CN114672447B - 一种具有自絮凝能力的菌株及其制备方法与应用 - Google Patents
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- C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids
Abstract
本发明公开了一种具有自絮凝能力的菌株及其制备方法与应用。本发明公开的具有自絮凝能力的菌株，其制备方法包括：敲除出发菌株中的多糖合成基因，或抑制出发菌株中多糖合成基因的表达量，或降低出发菌株中的多糖合成基因编码蛋白质的含量或活性，得到目的重组菌。本发明通过在盐单胞菌中敲除三个多糖合成基因簇PS1、PS2、PS4，获得了具有自絮凝能力的菌株ΔPS124，该菌株具有胞外多糖缺失表型和在液体培养基中自絮凝现象。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，一种具有自絮凝能力的菌株及其制备方法与应用。
背景技术
聚羟基脂肪酸酯(PHA)是微生物合成的一类结构和性能多样的高分子聚酯。作为环境友好型材料，将在解决由石油化工经济带来的能源和环境危机中作出贡献，在人类生活中有着广阔的应用前景，但是高昂的生产成本限制了PHA的大规模应用。从新疆盐湖中筛选出的盐单胞菌Halomonas bluephagenesis能够在胞内大量积累以3HB为单体的一类PHA颗粒PHB，并且具有生长快，鲁棒性高等特性，是PHA低成本生产的一大突破，以此开发的无灭菌连续发酵生产PHA的新技术已用于工厂中试，能将PHA生产成本降低30％。但Halomonasbluephagenesis在PHA工业生产链中仍有很多问题亟需解决。
此前，在另一株盐单胞菌Halomonas LS21中，通过敲除电子传递蛋白etf-α和etf-β基因后，获得具有自絮凝和自沉降特性的菌株Halomonas LSKO(Ling,C.,et al.(2019)."Engineering self-flocculating Halomonas campaniensis for wastewaterless openand continuous fermentation"Biotechnol Bioeng 116(4):805-815.)(另见中国专利申请《一种循环利用废水连续发酵培养微生物的方法及其所用具有自絮凝和自沉降特性的细菌》，申请号CN201811468572.7)。
发明内容
本发明从遗传改造的角度寻求制备具有自絮凝能力的菌株的解决方案，制备了具有自絮凝能力的菌株。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种重组菌的制备方法，所述方法包括：敲除出发菌株中的多糖合成基因，或抑制出发菌株中所述多糖合成基因的表达量，或降低出发菌株中的所述多糖合成基因编码蛋白质的含量或活性，得到目的重组菌。
本发明还提供了一种提高菌株絮凝能力的方法，所述方法包括：敲除出发菌株中的多糖合成基因，或抑制出发菌株中所述多糖合成基因的表达量，或降低出发菌株中的所述多糖合成基因编码蛋白质的含量或活性，得到与所述出发菌株相比絮凝能力提高的目的重组菌。
上文中，所述出发菌株含有所述多糖合成基因。
上文中，所述出发菌株可为盐单胞菌(Halomonas bluephagenesis)。在本发明的一个实施例中，所述盐单胞菌(Halomonas bluephagenesis)为盐单胞菌(Halomonasbluephagenesis)TD1.0。
所述多糖合成基因可为多糖合成基因簇PS1、PS2和/或PS4中的多糖合成基因。所述盐单胞菌(Halomonas bluephagenesis)TD1.0含有多糖合成基因簇PS1、PS2和/或PS4。在本发明的一个实施例中，所述多糖合成基因簇PS1的序列如序列表中序列1所示，所述多糖合成基因簇PS2的序列如序列表中序列2所示，所述多糖合成基因簇PS4的序列如序列表中序列3所示。
进一步，所述多糖合成基因可为所述多糖合成基因簇PS1中能编码NCBI中ID分别为WP_039868450.1、WP_009721844.1、WP_009721843.1、WP_039868553.1、WP_009721841.1、WP_009721840.1、WP_009721839.1、WP_009721838.1和WP_009721837.1的蛋白质(更新日期为2020年6月6日)的基因；
和/或，所述多糖合成基因簇PS2中能编码NCBI中ID分别为WP_009721819.1、WP_009721818.1、WP_009721817.1、WP_009721816.1、WP_009721815.1、WP_009721814.1、WP_186004631.1、WP_143759701.1、WP_009721811.1、WP_009721810.1、WP_009721809.1、WP_009721808.1和WP_009721807.1的蛋白质(更新日期为2020年6月6日)的基因；
和/或，所述多糖合成基因簇PS4中能编码NCBI中ID分别为WP_009721803.1、WP_009721802.1、WP_009721800.1、WP_009721799.1、WP_009721798.1、WP_009721797.1、WP_009721796.1、WP_009721795.1、WP_009721794.1、WP_009721793.1、WP_009721792.1、WP_009721791.1、WP_009721790.1、WP_009721789.1和WP_143759699.1的蛋白质(更新日期为2020年6月6日)的基因。
所述多糖合成基因编码蛋白质可为所述多糖合成基因簇PS1、PS2和/或PS4中的多糖合成基因编码的蛋白质。
进一步，所述多糖合成蛋白质可为所述多糖合成基因簇PS1编码的NCBI中ID分别为WP_039868450.1、WP_009721844.1、WP_009721843.1、WP_039868553.1、WP_009721841.1、WP_009721840.1、WP_009721839.1、WP_009721838.1和WP_009721837.1的蛋白质(更新日期为2020年6月6日)；
和/或，所述多糖合成基因簇PS2编码的NCBI中ID分别为WP_009721819.1、WP_009721818.1、WP_009721817.1、WP_009721816.1、WP_009721815.1、WP_009721814.1、WP_186004631.1、WP_143759701.1、WP_009721811.1、WP_009721810.1、WP_009721809.1、WP_009721808.1和WP_009721807.1的蛋白质(更新日期为2020年6月6日)；
和/或，所述多糖合成基因簇PS4编码的NCBI中ID分别为WP_009721803.1、WP_009721802.1、WP_009721800.1、WP_009721799.1、WP_009721798.1、WP_009721797.1、WP_009721796.1、WP_009721795.1、WP_009721794.1、WP_009721793.1、WP_009721792.1、WP_009721791.1、WP_009721790.1、WP_009721789.1和WP_143759699.1的蛋白质(更新日期为2020年6月6日)。
上文中，所述多糖合成基因的敲除通过将多糖合成基因簇PS1、PS2和/或PS4敲除实现。
上文中，所述多糖合成基因的敲除可通过CRISPR/Cas9的方法实现。
进一步，所述多糖合成基因的敲除可通过向所述出发菌株中导入能表达Cas9以及靶向所述多糖合成基因簇PS1、PS2和/或PS4的sgRNA的重组载体实现。
其中，能表达Cas9以及靶向所述多糖合成基因簇PS1、PS2和/或PS4的sgRNA的重组载体可为能分别表达Cas9以及靶向所述多糖合成基因簇PS1、PS2和/或PS4的sgRNA的一个或多个载体。
更进一步，能表达Cas9以及靶向所述多糖合成基因簇PS1、PS2和/或PS4的sgRNA的重组载体为由能表达Cas9的载体与如下P1、P2和/或P3组成的成套载体：
P1、表达能靶向所述多糖合成基因簇PS1的sgRNA的重组载体；
P2、表达能靶向所述多糖合成基因簇PS2的sgRNA的重组载体。
P3、表达能靶向所述多糖合成基因簇PS4的sgRNA的重组载体。
具体的，P1所述重组载体能表达分别靶向所述多糖合成基因簇PS1的两端的两个sgRNA。靶向所述多糖合成基因簇PS1的两端的两个sgRNA的靶序列分别为序列1的第77-96位和第16769-16788位。P1所述重组载体还可含有多糖合成基因簇PS1的上下游同源臂。P1所述重组载体可由能转录靶向所述多糖合成基因簇PS1的两端的两个sgRNA的DNA片段(2gPS1)、多糖合成基因簇PS1的上游同源臂、多糖合成基因簇PS1的下游同源臂与载体骨架连接得到。
所述2gPS1的序列可如序列表中序列4所示。所述多糖合成基因簇PS1的上游同源臂的序列可如序列表中序列7所示。所述多糖合成基因簇PS1的下游同源臂的序列可如序列表中序列8所示。
P2所述重组载体能表达分别靶向所述多糖合成基因簇PS2的两端的两个sgRNA。靶向所述多糖合成基因簇PS2的两端的两个sgRNA的靶序列分别为序列2的第37-56位和第22815-2283434位。P2所述重组载体还可含有多糖合成基因簇PS2的上下游同源臂。P2所述重组载体可由能转录靶向所述多糖合成基因簇PS2的两端的两个sgRNA的DNA片段(2gPS2)、多糖合成基因簇PS2的上游同源臂、多糖合成基因簇PS2的下游同源臂与载体骨架连接得到。
所述2gPS2的序列可如序列表中序列5所示。所述多糖合成基因簇PS2的上游同源臂的序列可如序列表中序列9所示。所述多糖合成基因簇PS2的下游同源臂的序列可如序列表中序列10所示。
P3所述重组载体能表达分别靶向所述多糖合成基因簇PS4的两端的两个sgRNA。靶向所述多糖合成基因簇PS4的两端的两个sgRNA的靶序列分别为序列3的第135-154位和第14764-14783位。P3所述重组载体还可含有多糖合成基因簇PS4的上下游同源臂。P3所述重组载体可由能转录靶向所述多糖合成基因簇PS4的两端的两个sgRNA的DNA片段(2gPS4)、多糖合成基因簇PS4的上游同源臂、多糖合成基因簇PS4的下游同源臂与载体骨架连接得到。
所述2gPS4的序列可如序列表中序列6所示。所述多糖合成基因簇PS4的上游同源臂的序列可如序列表中序列11所示。所述多糖合成基因簇PS4的下游同源臂的序列可如序列表中序列12所示。
所述载体骨架只要能实现上述各片段的连接并将所得重组载体导入所述出发菌株中即可。在本发明的一个实施例中，所述载体骨架为pSEVA241的骨架。所述pSEVA241的骨架为pSEVA241载体中AGCCGTCGTGACTGGGAAAA与TACCGAGCTCGAATTCGCGC间的大片段(含有AGCCGTCGTGACTGGGAAAA与TACCGAGCTCGAATTCGCGC所示片段)。
所述能表达Cas9的载体可为pQ08。
在本发明的一个实施例中，得到的所述目的重组菌为将所述出发菌株中序列表中序列1所示的多糖合成基因簇PS1、序列2所示的多糖合成基因簇PS2与序列3所示的多糖合成基因簇PS4敲除得到的重组菌。所述重组菌中，序列表中序列1所示的多糖合成基因簇PS1的上下游同源臂直接相连，序列表中序列2所示的多糖合成基因簇PS2的上下游同源臂直接相连，序列表中序列3所示的多糖合成基因簇PS4的上下游同源臂直接相连。
利用所述重组菌的制备方法得到的重组菌，也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了一种产品，所述产品为所述能表达Cas9以及靶向所述多糖合成基因簇PS1、PS2和/或PS4的sgRNA的重组载体和/或所述出发菌株。
具体的，所述产品可为所述能表达Cas9以及靶向所述多糖合成基因簇PS1、PS2和/或PS4的sgRNA的重组载体，也可为所述出发菌株，还可为由所述能表达Cas9以及靶向所述多糖合成基因簇PS1、PS2和/或PS4的sgRNA的重组载体与所述出发菌株组成的成套产品。
本发明还提供了一种菌体收集方法，所述方法包括：在用于培养出发菌株的液体培养基中培养所述重组菌，得到培养液，静置所述培养液或向所述培养液中添加NaCl，使菌体沉淀，弃上层液体，即得到所述重组菌菌体。
所述用于培养出发菌株的液体培养基可含有NaCl。NaCl在所述用于培养出发菌株的液体培养基中的浓度可大于等于0.4M。NaCl在所述用于培养出发菌株的液体培养基中的浓度可为如下任一种：0.4M-60g/L、0.4M-1M、0.6M-1M、0.8M-1M、0.4M-0.8M、0.6M-0.8M、0.4M-0.6M。
所述用于培养出发菌株的液体培养基可为60MMG发酵培养基。
向所述培养液中添加NaCl时，NaCl的添加量可满足使其在培养体系中的浓度大于等于0.4M。NaCl的添加量可满足使其在培养体系中的浓度为如下任一种：0.4M-60g/L、0.4M-1M、0.6M-1M、0.8M-1M、0.4M-0.8M、0.6M-0.8M、0.4M-0.6M。
本发明还提供了一种生产PHB的方法，所述方法包括：在含有葡萄糖的培养基中培养所述重组菌，得到PHB。
所述含有葡萄糖的培养基可为60MMG发酵培养基。所述培养的温度为能使盐单胞菌生长的温度，如37℃。所述培养时间可根据具体需要或PHB的产量确定。
本发明还提供了下述I或II的应用：
I、所述重组菌的制备方法，或所述重组菌，或所述产品，或所述菌体收集方法在生产PHB中的应用；
II、所述重组菌，或所述产品在制备生产PHB产品中的应用。
本发明中，所述絮凝能力为自絮凝能力。
本发明通过在盐单胞菌中敲除三个多糖合成基因簇PS1、PS2、PS4，获得了基因敲除菌株ΔPS124，该菌株具有胞外多糖缺失表型和在液体培养基中自絮凝现象，该菌株具有以下优点：
1.在发酵后的液体培养基中，ΔPS124能够通过静置在30min内快速自絮凝并沉降到底部，方便菌体的收集；
2.ΔPS124可以通过控制培养基中的盐浓度操控其自絮凝特性；
3.ΔPS124胞外多糖缺失，节约了合成胞外多糖所需的碳源；
4.ΔPS124胞外多糖缺失使细胞表面氧气透过率提高，促进了菌体生长，进而缩短了发酵周期。
本发明可以解决现有工业大规模生物发酵中下游工艺中产生的能耗高、产率低、菌体收集过程复杂以及发酵周期长等诸多问题，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为PCR检测原理图。
图2为在盐单胞菌(Halomonas bluephagenesis)TD1.0的基础上敲除PS1基因簇的ΔPS1的PCR验证结果。
图3为在ΔPS1的基础上敲除PS2基因簇的菌株的PCR检测结果。其中，编号为1、2-7、9-12的菌株均为基因簇PS1和PS2全部敲除的敲除菌株。
图4为在ΔPS12的基础上敲除PS4基因簇的菌株的PCR检测结果。其中，编号为1的菌株为基因簇PS1、PS2、PS4全部敲除的敲除菌株。
图5为多糖基因簇敲除后菌体表型。A为基因簇PS1、PS2、PS4在基因组中所在位置；B为菌株在LB60固体培养基上的生长状况；C为菌株于LB60液体培养基中培养24h后静置不同时间的絮凝沉降状况。
图6为ΔPS124在60MMG发酵培养基中和不同浓度NaCl水溶液中的沉降效率。左图为待测菌株在60MMG发酵培养基中的沉降效率，纵坐标为沉降效率，横坐标为沉降时间；右图为ΔPS124在不同盐浓度的NaCl水溶液中静置20min时的沉降效率，纵坐标为沉降效率，横坐标为NaCl浓度。
图7为ΔPS124在60MMG培养基摇瓶发酵产量。A为细胞干重的检测结果；B为PHB产量的检测结果；C为PHB含量的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
下述实施例中的盐单胞菌(Halomonas bluephagenesis)TD1.0记载在文献(Qin,Q.,Ling,C.,Zhao,Y.,Yang,T.,Yin,J.,&Guo,Y.,et al.(2018).Crispr/cas9 editinggenome of extremophile halomonas spp.Metabolic Engineering,47(2018)219–229，S1096717618300053.)中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的质粒pQ08与pSEVA241均记载在文献(Qin,Q.,Ling,C.,Zhao,Y.,Yang,T.,Yin,J.,&Guo,Y.,et al.(2018).Crispr/cas9 editing genome ofextremophile halomonas spp.Metabolic Engineering,47(2018)219–229，S1096717618300053.)中，公众均可从申请人处获得，这两个质粒只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。其中，质粒pQ08携带Cas9的编码基因，能表达Cas9。pSEVA241的序列为序列表中序列13。
下述实施例中的大肠杆菌E.coli S17-1记载在文献(Qin,Q.,Ling,C.,Zhao,Y.,Yang,T.,Yin,J.,&Guo,Y.,et al.(2018).Crispr/cas9 editing genome ofextremophile halomonas spp.Metabolic Engineering,47(2018)219–229，S1096717618300053.)中，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
用于盐单胞菌发酵实验的60MMG发酵培养基：酵母粉1g/L，NaCl 60g/L，葡萄糖30g/L，溶液Ⅰ(十二水合磷酸氢二钠482.5g/L，磷酸二氢钾75g/L，)2％，溶液Ⅱ(七水合硫酸镁20g/L,氯化铵50g/L)2％，溶液Ⅲ(柠檬酸铁铵5g/L,二水合氯化钙2g/L)1％，溶液Ⅳ(二水合钼酸纳0.03g/L,六水合氯化镍0.02g/L,五水合硫酸铜0.01g/L,硼酸0.3g/L,四水合氯化锰0.03g/L,七水合硫酸锌0.1g/L,六水合氯化钴0.2g/L)0.1％，用NaOH调节培养基的pH至8.5，余量为水，％均表示体积百分比。四种溶液单独配置成母液，其溶剂均为水，各溶液使用时单独加入。
下述实施例中抗生素使用浓度：氯霉素(25μg/ml)，壮观霉素(100μg/ml)，卡那霉素(25μg/ml)。
实施例1、ΔPS124的构建及其在发酵中的应用
一、ΔPS124的构建
发明人基于CRISPR-Cas9的双质粒敲除系统，通过基因大片段敲除方法先后对盐单胞菌(Halomonas bluephagenesis)TD1.0中三段相邻的多糖合成基因簇PS1(16861bp)、PS2(22861bp)、PS4(14851bp)进行基因敲除(图5中A)，得到了ΔPS124突变株。所用CRISPR-Cas9的双质粒敲除系统中，一个质粒为pQ08，另一个为携带转录靶向待敲除基因序列的sgRNA的DNA和同源臂的敲除质粒pgVector。
基因簇PS1(16861bp)，其序列为序列表中序列1，能编码NCBI中ID分别为WP_039868450.1、WP_009721844.1、WP_009721843.1、WP_039868553.1、WP_009721841.1、WP_009721840.1、WP_009721839.1、WP_009721838.1、WP_009721837.1的蛋白质，更新日期为2020年6月6日。
基因簇PS2(22861bp)，其序列为序列表中序列2，能编码NCBI中ID分别为WP_009721819.1、WP_009721818.1、WP_009721817.1、WP_009721816.1、WP_009721815.1、WP_009721814.1、WP_186004631.1、WP_143759701.1、WP_009721811.1、WP_009721810.1、WP_009721809.1、WP_009721808.1、WP_009721807.1的蛋白质，更新日期为2020年6月6日。
基因簇PS4(14851bp)，其序列为序列表中序列3，能编码NCBI中ID分别为WP_009721803.1、WP_009721802.1、WP_009721800.1、WP_009721799.1、WP_009721798.1、WP_009721797.1、WP_009721796.1、WP_009721795.1、WP_009721794.1、WP_009721793.1、WP_009721792.1、WP_009721791.1、WP_009721790.1、WP_009721789.1、WP_143759699.1的蛋白质，更新日期为2020年6月6日。
1、携带sgRNA和同源臂的敲除质粒pgVector的构建
所构建的携带转录靶向基因簇PS1的sgRNA的DNA和同源臂的质粒pgVector，其名称为p2gPS1；携带转录靶向基因簇PS2的sgRNA的DNA和同源臂的质粒pgVector，其名称为p2gPS2；携带转录靶向基因簇PS4的sgRNA的DNA和同源臂的质粒pgVector，其名称为p2gPS4。
各敲除质粒均由转录待敲除目的片段的两个sgRNA的DNA(分别记为2gPS1、2gPS2和2gPS4)、上游同源臂、下游同源臂以及pSEVA241的质粒骨架四部分连接得到。
p2gPS1的构建方法如下：
合成序列表中序列4所示的2gPS1，以其为模板利用sgRNA F和sgRNA R组成的引物对进行PCR扩增，将得到的PCR产物记为PCR产物1；以盐单胞菌(Halomonasbluephagenesis)TD1.0的基因组DNA为模板，利用PS1 H1F和PS1 H1R组成的引物对进行PCR扩增，得到含有PS1上游同源臂的PCR产物；以盐单胞菌(Halomonas bluephagenesis)TD1.0的基因组DNA为模板，利用PS1 H2F和PS1 H2R组成的引物对进行PCR扩增，得到含有PS1下游同源臂的PCR产物；以pSEVA241为模板，利用pgVector F和pgVector R组成的引物对进行PCR扩增，将得到的PCR产物利用DpnI消化2h去除模板质粒得到pgVector质粒骨架。
所得PCR产物1与含有PS1上游同源臂的PCR产物、含有PS1上游同源臂的PCR产物与含有PS1下游同源臂的PCR产物、含有PS1下游同源臂的PCR产物与pgVector质粒骨架、pgVector质粒骨架与PCR产物1均有一端序列相同。
将PCR产物1、含有PS1上游同源臂的PCR产物、含有PS1下游同源臂的PCR产物以及pgVector质粒骨架通过Gibson组装克隆试剂盒重组，将得到的产物转化到大肠杆菌中，并挑取单克隆提取质粒测序验证，得到的序列正确的重组质粒即为p2gPS1。
序列4中，第21-55位和第171-205位均为启动子序列；第56-136位和第206-286位分别为转录靶向基因簇PS1的两个sgRNA的DNA序列，这两个sgRNA的靶序列分别为序列4的第56-75位和第206-225位；第137-161位和第287-311位均为终止子序列。
p2gPS2的构建方法如下：
合成序列表中序列5所示的2gPS2，以其为模板利用sgRNA F和sgRNA R组成的引物对进行PCR扩增，将得到的PCR产物记为PCR产物2；以盐单胞菌(Halomonasbluephagenesis)TD1.0的基因组DNA为模板，利用PS2 H1F和PS2 H1R组成的引物对进行PCR扩增，得到含有PS2上游同源臂的PCR产物；以盐单胞菌(Halomonas bluephagenesis)TD1.0的基因组DNA为模板，利用PS2 H2F和PS2 H2R组成的引物对进行PCR扩增，得到含有PS2下游同源臂的PCR产物。
所得PCR产物2与含有PS2上游同源臂的PCR产物、含有PS2上游同源臂的PCR产物与含有PS2下游同源臂的PCR产物、含有PS2下游同源臂的PCR产物与上文所得pgVector质粒骨架、上文所得pgVector质粒骨架与PCR产物2均有一端序列相同。
将PCR产物2、含有PS2上游同源臂的PCR产物、含有PS2下游同源臂的PCR产物以及上文所得pgVector质粒骨架通过Gibson组装克隆试剂盒重组，将得到的产物转化到大肠杆菌中，并挑取单克隆提取质粒测序验证，得到的序列正确的重组质粒即为p2gPS2。
序列5中，第21-55位和第171-205位均为启动子序列；第56-136位和第206-286位分别为转录靶向基因簇PS2的两个sgRNA的DNA序列，这两个sgRNA的靶序列分别为序列5的第56-75位和第206-225位；第137-161位和第287-311位均为终止子序列。
p2gPS4的构建方法如下：
合成序列表中序列6所示的2gPS4，以其为模板利用sgRNA F和sgRNA R组成的引物对进行PCR扩增，将得到的PCR产物记为PCR产物3；以盐单胞菌(Halomonasbluephagenesis)TD1.0的基因组DNA为模板，利用PS4 H1F和PS4 H1R组成的引物对进行PCR扩增，得到含有PS4上游同源臂的PCR产物；以盐单胞菌(Halomonas bluephagenesis)TD1.0的基因组DNA为模板，利用PS4 H2F和PS4 H2R组成的引物对进行PCR扩增，得到PS4含有下游同源臂的PCR产物。
所得PCR产物3与含有PS4上游同源臂的PCR产物、含有PS4上游同源臂的PCR产物与含有PS4下游同源臂的PCR产物、含有PS4下游同源臂的PCR产物与上文所得pgVector质粒骨架、上文所得pgVector质粒骨架与PCR产物3均有一端序列相同。
将PCR产物3、含有PS4上游同源臂的PCR产物、含有PS4下游同源臂的PCR产物以及上文所得pgVector质粒骨架通过Gibson组装克隆试剂盒重组，将得到的产物转化到大肠杆菌中，并挑取单克隆提取质粒测序验证，得到的序列正确的重组质粒即为p2gPS4。
序列6中，第21-55位和第171-205位均为启动子序列；第56-136位和第206-286位分别为转录靶向基因簇PS4的两个sgRNA的DNA序列，这两个sgRNA的靶序列分别为序列6的第56-75位和第206-225位；第137-161位和第287-311位均为终止子序列。
PS1上游同源臂与PS1下游同源臂的序列分别为序列7和序列8，上文含有PS1上游同源臂的PCR产物的序列由在序列7的两端分别添加相应的用于DNA拼接的序列得到，上文含有PS1下游同源臂的PCR产物的序列由在序列8的两端分别添加相应的用于DNA拼接的序列得到；PS2上游同源臂与PS2下游同源臂的序列分别为序列9和序列10，上文含有PS2上游同源臂的PCR产物的序列由在序列9的两端分别添加相应的用于DNA拼接的序列得到，上文含有PS2下游同源臂的PCR产物的序列由在序列10的两端分别添加相应的用于DNA拼接的序列得到；PS4上游同源臂与PS4下游同源臂的序列分别为序列11和序列12，上文含有PS4上游同源臂的PCR产物的序列由在序列11的两端分别添加相应的用于DNA拼接的序列得到，上文含有PS4下游同源臂的PCR产物的序列由在序列12的两端分别添加相应的用于DNA拼接的序列得到。
所用各引物如表1所示。
表1、用于构建敲除载体的引物和合成的sgRNA序列
表2、DNA序列
表1与2中相同标记的序列反向互补或相同，用于DNA片段的拼接；表2中下划线处序列为相应sgRNA的靶序列。
2gPS1转录的两个sgRNA的靶序列分别为序列1的第77-96位和第16769-16788位，2gPS2转录的两个sgRNA的靶序列分别为序列2的第37-56位和第22815-2283434位，2gPS4转录的两个sgRNA的靶序列分别为序列3的第135-154位和第14764-14783位。
各质粒信息如表3所示。
表3、用于基因敲除的质粒列表
2、ΔPS124的构建
2.1培养基配制
用于大肠杆菌培养的LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，余量为水。
用于盐单胞菌培养的LB60培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 60g/L，余量为水。
用于接合转化的LB20培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 20g/L，余量为水。
2.2盐单胞菌的接合转化
使用E.coli S17-1作为接合转化的工具菌株，其过程如下：
将待转化质粒导入E.coli S17-1中，得到携带待转化质粒的E.coli S17-1；
将目的盐单胞菌和携带待转化质粒的E.coli S17-1菌种分别在添加相应抗生素的LB60和LB培养基中过夜培养活化。之后6000rpm离心2分钟，收集菌体，各加入50μl相应培养基重悬，将目的盐单胞菌和携带待转化质粒的E.coli S17-1重悬菌液混匀，取混合的菌液滴于LB20固体培养基上。在恒温培养箱37℃正置培养12小时后，刮取菌苔重悬于100μl的含相应抗生素的LB60培养基中并涂布于相应抗性的LB60平板，恒温培养箱37℃培养24-48h，即得到携带转化质粒的盐单胞菌。
2.3敲除过程
以pQ08质粒为待转化质粒，将目的盐单胞菌按照步骤2.2的方法通过接合转化导入pQ08质粒，通过LB60平板(添加氯霉素)筛选获得转化株，得到携带pQ08质粒的盐单胞菌。之后，再通过接合转化，在携带pQ08质粒的盐单胞菌中导入pgVector质粒(p2gPS1、p2gPS2或p2gPS4)，通过LB60平板(添加氯霉素和壮观霉素)筛选获得转化株，而后挑取单菌落划线于LB60平板(添加氯霉素和壮观霉素)，并通过菌落PCR验证敲除结果。当pQ08和pgVector同时转入到盐单胞菌中时，敲除过程既已经发生，pgVector表达的sgRNA与pQ08表达的Cas9蛋白结合，靶向目的基因进行切割，而后细菌利用内源的同源重组系统以pgVector质粒上携带的同源臂为模板进行重组修复，修复后既完成编辑。
2.4 PCR验证敲除结果
分别使用待敲除目的DNA同源臂外侧设计的一对引物VPS(n)F和VPS(n)R进行菌落PCR来验证是否存在敲除突变体，如果成功敲除将得到一条约2500bp的PCR条带，如果没有敲除将无条带。然后用目的基因内设计的引物VPS(n)in和VPS(n)F进行菌落PCR以验证目的基因是否残留，如果目的基因无残留PCR将无条带产生，如果目的基因有残留，将PCR得到一条约1500bp大小的条带，原理如图1所示。所用引物如下表所示。
2.5质粒消除
经过筛选验证得到的敲除株纯合子在下一步敲除另一DNA片段前需要先将携带sgRNA的pgVector质粒进行消除。质粒消除通过传代培养进行。挑取验证正确的敲除株菌落在LB60(添加氯霉素)的试管中过夜培养，之后稀释涂布在LB60(添加氯霉素)固体平板上，培养24-48h，待其长出单克隆。从固体平板上挑取单克隆先后划线于LB60(添加氯霉素和壮观霉素)固体平板和LB60(添加氯霉素)固体平板上，培养24h。在LB60(添加氯霉素和壮观霉素)固体平板不能生长，但在LB60(添加氯霉素)固体平板能生长的克隆则为pgVector质粒消除菌株。
2.6ΔPS1敲除株构建
将敲除质粒p2gPS1、p2gPS2和p2gPS4分别导入大肠杆菌E.coli S17-1中，将得到的重组菌分别记为E.coli S17-1/p2gPS1、E.coli S17-1/p2gPS2和E.coli S17-1/p2gPS4。
以pQ08质粒为待转化质粒，以盐单胞菌(Halomonas bluephagenesis)TD1.0为目的盐单胞菌，按照步骤2.2的结合转化方法得到携带pQ08质粒的盐单胞菌(Halomonasbluephagenesis)TD1.0，记为盐单胞菌(Halomonas bluephagenesis)TD1.0/pQ08。
将盐单胞菌(Halomonas bluephagenesis)TD1.0/pQ08和E.coli S17-1/p2gPS1菌种分别在添加相应抗生素的LB60和LB培养基中过夜培养活化。之后6000rpm离心2分钟，收集菌体，各加入50μl相应培养基重悬，将盐单胞菌(Halomonas bluephagenesis)TD1.0/pQ08和E.coli S17-1/p2gPS1重悬菌液混匀，取混合的菌液滴于LB20固体培养基上。在恒温培养箱37℃正置培养12小时后，刮取菌苔涂布于含氯霉素和壮观霉素的LB60平板，恒温培养箱37℃培养24-48h进行转化筛选，培养结束挑取3个单克隆划线在LB60(添加氯霉素和壮观霉素)平板上。通过菌落PCR鉴定，3个单克隆的PS1基因簇均敲除成功(图2)，得到基因簇PS1全部敲除的敲除菌株，记为ΔPS1，经测序验证ΔPS1中不含PS1上下游同源臂间的片段。
2.7ΔPS12敲除株构建
将步骤2.6得到的ΔPS1按照2.5的方法进行质粒消除，得到携带pQ08质粒的菌株，记为ΔPS1/pQ08。
将ΔPS1/pQ08和E.coli S17-1/p2gPS2菌种分别在添加相应抗生素的LB60和LB培养基中过夜培养活化。之后6000rpm离心2分钟，收集菌体，各加入50μl相应培养基重悬，将ΔPS1/pQ08和E.coli S17-1/p2gPS2重悬菌液混匀，取混合的菌液滴于LB20固体培养基上。在恒温培养箱37℃正置培养12小时后，刮取菌苔涂布于含氯霉素和壮观霉素的LB60平板，恒温培养箱37℃培养24-48h进行转化筛选，培养结束挑取12个单克隆划线在LB60(添加氯霉素和壮观霉素)平板上。通过菌落PCR鉴定，其中10个单克隆PS2基因簇敲除成功(图3)，得到基因簇PS1和PS2全部敲除的敲除菌株，记为ΔPS12，经测序验证ΔPS12中不含PS1上下游同源臂间的片段，也不含PS2上下游同源臂间的片段。
2.8ΔPS12敲除株构建
将步骤2.7得到的ΔPS12按照2.5的方法进行质粒消除，得到携带pQ08质粒的菌株，记为ΔPS12/pQ08。
将ΔPS12/pQ08和E.coli S17-1/p2gPS4菌种分别在添加相应抗生素的LB60和LB培养基中过夜培养活化。之后6000rpm离心2分钟，收集菌体，各加入50μl相应培养基重悬，将ΔPS12/pQ08和E.coli S17-1/p2gPS4重悬菌液混匀，取混合的菌液滴于LB20固体培养基上。在恒温培养箱37℃正置培养12小时后，刮取菌苔涂布于含氯霉素和壮观霉素的LB60平板，恒温培养箱37℃培养24-48h进行转化筛选，培养结束挑取4个单克隆划线在LB60(添加氯霉素和壮观霉素)平板上。通过菌落PCR鉴定，其中1个单克隆PS4基因簇敲除成功(图4)，得到基因簇PS1、PS2、PS4全部敲除的敲除菌株，记为ΔPS124，经测序验证ΔPS124中不含PS1上下游同源臂间的片段，也不含PS2上下游同源臂间的片段，也不含PS4上下游同源臂间的片段，该菌株中，序列表中序列1所示的多糖合成基因簇PS1的上下游片段直接相连(即序列7与序列8所示的两个DNA片段直接相连)，序列表中序列2所示的多糖合成基因簇PS2的上下游片段直接相连(即序列9与序列10所示的两个DNA片段直接相连)，序列表中序列3所示的多糖合成基因簇PS4的上下游片段直接相连(即序列11与序列12所示的两个DNA片段直接相连)。
二、基因敲除株ΔPS124的特征
以步骤一所得ΔPS124与盐单胞菌(Halomonas bluephagenesis)TD1.0(野生型菌株，WT)作为待测菌株，检测其生长状况，步骤如下：
将ΔPS124与野生型TD1.0菌株分别在LB60液体培养基中过夜活化，按1％接种量接种在含有LB60液体培养基的试管中，37℃、200rpm摇床中培养24h后观察。并在LB60固体培养基上划线，于37℃恒温培养箱中培养48h后观察。
结果显示，盐单胞菌TD1.0在LB60固体培养基上生长会出现湿润凸起的黏液化菌苔形状(图5中B)，而敲除了其基因组上的多糖合成基因簇PS1、PS2和PS4的菌株ΔPS124在LB60固体培养基上表现出干扁粗糙的菌苔形状(图5中B)，说明ΔPS124的主要胞外多糖已经无法合成分泌。并且ΔPS124在LB60液体培养基中产生了明显的自絮凝现象(图5中C)，有助于工业生产中菌体的回收。
三、ΔPS124的自絮凝和沉降效率测定
ΔPS124会产生明显的自絮凝和沉降的现象，为评价ΔPS124的自絮凝效果，发明人进一步以沉降效率作为衡量指标进行测定。将ΔPS124和野生型菌株盐单胞菌(Halomonas bluephagenesis)TD1.0作为待测菌株，在60MMG发酵培养基中培养48h后分别测定在培养基中的沉降效率和在不同盐浓度的盐水中20min时的沉降效率。具体步骤如下：
菌株的培养：将待测菌株在LB60液体培养基中过夜培养活化，后以1％(体积百分比)接种在LB60液体培养基中于摇床中37℃、200rpm下培养8h作为种子液。然后将种子液按5％(体积百分比)的接种量接种在60MMG发酵培养基中，分装在500mL摇瓶中，每瓶50mL，而后于37℃、200rpm下分别培养48h，得到发酵液。
60MMG沉降效率：两种菌株的发酵液各取15ml，分别于15ml离心管中静置，每隔5min吸取距液面0.5cm处的液体(上清液)测定其OD600。OD值使用96孔板于酶标仪测定，每孔加入200μl待测样品，样品浓度过高需用60MMG发酵培养基稀释至OD600＝0.2-0.8之间。N分钟时样品沉降率＝(样品静置前的OD值-样品静置N分钟后上清液的OD值)/样品静置前的OD值×100％。设置三次重复实验。
不同盐浓度沉降效率：将ΔPS124的发酵液分装在15ml离心管中，每个15ml，4000rpm离心10min后弃上清，收集菌体沉淀。用0.02M NaCl水溶液重悬洗涤一次。再用不同浓度的NaCl水溶液重悬至15ml总体积，得到菌体重悬液。按照上述60MMG沉降效率的测定方法，将发酵液替换为菌体重悬液测定不同盐浓度沉降效率。
结果如图6所示，在60MMG发酵培养基中，ΔPS124在15min左右就能达到最大的沉降效率，为95.66％。并且，ΔPS124的自絮凝受到盐浓度的影响，在0.4M以上的NaCl水溶液才能表现出明显的自絮凝现象，且在0.6M以上的NaCl水溶液能达到最好的沉降效率，在0.2M以下的NaCl水溶液则不具有自絮凝现象。因此，该菌的自絮凝现象可以通过盐浓度进行控制。
在60MMG发酵培养基中，野生型菌株在0、5、10、15和30分钟时的沉降效率分别为0、7.38±2.13、7.37±1.59、9.08±1.90、8.14±4.97％，ΔPS124在0、5、10、15和30分钟时的沉降效率分别为0、86.53±0.64、92.54±1.20、95.66±0.46、96.10±0.55％(Mean±SD，每组3个重复)，如图6所示。
在NaCl水溶液的浓度为0、0.02、0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8和1.0M时，ΔPS124的沉降效率分别为6.34、11.42、6.76、9.09、59.09、78.79、85.20、86.95、88.00％，如图6所示。
四、ΔPS124进行PHB酵的测定
以盐单胞菌(Halomonas bluephagenesis)TD1.0和ΔPS124作为待测菌株，进行PHB发酵的测定，设置三次重复实验。步骤如下：
将待测菌株在LB60液体培养基中过夜培养活化，后以1％(体积百分比)接种在LB60液体培养基中于摇床中37℃、200rpm下培养8h作为种子液。然后将种子液按5％(体积百分比)的接种量接种在60MMG发酵培养基中，分装在500mL摇瓶中，每瓶50mL，而后于37℃、200rpm下分别培养24h、36h和48h，收集培养液，离心，收集菌体，测定其细胞干重和PHB产量。
将菌体于先于-80℃预冷，而后在真空冷冻干燥器中冻干48h，称重即得到细胞干重。
PHB产量检测步骤如下：
(1)配制酯化液：在甲醇和98％(质量百分比)浓硫酸的混合液(甲醇与浓硫酸的体积比97:3)中溶解苯甲酸(苯甲酸作为内参，国药集团化学试剂有限公司产品，货号为30018617)，即得到酯化液，酯化液中苯甲酸的浓度为1g/L；
(2)称取40mg左右冻干菌体于酯化管中；
(3)向酯化管中加入2mL酯化液和2mL三氯甲烷，100℃酯化4h；
(4)自然冷却，加入1mL蒸馏水振荡混匀，静置分层，取下层氯仿相即为待测液；
(5)称取10mg左右的PHB标准品(Sigma，No.P-8150)于酯化管中，而后向酯化管中加入2mL酯化液和2mL三氯甲烷，100℃酯化4h，自然冷却，加入1mL蒸馏水振荡混匀，静置分层，取下层氯仿相得到标样。
(6)将步骤(4)所得待测液与步骤(5)所得标样分别进行气相色谱分析，以苯甲酸(国药集团化学试剂有限公司产品，货号为30018617)为内参。使用Agilent GC6820气相色谱仪，色谱柱DB-FFAP，氮气为载气，设定柱温为200℃，进样器温度为200℃，检测器温度为220℃，柱长30m，柱头压力为0.25Mpa。程序升温条件为：80℃维持1.5min后，以30℃/min的速度升温至140℃，再以40℃/min的速度升温至220℃并在此温度保持0.5min。样品进样量为1μl。根据苯甲酸与PHB峰面积比值计算PHB含量。
结果如图7所示，ΔPS124由于胞外多糖合成的减少，在培养相同时间时的菌体干重相比TD1.0明显较低。ΔPS124在培养36h时PHB产量达到最高，在36h前ΔPS124的PHB含量和产量都略优于野生型的TD1.0。说明，ΔPS124有效缩短了发酵周期。
盐单胞菌(Halomonas bluephagenesis)TD1.0在培养24h、36h和48h时的细胞干重分别为10.15±0.32、12.68±0.01、12.55±0.07g/L；ΔPS124在培养24h、36h和48h时的细胞干重分别为9.69±0.19、11.85±0.44、11.75±0.07g/L(平均值±标准差，每组3个重复)。
盐单胞菌(Halomonas bluephagenesis)TD1.0在培养24h、36h和48h时的PHB产量分别为6.54±0.35、9.01±0.19、9.52±0.68g/L；ΔPS124在培养24h、36h和48h时的PHB产量分别为6.73±0.43、9.40±0.22、8.98±0.62g/L(平均值±标准差，每组3个重复)。PHB产量(g/L)＝(S样品峰×S标准品苯甲酸峰)/(S标准品峰×S样品苯甲酸峰)×(m标准品/m样品)×细胞干重(S代表峰面积，m代表质量)。
盐单胞菌(Halomonas bluephagenesis)TD1.0在培养24h、36h和48h时的PHB含量分别为64.36±1.40、71.10±1.47、75.85±5.07(wt％)；ΔPS124在培养24h、36h和48h时的PHB含量分别为69.42±3.83、79.37±1.51、76.45±4.89(wt％)(平均值±标准差，每组3个重复)。PHB含量(wt％)＝(S样品峰×S标准品苯甲酸峰)/(S标准品峰×S样品苯甲酸峰)×(m标准品/m样品)(S代表峰面积，m代表质量)。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 一种具有自絮凝能力的菌株及其制备方法与应用
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 16861
<212> DNA
<213> 盐单胞菌（Halomonas bluephagenesis）
<400> 1
atggcaaaac taatagcagg ctatacatct cccggtatta ccaagatcaa cgctcttgct 60
tcttttttgc ctgaatactc acatttttca cgcataaggc cactgagccc taaaccgaat 120
gtggtcgttg gatggggtct taagcccact agtgatcgtg ctcgacatta tgcctctcgc 180
catagcctac cgtatgtcgc tctagaggat ggctttcttc gttctttagg attaggggtt 240
gaaggctatc agcctcatag catggtagtc gattatacgg gcatctatta tgacgcctct 300
cgacctagtg atttagaaaa ctggctcaat catgacacgt ttgacgacga tgaacttgct 360
caagcccaac gctgcattga gcaactatca cgttatcgct tatcaaaata caaccacgcg 420
cctgattatc cgcttcccgc tgtaggaacc gacaatgctg gtactaacag tgtgttggtc 480
gtggatcaaa ccgcaggcga tgcctctatt caccatggcg gtgctaacgc agacagtttt 540
cggcaaatgt tagcgtgcgc tctaaataat catcctgacg ccgatatttt cattaaagta 600
catcctgacg tcatcgcagg caaaaaacag ggccatctag cagacgctca cgagaatcct 660
cgttgccaca ttgttagcga taacattaac ccttgggcgc tatttgatag ggttaagacc 720
gtttatgtcg taacaagcca gttggggttc gaagcattga tggctggcaa gcaagtacac 780
tgttttggcc tccccttcta tgcggggtgg gggttaaccc atgatcagat cagttgcact 840
cgcagaaggg ttccgcgacg cctggaagaa gtatttgccg cagcctatct tcgctacacc 900
cggtatgcca acccctacac gggcaacacc gcgacgctag aagagacgat tgccctgatt 960
gctgaccaaa agcgccagca agagcgtctg cgtggggagt gggtggcctg cggtttctcg 1020
tcgtggaaaa agcgcttcat tggctatttt cttggcccag cggcaaaaat tgtatatcag 1080
aaagagctgc cagctgcttt cgaagcagat gttaaaaaac caaatttact ggtgtggtcc 1140
agtcgtatta acgatgactt taaagcccgc caccgcgacc atttagcgac attatggcga 1200
atggaagacg gttttatccg atcggttggc ctaggggtag atcttgctca gccactatcc 1260
ctggtcattg atcgcctggg catttactac gaccccagcc aacctagcga gctagaaaac 1320
ttgcttaata ccgccgactt cagcgatgac ttattagagc gggcggcaca gctgcgcgaa 1380
cggttagtcg cgttaaagct ttccaaatat aatgtaccgg gcaaagaagc cattgaatta 1440
cccgccaaca aacacattat tttggtgcct ggccaggtag aaagtgatgc gtcaattgcc 1500
actggctcac cagagatcag tactaatagt gcgcttttga aagccgttcg aaatgctaac 1560
cccgatgcct ttattgtgta taaagctcac cctgacgtga ttaccggcgc tcgtatcgga 1620
gcactcgata cccacgccaa acgcctgtat gatcttgatg ctagtcatat agatatcacc 1680
gtgctgctag cacgcgttga tgcagtgcat accatgagtt cgctcaccgg ctttgaagca 1740
ctgcttcgtc aacgccaggt atacacctac ggcctcccgt tttacgcagg ctggggatta 1800
acccaggatg ccatgcactg tccgagacga aaccgggtgc tgtcactgga tgcgctggta 1860
gcaggaacac tgcttctata cccaagctac gtcgaccctg gctctcggca gctgtgtaat 1920
gctgaaacgg tagtcagcct gttggagcag gctaaattac aacaatttaa gtctcaaaaa 1980
catatgctta catggaagca gcgactatat cgctgctatc gtaacttatt cattggaagt 2040
cattaagttg aagcaaaagc gcgcattctt atttctccaa ggcgtctgct cgccctttta 2100
ccagcgtcta gcccgtcggc taaccgacga cggacaccgc gtggtaaaag ttaacttcaa 2160
cgctggcgat atcgtctact ggcagcgcac tcacagtcaa aaccatttgt ttcgcggccc 2220
gttaagcgag ctaccggctt atatccagtc gctctggcaa cgctacgaca ttaccgacca 2280
agttctgttt ggtgaccgcc gcccaattca ccgcccggcg gtagacttag cgcccgctgc 2340
tggcattcgt actcacgtct ttgaagaagg ctattttcgt cctttttggg tcaccctcga 2400
acgcgagggc gttaatggac actcgctgct acccagggac cccaaatggt ttttcgaaac 2460
gggcaaagcg ctgcccaaat tacccgcacc ggtccgcttt cgctcatctt ttaaaatccg 2520
tgccgctcac gacatgtgct atcacctagc ggggttagcg aatcccctgg tggctccgca 2580
ctaccgtaac catgcgccta tcactgcacc ggtggagtat gcaggctacg ccaaacgctt 2640
taccttactt cgatactgga aaaggcgcga tgcagtacgg attaaaaacc tgatagaggg 2700
cggaaagcct tattttatgt tgccgctgca gctcaacacc gatgctcaga ttcgtgacca 2760
ttcgccttat gccaatatgg aagaggtgat ggaccacgtc atgggttcat ttgctctgca 2820
cgcccctagc gattcactgc tgtgcataaa aaaccatccg ctagatatgg ggctggttaa 2880
ctacacggac attattcaaa ggctcgagga tttttacggc ctccaggggc gtatcgttta 2940
cctggagtca ggcaacctca atccattgct gaaacacgct acgggcaccg tcacagtgaa 3000
cagcacggtc ggcattgttt cccttgaaaa gcagtgcccc acttttgcgc tcagtgaccc 3060
tatctacaat ttagcgggcc tcacttacga aggcgctcta gatgagtttt ggcatcagcc 3120
accgctgccc agccaagcgc tgtttagcta ttttcgcaat gccgtgatgc acaccacgca 3180
gattaacggt ggcttttact gccagcccag tatcgattta gccgtgaaca atgcagcgcg 3240
tatactggaa gcctgcccct caccgttgga gaagttgctg tgagcgctgg cgtaacgaca 3300
catctctctt ctagcacccc acgctgcgtg ctgattaccg gagccaccgg cgcaataggc 3360
ggggcgctag cccatgctta tgcaaccccc aatacgtact tggtgctaca tggccgcaat 3420
cagcaggcgc ttgaagggtt ggcaacggcg tgtcgagaaa aaggcgcgca agtatcgctt 3480
tcatcggcca gtttgacaga cgaaaccgaa ctcaacgctt ggctcgatac actatgcaac 3540
gaacacgtac cagatattgt gattgccaat gcgggtatca atacgcaccc aagcgaaagc 3600
acactagagc catgggacga ggttcaagcg ctattggata ttaatttgaa agcgccgatt 3660
gcgatggcac agcgccttgt gcctgccatg caagcacgag gcagcggtca gttggtgttt 3720
attagctcat tggcgggctg gcacggctta ccaacaacgc ctagttacag tgccagcaaa 3780
gcgggcatta aagcctacgg agaaggccta agaggcttac ttgaacccca tggtattggc 3840
gtgaccgtgg tgatgcctgg ctacgtcacc tcacccatgt gtaacgccat gcctggcccg 3900
aagccttggg agtggtcgcc agagcgcgct gccaacgcca tacaacgtgg tattaccgct 3960
aaccgcgctc gtattagctt tccctttccg ctgaacttcg gcacctggtg gctagctgtt 4020
ctacctgctg gcatttctca atggctcgtt aaacgccttg gctttaatca taccgggggc 4080
gtgtagcgtg cagctcttac tgtcatccac gtttattagc ccgcttttag taggtttact 4140
aggcagccta ttgttcgagg cgctgctaag ccctcgccct cgcccgctct ggaagcgcgg 4200
cgttgctaca aacatcgtcc accttggcag ctggttactg ttgtttggga tctttattct 4260
gcttctgcag cgcccttggt ttgctgtcgt cttcgttcta tcgctgcaac tcgtggtcgt 4320
gcagtccagc aataccaaat cacgcacgtt gaacgaaccc tttatctgtc acgactttga 4380
atacttctgg gatgctgttt tgcacccacg cctgtatgtg cctttttttg gcattggtct 4440
tgccattgct gccagcagtg ccggggcgat tgccattggt agttttttgg tttttgaacc 4500
atcgctgatc cgccactggg gcggcacagc gtttctagtt aatagcctag cgctgatagc 4560
aaccggtgcg ctgtttgttt ggctggggtg gcgcaaattg ccgtctatca cgcttaaccc 4620
tgtgattgac ctagatcggc tggggctatt ttccagcctg tggacatacg gcattgccct 4680
ggcccactcc aaaccgccca caccagacgc atcgcccttc catcgattga ctcaacactg 4740
ccttgagcaa gacgcccatg cgacgctgcc taacgttgtg ttggtacaga gtgaatcgtt 4800
ttttgatcct cgcccatggt gtagcgagat tgccgctgac ttactgccga attatgatgc 4860
tacgtgcagg gaagctgtag ccaagggagc gctgaatgtg cccgcatggg gcgcaaatac 4920
agtgcgaacc gaatgcgccg tgttaactgg catagcacct gatgcctggg ggccgcgcca 4980
gttcaatcct taccgcacgc tatcgcgtca tacgttgccc agcattgcca gcgcctttaa 5040
agcccaaggg tatcgaactg tttgtgttca tccttaccct gctacgtttt atctgcgaga 5100
cagcgttatt ccaaaactgg ggtttgagac gtttgtcgac attagcgcct tcgaaagcca 5160
ggataagcat ggtcagtaca ttggcgacca agcggttgca cgaaagattg gacgcctgct 5220
tgaagataac gataataggc cactctttgt atttgtgatt accatggaaa atcacggccc 5280
tttacactta gaagcacccg aaaaggccgg ggtagcgtca acattgcctg cagcgccgtg 5340
gccgctgccg catcatttgc gcgatttggc cgtttacctg caccatctag gtgaatcgga 5400
taaaatgctc gaaagcgtta aagcagcgct aaactcagct gtaagaccag gactgttggg 5460
ctggtacggt gaccacgtac cgatactgcc tgccgcatat aggcactatt cgcctcctgc 5520
tagcagcacc ccgtacatga tatggtcaac ggaaatagat cgtaatttgc atgacaaacc 5580
gcccattgag cgcgagtcgt gcacgctgga agcaaacgaa cttggcgtct acctatttaa 5640
acaagcgttt ggacgcgata taagtagcga tgtgatcaag gcagaaccag aacctcagga 5700
gcaagaatga ctaaacgcgt tgccattatc ggcgccgccc atcgtttccc cggcaccaca 5760
cctgaaacgt tctggcagga cctgcaagcc gaaaaagacc tcgtcaccca agtggccccc 5820
gaccgttgga gccacgatgc tttctggcat cctgacaaac gccaccctgg caccagcgtc 5880
acgtttgccg cgggtagcct gggcgatatc agcggcttcg acgcagagtt tttcggcatt 5940
tcgccccgtg aagcggcgaa catggatccg caacagcgca tgctgttaga acttacctgg 6000
gaagccatgg aaagcgcggg catcgtgccc agcaccctcc gcgccagcca atgcggcgtt 6060
ttccttggcg tcgccagcct tgattactcc tatcgcctgg ccgatgacat gtcagcgatt 6120
gatgcctcta ccgcgacagg taatacctca agtattgcgt ctaaccggct ttcttacgtc 6180
tttgatctgc atggccccag catgtcgctg gataccgcct gctcatcttc tatggtcgcg 6240
ttccatcaag cgtgccaatc aattcgcagc ggcgaaacca acatggcgct ggcggggggc 6300
ataagcctgc acctgcaccc gtatggtttt attattttct cgaaggccag catgctctcc 6360
cccactgggc gctgccaagt cttcgatgaa gccggcaatg gctacgtgcg ttcagaaggc 6420
gccgggctat ttttgctaaa agattatgat caagccgtgg ccgatggcga taatatccta 6480
gccgtggtag caggctcagc ggttaacact gacggccaca agtccggcct caccgtgccc 6540
aatcccagcg cacagattga tttaatgcgc cgcgcctacg aacaagcggg catttcgccg 6600
gacgagatcg actaccttga agctcacggc accggcaccg ccgttggcga ccccattgaa 6660
actcgtgcta tcggcgaagc actcggcaag caccgtaaaa cgccgctcct gattggctca 6720
gtgaaaagta accttggtca tttagaaacg gcctctggcg ttgccggact tgctaaagcg 6780
ctctacagcc tgcagcaccg tgaagtgccc gccacgattg gcatacgcaa ccttaatcct 6840
cgtatcaaat ttgatgagtg gaacattagc gttgttacca aagcccaggc gctcaaaaaa 6900
cagggccgct tggtcattgg cgttaactcc tttggttttg gcggtgccaa cgctcacgtc 6960
atactggaaa gcgctccaga aaaagcatca acacctcgcc aagtgcccga taccccgctg 7020
ccacttcgca ttagtgcacg aagccaggaa gcgctggcag ataatgcccg cgaactagcg 7080
aatttcttac gcgaaagcga tcatgctttt tatgatattg ctcatacgct gaacagccac 7140
cgtgaacaac acacgcatgg cgcgctctgc ttcgcccaaa caccggaagc cgccgtcagt 7200
gcgctcagcc agtttgccga aggtgaaacc aacagcgttg tgacacttga gcgcttagct 7260
aacgcccgcg gcccagtgtt cgtatacgac ggcaacggct gcccatggga aaacatgggc 7320
cacgacctgc tggatagcga accagcgttt agcgatgcca ttgatcgtgt ggatgcccta 7380
ttccagaaac atggcgattt ttcactgcgt gacgagctgg cgggccgcaa ccagtcagaa 7440
gccggcgttg gccgctttga tcgcactgaa atcgctcagc cggcactgtt tgcactgcag 7500
gtagcgttaa ccgaatggct taaatccaag ggcattgtgc ccaccgccgt attcggccat 7560
agcgttggcg aagtggctgg cgcgtgggcg tccggcgcac tgacgctaga agacgccgtt 7620
aacgttattt actaccgcag cttctaccaa ggcaaaaccc gtggccttgg ggaaatgacg 7680
gccgtcgcca tgagcgcgga agagatcgct ccctggcttg aaaaacccga atttagcaac 7740
atcagcttgg cgggcattaa cagtcccaaa ggcatcacct tagcgggtga ccgtgaccaa 7800
ctaagcgcca ttgaagcagc ccttagcgaa cagagcacct ttgctaagcg cctgccattg 7860
gattacgcct ttcacagccc cgccatggac agcatcaaag ctggcgtttt agaagccttg 7920
gctgacattc gcccgcgcac cacaacgatt ccttatgtat ccaccgtcac gggcactatc 7980
agtgaaggca cacaactgga tgcccattac tggtggctca atattcgtga acctgttcta 8040
tttgataacg ccgcgacggt gcttattgag cagggctata acgtttttgt ggaagtcggc 8100
gcccatccta tcctacgccg ctatctgaac gagtccctgc gccagcaaga gcgcagcgga 8160
ttagtgctag gcaccattga gcgtcatatg tcaggcgtag acggcttaac tcgctgcctt 8220
ggccaattgc tgctaagcgg gttaacgctt aatagccacc actttttccc cgtggaaggc 8280
cagcgagtgc tgctgccacg ctacgcctgg caacgcaccc agctttgggt gcaaggcact 8340
aacgatggtc aggggctgct ttcccgttat taccagcacc cgctattggg ctacccattg 8400
gcgcagcagg atcacacctg ggaaagccag ttggacacca agcgccagcc atggcttgct 8460
gaccacgtcg tcggcgaagg cgcagtcttc ccgggcgctg ggtttgtgga gctgacgctt 8520
gccgcggccc tgcagcagaa agacactccg cttttagaca ttgaagagct ggagattcgc 8580
gccccgttgc ttctggatgg ccccaatggc cgcaccatgc gcttaacgct ggacccagac 8640
gacggccgct tagcgatcca ctcccgcgag cctgcaaccg gcagcgaatg gcagctaaat 8700
gctgttgctc gccgtatgcg cgaaagccga ggctttttgc tcaaccgcca agtgcctagc 8760
ctgcctaacc gcgcacctga ctataccctg gtcgagcatt tgcagatggc cgagcgcatc 8820
ggactgcatt acggccctgc gttccaagcc attagccgtg gctggattga aggcgactgc 8880
gtcataggtg aaattaccct atccgatagc gttcagtcgc agctcgatac gctgcacgtt 8940
catccgggca ttctggacag tgctttccag atgtttattc cgctgctggc tcaacacagc 9000
gagtttgcag cgcagttagc cttcgtgcca gttcgcgttg ggcgcattca ggttaacgct 9060
gaagccggtg cccccgtgct agcacgggcc gtgatgggta aacgcgcacc tcactccttc 9120
accgccgact tcgagctgta tgatgctgct ggcaacgccg tggccgtact cagtgaaact 9180
cgcttcaaag cgattcgcct gaaccgcgcc caccatcagc attttagcta cctggatgtt 9240
gagttaacgc ctgccccgct gaccgcggca aaactaccat tgcctgacaa tgcattcacc 9300
cgactagcag ggctaagcga tgcgtttgcc gccagcactg gtcaacgcta tgcccaagaa 9360
gtatcaccgt tacttgatag ccttagtgaa gctttttctg gcgttaatgt tgacagtggc 9420
gaagatcaac tcgcacccga aaccatttgg cagttactgg tacaggatta ccccgattat 9480
tttgccccta ttcatatggt gggccgctta gggctgcacc gtgagcaact caccagcggc 9540
agcgatacac ttgaaagctt aggcattacg gctgagcacc tggcgggcat taaccgcgtc 9600
cttatcggcg aagacggctg gcaagtgcta gcggccgagc ttggcgcatt gatggaggcc 9660
acgctagcca cgctgcccaa cggtcagcga gtgcagctgt tggaagcggg cccttgtgct 9720
cctgcccttg gccagcgcct gctcgaacag ttggctaaca cggcactcat cgcgaaagat 9780
gcgcaccact accgtgccat caccaccagc gacacagctc gccatcaggc ggaacagctt 9840
caagagcgct tcccgctgat agatgttcag ccgctggacg actcattgcc cacgcttagc 9900
agtgcagaaa aagcccaact ggcgtttatc agcgtggacg tgacccagcc cgaacgcacc 9960
cgccaactga ttgaagccct gcctgcccag cttgcccctg gtgctcaggt aatggtgatc 10020
agcgttcacc ccagccgttg gctggatgat ttgctggcca caccaggcat cgaccaaacg 10080
gccctggaac aagacaccct acgcgattgg ttaaccaacc aaggccttag cgtttcgccg 10140
ccagtcgagc ttgaagaaaa cggcgcttac ctgcttcatg cccaatacgc agcaggtgat 10200
gacttaccga ttcaaaatgc ggcagaggca taccacctaa ttgtctctga cgctgagcac 10260
gaaacactcg ccgcccaact tgcagagcgg ctaggcacga ccaacacatg gctaaccgtc 10320
agcgatgcaa ctccgcaagc actgttaaat acagcgctga gggaacgcca agacgcacct 10380
gccgcactca atgtgattga cctacgtggg ctaaagggca gtacaaccac cgcccaaacc 10440
caacgctgtt acgcagcaca gcaatggtcg ctggcattag aagcaagcgg gcttgaaagc 10500
caaggcagcc gcgtcacgct ttggctgtcg acccaggatg ccagtacagg cgatgacgcc 10560
gcgctatggg gctttggccg ctcgctagca aatgaagcgg ttggccatag cgtcacgctg 10620
atcgacctac caggcacacc cagcgatgcg acgctaaacg cgtttgcagc gtcacttgcc 10680
atgccagata atgaaaacga gctggtaata accgttgaag gcgaacggtt tgccacgcgt 10740
cttcgcaccc tgcccgcgcc tcatccagag aaacaggcaa gcgctgcgcc tcatcaagca 10800
atgacgctgg gctttacctt gcctggacaa ctgcgccagc tgcagtggcg gccacgcccg 10860
ctgcctgaac tgggtgcaga tgaggtagaa attcgcgtca aagcaaccgg cctcaacttc 10920
cgcgatgtca tgtacaccct tggcttactg tccgatgaag cgattgaaaa tggctttgcc 10980
gggccaaccc tagggcttga gttttcgggg gaggttctcg cggttggcgc caatgtccag 11040
cacattgcgc ccggccaagc ggtcgtaggc tttgggccag ccagcttcag cgaccggctg 11100
attgccagcc agcatgccgt agcgccactg cctgaaggcg tgagctatgc cgccgctgcg 11160
acgattccta ccaccttctt tacggtgtac tacgcgctga aacatctggc acgcctggag 11220
cctggcgaaa aagtactgat tcacggcgcc gctggcggcg tagggatcgc cgcgctgcaa 11280
attgcccaat ggctgggtgc cgacatctat gccacggtcg ggtctgaaga gaagcgcgac 11340
ttcctgcgcc tcatgggtga agaacgcatc tacgactccc gttcgctgac gtttgctgaa 11400
gagatcctag aggacactca aggcgaaggc gtagatatcg tactgaactc tttggcaggc 11460
gaagcgatca accaaaacct ccgcgcattg cgcccgtttg gccgcttcct agaattaggc 11520
aaacgtgact tctatgaaaa cacccatatt ggcctgcgcc cgttccgcaa caacttgagc 11580
tacttcggca tcgactccga tcagctgatg aaagtgcagc ctgccctcac ccaacgcctg 11640
ttcggtgaaa tgatggcgct gtttaacgat ggcacattaa gtccgctgcc gttcacagcg 11700
ttcagccaca gccaggtgat tgacgccttc cgttacatgc agcaagcacg ccaaatcggc 11760
aaagtcgtgg tcacctacga acaacctatt gcgccgccgc gtgacgaact cttaggcacg 11820
ggcgccatga cactggctgc cgatgccagc tatctggtga ccggtggact aggtggcttt 11880
ggcctaaaaa ctgcccaatg gctggtcagc aaaggcgcac gtcagcttgt cctgctaagc 11940
cgtagcggcc ccgctagcga agaagcccag tcagctatcg caaccttcga agcccaaggc 12000
gtgaaggtac tagcagcagc atgtgatatt accgatcacg atgcgctagc gagcgttatg 12060
ggacgcgtcc aacgcgaact tagcccgctg cgtggcatcg tgcatgccgc gacggtgatc 12120
gacgacggct tgattcgcaa cttagatgct gagcgcattc aaaaggtact ggctcctaaa 12180
attgacggtg cccgtcacct ggacgtcctc acccgcgaca ttgagctaga cttctttgtg 12240
ctctactcct cggctaccac gctatttggt aacccagggc aggccaatta cgttgccgct 12300
aaccactggc tagaagcctt tgctgcccgc cgccgcgccg ctggccttcc tgccacctgt 12360
gtacgctggg gtgccattga agatgtcggt ttcctggcac gcaacacgcg cacacgagat 12420
gcgttgcaag agcgcttagg cggttctgcg ctgcgctctg atgatgccct caatgtgctc 12480
gagcaaatgt tgctaacacc tgggccaagc cttggtgttc ttgagcttga gtggggagca 12540
ctggcgcgct tcttgcccac agcccaagca ccacggttca acgaaattgc ccgcgccagc 12600
gatgatgatg gcagcattga ccacgacgac gatatcagtg ctctactggc cgacctttcg 12660
cccgaagagt tacatagcac cattaccgac ctactgcgcg cagaactggc cagtattctg 12720
ttgattgatg aagagaaaat cgacattaat cgctcggtgt acgatatggg ctttgattca 12780
ctcatgggcg ttgaattgat gaccgccatc gagaaccgcc taaatgtgca agtaccggta 12840
atggtgctga gtgaggcgtc aacgttgaac aagctggcag ttgtgctgat tcaaaagtta 12900
catcagcatg acaatgatgt tgaagaagcg ccacaagatg cgttagcctc tctggccgct 12960
cgccacgggg cggacgggct caacaatgag acggcttcaa catcgaccac cgagacacca 13020
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cgccccgagc caccagcccc caaacgcctg ctacgtcagg cgctgaggca actcggacgg 13140
ttcccgagcg ctttacacga tttgatgccc acccgggcta tcaacagcta gtcatgatgc 13200
gtcagggcgc aaaacagcta ggcctgatag acccgttctt taaagtccac gacgggctcg 13260
ccggtgccac cagcgtgatt gatggacatt tgtgcatcaa tttcgccagc tataactacc 13320
tgggttactc cggcgacccg cgggttgttc aagcagcatc cgatgcagcg gctcactacg 13380
gcacatccgt atcggccagt cgcgttgtgt cgggagaacg tcctattcac ggtgaactag 13440
aacaggcgat cgccaacatc tatggtgttg aagacgccgt tgcttttgtc agcggtcacg 13500
cgacaaatgt gtccaccctt ggttatctgt taggcccgaa agacctcgtg cttcacgacg 13560
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cagaaaatag catcaatacg tagacgtact tcggtgttgt tgggtaacgg ccattcaata 15060
acatcgccta ctcgcaagcc aattaacgct gcgccaatcg gtgccatcac cgaaatgcca 15120
tcctcgacgc tttcaagcgc atgaggatac accaacgttc gaatcatctg acgctcgcgg 15180
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gggtcaagca cctctccgcg ggccaactct tcttccagta gctccgccac catcatgtct 15300
ttttcagatg cagtatcaat caggcgctga agtcgttcag catcaagacg gttaatgata 15360
ataggaggac gctgccccat ttctactctc cttggaaagc aatcaatagt gatgttagtg 15420
agtgtaaaac gcaccaacga aaacagccct tccccaaagg gaaaggactg tgtcacgaca 15480
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ccactttgcg gaagcccgca atgtttgctc ccaatacaag attgtcaggt tcgccaaatt 15600
cgcttgctgt atccgcacac tgacgataaa tatccgccat aatctgttta agcttctggt 15660
caaccttctc taacggccac tgttccatac tgctgttctg ggccatctcc aactggctgg 15720
tcgccacacc acccgcatta gctgccttgc caggcccata ggcaatttta gcctccaaaa 15780
agacatctac cgcctctttg gtagaaggca tgttcgcccc ctcgctcacg caggtaacgc 15840
cattggctaa cagtgccttg gcatcggctt cggtcagctc gttttgcgtc gcacaaggga 15900
acgccgcctc gccttcaata cgccaaaccg cgtggccatc ctgcggataa tcgcgagccg 15960
gaatatagtg ggcttcggga tgatcgtgca gatagctttc cagcgataca cgctgtactt 16020
cttttaactg ttttagcaaa cctaaatcga tgccgctcgg gtcgtgaatc atcccttttg 16080
aatcactaca ggtaactggc ctcgcaccta gctcatatag cttctcaata gtatagatcg 16140
ccacgttgcc cgcgccagat accaagcatg ttttaccacg caaggcttca tctttagctg 16200
ccagcatgtt ctcggcaaaa tagaccgcac cgtagccagt ggcctctttc cggccaagag 16260
agccgcccca gtttagccct ttcccagtca gcacgccttc gtaacgcccc gttaaacgct 16320
tatattggcc aaataggtaa ccaatttctc gcccaccaac gccgatatcc ccagcgggca 16380
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gaaacatcac ttggcgttcc ggctcaacaa tacgctcaat aatgctgtgc tgatggtaat 16740
gcggcgcacg ctcgaacaac gggcgaagac actcaagcac ttcctcagtg gcttgataaa 16800
actcagtttg tgcagggcta cttttcgcta aacgcgtcag cgtatcgtgg acataaggca 16860
t 16861
<210> 2
<211> 22861
<212> DNA
<213> 盐单胞菌（Halomonas bluephagenesis）
<400> 2
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aaagtcaaag atatcatccc tccttcccag tcgaacatta aagctttgtt ttacttgctc 120
catatccctg taaacccact ctttcggata aatctcatcc gcgccttccc atggcaatac 180
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acttaccgaa agaatgaaat caaccccagc ataccattga ggcatatcat tgccgtgagg 300
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ataccaagcc atttcttcgg gccggtgcat gaccatccag gcgaagtctt ctggccgctt 420
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ggtgggttga cgcggtaccg cttgcatggc gtcgatatca acgccgttat agatgaccac 600
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cagcaccgag ttgacgttaa tctgcaccgg atgagctttg taagcctgga tcatctcctc 1800
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tattcttttt attggatcag aaaactttat ttttggcggg tttgaattaa cttgaaaaaa 13800
aggattagta gaaatagcat caaaatcatg ggcgccagat ccaataatta cattgcgacc 13860
aatactacag taacggccca ccataacgct agatctaata aaaccgctat taaaatagct 13920
ggaaaaacca aaactgaccc caccatgcat ctctactttt ccaagcatca cttcaggttc 13980
atagcgaaaa ttatcgtgtg gcttaaattc tttattatat tttaaactca aaactaagaa 14040
ctccatgacc taacaatcaa cactcgtttc ataaaactca catatcaatc attcacgtta 14100
taaagatctt gatatagttt ttctaatagc aagatcaaca tccgcgataa cattatccac 14160
tccaaaaaaa tctaacgaat tgtatccagc ggaacttata cgcgaccaaa tatcttcacg 14220
ctcatataga tttttacata cttcgccaag ctcaaaaggt gatgctacct ctacagaaag 14280
cggagataaa tactcactta atgactgcgg catttctcgg tgtataacag gagttccaga 14340
aaccatagat tccaaaggaa ccatttcaaa tgtagctcca ggaacaagac acacagtaag 14400
cctaaactta ttcaataccc gccctatgtc ttgagtgtaa ggtatcactt tcagatagtt 14460
gagtggaaca ttatttgtat ggtaatgctt caatacataa atattgacat gcggcagctt 14520
aattctaatt tgctcaaccc actttgctaa gtttccgttt actaaagaag agttactaag 14580
ctttgcaaga tcgccaagga atattccctc acgctgtgaa taaggtttat tctcgtacct 14640
ctcaagtgag atagttttcg gaaaaggaac aatcatctct ttggtttttt ctttaaaaga 14700
gtattgcgtt gagttggaaa aacttgcaaa aaatattttt ggtttttcaa actctgaatt 14760
caattcccat agtttgtcct cgatccatgc tgtcctttgc ttattcaaat taaacgataa 14820
attaactgca cacacgcagc cctctactgc taatttttta atatactcaa tgcagtcacc 14880
aaaatctggc ctatctggat caggagcata agccaaacaa aagtcatatt ttctgtttac 14940
ctcacattca ttaagttctg aaaggcaaca cacatcaact atatgcccta gtttctcaag 15000
cccatttttt aataaatgag agcttttaaa aacccccccc ttaacattaa ttttaaaacg 15060
accaacaatc aaaattctta gcttagtatt tacgtaatta acgctccaat ccgtagcact 15120
aactatctta ttttgctttt cttttgtatt atgccttgat cccttgatgc ttttagagct 15180
gtgctgatat atagaaaact cttgactggc atcagactca taaatctctc cttttttatg 15240
ctcgataact acaaaaggta ttctttgttc ttgacccaaa accgcaaagt atatatctgc 15300
catattgggt gatttaaaat ctgcaaatga tacattaatg tgggaagtat gaaaccccat 15360
acaacctgta cccaatacat gtaccggcgt atcataaggc ctcggagctc caaaagaaaa 15420
cactcgacgt gagtccttat tgtagtaatt tacaaaaggc tcaagtatta cactgccatg 15480
ccaaccgaca actaccggat aattataatg ctgaattcgt ttgacaatcc tgttgataaa 15540
gtcttggggg tatatcaaat catcatcaca tgtaaaataa tatccatcaa aatcatcaac 15600
ccaataaaac tttcctgcat cacctatttc tctagagaag tcactagata acttgtatgt 15660
aattttttca ttattttcaa gaaactctgg aacagaatcg tatttatcta agaaaacacc 15720
tatcctatct acttgatcaa tcagtgattg aacggtttgt ttcaaacagt taactcgctg 15780
aggtatcgag gcaatgccta cgaaaatttt atcattttcc ttatgataaa agtcaccact 15840
ccatgaaaca ctaacgtctt tctttacgac taaatcacgt tcataattgc cattaggaga 15900
atctatcttt aagccttcat ttatcccaac cgacagataa tgtagtaatg cccagtcgcc 15960
tttcctgaaa aaccttgaat atcgagcagt atagtccgca ctagaaaatt tcggccctgg 16020
atcacgcaaa agacgatacc catatttcac gaaatgctgc aaaggagata agtcaccttc 16080
aaaaacatca ggatattttt cgcaatacca tttgccatcg aaaaaacccg actcttcaac 16140
taattcacat acttcttttt tactaagcaa aacttttccc ctataactaa attacatgta 16200
aattatattt tcgccgcaag ctttaacaac tttctttata tctacaaaag tgaaaatttc 16260
cttacagtaa gagaaaagct ccctcccctc ctgaacaaac tcattatgct taacagtcac 16320
aacaactgca tcatagtaat ttttcttcgg cacactgatt aaatctaacc cgtatatttc 16380
ttttgcttca tttttatcaa cccaaggatc ataaacgtcc acatgtaacc cataggattt 16440
aagctcttta ataaggtcca ctactttact attacgtata tcaggacaat tttctttaaa 16500
ggtcatgccc atcactagca ctttggcacc tttgatcaac tggctttttt caatcatggc 16560
tttgatcaat ttagaggcta caaagcgggc catgccatcg ttgatttcgc gcgctttacg 16620
aatcatatca gggatgtggc ctaccgacat ggatttatgt actaagtaat acgggtctac 16680
tcctatgcaa tgaccaccta ctaagcctgg ttgtaacttg ataaagttcc atttggtagc 16740
tgcggcctca attacatcat tggtatctat acccaggtgg ctgaaaatca ttgccagctc 16800
attgataaga gcaatattga catcgcgctg ggtgttttca ataattttag aagcttcagc 16860
tactttaatg ctgctggcct tatgggtacc tgcttcaata atggtgccat aaagttggtc 16920
gacaaagtct gctatttcag gcgtagagcc agatgtcact ttcataatct tagtgacagg 16980
gcgctcttta tcgcctgggt ttatacgctc ggggctatag cccgcataga aatcctggtt 17040
gaatacaagg ccggaaacct tctcaacaac aggtatacac tcttcttctg ttgcacccgg 17100
gtaaaccgta gactcgtaaa ttaccacatc gcctttgttt attacacgcc caagcatttc 17160
agatgctttc actagtgggg taagatcagg ctggcggtgg tcatcgatgg gtgttggcac 17220
agtaacaatt aatacgtttg ctgctttcag gtcttcttca ttacagctaa aagcaagatt 17280
gggtgcagca gccagctcgg cctcacttac ttcacgggtg ttatctttac cctgcattaa 17340
ttcttcaatg cgcgtctttt taatatcaaa accaatggtc gggaaatatt tactgaacgc 17400
gactgccaaa ggtaaaccaa cgtaacctag acctaaaata gcaattttgg tattttccat 17460
ttgcatggcg cttcttactc ctgattatgt ttgcagtgcg ttaacgatac ttgaatttga 17520
taattcaagc agaaacggta ttatcttttt cttctaatat gcgggttaaa atcgctagct 17580
ccttaaagcg ctcgttgata ttggcgtctt tttcacgtag ctggcgctgc atatcgcgca 17640
tctgctcgtg caatttttta acttctgcac tttcaatgag tgaattaatc gttgatttct 17700
ctttacctga tgctacttgc aggtatttgt cgcataagac aacattaacg ctaaaaagtg 17760
tttctccata gagctttgct gctttttggt aaagtttttt agccgctatg taatcacctt 17820
cattgaaagc ggcgtgtgcg cgtataacga gatctttttc catgatgttg gcccgtgaat 17880
agtgagtggt gaatagtgag tggtggatag taagtggcga atcatccggt tgggggcaaa 17940
attcgattct cggctccgct actcaactct taggctgtag gcattgggga gtgtcaacca 18000
ttgggcaggg cgttggcggg tttcgagcag cgtatcccaa taggagacta aattgctttc 18060
ctgtggatag ctattgctct ccagcacgat atctagccgc tgcgtgggca gttgctttaa 18120
taatagcggt aaggctactt ctcggctgtg gcctgcttca ggtagcgttt cccctacaat 18180
gatcagcacg cgggcatctt ctggcagcca ttgattaagc cgttgcaacg tggtttccgc 18240
tgagtaaaac agcgctgttt ggtcgttggc ctggcactca ccccatgggg cgtaaaccac 18300
attcaccgcg tggctaaggc gcttgttgtt taagcgctct ttgagttcgt cactgaccgt 18360
tttctgatgc tgaatgctca ctatggtttg cggtaaatca tcgtgagaaa gcgtcacttc 18420
attatgagtc tcttgccgct ggccgttttg cctaattaag cgtggttgct ctgtccgggc 18480
attgataatg ctctgagcaa gtagctctgt ggtgttcaag ctgccgaaaa tcaccaccac 18540
atcatgatgg tgggtatcat agtgtactag cagcgccata gcgtaaccgg gcgcaagctg 18600
agtactgaca gggcgctgcc catgttgcaa atagtgcgtc agtgcctgct catcacgctg 18660
ttggcgggcg cttcgggtaa cgtgctggcc aagcgcgctg gtcgtttgct gaatgtagct 18720
gcgctgttcg ccgaacaatg attccagttt gctttctaac tgcccaaaac gttcgttact 18780
atgctttaac gtagctagct gttcgctgag ctggctgatc atagcgtctt tttcagttag 18840
ctgctgctgg gcctcaacta gtttagcctc agattcttca tgctgttttt tactattggc 18900
aaagtagcgc tggtaattct cgcgttcttc ttcactaagc gttaaatttt cttgaaggct 18960
ttctgactgg gcctgctgag ttgttagctt tgcctgcagc gctttaattt gctcagcgcc 19020
ctcttctgct tgctgcttgc gattaataaa ccaagcgtga gtttcttcca gttttttcag 19080
cgctttctgt tcggattgaa cagcattttg taactgctgt tctacagctt catatttctg 19140
tgttacatct ttaagtcttt gctcactttc ctggtgttct ttttgatgct gctggctaac 19200
tttaatcgct tggtttagct gcttcttcag cgtatcgcgc tcttcggtta gctggcttaa 19260
ttgggtatca cgctcggcta gctccgcgtc tttttctttc aactgggcat ctttttcttt 19320
cagctgttgc tgggcttttt gggcactctg cttgctgttt tgctcggctt ccgcaagcgt 19380
tttcttgagc gcatcacgct cttctgtcag ctgtttaagc tgactagcac gctcacccaa 19440
ctgggcatct ttttctttca acagttgctg ggctttttgg gcactctgct tgctgttttg 19500
ctcggcttcc gcaagcgttt tcttcagctt gtcgcgctca gtgcttagct gttcaagttg 19560
gctagcacgc tcacctagct gtgcatcttt ttctttcagc tgctgctgag ctttctcgtc 19620
gctttgcttg ctgttttgct cagtatccgc aaggattttc ttgagcgcgt catgctcttc 19680
tgtcagctgt tgaagctgac tatcccgctc acccaactgg gcatctttct ctttcagctg 19740
ttgctgagct ttctgtgcat attgcttact gttttgctcg gtttcagcga gcgctttctt 19800
cagtgtgtct cgttctgcgc ttagatgact aaattgggtt tcatgttcag ccagctgttc 19860
ttgaacagct ttcaacttgc tatagagagg gttacgagta agctcgatga ggaaaaaatc 19920
tgggtcttca gcatcttgaa caccaacctc aaaaccatgc tgttcacacc attgagccag 19980
ctcaacgttg gtggccattc cctcgtaaag actcagcggg ctggtacgca cccaaagatg 20040
agttaactga tccagcaaac ctgagtgatt aaatacttgt agcaagctga gagcgatttc 20100
cggttgctcg ataatcaaat gggttagcgt ggcttggctt aaaccagcct gttccagcgc 20160
ttgaggaagc gtttgggtat ccacggtttg atggcgagcc ttacccaacc ctggatagag 20220
actggttaac tcactagcag gagccaagct gttaaagtct ttcagcgtat aggcatagca 20280
caccgcctct ccaccggggg gggtcactgg ctgctccgta atgtgcaaag caggcaagtt 20340
ttttgctaac gcctgctgac gatcaagcat aggggaaagc ggtgccaata atgtgacttg 20400
gtttacatgt tttagcagcg tttcgctttc ttcacgtagc gggccaatgt gtactagcag 20460
gtcaacattc tggctcatgc tttagccccc ttcgctattg tttgaagcgc tgacaactgg 20520
tattgaggtg ggtgtatctc gcgattttcc tcttttccat agcgaaggta atgcagcaac 20580
ggatgctggc cagaggcagc gacatcttca tagtgagtaa gataaaactc agtactgaac 20640
agtggccctg ggtggcggcc atcaatggca ccaaacttga tgaaatgctc agcgggtttg 20700
atattggcct gagctacgtc tgggtattgc ttacagtacc actcggcatc aaacagcggg 20760
ctagcttcta gcatggctac ctgtgagggc aacgccttct tgtagctgcg gatttcgcgg 20820
taagctacag ctgcgtggcg ctgggcatgc acacgtagcc actgcaccaa acgctctagg 20880
cggtgtatac gctgttcact ttccgtgcgc agaacgttga gttctgtttg gcgcttttcc 20940
agctgctggc ggagggttat ctgctcagaa gcgttctttt caagctcttg ctggttttgc 21000
gggtataccg tgaatagctg ctcagatagt gcttgctgtt ctacatacaa cgtttcatac 21060
gcctgttggg cctcctgcag ggtactcagc aattgcacat tttgcgctgc agtgagttcc 21120
tgctgggcaa tcgcttgctc tctgtgctca aaatcagtgg ccctgacttg ctgcaacata 21180
tcgaatattt cagcggcttc tatttgcaca ttttgcagcg cctgcaaaat gactgcttgg 21240
tctttctgct ctgtctccaa aacctgttta agtgtttggt tttctttttg cagcgtttga 21300
acatgttgct gaatagcact ttgttctttg cgctgagtct caacgttcat cttaagtgtg 21360
tcagaagcct gtccaagtgc ttcgttttct tttttcagca cctgattgtg ttgctgagta 21420
acatctttct ctttgcgctg agtatcaaaa gcttgcttaa gtgcttcgtt ttcttttttc 21480
aacgtttgaa gatcattgat tccttctgct aagaattctt gtgtgttttg gagttgttgg 21540
agcactaggg cgtactcatc gtgggtacta ctcaattcac ctttcaggcg ggcaatatcc 21600
tgctgctggc gttcctgggc ggcgtctgcc tcttttagcg cacgaccatt tcgctggcct 21660
tgctcactct ccgcttgccg agcgtgatat tcgctcagcg ctgcttgagc catctctgcc 21720
tcgcgcgcct ctacaaccgg gcactccttg ctgctggctg ccaagtaggc ataggtatct 21780
tgtaatgctt gagattgact gctcagatac gccgctgcta gttgatatat cggattttca 21840
gagcggtcta tcactggcgc tttaatcact tctaattcac agccaggcat gtaaccagcc 21900
aacgtcactt gacggcgagc tgagcgaaaa agcgcgagta aacgtttagc ttgcgacagc 21960
caatcactta acgcttcctc gcctgttgtc ccggttgcca ggctagccgc cagccaagca 22020
acaggctgcg gccaagcgat gatacatgca tgcgctgtct cttttttcag ccagctttta 22080
agtgacgcta acgcttcttc actaaacata tcaatcacca gcaattggtc ttcaacggtg 22140
ctggcttcat cagtgctggg ctgccccttt gcaatgtcgc ttaacgttag ttcagtcgcg 22200
ttttgctcgc gcagggcggc gcctgattcg gccttgaatt tatctattcc tacgtacacg 22260
actaaggaca tggtgagagc agctccattc ttttctttag caatcattaa ttttaattaa 22320
aacgaggggc atttggcaaa cttaagcctt gtttatcttt ggctgaaagc atgggtgccc 22380
ggctgtttac caacggccat tgaatattaa gtgtggggtc atcccagcgc agcgatactt 22440
catcccctgg ggcgtagtaa tcggtgcatt tgtactgaaa ttcggcttgt tcactggtga 22500
cataaaagcc atgagcaaac ccgggtggca cccataacat ttgcttgttc tgctcgctaa 22560
gcattgcgcc aacccactgg ccgaaggttg gcgaactttg gcgcatatct accgctacat 22620
cgaagacttc accttgggtt acccgcacta gcttgccctg cggctgttgg tgctggtaat 22680
gaaggccacg cagtatgcct tgggcggatt tactgtgatt atcctgcaca aaggtgtgat 22740
gcccacagtg ggcttcgaat tcgctttggc gaaaggtttc catgaagaag ccgcgctcat 22800
cgccgaagac ttggggggta ataagcacaa catcaggaat ggcgagtttt tcgtattgca 22860
t 22861
<210> 3
<211> 14851
<212> DNA
<213> 盐单胞菌（Halomonas bluephagenesis）
<400> 3
ctatcgttcg ctttgtcgaa gctctaaatt tgcccgcgca tctttagctc tgttgcctgc 60
ttcttgaacc gcttttttcg ccgcgaccag cgccgcttta tcatcttgct ctttggcatc 120
agccagggtt tcttgagcag cttttaaatc ggcatggcag gcttgtaggt atttacgagc 180
gcccacaaca tcgctaggca gttcggcatg acgtttcttt tcatcgacat ctgagtgata 240
ggcagcaatg gcatcattga tatcgtcata ccagtaggca ttaccctttt tgagataaac 300
ccctgcctgg cagaggtcct tcaaaatgcc ttctgagtga gacaccatta tcaaagaggc 360
ttggcctgtt tttgcttcaa ataactcttt ggctttggct ttaaatgcac gatcgcccac 420
ggcagtggct tcatcggaga tgtagacgtc aaaatcaaac gcgagcgata gaccgaaaga 480
aatacgtgat ttcatacccg atgagtacgt gcggattggc tcatcgaagg cagggccaat 540
ttcagcgaac tcttccacga acttgataac tctcttgact tcttcggggt cactgccttg 600
cacgcgagca acgaatttaa cgttttggcg ccccgtcata ttgccctgca taccaccaga 660
aagccctacc ggccaagaaa cacgactatg tctaattacc tcgccgcgct cgggggtgtc 720
cataccagca attagacgta aaagcgttga tttacctgcc ccgttcgcac caatcaagcc 780
cacactgacg cccataggga ttgtgaaatt gacgtctttt agtacccaat tactaccgtg 840
gtgattgtgg tagcgtttgt agagatgttt gatttcaatc attttaaatt cgtgaatagt 900
gagtggtgaa tagtgaatag gaaattcatg ggcaagtaag tttcaccgac tctttaggtg 960
tttaataggt agcaagcggt aagcgaaccg cactacaaat tgatatcaag cggtttgctg 1020
ttgcgctgat aaagcgcttc tagttcattt ttgagcgcgt gcttggcggc ttggtcaccg 1080
tgcacaaggc gtatggtatg gggccagcgt cgcatgcgct ttacaaaatt aagcaggtct 1140
ttttgatctg catgggcgga atagccgctg atggtggtaa tgccagcatg gatatcgatg 1200
cgctgaccat ctatttccac ccaaccgccc tgtgggccgt gttgctgtat cattcgtcct 1260
ggcgtgcctg cgccttgata ccccacaaac aatacctgat gacgcgcatc gcttagcatg 1320
gcttttaggt agttcataat gcggccacct gcacacatgc cgctggccgc aatgactacc 1380
gctgggcggc tggttttcgc taagtattgg acagtttgct cgtgagcttc gtggctttct 1440
acggtgtaga gattttcgaa actgagcggg tgacggccac tgcgtaggcg gcggtgggct 1500
tctttatccc aatagggctt tagctggcgg tatacgtggg taaagcgggc agcaagaggt 1560
gaatcaacaa tgatttccaa gtcttgccaa cggctttgct tgggcttcga tttagcctcg 1620
aaaataatgc cttccagctc gtatagcagc tcttgggtgc ggcctatgct aaaggcaggc 1680
accattaccg tacccccgtt agcgagggct tgttcaatgg cattttttag cgtggcacgc 1740
cgtttgcggc gaccttgatg ctggcggtcg ccgtaagtac tttcaaggac tagctggtca 1800
caactataag gcgacttagg cgcaggcagc aatggtgcat agggtgcccc taaatcaccg 1860
ctgaagacaa tgcgctcttt gtggccattg gcatgctggt gggcgatctc tacgtagcta 1920
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tccacatttt caccaaccaa ggtgtgccac ttaccgtagg gcacactgac gatttgtgat 2040
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ttataacccg ccgccagcag gtaaggtagc cgccccacgt ggtcaatatg tacgtgggta 2220
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agaataagct ggtgacagct acccgtcacc cctgccgcac caccatgatg gataatctca 2400
agcatcgaaa ttcctttttc ggtggcgcta gttggcgtcg gtgctgatat tgagcaggta 2460
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tacatatttg cctttcaggt tatgtggcat ggcgcttcta ttcgcgggtg cctcatttgc 2580
tcgtgcctcg caagattcgt tacaccgcgc tacacgtttg cctttcgggt tatgtggcat 2640
ggcgctacac gtttgccttt cgggttttgt agcgcgtggt aagcgaagcg cccccgcggg 2700
caatgtgcag cataggcacg gcgttagatt tcaggcagct tgacttttca aaagtggcca 2760
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cagcactaaa atatcgtctg cctcatcgta agtagtccgc attacttttc ctcccactca 2940
aaatgatgca ttaccgtttt cactacaatt ttgtcctcta ggactgctgc aacgcataag 3000
agattgtctt gcctattatc aaaatttttt gccacccaca ctcgcacatc atctttatgc 3060
ttaaccgtgc ctgcttctat caattcgatt aactcaccat catttatgtt tctagcagcc 3120
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cttttaggcg gctgcgccgc ctgatattga gcaggtaaca ttgcggggcg gctacgccgc 3300
cgttgcgggt gcctcggttt cgctcgttcc tcgcgacctc gttacgccgc actacatatt 3360
tgcctttcag gttatgtggc atggcgcttc tattcgcggg tgcctcattt gctcgtgcct 3420
cgcaagattc gttacaccgc gctacacgtt tgcctttcgg gttttgtggc atggcgctac 3480
acgtttgcct ttcggttttt gtagcgcgtg gtaagcgaag cgcacccgcg acctcgttac 3540
gcggcgctac aaaattccac cttaatccct gtggtccttc acaatcatca tgatcatgct 3600
gaaaatgaag gctaagaaga tagtgatgat ggcaaataca ctgctgttgt aaaggcggtt 3660
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ccccgttgct tgcgctaggc ggtcacgctg ctcgacgatt tgatctcgca atgcggtgat 3900
gctgcgctct acttggcgta gctcagctga ttgcgagctt tggaaactgg ccaacgcgtt 3960
acgttgcgct tgcaaacggg ccaagtcgcc ttctagcgta gccactactt ggttgatgct 4020
ttccaccgtg gaggttggcg atactaagcc gtactcgttt tgaaattcga gcagctcagt 4080
gcgggtatca cgaaaacgat cttccaggcg aatcatctgc tgttctaaaa agcgaacctg 4140
ctcttccgct aagcggtggc ccattgtatt catgtggttt tcgccagcgt ctagcagcag 4200
cccagccata tctcgggcga attctggtgt gtagccttgg acgtgaatat tcagaacgcc 4260
ggcatattca tccaactcta cctcaacccg gcgcagatag tatttgtgca agtcttcaat 4320
ggggacatta gggtcgcgca gcttggcaaa aatatcgccg tgttcgctgt agtgctggcg 4380
aatatcgagc tgctcatcaa gcaggcgcag catatcaaca gaaagtagat gctctcgaag 4440
cagcaaaaga tcggccgtat tccccccacc gccgcccatc aaggaggaaa ggctgaattc 4500
cggcgtggct acctgggggc tttctagcac cacggtagcc cgagacacat agcgctcttc 4560
tgcccataca aaccaataaa aagacactag caaaatagca ataaatgcta acgcccagtg 4620
gggagatgtt tttacaaatc gacgcaggga aacttgcatg aattattttg cctttaactt 4680
atcaacaaag cgcaggtgca tcagcaaacc tagcgatatt aaggtgaaag tgaacagcca 4740
catgtaaagc atgctggtac cttgcaccac ttcataattt tcgaaaaacc ctaagcgaag 4800
tgtttctaat ccatgaggaa tggggttcag cattaagtat tccagcagcc agtgaggcag 4860
actatttaat ggcaaaataa caccagaaat aattaatagt ggcagcgaaa tcatgcgaat 4920
gacaatacct atttcaggca ctaatgttgc agcaacagat gtgaccagcc ctgcccctaa 4980
gcctaaactc caaagtgaca accaagccgc aatagcgcgt atcgcgttat ctgggtacat 5040
atctagcccc agcattaatc caccaccaat aaagatcaaa aaaaccaaac tgcgtaacgt 5100
tccttcaaga aaattacgca ctaataccgg gtcaatcggt tgtacttggc ggtaggcaaa 5160
cagtgcttta ttaccatcaa ttgcacccat gccgcgaatc ataccctcac gcacaagaaa 5220
aaagcccatc atccctgtaa tcatccacgg cataaaggga gcattagtaa ttaggcgtcc 5280
accaccaccc acaaagctac gaatacccac cataattgcc accagggcaa acggctcgaa 5340
aaccatccag aaccagccca tgcggtcgcc catggtgcgg gagagcgctt ctcgcacgaa 5400
catggcgtac caaacgctac gagtgacttg ccaaggcgtg cgggcgcctt tcggcgcgcc 5460
ttttacattt gccatagctc tacttttaaa taagtgagat gtgaggcgtg aggcgtgagg 5520
tgttagtggt tttacccctc acacctcacc cttcaccatt tacagatcaa ctgcgacgcg 5580
agtagcgaca gcgatttgga acaatatctg cgtgagcgta gaggctagct gcagattgtg 5640
ggtaggtgca gcgggcatga caagaatttc atccccaggg cgcaagttga cgttgcgagc 5700
gttttctact gcaccgttct gacgaacaac gagaatgtgg tcttcatcgg cgcggttggt 5760
gaagccacca gcactttcga tgtaatcaat cacattcatg ccaggacgga acaccgctgc 5820
ttggggcacg agtacttcgc cgctgatgag catggagtca ctcaactcag gaatggtgat 5880
gacgtcgcca tcctgcagac ggatatcgga aatacggtcg ttgtaggcaa ccaccaaacg 5940
gccacttggt tctagctcgc gggcacgctc aatgaagttt tggataagtt cggcttcttg 6000
agcgcgaatt cgagcttctt cattagtgct ggattcagcg cttaggtagg tggtttctaa 6060
gcggcgtaag ctatcttcca tggattgctg ttgctgctgc ctgacgcttt cacgctgtag 6120
cgagatgctt tccactgcgg tcatgttttc aggcaccgga atggcatcga gtagttcgct 6180
taagcgtgca tcacggggta acgcgtaacg tgaaggcccg tagtaactgc cttccacttc 6240
aaccacgatg gtttcactgc gcttatcggc actgaacagg acttcatcgc cgctacgaat 6300
ggtttggccg tagaacatat caatcgggaa atattgggca atgggcccct cttcccggtt 6360
gccgcgtagc agaacatggg aaacaccact tctcaagcgc gccagattaa ctaattcagc 6420
gccacttaat tggttgccca gtagctcata acggtgctcg cggtgcacat caccccccac 6480
tgcaatcgcg gggccgcgct cttctaccac aatggtatcg ccgtcttgaa actgcggacg 6540
ggcaatagag ccattgataa ggaagtcgta gagatcgacc gtggcaacag tgcggtcgtt 6600
acgcatcacg cgaatttgac gataactgcc taagtcttgg tcgataccgc ctgcttgatc 6660
gaggaaatag agcaccgagt cgtttggtgt gcctgcaaaa cgacctgggt tttcaacata 6720
gcctgtcaca aaaacagcaa caggttgaac accctgtacg ttggtgtaga cctgtacgtt 6780
ttctggataa accgacgtaa tggcaccgcg cacactgctt tctacttgct ggctattttg 6840
gccctctaca tttaatgggc cagaaccagg aataaagata ttgccctgag catctacagg 6900
tatcactcgt tcaaactcaa acgctcccca ggcgcgcacg gtaatttgat caccgggctt 6960
tacttggtag ctagcgttca ggccatcgcc catagcgcca cgaaacccac cgctaaacag 7020
attggcccca aacggtggta acgcatcagg gttttgcggc tgagcgctaa caggcccata 7080
ggtgccgctt cgccaatcgg cgcggggcgt atcatccacc tgctcttgct gctcgcgagc 7140
ctgcccttcc ggcagaatag tattgggcaa gctaatgctt tgcgcccacc ccgaactgct 7200
tatggcactg ctgatgacaa caaaagaagc aacggcaaga gggcgtttaa acgaaagccg 7260
tttaaggaga cgaatagcgt tcattagtag cgcccttgtg ctgcagagga tgtaacggag 7320
gtgctttgac tcagcacccg ctgattaacc cagccattgg gagtttcgca agtgagggcg 7380
gtgcgggcag cgctgcctcc ggcttctgtt acacgcagtt gcctgcacgc tctgccgctg 7440
gcgggtagat agggagcacc ggcaatgatt tcgacgttat caccccaagg gctgcgcact 7500
aggttcatga ctgccccggc tggcgcttga gatagaaagc cattgaggtt gtcgtcaccc 7560
aacagtctag ctgagtcggt attcagcacg tattgggctt gctgctgtgt gctgttggga 7620
taggtagcgc agccgcttac tacggcaacg cttaacgctg ccaacagcat gcgagctggc 7680
cgcgtcagag aaagtaggct atttgacatg atgatttcca gtaaaaaggc acgctaccgc 7740
ccagggattc taacgggcgt attcccttgc cctacgctgt gcggcttaaa aagtggttaa 7800
cctgtgctaa caaagcgatg ccattgtaag gtattaacaa gcgaggctct acgttgacaa 7860
accttataca atcaattaat taaattttgc tacattacca atgatacaca taaaaaaagc 7920
cagctttatg aaagctggct tttttcatca cgggatcaac aacttaaaaa tcaactttga 7980
ctcatagcag gattagcttc cctcgtaagg tttgcataga taccccaaaa cgaggctagt 8040
aaaaaagcat acatcattac accgctgtta tgcgtcagga acgcttgaga taggccaaag 8100
tcgatatagg tgactggcag cagcacccca gcggtagcaa tggcacgaac tgctaagtta 8160
tcggctttta tctgcttggc aaacagtcgc atagggataa tgtatagcgc taacaaaaca 8220
aacaggccaa tcaaaccacg cttggcaaag gcgtcaataa attcattgtg cgcatggccg 8280
tactgagcgg cttcttgatt aataacgccc ttctccccca gcgccgccat cgcttgctcg 8340
tagccgttac ttccccaacc taccaacggt ttctcttgaa ttagcagcgt tgcaccacgc 8400
cacatttcaa acctagaccc caccgaggta gcgcggttct cgcctgagat atacaaattg 8460
acatcactaa ccgcttgatg aacacgactt tgcacaccaa gctgtggcac tgcgtagacg 8520
gcgataccag cggttaatac tgccacaata gccgctactt ttagcttcgg tgaaagccct 8580
gttccgtaag cgcgatatag caccagtaac acgataggaa accctaccca gccacctcgg 8640
ctgcctgaaa atagcgagcc tagtatgccg cccatcgccc ccagcagcat gaaagccacc 8700
catccgttgc gctgacgctg aacaactgcc cacccaagcc ctgctaaaca aagcacccct 8760
aacaacatac ttaggttgcc aaattggata acgtgggtgt ggcctcctgc gcgcgaaacg 8820
ccttcaaata acttttgcca ccctgcccaa ctgccagcag atatcgcccc aacagcgatc 8880
cctccccata aaaaagcgag tttaggaggg tgggcaatta cccaccacag cgcagggacg 8940
gcgagtataa aacgaatggg tttatcgatc cccctactgc cttgtgcatc ccaccagacc 9000
tcagccaggc taaccagtgc ataggccatt aaagcggcga tgacccatcg atcttgggcg 9060
gtgaactgcg gcaaacgcct cattaccaaa agaccaacgc ccgcgaaaaa cagaaccaca 9120
gcccccagcg aatagccact agggatcacc agcgacaagg ctcctaacag aaaaatcgcc 9180
acactagtta accagtgtgg cgtgtatagt gtgccgtttg caggcgaatt ttgagacacc 9240
atcaaagcaa ggttcctaat gactgttgaa cactcgcaaa agccgataag ccttcacacg 9300
ggcttacatt attacagggc ttatactgtc gagccaacca tcaccttgaa aagcgtactt 9360
tatatcattt tgttagtagg cgtttttatt gataaaacct ttaaaaacag tcattacaat 9420
gatctttaga tccagccata aagaccagtt atcgatgtac caaagatcat actcgacgcg 9480
ccgctgcatt ttttgcaggg tgtccgttcc cccccgcaac ccgttgacct gtgcccagcc 9540
agtaatgcca ggctttacct tatggcgtcg catataagac tcaaccagct ctttatactg 9600
ctcgttatga gctaatgcgt gagggcgcgg cccaactatc gacattcgcc cctgcagcac 9660
attgaaaaac tgcggcaact catctaacga tgtgcgcctt aaaaacgcac caattttggt 9720
aatacggcta tcgtttttct tcgcctgggt gacctgccca ttattttcat tgtgcacgtg 9780
catagagcgg aatttataga ctttaaagtg tcgcccattg gagccttctc gatactgctt 9840
gaaaagcacc ggccccggag atgtgagctt aatggctaac gcaatcgccg cacataccgg 9900
caatataagc agggaaatta acgacccgat cacaacatct tcagaacgct tgataaagcg 9960
tgacatgcca ctcattgggg aaacgcttaa atcgatggcg taatggcctg ccacttccga 10020
catgcgatga ttcagcagat gcatatcttg aaaagcggga ataaaacgca cttccgcggt 10080
gtgattacgc agcgcgtaaa acagtgctcg caccgtttca cccatttcaa agggcacgca 10140
gatccacact tcccgagcgc tagattcatt gatacgtcgc gcaatgcgat ctatacagac 10200
atcattaagt ggcgctttaa tacgctcaac accggcaata gtatggcctt cccaagaggc 10260
actacgaatc cctttggcaa catcgagtac gttttgactt ggcccaatta gaaatactgg 10320
ccgacgcgca ccacctcgca aacgcacgtg ccgcagccct aactgaacca gcaaccgcgc 10380
cccgcccgcc attagaaaag acgccactag cgttaaccct atccacagcc ttgagtaacg 10440
ctctgcggcg tgagcgaaat agattaatga tgcggcggta attccaacgg ctaaccagac 10500
caacaagagt tttgccaaca tgtgataaac gggcgtgatt cgccaacgtt tatagctctc 10560
tgacatgctg ttgatcacta acaccaataa agcaatgcag attaacgcca acacataccg 10620
ctcatgaagc tgaaacgagc caaagcgcat gagatgtgcc agccaaccgc ccacaaaaat 10680
ggcgaacaca tcaaaaaacg gaaataccac ctgcggtggg taacgctccg aaaacgtcat 10740
tgtttttgga ttacccatcg ttgttatctc ctgccacgtg tttgttcatc atcggctata 10800
tcgccctgct gcctatccag aatttgactt acgccttgag tgaagacctg ttcgtaatta 10860
aattgcttgc ccaccaagga ggcctgctct gataacaccg aacgctgagc aggtggtagt 10920
gcataaaatg cttctatggc ttcttgcagc ccctcttttc cattgtgata aaagtagcca 10980
tttctcgctt cttctaaata ctcttttgcc gcgtgaagct tggcattagc aatcacgggt 11040
acgccgcacg cgagtgcctc tacagcgact aaaccaaaac tttctttaac agaaggaaat 11100
acaaatacgg aaaactgggc gatttcactc ggaagttttg tgcggggaag cgcccctgta 11160
aaggttacca actcccttac gctgagctga tctgctaacg cctctaacgc atcacgctga 11220
gagccgtcac cgatcatcac caaacgtttg ttgggtattg ttaactccgc aaaggcctgg 11280
agtaattctt ggcagttctt attgggctcc aaccttgaga cgcagccaat tgtaaaaaaa 11340
tcttctgctc tgatattaag ctcactactg gcggcaacaa actcttcccc aatgttatct 11400
gggtaaactt taatgacccg ttcaatggga atctgaagct catgacttag cttttggcga 11460
aagtatcctg aaggggcgac acacaggtca atcctttttt gtatgcgacg aaaaagcata 11520
cgaaacagtg acgactgcat gatttggtct aggtcagtac catggaaacg aagcacgata 11580
taaaagcgct tggccttcaa caaactcgct aaatacaaga taggcagaaa gtagactggg 11640
taatgcactt cgagcacagt tccagttggc tgcttaaaaa gtgacacaca gcatctgctt 11700
agcaggcctg cataaagctt gattttgctt agtgctccgg agggcttgtc tttaatagcc 11760
actagctcga catttttatc accgagcgct tttctccatg cctgctcggt tgagcgcaca 11820
aatgtgccgt agtgcggcgc tgactcggat ggatacatat tagtccaaat caagacatgg 11880
ctcacaacag cgctcccttt atgccaaggt atgtcgcaat attatcgcct agctcgctgc 11940
tgctctcttg atctaccaat gcttcttgtg ggtcgcgcct atcaataagc ttgtttaacg 12000
cactgaagaa ggctgcttta tccgcacaaa attcgagtgt gggatacttt ccactgaaag 12060
cttgagcagt atctagctga tggtcgtttc gatgctcgcc taatgcgtat tgacgcggca 12120
ggaatacgcc tcgcttatca tggtcgaggc atgacaagat actgcccatg cctgtatgag 12180
acactatccc ttcagcctga cagaaccagt ggtagtactg ctcactcgat aatgttttaa 12240
aaatttctat cgaggggctg ctgaagtggc tatcttcacc tatttgagca acaaccttgc 12300
ctgagtagcc cacgtctgtg cgccactctt caaaatattc aagcaatcta tcaaaaggca 12360
gctgggtacc tactgtgata aaaatcataa taccttcccc cagtagccaa cgcgcttgtc 12420
gttcgtggct aggggttccc cctgtgttag gcatacgtca cagaaaaatt ttgcaatatt 12480
tcctgaaaaa gacagctttt gataatttgc catactatcg agccaaataa ctttcttacc 12540
ttttaattta gccacaaaac aaacaataag ccccggcagt gcacccgttg aaataacaac 12600
atctggttta gcttgcttta gcagtgttga tgcctggcga aaggcaccta gaattttcca 12660
tataccgcta tcgcggtgca cattcgtgaa atagagcgca tttacatcat caacctgtac 12720
atcttgttca gttactgcga aaacgaacga cgtattaccg tcattcgctt caccctttat 12780
ttgtttatac aaacgtttaa gctgtataaa atgaccgcca aaagaagcca ccatcaaaat 12840
tctcatttac cttctccttg aaacgaggca cgcttctctt tcaccctata gacataactg 12900
actaaaaaag cggtagcact agatgcgata ccagaattta caacatgccc tgcggttaag 12960
ctgaccccta tcaacgtaat agcaagcagc ataaagcaaa cgctatcttt tggactgcta 13020
gcaaacaact gactggacca cttaagcact aataaccacg ggaagtaaaa aacgagagga 13080
cccacaatac caaaggcaat gaacacatcg actaaatcaa tctcgactaa tgacccccta 13140
actgccaaca gatgatctac accaactccg aaaaacacat caagaaaact gaaatcgata 13200
atcacttggc taaaggcatc ttgtaagaag gtgacgcgac cactaagcag cgctccccag 13260
ataccgccat gcaggctata aagatatata attcgatcaa gcaagccagt tgcttgaata 13320
aactgataac ccagcactga catagcaaac gcaccgccca ggcctaatat ataaatgaca 13380
ggaatacgtt ttacattaaa gtacccgccg tgaatcaaag catataaata ggcaagacaa 13440
atcccaatca tggcaacttt agtggctttc ataaggaaaa aaaacagtag caccagaaat 13500
acactagata gcacccaaac gtttttattt tcggcgatat aaaaaagaac gatacttgct 13560
gaagcgagca ttaaatagct catttcatta ccagcaataa taaagccctt gccacctatt 13620
ccgcctgcgt actgagattc ccctacacca aaaacaccca gagtgacgtt cgccgccata 13680
gcaacaaaat aaataagcat cagcgcggct atcttttctc cactccaaaa gctgccgtta 13740
gcactttcgc ctattagata aaacagcaga gcaagcgtca aaagccctct tacagcccaa 13800
gtagtgcttt ccgttgccgc accgtaaaca aacatttggt aagcaatgct ggctactaac 13860
aacgcgatca tgatcagcag ttgaaaaaaa cgccagggat gatacaccag caacataagc 13920
acaacaccta tgaagcccaa ggctttatag ggagcagata tactcggcat tgccacctcc 13980
tggtaatgga agtagccatt taaggtatct acggctggcc atagcatcaa aaatatcaac 14040
aacgtgatat cgagacaggt tttaaccttt acatccatgg ctaatcgcca cgttgatagg 14100
caacgcgcac ttttttcaca aaaatgctca ttaccgcagc aataggtgca aatagaaacg 14160
ccagcaacag gcctactgcc ataataaagc tcctgcccaa cccaacaggc tccaggcctc 14220
tcactgccag ctgagatgcg tcgccttcat taatactgtc aatccggcgc tctagcagaa 14280
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cagcctctaa tgcttctgag tatgcttcaa actgatattg aagattattc tttagcgtat 14400
tgactaaatt actttgatcg ttttctatcg cttgaacaag gccatcatga aagcgctcaa 14460
taagcggttg atgctcgtcc tctgacaaac tggtcactct tagcagtaga gtatttctcg 14520
gattgttaac actaacttca aaaggcagct ctaaaacact gctatctgac aacatgttac 14580
gttgctgctg ctctaaaaaa acattattaa cttttgcaat aacttcctca ggcgtttcca 14640
accctctctt caccccttca actgtttcat aggaagcgac gctatacatt gttgtaaatt 14700
catacttaac tggctttaaa aatataacta aaacagtaat caatagcact ataactatac 14760
agctaaacat tcccttccac tgtcggagca agagcaccac aaagtcaacc agtgttatat 14820
tttcagcctt acccgcatcg ttgctatcca t 14851
<210> 4
<211> 340
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
gcgcgaattc gagctcggta ttgacagcta gctcagtcct aggtataata ctagtactca 60
catttttcac gcatagtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta 120
tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg ctttttttga acccgggatg ttgacagcta 180
gctcagtcct aggtataata ctagtacact caagcacttc ctcaggtttt agagctagaa 240
atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg 300
ctttttttga acccgggatg actgcatgtg cagctaatgc 340
<210> 5
<211> 340
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
gcgcgaattc gagctcggta ttgacagcta gctcagtcct aggtataata ctagtgttaa 60
tattaaaact tgcgcgtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta 120
tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg ctttttttga acccgggatg ttgacagcta 180
gctcagtcct aggtataata ctagtggggt aataagcaca acatcgtttt agagctagaa 240
atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg 300
ctttttttga acccgggatg actgcatgtg cagctaatgc 340
<210> 6
<211> 340
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
gcgcgaattc gagctcggta ttgacagcta gctcagtcct aggtataata ctagtgagca 60
gcttttaaat cggcagtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta 120
tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg ctttttttga acccgggatg ttgacagcta 180
gctcagtcct aggtataata ctagttaaac attcccttcc actgtgtttt agagctagaa 240
atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg 300
ctttttttga acccgggatg actgcatgtg cagctaatgc 340
<210> 7
<211> 1000
<212> DNA
<213> 盐单胞菌（Halomonas bluephagenesis）
<400> 7
taattagcgt tctattcggg tggtataaca ctctgccagt ggcagtggaa accgcagcgt 60
aaccttcact acccaatcga atagttgcta ggcgtttgaa taacccgctg ctatctaaac 120
taaccacacc gccaatcatg cctccgaacc ggccttcact gtctaatcgc ggcacgctca 180
ctaacaccat cggcatttcg ctagctcggc caacaaaagg ctcgctgaca taaggcctgc 240
gcgtaccttt cagcatttta aaatattcaa gctccgctgt atcaaggccc acgcgccccg 300
caacagctgg ccaatctgac actattgtcc cattgctatc gctaacaaca atggcgtcaa 360
accatgccaa tagcgcatcg tttttgcgca gctcatagcc aagccattcg ggatcatcag 420
acattccaag gacgctactt agccggtcta atgcttggaa acggtggtcg atctgttggg 480
taacttcatc tgctatcagg tcagcttcgt aacgcatgtg ggccatgttg gtttcttgca 540
ccatgatttt acccacctgc cacgccatcc ctagcaccaa gccggccatc aataacagcg 600
cacacaaaag ccccagcagc agccggcctt ttaatgtgct aagaatcggt ttactcagca 660
tcgatttcct aaacatcgat cttatgaaca tcggcgttct gcaggcaggg atcagacgca 720
ccaatcaccc tttttccgta accatttact accactgcgt ccaatgaatc tgccccaatc 780
gcgttgtaaa ccgacaactt accaaaatgg cgtgagaagt gcgcgttggt gtaattcaac 840
gtggttgttt ttttgacatg tatcattatg taacaaagga ccctcttgcc gtaagaccac 900
tttaggctta attgataagc tagacctttt cacgtatgtt cgccgcttta attgtttgcg 960
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<210> 8
<211> 1000
<212> DNA
<213> 盐单胞菌（Halomonas bluephagenesis）
<400> 8
aaacaggcac ccttttatag ttaaaaacgt cgatttgctg gccagagcga tgacgtattt 60
aactgcgagc acgtaaacct gcatacccta tgccggttcg gtataggcaa aaatcgcatc 120
aaaaatagac taaagtggta gctaaatcgc cccgttttgg tgcaattaac aaaatctaat 180
aaacgattta ttaacgaaaa aaagaaaaaa gccccacata ccgtgcgtgg cgtggcataa 240
agaaccgcgc caagaacgag cgaatgaggc acccgtgatt tagacacggc taccctaagt 300
catcacattc aatgtttcta aacaacaagc aggcctacca aacattatca agcagtcgca 360
aaataccgcc ccaccaactg ccgataccaa aacattctaa aaatattgat gacgcctagc 420
aatataggca ataaataaat aataaagaat gcatttttca tagctggcaa aagattaggt 480
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tcatatccac ataaattaac cataacagac tcaacaacac caagctgagc ggtagcaata 600
taaaacccaa gcgcagccac aaatacaatc gatgctaaaa aatcatcaat ctctacaaat 660
acatacaaat aaataaaaat aaagagcgtt aaagaaggaa acaacgtagc gataataagc 720
ttcaccttat agcgcaggct taatacaaac tgactatcaa aatgtttcgc caatatcatt 780
ttagataaag cagccgtgcc gttattgatc acccccctag gaacggcaga gatcgagcta 840
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ctagaaaccg ctttatcttt agatatcaag gctacactat 1000
<210> 9
<211> 1000
<212> DNA
<213> 盐单胞菌（Halomonas bluephagenesis）
<400> 9
caacgttatc agctaaatat aatttcaaag cagacacaat tagctttctt ggtggaaccg 60
catgacctgc accccaattc cctttaaaaa aaagcatctt ctctttgctg taaaaaaaac 120
catcttcgtc atccaagtca agctttttga taaatggctc agcatgaaca gtagtatgcc 180
agtcgagagc attttgaagg taaataaaat ctttattctt taggctgtca ctcttggata 240
ataaactagt gcatatacca atcgcccccc tttcctcgga aaactctact tcacttgtta 300
gctttttctg taaagacacc tcagacaaat gcctccaaaa cctagaatta tatttctcga 360
caaccgtttg acaattccag acaaaagctt tattgatttc gtcactttcg ctcaaataat 420
ataagctcgc aaatccacca ccacttccgc cgaatgagca gaaactaacg cccatcactt 480
ttgccaaatg atttacaatc aatataatag ttttttgagt atttagctct cgccacccca 540
aataccaacc aatatatata tcatccttta aataaataac tggatcaaaa aaagctacta 600
cagatgcacc tatctcctca gctaatgcta cacctgtaaa attaggtatc aaatctaact 660
ctcttgcttt ctcacttaat gctccattaa aggtcaacag agctttatcg ctaaaggtta 720
ttcctctttt gatcaaaaca tcaatcgcgt tacctccaat caatatctga taaagcccat 780
catctattat atttctatca agaaactgat caatagatag cgagtagaaa ctcactttaa 840
atctattcgc agatctttta cctttgttta ttttgctcga aacatcacac acagggcata 900
tcactcccaa acacttccac caaccatccc aaaagctata actactttca tagctatcga 960
aagaattctc aaacaattag attctagaac tttaaaaaca 1000
<210> 10
<211> 1000
<212> DNA
<213> 盐单胞菌（Halomonas bluephagenesis）
<400> 10
atctaaaccg taagaggtga aaggtgagga gcttgatgta aggcttgagg ggtaagatta 60
ctttctcctc actactcacc ccttacttat tacctttcgt tttgagtagg cgttgtaggt 120
attggccata ttgggtttta gcgagtggtt tggcgagctc agctaagcat tcgtcgctga 180
tccactgctg ctgccaggcg atttcttcta ggcaagcgat tttaagacct tggcggtgtt 240
caatcgtttg tacgtattgg ctgggttcta acaagctgtc atgagtaccg gtgtctagcc 300
aagcgaaccc gcgaccaaga cgctctacgc gtaaatcccc ccgctgcagg taggcgttgt 360
tcacactggt gatttctagc tcgccgcgct ctgaaggagt tacctgcttg gcaatatcta 420
ctacgtcgtt atcgtagaaa tacagtccgg tgacggcgta ggcagatttt ggcttttttg 480
gcttttcttc gatggaaata gcgcggccct gctcgtcaaa ttccaccacg ccgaaacgtt 540
cagggtcttt aactagataa ccaaataccg tcgcgcccga cgtatgcgaa ctggcacgct 600
ttaactgatc agagaagtgc tgaccatgga agatgttgtc gcccaacact aagcaaacag 660
aactttcgcc aataaattct tcaccgatta taaacgcctg ggctaggccg tcggggttag 720
gctgttctgc gtattgcagg cgaatgccaa aatcttcgcc ggtacccagc aggttttgat 780
attgaggtaa atcttccggc gttgagatga tcagaatgtc gcggatgcct gccaacatga 840
gcaccgagat cgggtagtag atcatcggtt tgtcgtaaat cggcaggagt tgcttggata 900
caccgcgggt aatggggtgt aaccgcgtgc ccgagccacc ggccaggata atgcctttac 960
ggttttgggt gttgctcata ctcaactcgc tgtaataatt 1000
<210> 11
<211> 1000
<212> DNA
<213> 盐单胞菌（Halomonas bluephagenesis）
<400> 11
tcggtgacga acgtgatcag ttgtttatgt gaatcgtgag tggtgagtgg taagtggtga 60
gaattaccct tcactttgta tggcactagc tcatccaaaa tctcacagat agtctctact 120
acatgtaagt tagtttgttc gttgtgcccg ccgatattat aggtttcgcc tatacgacct 180
tcggtggcaa ctttgatcag ggctcgggca tgatcttcta catagagcca atcccgaatt 240
tgctgcccat cgccatacac cggcagcggt ttgccagcca gggcattgag aatcatcaac 300
ggaattagtt tttccggaaa atggtacggc ccgtagttgt tagaacagtt ggtgacaagt 360
gtaggcaggc cataggtgcg ctgccaagcg cgaacaagat ggtctgaact ggctttactc 420
gccgaatagg gtgagctagg agcgtagtga gtttcttctg tgaagaggtc gtcagtgcct 480
tctaggtcgc catacacttc atcggtgctt atatgatgaa agcgaaacac tgctgcttta 540
tcggcatctt gttgctgcag gtctttccag taagctcggg cggcttctag cagaactgca 600
gtaccaacca cgttggtttg aataaacgca gcggggccgt cgatagagcg gtctacatgg 660
ctttctgctg ctaagtgcat caccacatca ggctggtgct gttcaaacag ctgctgcatg 720
gcaggggcat cgcaaatgtc cgcttgcaca aatgcgtagc gctcattggc agagacgctt 780
accaacgatt ctaggttgcc agcataggtg agcttatcga tattcacgac acggtggtcg 840
gtattcttaa ttagctcacg aataacggca gaaccaataa atcctgcacc accggtgatt 900
aaaaacgttt ttctcattaa ctatctcatt aactatctca ttaactatct caccaactaa 960
ctcatcagcc atctcatcaa ctatctcatc aacgctggca 1000
<210> 12
<211> 1000
<212> DNA
<213> 盐单胞菌（Halomonas bluephagenesis）
<400> 12
acactctctc tcattcctca tggagctttt aaataccact tatgtgtaat gattattatt 60
tctaaccact aattatcgac attgacttac tacgcactca ttttttctat attttttaac 120
tgttgcgctg ggtgcttgtg aacgatggtg ccaacatctt gctcactcat cctcttattt 180
ttttgcggta taaatactgc taatttctag ggttatcata cctgtttgct agcagctatg 240
taactcaacg tagctaaggt ttaccccgac tttcttcatt ttggttcaaa atacgcttag 300
ccgcgacctc aaattttaat acttttcatg agaacgccct atcacaacca tctattctac 360
actgcagttt aacactcagc ggcaggcgca aaggctcttt tcggattggc gtattaagac 420
cataaaaaaa ccggcctcgt aatgaggccg gttctatttt aactaacagg ggttacctgc 480
taaacatggc ttgagccaag cttagaagtg gtaacgcgcg cctgtcagcc aataaacgtt 540
gtcagtcaga tcgctcagag tagtttcgtc acgattgata gacggtgcgt cgccatcagc 600
aacttctacg aaaacgtcaa acgcgctgga aactttgtag taagaaccca aagcccatgc 660
gttgctgtcg ccgttcttct cgccttcagg attgatgccg tcgcggctga cgtggtagta 720
atcaccagcg aatgcccaag gacctgtggt gtaagttgca ccaataccaa ctttgtcgta 780
gccgttttca cgaagacgta ggtcttcgtt gttttcacga ccttcgtaac ccagacgaac 840
tgacagctga tcgtttactg cgtaagaacc gatcaaacca cccaggattt cgccgttccc 900
gccgccacgc tcaacgtcgt caacgaagcc aagacctaca gtgatcgggc cttgctcgta 960
gcgtacgcca ccttgtgcag caactacgtt gccttcttca 1000
<210> 13
<211> 5143
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 13
gtctagggcg gcggtctagg gcggcggatt tgtcctactc aggagagcgt tcaccgacaa 60
acaacagata aaacgaaagg cccagtcttt cgactgagcc tttcgtttta tttgatgcct 120
ttaattaaag cggataacaa tttcacacag gaggccgcct aggccgcggc cgcgcgaatt 180
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ataaaaatat atcatcatga acaataaaac tgtctgctta cataaacagt aatacaaggg 480
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gtagcgttgc caatgatgtt acagatgaga tggtcagact aaactggctg acggaattta 720
tgcctcttcc gaccatcaag cattttatcc gtactcctga tgatgcatgg ttactcacca 780
ctgcgatccc cgggaaaaca gcattccagg tattagaaga atatcctgat tcaggtgaaa 840
atattgttga tgcgctggca gtgttcctgc gccggttgca ttcgattcct gtttgtaatt 900
gtccttttaa cagcgatcgc gtatttcgtc tcgctcaggc gcaatcacga atgaataacg 960
gtttggttga tgcgagtgat tttgatgacg agcgtaatgg ctggcctgtt gaacaagtct 1020
ggaaagaaat gcataagctt ttgccattct caccggattc agtcgtcact catggtgatt 1080
tctcacttga taaccttatt tttgacgagg ggaaattaat aggttgtatt gatgttggac 1140
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cattaaacgc gtattcaggc tgaccctgcg cgctgcgcag ggctttattg attccatttt 1680
tacactgatg aatgttccgt tgcgctgccc ggattacagc cggatcctct agagtcgacc 1740
tgcaggcatg ctgatcggca cgtaagaggt tccaactttc accataatga aataagatca 1800
ctaccgggcg tattttttga gttatcgaga ttttcaggag ctaaggaagc taaaatgcgc 1860
tcacgcaact ggtccagaac cttgaccgaa cgcagcggtg gtaacggcgc agtggcggtt 1920
ttcatggctt gttatgactg tttttttggg gtacagtcta tgcctcgggc atccaagcag 1980
caagcgcgtt acgccgtggg tcgatgtttg atgttatgga gcagcaacga tgttacgcag 2040
cagggcagtc gccctaaaac aaagttaaac atcatgaggg aagcggtgat cgccgaagta 2100
tcgactcaac tatcagaggt agttggcgtc atcgagcgcc atctcgaacc gacgttgctg 2160
gccgtacatt tgtacggctc cgcagtggat ggcggcctga agccacacag tgatattgat 2220
ttgctggtta cggtgaccgt aaggcttgat gaaacaacgc ggcgagcttt gatcaacgac 2280
cttttggaaa cttcggcttc ccctggagag agcgagattc tccgcgctgt agaagtcacc 2340
attgttgtgc acgacgacat cattccgtgg cgttatccag ctaagcgcga actgcaattt 2400
ggagaatggc agcgcaatga cattcttgca ggtatcttcg agccagccac gatcgacatt 2460
gatctggcta tcttgctgac aaaagcaaga gaacatagcg ttgccttggt aggtccagcg 2520
gcggaggaac tctttgatcc ggttcctgaa caggatctat ttgaggcgct aaatgaaacc 2580
ttaacgctat ggaactcgcc gcccgactgg gctggcgatg agcgaaatgt agtgcttacg 2640
ttgtcccgca tttggtacag cgcagtaacc ggcaaaatcg cgccgaagga tgtcgctgcc 2700
gactgggcaa tggagcgcct gccggcccag tatcagcccg tcatacttga agctagacag 2760
gcttatcttg gacaagaaga agatcgcttg gcctcgcgcg cagatcagtt ggaagaattt 2820
gtccactacg tgaaaggcga gatcaccaag gtagtcggca aataaactag taaataataa 2880
aaaagccgga ttaataatct ggctttttat attctctgca taaccctgct tcggggtcat 2940
tatagcgatt ttttcggtat atccatcctt tttcgcacga tatacaggat tttgccaaag 3000
ggttcgtgta gactttcctt ggtgtatcca acggcgtcag ccgggcagga taggtgaagt 3060
aggcccaccc gcgagcgggt gttccttctt cactgtccct tattcgcacc tggcggtgct 3120
caacgggaat cctgctctgc gaggctggcc gtaggccggc cgataatctc atgaccaaaa 3180
tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat 3240
cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc 3300
taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg 3360
gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc 3420
acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg 3480
ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg 3540
ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa 3600
cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg 3660
aagggagaaa ggcggacagg catccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga 3720
gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct 3780
gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca 3840
gcaacgcggc cgtgaaaggc aggccggtcc gtggtggcca cggcctctag gccagatcca 3900
gcggcatctg ggttagtcga gcgcgggccg cttcccatgt ctcaccaggg cgagcctgtt 3960
tcgcgatctc agcatctgaa atcttcccgg ccttgcgctt cgctggggcc ttacccaccg 4020
ccttggcggg cttcttcggt ccaaaactga acaacagatg tgtgaccttg cgcccggtct 4080
ttcgctgcgc ccactccacc tgtagcgggc tgtgctcgtt gatctgcgtc acggctggat 4140
caagcactcg caacttgaag tccttgatcg agggataccg gccttccagt tgaaaccact 4200
ttcgcagctg gtcaatttct atttcgcgct ggccgatgct gtcccattgc atgagcagct 4260
cgtaaagcct gatcgcgtgg gtgctgtcca tcttggccac gtcagccaag gcgtatttgg 4320
tgaactgttt ggtgagttcc gtcaggtacg gcagcatgtc tttggtgaac ctgagttcta 4380
cacggccctc accctcccgg tagatgattg tttgcaccca gccggtaatc atcacactcg 4440
gtcttttccc cttgccattg ggctcttggg ttaaccggac ttcccgccgt ttcaggcgca 4500
gggccgcttc tttgagctgg ttgtaggaag attcgatagg gacacccgcc atcgtcgcta 4560
tgtcctccgc cgtcactgaa tacatcactt catcggtgac aggctcgctc ctcttcacct 4620
ggctaataca ggccagaacg atccgctgtt cctgaacact gaggcgatac gcggcctcga 4680
ccagggcatt gcttttgtaa accattgggg gtgaggccac gttcgacatt ccttgtgtat 4740
aaggggacac tgtatctgcg tcccacaata caacaaatcc gtccctttac aacaacaaat 4800
ccgtcccttc ttaacaacaa atccgtccct taatggcaac aaatccgtcc ctttttaaac 4860
tctagaggcc acggattacg tggcctgtag acgtcctaaa aggtttaaaa gggaaaagga 4920
agaaaagggt ggaaacgcaa aaaacgcacc actacgtggc cccgttgggg ccgcatttgt 4980
gcccctgaag gggcggggga ggcgtctggg caatccccgt tttaccagtc ccctatcgcc 5040
gcctgagagg gcgcaggaag cgagtaatca gggtatcgag gcggattcac ccttggcgtc 5100
caaccagcgg caccagcggc gcctgagagg ggcgcgccca gct 5143
Claims (10)
1.一种重组菌的制备方法，包括：敲除出发菌株中的多糖合成基因，或抑制出发菌株中所述多糖合成基因的表达量，或降低出发菌株中的所述多糖合成基因编码蛋白质的含量或活性，得到目的重组菌；
所述出发菌株为盐单胞菌（Halomonasbluephagenesis）；
所述多糖合成基因为多糖合成基因簇PS1、PS2和PS4中的多糖合成基因；
所述多糖合成基因编码蛋白质为所述多糖合成基因簇PS1、PS2和PS4中的多糖合成基因编码的蛋白质；
所述多糖合成基因簇PS1的序列如序列表中序列1所示，所述多糖合成基因簇PS2的序列如序列表中序列2所示，所述多糖合成基因簇PS4的序列如序列表中序列3所示。
2.一种提高菌株絮凝能力的方法，包括：敲除出发菌株中的多糖合成基因，或抑制出发菌株中所述多糖合成基因的表达量，或降低出发菌株中的所述多糖合成基因编码蛋白质的含量或活性，得到与所述出发菌株相比絮凝能力提高的目的重组菌；
所述出发菌株为盐单胞菌（Halomonasbluephagenesis）；
所述多糖合成基因为多糖合成基因簇PS1、PS2和PS4中的多糖合成基因；
所述多糖合成基因编码蛋白质为所述多糖合成基因簇PS1、PS2和PS4中的多糖合成基因编码的蛋白质；
所述多糖合成基因簇PS1的序列如序列表中序列1所示，所述多糖合成基因簇PS2的序列如序列表中序列2所示，所述多糖合成基因簇PS4的序列如序列表中序列3所示。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述多糖合成基因的敲除通过CRISPR/Cas9的方法实现。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述多糖合成基因的敲除通过向所述出发菌株中导入能表达Cas9以及靶向所述多糖合成基因簇PS1、PS2和PS4的sgRNA的重组载体实现。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：能表达Cas9以及靶向所述多糖合成基因簇PS1、PS2和PS4的sgRNA的重组载体为能分别表达Cas9以及靶向所述多糖合成基因簇PS1、PS2和PS4的sgRNA的一个或多个载体。
6.利用权利要求1-5中任一所述方法得到的重组菌。
7.一种产品，为权利要求4或5中所述的重组载体。
8.一种菌体收集方法，包括：在用于培养出发菌株的液体培养基中培养权利要求6所述的重组菌，得到培养液，静置所述培养液或向所述培养液中添加NaCl，使菌体沉淀，弃上层液体，即得到所述重组菌菌体。
9.一种生产PHB的方法，包括：在含有葡萄糖的培养基中培养权利要求6所述的重组菌，得到PHB。
10.下述I或II的应用：
I、权利要求1-5中任一所述方法，或权利要求6所述的重组菌，或权利要求7所述的产品，或权利要求8所述的方法在生产PHB中的应用；
II、权利要求6所述的重组菌，或权利要求7所述的产品在制备生产PHB产品中的应用。
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