JPS6251991A - 複合プラスミドベクタ− - Google Patents
複合プラスミドベクタ−Info
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- JPS6251991A JPS6251991A JP60191427A JP19142785A JPS6251991A JP S6251991 A JPS6251991 A JP S6251991A JP 60191427 A JP60191427 A JP 60191427A JP 19142785 A JP19142785 A JP 19142785A JP S6251991 A JPS6251991 A JP S6251991A
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- Japan
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- dna fragment
- fragment
- plasmid vector
- promoter
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、適宜の蛋白質の遺伝子を動物細胞中に導入し
動物細胞中にてその遺伝子を発現させて、相当する蛋白
質を生産せしめるのに有用な、動物ウィルスを利用した
複合プラスミドベクターに係るものである。
動物細胞中にてその遺伝子を発現させて、相当する蛋白
質を生産せしめるのに有用な、動物ウィルスを利用した
複合プラスミドベクターに係るものである。
一般に、遺伝子操作の技術を用いて、高等生物の適宜の
蛋白質を生産する場合には、高等生物の蛋白質は、実際
には、糖鎖の結合、ジスルフィド結合、Ｃ末端のアミド
化等、種々の修飾構造を有することが多いことから、遺
伝子を高等生物の細胞に導入して目的蛋白質を生産する
ことが、生理活性を有する蛋白質を生産する一ヒで、好
適な方法であると考えられる。
蛋白質を生産する場合には、高等生物の蛋白質は、実際
には、糖鎖の結合、ジスルフィド結合、Ｃ末端のアミド
化等、種々の修飾構造を有することが多いことから、遺
伝子を高等生物の細胞に導入して目的蛋白質を生産する
ことが、生理活性を有する蛋白質を生産する一ヒで、好
適な方法であると考えられる。
従来、適宜の外来遺伝子を動物細胞中にて発現させるた
めに、動物ウィルスをベクターとして利用することが、
一般的に行われている。すなわち、動物ウィルスのプロ
モーターに、外来遺伝子を連結し、これを動物細胞に導
入すると、ウィルスのプロモーターによるＲＮＡの転写
が行われ、さらに、蛋白質への翻訳が行われることが知
られている。
めに、動物ウィルスをベクターとして利用することが、
一般的に行われている。すなわち、動物ウィルスのプロ
モーターに、外来遺伝子を連結し、これを動物細胞に導
入すると、ウィルスのプロモーターによるＲＮＡの転写
が行われ、さらに、蛋白質への翻訳が行われることが知
られている。
この場合、一般に、ベクターとしてよく利用される動物
ウィルスとしては、パボバウイルス、パピローマウフイ
ルス、レトロウィルス等がある。これらのうち、パポバ
ウイルスの一種であるＳＶ４０や、 ＳＶ４０由来のｐ
ＳＶ２、パピローマウィルスの一種であるウシパピロー
マウィルス等は、よく研究されており、その使用例も多
い、他方、レトロウィルスは、他のウィルスと比較して
種々の利点、例えば、■宿主域が広いこと、■感染細胞
中にて染色体に組み込まれ、比較的安定に存在すること
、■感染細胞が死なないこと、■比較的大きな遺伝子を
挿入することができること、等の利点を有ししており、
ベクターとしての好適な条件を具備していることから、
その将来性が期待されている。
ウィルスとしては、パボバウイルス、パピローマウフイ
ルス、レトロウィルス等がある。これらのうち、パポバ
ウイルスの一種であるＳＶ４０や、 ＳＶ４０由来のｐ
ＳＶ２、パピローマウィルスの一種であるウシパピロー
マウィルス等は、よく研究されており、その使用例も多
い、他方、レトロウィルスは、他のウィルスと比較して
種々の利点、例えば、■宿主域が広いこと、■感染細胞
中にて染色体に組み込まれ、比較的安定に存在すること
、■感染細胞が死なないこと、■比較的大きな遺伝子を
挿入することができること、等の利点を有ししており、
ベクターとしての好適な条件を具備していることから、
その将来性が期待されている。
ところで、レトロウィルスの一種であるマウス乳癌ウィ
ルス（ＭＭＴＶ）は、その遺伝子の発現がホルモン調節
を受けること、すなわち、グルココルチコイドホルモン
の添加によって、その遺伝情報の発現が調節−されるこ
とは知られており、この点に着目して、このウィルスの
プロモーター領域及びホルモン調節を受ける領域を含む
部分、一般に、レトロウィルスのＬＴＲ（ｌｏｎｇ ｔ
ｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）と呼ばれる部分を用い
たベクターがいくつか作成されている。例えば、このＬ
ＴＲが外来のｒａｓ遺伝子を発現させてｐ２１を生産さ
せるのに有用であることが報告されており（Ｃｅｌｌ、
２７，２４５−２５５（１９８１））、また、このＬＴ
Ｒをウシパピローマウィルスにつないだベクターが報告
されている（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、。
ルス（ＭＭＴＶ）は、その遺伝子の発現がホルモン調節
を受けること、すなわち、グルココルチコイドホルモン
の添加によって、その遺伝情報の発現が調節−されるこ
とは知られており、この点に着目して、このウィルスの
プロモーター領域及びホルモン調節を受ける領域を含む
部分、一般に、レトロウィルスのＬＴＲ（ｌｏｎｇ ｔ
ｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）と呼ばれる部分を用い
たベクターがいくつか作成されている。例えば、このＬ
ＴＲが外来のｒａｓ遺伝子を発現させてｐ２１を生産さ
せるのに有用であることが報告されており（Ｃｅｌｌ、
２７，２４５−２５５（１９８１））、また、このＬＴ
Ｒをウシパピローマウィルスにつないだベクターが報告
されている（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、。
３．２０４５−２０５７（１９８３））、 ソの他、Ｓ
Ｖ４０由来ｃｙ）ｐｓＶ２ニＬＴＲをつないだベクター
が報告されている（Ｎａ ｔｕ ｒｅ、２９４，２２８
−２３２（１９８１））。
Ｖ４０由来ｃｙ）ｐｓＶ２ニＬＴＲをつないだベクター
が報告されている（Ｎａ ｔｕ ｒｅ、２９４，２２８
−２３２（１９８１））。
そこで、本発明者らは、前記した、レトロウィルスのベ
クターとしての石川性に着目し、ち該ウィルスを利用し
て、適宜の生理活性を有する蛋白質を動物細胞中にて生
産することができるベクターを開発すべく鋭意研究開発
を屯ねた結果、前記のマウス乳癌ウィルス（ＭＭＴＶ）
から、ホルモン調節を受けるプロモーターをもつＬＴＲ
及びウィルス粒子を生成するのに必要と考えられる部分
をとり出し、下記に述べるような構成で作成した複合プ
ラスミドベクターが、とりわけ有用であることを見い出
して、本発明を完成するに至った。
クターとしての石川性に着目し、ち該ウィルスを利用し
て、適宜の生理活性を有する蛋白質を動物細胞中にて生
産することができるベクターを開発すべく鋭意研究開発
を屯ねた結果、前記のマウス乳癌ウィルス（ＭＭＴＶ）
から、ホルモン調節を受けるプロモーターをもつＬＴＲ
及びウィルス粒子を生成するのに必要と考えられる部分
をとり出し、下記に述べるような構成で作成した複合プ
ラスミドベクターが、とりわけ有用であることを見い出
して、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、動物細胞中において、適宜の外来
遺伝子を安定に発現させて、生理活性のある目的蛋白質
を生産するのに有用な新規複合プラスミドベクターを供
給することを目的とするものである。
遺伝子を安定に発現させて、生理活性のある目的蛋白質
を生産するのに有用な新規複合プラスミドベクターを供
給することを目的とするものである。
そして、この目的を達成するための本発明の構成は、マ
ウス乳癌ウィルス（ＭＭＴＶ）由来のＬＴＲ領域を共に
含む第１のＤＮＡ断片及び第２のＤＮＡ断片を、大Ｉｔ
ｌ’ＪプラスミドｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性
領域及び複製開始領域を含むＤＮＡ断片と連結すると共
に、第１のＤＮＡ断片のＭＭ〒Ｖプロモーターの下流に
、πＡＮ７由来のポリリンカーを連結し、このポリリン
カーの直前に、プラスミドｐＣＶＳＶＥ由来の３゛−ス
プライシングサイトを有するＤＮＡ断片を連結し、更に
、選択マーカーとして、ＳＶ４０由来のｐＳＶ２ｇｐｔ
の ５Ｖ４０のプロモーター領域及びＥｃｏ−ｇｐｔ
遺伝子を含むＤＮＡ断片を、前記ｐＢＲ３２２由来のＤ
ＮＡ断片に挿入して成る複合プラスミドベクターそれ自
体である。
ウス乳癌ウィルス（ＭＭＴＶ）由来のＬＴＲ領域を共に
含む第１のＤＮＡ断片及び第２のＤＮＡ断片を、大Ｉｔ
ｌ’ＪプラスミドｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性
領域及び複製開始領域を含むＤＮＡ断片と連結すると共
に、第１のＤＮＡ断片のＭＭ〒Ｖプロモーターの下流に
、πＡＮ７由来のポリリンカーを連結し、このポリリン
カーの直前に、プラスミドｐＣＶＳＶＥ由来の３゛−ス
プライシングサイトを有するＤＮＡ断片を連結し、更に
、選択マーカーとして、ＳＶ４０由来のｐＳＶ２ｇｐｔ
の ５Ｖ４０のプロモーター領域及びＥｃｏ−ｇｐｔ
遺伝子を含むＤＮＡ断片を、前記ｐＢＲ３２２由来のＤ
ＮＡ断片に挿入して成る複合プラスミドベクターそれ自
体である。
さらに、本発明の複合プラスミドベクターについて、第
１図〜第５図に基づいてその合成過程を説明すれば、以
下のとおりである。
１図〜第５図に基づいてその合成過程を説明すれば、以
下のとおりである。
先ず、大腸菌由来のプラスミドｐＢＲ３２２のＢａ履Ｈ
Ｉ−３ａｌＩ部位の間に、マウス乳癌ウィルス（ＭＭＴ
Ｖ）をラムダファージベクター人ｇ ｔＷＥＳ・入Ｂの
ＥｃｏＲＩサイトにクローニングして作成したクローン
Ｈ（Ｃａｌｌ、２３，３３５−３４５（１９８１））の
ＢａｍＨＩ−Ｘｈｏｌ断片をクローニングしてｐ）ＩＭ
ｌ （中間体ｌ）を作成する。このｐＭＭ １を、Ｐｖ
ｕｌｒで切断して得た大きい方の断片をＴ４リガーゼに
より連結して９ＭＭ２ （中間体２）を作成する。
Ｉ−３ａｌＩ部位の間に、マウス乳癌ウィルス（ＭＭＴ
Ｖ）をラムダファージベクター人ｇ ｔＷＥＳ・入Ｂの
ＥｃｏＲＩサイトにクローニングして作成したクローン
Ｈ（Ｃａｌｌ、２３，３３５−３４５（１９８１））の
ＢａｍＨＩ−Ｘｈｏｌ断片をクローニングしてｐ）ＩＭ
ｌ （中間体ｌ）を作成する。このｐＭＭ １を、Ｐｖ
ｕｌｒで切断して得た大きい方の断片をＴ４リガーゼに
より連結して９ＭＭ２ （中間体２）を作成する。
次に、前記クローンＨのＬＴＲ領域を含むＢｇｉＩＩ断
片を９ＭＭ２のＢａ諺Ｈ１サイトに連結してｐＭｌｌＩ
３ （中間体３）を作成し、これをＥｃｏＲＩと旧ｎｄ
ｍで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素により切断点を埋めてモ
らにし、再び、連結して、ＥｃｏＲＩと旧ｎｄｍの両切
断点が消滅した９ＭＭ４ （中間体４）を作成する。
片を９ＭＭ２のＢａ諺Ｈ１サイトに連結してｐＭｌｌＩ
３ （中間体３）を作成し、これをＥｃｏＲＩと旧ｎｄ
ｍで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素により切断点を埋めてモ
らにし、再び、連結して、ＥｃｏＲＩと旧ｎｄｍの両切
断点が消滅した９ＭＭ４ （中間体４）を作成する。
９ＭＭ４をＸｂａｌテ切断し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素により
切断点を埋めて平らにし、その切断末端間に、 πＡ
Ｎ？（Ｇｅｎｅ、３０，２５７−２［１０（１９８４）
）の旧ｎｄｍ−ＥｃｏＲＩ断片をＫｌｅｎｏｗ酵素で処
理して得たポリリンカーを挿入してｐＭＭ５ （中間体
５）を作成する。このポリリンカーは、ｌｉｎｄｍ、Ｘ
ｂａｌ、 ＢｇｉＩＩ、Ｐｓｔｌ、 ５ａｌＩ、Ｂａ
ｍＨＩ、Ｓ■ａｌ、 ＥｃｏＲＩの各切断サイトをもつ
ＤＮＡ断片である（第４図）。
切断点を埋めて平らにし、その切断末端間に、 πＡ
Ｎ？（Ｇｅｎｅ、３０，２５７−２［１０（１９８４）
）の旧ｎｄｍ−ＥｃｏＲＩ断片をＫｌｅｎｏｗ酵素で処
理して得たポリリンカーを挿入してｐＭＭ５ （中間体
５）を作成する。このポリリンカーは、ｌｉｎｄｍ、Ｘ
ｂａｌ、 ＢｇｉＩＩ、Ｐｓｔｌ、 ５ａｌＩ、Ｂａ
ｍＨＩ、Ｓ■ａｌ、 ＥｃｏＲＩの各切断サイトをもつ
ＤＮＡ断片である（第４図）。
ｐＭＭ ５をＡｐａｌとＫｐｎｌで切断し、 Ｔ４ポリ
メラーゼで切断点をけずって平らにし、これを連結して
間をつめて２ＭＭ８（中間体６）を作成する。
メラーゼで切断点をけずって平らにし、これを連結して
間をつめて２ＭＭ８（中間体６）を作成する。
続いて、ｐＭＮ ＥｌをＮｄｅｌで短時間処理し、Ｎｄ
ｅ Ｉ切断点３箇所のうち部分分解により１箇所のみ切
れたＤＮＡ断片を７ガロースゲル泳動により、分離。
ｅ Ｉ切断点３箇所のうち部分分解により１箇所のみ切
れたＤＮＡ断片を７ガロースゲル泳動により、分離。
抽出し、さらに、 ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、Ｋｌｌ！
！１０１１酵素で処理して切断点を埋め、これを連結し
て間をつめて９ＭＭ７（中間体７）を作成する。
！１０１１酵素で処理して切断点を埋め、これを連結し
て間をつめて９ＭＭ７（中間体７）を作成する。
残り２箇所にあるＮｄｅＩの切断点をＮｄｅｌで部分分
解し、Ｋｌａｎｏｗ酵素で切断点を埋めて、その間にｘ
ｈＯ■リンカ−を連結する。この際、ｐＢＲ３２２由来
のＮｄｅｌ切断点にＸｈｏＩリンカ−の連結したものを
選択しテｐＭＭ？Ｘ１ （中間体８）を得る。
解し、Ｋｌａｎｏｗ酵素で切断点を埋めて、その間にｘ
ｈＯ■リンカ−を連結する。この際、ｐＢＲ３２２由来
のＮｄｅｌ切断点にＸｈｏＩリンカ−の連結したものを
選択しテｐＭＭ？Ｘ１ （中間体８）を得る。
次にＳＶ４０由来のｐＳＶ２ｇｐｔ （Ｓｃｉｅｎｃｅ
、２０９．１４２２−１４２７（１９８０）） ヨリ、
５Ｖ４０のプロモーター及びＥｃｏ−ｇｐｔ遺伝子（マ
イコフェノ−リック酸耐性） 、 ５Ｖ４Ｇスプライシ
ングサイトを含むＰｖｕＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を、 Ｋ
ｌｅｎｏｗ酵素で処理した後、これに、ＸｈｏＩリンカ
−を連結し、前記ｐＭＭ７Ｘ１のＸｈｏＩ切断点にクロ
ーニングして２ＭＭ８ （中間体９）を作成する。
、２０９．１４２２−１４２７（１９８０）） ヨリ、
５Ｖ４０のプロモーター及びＥｃｏ−ｇｐｔ遺伝子（マ
イコフェノ−リック酸耐性） 、 ５Ｖ４Ｇスプライシ
ングサイトを含むＰｖｕＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を、 Ｋ
ｌｅｎｏｗ酵素で処理した後、これに、ＸｈｏＩリンカ
−を連結し、前記ｐＭＭ７Ｘ１のＸｈｏＩ切断点にクロ
ーニングして２ＭＭ８ （中間体９）を作成する。
この２ＭＭ８のポリリンカ一部位の旧ｎｄＩｎ −Ｐｓ
ｔ Ｉ部位の間に、免疫グロブリンＶ領域由来の３°−
スプライシングサイトの塩基配列をもつプラスミドＰＣ
ＶＳＶＥ（Ｍａｌ、Ｃｅｌ １．Ｂｉｏｌ、 、２．１
３０４−１３１９（１９８２））より得た３−スプライ
シングサイトを含む旧ｎｄＩ［Ｉ−ＰｓｔＩ断片をクロ
ーニングして、本発明の複合プラスミドベクターｐＭＭ
１０２を作成する。
ｔ Ｉ部位の間に、免疫グロブリンＶ領域由来の３°−
スプライシングサイトの塩基配列をもつプラスミドＰＣ
ＶＳＶＥ（Ｍａｌ、Ｃｅｌ １．Ｂｉｏｌ、 、２．１
３０４−１３１９（１９８２））より得た３−スプライ
シングサイトを含む旧ｎｄＩ［Ｉ−ＰｓｔＩ断片をクロ
ーニングして、本発明の複合プラスミドベクターｐＭＭ
１０２を作成する。
そして、本発明の複合プラスミドベクターｐＭＭ１０２
は、前記したように、大腸菌においても複製可能であり
、これにより、大ｌｌ！菌χ１７７６を１合成？−とじ
て、既に寄託済みである。
は、前記したように、大腸菌においても複製可能であり
、これにより、大ｌｌ！菌χ１７７６を１合成？−とじ
て、既に寄託済みである。
本発明の複合プラスミドベクターは、マウス乳癌ウィル
ス（ＭＭＴＶ）のＬＴＲ領域のみではなく、ＭＭＴＶが
ウィルスとして複製するのに必要と考えられる領域をも
含めて、ｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ断片と連結したもの
である。 ＭＭＴＶの複製、粒子形成に必要な領域は正
確にはわかっていないが、他のレトロウィルスと比べて
Ｍに↑Ｖも同様であると思われる。従って、細胞へ導入
後、両ＬＴＨにはさまれた部分を再びウィルス粒子とし
て回収することができるものと期待される。
ス（ＭＭＴＶ）のＬＴＲ領域のみではなく、ＭＭＴＶが
ウィルスとして複製するのに必要と考えられる領域をも
含めて、ｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ断片と連結したもの
である。 ＭＭＴＶの複製、粒子形成に必要な領域は正
確にはわかっていないが、他のレトロウィルスと比べて
Ｍに↑Ｖも同様であると思われる。従って、細胞へ導入
後、両ＬＴＨにはさまれた部分を再びウィルス粒子とし
て回収することができるものと期待される。
また、ＭＭＴＶのプロモーターの下流に、ポリリンカー
サイトが位置し、さらに、ポリリンカーサイトの直前に
、３°−スプライシングサイトが位置しているので、外
来遺伝子のクローニングが容易であり、また、真核細胞
において転写された層ＲＮＡのうち、プロモーターの後
にある５゛−スプライシングサイトと、前記３°−スプ
ライシングサイトまでの間が、イントロンとして除去さ
れることから。
サイトが位置し、さらに、ポリリンカーサイトの直前に
、３°−スプライシングサイトが位置しているので、外
来遺伝子のクローニングが容易であり、また、真核細胞
において転写された層ＲＮＡのうち、プロモーターの後
にある５゛−スプライシングサイトと、前記３°−スプ
ライシングサイトまでの間が、イントロンとして除去さ
れることから。
ポリリンカーサイトに挿入した外来遺伝子が発現するの
に適切な部位に位置するようになっている、なお、 Ｒ
ＮＡの転写は、さらに下流に位置するもう一つのＬＴＲ
領域の中で終了する。
に適切な部位に位置するようになっている、なお、 Ｒ
ＮＡの転写は、さらに下流に位置するもう一つのＬＴＲ
領域の中で終了する。
一般に、ベクターを動物細胞に導入する際、ベクターが
取り込まれた細胞のみを選択する必要があるが、本発明
の複合プラスミドベクターでは、ＳＶ４０由来の ｐＳ
Ｖ２ｇｐｔ の ５Ｖ４０のプロモーター及びＥｃｏ−
ｇｐｔ遺伝子を含むＤＮＡ断片をｐＢＲ３２２由来のＤ
ＮＡ断片に挿入して、選択マーカーとしているので、 当該選択マーカーを、ＭＭＴＶのプロモーターと独立さ
せて利用することができる。
取り込まれた細胞のみを選択する必要があるが、本発明
の複合プラスミドベクターでは、ＳＶ４０由来の ｐＳ
Ｖ２ｇｐｔ の ５Ｖ４０のプロモーター及びＥｃｏ−
ｇｐｔ遺伝子を含むＤＮＡ断片をｐＢＲ３２２由来のＤ
ＮＡ断片に挿入して、選択マーカーとしているので、 当該選択マーカーを、ＭＭＴＶのプロモーターと独立さ
せて利用することができる。
レトロウィルス由来の本複合プラスミドベクターは、宿
主細胞の染色体に組み込まれて安定に存在すると共に、
ＬＴＲ領域にあるＭＭＴＶのプロモーターは強力であり
、大量の遺伝子産物を生産するのに好適である。■ＴＶ
のプロモーターは、グルココルチコイドホルモン感受性
であり、このホルモンの添加によりプロモーターの活性
が上昇することから、これにより外来遺伝子の形質発現
を１１節することができ、例えば、その遺伝子の細胞中
での機能を検証するために利用し得ると共に、外来遺伝
子が、宿主細胞にとって有害なものである場合に、その
遺伝子の発現を抑制させた状態で、これを細胞内に導入
することが可ス莞である。
主細胞の染色体に組み込まれて安定に存在すると共に、
ＬＴＲ領域にあるＭＭＴＶのプロモーターは強力であり
、大量の遺伝子産物を生産するのに好適である。■ＴＶ
のプロモーターは、グルココルチコイドホルモン感受性
であり、このホルモンの添加によりプロモーターの活性
が上昇することから、これにより外来遺伝子の形質発現
を１１節することができ、例えば、その遺伝子の細胞中
での機能を検証するために利用し得ると共に、外来遺伝
子が、宿主細胞にとって有害なものである場合に、その
遺伝子の発現を抑制させた状態で、これを細胞内に導入
することが可ス莞である。
本発明の複合プラスミドは、５ａ１１．５ｎａ１． Ｅ
ｃｏＲＩ、Ｘｂａ Ｉの切断サイトが各１ケ所ポリリン
カーサイトに存在し、また、ＢａｍＨＩ 、ＡｃｃＩの
切断サイトが各２ケ所存在する（そのうち各１ケ所はポ
リリンカーサイトに存在する）ので、５ａｌＴ、Ｂａｇ
）ＩＩ、ＢｇｉＩＩ 、 Ｂｃｌｌ、 Ｓｍａｌ
、 ＥｃｏＲＩ 、 Ｘｂａｌ、 Ｘｈｏｌ、
ＡｃｃＩ、Ｔａｑｌ、５ａｕ３Ａ断片等を容易にクロ
ーニングすることができる。
ｃｏＲＩ、Ｘｂａ Ｉの切断サイトが各１ケ所ポリリン
カーサイトに存在し、また、ＢａｍＨＩ 、ＡｃｃＩの
切断サイトが各２ケ所存在する（そのうち各１ケ所はポ
リリンカーサイトに存在する）ので、５ａｌＴ、Ｂａｇ
）ＩＩ、ＢｇｉＩＩ 、 Ｂｃｌｌ、 Ｓｍａｌ
、 ＥｃｏＲＩ 、 Ｘｂａｌ、 Ｘｈｏｌ、
ＡｃｃＩ、Ｔａｑｌ、５ａｕ３Ａ断片等を容易にクロ
ーニングすることができる。
本複合プラスミドベクターは、大１ｍ菌中にて複製可能
であり、ｐＭＭ１０２を保有する大腸菌は、アンピシリ
ンによって選択できる。
であり、ｐＭＭ１０２を保有する大腸菌は、アンピシリ
ンによって選択できる。
本複合プラスミドベクターの合成過程を第１図〜第２図
に、また、その制限酵素切断地図を第３に示す。
に、また、その制限酵素切断地図を第３に示す。
以下に１本発明の複合プラスミドベクターの実施例を示
して、本発明の詳細な説明する。
して、本発明の詳細な説明する。
く複合プラスミドベクターｐＮＭ１０２の合成〉（１）
ｐＭＭｌの合成 ２ルｌのｐＢＲ３２２０ＮＡＣ０，５℃ｇ／ルｌ）に、
２終ｌの１００倍量緩衝液（１００＋ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ（ｐＨ７，８）、７０ｍＭ−ＭｇＣＩ２．７０
ｍトβトメ−カプトエタノール、５００厘Ｍ−ＮａＣｌ
）を加えた後、水を加えて全量を １８延１にし、こ
れに ＩＪＬＩ のＢａｍＨ（１０ｕｎｉｔ／ ＪＬｌ
）、 １用Ｉ ノＳａｌ Ｉ（８ｕｎｉｔ／ｇ ｌ）を
加え、３７℃にて１時間反応させた。６５℃にて５分間
加熱して反応を止めた後、 １％アガロースゲルにて電
気泳動を行ない、４、Ｉ Ｋｂｐの長さのバンドを切り
出した０次いで、このゲルを透析チューブに入れ、電気
泳動を行なって、ＤＮＡを透析チューブ中のＴｒｉｓ−
酢酸緩衝液（０，０４Ｍ−Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７，５
） 、 Ｏ，ＱＯＩＭ−Ｅ［１ＴＡ）に流し出した。こ
の液を取り出し、等積のフェノールを加えて振とうした
後、１５．００Ｏｒｐｍ、５分間遠心処理してＤＮＡを
含む水層を採取し、再び、等量のフェノールを加え、前
記操作を繰返して、ＤＮＡを含む水層を採取した０次に
１等量のクロロホルムを加えて、同じ操作を繰返して得
たＤＮＡを含む水層に、これの１０分の１量の３ト酢酸
ナトリウム液（ｐＨ７，０）を加え、３倍量のエタノー
ルを加え、−７０℃にて１０分間冷却した。０℃にて、
１５．ＯＯＯｒｐｍ、１０分間遠心して沈澱させ、エタ
ノールを蒸発させた後、１０＃Ｌｌの水に溶解した。
ｐＭＭｌの合成 ２ルｌのｐＢＲ３２２０ＮＡＣ０，５℃ｇ／ルｌ）に、
２終ｌの１００倍量緩衝液（１００＋ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ（ｐＨ７，８）、７０ｍＭ−ＭｇＣＩ２．７０
ｍトβトメ−カプトエタノール、５００厘Ｍ−ＮａＣｌ
）を加えた後、水を加えて全量を １８延１にし、こ
れに ＩＪＬＩ のＢａｍＨ（１０ｕｎｉｔ／ ＪＬｌ
）、 １用Ｉ ノＳａｌ Ｉ（８ｕｎｉｔ／ｇ ｌ）を
加え、３７℃にて１時間反応させた。６５℃にて５分間
加熱して反応を止めた後、 １％アガロースゲルにて電
気泳動を行ない、４、Ｉ Ｋｂｐの長さのバンドを切り
出した０次いで、このゲルを透析チューブに入れ、電気
泳動を行なって、ＤＮＡを透析チューブ中のＴｒｉｓ−
酢酸緩衝液（０，０４Ｍ−Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７，５
） 、 Ｏ，ＱＯＩＭ−Ｅ［１ＴＡ）に流し出した。こ
の液を取り出し、等積のフェノールを加えて振とうした
後、１５．００Ｏｒｐｍ、５分間遠心処理してＤＮＡを
含む水層を採取し、再び、等量のフェノールを加え、前
記操作を繰返して、ＤＮＡを含む水層を採取した０次に
１等量のクロロホルムを加えて、同じ操作を繰返して得
たＤＮＡを含む水層に、これの１０分の１量の３ト酢酸
ナトリウム液（ｐＨ７，０）を加え、３倍量のエタノー
ルを加え、−７０℃にて１０分間冷却した。０℃にて、
１５．ＯＯＯｒｐｍ、１０分間遠心して沈澱させ、エタ
ノールを蒸発させた後、１０＃Ｌｌの水に溶解した。
２０ｐ＋ のクローンＨ（Ｃｅ１ｉ、２３，３３５−３
４５（１９８１））（Ｉ ＪＡｇ／ｐｌ）を前記と同様
にして、ＢａｍＨＩ とＸｈｏｌ（８ｕｎｉｔ／μｌ）
’ｔ’切［ｒＬ、 １％アガロースゲルにて電気泳動し
、３．８Ｋｂｐのバンドを切り出し、前記方法にてＤＮ
Ａを抽出した。これを１０＃Ｌ＋の水に溶解し、前記の
ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ 、 ５ａｌｌ切断０．１．
ｌ、 ２．１の１０倍緩衝液（８８０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、８８ｍＭ−ＭｇＣ１１０（ｌｓ
Ｍ−ＤＴ７．１ｍＭ−ＡＴＰ）を加え、水で全量２゛ を１８ｐｌにした。２ＪＬｌのＴ４リガーゼ（１，４ｕ
ｎｉｔ／ＪＬｌ）を加え、４℃にて１晩反応させた。こ
れを、５倍に希釈し、その ｌｐ＋を２０μｌのコンピ
テント状態の大腸菌ＨＢＩＯＩに加え、０℃にて３０分
間放置した。４２℃にて２分間加温した後、８０．１の
し−ブロスを加え、３７℃にて３０分間培養し、これを
４０ｇｇ／１ｌｌｌのアンピシリンを含む寒天培地のプ
レート−Ｌで、３７°Ｃにて一晩培養した。得られたコ
ロニーを解析し、ｐＢＲ３２２のＢａｍＨ−３ａｌＩ断
片に、クローンＨのＢａ＋ａＨＩ −ＸｈｏＩ断片が連
結したものを選択して、 ＰＭ旧を得た。
４５（１９８１））（Ｉ ＪＡｇ／ｐｌ）を前記と同様
にして、ＢａｍＨＩ とＸｈｏｌ（８ｕｎｉｔ／μｌ）
’ｔ’切［ｒＬ、 １％アガロースゲルにて電気泳動し
、３．８Ｋｂｐのバンドを切り出し、前記方法にてＤＮ
Ａを抽出した。これを１０＃Ｌ＋の水に溶解し、前記の
ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ 、 ５ａｌｌ切断０．１．
ｌ、 ２．１の１０倍緩衝液（８８０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、８８ｍＭ−ＭｇＣ１１０（ｌｓ
Ｍ−ＤＴ７．１ｍＭ−ＡＴＰ）を加え、水で全量２゛ を１８ｐｌにした。２ＪＬｌのＴ４リガーゼ（１，４ｕ
ｎｉｔ／ＪＬｌ）を加え、４℃にて１晩反応させた。こ
れを、５倍に希釈し、その ｌｐ＋を２０μｌのコンピ
テント状態の大腸菌ＨＢＩＯＩに加え、０℃にて３０分
間放置した。４２℃にて２分間加温した後、８０．１の
し−ブロスを加え、３７℃にて３０分間培養し、これを
４０ｇｇ／１ｌｌｌのアンピシリンを含む寒天培地のプ
レート−Ｌで、３７°Ｃにて一晩培養した。得られたコ
ロニーを解析し、ｐＢＲ３２２のＢａｍＨ−３ａｌＩ断
片に、クローンＨのＢａ＋ａＨＩ −ＸｈｏＩ断片が連
結したものを選択して、 ＰＭ旧を得た。
（２）ｐＭＭ２の合成
ｐＭＭＩ ＤＮＡを、前記と同様の方法にて、 Ｐｖｕ
ｌＩにより切断した。 ４．５Ｋｂｐのバンドをアガロ
ースゲルより切り出し、ＤＮＡを抽出した０次いで、前
記（１）と同様に、Ｔ４リガーゼにより連結し、さらに
、大腸菌ＨＢＩＯＩを形質転換させて、ＰＭＭ２を得た
。
ｌＩにより切断した。 ４．５Ｋｂｐのバンドをアガロ
ースゲルより切り出し、ＤＮＡを抽出した０次いで、前
記（１）と同様に、Ｔ４リガーゼにより連結し、さらに
、大腸菌ＨＢＩＯＩを形質転換させて、ＰＭＭ２を得た
。
（３）２ＭＭ３の合成
前記クローンＨを、 ＢｇｉＩＩで切断し、アガロース
ゲルから４．５ｋｂｐの断片を抽出した。これを、ｐＨ
Ｍ２のＢａｍＨＩ切断片と、前記（１）と同様に処理し
−（、ｐＭＭ３を得た。
ゲルから４．５ｋｂｐの断片を抽出した。これを、ｐＨ
Ｍ２のＢａｍＨＩ切断片と、前記（１）と同様に処理し
−（、ｐＭＭ３を得た。
（４）９ＭＭ４の合成
前記ｐＭＭ３を旧ｎｄｍとＥｃｏＲＩテ切断し、エタノ
ールにて沈ｔさせた後、２１ｇ１の水に溶解させた。
ールにて沈ｔさせた後、２１ｇ１の水に溶解させた。
２．５ｇ１ｃ７）緩衝液（０，５Ｍ−Ｔｒｉｓ−ＨＧＩ
（ｐＨ７，２） 、０．ｌＮ−ＭｇＣｌ２、 ｌ鳳Ｍ
ＤＴＴ 、 ５００ ルｇ／ｌｌ ＢＳＡ）
と 、 ｌ終 １のデオキシヌクレオチド混合液
（ｄＡＴＰ 、 ｄＧＴＰ、 ｄｃＴＰ、 ｄＴＴＰ各
２ｍＭ）を加え、 ０．５μｍのＫｌｅｎｏｗ酵素（２
，８ｕｎｉｔ／ ＪＬ １）を加えて、室温にて、３０
分間放置した。６５℃にて、 ５分間加温した後、 ２
ＪＬ１のＴ４リガーゼを加え、連結して、ＨｉｎｄＩＩ
ＩとＥＣＯＲＩの切断点の無くなった９ＭＭ４を得た。
（ｐＨ７，２） 、０．ｌＮ−ＭｇＣｌ２、 ｌ鳳Ｍ
ＤＴＴ 、 ５００ ルｇ／ｌｌ ＢＳＡ）
と 、 ｌ終 １のデオキシヌクレオチド混合液
（ｄＡＴＰ 、 ｄＧＴＰ、 ｄｃＴＰ、 ｄＴＴＰ各
２ｍＭ）を加え、 ０．５μｍのＫｌｅｎｏｗ酵素（２
，８ｕｎｉｔ／ ＪＬ １）を加えて、室温にて、３０
分間放置した。６５℃にて、 ５分間加温した後、 ２
ＪＬ１のＴ４リガーゼを加え、連結して、ＨｉｎｄＩＩ
ＩとＥＣＯＲＩの切断点の無くなった９ＭＭ４を得た。
（５）９ＭＭ５の合成
前記ｐＭＭ４をｘｂａ■テ切断し、Ｋｌｅｎｏｖ酵素で
処理した断片を、πＡＮ７由来の旧ｎｄｍ−ＥｃｏＲＩ
断片をＫｌｅｎｏｗ酵素で処理したポリリンカーサイト
（多重制限酵素切断部位）に連結し、前記（１）と同様
に処理して、Ｐ）１Ｍ５を得た。
処理した断片を、πＡＮ７由来の旧ｎｄｍ−ＥｃｏＲＩ
断片をＫｌｅｎｏｗ酵素で処理したポリリンカーサイト
（多重制限酵素切断部位）に連結し、前記（１）と同様
に処理して、Ｐ）１Ｍ５を得た。
（６）９ＭＭ８の合成
前記ｐＭ）１５をＡｐａ ＩとＫｐ！ＩＩテ切断し、Ｄ
ＮＡ断片を、エタノール沈澱で回収して、１６ｕＬｌの
水に溶解した、２．１の緩衝液（０，３３Ｍ−Ｔｒｉｓ
−酢酸（ｐＨ７，ｉ３）、０゜８８１酢酸ナトリウム、
Ｑ、 ＩＯＭ−酢酸マグネシウム、５、ＯｒｒｒＭ−Ｄ
ＤＴ、 １ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）、１μｍのデオキシヌ
クレオチド混合液（各２ｍＭ）、 １終１の７４ ＤＮ
Ａポリメラーゼを加え、３７℃にて、５分間保温した。
ＮＡ断片を、エタノール沈澱で回収して、１６ｕＬｌの
水に溶解した、２．１の緩衝液（０，３３Ｍ−Ｔｒｉｓ
−酢酸（ｐＨ７，ｉ３）、０゜８８１酢酸ナトリウム、
Ｑ、 ＩＯＭ−酢酸マグネシウム、５、ＯｒｒｒＭ−Ｄ
ＤＴ、 １ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）、１μｍのデオキシヌ
クレオチド混合液（各２ｍＭ）、 １終１の７４ ＤＮ
Ａポリメラーゼを加え、３７℃にて、５分間保温した。
Ｉｇｌの０．５８−ＥＤＴＡを加えて反応を止め、
フェノール抽出した後、エタノール沈澱により、 ＤＮ
Ａを回収した。これを前記（１）と同様に処理して、９
ＭＭ６を得た。
フェノール抽出した後、エタノール沈澱により、 ＤＮ
Ａを回収した。これを前記（１）と同様に処理して、９
ＭＭ６を得た。
の９ＭＭ７の合成
前記ｐＭＭ６をＮｄｅｌで切断し、フェノール抽出した
後、アガロースゲルにて電気泳動し、？、５Ｋｂｐのバ
ンドを切出し、フェノール抽出、エタノール沈澱により
、ＤＮＡを回収した。これを旧ｎｄｍで切断し。
後、アガロースゲルにて電気泳動し、？、５Ｋｂｐのバ
ンドを切出し、フェノール抽出、エタノール沈澱により
、ＤＮＡを回収した。これを旧ｎｄｍで切断し。
Ｋｌｅｎｏｗ酵素で処理し、さらに前記（１）と同様に
処理して、ｐＭＭ？を得た。
処理して、ｐＭＭ？を得た。
（８） ｐＭＮ？Ｘ１の合成
前記ｐＭＭ７を、ＮｄｅＩテ切断し、？、５ＫｂｐのＤ
ＮＡを得た。これに、 １鉢！のＸｈｏＩリンカ−（０
，０２００ｕｎｉｔ／ｇｌ、宝酒造■製）を加えて、全
量２０ル１の反応液中にて連結させ、前記（１）と同様
に処理して、ポリリンカーから離れた方のＮｄｅｌサイ
トにＸｈｏｌリンカ−が連結したｐＭＭ７Ｘ１を得た。
ＮＡを得た。これに、 １鉢！のＸｈｏＩリンカ−（０
，０２００ｕｎｉｔ／ｇｌ、宝酒造■製）を加えて、全
量２０ル１の反応液中にて連結させ、前記（１）と同様
に処理して、ポリリンカーから離れた方のＮｄｅｌサイ
トにＸｈｏｌリンカ−が連結したｐＭＭ７Ｘ１を得た。
（９）９ＭＭ８の合成
１０トｇのｐｓＶ２ｇｐｔ （Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０９
．１４２２−１４２７（１９８０））をＰｖｕ■とＢａ
ｍＨＩで切断し、２．２Ｋｂｐの断片とアガロースゲル
にて抽出した。Ｋｌｅｎｏｖ酵素で処理し、ＸｈｏＩリ
ンカ−と連結させた後、Ｘｈｏｌで切断した、アガロー
スゲルにて、２．２Ｋｂｐの断片を抽出し。
．１４２２−１４２７（１９８０））をＰｖｕ■とＢａ
ｍＨＩで切断し、２．２Ｋｂｐの断片とアガロースゲル
にて抽出した。Ｋｌｅｎｏｖ酵素で処理し、ＸｈｏＩリ
ンカ−と連結させた後、Ｘｈｏｌで切断した、アガロー
スゲルにて、２．２Ｋｂｐの断片を抽出し。
これを前記ｐＭ）１７Ｘ１のＸｈｏｌ切断片と連結して
、９ＭＭ８を得た。
、９ＭＭ８を得た。
（１０） ９ＭＭ１０２の合成
１０ｐｇのｐＣＶＳＶＥ （Ｍｏ１．Ｇｅ１１．Ｂｉｏ
ｌ、、２．１３０４−１３１９（１９８２））をＰｓｔ
Ｉと旧ｎｄＩｎにより切断し、アクリルアミドゲルによ
り、約９０ｂｐの断片を抽出した。前記ｐＭ）！８をＰ
ｓｔｌで切断し、アガロースゲルにより８゜７Ｋｂｐの
断片を抽出した。さらに、 Ｉ（ｉｎｄｍで切断し、前
記の９０ｂｐの断片と連結してｐＭ＞１１０２を得た。
ｌ、、２．１３０４−１３１９（１９８２））をＰｓｔ
Ｉと旧ｎｄＩｎにより切断し、アクリルアミドゲルによ
り、約９０ｂｐの断片を抽出した。前記ｐＭ）！８をＰ
ｓｔｌで切断し、アガロースゲルにより８゜７Ｋｂｐの
断片を抽出した。さらに、 Ｉ（ｉｎｄｍで切断し、前
記の９０ｂｐの断片と連結してｐＭ＞１１０２を得た。
〈実施例１〉
この実施例は、９ＭＭ１０２の、動物細胞への導入とそ
こでの発現に関するものである。
こでの発現に関するものである。
１００終ｇのｐＨ）１１０２を滅菌蒸留水に溶解し、２
．５Ｍ−Ｃａ Ｃｌ ２を０．５ｍ ｌ加えた。 ＨＮ
Ｐ溶液（５０ｓＭ−ＨＥＰＥＳ 、 ２８０ｍＭ−Ｎａ
Ｃ１，１，５ｖＭ−Ｈａ２ＨＰＯ４，ｐＨ７，１）をチ
ューブに２．５■ｌとり、空気を送り込んで泡だだせな
がら、上記Ｄ Ｎ Ａ −Ｃａ Ｃｌ ２溶液を一滴ず
つ加え、室温にて３０分間放置して沈澱させた。
．５Ｍ−Ｃａ Ｃｌ ２を０．５ｍ ｌ加えた。 ＨＮ
Ｐ溶液（５０ｓＭ−ＨＥＰＥＳ 、 ２８０ｍＭ−Ｎａ
Ｃ１，１，５ｖＭ−Ｈａ２ＨＰＯ４，ｐＨ７，１）をチ
ューブに２．５■ｌとり、空気を送り込んで泡だだせな
がら、上記Ｄ Ｎ Ａ −Ｃａ Ｃｌ ２溶液を一滴ず
つ加え、室温にて３０分間放置して沈澱させた。
一方、 ６’ｃｍ直径のシャーレ出り ３×ｌＯ５個（
１０’ ／ ｃｒｎ’）となるように、ダルベツコ変法
イーグル培地（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ、９ ４８８−４８９
（１９７４））に１０２牛脂児血清を添加した培地にて
、ミンク肺細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ８４）を培養し、これ
に、前記沈澱を各シャーレにつき０．５１滴下し、１６
時間培養した。０゜６履ｌのＤＭＳＯを最終濃度が１０
％になるように加え、３０分間放置後、新培地と交換し
て培養を続けた。
１０’ ／ ｃｒｎ’）となるように、ダルベツコ変法
イーグル培地（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ、９ ４８８−４８９
（１９７４））に１０２牛脂児血清を添加した培地にて
、ミンク肺細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ８４）を培養し、これ
に、前記沈澱を各シャーレにつき０．５１滴下し、１６
時間培養した。０゜６履ｌのＤＭＳＯを最終濃度が１０
％になるように加え、３０分間放置後、新培地と交換し
て培養を続けた。
得られた細胞を選択培地（前記培地に１５ＪＬｇ／ｍｌ
ヒボキサンチン、１０ｇｇ／■ｌチミジン、 ５ｇｇ／
ａｔグリシン、 ２ｇｇ／ｍｌアミノプテリン、２５
ｇ ｇ／ｍｌマイコフェノ−リック酸、 ２５０ Ｊ
Ｌ ｇ／腸ｌキサンチンを加えたもの）にて約２週間培
養して、マイコフェノ−リック酸耐性のコロニーを得た
。これは、ｐＭＭ １０２が細胞に取り込まれ、Ｅｃｏ
−ｇｐｔ遺伝子が発現している結果であることを示す。
ヒボキサンチン、１０ｇｇ／■ｌチミジン、 ５ｇｇ／
ａｔグリシン、 ２ｇｇ／ｍｌアミノプテリン、２５
ｇ ｇ／ｍｌマイコフェノ−リック酸、 ２５０ Ｊ
Ｌ ｇ／腸ｌキサンチンを加えたもの）にて約２週間培
養して、マイコフェノ−リック酸耐性のコロニーを得た
。これは、ｐＭＭ １０２が細胞に取り込まれ、Ｅｃｏ
−ｇｐｔ遺伝子が発現している結果であることを示す。
〈実施例２〉
この実施例はＭＭＴＶのプロモータ作用の、グルココル
チコイドホルモンへの依存性に関するものである。
チコイドホルモンへの依存性に関するものである。
実施例１で得たマイコフェノ−リック酸耐性株１５株を
それぞれ個別に培養し、各々の株を２つの群に分け、一
方に１０−６Ｍのデキサメタシンを加えた。２０時間後
に、細胞からグアニジウム−〇ｓＣ１によって全ＲＮＡ
を抽出した。 ｐＭ旧０２をＢｇｌ■で切断して得たＭ
ＭＴＶプロモーターの下流のＤＭＡ断片を３２Ｐアイソ
トープでラベルし、これを用いてハイブリダイゼーショ
ン法により、前記ＢｇｉＩＩ断片と相補性をもつＲＮＡ
量を分析したところ、デキサメタシン添加によって、Ｒ
ＮＡ量の転写量が、約１０倍以上増加した株が２株得ら
れた。これは、ＭＭＴＶのプロモーターによるＲＮＡの
転写が、前記ホルモン依存性であることを示す。
それぞれ個別に培養し、各々の株を２つの群に分け、一
方に１０−６Ｍのデキサメタシンを加えた。２０時間後
に、細胞からグアニジウム−〇ｓＣ１によって全ＲＮＡ
を抽出した。 ｐＭ旧０２をＢｇｌ■で切断して得たＭ
ＭＴＶプロモーターの下流のＤＭＡ断片を３２Ｐアイソ
トープでラベルし、これを用いてハイブリダイゼーショ
ン法により、前記ＢｇｉＩＩ断片と相補性をもつＲＮＡ
量を分析したところ、デキサメタシン添加によって、Ｒ
ＮＡ量の転写量が、約１０倍以上増加した株が２株得ら
れた。これは、ＭＭＴＶのプロモーターによるＲＮＡの
転写が、前記ホルモン依存性であることを示す。
、〈実施例３〉
この実施例は、ＣＡＴ遺伝子の動物細胞中での発現に関
するものである。
するものである。
プラスミドｐＢＲ３２５（Ｇｅｎｅ 、 １４．２８９
（１９８１））をＴａｑ Ｉ テ切断してクロラムフェ
ニコール耐性遺伝子（ＣＡＴ遺伝子）を含む断片を得た
。これをＫｌｅｎｏｗ酵素で処理した後、 ５ａｌｌリ
ンカ−を連結し、９ＭＭ１０２のポリリンカーの５ａｌ
Ｉサイトにクローニングした。 ＣＡＴ遺伝子がプロモ
ーターに対し正方向に挿入したものを選択し、これを実
施例１と同様の方法にて。
（１９８１））をＴａｑ Ｉ テ切断してクロラムフェ
ニコール耐性遺伝子（ＣＡＴ遺伝子）を含む断片を得た
。これをＫｌｅｎｏｗ酵素で処理した後、 ５ａｌｌリ
ンカ−を連結し、９ＭＭ１０２のポリリンカーの５ａｌ
Ｉサイトにクローニングした。 ＣＡＴ遺伝子がプロモ
ーターに対し正方向に挿入したものを選択し、これを実
施例１と同様の方法にて。
ミンク肺細胞へ導入した。４８時間後に細胞を集め、
０．２５Ｍ 〒ｒｉｇ緩衝液に溶解後、 １分間超音
波処理して細胞を破壊し、１５．ＯＯＯｒｐｍ、５分間
遠心し、上清を集めた。これに１４０でラベルしたクロ
ラムフェニコール、アセチルＣｏＡを加え３７℃にて８
０分間保温した後、酢酸エチルにより抽出し、有機層を
乾燥させ、これを１０ｐｌの酢酸エチルに溶かし、シリ
カゲルの薄層クロマトにスポットし、９５：５（Ｖ／Ｖ
）の゛クロロフォルムーメタノールにより展開した。展
開終了後、乾燥させて、Ｘ線フィルムを密着させてオー
トラジオグラフィー法にて解析した結果、ＣＡＴ遺伝子
を導入した細胞の抽出液において、クロラムフェニコー
ルがアセチル化されていた。これは、前記細胞中にてＣ
ＡＴ遺伝子が発現されていることを示す。
０．２５Ｍ 〒ｒｉｇ緩衝液に溶解後、 １分間超音
波処理して細胞を破壊し、１５．ＯＯＯｒｐｍ、５分間
遠心し、上清を集めた。これに１４０でラベルしたクロ
ラムフェニコール、アセチルＣｏＡを加え３７℃にて８
０分間保温した後、酢酸エチルにより抽出し、有機層を
乾燥させ、これを１０ｐｌの酢酸エチルに溶かし、シリ
カゲルの薄層クロマトにスポットし、９５：５（Ｖ／Ｖ
）の゛クロロフォルムーメタノールにより展開した。展
開終了後、乾燥させて、Ｘ線フィルムを密着させてオー
トラジオグラフィー法にて解析した結果、ＣＡＴ遺伝子
を導入した細胞の抽出液において、クロラムフェニコー
ルがアセチル化されていた。これは、前記細胞中にてＣ
ＡＴ遺伝子が発現されていることを示す。
第１図は、本発明の複合プラスミドベクターｐＭＭ１０
２の中間体ｐＭＭ１〜ｐＭＭ５の合成過程を示す。 第２図は、同中間体ｐにＭ６〜ｐＭＭ８及び本発明の複
合プラスミドベクターｐＭＭ１０２の合成過程を示す。 第３図は、ｐＭＭ１０２の制限酵素切断地図を示す。 第４図は、πＡＮ７由来のポリリンカーの塩基配列を示
す。 第５図は、Ｘｈａｌリンカ−の塩基配列を示す。 なお、第１図中、クローンＨの記号は、以下の制限酵素
の略号を示す、また、（）は、消滅した制限酵素サイト
を示す。 Ｂａ ： Ｂａ＋ｓＨＩ Ｐ ： ＰｓｔＩ
８ｇ ： ＢｇｉＩＩ Ｓ ： ５ｓｔＩＥ
： ＥｃｏＲＩ Ｘｈ ： ＸｈｏｌＨ：
ＨｉｎｄＩＩＩ Ｘｂ ： ＸｂａｌＫ：Ｋｐ
ｎＩ 特許出願人 株式会社ヤクルト本社 第４０ ＡＡＧＣ丁ＴＣＴＡＧＡＧＡＴＧＴＧＣＡＧＧＴＣＧノ
ＴＴＣＧＡＡＧＡＴＣＴＣＴＡＧＡＣＧＴＣＣＡＧＣＩ
第５［ ＣＴＣＧ ＧＡＧＣ 、ＣＧＯＡＴＣＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣ’ＧＣＣＴＡＧ
ＧＧＧＣＣＣＴＴＡＡＧ口 ＧＧ ＣＣ
２の中間体ｐＭＭ１〜ｐＭＭ５の合成過程を示す。 第２図は、同中間体ｐにＭ６〜ｐＭＭ８及び本発明の複
合プラスミドベクターｐＭＭ１０２の合成過程を示す。 第３図は、ｐＭＭ１０２の制限酵素切断地図を示す。 第４図は、πＡＮ７由来のポリリンカーの塩基配列を示
す。 第５図は、Ｘｈａｌリンカ−の塩基配列を示す。 なお、第１図中、クローンＨの記号は、以下の制限酵素
の略号を示す、また、（）は、消滅した制限酵素サイト
を示す。 Ｂａ ： Ｂａ＋ｓＨＩ Ｐ ： ＰｓｔＩ
８ｇ ： ＢｇｉＩＩ Ｓ ： ５ｓｔＩＥ
： ＥｃｏＲＩ Ｘｈ ： ＸｈｏｌＨ：
ＨｉｎｄＩＩＩ Ｘｂ ： ＸｂａｌＫ：Ｋｐ
ｎＩ 特許出願人 株式会社ヤクルト本社 第４０ ＡＡＧＣ丁ＴＣＴＡＧＡＧＡＴＧＴＧＣＡＧＧＴＣＧノ
ＴＴＣＧＡＡＧＡＴＣＴＣＴＡＧＡＣＧＴＣＣＡＧＣＩ
第５［ ＣＴＣＧ ＧＡＧＣ 、ＣＧＯＡＴＣＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣ’ＧＣＣＴＡＧ
ＧＧＧＣＣＣＴＴＡＡＧ口 ＧＧ ＣＣ
Claims (5)
- （１）マウス乳癌ウィルス（ＭＭＴＶ）由来のＬＴＲ領
域を含む第１のＤＮＡ断片及び第２のＤＮＡ断片を、大
腸菌プラスミドｐＢＲ３２２由来のアンピシリン耐性領
域及び複製開始領域を含むＤＮＡ断片と連結すると共に
、第１のＤＮＡ断片のＭＭＴＶプロモーターの下流に、
πＡＮ７由来のポリリンカーを連結し、当該ポリリンカ
ーの直前に、プラスミドｐＣＶＳＶＥ由来の３′−スプ
ライシングサイトを含むＤＮＡ断片を連結し、更に、選
択マーカーとして、ＳＶ４０由来のｐＳＶ２ｇｐｔのＳ
Ｖ４０のプロモーター領域及びＥｃｏ−ｇｐｔ遺伝子を
含むＤＮＡ断片を、前記ｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ断片
に挿入することにより構成したことを特徴とする複合プ
ラスミドベクター。 - （２）第１のＤＮＡ断片が、マウス乳癌ウィルス（ＭＭ
ＴＶ）をラムダファージベクターλｇｔＷＥＳ・λＢの
ＥｃｏＲ I サイトにクローニングして作成したクロー
ンＨのＢａｍＨ I −Ｘｈｏ I 断片由来のＤＮＡ断片で
ある特許請求の範囲第１項記載の複合プラスミドベクタ
ー。 - （３）第２のＤＮＡ断片が、クローンＨのＢｇｉII断片
由来のＤＮＡ断片である特許請求の範囲第１項記載の複
合プラスミドベクター。 - （４）３′−スプライシングサイトを含むＤＮＡ断片が
、ｐＣＶＳＶＥのＰｓｔ I −ＨｉｎｄIII断片由来のＤ
ＮＡ断片である特許請求の範囲第１項記載の複合プラス
ミドベクター。 - （５）Ｅｃｏ−ｇｐｔ遺伝子を含むＤＮＡ断片が、ｐＳ
Ｖ２ｇｐｔII−ＢａｍＨ I 断片由来のＤＮＡ断片であ
る特許請求の範囲第１項記載の複合プラスミドベクター
。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60191427A JPH0630590B2 (ja) | 1985-08-30 | 1985-08-30 | 複合プラスミドベクタ− |
| CA000516964A CA1287002C (en) | 1985-08-30 | 1986-08-27 | Chimeric plasmid vector |
| AT86306714T ATE74623T1 (de) | 1985-08-30 | 1986-08-29 | Chimaerer plasmidvektor. |
| EP86306714A EP0219214B1 (en) | 1985-08-30 | 1986-08-29 | Chimeric plasmid vector |
| DE8686306714T DE3684753D1 (de) | 1985-08-30 | 1986-08-29 | Chimaerer plasmidvektor. |
Applications Claiming Priority (1)
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