JP2005269936A - 蛋白質の生産方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 目的蛋白質の宿主への毒性発現、宿主の分泌するプロテアーゼによる分解、折
り畳み不良、封入体形成等を抑制し、いかなる目的蛋白質であっても可溶性蛋白質として
万能的に大量発現させることができる新規な蛋白質の生産方法を提供する。
【解決手段】 Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニンサ
ブユニットをコードする遺伝子と目的蛋白質をコードする遺伝子とを含有する遺伝子を転
写・翻訳して、前記目的蛋白質が前記Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ
８由来シャペロニンサブユニットとペプチド結合を介して連結した融合蛋白質を合成する
工程を有する蛋白質の生産方法。
【選択図】 なし

Description

本発明は、宿主系での組み換え蛋白質発現、又は、無細胞翻訳系での蛋白質発現において
、活性型蛋白質として合成することが困難であった蛋白質の生産を可能とし、また、効率
的な蛋白質の合成及び精製を実現する新規な蛋白質の生産方法に関する。

これまでに、バクテリア、酵母、昆虫、動植物細胞、トランスジェニック動・植物等の多
くの宿主での組み換え蛋白質発現系及び無細胞翻訳系が確立されてきた。なかでも、哺乳
動物の培養細胞による組み換え蛋白質生産方法は、適当な翻訳後修飾が施されることから
治療薬製造の標準システムとなりつつある。しかし、哺乳動物の培養細胞を用いる系は、
微生物を宿主とする系に比べて蛋白質の合成レベルが低く、より大きな培養槽を必要とす
る。このことから、今後新薬を手がけるバイオテクノロジー産業では、製造設備が不足す
ると考えられている（非特許文献１）。また、近年生産効率の向上が図られているトラン
スジェニック動・植物を用いる蛋白質生産技術も、全幅の信頼を得るには至っていない（
非特許文献１）。

一方、これまでに開発された組み換え蛋白質発現系においては、活性型蛋白質を大量に得
ることが困難な場合が多々あった。例えば、目的蛋白質が宿主に対してなんらかの毒性を
有する場合には、その蛋白質の合成は抑制され発現量が低下する。また、例えば、目的蛋
白質が可溶性蛋白質として発現しても、宿主の分泌するプロテアーゼによって分解されて
しまう場合には、生産量が極めて少なくなる。更に、例えば、蛋白質の多くは生成後に折
り畳み等が施され一定の三次元構造をとったときに初めて機能を発現するところ、目的蛋
白質が発現しても折り畳みがうまくいかずに所期の機能を発現しなかったり、封入体を形
成してしまったりする場合もある。とりわけ、このような封入体がいったん形成されると
、たとえ可溶化して再折り畳みを行っても、最終的に得られる活性型蛋白質の量は極めて
少量となる。このような封入体の形成は、特に無細胞翻訳系を用いた場合に見られる。

封入体の生成を抑制する方法としては、例えば、非特許文献２には、目的蛋白質をグルタ
チオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白質として発現させる方法が開示
されており、非特許文献３には、目的蛋白質をチオレドキシンとの融合蛋白質として発現
させる方法が開示されており、非特許文献４には、目的蛋白質をマルトース結合蛋白質と
の融合蛋白質として発現させる方法が開示されている。しかしながら、これらの方法でも
、封入体の形成を完全には解消することができなかった。

また、活性型蛋白質を製造する方法としては、例えば、非特許文献５には、目的蛋白質を
蛋白質の折り畳み反応を支援する蛋白質群である分子シャペロンと共発現させ、目的蛋白
質の可溶性画分への発現量を増大させる方法が開示されている。しかしながら、この方法
でも、活性型蛋白質の収量を飛躍的に増加させるには至っていないのが現状であった。

更に、宿主の分泌するプロテアーゼによる目的蛋白質の分解を抑制する方法としては、例
えば、非特許文献６には、ｌｏｎ、ｏｍｐＴ等のプロテアーゼ構造遺伝子の一部を欠損さ
せた大腸菌を宿主として用いる方法が開示されている。しかしながら、宿主のプロテアー
ゼ構造遺伝子を全て欠損させてしまうと大腸菌自身の生育等が悪くなるところ、一部のプ
ロテアーゼ構造遺伝子を残存させた場合にはプロテアーゼによる分解の影響を完全には回
避できないという問題があった。

以上のように、従来の蛋白質発現技術には、宿主に対する毒性、宿主の分泌するプロテア
ーゼによる分解、折り畳み不良、封入体形成等の大きな問題点があったため、発現させよ
うとする蛋白質の種類によって発現量が著しく異なってしまい、蛋白質毎に発現条件を試
行錯誤で検討する必要があった。このため、これらの問題点を根本的に解決できる技術の
開発が望まれていた。

Ｇａｒｂｅｒ，Ｋ．，２００１，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９，１８４−１８５ Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｇｅｎｅ ６７，３１−４０ ＬａＶａｌｌｉｅ，Ｅ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１，１８７−１９３ Ｇｕａｎ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ６７，２１−３０ Ｎｉｓｈｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．１９９８，Ａｐｐｌｙ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４，１６９４−１６９９ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ．１９８４，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５９，２８３−２８７

本発明は、上記現状に鑑み、目的蛋白質の宿主への毒性発現、宿主の分泌するプロテアー
ゼによる分解、折り畳み不良、封入体形成等を抑制し、いかなる目的蛋白質であっても可
溶性蛋白質として万能的に大量発現させることができる新規な蛋白質の生産方法を提供す
ることを目的とする。

本発明は、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニンサブユ
ニットをコードする遺伝子と目的蛋白質をコードする遺伝子とを含有する遺伝子を転写・
翻訳して、前記目的蛋白質が前記Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由
来シャペロニンサブユニットとペプチド結合を介して連結した融合蛋白質を合成する工程
を有する蛋白質の生産方法である。
以下に本発明を詳述する。

本発明の蛋白質の生産方法は、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来
シャペロニンサブユニット（以下、単にシャペロニンサブユニットともいう）と目的蛋白
質とが、ペプチド結合を介して連結した融合蛋白質を合成する工程を有する。

好熱性バクテリアＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８に熱ショック等の
ストレスを与えると、エネルギー物質であるＡＴＰの存在下又は非存在下で蛋白質の折り
畳みを支援したり、構造安定化に貢献したりする、一般に分子シャペロンと呼ばれる蛋白
質群の発現が誘導される。本明細書においてＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
ＨＢ８由来シャペロニンとは、これらの好熱性バクテリアＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍ
ｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８が産生する分子シャペロンのうち、サブユニットの分子量が約６
０ｋＤａのものを意味する。Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シ
ャペロニンは、蛋白質の折り畳み支援や変性防御の機能を有している。

上記Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニンは、複数のシ
ャペロニンサブユニットが非共有結合的に会合し、リング構造体（以下、これをシャペロ
ニンリングともいう）を形成する。このようなシャペロニンリングは、更に、シャペロニ
ンリング同士がリング面を介して非共有結合的に会合して２層構造体を形成したり、他の
複数のシャペロニンリングとリング面又はその側面を介して非共有結合的に会合して繊維
状構造体を形成したりする。このような２層構造体や繊維構造体をとる場合には、シャペ
ロニンの安定性及び機能が向上し、蛋白質の折り畳み支援を効率的に行う。また、後述す
るように、シャペロニンの補因子であるコシャペロニンと結合することで、目的蛋白質を
格納できるキャビティを同時に安定化することもできる。

図１に、７個のシャペロニンサブユニットで構成されるシャペロニンリング同士がリング
面を介して非共有結合的に会合した、合計１４のシャペロニンサブユニットからなる２層
構造体の模式図を示した。
上記シャペロニンリングは、その構造上、リングの内側に空洞（キャビティ）を有し、こ
のキャビティ内に蛋白質を収容することができる。例えば、図１に示した２層構造体は、
内径４．５ｎｍ、高さ１４．５ｎｍの空洞（キャビティ）を有し、６０ｋＤａの球状蛋白
質一つを充分に納めることができる。

更に、上記シャペロニンリングの構造をＸ線結晶構造解析によって調べたところ、シャペ
ロニンサブユニットのＮ末端及びＣ末端はともにキャビティ側に位置し、フレキシビリテ
ィの高い構造となっており、特にＣ末端の少なくとも２０アミノ酸はフレキシビリティの
極めて高い構造を示すことが明らかにされている。

上記Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニンは、上記シャ
ペロニンリングのキャビティ内に様々な蛋白質の折り畳み中間体や変性蛋白質を一時的に
納める機能を有し、蛋白質の折り畳み構造が形成されると、ＡＴＰの分解と共役して、納
めていた蛋白質をキャビティから放出する。
上記Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニンは、このよう
なシャペロニンリング構造を保った状態で大腸菌の細胞質可溶性画分に容易に大量生産さ
せることが可能である。

本発明の蛋白質の生産方法では、上記Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ
８由来シャペロニンサブユニットと目的蛋白質とがペプチド結合を介して連結した融合蛋
白質を合成する。

上記融合蛋白質において、上記シャペロニンサブユニットと目的蛋白質とは、上記シャペ
ロニンサブユニットのＮ末端、Ｃ末端、又は、上記シャペロニンサブユニット同士が連結
してシャペロニンリングを形成している場合のＮ末端、Ｃ末端又は連結部に、ペプチド結
合を介して連結されていることが好ましい。上記シャペロニンサブユニットと目的蛋白質
とがこのように連結されることにより、目的蛋白質はシャペロニンリングのキャビティ内
に確実に収納される。

また、上記シャペロニンサブユニットと目的蛋白質との連結部は、限定分解型プロテアー
ゼの切断配列を有することが好ましい。このような連結部を有する場合には、限定分解型
プロテアーゼを作用させることにより、容易にシャペロニンと目的蛋白質とを分離するこ
とが可能となる。上記限定分解型プロテアーゼとしては特に限定されず、例えば、トロン
ビン、エンテロカイネース、活性型血液凝固第１０因子等が挙げられる。
また、上記シャペロニンサブユニットと目的蛋白質との連結部は、目的蛋白質にメチオニ
ンが含まれない場合には、メチオニン残基を有することが好ましい。このような連結部を
有する場合には、ＣＮＢｒを作用させることにより、容易にシャペロニンと目的蛋白質と
を分離することが可能となる。

上記融合蛋白質における上記シャペロニンサブユニットと目的蛋白質の比は、Ｔｈｅｒｍ
ｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニンが本来サブユニット７つでリ
ングを形成することから、シャペロニンサブユニット数：目的蛋白質の比が１：１又は７
：１であることが好ましい。この場合、発現した融合蛋白質は、１：１の比のときは融合
蛋白質が７分子、７：１の比のときは、融合蛋白質が１分子のみでリングを形成する。
ただし、目的蛋白質の形状や分子量によってはこれ以外の数比も適する場合もある。例え
ば、目的蛋白質の分子量が６０ｋＤａ以上で、上記Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニンサブユニット７つからなるリング内部に格納されないと
きは、シャペロニンサブユニット数：目的蛋白質の比が、８〜１０：１の融合蛋白質１分
子でリング構造を形成し、そのリング内部に目的蛋白質を格納する場合もある。一方、目
的蛋白質の分子量が６０ｋＤａ以下である場合は、シャペロニンサブユニット数：目的蛋
白質の比が、６：１の融合蛋白質１分子でリング構造を形成し、そのリング内部に目的蛋
白質を格納する場合もある。

また、上記Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニンサブユ
ニット数と目的蛋白質数の比率が３：１である融合蛋白質であっても、目的蛋白質の分子
量が、３０または２０ｋＤａ前後である場合は、それぞれ、これらが２又は３分子会合し
てリング構造を形成し、６又は９個のシャペロニンサブユニットからなるシャペロニンリ
ングの内部に、それぞれ、目的蛋白質が２又３個格納される場合もある。同様に、目的蛋
白質の分子量に応じて、シャペロニンサブユニット数と目的蛋白質数の比率が２：１や４
：１の融合蛋白質であっても、目的蛋白質を複数個格納したシャペロニンリングを形成す
ることが可能である。

一般的には、シャペロニンサブユニットの比率が高くなればなるほど、シャペロニンリン
グのキャビティ内に格納可能な目的蛋白質の分子サイズは大きくなる。上記目的蛋白質が
、宿主細胞にさらされる危険性を避けるため、目的蛋白質１個に対してシャペロニンサブ
ユニットが２個以上であることが好ましい。

また、通常、シャペロニンによる蛋白質折り畳み反応は、基質蛋白質であるシングルポリ
ペプチドと１：１で起こることから、１個の目的蛋白質に対して１個のシャペロニンリン
グ又はシャペロニンが対応するように融合蛋白質を設計することが好ましい。ただし、目
的蛋白質の分子量によっては、１個のシャペロニンリング又はシャペロニンに２個以上の
目的蛋白質を対応させた場合であっても、充分な折り畳み反応が行われ得る。

以上を総合すると、融合蛋白質は、互いに連結した１〜１０個のＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニンサブユニットと目的蛋白質とからなり、Ｔ
ｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニンサブユニットのＮ末
端、互いに連結したＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニ
ンサブユニットのＣ末端、又は、互いに連結したＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓ ＨＢ８由来シャペロニンサブユニット同士の連結部に、目的蛋白質がペプチド結合
を介して連結されていることが好ましい。

上記融合蛋白質では、目的蛋白質はシャペロニンリングのキャビティ内部に格納されてい
ることから、生体内環境から保護され、プロテアーゼによる消化を受けにくくなる。また
、目的蛋白質が宿主にとって重要な生理機構を阻害する性質を有するものであっても、合
成されると同時にシャペロニンキャビティ内に格納され、宿主の生理機構に対する阻害作
用を発現することがない。Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャ
ペロニンは宿主の細胞質又は体液等の可溶性画分へ合成されるため、目的蛋白質が膜結合
性又は膜貫通性を有していても、膜へ移行し宿主の膜構造を破壊することはなく、宿主に
対する毒性を発現しない。また、目的蛋白質同士が直接会合することがないことから封入
体の形成も抑制することができる。更に、そもそも、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニンは、蛋白質折り畳み機能を有するものであることから
、キャビティ内に格納された目的蛋白質は、シャペロニンによる折り畳み反応により活性
型に折り畳まれ、かつ、その構造が安定化される。
このようなＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニンサブユ
ニットと目的蛋白質とからなる融合蛋白質であって、上記Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニンサブユニットにペプチド結合を介して連結した目
的蛋白質が、互いに連結したＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シ
ャペロニンサブユニットからなるリング構造体の内部に格納されている構造を有する融合
蛋白質もまた、本発明の１つである。

シャペロニンサブユニットとの連結はペプチド結合を介して行われることから、いかなる
蛋白質であっても上記融合蛋白質を生成可能であり、従来の蛋白質の生産方法のように、
蛋白質毎に最適の方法を模索する必要もなく、同一の条件にて生産することができる。

上記目的蛋白質としては特に限定されず、ヒト、マウス等の高等動物由来の疾病関連遺伝
子産物や化学プロセスに有効な酵素群の全てが目的蛋白質となりえるが、例えば、Ｂ型肝
炎ウィルス、Ｃ型肝炎ウィルス、ＨＩＶ、インフルエンザ等の病原性ウィルスゲノムにコ
ードされる、外被蛋白質、コア蛋白質、プロテアーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼ等の
蛋白質（ウィルス抗原）；哺乳動物由来抗体の重鎖、哺乳動物由来抗体の軽鎖、哺乳動物
由来抗体のＦｖ領域単鎖抗体（ｓｃＦＶ）の全長、又は、それらの６残基以上の部分蛋白
質、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）２、及び、完全抗体型である治療・診断用抗体；７回膜貫通型受
容体（Ｇ蛋白質共役型受容体）；血小板増殖因子、血液幹細胞成長因子、肝細胞成長因子
、トランスフォーミング成長因子、神経成長・栄養因子、線維芽細胞成長因子、インスリ
ン様成長因子等の成長因子；腫瘍壊死因子、インターフェロン、インターロイキン、エリ
スロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、マクロファージ・コロニー刺激因子、アルブミ
ン、ヒト成長ホルモン等のサイトカイン類等が挙げられる。

次に、本発明の蛋白質の生産方法について、具体的に説明する。
本発明の蛋白質の生産方法では、例えば、制限酵素を用いる方法やＰＣＲによる方法等の
通常の遺伝子工学的手法を用いて、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８
由来シャペロニンサブユニットをコードする遺伝子と目的蛋白質をコードする遺伝子とを
含有する遺伝子（以下、融合蛋白質をコードする遺伝子ともいう）を調製し、これらを組
み込んだ発現ベクターを作製する。この発現ベクターを用いて宿主を形質転換することに
より、宿主内で融合蛋白質を合成することができる。
上記目的蛋白質をコードする遺伝子としては、哺乳動物由来のｃＤＮＡ又はその６残基以
上のアミノ酸配列をコードする部分遺伝子が好適に用いられる。

上記発現ベクターは、ただ１種のものであってもよいし、融合蛋白質をコードする遺伝子
がそれぞれ組み込まれた複数の発現ベクターからなる群であってもよい。
一般に、大腸菌等を宿主として用いる場合、発現ベクターの大きさが１０ｋｂｐ以上にな
るとコピー数が減少することから、結果的に目的蛋白質の合成量が低下することがある。
例えば、シャペロニンサブユニットが７個連結した融合蛋白質を生産する場合、発現ベク
ターの大きさは少なくとも１５ｋｂｐ以上になる。これに対して、融合蛋白質をコードす
る遺伝子を、同一の宿主内で共存・複製することが可能な２種の異なる発現ベクターのそ
れぞれに組み込み、同一の宿主内で共発現させることにより発現量の低下を防ぐことがで
きる。例えば、同一の融合蛋白質を産する同一遺伝子を、異なる複製領域及び薬剤耐性遺
伝子を有する２種類の発現ベクターに組み込み、これら２種類のベクターで２種の薬剤の
存在下で大腸菌等を形質転換し、融合蛋白質の合成を行うことで、高発現をもたらすこと
も可能である。

また、融合蛋白質のみをコードする遺伝子と、シャペロニンサブユニットのみをコードす
る遺伝子とをそれぞれ同一の宿主内で共存・複製することが可能な２種の異なる発現ベク
ターに組み込み、同一の宿主内で共発現させてもよい。例えば、融合蛋白質のみをコード
する遺伝子とシャペロニンサブユニットのみをコードする遺伝子とをそれぞれ、異なる薬
剤耐性及び複製領域を有する２種類の発現ベクターに組み込み、２種類の薬剤の存在下で
共発現することにより、得られるＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由
来シャペロニンの構造を制御することができる。具体的には例えば、シャペロニンサブユ
ニットと目的蛋白質との数比が４：１である融合蛋白質を生産できる発現ベクターと、シ
ャペロニンサブユニットが１〜３個連結した遺伝子のみを含む発現ベクターとを、同一の
宿主内で共発現させることにより、シャペロニンサブユニットと目的蛋白質との数比が７
：１の融合蛋白質を形成することが可能である。
上述のように、発現ベクターの巨大化はコピー数の減少につながり、発現量の低下をもた
らすことがあることから、この方法は、発現量増加に有効である。

上記宿主としては特に限定されず、例えば、大腸菌等のバクテリア、その他の原核細胞、
酵母、昆虫細胞、哺乳動物の培養細胞等の動物細胞、植物の培養細胞等の植物細胞、動物
個体、植物個体、昆虫個体等が挙げられる。なかでも、培養コストが安価である点、培養
日数が短い点、培養操作が簡便な点等から、バクテリア又は酵母が好ましい。また、バク
テリア、真核生物抽出液等を用いた無細胞翻訳系（Ｓｐｉｒｉｎ，Ａ．Ｓ．，１９９１，
Ｓｃｉｅｎｃｅ １１，２６５６−２６６４：Ｆａｌｃｏｎｅ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，１９
９１，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１，２６５６−２６６４）により、融合蛋白質を
可溶性蛋白質として合成することも可能である。

また、上記融合蛋白質をコードする遺伝子は、発現ベクターを介して宿主生物に導入しな
くとも、宿主の染色体上に直接導入して発現させることもできる。例えば、大腸菌では、
ランバダインテグラーゼを発現する宿主にランバダインテグラーゼの部位特異的組み換え
機能を利用してプロモーター、リボゾーム結合部位、目的遺伝子、ターミネーター及び薬
剤耐性遺伝子等から成る発現ユニット遺伝子を染色体に導入することが可能である（Ｏｌ
ｓｏｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１４，
１６０−１６６）。例えば、酵母では、メタノール資化性酵母のアルコールデヒドロゲナ
ーゼ（ＡＯＸ）の下流と上流配列を利用して相同組み換えにより、ＡＯＸプロモーター配
列及びターミネーターを含む目的蛋白質の発現ユニット遺伝子を宿主染色体上に組み込む
方法がある（Ｓｃｏｒｅｒ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ １２，１８１−１８４）。
これらの方法では、いずれの場合も発現ユニット遺伝子を複数連結したものを染色体に導
入することで発現量を増加させることが可能である。染色体上への遺伝子組み込みによる
蛋白質発現では、発現ベクターを用いる場合のようにそのサイズの増大に応じてコピー数
が低下することなく、本発明のような分子量の大きい融合蛋白質の発現を安定化させるこ
とが可能である。

本発明で合成される融合蛋白質は、通常、その分子量が約４２０〜５００ｋＤａと巨大で
あるため、転写されたｍＲＮＡが特定のリボヌクレアーゼにより分解され、更に、翻訳さ
れた融合蛋白質がプロテアーゼにより分解されるという２段階の切断を受けることがある
。これに対しては、例えば、大腸菌を宿主として用いる場合は、ｍＲＮＡの分解に関与す
るリボヌクレアーゼであるＲＮａｓｅＥ遺伝子を欠損させた宿主を用いることにより、ｍ
ＲＮＡの分解を抑制することが可能である（Ｇｒｕｎｂｅｒｇ−Ｍａｎａｇｏ，Ｍ．，１
９９９，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．，３３，１９３−２２７）。翻訳後、プロテーゼに
よる分解を抑制する方法としては、例えば、１５〜２５℃の低温で発現させる方法；ｌｏ
ｎ、ｏｍｐＴ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
．，１５９，２８３−２８７）、Ｃｌｐ、ＨｓｌＶＵ（Ｋａｎｅｍｏｒｉ，Ｍ．ｅｔ ａ
ｌ．，１９９７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９，７２１９）等のプロテアーゼの構
造遺伝子を欠損させた大腸菌を宿主として用いる方法等が挙げられる。

また、本発明の蛋白質の生産方法においては、用いるベクターにシャペロニンの繰り返し
配列が含まれるため、ベクターが不安定となったり、特に宿主細胞とシャペロニンの由来
生物が同じであるときは、ベクターＤＮＡとゲノムＤＮＡの相同組換えが起こったりする
可能性がある。このような場合には、宿主として遺伝子の相同組換えに関する遺伝子であ
るＲａｃＡを欠損させた大腸菌を用いることにより、ベクターの安定性を向上させ、更に
相同組換えを抑制することができる。

本発明の蛋白質の生産方法は、更に、上記宿主内で融合蛋白質を合成した後、細胞を回収
して破砕し、上清から融合蛋白質を回収する工程を有することが好ましい。
上記融合蛋白質を回収する方法としては特に限定されないが、上記Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈ
ｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニン自体の分子量が約８４０ＫＤａの巨大蛋
白質であることから、４０％飽和程度の硫安塩析を行うことにより容易に上記融合蛋白質
を沈殿させることができる。

本発明の蛋白質の生産方法は、更に、得られた融合蛋白質を精製する工程を有してもよい
。上記精製の方法としては特に限定されないが、例えば、以下の方法が好適である。即ち
、まず、回収した融合蛋白質を適当な緩衝液に溶解し、疎水クロマトグラフィーやイオン
交換クロマトグラフィーによって融合蛋白質の存在する画分を回収する。回収した融合蛋
白質画分を限外ろ過によって濃縮した後、得られた濃縮液に対して、５〜５０ｍＭ程度の
塩化マグネシウム、及び、５０〜３００ｍＭ程度の塩化ナトリウム又は塩化カリウムを含
有する緩衝液を展開液としてゲルろ過を行い、排除限界直後のピークを回収することによ
って融合蛋白質を精製することができる。

また、予め上記融合蛋白質のＮ末端又はＣ末端に６〜１０個のヒスチジンが並んだタッグ
を連結させた場合には、ニッケル等の金属キレートカラムを用いて、簡便かつ効率的に融
合蛋白質の回収を行うことができる。更に、用いるＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニン又はシャペロニンサブユニットに対する抗体を用いて、
免疫沈降又はアフィニティクロマトグラフィーを行うことによっても迅速・簡便に精製す
ることが可能である。なお、リング構造を形成した融合蛋白質のみを回収するためには、
これらにイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過を組み合わせることが好ましい。

更に、上記Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニンは耐熱
性が高いことから、宿主細胞を破砕した上澄み液を６０〜８０℃で熱処理することによっ
て大部分の宿主由来の蛋白質を沈殿させることができ、融合蛋白質の精製をより簡略化さ
せることができる。この際、目的蛋白質自身は耐熱性のものでなくとも、Ｔｈｅｒｍｕｓ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニンのキャビティ内部に保持されてい
ることから、熱変性してしまうことがない。

上記Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニンでは、サブユ
ニット間の会合は、マグネシウムイオン及びＡＴＰによって安定化されている。従って、
融合蛋白質のリング構造が不安定な場合には、精製の過程でマグネシウム及びＡＴＰを存
在させておくことにより、リング構造を形成した融合蛋白質を効率的に回収することが可
能となる。

上述のいずれの方法で精製する場合であっても、融合蛋白質の形態を透過型電子顕微鏡に
よって観察することができ、目的蛋白質がＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
ＨＢ８由来シャペロニンのリングの内部に格納されている場合は、外径１４〜１６ｎｍ程
度のシャペロニン特有のリング構造を観察することができる。

本発明の蛋白質の製造方法は、更に、得られた融合蛋白質から目的蛋白質を単離する工程
を有していてもよい。
上述のように上記Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニン
では、サブユニット間の会合はマグネシウムイオン及びＡＴＰによって安定化されている
ことから、融合蛋白質を、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）処理した後、マグネシウ
ム及びＡＴＰが入っていない緩衝液に対して透析を行いマグネシウム及びＡＴＰを取り除
くことにより、サブユニット間の相互作用は解除されて立体構造が壊れ、目的蛋白質が露
出する。

上記融合蛋白質が、シャペロニンサブユニット間の連結部及び／又はシャペロニンサブユ
ニットと目的蛋白質との連結部に限定分解型プロテアーゼの切断配列を有する場合には、
上記限定分解型プロテアーゼを作用させることにより融合蛋白質から目的蛋白質を分離す
ることができる。この場合、回収した融合蛋白質の画分を透析する際に、透析内液にトロ
ンビン等の限定分解型プロテアーゼを作用させることにより、目的蛋白質とシャペロニン
サブユニットとを効率よく分離することができる。透析後、イオン交換クロマトグラフィ
ー、疎水クロマトグラフィー、又は、抗体を用いるアフィニィティクロマトグラフィーに
供すれば、容易に高純度の目的蛋白質を回収することができる。

上記融合蛋白質が、シャペロニンサブユニットと目的蛋白質との連結部にメチオニン残基
を有する場合には、ＣＮＢｒを作用させることにより融合蛋白質から目的蛋白質を分離す
ることができる。ただし、目的蛋白質がメチオニン残基を有する場合には、その部分で目
的蛋白質の切断が生じる可能性がある。

上記目的蛋白質が膜結合性蛋白質又は膜貫通性蛋白質である場合には、目的蛋白質とシャ
ペロニンサブユニットとを分離することによって目的蛋白質が不溶化することもあるが、
この場合には、不溶化物のみを遠心分離によって回収した後、疎水性アルキル鎖がオクチ
ル（炭素数８）からドデシル（炭素数１２）程度の長さである非イオン性界面活性剤等を
作用させることにより、ミセルの直径がほぼ生体膜の厚さに相応し、可溶化しやすくなる
。このような非イオン性界面活性剤としては特に限定されないが、例えば、β−オクチル
グルコシド、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、Ｔｗｅｅｎ２０等
が挙げられる。

なお、目的蛋白質の回収のみが目的である場合は、融合蛋白質は必ずしも均一に精製する
必要はなく、粗精製サンプルにＥＤＴＡ処理を施した後プロテアーゼを作用させる等、目
的蛋白質に応じた精製操作を施せばよい。

本発明の蛋白質の生産方法によれば、目的蛋白質をＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニンとの融合蛋白質として確実にＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニンリングのキャビティ内部に納めることにより
、目的蛋白質の宿主への毒性の発現、プロテアーゼによる分解、封入体の形成等の問題を
解決し、可溶性蛋白質として大量発現させることができる。また、効率的に精製を行うこ
とができる。

本発明によれば、目的蛋白質の宿主への毒性発現、宿主の分泌するプロテアーゼによる分
解、折り畳み不良、封入体形成等を抑制し、いかなる目的蛋白質であっても可溶性蛋白質
として万能的に大量発現させることができる新規な蛋白質の生産方法を提供することがで
きる。

以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定
されるものではない。

（実施例１）Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニンの発
現
配列１に示されたＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニン
Ｔｃｐｎ６０遺伝子を、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８株ゲノムを
鋳型とするＰＣＲ法によってクローニングした。得られたＴｃｐｎ６０遺伝子を用いて、
Ｔｃｐｎ６０遺伝子が一方向に１、２、３、４、５、６及び７回連結した遺伝子断片が挿
入されたｔｒｃプロモーターを有する発現ベクターｐＴｒ（Ｔｃｐｎ６０）_ｎ（ｎは１〜
７）を構築した。

得られた発現ベクターｐＴｒ（Ｔｃｐｎ６０）_ｎを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し
、カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含む２ＸＹ．Ｔ．培地（バクトトリプトン１６
ｇ、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ）で２５℃で２４時間培養し、Ｔｈｅｒｍｕｓ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニンサブユニット連結体を発現させた
。
培養終了後、細胞を回収し超音波で破砕した。遠心分離で上清を回収後、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅによって分析した結果、（Ｔｃｐｎ６０）_ｎ（ｎは１〜７）が可溶性画分に大量発現し
ていることが確認できた。

回収した大腸菌抽出液を７５℃、３０分間の熱処理した後、３００００ｇ、３０分間、４
℃の超遠心分離し、更にゲル濾過によって精製して組み換え（Ｔｃｐｎ６０）_７の精製標
本を得た。
得られた精製標品を透過型電子顕微鏡によって観察したところ、シャペロニン特有のリン
グ構造が観察された。このことから、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ
８由来シャペロニンは、全てのサブユニットを連結しても７回回転対称構造が維持される
ことがわかった。

（実施例２）Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニン７回
連結体とＨＢｓ抗原との融合蛋白質の合成
配列２に示されたＢ型肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）遺伝子の５’末端にＢｇｌＩ
Ｉサイトを、３’末端にＸｈｏＩサイトを導入した。得られた両末端に制限酵素切断部位
を有するＢ型肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）遺伝子を、ＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩ処
理が施されたｐＴｒ（Ｔｃｐｎ６０）_７に組み込み、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニン７回連結体とＨＢｓＡｇとの融合蛋白質を合成するた
めの発現ベクターｐＴｒ（Ｔｃｐｎ６０）_７・ＨＢｓＡｇを構築した。

得られた発現ベクターｐＴｒ（Ｔｃｐｎ６０）_７・ＨＢｓＡｇを用いて大腸菌ＢＬ２１（
ＤＥ３）株を形質転換した後、実施例１と同様の条件で融合蛋白質の合成を行った。この
とき、コントロールとしてｐＴｒ（Ｔｃｐｎ６０）_７を用いた発現、及び、Ｂ型肝炎ウィ
ルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）遺伝子を単独で組み込んだ発現ベクターを用いた場合につい
ても発現も行った。

各大腸菌抽出液の上清と沈澱画分とをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、ブロッティ
ングメンブランに転写し、抗ＨＢｓＡｇポリクローナル抗体を用いてウエスターンブロッ
ティングを行った。その結果、ｐＴｒ（Ｔｃｐｎ６０）_７・ＨＢｓＡｇ保持の大腸菌抽出
液サンプルのみにおいて、可溶性画分に融合蛋白質の分子量（４２０〜４５０ＫＤａ）に
相当する位置に強くバンドが検出された。一方、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ
）遺伝子を単独で組み込んだ発現ベクターを用いた場合には、宿主大腸菌の可溶性画分に
も不溶性画分にもＨＢｓＡｇは生産されなかった。以上のことから、ＨＢｓＡｇはＴｈｅ
ｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニンとの融合蛋白質として発
現させることで、可溶性蛋白質として発現することがわかった。

ｐＴｒ（Ｔｃｐｎ６０）_７・ＨＢｓＡｇで形質転換した大腸菌の抽出液を、７５℃、３０
分間の熱処理、３００００ｇ、３０分間、４℃の超遠心分離、及び、Ｇ４０００ＳＷ_ＸＬ
（東ソー社製）によるゲルろ過を施すことにより融合蛋白質を精製して精製標品を得た。
得られた精製標品を透過型電子顕微鏡によって観察したところ、シャペロニン特有のリン
グ構造が観察された。以上のことから、ＨＢｓＡｇはＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニンのキャビティ内部に１分子ごとに格納されることによ
って可溶性画分に発現したと考えられる。

本発明によれば、目的蛋白質の宿主への毒性発現、宿主の分泌するプロテアーゼによる分
解、折り畳み不良、封入体形成等を抑制し、いかなる目的蛋白質であっても可溶性蛋白質
として万能的に大量発現させることができる新規な蛋白質の生産方法を提供することがで
きる。

Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニンの立体構造の１種を模式的に示した図である。

Claims (15)

1. Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニンサブユニットをコ
   ードする遺伝子と目的蛋白質をコードする遺伝子とを含有する遺伝子を転写・翻訳して、
   前記目的蛋白質が前記Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロ
   ニンサブユニットとペプチド結合を介して連結した融合蛋白質を合成する工程を有するこ
   とを特徴とする蛋白質の生産方法。
2. 融合蛋白質は、互いに連結した１〜１０個のＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
   ＨＢ８由来シャペロニンサブユニットと目的蛋白質とからなり、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈ
   ｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニンサブユニットのＮ末端、互いに連結した
   Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニンサブユニットのＣ
   末端、又は、互いに連結したＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シ
   ャペロニンサブユニット同士の連結部に、目的蛋白質がペプチド結合を介して連結されて
   いることを特徴とする請求項１記載の蛋白質の生産方法。
3. 融合蛋白質は、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニンサ
   ブユニットにペプチド結合を介して連結した目的蛋白質が、互いに連結したＴｈｅｒｍｕ
   ｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニンサブユニットからなるリング構
   造体の内部に格納されていることを特徴とする請求項１又は２記載の蛋白質の生産方法。
4. 互いに連結したＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニンサ
   ブユニットからなるリング構造体は、他のリング構造体とリング面を介して非共有結合的
   に会合した２層構造を形成していることを特徴とする請求項３記載の蛋白質の生産方法。
5. 互いに連結したＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニンサ
   ブユニットからなるリング構造体は、他のリング構造体とリング面又はその側面を介して
   非共有結合的に会合した繊維状構造を形成していることを特徴とする請求項３記載の蛋白
   質の生産方法。
6. 融合蛋白質は、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニンサ
   ブユニットと目的蛋白質との連結部に限定分解型プロテアーゼの切断配列を有するもので
   あって、
   更に、前記限定分解型プロテアーゼを用いて、目的蛋白質を融合蛋白質から分離する工程
   を有する
   ことを特徴とする請求項１、２、３、４又は５記載の蛋白質の生産方法。
7. Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニンサブユニット同士
   の連結部に限定分解型プロテアーゼの切断配列を設け、前記目的蛋白質を前記限定分解型
   プロテアーゼにより融合蛋白質から切り出す工程を有することを特徴とする請求の範囲第
   １、２、３、４又は５項記載の蛋白質の生産方法。
8. 融合蛋白質は、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニンサ
   ブユニットと目的蛋白質との連結部にメチオニン残基を有するものであって、
   更に、ＣＮＢｒを用いて、目的蛋白質を融合蛋白質から分離する工程を有する
   ことを特徴とする請求項１、２、３、４又は５記載の蛋白質の生産方法。
9. 融合蛋白質を、バクテリア、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体、植物個体
   、又は、昆虫個体を宿主として合成させることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、
   ６、７又は８記載の蛋白質の生産方法。
10. 目的蛋白質をコードする遺伝子は、哺乳動物由来のｃＤＮＡ又は哺乳動物由来のｃＤＮＡ
    の６残基以上のアミノ酸配列をコードする部分遺伝子であることを特徴とする請求項１、
    ２、３、４、５、６、７、８又は９記載の蛋白質の生産方法。
11. 目的蛋白質は、哺乳動物由来抗体の重鎖、哺乳動物由来抗体の軽鎖、若しくは、哺乳動物
    由来抗体のＦｖ領域単鎖抗体の全長、又は、それらの６残基以上の部分蛋白質であること
    を特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０記載の蛋白質の生産方
    法。
12. 目的蛋白質は、ウィルス抗原、７回膜貫通型受容体蛋白質、又は、サイトカイン類である
    ことを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０記載の蛋白質の生
    産方法。
13. Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニンサブユニットと目
    的蛋白質とからなる融合蛋白質であって、前記Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
    ｓ ＨＢ８由来シャペロニンサブユニットにペプチド結合を介して連結した目的蛋白質が
    、互いに連結したＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニン
    サブユニットからなるリング構造体の内部に格納されている構造を有することを特徴とす
    る融合蛋白質。
14. 互いに連結したＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニンサ
    ブユニットからなるリング構造体は、他のリング構造体とリング面を介して非共有結合的
    に会合した２層構造を形成していることを特徴とする請求項１３記載の融合蛋白質。
15. 互いに連結したＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来シャペロニンサ
    ブユニットからなるリング構造体は、他のリング構造体とリング面又はその側面を介して
    非共有結合的に会合した繊維状構造を形成していることを特徴とする請求項１３記載の融
    合蛋白質。