濃度を下げることによって２層リング構造ごとに解離するので、目的蛋白質を回収することができる。
本発明の蛋白質の生産方法では、制限酵素を用いる方法、ＰＣＲによる方法等の通常の遺伝子工学的手法を用いて、融合蛋白質をコードする遺伝子を作製し、これを導入した発現ベクターを用いて、宿主内で融合蛋白質を合成することができる。
上記融合蛋白質をコードする遺伝子を作製する際に用いる目的蛋白質をコードする遺伝子としては、哺乳動物由来のｃＤＮＡ又はその６残基以上のアミノ酸配列をコードする部分遺伝子が好適に用いられる。
上記宿主としては特に限定されず、例えば、大腸菌等のバクテリア、その他の原核細胞、酵母、昆虫細胞、哺乳動物の培養細胞等の動物細胞、植物の培養細胞等の植物細胞、動物個体、植物個体、昆虫個体等が挙げられる。なかでも、培養コストが安価である点、培養日数が短い点、培養操作が簡便な点等から、バクテリア又は酵母が好ましい。また、バクテリア、真核生物抽出液等を用いた無細胞翻訳系（Ｓｐｉｒｉｎ，Ａ，Ｓ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ １１，２６５６−２６６４：Ｆａｌｃｏｎｅ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１，２６５６−２６６４）により、本発明の融合蛋白質を可溶性蛋白質として合成することも可能である。
一般的に、大腸菌等では発現プラスミドは１０ｋｂｐ以上になるとコピー数が減少し、結果的に目的蛋白質の合成量が低下することがある。例えば、シャペロニンサブユニットが８個連結した融合蛋白質を生産する場合、発現プラスミドは１５ｋｂｐ以上になる。これに対して、融合蛋白質をコードする遺伝子を、同一の宿主内で共存・複製することが可能な２種の異なるプラスミドのそれぞれに導入し、同一の宿主内で共発現させることにより発現量の低下を防ぐことができる。例えば、同一の融合蛋白質を産する同一遺伝子を、異なる複製領域及び薬剤耐性遺伝子を有する２種類のベクターに導入し、これら２種類のベクターで２種の薬剤の存在下で大腸菌等を形質転換し、融合蛋白質の合成を行うことで、高発現をもたらすことが可能である。
また、本発明では、融合蛋白質をコードする遺伝子と、シャペロニンサブユニットのみをコードする遺伝子とをそれぞれ、同一の宿主内で共存・複製することが可能な２種の異なるプラスミドに導入し、同一の宿主内で共発現させてもよい。例えば、融合蛋白質をコードする遺伝子とシャペロニンサブユニットのみをコードする遺伝子とをそれぞれ、異なる薬剤耐性及び複製領域を有する２種類のベクターに導入して、２種類の薬剤の存在下で共発現することにより、シャペロニンの構造を制御することができる。例えば、シャペロニンサブユニットと目的蛋白質の数比が４：１である融合蛋白質を生産する場合において、シャペロニンサブユニットが１個又は２〜４個連結した遺伝子のみを含むベクターを導入して共発現させることにより、シャペロニンサブユニットと目的蛋白質の数比が８：１のシャペロニンリングを形成することが可能である。上述のように、プラスミドの巨大化はプラスミドのコピー数の減少につながり発現量が低下することがあるため、この方法は、発現量増加に有効である。
本発明の融合蛋白質遺伝子はプラスミド等のベクターで宿主生物に導入しなくとも、宿主の染色体上に導入して、融合蛋白質を発現させても良い。例えば大腸菌では、ランバダインテグラーゼを発現する宿主にランバダインテグラーゼの部位特異的組み換え機能を利用してプロモーター、リボゾーム結合部位、目的遺伝子、ターミネーター及び薬剤耐性遺伝子等から成る発現ユニット遺伝子を染色体に導入することが可能である（Ｏｌｓｏｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１４，１６０−１６６）。酵母では、例えばメタノール資化性酵母のアルコールデキドロゲナーゼ（ＡＯＸ）の下流と上流配列を利用して相同組み換えにより、ＡＯＸプロモーター配列及びターミネーターを含む目的蛋白質の発現ユニット遺伝子を宿主染色体上に組み込む方法がある（Ｓｃｏｒｅｒ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２，１８１−１８４）。いずれの場合も発現ユニット遺伝子を複数連結したものを染色体に導入することで発現量を増加させることが可能である。染色体上への遺伝子組み込みによる蛋白質発現では、プラスミドを用いる場合のようにそのサイズの増大に応じてコピー数が低下することなく、本発明のような分子量の大きい融合蛋白質の発現を安定化させることが可能である。
本発明で生産される融合蛋白質は、その分子量が約６５０〜６００ｋＤａと巨大であるため、転写されたｍＲＮＡが特定のリボヌクレアーゼにより分解され、更に、翻訳された融合蛋白質がプロテアーゼにより分解されるという２段階の切断を受けることがある。例えば、大腸菌を宿主として用いる場合は、ｍＲＮＡの分解に関与するリボヌクレアーゼであるＲＮａｓｅＥ遺伝子を欠損させた宿主を用いることにより、ｍＲＮＡの分解を抑制することが可能である（Ｃｒｕｎｂｅｒｇ−Ｍａｎａｇｏ，Ｍ．，１９９９，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．，３３，１９３−２２７）。翻訳後、プロテーゼによる分解を抑制するには、１５〜２５℃の低温で発現させる方法；ｌｏｎ、ｏｍｐＴ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５９，２８３−２８７）、Ｃｌｐ、ＨｓｌＶＵ（Ｋａｎｅｍｏｒｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｊｏｌ．，１７９，７２１９）のようなプロテアーゼの構造遺伝子を欠損させた大腸菌を宿主として用いる方法等を用いることができる。
上記の各種宿主内で融合蛋白質を合成させた後、細胞を回収し破砕し、上清を回収する。シャペロニンは分子量が約８４０〜９６０ＫＤａの巨大蛋白質であるため、４０％飽和程度の硫安塩析によって沈殿させることができる。沈殿した蛋白質を回収した後、適当な緩衝液に溶解し、疎水クロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィーによって融合蛋白質の存在する画分を回収する。回収した融合蛋白質溶液を限外ろ過によって濃縮した後、得られた濃縮液に対して、５〜５０ｍＭ程度の塩化マグネシウム及び５０〜３００ｍＭ程度の塩化ナトリウム又は塩化カリウムを含有する緩衝液を展開液としてゲルろ過を行い、排除限界直後のピークを回収することによって融合蛋白質を精製することができる。
上記融合蛋白質のＮ末端又はＣ末端に６〜１０個のヒスチジンが並んだタッグを連結させた場合には、ニッケル等の金属キレートカラムを用いて、簡便かつ効率的に融合蛋白質の回収を行うことができる。また、用いるシャペロニン又はシャペロニンサブユニットに対する抗体を用いて、免疫沈降又はアフィニティクロマトグラフィーによっても迅速・簡便に精製することが可能である。しかしながら、リング構造を形成した融合蛋白質のみを回収するためには、これらにイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過を組み合わせることが好ましい。
上記シャペロニンが耐熱性のものである場合、大腸菌の抽出液を６０〜８０℃で熱処理することによって大部分の大腸菌由来蛋白質を沈殿させることができ、融合蛋白質の精製をより簡略化させることができる。この際、目的蛋白質自身は耐熱性のものでなくとも、シャペロニンの空洞内部に保持されているので、変性することはない。
上記のいずれの方法で精製する場合であっても、融合蛋白質の形態を透過型電子顕微鏡によって観察することができ、目的蛋白質がシャペロニンリングの内部に格納されている場合は、外径１４〜１６ｎｍ程度のシャペロニン特有のリング構造を観察することができる。
多くのシャペロニンでは、サブユニット間の会合は、マグネシウムイオン及びＡＴＰによって安定化されている。従って、融合蛋白質のリング構造が不安定な場合は、精製の過程でマグネシウム及びＡＴＰを存在させておくことにより、リング構造を形成した融合蛋白質を効率的に回収することが可能である。一方、得られた融合蛋白質から目的蛋白質のみを分離する場合には、上記のようにして回収した融合蛋白質の画分を、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）処理した後、マグネシウム及びＡＴＰが入っていない緩衝液に対して透析を行いマグネシウム及びＡＴＰを取り除く。これによって、シャペロニンサブユニット間の相互作用は解除されシャペロニンの立体構造は壊れ、目的蛋白質が露出する。
また、トロンビン、エンテロカイネース、活性型血液凝固第１０因子等の限定分解型プロテアーゼの切断配列を、シャペロニンサブユニットと目的蛋白質との連結部、更にシャペロニンサブユニット同士の連結部にも配置することで、これらの限定分解型プロテアーゼにより融合蛋白質から目的蛋白質を切り出すことが可能となる。この場合は、上記のようにして回収した融合蛋白質の画分を透析する際に、透析内液にトロンビン等の限定分解型プロテアーゼを作用させることにより、目的蛋白質とシャペロニンサブユニットとを切り離すことができる。なお、本発明の融合蛋白質を目的に応じてそのまま用いる場合は、プロテアーゼ等の切断配列を介在させなくともよい。
透析後、イオン交換クロマトグラフィーや疎水クロマトグラフィー又は抗体を用いるアフィニィティクロマトグラフィーに供することによって、容易に高純度の目的蛋白質を回収することが可能である。
上記目的蛋白質にメチオニン残基が存在しない場合には、シャペロニンサブユニットと目的蛋白質との連結部にメチオニン残基を存在させることにより、ＣＮＢｒによって容易に目的蛋白質をシャペロニンから切り出し、遊離させることができる。
上記目的蛋白質の回収のみが目的である場合は、融合蛋白質は必ずしも均一に精製する必要はなく、粗精製サンプルにＥＤＴＡ処理を施した後、プロテアーゼを作用させ、目的蛋白質に応じた精製操作を施せば良い。上記目的蛋白質にメチオニンが存在しないであって、シャペロニンサブユニットと目的蛋白質の間にメチオニンを存在させた場合は、シャペロニンサブユニットと目的蛋白質とをＣＮＢｒによって切断することができるので、融合蛋白質をＥＤＴＡ処理及び透析するという操作は必要ない。
上述のようにして融合蛋白質を合成することにより、宿主細胞質可溶性画分に融合蛋白質を産出させ、そこから目的蛋白質のみを取り出す組み換え目的蛋白質の生産方法もまた、本発明の１つである。
上記目的蛋白質が膜結合性蛋白質又は膜貫通性蛋白質である場合には、目的蛋白質とシャペロニンサブユニットとを切り離すことによって目的蛋白質が不溶化することもあるが、この場合は、不溶化物のみを遠心分離によって回収した後、疎水性アルキル鎖がオクチル（炭素数８）からドデシル（炭素数１２）程度の長さである非イオン性界面活性剤等を用いると、ミセルの直径がほぼ生体膜の厚さに相応し、可溶化しやすい。このような非イオン性界面活性剤としては、例えば、β−オクチルグルコシド、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、Ｔｗｅｅｎ２０等が挙げられる。
本発明によれば、目的蛋白質をシャペロニンとの融合蛋白質として確実にシャペロニンリングのキャビティ内部に納めることにより、目的蛋白質の宿主への毒性の発現、プロテアーゼによる分解及び封入体の形成の問題を解決し、可溶性蛋白質として大量発現させることができる。また、効率的に精製を行うことができる。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
［実施例１］
（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ＫＳ−１株シャペロニンβサブユニット連結体の合成）
配列１に示されたシャペロニンβサブユニット（ＴＣＰβ）遺伝子をＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ＫＳ−１株ゲノムを鋳型とするＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）によってクローニングした。ＴＣＰβ遺伝子が一方向に１、２、３及び４回連結した遺伝子断片が挿入されたＴ７プロモーターを有する発現ベクターｐＥＴＤ（ＴＣＰβ）ｎ（ｎは１〜４）を構築した（図３）。各発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含む２ＸＹ．Ｔ．培地（バクトトリプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ）で３０℃で２４時間培養し、シャペロニンβサブユニット連結体を発現させた。培養終了後、回収した細胞を超音波で破砕し、遠心分離で上清を回収後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析を行った（図４）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、（ＴＣＰβ）ｎ（ｎは１〜４）が細胞質の可溶性画分に大量発現していることが確認できた。
［実施例２］
（ＴＣＰβ連結体の透過型電子顕微鏡による観察）
ｐＥＴＤ（ＴＣＰβ）２及びｐＥＴＤ（ＴＣＰβ）４をＭｌｕＩで切断後、セルフライゲーションさせることによって、ＴＣＰβ２量体及びＴＣＰβ４量体のＣ末端に６残基のヒスチジンが付加された組み換え蛋白質を合成するための発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）２及びｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４を得た（図３参照）。本ベクターでＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した後、実施例１と同様の条件でシャペロニンβサブユニット連結体を発現させた大腸菌抽出液を得た。菌体抽出液を５ｍｇ／ｍＬの蛋白質濃度で７５℃で３０分間加熱処理を行い、大腸菌由来蛋白質の大部分を変性沈殿させた。遠心分離によって上清を回収し、ニッケルキレートセファロースカラムにアプライした。１０ｍＭイミダゾールを含有する５０ｍＭ Ｎａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で充分にカラムを洗浄した後、５００ｍＭイミダゾールを含有する同緩衝液でニッケルキレートセファロースに吸着した画分を溶出した。溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果、ＴＣＰβ２量体及びＴＣＰβ４量体が回収されていることがわかった。得られた画分を５ｍＭ ＭｇＣｌ₂を含む２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析した後、透析内液をＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷカラム（トーソー社製）によるアニオン交換クロマトグラフィーによって分離し、ＴＣＰβ２量体及びＴＣＰβ４量体をそれぞれ均一に精製した。
それぞれの精製標品に対して、０．２％酢酸ウラニルによるネガティブ染色を施し、透過型電子顕微鏡によって形態を観察した結果、図５に示すようにともに直径約１５ｎｍのシャペロニン特有のリング構造を形成していた。この結果から、ＴＣＰβはサブユニット間を連結させても各分子が集合し、シャペロニン特有のリング構造を形成することがわかった。ＴＣＰβ２量体は４分子集合して１個のリングを形成し、ＴＣＰβ４量体は２分子集合してリング１個を形成するものと考えられる。
［実施例３］
（ＴＣＰβ４量体とＨＢｓ抗原との融合蛋白質の合成）
配列２に示されたＢ型肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓ抗原）遺伝子に対して、ＰＣＲによって、５’末端にＳｐｅＩサイトを、３’末端にＨｐａＩサイトを設け、ＳｐｅＩ及びＨｐａＩ処理が施されたｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４に導入し、ＴＣＰβ４量体とＣ末端に６残基のヒスチジンが導入されたＨＢｓ抗原との融合蛋白質を合成するための発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４・ＨＢｓを構築した。本ベクターでＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した後、実施例１と同様の条件で融合蛋白質を合成させた。大腸菌破砕物の可溶性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離後、クマシーブリラントブルー染色によって分析した結果、融合蛋白質に相当するサイズのバンドが検出された（図４）。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ブロッティングメンブランに転写し、抗ＨＢｓ抗原ポリクローナル抗体を用いてウエスターンブロッティングを行った結果、ＴＣＰβ４量体のみを発現させた大腸菌抽出液では陰性であったが、融合蛋白質を合成させた大腸菌の抽出液でのみ、そのサイズ（約２６０ＫＤａ）に相当する陽性バンドが検出された。このことからＨＢｓ抗原がＴＣＰβ４量体との融合蛋白質として大腸菌の可溶性画分に発現することがわかった。ＨＢｓ抗原単独での発現実験では、大腸菌の可溶性画分も沈殿画分も同様のウエスターンブロッティングで陰性であった。
（組み換えＨＢｓ抗原の精製）
実施例２と同様にして、ニッケルキレートカラムによって融合蛋白質を回収し、透析によってイミダゾールを除いた後、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂を含む展開液を用いるＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷカラムによるアニオン交換クロマトグラフィーによって、ＴＣＰβ４量体とＨＢｓ抗原との融合蛋白質を精製した。また、抗ＨＢｓ抗原ポリクローナル抗体を用いたウエスターンブロッティングによってＨＢｓ抗原が存在することを確認した。得られた融合蛋白質を透過型電子顕微鏡によって観察した結果、シャペロニン特有のリング構造を形成していた。このことから融合蛋白質が２分子集合してリング構造を形成するものと考えられた。回収された画分を１ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａ（エチレンジアミン四酢酸・二ナトリウム）存在下でインキュベーションした後、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅａｓｅ（アマシャム・ファルマシア・バイオテック社製）を作用させ、４℃で一昼夜インキュベーションした。生成した不溶物を遠心分離によって回収後、１．０％β−オクチルグルコシドに溶解した。得られた可溶化物中のＨＢｓ抗原をＨＢｓ抗原測定用ＥＩＡキット「エンザイグノスト−ＨＢｓＡｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ」（ヘキスト・ベーリングダイアグノスティック社製）によって検出した。また、ウエスターンブロッティンッグによって分析した結果約２５ｋＤａのＨＢｓ抗原に相当する分子量のバンドが特異的に検出された。以上のことから組み換えＨＢｓ抗原はシャペロニンから限定分解型プロテアーゼによって切り出しが可能であることがわかった。また、本実施例の発現法によって大腸菌培養液１Ｌ当たり約４０ｍｇのＨＢｓ抗原が可溶性画分に発現していることが推定できた。
［実施例４］
（シャペロニンβサブユニット数とＨＢｓ抗原数との比が２：１の融合蛋白質とシャペロニンβサブニニット２回連結体の共発現）
実施例２で作製されたｐＥＴＤＨ（ＴＣＰＮβ）２（アンピシリン耐性）よりＢｇｌＩＩ及びＮｏｔＩによる切断によってＴ７プロモーターを含む（ＴＣＰＮβ）２の発現ユニットを回収した。これをｐＡＣＹＣ１８４プラスミド（日本ジーン社）へクローン化し、ｐＡＴＨ（ＴＣＰＮβ）２（クロラムフェニコール耐性）を構築した。ｐＥＴＤＨ（ＴＣＰＮβ）２とｐＡＴＨ（ＴＣＰＮβ）２で大腸菌を、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）及びクロラムフェニコール（１５μｇ／ｍＬ）含むＬＢ寒天培地にて形質転換し、生育してきた１０コロニーを２ＸＹＴ液体培地（バクトトリプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ）に接種し、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）及びクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍＬ）の存在下３０℃で培養し一昼夜培養した。
得られた菌体からＳＤＳ−ＰＡＧＥによって蛋白質発現の確認を行った結果、約１４５ｋＤａの融合蛋白質と約１２０ｋＤａのシャペロニンβサブユニットの２量体が発現していることが確認できた。また、抗ＨＢｓ抗原ポリクローナル抗体を用いるウエスターンブロッティングによって１４５ＫＤａ相当のバンドのみが検出された。大腸菌抽出液から、実施例２と同様にニッケルキレートカラムによって融合蛋白質が含まれる画分を回収した。更に透析によってイミダゾールを除いた後、ＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷカラムによるアニオン交換クロマトグラフィーを行い、融合蛋白質が含まれる画分の精製を行った。得られた蛋白質を透過型電子顕微鏡によって観察した結果、シャペロニン特有のリング構造を形成していた。また、コントロールとしてシャペロニンβサブユニット数とＨＢｓ抗原数との比が２：１の融合蛋白質のみを発現させた場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスターンブロッティングの結果から、共発現法よりもはるかに発現量は少ないと判断できた。以上のことから、シャペロニンβサブユニット数とＨＢｓ抗原数との比が２：１の融合蛋白質とシャペロニンβサブユニット２回連結体は互いに集合することによってリング構造を形成し、ＨＢｓ抗原をキャビティ内部に格納することによってＨＢｓ抗原を大量発現させることができるが、融合蛋白質のみでは立体障害によってリング構造の形成は難しくＨＢｓ抗原の大腸菌に対する毒性が生じ、発現に抑制がかかったと考えられる。本実施例の発現法によって大腸菌培養液１Ｌ当たり約７０ｍｇのＨＢｓ抗原が可溶性画分に発現していると推定できた。本実施例の発現法のほうが、ＴＣＰβ４量体とＨＢｓ抗原との融合蛋白質の合成（実施例３）よりも発現量は向上した。
［実施例５］
（ＴＣＰβ４量体とＨＣＶコア抗原との融合蛋白質の合成）
配列３に示されたＣ型肝炎ウィルスコア抗原（ＨＣＶｃ抗原）遺伝子に対して、ＰＣＲによって、５’末端にＳｐｅＩサイトを、３’末端にＨｐａＩサイトを設け、ＳＰｅＩ及びＨｐａＩ処理が施されたｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４に導入し、ＴＣＰβ４量体とＨＣＶｃ抗原との融合蛋白質を合成するための発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４・ＨＣＶｃを構築した。本ベクターでＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した後、実施例１と同様の条件で融合蛋白質を合成させた。大腸菌破砕物の可溶性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離後、クマシーブリラントブルー染色によって分析した結果、融合蛋白質に相当するサイズのバンドが検出された（図４）。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ブロッティングメンブランに転写し、抗ＨＣＶｃ抗原モノクローナル抗体を用いてウエスターンブロッティングを行った結果、ＴＣＰβ４量体のみを発現させた大腸菌抽出液では陰性であったが、融合蛋白質を合成させた大腸菌の抽出液ではそのサイズ（約２６０ＫＤａ）に相当する陽性バンドが検出された（図６）。このことからＨＣＶｃ抗原がＴＣＰβ４量体との融合蛋白質として大腸菌可溶性画分に発現することがわかった。ＨＣＶｃ抗原単独での発現実験をコントロールとして行った結果、大腸菌の沈殿画分では同様のウエスターンブロッティングで陽性であったが、可溶性画分では陰性であった。このことからＨＣＶｃ抗原は単独では全てが封入体として発現するが、シャペロニンβサブユニット４量体との融合蛋白質として可溶性画分に発現させることができることがわかった。実施例３と同様にニッケルキレートカラム及びＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷカラムによって融合蛋白質を精製した。得られた融合蛋白質を透過型電子顕微鏡によって観察した結果、シャペロニン特有のリング構造を形成していた。このことから融合蛋白質が２分子集合してリング構造を形成するものと考えられた。回収された画分を１ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａ存在下でインキュベーションした後、５０ｍＭ Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析を行った。透析内液にＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅａｓｅ（アマシャム・ファルマシア・バイオテック社製）を作用させ、４℃で一昼夜インキュベーションした。その後、反応液をＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷカラムによって分画した。各画分の蛋白質を９６穴マイクロタイタープレートにコートした後、牛血清アルブミンでブロッキングを施し、ＰＢＳ−Ｔ緩衝液（１０ｍＭ Ｎａ−リン酸緩衝液ｐＨ７．５、０．８％塩化ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。次に、ＰＢＳ−Ｔ緩衝液で希釈したヒト陽性血清又はヒト陰性血清を加え反応させた。ＰＢＳ−Ｔ緩衝液で洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ヒトＩｇＧ抗体を作用させた。反応終了後、ＰＢＳ−Ｔ緩衝液で４回洗浄し、フェニルジアミン及び過酸化水素を含む基質発色液を加え反応させた。４Ｎ硫酸添加によって反応を止めた後、４９０ｎｍにおける吸収を測定した。検出されたＨＣＶｃ抗原陽性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した結果、ほぼ均一な約２２ｋＤａのＨＣＶｃ抗原が精製されたことがわかった。以上のことから組み換えＨＣＶｃ抗原はシャペロニンから限定分解型プロテアーゼによって切り出しが可能であることがわかった。また、本実施例の発現法によって大腸菌培養液１Ｌ当たり約８０ｍｇのＨＣＶｃ抗原が可溶性画分に発現していることが推定できた。
［実施例６］
（ＴＣＰβ４量体と抗リゾチームｓｃＦＶ抗体との融合蛋白質の合成）
配列４に示されたマウス由来抗ニワトリリゾチーム単鎖抗体（抗ＨＥＬ−ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ抗体：ＨｓｃＦＶ）遺伝子に対して、ＰＣＲによって、５’末端にＳｐｅＩサイトを、３’末端にＨｐａＩサイトを設け、ＳｐｅＩ及びＨｐａＩ処理が施されたｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４に導入し、ＴＣＰβ４量体とＨｓｃＦＶとの融合蛋白質を合成するための発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４・ＨｓｃＦＶを構築した。本ベクターでＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した後、実施例１と同様の条件で融合蛋白質を合成させた。大腸菌破砕物の可溶性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離後、クマシーブリラントブルー染色によって分析した結果、融合蛋白質に相当するサイズのバンドが検出された。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ブロッティングメンブランに転写し、６残基のヒスチジン残基を認識する抗体である抗６ＨＩｓモノクローナル抗体を用いてウエスターンブロッティングを行った結果、ＴＣＰβ４量体のみを発現させた大腸菌抽出液では陰性であったが、融合蛋白質を合成させた大腸菌の抽出液ではそのサイズ（約２６５ＫＤａ）に相当する陽性バンドが検出された。このことからＨｓｃＦＶがＴＣＰβ４量体との融合蛋白質として大腸菌可溶性画分に発現することがわかった。ＨｓｃＦＶ単独での発現実験をコントロールとして行った結果、大腸菌の沈殿画分では同様のウエスターンブロッティングで陽性であったが、可溶性画分では陰性であった。このことからＨｓｃＦＶは単独では全てが封入体として発現するが、シャペロニンβサブユニット４量体との融合蛋白質として可溶性画分に発現させることができることがわかった。また、本実施例の発現法によって大腸菌培養液１Ｌ当たり約７５ｍｇのＨｓｃＦＶが可溶性画分に発現していることが推定できた。
［実施例７］
（ＴＣＰβ４量体とヒト由来抗体重鎖定常傾城との融合蛋白質の合成）
配列５に示されたヒト由来抗体重鎖定常領域（ＡｂＨＣ）遺伝子に対して、ＰＣＲによって、５’末端にＳｐｅＩサイトを、３’末端にＨｐａＩサイトを設け、ＳｐｅＩ及びＨｐａＩ処理が施されたｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４に導入し、ＴＣＰβ４量体とＡｂＨＣとの融合蛋白質を合成するための発現ベクターｐＥＴＤＨ（ＴＣＰβ）４・ＡｂＨＣを構築した。本ベクターでＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した後、実施例１と同様の条件で融合蛋白質を合成させた。大腸菌破砕物の可溶性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離後、クマシーブリラントブルー染色によって分析した結果、融合蛋白質に相当するサイズのバンドが検出された（図４）。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ブロッティングメンブランに転写し、ヒト由来抗体のＦｃ領域を認識する抗体である抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体を用いてウエスターンブロッティングを行った結果、ＴＣＰβ４量体のみを発現させた大腸菌抽出液では陰性であったが、融合蛋白質を合成させた大腸菌の抽出液ではそのサイズ（約２７０ＫＤａ）に相当する陽性バンドが検出された（図７）。このことからＡｂＨＣがＴＣＰβ４量体との融合蛋白質として大腸菌可溶性画分に発現することがわかった。ＡｂＨＣ単独での発現実験をコントロールとして行った結果、大腸菌の可溶性画分及び沈殿画分の両方で、同様のウエスターンブロッティングで陰性であった。このことからＡｂＨＣ単独では大腸菌ではほとんど発現しないが、シャペロニンβサブユニット４量体との融合蛋白質として可溶性画分に発現させることができることがわかった。また、本実施例の発現法によって大腸菌培養液１Ｌ当たり約７５ｍｇのＡｂＨＣが可溶性画分に発現していることが推定できた。
［実施例８］
（大腸菌シャペロニンＧｒｏＥＬ連結体の発現）
配列６に示された大腸菌シャペロニンＧｒｏＥＬ遺伝子を、大腸菌Ｋ１２株ゲノムを鋳型とするＰＣＲによってクローニングした。ＧｒｏＥＬ遺伝子が一方向に１、２、３、４、５、６及び７回連結した遺伝子断片が挿入されたｔｒｃプロモーターを有する発現ベクターｐＴｒ（ＧｒｏＥ）ｎ（ｎは１〜７）を構築した（図８）。各発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含む２ＸＹ．Ｔ．培地（バクトトリプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ）で２５℃で２４時間培養し、シャペロニンサブユニット連結体を発現させた。培養終了後、細胞を回収し超音波で破砕した。遠心分離で上清を回収後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した結果、（ＧｒｏＥ）ｎ（ｎは１〜７）が可溶性画分に大量発現していることが確認できた（図９）。組み換え（ＧｒｏＥ）７を、回収した大腸菌抽出液からＤＥＡＥ−セファロース、ＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷ及びゲル濾過によって精製した。得られた精製標品を透過型電子顕微鏡によって観察した結果、シャペロニン特有のリング構造が観察された。このことから、大腸菌シャペロニンＧｒｏＥＬは全てのサブユニットを連結しても７回回転対称構造は維持されることがわかった。
［実施例９］
（大腸菌シャペロニンＧｒｏＥＬ７回連結体とヒトインターフェロンとの融合蛋白質の合成）
配列７に示されたヒトインターフェロンα２ｂ（ＩＮＦ）遺伝子に対して、ＰＣＲによって、５’末端にＮｈｅＩサイトを、３’末端にＸｈｏＩサイトを設け、ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩ処理が施されたｐＴｒ（ＧｒｏＥ）７に導入し、ＧｒｏＥＬ７回連結体とＩＮＦとの融合蛋白質を合成するための発現ベクターｐＴｒ（ＧｒｏＥ）７・ＩＮＦを構築した。本発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した後、実施例８と同様の条件で融合蛋白質の合成を行った。コントロールとしてｐＴｒ（ＧｒｏＥ）７を用いた発現及びＩＮＦ単独の発現も行った。各大腸菌抽出液の上清と沈澱画分とをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、ブロッティングメンブランに転写し、抗ＩＮＦポリクローナル抗体を用いてウエスターンブロッティングを行った。その結果、ｐＴｒ（ＧｒｏＥ）７・ＩＮＦ保持の大腸菌抽出液サンプルのみが可溶性画分に融合蛋白質の分子量（２５０〜２６０ＫＤａ）に相当する位置に強くバンドが検出された。ＩＮＦ単独での発現では大部分が不溶性画分に生産されていることがわかった。以上のことから、ＩＮＦは大腸菌ＧｒｏＥＬ７回連結体との融合蛋白質として発現させることで、可溶性蛋白質として発現することがわかった。ｐＴｒ（ＧｒｏＥ）７・ＩＮＦが含まれる大腸菌抽出液から塩析、ＤＥＡＥ−セファロース及びＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷカラムによるアニオン交換クロマトグラフィー、並びに、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６（アマシャム・ファルマシア・バイオテック社製）によるゲルろ過によって、融合蛋白質を精製した。得られた精製標品を透過型電子顕微鏡によって観察した結果、シャペロニン特有のリング構造が観察された。以上のことから、ＩＮＦはＧｒｏＥＬのキャビティ内部に１分子ごとに格納されることによって可溶性画分に発現したと考えられる。
［実施例１０］
（大腸菌シャペロニンＧｒｏＥＬ７回連結体とセロトニンレセプターとの融合蛋白質の合成）
配列８に示されたヒトセロトニンレセプター（５ＨＴ１Ａ）遺伝子に対して、ＰＣＲによって、５’末端にＮｈｅＩサイトを、３’末端にＸｈｏＩサイトを設け、ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩ処理が施されたｐＴｒ（ＧｒｏＥ）７に導入し、ＧｒｏＥＬ７回連結体と５ＨＴ１Ａとの融合蛋白質を合成するための発現ベクターｐＴｒ（ＧｒｏＥ）７・５ＨＴ１Ａを構築した。本ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した後、実施例８と同様の条件で融合蛋白質の合成を行った。コントロールとしてｐＴｒ（ＧｒｏＥ）７を用いた発現及び５ＨＴ１Ａ単独の発現も行った。各大腸菌抽出液の上清と沈澱画分とをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、ブロッティングメンブランに転写し、抗５ＨＴ１Ａポリクローナル抗体を用いてウエスターンブロッティングを行った。その結果、ｐＴｒ（ＧｒｏＥ）７・５ＨＴ１Ａを保有する大腸菌の抽出液サンプルのみから、可溶性画分に融合蛋白質の分子量（約２８０ＫＤａ）に相当する位置に強くバンドが検出された。５ＨＴ１Ａ単独での発現では可溶性画分にも不溶性画分にも相当サイズのバンドは検出されなかった。以上のことから、５ＨＴ１Ａは単独では大腸菌で発現することはできないが、ＧｒｏＥＬ７回連結体との融合蛋白質として発現させることで、可溶性蛋白質として発現することがわかった。ｐＴｒ（ＧｒｏＥ）７・５ＨＴ１Ａを保有する大腸菌の抽出液から、塩析、ＤＥＡＥ−セファロース及びＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷカラムによるアニオン交換クロマトグラフィー、並びに、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６（アマシャム・ファルマシア・バイオテック社製）によるゲルろ過によって、融合蛋白質を精製した。得られた精製標品を透過型電子顕微鏡によって観察した結果、シャペロニン特有のリング構造が観察された。以上のことから、５ＨＴ１ＡはＧｒｏＥＬのキャビティ内部に１分子ごとに格納されることによって可溶性画分に合成されたと考えられる。
［実施例１１］
（無細胞翻訳系による（ＴＣＰβ）４とＨＢｓ抗原との融合蛋白質の合成）
無細胞翻訳のために、ＴＣＰβ４回連結体とＨＢｓ抗原との融合蛋白質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターｐＩＶ（ＴＣＰβ）４・ＨＢｓを構築した。反応は、通常無細胞翻訳系を構成するＲＮＡポリメラーゼ、リボゾーム、アミノ酸、ヌクレオチド、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素等を含む反応液にｐＩＶ（ＴＣＰβ）４・ＨＢｓを添加し、一定温度でインキュベーションすることにより行った。反応終了後、反応液からニッケルキレートクロマトグラフィー及びＴｓｋ ｇｅｌ ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷカラムによって単一蛋白質にまで精製した。精製された融合蛋白質を透過型電子顕微鏡で観察した結果、シャペロニン特有のリング構造が見られた。精製された融合蛋白質より、実施例３と同様に、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅａｓｅで、ＨＢｓ抗原を切り出した後、遠心分離によって不溶性ＨＢｓ抗原をβ−オクチルグルコシドによって可溶化させた。本サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、抗ＨＢｓ抗原ポリクローナル抗体によるウエスターンブロッティングを行うと、ＨＢｓ抗原の分子量に相当する約２５ＫＤａのバンドが検出された。ＨＢｓ抗原単独で発現させた場合は、同様に不溶性画分にＨＢｓ抗原は蓄積したが、β−オクチルグルコシドによる可溶化は困難であった。以上のように、（ＴＣＰβ）４との融合蛋白質を用いるＨＢｓ抗原の合成は無細胞翻訳系においても有効であった。
［実施例１２］
（無細胞翻訳系による（ＧｒｏＥ）７と５ＨＴ１Ａとの融合蛋白質の合成）
実施例１１と同様の方法で、ＧｒｏＥＬ７回連結体と５ＨＴ１Ａとの融合蛋白質の無細胞合成を行った。コントロールとして５ＨＴ１Ａ単独の合成も行った。反応終了後、抗５ＨＴ１Ａポリクローナル抗体を用いるウエスターンブロッティングを行った結果、融合蛋白質では、可溶性画分に融合蛋白質の分子量（約２８０ＫＤａ）に相当するサイズのバンドが検出された。実施例１１と同様の方法で融合蛋白質を精製した後、透過型電子顕微鏡によって観察した結果、シャペロニン特有のリング構造が見られた。５ＨＴ１Ａ単独の合成では、不溶性画分にのみ検出された。以上のことから、５ＨＴ１Ａ単独では無細胞翻訳系では不溶性蛋白質として発現されるが、一分子ごとにＧｒｏＥＬ７回連結体との融合蛋白質として発現させると、融合蛋白質は無細胞翻訳系においても可溶性蛋白質として合成されることがわかった。
産業上の利用の可能性
本発明の蛋白質の生産方法及び融合蛋白質は、上述の構成よりなるので、大量発現が困難な蛋白質、及び、可溶性画分への発現が困難であった組み換え蛋白質の合成量を増加させるのに有用である。
【配列表】

Claims (14)

1. ２以上のシャペロニンサブユニットをコードする遺伝子及び目的蛋白質をコードする遺伝子を含有する遺伝子を転写・翻訳して、前記目的蛋白質が前記シャペロニンサブユニットとペプチド結合を介して連結している融合蛋白質を合成する蛋白質の生産方法であって、
   融合蛋白質は、目的蛋白質が、シャペロニンサブユニットとペプチド結合を介して連結した状態で、７〜９個のシャペロニンサブユニットからなるシャペロニンリングの内部に格納されているものである
   ことを特徴とする蛋白質の生産方法。
2. 融合蛋白質は、互いに連結した１〜２０個のシャペロニンサブユニットと、連結したシャペロニンサブユニットのＮ末端、連結したシャペロニンサブユニットのＣ末端、又は、シャペロニンサブユニット同士の連結部にペプチド結合を介して連結されている目的蛋白質とからなることを特徴とする請求の範囲第１項記載の蛋白質の生産方法。
3. シャペロニンサブユニットをコードする遺伝子及び目的蛋白質をコードする遺伝子を含有する遺伝子を転写・翻訳して、前記目的蛋白質が前記シャペロニンサブユニットとペプチド結合を介して連結している融合蛋白質を合成する蛋白質の生産方法であって、
   融合蛋白質は、目的蛋白質が、シャペロニンサブユニットとペプチド結合を介して連結した状態で、７〜９個のシャペロニンサブユニットからなるシャペロニンリングの内部に格納されているものであり、
   シャペロニンサブユニットをコードする遺伝子及び目的蛋白質をコードする遺伝子を含有する遺伝子と、シャペロニンのみをコードする遺伝子とをそれぞれ、同一の宿主内で共存・複製することが可能な２種の異なるプラスミドに導入し、同一の宿主内で共発現させることを特徴とする蛋白質の生産方法。
4. シャペロニンリングは、リング面を介して非共有結合的に会合した２層構造を形成していることを特徴とする請求の範囲第１項記載の蛋白質の生産方法。
5. シャペロニンリングは、リング面又はその側面を介して非共有結合的に連結した繊維状構造を形成していることを特徴とする請求の範囲第１項記載の蛋白質の生産方法。
6. シャペロニンサブユニットと目的蛋白質との連結部に限定分解型プロテアーゼの切断配列を設け、前記目的蛋白質を前記限定分解型プロテアーゼにより融合蛋白質から切り出す工程を有することを特徴とする請求の範囲第１、２、３、４又は５項記載の蛋白質の生産方法。
7. シャペロニンサブユニット同士の連結部に限定分解型プロテアーゼの切断配列を設けることを特徴とする請求の範囲第６項記載の蛋白質の生産方法。
8. シャペロニンサブユニットと目的蛋白質との連結部にメチオニン残基を設け、前記目的蛋白質をＣＮＢｒにより融合蛋白質から切り出す工程を有することを特徴とする請求の範囲第１、２、３、４又は５項記載の蛋白質の生産方法。
9. シャペロニンの由来生物は、バクテリア、古細菌又は真核生物であることを特徴とする請求の範囲第１、２、３、４、５、６、７又は８項記載の蛋白質の生産方法。
10. 融合蛋白質を、バクテリア、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体、植物個体、又は、昆虫個体のいずれかの宿主に合成させることを特徴とする請求の範囲第１、２、３、４、５、６、７、８又は９項記載の蛋白質の生産方法。
11. 無細胞翻訳系で融合蛋白質を合成することを特徴とする請求の範囲第１、２、３、４、５、６、７、８又は９項記載の蛋白質の生産方法。
12. 目的蛋白質をコードする遺伝子は、哺乳動物由来のｃＤＮＡ又は哺乳動物由来のｃＤＮＡの６残基以上のアミノ酸配列をコードする部分遺伝子であることを特徴とする請求の範囲第１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１項記載の蛋白質の生産方法。
13. 目的蛋白質は、哺乳動物由来抗体の重鎖、哺乳動物由来抗体の軽鎖、若しくは、哺乳動物由来抗体のＦｖ領域単鎖抗体の全長、又は、それらの６残基以上の部分蛋白質であることを特徴とする請求の範囲第１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２項記載の蛋白質の生産方法。
14. 目的蛋白質は、ウィルス抗原、７回膜貫通型受容体蛋白質、又は、サイトカイン類であることを特徴とする請求の範囲第１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１項記載の蛋白質の生産方法。

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