JP4047763B2

JP4047763B2 - 分子間相互作用解析法

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Publication number: JP4047763B2
Application number: JP2003134927A
Authority: JP
Inventors: 昌弘古谷; 純一秦; 彰子東儀
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 2002-06-25
Filing date: 2003-05-13
Publication date: 2008-02-13
Anticipated expiration: 2023-05-13
Also published as: JP2004085542A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医薬品開発等に必要なタンパク質とそのリガンド物質との分子間相互作用、特に受容体タンパク質とリガンド物質（阻害剤候補物質）の結合力を解析する分子間相互作用解析法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
受容体タンパク質に強く結合する物質は、受容体タンパク質の阻害剤医薬として有望であることから、受容体タンパク質とリガンド物質との結合力を解析することは医薬品開発において極めて重要である。
【０００３】
従来、膜受容体タンパク質のような受容体タンパク質は組み換えＤＮＡ技術によって動物細胞や大腸菌等の宿主の膜画分に発現させ、その膜画分又はリポソーム等で再構成した精製標品を得て、アッセイに使用していた。しかし、膜受容体等の膜タンパク質は精製が困難であり、またリポソーム等で再構成するのも技術的に困難であった。また、未精製の膜画分を用いようとしても、粗精製品では結合の特異性を見極めるのが難しいという問題点があった。
【０００４】
また、組み換えＤＮＡ技術によって宿主の膜画分に膜受容体タンパク質を発現させるにあたっても、産生された膜タンパク質受容体が宿主細胞の膜画分に蓄積してしまい、膜機能が阻害され毒性を発現することから、大量生産が困難であるという問題点があった。
【０００５】
更に、受容体タンパク質とリガンド物質との結合力の解析にあたっては、金薄膜表面に受容体タンパク質を物理的又は化学的に固定化し、リガンド物質との結合に伴う質量変化を表面プラズモン共鳴シグナルとして検出し、相互作用を解析する方法が考えられているが、受容体タンパク質を金薄膜表面への固定化すると活性が低下してしまうという問題点もあった。
【０００６】
現在ではヒトゲノムシーケンスが完了し、その解析もかなり行われ、受容体タンパク質の一種である膜受容体タンパク質の中でもＧタンパク質共役型レセプタータンパク質（ＧＰＣＲ）は創薬のターゲットとなってきている。ＧＰＣＲは少なくとも８００種類存在すると考えられていることから、数多くの受容体タンパク質等を画一的な方法で簡便に安定的に調製し、アッセイに提供することが可能なレセプタ・リガンドアッセイ技術の開発が望まれていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記現状に鑑み、医薬品開発等に必要なタンパク質とそのリガンド物質との分子間相互作用、特にＧＰＣＲをはじめとする膜受容体タンパク質等の受容体タンパク質とリガンド物質（阻害剤候補物質）の結合力を解析する分子間相互作用解析法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、シャペロニン遺伝子Ｎ回連結体（Ｎは１〜１２）と目的タンパク質遺伝子とを含む遺伝子を転写・翻訳してなる、シャペロニンと目的タンパク質とがペプチド結合を介して連結した融合タンパク質と、目的タンパク質に対するリガンド物質との結合を解析する分子間相互作用解析法である。
以下に本発明を説明する。
【０００９】
本発明の分子間相互作用解析法では、シャペロニン遺伝子Ｎ回連結体（Ｎは１〜１２）遺伝子と目的タンパク質遺伝子とを含む遺伝子を転写・翻訳することによって、シャペロニンと目的タンパク質とがペプチド結合を介して連結した融合タンパク質を合成する。
上記シャペロニンとは、細胞に熱ショック等のストレスを与えるとにより誘導される、エネルギー物質であるＡＴＰの存在下又は非存在下でタンパク質の折り畳みを支援したり、構造安定化に貢献したりする分子シャペロンと呼ばれるタンパク質群のなかで、特に分子量が約６０ｋＤａのもののことであり、細菌、古細菌及び真核生物の全ての生物に存在し、タンパク質の折り畳み支援や変性防御の機能を有するものである。
【００１０】
シャペロニンは図１に示したように、１４〜１８個のサブユニットからなる２層のリング構造（以下、構造体をシャペロニン複合体、リングをシャペロニンリングという）を形成する。例えば図１に示した大腸菌シャペロニンの場合、内径４．５ｎｍ、高さ１４．５ｎｍの空洞（キャビティ）を有する。シャペロニンリングのキャビティは６０ｋＤａの球状タンパク質一つが充分に納まる空間を有する。シャペロニン複合体は、このキャビティに様々なタンパク質の折り畳み中間体や変性タンパク質を一時的に納める機能を有し、タンパク質の折り畳み構造が形成されるとＡＴＰの分解と共役して納めていたタンパク質をキャビティから放出させる。
【００１１】
細菌、古細菌由来のシャペロニンは、遺伝子工学的に大腸菌細胞質可溶性画分にシャペロニン複合体として容易に大量生産させることが可能である。このことは、様々のシャペロニンが大腸菌でも自己集合し、１４〜１８量体からなる２層リング構造のシャペロニン複合体を形成できることを示している。
【００１２】
Ｘ線結晶構造解析によれば、上記シャペロニン複合体の立体構造は、シャペロニンのＮ末端及びＣ末端がともにキャビティ側に位置し、フレキシビリティの高い構造となっている。特にＣ末端の少なくとも２０アミノ酸はフレキシビリティの高い構造を示す（Ｇｅｏｒｇｅら、２０００、Ｃｅｌｌ、１００、Ｐ．５６１−５７３）。
【００１３】
本発明では、目的とするタンパク質をシャペロニンとの融合タンパク質として確実にシャペロニンリングのキャビティ内部に納めることにより、目的タンパク質の宿主への毒性、プロテアーゼによる分解及び封入体の形成を解消し、可溶性タンパク質として大量発現させることができる。すなわち、融合タンパク質として発現した目的タンパク質はシャペロニンリングのキャビティ内に納められることによって生体内環境から保護され、プロテアーゼによる消化を受けにくくなる。
【００１４】
この時、目的タンパク質が宿主生物にとって重要な自然機構を阻害する性質を有するものであってもシャペロニンリングで生体内環境から仕切られているため阻害作用を発現することもない。また、強力なプロモーターによって発現が誘導された時にみられるようにタンパク質の折り畳み中間体同士が多数会合することなく、個々にシャペロニンリングのキャビティ内に固定されるため、宿主生物を用いた発現及び無細胞翻訳系に見られる封入体形成も抑えられる。また、シャペロニンは宿主生物の細胞質あるいは体液等の可溶性画分へ発現するため、シャペロニンリングに格納されたタンパク質が膜結合性又は膜貫通性のタンパク質であっても膜へ移行し宿主生物の膜機能を阻害することもなく、宿主生物に対する毒性は発現しない。また、いかなるタンパク質も同一のシャペロニンリングに格納されているため、同一の精製条件で融合タンパク質として精製可能である。
【００１５】
更に、シャペロニン複合体は単に外部環境から仕切られたスペースを提供するだけでなく、タンパク質折り畳み機能を有するため、目的タンパク質の折り畳みも正常に行われ、かつ構造が安定することも期待できる。通常、シャペロニン複合体のタンパク質折り畳み反応は基質タンパク質（シングルポリペプチドとして）と１：１で起こるため、本発明においてシャペロニンによる折り畳み機能を発現させるには、シャペロニンリング又はシャペロニン複合体に1個の目的タンパク質が格納されるよう融合タンパク質を設計することが好ましいが、目的タンパク質の分子量によっては２分子以上格納させてもよい。
【００１６】
上記シャペロニンとしては、細菌、古細菌及び真核生物いずれの由来のものでも使用可能である。上記シャペロニンとしては、リング構造への自己集合能が維持されていれば、野生型のみならずアミノ酸変異体も使用可能である。
【００１７】
ただし、上記シャペロニン複合体の構造は由来生物によって若干相違する。例えば、細菌由来のシャペロニンリングのシャペロニンサブユニットの構成数は７個であり、古細菌由来のそれは８〜９個、真核生物由来のものは８個である。例えば、サブユニット構成数８個である古細菌由来のシャペロニンを用い、シャペロニン：目的タンパク質の数比２：１である融合タンパク質は、発現した融合タンパク質が４つ集まってシャペロニンリングを形成する。シャペロニン：目的タンパク質の数比４：１の融合タンパク質では、発現した融合タンパク質が２つ集まってシャペロニンリングを形成する。よって、シャペロニンの比率が高くなればなるほど、シャペロニン複合体のキャビティ内に格納可能な目的タンパク質の分子サイズは大きくなる。目的タンパク質が宿主細胞質にさらされる危険性を避けるためには、目的タンパク質１に対しシャペロニンが２以上が好ましい。シャペロニンリングは更に会合し、２層リングの構造をもつシャペロニン複合体を形成する。
【００１８】
従って本発明では、使用するシャペロニンの由来により、シャペロニンと目的タンパク質の数の比を選択することが好ましい。シャペロニン：目的タンパク質の比は１：１〜１２：１まで可能であるが、このましくは１：１〜９：１である。９：１よりもシャペロニンの比が大きくなると、発現する目的タンパク質の実質的な生産量が少なくなるとともに、シャペロニンによるリング形成も困難となることがある。
【００１９】
具体的にはシャペロニンサブユニットの構成数が７個である細菌由来のシャペロニンを用いる場合には、シャペロニン複合体の構造形成のしやすさからシャペロニン：目的タンパク質の比は１：１又は７：１であることが好ましく、シャペロニンサブユニット構成数が８個である古細菌由来のシャペロニンを用いる場合には、シャペロニン複合体の構造形成のしやすさからシャペロニン：目的タンパク質の数の比は１：１、２：１、４：１又は８：１であることが好ましい。
【００２０】
ただし、目的タンパク質の形状や分子量によっては上記以外の数比であってもよい。
例えば、大腸菌由来シャペロニンと目的タンパク質の比率が３：１である融合タンパク質であってもこれらが２又は３分子会合することによりリング構造を形成することもできる。
【００２１】
上記融合タンパク質におけるシャペロニンと目的タンパク質の連結パターンとしては、目的タンパク質がシャペロニン複合体のキャビティ内に確実に納まるように、シャペロニンのＮ末端及び／又はＣ末端に結合することが好ましい。また、目的タンパク質がホモ又はヘテロ２量体で活性を発現する場合には、Ｎ末端及びＣ末端にそれぞれ同種又は異種の目的タンパク質が１サブユニットずつ結合することが好ましい。
また、目的タンパク質が宿主に対する毒性が極めて高い、又は、宿主プロテアーゼによる消化を極めて受けやすい場合には、目的タンパク質は複数のシャペロニン連結間に結合することが好ましい。
図２にサブユニット構成数が８個である古細菌由来のシャペロニンを用いた場合の融合タンパク質の設計例を示した。
【００２２】
Ｍｇ−ＡＴＰの存在化では、シャペロニンは１ｍｇ／ｍＬ以上の高濃度で２層シャペロニンリングが更にリング面を介して可逆的に重合し、繊維状構造を形成する場合がある（Ｔｒｅｎｔ，Ｊ．Ｄ．ｅｔａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４，５３８３−５３８８：Ｆｕｒｕｔａｎｉ，Ｍ．ｅｔａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２８３９９−２８４０７）。本発明では融合タンパク質は生体内において高濃度で発現するため、繊維状構造が形成される可能性が有り、このことにより、目的タンパク質が宿主生物に毒性があってもシャペロニンリング内への格納が促進され、目的タンパク質の高度発現が達成される可能性がある。繊維状構造が形成されても希釈することによってシャペロニン二層リング構造に解離する。
【００２３】
本発明において、シャペロニン遺伝子Ｎ回連結体（Ｎは１〜１２）と目的タンパク質遺伝子とを含有する遺伝子を転写・翻訳することによって、シャペロニンと目的タンパク質とがペプチド結合を介して連結した融合タンパク質を合成する方法としては特に限定されないが、シャペロニン遺伝子Ｎ回連結体（Ｎは１〜１２）及び目的タンパク質遺伝子をプラスミドに組み込み、このプラスミドをベクターとして宿主に導入する方法が好適である。
【００２４】
ただし、一般的に、大腸菌等では発現プラスミドは１０ｋｂ以上になるとコピー数が減少し、結果的に目的タンパク質の発現量が低下することがある。例えば、シャペロニンが８つ連結した融合タンパク質を１つのプラスミドで生産しようとすると、発現プラスミドは１５ｋｂｐ以上にもなり、効率的な発現ができないことがある。従って、プラスミドを導入するにあたっては、シャペロニン遺伝子Ｎ回連結体（Ｎは１〜１２）遺伝子の大きさと目的タンパク質遺伝子の大きさ、得ようとする融合タンパク質におけるシャペロニンと目的タンパク質との数比等を考慮することが必要となる。
【００２５】
具体的には、例えば、同一宿主内で共存・複製可能な２種の異なるプラスミドに、融合タンパク質をコードする遺伝子と、シャペロニンのみをコードする遺伝子とをそれぞれに組み込み、これらのプラスミドを同一の宿主に導入する方法が好ましい。この方法によれば、シャペロニン複合体の構造を制御することができる。例えば、シャペロニンと目的タンパク質の数比が４：１である融合タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだベクターと、１個又は２〜４個連結したシャペロニンのみをコードする遺伝子を組み込んだベクターとを導入して共発現させることにより、シャペロニンと目的タンパク質の数比が８：１のシャペロニンリングを形成することが可能である。この方法は、プラスミドの巨大化を防止し、プラスミドコピー数の減少を防止することにより、発現量が低下するのを防ぐことができることから特に好ましい。
【００２６】
プラスミドを導入した宿主内で融合タンパク質を発現させる方法としては特に限定されず、公知の方法を用いることができ、例えば、予めプラスミドにコードされていた薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤を含有する培地中で宿主を培養する方法等が挙げられる。また、２種類のプラスミドを用いる場合であって、各々のプラスミドにコードされる薬剤耐性遺伝子がそれぞれ異なっている場合には、この２種類の薬剤の存在下で培養することにより、効率よく、融合タンパク質を発現させることができる。
【００２７】
上記宿主としては特に限定されず、例えば大腸菌等の細菌、その他の原核細胞、酵母、昆虫細胞、哺乳動物培養細胞、植物培養細胞、及びトランスジェニック動・植物等が挙げられる。なかでも、高い細胞増殖特性を有し、培養操作が簡便でかつ培養に用いる栄養源等のコストが安価であることから、大腸菌等の細菌や酵母等が好適である。また、細菌、真核生物抽出液等を用いた無細胞翻訳系（例えばＳｐｉｒｉｎ，Ａ．Ｓ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ１１，２６５６−２６６４：Ｆａｌｃｏｎｅ，Ｄ．ｅt ａｌ．，１９９１，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１，２６５６−２６６４）でも、融合タンパク質を可溶性タンパク質として発現させることが可能である。
【００２８】
また、上記融合タンパク質は、分子量が約６５〜６００ｋＤａと巨大であるため、転写されたｍＲＮＡの特定のリボヌクレアーゼによる分解、翻訳された融合タンパク質のプロテアーゼによる２段階の切断を受ける可能性がある。この場合には、例えば、大腸菌を宿主として用いる場合はｍＲＮＡの分解に関与するリボヌクレアーゼであるＲＮａｓｅＥ遺伝子を欠損させた大腸菌を宿主として用いることにより、ｍＲＮＡの分解を抑制することが可能である（Ｇｒｕｎｂｅｒｇ−Ｍａｎａｇｏ，Ｍ．，１９９９，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．，３３，１９３−２２７）。更に、翻訳後切断については、１５〜２５℃の低温で発現させたり、例えばｌｏｎ、ｏｍｐＴ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｅｔａｌ．１９８４，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ１５９，２８３−２８７）、又は、Ｃｌｐ、ＨｓｌＶＵ（Ｋａｎｅｍｏｒｉ，Ｍ．ｅｔａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９，７２１９）等のプロテアーゼの構造遺伝子を欠損させた大腸菌を宿主として用いたりすることにより制御することが可能である。
【００２９】
本発明の分子間相互作用解析法では、上述のようにして発現した融合タンパク質を精製して用いる。精製する方法としては特に限定されず、従来公知の方法を用いることができ、例えば、以下のような方法等が挙げられる。
宿主内で融合タンパク質を発現させた後、細胞を回収し破砕し、上清を回収する。シャペロニン複合体は分子量が約８４０〜９６０ＫＤａの巨大タンパク質であるため、４０％飽和程度の硫安塩析によって沈殿させることができる。塩析により沈澱した融合タンパク質を回収した後、適当な緩衝液に溶解し、疎水クロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィーによって融合タンパク質の存在するフラクションを回収する。これらを限外ろ過によって濃縮した後、濃縮液を５〜５０ｍＭ程度の塩化マグネシウム及び５０〜３００ｍＭ程度の塩化ナトリウム又は塩化カリウムが含有された緩衝液を展開液としてゲルろ過を行い、排除限界直後のピークを回収することによって融合タンパク質を精製することができる。
【００３０】
融合タンパク質のＮ末端又はＣ末端に６〜１０個のヒスチジンが並んだヒスチジンタッグを連結させた場合には、ニッケル等の金属キレートカラムを用いれば、融合タンパク質の回収はより簡便で効率的である。また、用いるシャペロニンに対する抗体を用いて、免疫沈降又はアフィニティクロマトグラフィーによっても迅速・簡便に精製することが可能である。ただし、リング構造を形成した融合タンパク質のみを回収するためには、これらにイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過を組み合わせることが好ましい。
【００３１】
シャペロニンが耐熱性のものである場合には、宿主の抽出液を６０〜８０℃で熱処理することによって大部分の宿主由来タンパク質を沈殿させることができ、融合タンパク質の精製をより簡略化させることができる。このとき、目的タンパク質自身が耐熱性を有していなくとも、シャペロニンの空洞内部に保持されているので、変性することはない。
【００３２】
上記いずれの方法によっても、得られた精製融合タンパク質の形態は透過型電子顕微鏡によって観察可能である。目的タンパク質がシャペロニンリングに格納されている場合、外径１４〜１６ｎｍ程度のシャペロニン特有のリング構造が観察される。融合タンパク質のリング構造が不安定な場合は、精製の過程でマグネシウム及びＡＴＰを存在させておくことで、リング構造である融合タンパク質を効率的に回収することが可能である。
【００３３】
目的タンパク質が膜結合性タンパク質又は膜貫通性タンパク質である場合には、融合タンパク質を精製した後、疎水性アルキル鎖がオクチル（Ｃ８）からドデシル（Ｃ１２）である非イオン性界面活性剤等を作用させると、ミセルの直径がほぼ生体膜の相応し、シャペロニン内部で正しい構造を形成しやすい。上記非イオン性界面活性剤として、例えば、β−オクチルグルコシド、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、Ｔｗｅｅｎ２０等が挙げられる。
【００３４】
本発明の分子間相互作用解析法では、このようにして得られた融合タンパク質を用いて、目的タンパク質とそのリガンド物質との結合力を解析する。上記解析の方法としては特に限定されず従来公知の方法を用いることができ、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動法、表面プラズモン共鳴シグナル法、水晶振動子を用いる方法等が挙げられる。なかでも、融合タンパク質と目的タンパク質のリガンド物質とのいずれか一方をセンサーチップ等の金属膜の表面に固定化した後、他方を作用させることによって結合体を形成させ、作用前後の質量変化を表面プラズモン共鳴シグナル法により検出する方法が好ましい。
【００３５】
融合タンパク質又は目的タンパク質のリガンド物質を物理吸着又は化学結合によって金薄膜の表面に固定化する方法としては特に限定されず、化学結合としては、例えば、金薄膜の表面にカルボキシメチル基を導入し、融合タンパク質中のシャペロニンのアミノ基又はリガンド物質のアミノ基、チオール基、アルデヒド基と結合させる方法等が挙げられる。
【００３６】
通常、タンパク質を担体に固定化すると、蛋白が変性したり、配向性が悪くなったりして活性が低下する場合が多い。しかし、本発明では、目的タンパク質がシャペロニンによって保護され、かつ、シャペロニンを介して固定化されているため、変性することはない。また、シャペロニンが固定化されれば、シャペロニンキャビティの内径が５ｎｍ程度あるため、リガンド物質が低分子化合物であれば受容体とリガンド物質とが充分に相互作用することのできる空間が維持されている。
【００３７】
金薄膜表面に固定化された融合タンパク質又はリガンド物質に、リガンド物質又は融合タンパク質が結合して結合体が形成すると、質量変化が生じることから、この作用の前後の質量変化を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）シグナルとして検出することができる。すなわち、金属・液界面を光励起すると表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が発生する。生体分子の固定化されていない側の金薄膜に光を全反射させるように当てると、反射光の一部に反射光強度が低下した部分が観察される（ＳＰＲシグナル発生）。この光の暗い部分の現れる角度（屈折率変化）は、金属膜上での質量に依存する。金属膜上で融合タンパク質とリガンド物質との結合体が生成すると質量変化が生じ、光の暗い部分がシフトする。逆に解離により質量が減少すれば屈折率は元に戻る。すなわち、金属膜表面での質量変化を縦軸に採り、質量変化をリアルタイムでモニターすることが可能である。
【００３８】
本発明の分子間相互作用解析法の対象となるタンパク質としては特に限定されず、例えば、セレトニンレセプター等の７回膜貫通型受容体（Ｇタンパク質共役型受容体：ＧＰＣＲ）等の膜受容体タンパク質、抗体、触媒抗体、タンパク質リン酸化酵素、プロテアーゼ等が挙げられる。
【００３９】
本発明の分子間相互作用解析法によれば、目的タンパク質をシャペロニンとペプチド結合を介して結合した融合タンパク質の形で宿主細胞内に産生させるため、目的タンパク質が膜受容体タンパク質であっても、宿主生物に対する毒性が発現したり、宿主細胞のプロテアーゼによる消化を受けることなく、しかも、精製が非常に容易であることから、大量の目的タンパク質を容易に得ることができる。更に、目的タンパク質をシャペロニンと結合した融合タンパク質の形で金属膜の表面に結合させることにより、目的タンパク質の活性が低下してしまうということもない。
本発明の分子間相互作用解析法によれば、極めて容易に、タンパク質とリガンドとの相互作用を解析することができる。
【００４０】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００４１】
実施例１
（古細菌シャペロニンＴＣＰＮβ８回連結体とセロトニンレセプターの融合タンパク質の発現）
配列１に示された古細菌シャペロニン（ＴＣＰ）遺伝子の８回連結体発現ベクターｐＴＣＰ８を作製した。次いで、配列２に示されたヒトセロトニンレセプター（５ＨＴ１Ａ）遺伝子をＰＣＲによって５’末端にＮｈｅＩサイトを、３’末端にＸｈｏＩサイトを設け、ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩ処理が施されたｐＴＣＰ８に導入し、ＴＣＰ８回連結体と５ＨＴ１Ａの融合タンパク質を合成する発現ベクターｐＴＣＰ８・５ＨＴ１Ａを構築した。
【００４２】
本発現ベクターｐＴＣＰ８・５ＨＴ１Ａを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した後、融合タンパク質の発現を行った。なお、コントロールとして発現ベクターｐＴＣＰ８、及び５ＨＴ１Ａ遺伝子単独を組み込んだ発現ベクターｐＴＨＴ１Ａをそれぞれ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した後、タンパク質の発現も行った。
【００４３】
各大腸菌抽出液の上清と沈澱画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、ブロッティングメンブランに転写し、抗５ＨＴ１Ａポリクロナル抗体を用いてウエスターンブロッティングを行った。その結果、発現ベクターｐＴＣＰ８・５ＨＴ１Ａ保持の大腸菌抽出液サンプルのみにおいて、可溶性画分に融合タンパク質の分子量相当（約２８０ＫＤａ）の位置に強くバンドが検出された。一方、発現ベクターｐＴＣＰ８又はｐＴＨＴ１Ａ保持の大腸菌抽出液サンプルでは可溶性画分には検出されなかった。ただし、ｐＴＨＴ１Ａ保持の大腸菌抽出液サンプルでは不溶性画分に弱い強度のバンドが検出された。以上のことから、５ＨＴ１Ａ遺伝子は単独では大腸菌可溶性画分で発現することはできないが、ＴＣＰ８回連結体との融合蛋白として発現させることで、可溶性蛋白として発現することがわかった。
【００４４】
次に、発現ベクターｐＴＣＰ８・５ＨＴ１Ａ保持の大腸菌抽出液を塩析し、塩析により沈澱した融合タンパク質を回収した後、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液に溶解し、５ｍＭＭｇＣｌ_２／５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に透析した。透析後、透析内液をＤＥＡＥ−セファロース及びＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷカラムによるアニオン交換クロマトグラフィー及びＳｕｐｅｒｏｓｅ６（アマシャムファルマシアバイオテック社）によるゲルろ過によって融合タンパク質を精製した。
【００４５】
精製標品を透過型電子顕微鏡によって観察したところ、シャペロニン特有のリング構造が観察された。以上のことから、５ＨＴ１ＡはＴＣＰのキャビティ内部に１分子ごとに格納されることによって可溶性画分に発現したと考えられる。
【００４６】
実施例２
（表面プラズモン共鳴シグナルによるセロトニンと古細菌シャペロニン・セロトニンレセプター融合タンパク質の結合状態の解析）
実施例１にて調製した融合タンパク質を、金薄膜がコートされたセンサーチップ表面に固定化した。なお、固定化は、予め金薄膜の表面にカルボキシメチル基を導入しておき、融合タンパク質中のシャペロニンのアミノ基と結合させることにより行った。
【００４７】
得られたセンサーチップを、表面プラズモン共鳴シグナル解析装置（ビアコア社製、ＢＩＡＣＯＲＥＸ）にセットし、リガンドサンプルとして１０〜１００ｎＭのセロトニン溶液をフローセルに流してリガンド物質を結合させた後、ｐＨ２．５のグリシン溶液によって解離させた。
この結合・解離に伴う質量変化をリアルタイムで測定し、解析ソフトウウェアＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ９．１（ビアコア社）によって解離定数（Ｋｄ）を算出したところ１３．７ｎＭであった。
【００４８】
なお、コントロール実験として、ＴＣＰ８回連結体のみをセンサーチップに固定化して同様の実験を行ったところ、セロトニンとの結合は全く検出されなかった。以上のことから、セロトニンレセプターはシャペロニンキャビティ内部に収納された融合タンパク質の状態でもセロトニンと強く結合できる構造をとっていると考えられた。
【００４９】
実施例３
（大腸菌シャペロニンＧｒｏＥＬ７回連結体とセロトニンレセプターの融合タンパク質の発現）
配列３に示された大腸菌シャペロニンＧｒｏＥＬ７回連結体発現ベクターｐＴｒ（ＧｒｏＥ）７を作製した。次いで、配列２に示されたヒトセロトニンレセプター（５ＨＴ１Ａ）遺伝子をＰＣＲによって５’末端にＮｈｅＩサイトを、３’末端にＸｈｏＩサイトを設け、ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩ処理が施された発現ベクターｐＴｒ（ＧｒｏＥ）７に組み込み、ＧｒｏＥＬ７回連結体と５ＨＴ１Ａの融合タンパク質を合成する発現ベクターｐＴｒ（ＧｒｏＥ）７・５ＨＴ１Ａを構築した。
【００５０】
発現ベクターｐＴｒ（ＧｒｏＥ）７・５ＨＴ１Ａを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した後、融合タンパク質の発現を行った。なお、コントロールとして発現ベクターｐＴｒ（ＧｒｏＥ）７及び５ＨＴ１Ａ遺伝子単独を組み込んだ発現ベクターｐＴＨＴ１Ａをそれぞれ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した後、タンパク質の発現も行った。
【００５１】
各大腸菌抽出液の上清と沈澱画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、ブロッティングメンブランに転写し、抗５ＨＴ１Ａポリクロナル抗体を用いてウエスターンブロッティングを行った。
その結果、発現ベクターｐＴｒ（ＧｒｏＥ）７・５ＨＴ１Ａ保持の大腸菌抽出液サンプルのみにおいて、可溶性画分に融合タンパク質の分子量相当（約２８０ＫＤａ）の位置に強くバンドが検出された。一方、発現ベクターｐＴｒ（ＧｒｏＥ）７又はｐＴＨＴ１Ａ保持の大腸菌抽出液サンプルでは可溶性画分には検出されなかった。ただし、ｐＴＨＴ１Ａ保持の大腸菌抽出液サンプルでは不溶性画分に弱い強度のバンドが検出された。以上のことから、５ＨＴ１Ａ遺伝子は単独では大腸菌可溶性画分で発現することはできないが、ＧｒｏＥＬ７回連結体との融合蛋白として発現させることで、可溶性蛋白として発現することがわかった。
以上のことから、５ＨＴ１Ａ遺伝子は単独では大腸菌可溶性画分で発現することはできないが、ＧｒｏＥＬ７回連結体との融合蛋白として発現させることで、可溶性蛋白として発現することがわかった。
【００５２】
次に、発現ベクターｐＴｒ（ＧｒｏＥ）７・５ＨＴ１Ａ保持の大腸菌抽出液を塩析し、塩析により沈澱した融合タンパク質を回収した後、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液に溶解し、５ｍＭＭｇＣｌ_２／５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に透析した。透析後、透析内液をＤＥＡＥ−セファロース及びＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷカラムによるアニオン交換クロマトグラフィー及びＳｕｐｅｒｏｓｅ６（アマシャムファルマシアバイオテック社）によるゲルろ過によって融合タンパク質を精製した。
【００５３】
精製標品を透過型電子顕微鏡によって観察したところ、シャペロニン特有のリング構造が観察された。以上のことから、５ＨＴ１ＡはＧｒｏＥＬのキャビティ内部に１分子ごとに格納されることによって可溶性画分に発現したと考えられる。
【００５４】
実施例４
（表面プラズモン共鳴シグナルによるセロトニンと大腸菌シャペロニン・セロトニンレセプター融合タンパク質の結合状態の解析）
実施例３にて調製した融合タンパク質を、金薄膜がコートされたセンサーチップ表面に固定化した。なお、固定化は、予め金薄膜の表面にカルボキシメチル基を導入しておき、融合タンパク質中のシャペロニンのアミノ基と結合させることにより行った。
【００５５】
得られたセンサーチップを、表面プラズモン共鳴シグナル解析装置（ビアコア社製、ＢＩＡＣＯＲＥＸ）にセットし、リガンドサンプルとして１０〜１００ｎＭのセロトニン溶液をフローセルに流してリガンド物質を結合させた後、ｐＨ２．５のグリシン溶液によって解離させた。
この結合・解離に伴う質量変化をリアルタイムで測定し、解析ソフトウウェアＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ９．１（ビアコア社）によって解離定数（Ｋｄ）を算出したところ１５．３ｎＭであった。
【００５６】
なお、コントロール実験として、ＴＣＰ８回連結体のみをセンサーチップに固定化して同様の実験を行ったところ、セロトニンとの結合は全く検出されなかった。以上のことから、セロトニンレセプターはシャペロニンキャビティ内部に収納された融合タンパク質の状態でもセロトニンと強く結合できる構造をとっていると考えられた。
【００５７】
実施例５
（無細胞翻訳系による（ＴＣＰβ）４とセロトニンレセプターの融合タンパク質の合成）
無細胞翻訳系発現ベクターｐＩＶＥＸ２．３（ロシュダイアグノスティックス社）にＴＣＰβ４回連結体とセロトニンレセプター（５ＨＴ１Ａ）の融合タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだｐＩＶ（ＴＣＰβ）４・５ＨＴ１Ａを構築した。
【００５８】
このｐＩＶ（ＴＣＰβ）４・５ＨＴ１ＡをもとにＲａｐｉｄＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍＲＴＳ５００（ロシュダイアグノスティック社）を用いてタンパク質合成を行った。反応方法はこの無細胞翻訳システムのＩｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎＭａｎｕａｌ（Ｖｅｒｓｉｏｎ１，Ｊｕｎｅ２０００）に従った。反応終了後、反応液からニッケルキレートクロマトグラフィーによって精製した。
【００５９】
精製された融合タンパク質を５ｍＭＭｇＣｌ２／１ｍＭＤＴＴ／５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液に透析後、透析内液を透過型電子顕微鏡で観察したところ、シャペロニン特有のリング構造が見られた。
【００６０】
実施例６
（表面プラズモン共鳴シグナルによるセロトニンと古細菌シャペロニン・セロトニンレセプター融合タンパク質の結合状態の解析）
実施例５にて調製した融合タンパク質を、金薄膜がコートされたセンサーチップ表面に固定化した。なお、固定化は、予め金薄膜の表面にカルボキシメチル基を導入しておき、融合タンパク質中のシャペロニンのアミノ基と結合させることにより行った。
【００６１】
得られたセンサーチップを、表面プラズモン共鳴シグナル解析装置（ビアコア社製、ＢＩＡＣＯＲＥＸ）にセットし、リガンドサンプルとして１０〜１００ｎＭのセロトニン溶液をフローセルに流してリガンド物質を結合させた後、ｐＨ２．５のグリシン溶液によって解離させた。
この結合・解離に伴う質量変化をリアルタイムで測定し、解析ソフトウウェアＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ９．１（ビアコア社）によって解離定数（Ｋｄ）を算出したところ１６．３ｎＭであった。
【００６２】
以上のことから、無細胞合成系で合成された古細菌シャペロニン・セロトニンレセプター融合タンパク質においても、セロトニンレセプターはシャペロニンキャビティ内部に収納された融合タンパク質の状態でもセロトニンと強く結合できる構造をとっていると考えられた。
【００６３】
実施例７
（シングルリングＧｒｏＥＬの作製）
大腸菌Ｋ１２株ゲノムを鋳型とするＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）によって、大腸菌シャペロニンＧｒｏＥＬ遺伝子をクローニングした。得られたＧｒｏＥＬをＤｒａＩＩＩ及びＢａｍＨＩで消化し、更にＧｒｏＥＬの４５２番目のアミノ酸をグルタミン酸に、４６１、４６３、４６４番目のアミノ酸をアラニンに置換するよう設計された合成ＤＮＡを挿入することによってシングルリングを構成するＧｒｏＥＬ、ＳＲ１を得た。ｐＴｒｃ９９Ａ発現ベクター（アマシャムファルマシア社製）を用いて、取得したＳＲ１が一方向に１、２、３、４、５、６及び７回連結した遺伝子断片が挿入された発現ベクターｐＴｒｃ（ＳＲ１）ｎ（ｎは１〜７）を構築した。各発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入しカルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含む２ＸＹ．Ｔ．培地（バクトトリプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ）で２３℃、１１０ｒｐｍで２４時間培養し、シャペロニン連結体を発現させた。培養終了後、回収した菌体を超音波で破砕し、遠心分離で上清を回収後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びにクマシーブリリアントブルー染色によって分析した結果、（ＳＲ１）ｎ（ｎは１〜７）が可溶性画分に大量発現していることが確認できた。
【００６４】
実施例８
（シングルリングＧｒｏＥＬ融合ＧＰＣＲの発現）
ヒト由来の膜蛋白質である５種のＧ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）である、セロトニン受容体（ＨＴ１ａＲ）遺伝子、エンドセリンＡ受容体（ＥＴＡＲ）遺伝子、エンドセリンＢ受容体（ＥＴＢＲ）遺伝子、ＶａｓｏａｃｔｉｖｅＩｎｔｅｓｔｉｎａｌＰｅｐｔｉｄｅ１受容体（ＶＩＰ１Ｒ）遺伝子、及び、ＣＤ９７遺伝子に、ＰＣＲによって５’末端にＮｈｅＩサイトを、３’末端にＸｈｏＩサイトを設け、ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩ処理が施されたｐＴｒｃ（ＳＲＩ）７に導入し、更に、Ｃ末端にＦＬＡＧタッグを付加した発現ベクターｐＴｒｃ（ＳＲ１）７ＨＴ１ａＲＦ、ｐＴｒｃ（ＳＲ１）７ＥＴＡＲＦ、ｐＴｒｃ（ＳＲ１）７ＴＣＦＥＴＢＲＦ、ｐＴｒｃ（ＳＲ１）７ＶＩＰ１ＲＦ、及び、ｐＴｒｃ（ＳＲ１）７ＣＤ９７Ｆを作製した。得られた発現ベクターで大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）株を形質転換し、実施例７と同条件で発現を行った。超音波による菌体破砕後、上清を遠心分離によって回収し、抗ＦＬＡＧ抗体固定化ビーズ（シグマ社製）を用いて免疫沈降反応を行った。５種全てのＧＰＣＲについて、いずれも融合蛋白質として４７０ｋＤａ付近にバンドが確認でき、またそれら全てが、抗ＦＬＡＧ抗体に対して結合した。このことから、これら５種のＧＰＣＲの全てが大腸菌可溶性画分に発現することが確認できた。
【００６５】
実施例９
（表面プラズモン共鳴法によるＳＲ１七量体及びエンドセリンＡ受容体の融合タンパク質とエンドセリン−１との結合状態の解析）
金薄膜を蒸着し、その金薄膜上にリンカー層を介して結合したデキストランにカルボキシルメチル基が導入されたセンサーチップ（ビアコア社製、センサーチップＣＭ５）にエンドセリン−１（ペプチド研究所、Ｈ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−ＯＨ）を、センサーチップ上のカルボキシル基とエンドセリン−１のアミノ基とを共有結合させることにより、センサーチップ上に固定した。得られたセンサーチップを、表面プラズモン共鳴解析装置（ビアコア社製、ＢＩＡＣＯＲＥＸ）にセットし、サンプルとして実施例８で得られた１００μｇのシングルリングＧｒｏＥＬ七量体融合エンドセリンＡ受容体溶液をフローセルに流した。この、エンドセリン−１とエンドセリンＡ受容体との結合・解離に伴う質量変化をリアルタイムで測定し、エンドセリン−１とエンドセリンＡ受容体との特異的結合を検出した。また、対照として、エンドセリンＡ受容体を融合していないシングルリングＧｒｏＥＬ七量体、シングルリング化を行っていないダブルリング構造のＧｒｏＥＬ七量体融合エンドセリンＡ受容体、及び、シングルリング化を行っていないダブルリング構造のＧｒｏＥＬ七量体も同様にフローセルに流し、エンドセリン−１との結合・解離に伴う質量変化を測定した。結果、図３に示すようにエンドセリン−１とシングルリングＧｒｏＥＬ七量体融合エンドセリンＡ受容体と間の相互作用が確認でき、また、エンドセリン−１とシングルリングＧｒｏＥＬ七量体との間に相互作用を認めることができなかったことから、エンドセリン−１とシングルリングＧｒｏＥＬ七量体融合エンドセリンＡ受容体中のエンドセリンＡ受容体が特異的に結合したことがわかった。一方、ダブルリング構造のＧｒｏＥＬ七量体融合エンドセリンＡ受容体、ダブルリング構造のＧｒｏＥＬ七量体は、エンドセリン−１との相互作用を認めることができなかったことから、ＧｒｏＥＬのシングルリング化がエンドセリンＡ受容体のリガンド結合活性には有効であることが確認できた。
【００６６】
【発明の効果】
本発明によれば、医薬品開発等に必要なタンパク質とそのリガンド物質との分子間相互作用、特にＧＰＣＲをはじめとする膜受容体タンパク質等の受容体タンパク質とリガンド物質（阻害剤候補物質）の結合力を解析する分子間相互作用解析法を提供できる。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】大腸菌シャペロニンの構造を示す模式図である。
【図２】サブユニット構成数が８個である古細菌由来のシャペロニンを用いた場合の融合タンパク質の設計例を示す模式図である。
【図３】エンドセリン−１固定化センサーチップを用いたエンドセリン−１と（ＳＲ１）７ＥＴＡＲ及び（ＳＲ１）７間における相互作用の測定結果を示す図である。

Claims

シャペロニン遺伝子Ｎ回連結体（Ｎは１〜１２）と目的タンパク質遺伝子とを含む遺伝子を転写・翻訳してなる、シャペロニンと目的タンパク質とがペプチド結合を介して連結した融合タンパク質と、目的タンパク質に対するリガンド物質との結合を解析することを特徴とする分子間相互作用解析法。
融合タンパク質は、目的蛋白質がシャペロニンＮ回連結体（Ｎは１〜１２）のＮ末端、Ｃ末端及び／又は複数のシャペロニン連結間に結合していることを特徴とする請求項１の分子間相互作用解析法。
融合タンパク質は、目的タンパク質がシャペロニンＮ回連結体（Ｎは１〜１２）のＮ末端及びＣ末端に結合したものであって、両末端に結合した前記目的タンパク質は同種又は異種のものであることを特徴とする請求項１又は２記載の分子間相互作用解析法。
融合タンパク質は、シャペロニンのリング構造内部に目的タンパク質が格納された構造を有することを特徴とする請求項１、２又は３記載の分子間相互作用解析法。
融合タンパク質と目的タンパク質に対するリガンド物質との結合の解析は、前記融合タンパク質と前記目的タンパク質のリガンド物質とのいずれか一方をセンサーチップ上に固定化した後、他方を作用させることによって結合体を形成させ、作用前後の質量変化を表面プラズモン共鳴シグナル法により検出することにより行うことを特徴とする請求項１、２、３又は４記載の分子間相互作用解析法。
融合タンパク質を無細胞蛋白合成系で調製することを特徴とする請求項１、２、３、４又は５記載の分子間相互作用解析法。
目的タンパク質はＧタンパク質共役型膜受容体であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５又は６記載の分子間相互作用解析法。