KR102282778B1 - 재조합 미생물 및 이의 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합 클로스트리듐 종의 제조에 사용되는 선별 마커, 방법, 핵산, 및 벡터를 제공한다.

Description

재조합 미생물 및 이의 사용 방법{RECOMBINANT MICROORGANISMS AND METHODS OF USE THEREOF}

관련 출원에 대한 교차 참조

본원은 2013년 9월 12일에 출원된 미국 가출원 제61/877,272호로부터 우선권을 주장하며, 이들의 내용은 본원에 참고로 편입되어 있다.

기술분야

본 발명은 재조합 클로스트리듐 종(Clostridium spp)의 제조에 사용되는 선별 마커에 관한 것이다.

재조합 유기체를 생산하는 과정은 공지되어 있다. 이것은 전형적으로 외인성 핵산 벡터를 이용하여 유기체를 형질전환시키는 것을 수반하며, 상기 외인성 핵산 벡터는 숙주 게놈과 통합되거나 안정적인 독립적 (예를 들면, 염색체외) 상태를 유지할 수 있다.

숙주 게놈 내로의 외인성 핵산의 통합은 벡터 및 내인성 핵산 사이의 이중-교차 사건을 수반한다. 이중-교차 재조합은 단지 우연히 통합물을 신뢰할 수 있게 확인하기에는 너무 낮은 빈도로 일어난다. 따라서, 하나 또는 둘 모두 교차를 선별하는 수단은 시간과 노력 모두에서 확인의 빈도에 커다란 이점을 갖는다.

재조합 사건을 스크리닝하는데 사용되는 선별 마커는 공지되어 있다. 그와 같은 마커는 전형적으로 숙주 유기체에 선별적 이점 (양성-선별) 또는 약점 (역선별)을 부여하는 단백질 코딩 서열이다. 많은 양성-선별 및 역선별 마커들이 공지되어 있으며, 이들은 원하는 재조합 사건이 일어난 유기체를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 양성-선별 마커는 전형적으로 발현시 유기체를 특정한 성장 환경에서 생존하게 하는 유전자를 포함한다. 역선별 마커는 전형적으로 발현시 유기체에 치명적인 독소를 생산하는 유전자를 포함한다.

클로스트리듐 이외의 박테리아에서, 이용할 수 있는 역선별 마커들은 많지만, 불행하게도 생리적 또는 유전적 이유로 인해, 상당수가 클로스트리듐에서 작동하지 못한다.

본 발명의 목적은 상기 선행기술의 하나 이상의 약점을 극복하거나, 또는 적어도 공공에게 유용한 선택을 제공하는 것이다.

발명의 요약

제1 측면에서, 본 발명은 친계 미생물로부터 재조합 미생물을 생산하는 방법에서 역선별 마커로서 ThiK 및/또는 PheS의 용도를 제공하며, 상기 친계 미생물은 클로스트리듐 종이고, 상기 PheS는 사용시 페닐알라닌 tRNA 합성효소가 페닐알라닌 유사체를 이용하여 tRNA를 아미노아실화할 수 있도록 야생형 PheS와 비교하여 적어도 하나의 변이를 포함한다.

제2 측면에서, 본 발명은 친계 미생물로부터 재조합 미생물을 생산하는데 사용되는 플라스미드에서 ThiK 및/또는 PheS를 인코딩하는 핵산의 용도를 제공하며, 상기 친계 미생물은 클로스트리듐 종이고, 상기 PheS는 사용시 페닐알라닌 tRNA 합성효소가 페닐알라닌 유사체를 이용하여 tRNA를 아미노아실화할 수 있도록 야생형 PheS와 비교하여 적어도 하나의 변이를 포함한다.

제3 측면에서, 본 발명은 친계 미생물로부터 재조합 미생물을 생산하기 위한 ThiK 및/또는 PheS를 인코딩하는 핵산을 포함하는 플라스미드의 용도를 제공하며, 상기 친계 미생물은 클로스트리듐 종이고, 상기 PheS는 사용시 페닐알라닌 tRNA 합성효소가 페닐알라닌 유사체를 이용하여 tRNA를 아미노아실화할 수 있도록 야생형 PheS와 비교하여 적어도 하나의 변이를 포함한다.

제4 측면에서, 본 발명은 친계 미생물로부터 재조합 미생물을 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 적어도 하기 단계를 포함한다:

a) 친계 미생물을 하기를 포함하는 플라스미드를 이용하여 형질전환하는 단계

1. PheS 및 ThiK로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 역선별 마커를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열로서, 상기 PheS는 사용시 페닐알라닌 tRNA 합성효소가 페닐알라닌 유사체를 이용하여 tRNA를 아미노아실화할 수 있도록 야생형 PheS와 비교하여 적어도 하나의 변이를 포함하며;

2. 적어도 하나의 양성 선별 마커를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및,

3. 상기 플라스미드와 친계 미생물의 게놈과의 재조합을 가능하게 하는, 친계 미생물의 게놈 내의 표적 위치 주위의 선택된 영역에 상동인 2개의 핵산 서열

b) 적어도 하나의 양성 선별 마커를 발현하는 하나 이상의 미생물을 선별하는 단계; 및,

c) 적어도 하나의 역선별 마커를 발현하지 않는 하나 이상의 미생물을 선별하는 단계.

일 구현예에서, 상기 선택 단계 b) 및 c)는 동시에 수행된다. 또 하나의 구현예에서, 상기 선택 단계 b) 및 c)는 순차적으로 수행된다.

일 구현예에서, 상기 플라스미드는 모계 게놈 내로 삽입될 적어도 하나의 관심있는 핵산 서열을 추가로 포함한다.

제4 측면에서, 본 발명은 PheS를 인코딩하는 핵산을 제공하며, 상기 PheS는 사용시 페닐알라닌 tRNA 합성효소가 페닐알라닌 유사체를 이용하여 tRNA를 아미노아실화할 수 있도록 야생형 PheS와 비교하여 변이되고, 상기 야생형 PheS는 클로스트리듐 종으로부터 유래되거나 또는 그의 기능적으로 동등한 변이체이다.

제5 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제4 측면에 따른 핵산을 포함하는 핵산 벡터를 제공한다. 일 구현예에서, 상기 벡터는 플라스미드이다.

일 구현예에서, 상기 벡터는 플라스미드이며, 또한 하기 중 하나 이상을 포함한다:

a. 적어도 하나의 양성 선별 마커를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열; 및,

b. 상기 플라스미드와 친계 미생물의 게놈과의 재조합을 가능하게 하는, 친계 미생물의 게놈 내의 표적 위치 주위의 선택된 영역에 상동인 2개의 핵산 서열.

일 구현예에서, 상기 플라스미드는 친계 미생물의 게놈 내로 삽입되고자 하는 적어도 하나의 관심있는 핵산 서열을 추가로 포함한다.

제6 측면에서, 본 발명은 PheS를 제공하며, 상기 PheS는 사용시 페닐알라닌 tRNA 합성효소가 페닐알라닌 유사체를 이용하여 tRNA를 아미노아실화할 수 있도록 야생형 PheS와 비교하여 하나 이상의 변이를 포함하고, 상기 야생형 PheS는 클로스트리듐 종으로부터 유래되거나 또는 그의 기능적으로 동등한 변이다.

제7 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제4 측면에 따른 핵산, 본 발명의 제5 측면에 따른 벡터 및/또는 본 발명의 제6 측면에 따른 PheS를 포함하는 세포를 제공한다.

본 발명의 상기 측면의 일 구현예에서, 야생형 PheS 및/또는 PheS를 인코딩하는 야생형 핵산은 클로스트리듐 종으로부터 유래되거나 또는 그의 기능적으로 동등한 변이체이다.

본 발명의 상기 측면의 및 구현예의 일 구현예에서, 야생형과 비교하여 PheS에서의 적어도 하나의 변이는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 부가를 포함한다.

본 발명의 상기 측면 및 구현예의 일 특정 구현예에서, PheS에서의 적어도 하나의 변이는 기질 특이성 부위 내에 위치한다. 일 구현예에서, 기질 특이성 부위는 C. 아우토에타노게넘의 야생형 PheS (서열번호 21)의 아미노산 위치에 대하여 판독된 아미노산 306 및 313 사이에 위치한다. 일 구현예에서, 적어도 하나의 변이는 위치 311에서의 아미노산 치환이다. 일 구현예에서, 상기 적어도 하나의 변이는 아미노산 311에서 Ala 대신 Gly으로의 치환이다.

본 발명의 상기 측면 및 구현예의 일 구현예에서, PheS는 클로스트리듐 아우토에타노게넘으로부터 유래되거나 또는 그의 기능적으로 동등한 변이체이다.

본 발명의 상기 측면 및 구현예의 일 구현예에서, 상기 변이된 PheS는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 상기 측면 및 구현예의 일 구현예에서, 야생형 PheS와 비교하여 적어도 하나의 변이를 포함하는 PheS를 인코딩하는 핵산은 야생형 PheS를 인코딩하는 핵산과 비교하여 적어도 하나의 변이를 포함한다. 일 구현예에서, PheS를 인코딩하는 핵산에서의 적어도 하나의 변이는 하나 이상의 뉴클레오타이드 치환, 결실 및/또는 부가를 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 서열에서의 하나 이상의 변이는 PheS의 기질 특이성 부위를 인코딩하는 핵산의 영역 내에 위치한다. 일 구현예에서, 기질 특이성 부위를 인코딩하는 핵산의 영역은 C. 아우토에타노게넘의 야생형 PheS를 인코딩하는 유전자 (서열번호 12)의 뉴클레오타이드 위치에 대하여 나타낸 염기 918 및 939 사이에 위치한다. 일 구현예에서, 적어도 하나의 변이는 염기 932에서의 뉴클레오타이드 치환이다. 일 구현예에서, 적어도 하나의 변이는 염기 932에서 C의 G로의 치환이다.

본 발명의 상기 측면 및 구현예의 일 구현예에서, PheS를 인코딩하는 핵산은 클로스트리듐 아우토에타노게넘으로부터 유래되거나 또는 그의 기능적으로 동등한 변이체이다.

본 발명의 상기 측면 및 구현예의 일 구현예에서, 변이된 PheS를 인코딩하는 핵산은 서열번호 14의 서열을 포함한다.

본 발명의 상기 측면 및 구현예의 일 구현예에서, 페닐알라닌 유사체는 클로로페닐알라닌, 플루오로페닐알라닌 및 브로모페닐알라닌으로부터 선택된다. 하나의 특정 구현예에서, 페닐알라닌 유사체는 DL-4-클로로페닐알라닌 및 p-클로로페닐알라닌, p-플루오로-L-페닐알라닌, p-플루오로-DL-페닐알라닌, p-브로모-L-페닐알라닌으로부터 선택된다.

본 발명의 상기 측면 및 구현예의 일 구현예에서, ThiK 및/또는 ThiK를 인코딩하는 핵산은 단순 포진 바이러스 1 또는 단순 포진 바이러스 2 (HSV-TK), VZV, CMV, HHV7, HHV7, HHV8, EBV 또는 이의 어느 하나 이상의 기능적으로 동등한 변이체로부터 유래된다.

본 발명은 또한 둘 이상의 부분, 요소 또는 특징의 어느 또는 모든 조합에서, 개별적으로 또는 총괄적으로, 상기 출원의 명세서에 언급되거나 표시된 부분, 요소 및 특징에 있다고 광범위하게 말할 수 있으며, 본 발명과 관련된 당해기술에서 공지된 등가물을 갖는 특정 정수가 본원에서 언급되는 경우, 그러한 공지된 등가물은 마치 개별적으로 제시된 바와 같이 본원에 편입되는 것으로 간주된다.

모든 신규한 측면에서 고려되어야 하는 본 발명의 이들 및 다른 측면들은 첨부한 도면을 참조하여, 단지 예로서 제시되는 하기 설명으로부터 명확하게 될 것이다:
도 1: 플라스미드 pMTL83155-HSV-tk의 지도를 보여준다
도 2: C. 아우토에타노게넘 형질전환체에서 pMTL83155 및 pMTL83155-Hsv-tk (h1 및 h2) 상의 그람 양성 레플리콘 및 catP 마커를 포괄하는 ~1.5 kb 단편의 PCR 증폭을 보여준다. 비변형된 C. 아우토에타노게넘 (C)이 대조군으로서 사용되었다. LZ-pMTL83155 (P1 및 P2) 및 LZ-pMTL83155-Hsv-tk (h1 및 h2)의 각각 2개의 콜로니가 스크리닝되었다.
도 3: E. 콜라이 MG1655 (서열번호 13) 및 C. 아우토에타노게넘 유래의 pheS의 쌍별 번역된 뉴클레오타이드 서열 정렬을 보여준다(추정적인 기질 특이성 영역은 볼드체로 밑줄쳐 있음).
도 4: 플라스미드 pMTL85151-pheS *의 지도를 보여준다
도 5: HSV-tk를 포함하는 플라스미드의 대표적인 지도를 보여준다.
도 6: pheS를 포함하는 플라스미드의 대표적인 지도를 보여준다.
도 7: AM041 및 AM042를 이용한 PCR 스크린으로부터의 TAE 아가로스 겔 전기영동 결과를 보여준다. 레인 1은 GeneRuler 1kb Ladder (Thermo)를 함유한다. 레인 2는 주형이 부가되지 않은 PCR을 함유한다. 레인 3은 예상된 야생형 생성물 크기 (3137 bp)를 보여주는 야생형 C. 아우토에타노게넘 게놈 DNA를 주형으로서 사용한 PCR을 함유한다. 레인 4-7은 주형으로서 p-클로로페닐알라닌 및 티암페니콜 내성 콜로니를 이용한 PCR을 함유한다. 레인 6은 K. 뉴모니아 유래의 부탄디올 탈수소효소 유전자를 이용한 원상태 부탄디올 탈수소효소 유전자의 성공적인 이중 교차 치환에 대해 예상된 크기 (3570 bp)의 PCR 생성물을 보여준다.
도 8: 인트론 표적 부위 (211s, 287a, 388a, 400s, 433s, 및 552a)를 보여주는 유전자 지도. 프라이머 결합 부위가 또한 나타나 있다 (하단, 수평 화살표).
도 9A-9C: 그룹 II 인트론 삽입의 확인. 도 9A: 433s 및 388a (희미한 밴드), 도 9B: 211s, 및 287a. 도 9C: 287a, 및 433
서열 정보의 간단한 설명
이하 나타낸 도면에 앞서, 본 명세서는 본 발명과 관련된 핵산 및 폴리펩타이드의 서열의 세부사항을 포함한다. 하기 서열이 제공된다:
서열번호 1: pMK-RQ-Hsv-tk의 핵산 서열
서열번호 2: pMTL83155-Hsv-tk의 핵산 서열
서열번호 3: pMTL83155의 핵산 서열
서열번호 4: 프라이머 repHf의 핵산 서열
서열번호 5: 프라이머 catr의 핵산 서열
서열번호 6: 프라이머 fD1의 핵산 서열
서열번호 7: 프라이머 rP2의 핵산 서열
서열번호 8: 프라이머 rP2를 이용하여 수득된 LZ-pMTL83155-1의 16s rRNA 핵산 서열
서열번호 9: 프라이머 rP2를 이용하여 수득된 LZ-pMTL83155-2의 16s rRNA 핵산 서열
서열번호 10: 프라이머 rP2를 이용하여 수득된 LZ-pMTL83155-hsv-tk-1의 16s rRNA 핵산 서열
서열번호 11: 프라이머 rP2를 이용하여 수득된 LZ-pMTL83155-hsv-tk-2의 16s rRNA 핵산 서열
서열번호 12: C. 아우토에타노게넘의 pheS를 인코딩하는 핵산 서열
서열번호 13: E. 콜라이 MG1655의 pheS를 인코딩하는 핵산 서열
서열번호 14: C. 아우토에타노게넘의 pheS *를 인코딩하는 핵산 서열
서열번호 15: PheS 플라스미드의 존재를 확인하는데 사용된 정방향 프라미어 서열 - M13F
서열번호 16: PheS 플라스미드의 존재를 확인하는데 사용된 역방향 프라이머 서열 - M13R
서열번호 17: 합성 프로모터 PpheS *
서열번호 18: pMTL85151-pheS *의 뉴클레오타이드 서열
서열번호 19: 인간 헤르페스바이러스 1 (단순 포진 바이러스 타입 1)의 HSV-TK를 인코딩하는 핵산 서열
서열번호 20: E. 콜라이 MG1655의 PheS의 아미노산 서열
서열번호 21: C. 아우토에타노게넘의 PheS의 아미노산 서열
서열번호 22: 인간 헤르페스바이러스 1 (단순 포진 바이러스 타입 1)의 ThiK를 인코딩하는 핵산 서열
서열번호 23: 클로스트리듐 페르프린겐스의 CatP를 인코딩하는 핵산 서열
서열번호 24: 펩토클로스트리듐 디피실레의 ErmB를 인코딩하는 핵산 서열
서열번호 25: 에스케리치아 콜리의 TetA를 인코딩하는 핵산 서열
서열번호 26: pPheS*-ErmB의 조립를 위한 traJ PCR 생성물을 갖는 PheS* 카세트 및 ColE1의 핵산 서열
서열번호 27: pPheS-CaBDHXXKpBDH (실시예 2)의 조립을 위해 사용된 pPheS 단편 PCR 생성물의 핵산 서열
서열번호 30: pPheS*-ErmB의 조립을 위해 사용된 pCB102 복제 기점 PCR 생성물의 핵산 서열
서열번호 33: pPheS*-ErmB의 조립을 위해 사용된 에리트로마이신 내성 카세트 PCR 생성물의 핵산 서열
서열번호 36: pPheS-CaBDHXXKpBDH의 조립을 위한 골격 플라스미드의 증폭을 위한 pPhes-ErmB 주형의 핵산 서열
서열번호 39: pPheS-CaBDHXXKpBDH의 조립을 위한 업스트림 상동성 암(arm) PCR 생성물의 핵산 서열
서열번호 42: pPheS-CaBDHXXKpBDH의 조립을 위한 K. 뉴모니애 부탄디올 탈수소효소 유전자 PCR 생성물의 핵산 서열
서열번호 45: pPheS-CaBDHXXKpBDH의 조립을 위한 클로르암페니콜 아세틸전달효소 카세트 PCR 생성물의 핵산 서열
서열번호 48: pPheS*-CaBDHXXKpBDH의 조립을 위한 다운스트림 상동성 암 PCR 생성물의 핵산 서열
서열번호 53: C. 아우토에타노게넘의 변이된 pheS *의 아미노산 서열
서열번호 54: 인간 헤르페스바이러스 1 (단순 포진 바이러스 타입 1)의 아미노산 서열
서열번호 55: C. 아우토에타노게넘의 일차:2차 알코올 탈수소효소의 핵산 서열
서열번호 56: 인트론 표적화 영역
서열번호 57: 156F에 대한 프라이머 서열
서열번호 58: 939R에 대한 프라이머 서열
본 발명과 관련된 다른 서열은 본원의 다른 곳에 기재되어 있다. 예를 들면, 실시예 2의 표 3을 참조한다.

발명의 상세한 설명

다음은 바람직한 구현예를 포함하는 본 발명의 설명으로서 일반적인 용어로 제시되어 있다. 본 발명은 하기에 제목 "실시예" 하에 제시된 개시내용으로부터 추가로 설명되며, 이는 본 발명을 뒷받침하는 실험 데이터, 본 발명의 다양한 측면의 구체적인 예, 및 본 발명을 수행하는 수단을 제공한다.

재조합 미생물의 생산은 외인성 핵산을 친계 미생물 내로 도입하는 것을 수반할 수 있으며, 상기 외인성 핵산 및 미생물의 게놈 사이에 이중-교차 재조합 사건이 일어나 적어도 하나의 원하는 유전적 변이가 게놈 내로 도입될 수 있다. 이중-교차 재조합은 단지 우연히 통합물을 신뢰할 수 있게 확인하기에는 전형적으로 너무 낮은 빈도로 일어난다. 따라서, 본 발명자들은 하나 또는 두 교차를 선별하는 수단이 시간과 노력 모두에서 확인의 빈도에 상당한 이점을 갖는다고 생각한다. 본 발명자들은 실험실에서 단일-교차 재조합의 빈도가, 비록 낮긴 하지만, 적절한 수의 콜로니를 스크리닝함으로써 확인할 수 있다는 점에 주목하였으나, 이것은 제2 교차 사건을 갖는 경우인 것으로 보이진 않았다. 본 발명은 친계 미생물 내로 도입된 외인성 핵산 내에 존재하는 조건 치사 유전자 생성물을 역선별함으로써 제2 사건을 선별하는 수단을 제공한다. 이는 역선별제의 존재시 단일-교차 사건만이 일어난 어떤 미생물에서, 조건 치사 유전자 생성물의 발현이 제2 교차 사건을 겪지 않고 역선별 마커를 인코딩하는 유전자를 함유하는 핵산을 방출한 임의의 미생물을 사멸시킬 것임을 의미한다.

역선별 마커는 공지되어 있다. 그러나, 이들은 박테리아의 상이한 속에서 사용하기 위해 반드시 전달될 수 있는 것은 아니다. 불행하게도 생리적 또는 유전적 이유 때문에, 상당수가 클로스트리듐에서 작동하지 않는다. 본 발명자들은 놀랍게도 ThiK 및 변이된 형태의 PheS가 클로스트리듐 종에서 역선별 마커로서 사용될 수 있음을 확인하였다

정의

"외인성 핵산"은 이들이 도입되는 미생물의 외부에서 기원하는 핵산이다. 외인성 핵산은 임의의 적절한 공급원으로부터 유래될 수 있으며, 이는 비제한적으로, 이들이 도입될 미생물, 이들이 도입될 유기체와 상이한 유기체의 균주 또는 종을 포함하거나, 또는 이들은 인공적으로 또는 재조합으로 만들어질 수 있다.

"유전자 변형"은 광범위하게 받아들여져야 하며, 예를 들면, 유전적 부위에 돌연변이를 도입하는 것, 게놈에 하나 이상의 뉴클레오타이드를 부가하거나 게놈으로부터 이를 제거하는 것, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 상이한 뉴클레오타이드로의 치환, 유전자의 치환, 유전자의 제거, 유전자의 부가 등을 포함하는 것으로 의도된다.

"변이된 PheS", 또는 사용시 페닐알라닌 tRNA 합성효소가 페닐알라닌 유사체를 이용하여 tRNA를 아미노아실화할 수 있도록 야생형 PheS와 비교하여 하나 이상 또는 적어도 하나의 "변이"를 포함하는 PheS가 본원에서 언급될 수 있다 "변이"는 광범위하게 고려되어야 하며, 예를 들면, 야생형 PheS와 비교하여 하나 이상의 아미노산의 치환, 하나 이상의 아미노산의 결실, 및/또는 하나 이상의 아미노산의 부가 중 하나 또는 조합을 포함한다. "변이된" PheS는, 그것이 여전히 그의 원하는 기능을 실질적으로 수행할 수 있다면, 페닐알라닌 tRNA 합성효소가 페닐알라닌 유사체를 이용하여 tRNA를 아미노아실화하는 것을 가능하게 하는 변이 이외에도 하나 이상의 변이를 포함할 수 있다.

야생형 PheS를 인코딩하는 핵산과 비교하여 하나 이상의 변이를 포함하는 PheS를 인코딩하는 핵산이 본원에서 언급될 수 있다. "변이"는 광범위하게 고려되어야 하며, 예를 들면, 야생형 PheS를 인코딩하는 핵산과 비교하여 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 및/또는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 부가 중 하나 또는 조합을 포함한다. 상기 핵산은 또한, PheS가 여전히 그의 원하는 기능을 실질적으로 수행할 수 있다면, 페닐알라닌 tRNA 합성효소가 페닐알라닌 유사체를 이용하여 tRNA를 아미노아실화하는 것을 가능하게 하는 변이 이외에도 하나 이상의 변이를 포함할 수 있다.

PheS 또는 PheS를 인코딩하는 핵산의 하나 이상의 변이는 특정 유기체로부터의 야생형 PheS (또는 이를 인코딩하는 핵산)에서의 특정 영역 또는 아미노산 또는 뉴클레오타이드 위치를 참조하여 본원에 기재될 수 있다. 특정 영역, 아미노산 또는 뉴클레오타이드의 정확한 위치는, 예를 들면 유기체의 상이한 균주 또는 종에서, PheS 또는 PheS를 인코딩하는 핵산마다 약간씩 달라질 수 있는 것으로 인식될 것이다. 이러한 변화를 설명하기 위해, 특정 영역, 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 위치가 본원에서 언급되는 경우, 그것은 C. 아우토에타노게넘의 야생형 PheS의 아미노산 위치 (서열번호 21) (또는 C. 륭달리이 DSM13528로부터의 야생형 Phe-S (유전자은행: ADK16487.1)) 또는 C. 아우토에타노게넘의 PheS를 인코딩하는 핵산의 뉴클레오타이드 위치 (본원에서 서열번호 12) (또는 C. 륭달리이 DSM13528로부터의 야생형 Phe-S (유전자은행: ADK16487.1)에 "대하여 나타낸(read in realtion to; 또는 read relative to)" 것으로 기재되며, 여기서 서열번호 21 (또는 ADK16487.1)에서 첫번째 위치 아미노산 및 서열번호 12 (또는 ADK16487.1)에서 첫번째 뉴클레오타이드는 위치 1이다. 그와 같은 어구는 광범위하게 받아들여져야 하며 이들이 상이한 위치에 있을 수 있음에도 불구하고 다른 PheS 단백질 (또는 이를 인코딩하는 핵산) 내의 동등한 영역, 아미노산 또는 뉴클레오타이드를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명과 관련된 당해분야의 숙련자는 일상적인 서열 정렬을 통해 그리고 본원에 함유된 정보를 이용하여 특정한 PheS 또는 이를 인코딩하는 핵산 내의 특정한 영역, 아미노산 또는 뉴클레오타이드의 위치를 쉽게 확인할 수 있을 것이다.

"2개의 특정한 아미노산 또는 뉴클레오타이드 "사이의" PheS 또는 핵산의 특정 영역에 대한 언급은 상기 뉴클레오타이드 또는 아미노산을 포함하는 영역을 의미하는 것으로 받아들여져야 한다. 즉, 상기 영역은 언급된 말단 뉴클레오타이드 또는 아미노산을 포함한다. 예를 들면, 위치 306 및 313에서의 아미노산 사이의 기질 특이 부위는 위치 306 및 313에 존재하는 아미노산을 포함한다.

용어 "페닐알라닌 유사체"는 광범위하게 받아들여져야 하며 미생물에게 독성을 유발하는 페닐알라닌 대신에 펩타이드 및 단백질 내로 편입될 수 있는 페닐알라닌의 유사체 또는 유도체를 포함한다. 일 구현예에서, 페닐알라닌 유사체는 클로로페닐알라닌, 플루오로페닐알라닌 및 브로모페닐알라닌으로부터 선택된다. 하나의 특정 구현예에서, 페닐알라닌 유사체는 DL-4-클로로페닐알라닌 및 p-클로로페닐알라닌, p-플루오로-L-페닐알라닌, p-플루오로-DL-페닐알라닌, p-브로모-L-페닐알라닌으로부터 선택된다. 숙련자는 본 발명에서 사용되는 다른 페닐알라닌 유사체를 쉽게 인식할 수 있다.

"관심있는 핵산 서열" 또는 유사한 어구를 포함하는 핵산 벡터가 본원에서 언급될 수 있다. 그와 같은 어구는 광범위하게 받아들여져야 하며, 이는 하나 이상의 뉴클레오타이드, 유전자, 프로모터, 조절 서열, 다른 유전 인자를 포함하고, 코딩 또는 비-코딩일 수 있다. 그것은 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 부가 또는 치환 중 하나 또는 조합을 포함하는, 숙주 게놈 내의 하나 이상의 표적 위치에 하나 이상의 유전자 변형을 도입하도록 설계된 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 관심있는 핵산 또는 핵산 서열은 친계 미생물의 게놈 내에 존재하는 유전자를 결실하도록 설계될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이 표현 "표적 위치" 및 "표적 핵산 서열"은 하나 이상의 유전자 변형 (하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함함)을 도입하고자 하는 경우 모계 또는 숙주 게놈 내의 임의의 부위, 영역 또는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것으로 광범위하게 받아들여져야 하며, 예를 들면 관심있는 유전자, 유전자간 영역, 프로모터 및/또는 조절 서열을 포함한다.

친계 미생물의 게놈 내의 "표적 위치 주위의 선택된 영역에 상동인 2개의 핵산 서열"을 포함하는 본 발명의 벡터가 본원에서 언급될 수 있다. 그와 같은 핵산 서열은 본원에서 "상동성 암(arms)"으로도 지칭될 수 있다.

특정한 유기체"로부터의" 또는 특정한 유기체"로부터 유래된" 단백질 (PheS 및/또는 ThiK) 또는 그와 같은 단백질을 인코딩하는 핵산이 본원에서 언급될 수 있다. 이것은 상기 단백질 또는 핵산이 유기체 내의 상기 관련된 단백질 또는 상기 관련된 단백질을 인코딩하는 핵산의 서열을 갖는다는 것을 의미하는 것으로 광범위하게 받아들여져야 한다. 상기 단백질 또는 핵산은 상기 유기체로부터 물리적으로 얻어졌다는 것을 의미하는 것으로 받아들이지 않아야 한다. 그와 같은 단백질 및 핵산은 예를 들면 화학적 합성 등을 이용하여 제조될 수 있다.

"친계 미생물"는 본 발명에 따른 재조합 미생물을 생성하기 위해 사용된 미생물이다. 일 구현예에서, 친계 미생물은 자연계에 존재하는 것(즉 야생형 미생물) 또는 이전에 변형된 것(유전적으로 변형된 또는 재조합 미생물)일 수 있다. 본 발명에 따르면, "친계 미생물"은 클로스트리듐 종이다.

숙련자는 본 발명에서 사용되는 클로스트리듐 종 미생물을 쉽게 확인할 수 있을 것이다. 그러나, 예로써, 상기 그룹은 하기를 포함할 수 있다: 클로스트리듐 아우토에타노게넘, 클로스트리듐 륭달리이, 클로스트리듐 라그스달레이, 클로스트리듐 카복시디보란스, 클로스트리듐 드라케이, 클로스트리듐 스카톨로게네스, 클로스트리듐 아세티쿰, 클로스트리듐 포르미코아세티쿰, 클로스트리듐 매그넘, 클로스트리듐 코스카티이, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰, 클로스트리듐 베이제린키이, 클로스트리듐 사카로페르부틸아세토니컴, 클로스트리듐 사카로부틸리쿰, 클로스트리듐 테르모셀룸, 클로스트리듐 셀룰롤리티쿰, 클로스트리듐 파이토페르멘탄스, 클로스트리듐 파스퇴리아눔, 클로스트리듐 클루이베리, 클로스트리듐 디피실레, 클로스트리듐 보툴리늄, 클로스트리듐 스포로게네스, 클로스트리듐 페르프린겐스, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰, 클로스트리듐 아시디솔리, 클로스트리듐 아시디콜레란스, 클로스트리듐 아시두리치, 클로스트리듐 에어로톨레란스,클로스트리듐 아카기이, 클로스트리듐 안데넨세, 클로스트리듐 알기니카르니스, 클로스트리듐 알지디크실라놀리티쿰, 클로스트리듐 알칼리셀룰로시, 클로스트리듐 아미노발레리쿰, 클로스트리듐 아미그달리눔, 클로스트리듐 아르티쿰, 클로스트리듐 아르게티넨세,클로스트리듐 아루란티부티리쿰, 클로스트리듐 바라이티, 클로스트리듐 보툴리늄, 클로스트리듐 보우만니이, 클로스트리듐 부티리쿰,클로스트리듐 베이제린키이, 클로스트리듐 카다베리스, 클로스트리듐 카미니테르말레, 클로스트리듐 카복시디보란스, 클로스트리듐 카르니스, 클로스트리듐 셀라툼, 클로스트리듐 셀레레크레센스, 클로스트리듐 셀룰롤리티쿰, 클로스트리듐 셀룰로시, 클로스트리듐 차르타타비둠, 클로스트리듐 클로스트리디오포르메, 클로스트리듐 칵코이데스, 클로스트리듐 코클레아리움, 클로스트리듐 코클레아툼, 클로스트리듐 콜리넘, 펩토클로스트리듐 디피실레, 클로스트리듐 디올리스, 클로스트리듐 디스포리컴, 클로스트리듐 드라케이, 클로스트리듐 두룸, 클로스트리듐 에스테르테티쿰, 클로스트리듐 팔락스, 클로스트리듐 펠시네움, 클로스트리듐 에르비둠, 클로스트리듐 피메타리움,클로스트리듐 포르미카세티쿰, 클로스트리듐 고니이, 클로스트리듐 글라이콜리쿰, 클로스트리듐 글라이사이르히지닐리티쿰, 클로스트리듐 하에폴리티쿰, 클로스트리듐 할로필럼, 클로스트리듐 테타니, 클로스트리듐 페르프린겐스, 클로스트리듐 파이토페르멘탄스, 클로스트리듐 필리포르메, 클로스트리듐 폴리사카롤리티쿰, 클로스트리듐 포풀레티, 클로스트리듐 프로피오니쿰, 클로스트리듐 프로테오클라스티쿰,클로스트리듐 프로테올리티쿰, 클로스트리듐 프사이크로필럼, 클로스트리듐 푸니세움, 클로스트리듐 푸리, 클로스트리듐 푸트레파시엔스, 클로스트리듐 푸트리피쿰, 클로스트리듐 쿠에르시콜럼, 클로스트리듐 퀴니이, 클로스트리듐 라모섬, 클로스트리듐 로세움,클로스트리듐 사카로부틸리쿰, 클로스트리듐 사카롤리티쿰, 클로스트리듐 사카로페르부틸아세토니컴, 클로스트리듐 사르디니엔스, 클로스트리듐 스테르코라리움, 클로스트리듐 스티클란디이, 클로스트리듐 파라독섬, 클로스트리듐 파라페르프린겐스, 클로스트리듐 파라푸트리피쿰, 클로스트리듐 파스쿠이, 클로스트리듐 페이스테우리아넘, 클로스트리듐 노뷔이, 클로스트리듐 셉티쿰, 클로스트리듐 히스톨리티쿰, 클로스트리듐 하이드록시벤조이쿰, 클로스트리듐 하일레모내, 클로스트리듐 인노쿠움, 클로스트리듐 클루이베리, 클로스트리듐 락타티페르멘탄스, 클로스트리듐 라쿠스피익셀렌세, 클로스트리듐 라라미엔세, 클로스트리듐 렌토셀럼, 클로스트리듐 렌토푸트레센스, 클로스트리듐 메톡시벤조보란스, 클로스트리듐 메틸펜토섬, 클로스트리듐 니트로페놀리쿰, 클로스트리듐 노뷔이,클로스트리듐 오세아니쿰, 클로스트리듐 오로티쿰, 클로스트리듐 옥살리쿰, 클로스트리듐 테르티움, 클로스트리듐 테타니, 클로스트리듐 테타노모르펌, 클로스트리듐 테르마세티쿰, 클로스트리듐 테르마우토트로피쿰, 클로스트리듐 테르모알칼리필럼, 클로스트리듐 테르모부티리쿰, 클로스트리듐 테르모셀룸, 클로스트리듐 테르모코프리아에, 클로스트리듐 테르모하이드로설피리쿰, 클로스트리듐 테르모락티쿰, 클로스트리듐 테르모팔마리쿰, 클로스트리듐 테르모파피롤리티쿰, 클로스트리듐 테르모사카롤리티쿰,클로스트리듐 테르모설피이리게네스, 클로스트리듐 타이로부티리쿰, 클로스트리듐 울리기노섬, 클로스트리듐 울투넨세, 클로스트리듐 빌로섬, 클로스트리듐 비리데, 클로스트리듐 크실라놀리티쿰, 클로스트리듐 크실라노보란스, 클로스트리듐 비페르멘탄스, 및 클로스트리듐 스포로게네스.

하나의 특정 구현예에서 모계 유기체는 초산생성 클로스트리듐 종의 군으로부터 선택된다. 하나의 특정 구현예에서, 친계 미생물은 종 클로스트리듐 아우토에타노게넘, 클로스트리듐 륭달리이, 클로스트리듐 라그스달레이, 클로스트리듐 카복시디보란스, 클로스트리듐 드라케이, 클로스트리듐 스카톨로게네스, 클로스트리듐 아세티쿰, 클로스트리듐 포르미코아세티쿰, 클로스트리듐 매그넘, 및 클로스트리듐 코스카티이를 포함하는 초산생성 일산화탄소영양 유기체의 군으로부터 선택된다.

하나의 구현예에서, 친계 미생물은 종 C. 아우토에타노게넘, C. 륭달리이, 및 "C. 라그스달레이" 및 관련된 분리물을 포함하는 일산화탄소영양 클로스트리듐의 클러스터로부터 선택된다. 이들은 비제한적으로 균주 C. 아우토에타노게넘 JAI-1^T (DSM10061) (Abrini, Naveau, & Nyns, 1994), C. 아우토에타노게넘 LBS1560 (DSM19630) (WO/2009/064200), C. 아우토에타노게넘 LBS1561 (DSM23693), C. 륭달리이 PETC^T (DSM13528 = ATCC 55383) (Tanner, Miller, & Yang, 1993), C. 륭달리이 ERI-2 (ATCC 55380) (US 특허 5,593,886), C. 륭달리이 C-01 (ATCC 55988) (US 특허 6,368,819), C. 륭달리이 O-52 (ATCC 55989) (US 특허 6,368,819), 또는 "C. 라그스달레이 P11^T" (ATCC BAA-622) (WO 2008/028055), 및 "C. 코스카티이" (US 특허 2011/0229947)와 같은 관련된 분리물, 및 C. 륭달리이 OTA-1과 같은 이의 돌연변이 균주 (Tirado-Acevedo O. Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium ljungdahlii. PhD thesis, North Carolina State University, 2010)를 포함한다.

이들 균주는 클로스트리듐 rRNA 클러스터 I (Collins 등, 1994) 내에서 서브클러스터를 형성하며, DNA-DNA 재회합 및 DNA 핑거프린팅 실험에 의해 결정된 바와 같이 뚜렷이 다른 종임에도 불구하고, 16S rRNA 유전자 수준에서 적어도 99% 동일성를 갖는다 (WO 2008/028055, US 특허 2011/0229947), .

이 클러스터의 균주들은 유사한 유전자형 및 표현형 모두를 갖는, 공통적인 특성에 의해 정의되며, 이들 모두는 동일한 방식의 에너지 보존 및 발효성 대사를 갖는다. 이 클러스터의 균주들은 사이토크롬이 결여되어 있고 Rnf 복합체를 통해 에너지를 보존한다.

이 클러스터의 모든 균주는 약 4.2 MBp의 게놈 크기 (Kopke 등, 2010) 및 약 32 %몰의 GC 조성 (Abrini 등, 1994; Kopke 등, 2010; Tanner 등, 1993) (WO 2008/028055; US 특허 2011/0229947), 및 우드-륭달 경로의 효소 (일산화탄소 탈수소효소, 포르밀-테트라하이드로폴레이트 합성효소, 메틸렌-테트라하이드로폴레이트 탈수소효소, 포르밀-테트라하이드로폴레이트 사이클로가수분해효소, 메틸렌-테트라하이드로폴레이트 환원효소, 및 일산화탄소 탈수소효소/아세틸-CoA 합성효소)를 인코딩하는 보존된 필수적인 핵심 유전자 오페론, 하이드로제나아제, 포르메이트 탈수소효소, Rnf 복합체 (rnfCDGEAB), 피루베이트:페레독신 산화환원효소, 알데하이드:페레독신 산화환원효소 (Kopke 등, 2010, 2011)를 갖는다. 가스 흡수를 담당하는 우드-륭달 경로 유전자의 조직 및 수는, 핵산 및 아미노산 서열 차이에도 불구하고, 모든 종에서 동일한 것으로 확인되었다 (Kopke 등, 2011).

상기 클러스터의 균주들은 모두 유사한 형태학 및 크기 (로그 성장 세포들은 0.5-0.7 x 3-5 μm 사이임)를 갖고, 중온성이며 (30-37 ℃의 최적의 성장 온도), 엄격히 혐기성 미생물이다 (Abrini 등, 1994; Tanner 등, 1993)(WO 2008/028055). 게다가, 이들 모두는 동일한 주 계통발생적 특성, 예컨대 동일한 pH 범위 (pH 4-7.5, 최적의 초기 pH 5.5-6), 유사한 성장율로 CO 함유 가스 상에서 강한 자가영양 성장, 및 주 발효 최종 생성물로서 에탄올 및 아세트산을 이용한 대사성 프로파일(어떤 조건 하에서, 소량의 2,3-부탄디올 및 젖산이 형성됨) (Abrini 등, 1994; Kopke 등, 2011; Tanner 등, 1993)(WO 2008/028055)을 갖는다. 인돌 생산이 모든 종에서 관찰되었다. 그러나, 상기 종은 다양한 당류 (예를 들면 람노오스, 아라비노오스), 산 (예를 들면 글루코네이트, 시트레이트), 아미노산 (예를 들면 아르기닌, 히스티딘), 또는 다른 기질 (예를 들면 베타인, 부탄올)의 기질 이용이 상이하다. 상기 종의 일부는 어떤 비타민 (예를 들면 티아민, 바이오틴)에 대해 영양 요구성인 반면 다른 것은 영양요구성이 아닌 것으로 확인되었다. 카복실산의 이의 상응하는 알코올로의 환원이 일부 범위의 이들 유기체에서 나타났다 (Perez, Richter, Loftus, & Angenent, 2012).

따라서, 상기 기재된 특성은 C. 아우토에타노게넘 또는 C. 륭달리이와 같은 하나의 유기체에 특이적이지 않지만, 일산화탄소영양, 에탄올-합성 클로스트리듐에 대해서는 오히려 일반적인 특성이다. 성능 차이가 있을 수 있음에도 불구하고, 본 발명은 이들 균주뿐만 아니라 모든 클로스트리듐 종에 걸쳐 작동할 것으로 기대될 수 있다.

특정 구현예에서, 친계 미생물 클로스트리듐 아우토에타노게넘, 클로스트리듐 륭달리이, 및 클로스트리듐 라그스달레이를 포함하는 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 상기 군은 또한 클로스트리듐 코스카티이를 포함한다. 하나의 특별한 구현예에서, 친계 미생물은 클로스트리듐 아우토에타노게넘 DSM23693이다.

친계 미생물은 페닐알라닌 tRNA 합성효소를 인코딩하는 핵산을 함유하거나 함유하지 않을 수 있거나 또는 페닐알라닌 tRNA 합성효소를 발현하거나 발현하지 않을 수 있다.

본 명세서 전반에, PheS, 변이된 PheS 및 ThiK 단백질/펩타이드 및 이를 인코딩하는 핵산에 대한 예시적인 서열 정보가 제공된다. 이 정보는 본 발명에 적용가능한 예시적인 단백질/펩타이드 및 핵산을 확인하고 숙련자가 과도한 실험 없이 본 발명의 특정 구현예를 실시할 수 있게 하기 위해 제공된다. 핵산 및 아미노산 서열은 미생물마다 상이할 수 있는 것으로 인식되어야 한다. 따라서, 본 발명은 이들 특정 구현예에 제한되는 것이 아니라 상이한 서열을 갖지만 실질적으로 동일한 기능을 수행할 수 있는 단백질/펩타이드 및 핵산으로 확장되는 것으로 해석되어야 한다. PheS의 경우 원하는 기능 (페닐알라닌 tRNA 합성효소의 서브유닛으로서)은 페닐알라닌을 이용한 tRNA^Phe의 아미노아실화이다. 변이된 PheS의 경우, 원하는 기능 (페닐알라닌 tRNA 합성효소의 서브유닛으로서)은 페닐알라닌 유사체를 이용한 tRNA의 아미노아실화이다. ThiK의 경우, 원하는 기능은 하기 반응을 촉매하는 것이다:

상기 식에서, Thd는　데옥시티미딘이고,　ATP는 아데노신 5'-삼인산이며,　TMP는 데옥시티미딘 5'-인산이고 ADP는 아데노신 5'-이인산이다.

전형적으로, 그와 같은 대안적인 또는 변이체 단백질/펩타이드는 본원에 예시된 PheS (변이된 PheS 포함) 또는 ThiK 단백질에 대해 적어도 대략 75% 아미노산 서열 유사성을 가질 것이다. 특정 구현예에서, 상기 대안적인 단백질은 본원에 예시된 PheS (변이된 PheS 포함) 또는 ThiK에 대해 적어도 대략 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 유사성을 가질 것이다. 특정 구현예에서, 상기 대안적인 단백질은 본원에 예시된 PheS (변이된 PheS 포함) 또는 ThiK에 대해 적어도 대략 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 가질 것이다. 핵산 수준에서, 상기 대안적인 또는 변이체 단백질을 인코딩하는 유전자는 전형적으로 본원에 예시된 PheS (변이된 PheS 포함) 또는 ThiK에 대해 적어도 대략 75% 서열 상동성을 가질 것이다. 특정 구현예에서, 상기 변이체 또는 대안적인 핵산은 본원에 예시된 PheS (변이된 PheS 포함) 또는 ThiK에 대해 적어도 대략 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 상동성을 가질 것이다. 일 특정 구현예에서, 그와 같은 핵산은 본원에 예시된 PheS (변이된 PheS 포함) 또는 ThiK에 대해 적어도 대략 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 가질 것이다. 기재된 대안적인 또는 변이체 핵산 또는 단백질/펩타이드는 본원에서 "기능적으로 동등한 변이체"로 언급될 수 있다.

또한 PheS의 기능적으로 동등한 변이체, 변이된 PheS, 또는 ThiK는 그것이 변이체인 단백질/펩타이드과 동일한 수준의 활성을 가질 필요는 없는 것으로 인식되어야 한다. 필요한 것은 원하는 활성의 일부 수준이 유지되는 것이다. PheS, 변이된 PheS 또는 ThiK의 활성을 평가하는데 사용되는 분석은 숙련자에게 알려져 있을 것이다. 그러나, 예로써: Phe S의 기능 또는 활성은 아미노아실화를 측정하는 방법을 이용하여 시험될 수 있다. 저자들은 페닐알라닌을 이용하는데 있어 pheS의 활성 변화를 시험하기 위하여 pheS의 아미노아실화의 속도 및 동력학적 파라미터를 사용하였다 (Kast 등, 1991 (J. Mol. Biol 222: 99-124)). 변이된 PheS의 기능 또는 활성은 미생물을 배양하거나 성장시키기 위해 알려진 방법을 이용하여 페닐알라닌의 독성 유사체의 존재하에 성장을 관찰함으로써 수행될 수 있다 (Kast 등, 1991 (J. Mol. Biol 222: 99-124)). ThiK의 기능 또는 활성은 문헌[Brockenbrough et al (Nucl Med Biol. 2007, 34(6):619-23) 및 Jonsson & McIvor (Anal Biochem. 1991, 199(2):232-7)]에 기재된 활성 분석을 이용하거나 또는 예를 들면 BioVendor로부터 상업적으로 이용가능한 ELISA 키트(Cat. No. 901/902)를 이용하여 시험할 수 있다.

친계 미생물을 "형질전환시키는 것"에 대한 언급은 외인성 핵산을 미생물 내로 전달하거나 도입하는 임의의 수단을 포함하는 것으로 광범위하게 받아들여져야 하며, 이는 당해기술에 공지되어 있다. 예로써, "형질전환"은, 비제한적으로 형질감염, 형질도입, 콘주게이션, 및 전기천공을 포함한다.

발명의 측면 및 구현예

본 발명은 친계 미생물로부터 재조합 미생물을 생산하는 방법에서 역선별 마커로서 ThiK 및/또는 PheS의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 Thik 및/또는 PheS를 인코딩하는 핵산(들), 상기 핵산(들)을 포함하는 핵산 벡터, 및 친계 미생물로부터 재조합 미생물을 생산하기 위한 상기 핵산(들) 및/또는 플라스미드의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 친계 미생물로부터 재조합 미생물을 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 친계 미생물은 앞서 본원에 기재된 바와 같이 클로스트리듐 종이며, PheS는 사용시 페닐알라닌 tRNA 합성효소가 페닐알라닌 유사체를 이용하여 tRNA를 아미노아실화할 수 있도록 야생형 PheS와 비교하여 적어도 하나의 변이를 포함한다.

PheS

PheS는 2개의 서브유닛 단백질 페닐알라닌 tRNA 합성효소의 알파 서브유닛이다. 페닐알라닌 tRNA 합성효소는 페닐알라닌을 이용한 tRNA^Phe의 아미노아실화를 담당하며, 이는 세포 내에서 단백질 생산에 매우 중요하다. 상기 효소는 페닐알라닌의 그의 동족 tRNA로의 아실화를 촉매한다. 그 결과로 생긴 tRNA^Phe는 신장 인자에 의해 리보솜으로 전달된 다음 차후에 mRNA 상에 존재하는 그의 동족 항-코돈에 결합된다. 결합되면, 상기 아미노산이 그의 선행하는 아미노산에 공유결합되어 펩타이드 사슬을 증가시킨다.

본 발명의 PheS는 사용시 페닐알라닌 tRNA 합성효소가 페닐알라닌 유사체를 이용하여 tRNA를 아미노아실화할 수 있도록 야생형 PheS와 비교하여 적어도 하나의 변이를 포함하는 것이다. 페닐알라닌 유사체를 세포성 단백질 내로 혼입하는 것은 불안정한 또는 비-기능적 단백질을 야기한다. 따라서, 변이된 PheS를 포함하는 임의의 세포는 전형적으로 생존할 수 없을 것이다.

상기 변이된 PheS가 기초로 하는 야생형 PheS는 많은 상이한 자가 복제성 유기체, 예컨대 식물, 동물, 진균 및 미생물을 포함하는 임의의 적절한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 하나의 특정 구현예에서, PheS는 하나의 미생물로부터 유래된다. 일 구현예에서, PheS는 클로스트리듐 종으로부터 유래되거나 또는 그의 기능적으로 동등한 변이체이다. 단지 예로써, 상기 클로스트리듐 종은 하기를 포함할 수 있다:

클로스트리듐 아우토에타노게넘, 클로스트리듐 륭달리이, 클로스트리듐 라그스달레이, 클로스트리듐 카복시디보란스, 클로스트리듐 드라케이, 클로스트리듐 스카톨로게네스, 클로스트리듐 아세티쿰, 클로스트리듐 포르미코아세티쿰, 클로스트리듐 매그넘, 클로스트리듐 코스카티이, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰, 클로스트리듐 베이제린키이, 클로스트리듐 사카로페르부틸아세토니컴, 클로스트리듐 사카로부틸리쿰, 클로스트리듐 테르모셀룸, 클로스트리듐 셀룰롤리티쿰, 클로스트리듐 파이토페르멘탄스, 클로스트리듐 파스퇴리아눔, 클로스트리듐 클루이베리, 클로스트리듐 디피실레, 클로스트리듐 보툴리늄, 클로스트리듐 스포로게네스, 클로스트리듐 페르프린겐스, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰, 클로스트리듐 아시디솔리, 클로스트리듐 아시디콜레란스, 클로스트리듐 아시두리치, 클로스트리듐 에어로톨레란스,클로스트리듐 아카기이, 클로스트리듐 안데넨세, 클로스트리듐 알기니카르니스, 클로스트리듐 알지디크실라놀리티쿰, 클로스트리듐 알칼리셀룰로시, 클로스트리듐 아미노발레리쿰, 클로스트리듐 아미그달리눔, 클로스트리듐 아르티쿰, 클로스트리듐 아르게티넨세,클로스트리듐 아루란티부티리쿰, 클로스트리듐 바라이티, 클로스트리듐 보툴리늄, 클로스트리듐 보우만니이, 클로스트리듐 부티리쿰,클로스트리듐 베이제린키이, 클로스트리듐 카다베리스, 클로스트리듐 카미니테르말레, 클로스트리듐 카복시디보란스, 클로스트리듐 카르니스, 클로스트리듐 셀라툼, 클로스트리듐 셀레레크레센스, 클로스트리듐 셀룰롤리티쿰, 클로스트리듐 셀룰로시, 클로스트리듐 차르타타비둠, 클로스트리듐 클로스트리디오포르메, 클로스트리듐 칵코이데스, 클로스트리듐 코클레아리움, 클로스트리듐 코클레아툼, 클로스트리듐 콜리넘, 클로스트리듐 디피실레, 클로스트리듐 디올리스, 클로스트리듐 디스포리컴, 클로스트리듐 드라케이,클로스트리듐 두룸, 클로스트리듐 에스테르테티쿰, 클로스트리듐 팔락스, 클로스트리듐 펠시네움, 클로스트리듐 에르비둠, 클로스트리듐 피메타리움,클로스트리듐 포르미카세티쿰, 클로스트리듐 고니이, 클로스트리듐 글라이콜리쿰, 클로스트리듐 글라이사이르히지닐리티쿰, 클로스트리듐 하에폴리티쿰, 클로스트리듐 할로필럼, 클로스트리듐 테타니, 클로스트리듐 페르프린겐스, 클로스트리듐 파이토페르멘탄스, 클로스트리듐 필리포르메, 클로스트리듐 폴리사카롤리티쿰, 클로스트리듐 포풀레티, 클로스트리듐 프로피오니쿰, 클로스트리듐 프로테오클라스티쿰,클로스트리듐 프로테올리티쿰, 클로스트리듐 프사이크로필럼, 클로스트리듐 푸니세움, 클로스트리듐 푸리, 클로스트리듐 푸트레파시엔스, 클로스트리듐 푸트리피쿰, 클로스트리듐 쿠에르시콜럼, 클로스트리듐 퀴니이, 클로스트리듐 라모섬, 클로스트리듐 로세움,클로스트리듐 사카로부틸리쿰, 클로스트리듐 사카롤리티쿰, 클로스트리듐 사카로페르부틸아세토니컴, 클로스트리듐 사르디니엔스, 클로스트리듐 스테르코라리움, 클로스트리듐 스티클란디이, 클로스트리듐 파라독섬, 클로스트리듐 파라페르프린겐스, 클로스트리듐 파라푸트리피쿰, 클로스트리듐 파스쿠이, 클로스트리듐 페이스테우리아넘, 클로스트리듐 노뷔이, 클로스트리듐 셉티쿰, 클로스트리듐 히스톨리티쿰, 클로스트리듐 하이드록시벤조이쿰, 클로스트리듐 하일레모내, 클로스트리듐 인노쿠움, 클로스트리듐 클루이베리, 클로스트리듐 락타티페르멘탄스, 클로스트리듐 라쿠스피익셀렌세, 클로스트리듐 라라미엔세, 클로스트리듐 렌토셀럼, 클로스트리듐 렌토푸트레센스, 클로스트리듐 메톡시벤조보란스, 클로스트리듐 메틸펜토섬, 클로스트리듐 니트로페놀리쿰, 클로스트리듐 노뷔이,클로스트리듐 오세아니쿰, 클로스트리듐 오로티쿰, 클로스트리듐 옥살리쿰, 클로스트리듐 테르티움, 클로스트리듐 테타니, 클로스트리듐 테타노모르펌, 클로스트리듐 테르마세티쿰, 클로스트리듐 테르마우토트로피쿰, 클로스트리듐 테르모알칼리필럼, 클로스트리듐 테르모부티리쿰, 클로스트리듐 테르모셀룸, 클로스트리듐 테르모코프리아에, 클로스트리듐 테르모하이드로설피리쿰, 클로스트리듐 테르모락티쿰, 클로스트리듐 테르모팔마리쿰, 클로스트리듐 테르모파피롤리티쿰, 클로스트리듐 테르모사카롤리티쿰, 클로스트리듐 테르모설피이리게네스, 클로스트리듐 타이로부티리쿰, 클로스트리듐 울리기노섬, 클로스트리듐 울투넨세, 클로스트리듐 빌로섬, 클로스트리듐 비리데, 클로스트리듐 크실라놀리티쿰, 클로스트리듐 크실라노보란스, 클로스트리듐 비페르멘탄스, 및 클로스트리듐 스포로게네스.

어떤 구현예에서, PheS는 클로스트리듐 종의 군으로부터 선택된 미생물로부터 유래되거나 또는 그의 기능적으로 동등한 변이체이다. 일 구현예에서, PheS는 초산생성 클로스트리듐 종의 군으로부터 선택된 미생물로부터 유래되거나 또는 그의 기능적으로 동등한 변이체이다. 하나의 특정 구현예에서, PheS는 종 클로스트리듐 아우토에타노게넘, 클로스트리듐 륭달리이, 클로스트리듐 라그스달레이, 클로스트리듐 카복시디보란스, 클로스트리듐 드라케이, 클로스트리듐 스카톨로게네스, 클로스트리듐 아세티쿰, 클로스트리듐 포르미코아세티쿰, 클로스트리듐 매그넘, 및 클로스트리듐 코스카티이를 포함하는 초산생성 일산화탄소영양 유기체의 군으로부터 선택된 미생물로부터 유래되거나, 또는 이의 어느 하나 이상의 기능적으로 동등한 변이체이다.

하나의 구현예에서, PheS는 앞서 본원에 기재된, 종 C. 아우토에타노게넘, C. 륭달리이, 및 "C. 라그스달레이" 및 관련된 분리물을 포함하는 일산화탄소영양 클로스트리듐의 클러스터로부터 선택된다.

단지 예로써, 적절한 야생형 PheS 단백질 (및 상응하는 핵산 서열)은 하기와 같이, 공공 데이타베이스, 예컨대 유전자은행에 기재된 것들을 포함한다: 클로스트리듐 륭달리이 DSM13528로부터의 PheS (유전자은행 ADK16487.1); 클로스트리듐 카복시디보란스 P7 (유전자은행: EET86555.1); 페닐알라닐-tRNA 합성효소 서브유닛 알파 [클로스트리듐 클루이베리] WP_012620882.1; 페닐알라닐-tRNA 합성효소 서브유닛 알파 [클로스트리듐 페르프린겐스 str. 13] 유전자은행: BAB81592.1; 페닐알라닐-tRNA 합성효소 서브유닛 알파 [클로스트리듐 보툴리늄 A str. ATCC 3502] 유전자은행: YP_001255621.1; 페닐알라닐-tRNA 합성효소 서브유닛 알파 [클로스트리듐 스포로게네스] 유전자은행: WP_003495653.1; 페닐알라닐-tRNA 합성효소 서브유닛 알파 [클로스트리듐 베이제린키이 NCIMB 8052] 유전자은행: YP_001308703.1; 페닐알라닐-tRNA 합성효소 서브유닛 알파 [클로스트리듐 아세토부틸리쿰 ATCC 824] 유전자은행: NP_348973.1; 페닐알라닐-tRNA 합성효소 서브유닛 알파 [클로스트리듐 테르모셀룸 ATCC 27405] 유전자은행: YP_001036648.1. 일 구현예에서, PheS는 C. 아우토에타노게넘으로부터 유래되며 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는다. 이들 예시적인 단백질의 기능적으로 동등한 변이체가 또한 사용될 수 있다.

일 구현예에서, 야생형 PheS와 비교하여 PheS에서의 적어도 하나의 변이는 기질 특이성 부위를 포함하는 영역 내에 위치한다. 일 구현예에서, 상기 기질 특이성 부위는 C. 아우토에타노게넘으로부터의 야생형 PheS 서열번호 21 (또는 C. 륭달리이 DSM13528로부터의 야생형 Phe-S (유전자은행: ADK16487.1))에 대하여 나타낸, 아미노산 306 및 313 사이에 위치한다.

상기 기질 특이성 부위의 정확한 위치는 특정한 PheS 단백질마다 달라질 수 있는 것으로 인식되어야 한다. 따라서, 본 발명은 상기 아미노산 306 내지 313에 의해 정의된 부위의 외부에서 변이되고, 페닐알라닌 tRNA 합성효소에게 페닐알라닌 유사체를 이용하여 tRNA를 아미노아실화하는 능력을 부여하는, 단백질을 포함하는 것으로 받아들여져야 한다. 본 발명과 관련된 당해기술에서 통상의 기술을 가진 자는 상기 아미노산 서열과 상기 기재된 C. 아우토에타노게넘의 아미노산 서열 서열번호 21 (또는 C. 륭달리이 DSM13528로부터의 야생형 Phe-S (유전자은행 ADK16487.1)과의 정렬에 기초하여 적절한 부위를 쉽게 확인할 수 있을 것이다. 그러나, 예로써, E. 콜라이에서의 PheS에서 기질 특이성 부위는 위치 289 내지 296에서의 아미노산에 의해 정의된다.

일 구현예에서, 상기 적어도 하나의 변이는 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실이다. 일 구현예에서, 상기 적어도 하나의 변이는 클로스트리듐 아우토에타노게넘 PheS의 아미노산 서열 (서열번호 21)에 대해 나타낸, 위치 311에서의 아미노산 치환이다. 일 구현예에서, 적어도 하나의 변이는 아미노산 311에서 Ala 대신 Gly으로의 치환이다. 다른 구현예에서, 상기 변이는 클로스트리듐 아우토에타노게넘 PheS의 아미노산 서열 (서열번호 21)에 대하여 나타낸, 위치 310 및 312에서의 아미노산 치환 중 하나 또는 조합이다.

일 구현예에서, 변이된 PheS는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.

본 발명은 또한 본 발명의 변이된 PheS를 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 일 구현예에서, 적어도 하나의 변이는 앞서 본원에 언급된 기질 특이성 부위를 인코딩하는 핵산의 하나의 영역 내에 위치한다.

일 구현예에서, 기질 특이성 부위를 인코딩하는 영역은 C. 아우토에타노게넘에서 PheS를 인코딩하는 핵산 (본원에서 서열번호 12) (또는 C. 륭달리이 DSM13528로부터의 야생형 Phe-S (유전자은행: ADK16487.1)에 대하여 나타낸, 염기 918 및 939 사이에 위치한다. 그러나, 상기 부위는, 위에서 기재된 바와 같이, 야생형 PheS 단백질 상의 기질 특이성 부위의 정확한 위치를 반영하기 위해, 핵산 (예를 들면 상이한 종 또는 유기체로부터의 핵산)마다 상이할 수 있다. 숙련자는 표준 서열 정렬을 통해 대안적인 핵산에서의 적절한 영역을 쉽게 확인할 수 있을 것이다.

일 구현예에서, 상기 적어도 하나의 변이는 하나 이상의 뉴클레오타이드 치환, 부가 및/또는 결실이다.

일 구현예에서, 상기 적어도 하나의 변이는 PheS를 인코딩하는 클로스트리듐 아우토에타노게넘 유전자 (서열번호 12)에 대해 나타낸 염기 932에서의 뉴클레오타이드 치환이다. 일 구현예에서, 적어도 하나의 변이는 염기 932에서 C의 G로의 치환이다. 일 구현예에서, 상기 핵산은 서열번호 14의 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다.

본 발명에 따른 변이된 PheS를 인코딩하는 핵산은, 예를 들면 본원에서의 정보, 예시적인 야생형 PheS 단백질의 아미노산 서열 (및/또는 상기 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열), 및 유전자 암호에 기초하여, 많은 당해기술에서 공지된 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 그러나, 예로써, 이들은 화학적 합성에 의해 또는 표준 재조합 기술을 통해 생산될 수 있다.

예로써, 야생형 PheS를 인코딩하는 예시적인 핵산이 본원에서 그리고 하기와 같은 공공연하게 이용가능한 데이타베이스, 예컨대 유전자은행에서 제공된다:

E. 콜라이 K12 (NC_000913.2), 유전자 식별번호: 946223, EcoGene:EG10709; 클로스트리듐 륭달리이 DSM 13528, 유전자은행: CP001666.1, GI:300433347.

변이된 PheS를 인코딩하는 핵산은 그것이 발현될 특정한 클로스트리듐 종에 대해 코돈 최적화될 수 있는 것으로 인식되어야 한다. 이것은 표준 코돈 최적화 기술을 이용하여 달성될 수 있다.

ThiK

ThiK는 하기 반응을 촉매하는 기능을 하는 단백질이다:

상기 식에서, Thd는 데옥시티미딘이고, ATP는 아데노신 5'-삼인산이며, TMP는 데옥시티미딘 5'-인산이고, ADP는 아데노신 5'-이인산이다. 예를 들면, HSV-TK는 데옥시티미딘의 인산화를 촉매한다.

본 발명에서 사용되는 ThiK는 임의의 적절한 유기체로부터 유래될 수 있다. 그러나, 예로써, ThiK는 단순 포진 바이러스 1 또는 단순 포진 바이러스 2 (HSV-TK), VZV, CMV, HHV7, HHV7, HHV8, EBV로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, HSV-TK 유래의 ThiK의 기능적으로 동등한 변이체가 사용될 수 있다.

단지 예로써, ThiK 단백질은 하기와 같은 공공 데이타베이스, 예컨대 유전자은행에 기재된 것들을 포함한다: AB009254.2. 이 예시적인 단백질의 기능적으로 동등한 변이체가 또한 사용될 수 있다.

일 구현예에서, ThiK는 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 ThiK를 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 숙련자는 본원에 제공된 예시적인 ThiK 단백질의 아미노산 서열, 및 유전자 암호를 고려하여, ThiK를 인코딩하는 핵산의 적절한 뉴클레오타이드 서열을 쉽게 인식할 것이다. 그러나, 예로써, ThiK를 인코딩하는 예시적인 핵산이 공공 데이타베이스, 예컨대 유전자은행 AB009254.2, JQ895546.1, AY575235.1, AF243479.1, AY575236.2, HQ123159.1에 제공되어 있다.

그러나, 예로써, 상기 핵산은 본원에 기재된 바와 같이 서열번호 19 또는 서열번호 22의 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다.

일 구현예에서, ThiK를 인코딩하는 핵산은 서열번호 19의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.

본 발명에 따른 ThiK를 인코딩하는 핵산은, 예를 들면 본원에서의 정보, 예시적인 ThiK 단백질의 아미노산 서열 (및/또는 상기 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산의 서열), 및 유전자 암호에 기초하여, 많은 당해기술에서 공지된 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 그러나, 예로써, 이들은 화학적 합성에 의해 또는 표준 재조합 기술을 통해 생산될 수 있다.

ThiK를 인코딩하는 핵산은 그것이 발현될 특정한 클로스트리듐 종에 대해 코돈 최적화될 수 있는 것으로 인식되어야 한다. 이것은 표준 코돈 최적화 기술을 이용하여 달성될 수 있다.

핵산 벡터

본 발명은 또한 본 발명에 따른 ThiK 및/또는 변이된 PheS를 인코딩하는 핵산을 포함하는 핵산 벡터를 제공한다. 상기 벡터는 본 발명과 관련된 당해분야의 숙련자에 의해 이해될 바와 같이, 어떤 기원이거나 천연일 수 있으며, 예를 들면 클로닝 및 발현 및 형질전환에 적합한 것들을 포함한다.

일 구현예에서, 상기 핵산 벡터는 본 발명의 재조합 미생물을 생성하는데 적합한 벡터이다. 이 구현예에서, 상기 핵산 벡터는 본원에 앞서 기재된 바와 같이 변이된 PheS 및/또는 ThiK를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산을 포함하는 플라스미드이다. 하나의 특정 구현예에서, 상기 벡터는 적어도 하기를 추가로 포함한다:

(a) 적어도 하나의 양성 선별 마커를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열;

(b) 상기 플라스미드와 친계 미생물의 게놈과의 재조합을 가능하게 하는, 친계 미생물의 게놈 내의 표적 위치 또는 핵산 서열 주위의 선택된 영역에 상동인 2개의 핵산 서열.

일 구현예에서, 상기 벡터는 친계 미생물의 게놈 내로 삽입되거나 통합되고자 하는 적어도 하나의 관심있는 핵산을 추가로 포함한다.

일 구현예에서, 양성 선별 마커를 인코딩하는 핵산은 상동성 암(arm)의 외부에 있는 플라스미드 벡터 상에 위치한다. 또 하나의 구현예에서, 양성 선별 마커를 인코딩하는 핵산은 상동성 암 사이에 위치한다.

상기 벡터가 본 발명에 따른 재조합 미생물을 생산하는데 사용되는 경우, 그것은 하나 이상의 선별 마커를 인코딩하는 핵산의 발현을 가능하게 하기 위해 사용시 조정될 것이다. 따라서, 그것은 또한 플라스미드 내에 함유된 선별 마커의 발현을 유도할 수 있는 적어도 하나의 프로모터를 포함할 것이다. 상기 적어도 하나의 프로모터는 적어도 하나의 역선별 마커를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열의 부분 또는 적어도 하나의 양성 선별 마커를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열의 부분을 포함할 수 있거나, 또는 그것은 플라스미드 내에 함유된 별개의 핵산일 수 있고, 이는 사이에 있는 (intervening) 뉴클레오타이드에 의해 하나 이상의 선별 마커를 인코딩하는 핵산(들)로부터 분리된다. 일 구현예에서, 상기 프로모터는 유도성일 수 있다. 또 하나의 구현예에서 상기 프로모터는 항시적일 수 있다.

숙련자는 본 발명의 플라스미드에서 사용되는 프로모터를 쉽게 인식할 것이다. 그러나, 예로써, 이들은 Ppta-ack 프로모터 (본원 실시예 부분에 기재됨), lac 프로모터, ara, tet, 또는 T7 시스템을 포함할 수 있다.

하나의 특정 구현예에서, 상기 플라스미드는 선별 마커(들)의 발현을 유도할 수 있는 강한 프로모터를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 플라스미드는 역선별 마커를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산의 발현을 유도하는 강한 프로모터를 포함한다. 이것은 특히 변이된 PheS가 역선별을 위해 사용되고 숙주 게놈이 PheS를 인코딩하는 핵산을 포함하는 경우이다. 이상적으로는, 상기 강한 프로모터는 숙주 게놈에 존재하는 PheS를 인코딩하는 핵산의 발현과 비교하여, 적어도 동일한 수준, 및 바람직하게는 증가된 수준으로 변이된 PheS의 발현을 유도하는데 충분할 것이다. 대안적으로, 하나 이상의 다른 조절 인자, 예컨대 작동자 및/또는 인핸서가 하나 이상의 선별 마커의 발현을 증가시키기 위해, 프로모터 외에 플라스미드 상에 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 강한 프로모터의 예는, 예를 들면, T3 프로모터, T7 프로모터, PrRNA 프로모터, Ptrc 프로모터, 또는 이하 실시예 부분에 예시된 것들을 포함한다.

적어도 하나의 양성 선별 마커는 본 발명과 관련된 기술 분야에서 숙련자에 의해 쉽게 인식될 많은 공지된 양성 선별 마커로부터 선택될 수 있다. 그러나, 예로써, CatP (클로르암페니콜 아세틸전달효소), ErmB 또는 TetA가 사용될 수 있다 [Heap 등, 2009 (J Microbial Methods; Jul; 78(1); 78-85). 숙련자는 공개된 정보, 및 유전자 암호에 기초하여, 이들 양성 선별 마커를 인코딩하는 핵산에 대한 뉴클레오타이드 서열을 쉽게 인식할 것이다. 그러나, 예로써, 유전자은행: WP_002570989 (CatP), YP_007078965 (ErmB), NP_957551.1 (TetA); CatP (서열번호 23); ErmB (서열번호 24); TetA (서열번호 25).

상동성 암(arm)은 벡터와 숙주 게놈과의 상동 재조합을 가능하게 한다. 상기 암이 이들이 표적화되는 게놈 내의 영역에 100% 상보성인 것이 바람직할 수 있지만, 상기 서열이 관심있는 유전자 영역과의 표적화된 재조합을 가능하게 할 정도로 충분히 상보성이면, 이것은 필요치 않다. 전형적으로, 상기 암은 문헌[Sambrook et al (Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)]에 의해 정의된 바와 같은 엄격한 조건하에 표적 영역에의 혼성화를 가능하게 할 상동성 수준을 가질 것이다. 당해분야의 숙련자에 의해 인식될 바와 같이, 상동성 암은 게놈 내의 핵산 서열에 혼성화되도록 설계될 수 있으며, 이들은 서로 인접하거나 또는 하나 이상의 뉴클레오타이드에 의해 서로 분리된다.

숙련자는 주어진 친계 미생물에 대해 공공연하게 이용가능한 서열 정보를 고려하여 표적화된 상동 재조합을 가능하게 할 정도로 충분한 상동성 암을 쉽게 설계할 수 있을 것이다. 예시적인 정보가 이하 실시예 부분에서 제공된다.

플라스미드는 또한 다른 요소들 중에서도, 하나 이상의 조절 인자, 하나 이상의 복제 기점, 하나 이상의 다중클로닝 부위를 포함하는, 하나 이상의 추가적인 요소를 포함할 수 있다. 하나의 특정 구현예에서, 플라스미드는, 예를 들면, 친계 미생물에 선천적인 (또는 적어도 이미 존재하는) 유전자의 파괴를 가능하게 하도록 조정된다. 또 하나의 구현예에서, 상기 플라스미드는 플라스미드에 의해 인코딩된 하나 이상의 유전자의 통합 및 발현을 가능하게 하도록 조정된다. 상기 플라스미드는 네이키드 (naked) 핵산 뿐만 아니라 세포에의 전달을 용이하게 하는 하나 이상의 제제와 함께 제형화된 핵산 (예를 들면, 리포좀-접합된 핵산, 핵산이 함유된 유기체)의 형태일 수 있다.

앞서 본원에 기재된 바와 같이, 페닐알라닌 tRNA 합성효소는 2개의 서브유닛으로 구성되며, 이들 중 하나는 PheS이다. 제2 서브유닛은 형질전환될 친계 미생물의 게놈 내에 존재할 수 있다. 따라서, 변이되고 페닐알라닌 유사체를 이용하여 tRNA를 아미노아실화할 수 있는 미생물에도 불구하고, 본 발명의 벡터의 존재시, 미생물은 페닐알라닌 tRNA 합성효소를 생산할 수 있다. 상기 변이된 PheS가 앞서 본원에서 기재된 바와 같이 임의의 유기체 유래의 PheS에 기초할 수 있음에도 불구하고, 바람직한 구현예에서 그것은 친계 미생물에 의해 발현된 다른 서브유닛과 양립가능한 것일 것이다. 만약 서브유닛이 양립가능하지 않으면, 이들은 기능적 효소를 형성하지 않을 것이다. 숙련자는 페닐알라닌 tRNA 합성효소 서브유닛이 앞서 본원에 기재된 바와 같이 효소의 활성 및 기능을 시험하기 위한 표준 분석을 이용하여 양립가능한지 여부를 확인할 수 있다. 그러나, 본 발명자들은 임의의 클로스트리듐 종 유래의 PheS가 임의의 다른 클로스트리듐 종 유래의 PheT 서브유닛과 양립할 것이라고 생각한다. 하나의 특정 구현예에서, PheS 서브유닛은 친계 미생물과 동일한 클로스트리듐의 종으로부터 유래된다. 하나의 특정 구현예에서, 변이된 PheS는 형질전환될 친계 미생물에 의해 발현된 페닐알라닌 tRNA 합성효소의 PheS에 기초한다. 또 하나의 구현예에서, 페닐알라닌 유사체를 이용하여 tRNA를 아미노아실화할 수 있는 변이된 것에도 불구하고, 본 발명의 플라스미드는 또한 PheT 서브유닛을 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있고, 이는 변이된 PheS와 함께 활성 페닐알라닌 tRNA 합성효소를 형성한다. 이것은, 예를 들면, 친계 미생물이 PheT 서브유닛을 인코딩하는 핵산을 함유하지 않는 경우에 유용할 수 있다.

플라스미드는 복제성이거나 자가-복제성일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 핵산 벡터는 당해기술에서의 많은 기술 표준을 이용하여 제작될 수 있다. 예를 들면, 화학적 합성 또는 재조합 기술이 사용될 수 있다. 그와 같은 기술은, 예를 들면, 문헌[Sambrook et al (Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)]에 기재되어 있다. 추가의 예시적인 기술은 이하 실시예 부분에 기재되어 있다. 본질적으로, 역선별 마커를 인코딩하는 핵산, 양성 선별 마커를 인코딩하는 핵산, 상동성 암, 관심있는 핵산, 및 임의로 다른 핵산을 포함하는 개개의 핵산은 이들이 그것의 원하는 기능을 수행할 수 있도록 서로 작동가능하게 연결될 것이다.

당해기술에서 공지된 수많은 플라스미드 벡터 중 어느 하나가 본 발명에서 사용하는데 적합할 수 있다. 그러나, 예로써, PMTL80000 시리즈로부터의 벡터가 적합할 것이다. 구체적인 예가 이하 실시예 부분에 제공되어 있다.

본 발명의 어떤 구현예에서, 핵산 벡터는 본 발명의 ThiK 또는 변이된 PheS를 인코딩하는 핵산을 생성하거나 클로닝하는데 적합한 벡터이다. 이 경우에, 상기 벡터는 ThiK 또는 변이된 PheS를 발현하도록 조정될 필요가 없다. 플라스미드 및 바이러스 벡터를 포함하는, 많은 공지된 핵산 벡터가 사용될 수 있다. 그와 같은 벡터는 당해분야의 숙련자에게 공지될 하나 이상의 조절 인자, 복제 기점, 다클로닝 부위 및/또는 선별 마커, 다른 요소들 중에서, 부위 및 마커를 포함할 수 있다.

세포

본 발명은 또한 본 발명의 핵산, 벡터, 본 발명에 따른 PheS 및/또는ThiK를 포함하는 세포를 제공한다. 상기 세포는 임의의 기원일 수 있고 본 발명에 따른 벡터를 클로닝하거나 제조하는데 사용되는 것들을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 세포는 대장균 또는 클로스트리듐 종이다.

방법

앞서 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명은 친계 미생물로부터 재조합 미생물을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 일반적으로 적어도 하기 단계를 포함한다: 친계 미생물을 앞서 본원에 기재된 바와 같은 플라스미드를 이용하여 형질전환시키는 단계, 적어도 하나의 양성 선별 마커를 발현하는 하나 이상의 미생물을 선별하는 단계 및 적어도 하나의 역선별 마커를 발현하지 않는 하나 이상의 미생물을 선별하는 단계.

친계 미생물은 재조합 미생물을 제조하기 위해 당해기술에 공지된 많은 기술을 이용하여 본 발명의 플라스미드로 형질전환될 수 있다. 단지 예로써, 형질전환 (형질도입 또는 형질감염을 포함함)은 전기천공, 전기융합, 초음파처리, 폴리에틸렌 글리콜-매개된 형질전환, 화학적 또는 천연 컴피턴스(competence), 원형질 형질전환, 프로파아지 유도 또는 콘주게이션에 의해 달성될 수 있다.　 적합한 형질전환 기술은 예를 들면 문헌[Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, 1989]에 기재되어 있다.

단지 예로써, 전기천공이 C. 륭달리이 (Kopke 등 2010, Poc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 107: 13087-92; Leang 등, 2012, Appl. Environ. Microbiol.; PCT/NZ2011/000203; WO2012/053905), 및 C. 아우토에타노게넘 　　　　　　　 (PCT/NZ2011/000203; WO2012/053905)과 같은 몇몇 일산화탄소영양 아세토겐 (acetogen)에 대해 기재되어 왔으며, 이는 많은 클로스트리듐, 예컨대 C. 아세토부틸리쿰 (Mermelstein 등, 1992, Biotechnology, 10, 190-195), C. 셀룰롤리티쿰 (Mermelstein 등, 1992, Biotechnology, 10, 190-195) 또는 C. 테르모셀룸 (Tyurin 등, 2004, Appl. Environ. Microbiol. 70: 883-890)에서 사용된 표준 방법이다.

추가 예로써, 전기융합이 초산생성 클로스트리듐 종 MT351 (Tyurin 및 Kiriukhin, 2012, J Biotech: 1-12)에 대해 기재되어 왔다.

추가의 예시적인 기술은 C. 스카톨로게네스와 같은 일산화탄소영양 아세토겐에 대해 기재된 프로파아지 유도를 포함한다 (Prasanna Tamarapu Parthasarathy, 2010, Development of a Genetic Modification System in Clostridium scatologenes ATCC 25775 for Generation of Mutants, Masters Project Western Kentucky University).

추가 예로써, 문헌[Herbert 등, 2003, (FEMS Microbiol. Lett. 229: 103-110) 및 Williams 등, 1990 (J. Gen. Microbiol. 136: 819-826)]의 콘주게이션 방법이 사용될 수 있다.

플라스미드는 네이키드 핵산으로서 친계 미생물에 전달될 수 있거나 또는 형질전환 공정을 용이하게 하는 하나 이상의 제제와 함께 제형화 (예를 들면, 리포좀-접합된 핵산, 핵산이 함유된 유기체)될 수 있는 것으로 인식되어야 한다.

어떤 구현예에서, 형질전환될 미생물에서 활성인 제한 시스템으로 인해, 미생물 내로 도입될 임의의 핵산 (예를 들면 본 발명의 플라스미드)을 메틸화하는 것이 필요하다. 이것은 하기 기재된 것들을 포함하는, 다양한 기술을 이용하여 수행될 수 있다.

예로써, 일 구현예에서, 본 발명의 재조합 미생물은 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 생산된다:

- (i) 본원에 기재된 바와 같은 친계 미생물에 도입될 적어도 하나의 플라스미드 및 (ii) 메틸전달효소 유전자를 포함하는 메틸화 컨스트럭트/벡터의 셔틀 미생물 내로의 도입;

- 메틸전달효소 유전자의 발현;

- 셔틀 미생물로부터 적어도 하나의 플라스미드의 단리; 및,

- 지정 미생물 내로 적어도 하나의 플라스미드의 도입.

일 구현예에서, 상기 메틸전달효소 유전자는 항시적으로 발현된다. 또 하나의 구현예에서, 메틸전달효소 유전자의 발현은 유도된다.

셔틀 미생물은 본 발명의 플라스미드를 구성하는 핵산 서열의 메틸화를 용이하게 하는, 미생물, 바람직하게는 제한 음성 미생물이다. 특정 구현예에서, 상기 셔틀 미생물은 제한 음성 E. 콜라이, 바실러스 서브틸리스, 또는 락토코쿠스 락티스이다.

메틸화 컨스트럭트/벡터는 메틸전달효소를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.

하나 이상의 플라스미드 및 메틸화 컨스트럭트/벡터가 셔틀 미생물 내로 도입되면, 메틸화 컨스트럭트/벡터 상에 존재하는 메틸전달효소 유전자가 유도된다. 본 발명의 하나의 특정 구현예에서, 상기 메틸화 컨스트럭트/벡터가 유도성 lac 프로모터를 포함하고 락토오스 또는 이의 유사체, 더 바람직하게는 이소프로필-β-D-티오-갈락토사이드 (IPTG)의 부가에 의해 유도됨에도 불구하고, 유도는 임의의 적합한 프로모터 시스템에 의할 수 있다. 다른 적합한 프로모터는 ara, tet, 또는 T7 시스템을 포함한다. 본 발명의 추가 구현예에서, 메틸화 컨스트럭트/벡터 프로모터는 항시적 프로모터이다.

특정 구현예에서, 상기 메틸화 컨스트럭트/벡터는 메틸화 컨스트럭트/벡터 상에 존재하는 임의의 유전자가 셔틀 미생물에서 발현되도록 셔틀 미생물의 동일성에 특이적인 복제 기점을 갖는다.

메틸전달효소 효소의 발현은 친계 미생물에 도입될 하나 이상의 플라스미드 상에 존재하는 유전자의 메틸화를 야기한다. 그리고 나서, 상기 플라스미드는 수많은 공지된 방법 중 어느 하나에 따라 셔틀 미생물로부터 단리될 수 있다. 예를 들면, Qiagen 또는 Zymo와 같은 상업적으로 이용가능한 키트가 제조자의 설명에 따라 사용될 수 있다.

하나의 특정 구현예에서, 본 발명의 메틸화 컨스트럭트/벡터 및 하나 이상의 플라스미드 모두는 동시에 단리된다.

친계 미생물에 대해 지정된 하나 이상의 플라스미드는 많은 공지된 방법을 이용하여 미생물 내로 도입될 수 있다. 그러나, 예로써, 위에서 기재된, 또는 이하 실시예 부분에 기재된 방법이 사용될 수 있다.

메틸전달효소 유전자가 셔틀 미생물 내로 도입되어 과-발현될 수 있음이 구상된다. 따라서, 일 구현예에서, 수득한 메틸전달효소 효소는 공지된 방법을 이용하여 수집될 수 있고 친계 미생물 내로 도입될 하나 이상의 플라스미드를 메틸화하기 위해 시험관내에서 사용될 수 있다. 그리고 나서, 상기 하나 이상의 플라스미드는 지정 (모계) 미생물 내로 도입될 수 있다. 또 하나의 구현예에서, 상기 메틸전달효소 유전자가 셔틀 미생물의 게놈 내로 도입된 후 친계 미생물에 대해 지정된 하나 이상의 플라스미드가 상기 셔틀 미생물 내로 도입되고, 상기 셔틀 미생물로부터 상기 하나 이상의 플라스미드가 단리된 후, 상기 하나 이상의 플라스미드가 지정 (모계) 미생물 내로 도입된다.

친계 미생물에 대해 지정된 하나 이상의 플라스미드 및 상기에서 정의된 바와 같이 메틸화 컨스트럭트/벡터는 조합되어 물질의 조성물을 제공할 수 있음이 구상된다. 그러한 조성물은 제한 배리어 기전을 피해 본 발명의 재조합 미생물을 생산하는데 특히 유용하다.

하나의 특별한 구현예에서, 상기 메틸화 컨스트럭트/벡터는 플라스미드이다.

숙련자는 본 발명에 따른 미생물을 생산하는데 사용되는 많은 적합한 메틸전달효소를 인식할 것이다. 그러나, 예로써 바실러스 서브틸리스 파아지 ΦT1 메틸전달효소 및 WO2012053905호에 기재된 메틸전달효소가 사용될 수 있다. 적합한 메틸전달효소를 인코딩하는 핵산은 원하는 메틸전달효소의 효소 및 유전자 암호를 고려하여 쉽게 인식될 것이다.

메틸전달효소 유전자의 발현을 가능하게 하기 위해 조정된 많은 컨스트럭트/벡터가 메틸화 컨스트럭트/벡터를 생성하는데 사용될 수 있다. 그러나, 예로써 WO2012053905호에 언급된 것들이 사용될 수 있다.

플라스미드가 원하는 친계 미생물 내로 도입되면, 제1 선별이 일어난다. 이것은 적어도 하나의 양성 선별 마커를 발현하는 하나 이상의 미생물을 선별하는 것을 포함한다.

상기 미생물은 사용될 양성 선별 마커를 고려하여, 많은 공지된 기술을 이용하여 확인 및 선별될 수 있다. 그러나, 일반적인 예로써, 상기 미생물은 양성 선별 마커를 발현하지 않는 임의의 미생물을 사멸시킬 독소를 함유하는 배지에서 또는 배지 상에서 배양될 수 있다. 구체적인 예로써, 상기 미생물은 미생물에게 항생제 내성을 부여하는 생성물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 본 발명의 플라스미드를 이용하여, 독성 항생제의 존재하에 성장할 수 있다. 상기 플라스미드가 존재하는 상기 미생물들은 생존할 것이고 그렇지 않은 미생물들은 죽을 것이다.

양성 선별 마커를 발현하는 미생물을 선별하는데 사용되는 방법 및 조건의 추가 예는, 예를 들면, 문헌[Sambrook 등, 1989] (앞서 본원에 기재된 바와 같음)에 기재되어 있다. 추가의 예는 이하 실시예 부분에서 제공된다.

본 발명의 방법은 또한 제2 선별을 포함한다. 이것은 적어도 하나의 역선별 마커를 발현하지 않는 하나 이상의 미생물을 선별하는 것을 포함한다.

역선별 마커로서 ThiK를 사용하는 경우, 이러한 역선별 마커를 발현하지 않는 하나 이상의 미생물의 선별은 구아노신 유사체를 함유하는 배지에서 또는 배지 상에서 미생물을 배양하는 것을 포함한다. 하나의 특별한 구현예에서, 상기 구아노신 유사체는 강시클로비르이다. ThiK 역선별 마커를 인코딩하는 핵산을 함유하고 발현하는 상기 미생물은 구아노신 유사체의 존재하에 생존하지 못할 것이다. 따라서, 생존하는 미생물들이 원하는 이중-교차 재조합 사건을 겪은 것으로서 선별된다.

역선별 마커로서 변이된 PheS를 사용하는 경우, 이러한 역선별 마커를 발현하지 않는 하나 이상의 미생물의 선별은 페닐알라닌 유사체를 함유하는 배지에서 또는 배지 상에서 미생물을 배양하는 것을 포함한다. 하나의 특별한 구현예에서, 상기 페닐알라닌 유사체는 앞서 본원에 예시된 바와 같다. 변이된 PheS 역선별 마커를 인코딩하는 핵산을 함유하고 발현하는 상기 미생물들은 페닐알라닌 유사체의 존재하에 생존하지 못할 것이다. 따라서, 생존하는 미생물들이 원하는 이중-교차 재조합 사건을 겪은 것으로서 선별된다.

역선별 마커로서 변이된 PheS를 이용하는 경우, 배지에 페닐알라닌을 포함하는 것이 또한 필요할 수 있다.

본 발명의 방법은 동시 및 연속적 선별 단계를 모두 포함한다. 예를 들면, 양성 선별 마커를 이용하여 단일 교차 사건에 대한 미생물을 선별한 후 역선별 마커를 이용하여 이중 교차 사건에 대한 미생물을 선별할 수 있다. 대안적으로, 상기 양성 선별 및 역선별은 동시에 일어날 수 있다. 예로써, 양성 선별 마커를 인코딩하는 핵산이 상동성 암의 외부에 있는 플라스미드 벡터 상에 위치하는 경우, 단일-교차 사건에 대하여 연속적으로 선별한 다음, 역선별하여, 이중-교차 사건에 대하여 선별할 수 있다. 추가 예로서, 양성 선별 마커를 인코딩하는 핵산이 상동성 암 사이에 위치하는 경우 (그리고 친계 미생물의 게놈 내로 통합되는 경우), 양성 선택 및 역선별은 동시에 일어날 수 있고; 게놈 내로 통합된 양성 선별 마커를 갖고 역선별 마커에 대해 내성인 임의의 세포는 이중 교차 사건이 일어났을 것이다.

하나 이상의 미생물을 배양하는데 적합한 임의의 배지가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 숙련자는 공개된 정보에 기초하여 그리고 본 발명의 특성 및 본원에 기재된 친계 미생물을 고려하여 적절한 배지를 쉽게 인식할 것이다. 바람직하게는, 배지는 페닐알라닌이 거의 내지 전혀 존재하지 않거나, 또는 역선별 동안 페닐알라닌 유사체보다 경쟁력이 우수하지 않은 페닐알라닌의 적어도 어느 수준을 갖는 배지일 것이다. 예로써, 임의의 적절한 최소 배지가 적합할 것이다, 예컨대: 클로스트리듐 최소 배지, 최소 한정 배지 (MDM), 보충된 한정 배지 (SDM) 및 완전 한정 배지 (CDM). 구체적인 예는 실시예 부분에서 하기에 제공된다.

본 발명에 따라 하나 이상의 미생물이 선별되면, 그것은 공지된 방법을 이용하여 배양되고 추후 사용을 위해 선택적으로 보관될 수 있다.

단지 예로써 하기 실시예를 참조하여 본 발명이 설명될 것이다.

실시예

하기 실시예는 역선별 마커 HSV-Tk 및 PheS*를 위한 플라스미드의 제작, 클로스트리듐 아우토에타노게넘에서 역선별을 위한 HSV-Tk 및 PheS*의 기능성, 및 클로스트리듐 아우토에타노게넘의 게놈 상에서 상동 재조합 유전자 치환을 용이하게 하는 HSV-Tk 및 PheS*의 용도를 기술한다. HSV-Tk 유전자의 동족체가 임의의 시퀀싱된 클로스트리듐에 존재하지 않고 pheS 유전자 또는 클로스트리듐 종이 고도로 보존되어 있기 때문에, 동일한 원리가 클로스트리듐 패밀리의 다른 멤버에도 적용될 수 있다.

본 발명에서 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술을 사용하였고, 이는 문헌[Sambrook 등, 1989 및 Ausubel 등, 1987]에 기재되어 있다. E. 콜라이 균주 TOP10 (Life Technologies) 및 클로스트리듐 아우토에타노게넘 DSM10061 및 DSM23693 (DSM10061의 유도체)을 사용하였다. E. 콜라이는 문헌[Sambrook 등, 1989 및 Ausubel 등, 1987]에 기재된 바와 같이 LB 및 SOB 배지에서 성장시켰고, 반면 클로스트리듐 아우토에타노게넘은 혐기성 PETC 배지에서 성장시켰다 (표 1).

표 1: PETC 배지 (ATCC 배지 1754; tcc . org /Attachments/2940.pdf)

실시예 1: 클로스트리듐 아우토에타노게넘에서의 역선별을 위한 HSV - Tk 및 PheS*의 기능성

플라스미드의 제작:

Hsv - tk를 함유하는 플라스미드의 제작 : 인간 헤르페스 바이러스 티미딘 키나아제 (Hsv -tk)의 DNA 서열을 NCBI (핵산 및 아미노산)로부터 수득하였다. Hsv-tk 유전자 내의 코돈을 C. 아우토에타노게넘에 맞게 최적화하고 GeneArt에 의해 합성하고 그것의 표준 벡터 pMK-RQ (서열번호 1 - pMK-RQ-HSV-tk)) 내에 전달하였다.

Nde1 및 Nhe1 제한 효소 (New England Biolabs)로 절단하여 pMK-RQ 벡터로부터 HSV -tk를 방출시키고, 이를 pMTL83155로도 불리는 변형된 형태의 E. 콜라이-클로스트리듐 셔틀 벡터 pMTL83151 (FJ797651.1; Nigel Minton, University of Nottingham; Heap 등, 2009) (서열번호 3) 내로, E. 콜라이 균주 TOP10 (Life Technologies)에서의 동일한 부위 사이로, 클로닝하여 pMTL83155-Hsv-tk (서열번호 2, 도 1)를 생성하였다. 상기 pMTL83155 플라스미드는 Not1 및 Nde1 부위 사이에 C. 아우토에타노게넘 포스페이트 아세틸 전달효소 유전자의 프로모터 서열 (서열번호 3)을 함유한다.

돌연변이된 pheS*의 제작 : 원상태 pheS를 C. 아우토에타노게넘 DSM 10061의 서열 (서열번호 12)로부터의 게놈에서 확인하였다. E. 콜라이 MG1655 (서열번호 13) 및 C. 아우토에타노게넘의 pheS의 서열을 서열 정렬에 의해 비교함으로써, E. 콜라이의 G284 및 G298 사이의 아미노산 (E. 콜라이 MG1655 유래의 PheS의 아미노산 서열은 서열번호 20임) 및 C. 아우토에타노게넘의 아미노산 G301 및 G315 사이의 아미노산의 아미노산 서열의 상동성에 기초하여 추정되는 기질 특이성 부위를 확인하였다 (도 3). 염기 932에 C를 G로 치환하는 단일 점 돌연변이가 도입되어, 알라닌 대신에 글리신을 인코딩하는 코돈을 야기하였다 (서열번호 14).

pheS *를 함유하는 플라스미드의 제작 : 상기 변형된 pheS *를 시작 코돈의 업스트림에 있는 합성 프로모터 및 RBS 부위 (PpheS*; 서열번호 17)에 전사적으로 커플링시켜 높은 항시적 발현을 가능하게 하였다. 상기 컨스트럭트를 또한 PmeI 제한 부위에 의해 측접시켜 대안적인 벡터 내로 상기 유전자의 클로닝을 가능하게 하였다. 합성 및 제한 효소 PmeI를 이용하는 벡터 pMTL85151 내로의 서브클로닝을 GeneArt에 의해 수행하여 최종 벡터 pMTL85151-pheS* (서열번호 18; 도 4)를 수득하였다.

민감성 시험 :

DL -4- 클로로페닐알라닌의 독성 시험 : 공 벡터 pMTL85151를 갖는 E. 콜라이 Top10 및 C. 아우토에타노게넘 DSM23693을 플레이트 상에서 그리고 액체 배지에서 DL-4-클로로페닐의 존재하에 초기에 성장시켜 역선별 마커가 유기체의 성장에 어떤 영향을 미치는지 확인하였다. 상기 화합물은 액체 배지에서 또는 플레이트 상에서 유기체의 성장을 방해하지 않았고 콜로니가 E. 콜라이 및 C. 아우토에타노게넘의 경우 각각 24/48시간 후 동일한 크기로 성장하였음에 주목하였다.

E. 콜라이에서 pheS * 시험 : E. 콜라이에서 작동하는 역선별 마커의 능력을 시험하기 위해, 플라스미드 pMTL85151-pheS*를 TOP10 내로 형질전환시키고 클로르암페니콜 선별 하에서만 성장시켰다. 배양이 지수 성장 단계에 해당하는 0.5의 OD에 도달하면, 3반복하여, 클로르암페니콜 및 DL-4-클로로페닐알라닌 뿐만 아니라 단독 대조군으로서 클로르암페니콜을 함유하는 LB 플레이트 상에 100 ul를 플레이팅하고, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 상기 플레이트를 조사하였고, 클로르암페니콜 플레이트 단독 상에서는, 예상대로 거대한 콜로니의 잔디가 존재하였으나, 클로르암페니콜 및 DL-4-클로로페닐알라닌을 모두 함유하는 플레이트 상에서는, 약한 명암의 작은 콜로니들이 존재하였다는 점에 주목하였는데, 이는 DL-4-클로로페닐알라닌이 pMTL85151-pheS*를 갖는 E. 콜라이의 성장에 영향을 미쳤음을 제시한다. 36시간 후, 이중 선택 플레이트는 클로르암페니콜 단독 플레이트와 동일한 수준보다 더 성장하였다.

C. 아우토에타노게넘의 형질전환 및 플라스미드의 확인 :

C. 아우토에타노게넘의 형질전환 : pMTL83155, pMTL83155-Hsv-tk 및 pMTL85155-PheS 플라스미드를 WO2012053905호에 기재된 바와 같이 C. 아우토에타노게넘 DSM23693 (DSM10061의 유도체) 내로 도입하였다. PETC 액체배지에서 성장시키고 15 μg/ml 티암페니콜 (Sigma) 및 10 μg/ml 트리메토프림 (Sigma)이 보충된 PETC-한천 배지 상에 스프레딩하였다. 48% CO, 2% H2, 20% CO2, 30% N2의 20 psi의 가스 혼합물을 갖는 가압된 가스병에서 37℃에서 3일간 배양 후 콜로니가 관찰되었다. 단일 콜로니를 15 μg/ml 티암페니콜을 함유하는 PETC-한천 배지 상에 스트리킹하였다.

플라스미드의 존재에 대한 형질전환체의 스크리닝 : LZ-pMTL83155 및 LZ-pMTL83155-hsv-tk 형질전환접합체(transconjugant)로부터의 2개의 콜로니를 대상으로, pMTL83155 및 pMTL83155-Hsv-tk 내의 그람-양성 레플리콘 및 catP 양성 선별 마커를 포괄하는 프라이머 repHf (서열번호 4) 및 catr (서열번호 5)을 이용한 PCR에 의해 pMTL83155 및 pMTL83155-Hsv-tk 플라스미드의 존재를 무작위로 스크리닝하였다. 비변형된 C. 아우토에타노게넘을 이들 PCR에서 대조군으로서 사용하였다. PCR을 위해 Maxime PCR PreMix 키트를 사용하였다. 또한 프라이머 fD1 (서열번호 6) 및 rP2 (서열번호 7) 및 Maxime PCR PreMix 키트를 이용하여 이들 형질전환체로부터 16s rDNA를 PCR 증폭시켰다.

repHF 및 catR 프라이머를 이용한 PCR은 LZ-pMTL83155-1 및 -2 및 LZ-pMTL83155-hsv-tk-1 및 -2로부터 ~1.5 kb 밴드를 증폭시켰다 (도 2). 비변형된 C. 아우토에타노게넘 샘플로부터는 증폭이 검출되지 않았는데, 이는 상기 형질전환체 내에만 플라스미드가 존재함을 확인시켜준다. LZ-pMTL83155-1 (서열번호 8) 및 -2 (서열번호 9) 및 LZ-pMTL83155-hsv-tk-1 (서열번호 10) 및 -2 (서열번호 11)로부터의 16s rRNA의 시퀀싱은 상기 클론들이 C. 아우토에타노게넘임을 추가 확인시켜주었다.

16s rRNA를 시퀀싱하기 위해 상기 플라스미드에 특이적인 PCR 프라이머 (서열번호 15 및 16), 및 프라이머 fD1 (서열번호 6) 및 rP2 (서열번호 7)를 이용하여 3개의 독립적인 콜로니에 대해 플라스미드 pMTL85151-pheS*를 갖는 C. 아우토에타노게넘 형질전환체를 확인하였다.

클로스트리듐 아우토에타노게넘에서 역선별 마커로서 HSV - Tk 및 PheS *의 기능성:

강시클로비르에 대한 C. 아우토에타노게넘 형질전환체의 민감성 : 강시클로비르에 대한 LZ-pMTL83155 및 LZ-pMTL83155-hsv-tk의 민감성을 이들을 20nM 강시클로비르만을 함유하는 PETC 한천 배지 및 20nM 강시클로비르 및 15μg/ml 티암페니콜을 함유하는 PETC 한천 배지 상에 도말함으로써 시험하였다. 강시클로비르 플레이트 상의 콜로니는 LZ-pMTL83155 형질전환체만을 가지며 LZ-pMTL83155-hvs-tk 를 갖지 않는 것으로 관찰되었다(표 2). Hvs-tk 유전자의 존재는 강시클로비르에 대한 독성을 부여한다.

DL -4- 클로로페닐알라닌에 대한 플라스미드 pMTL85151 - pheS *를 갖는 C. 아우토에 타노게넘의 민감성 : pMTL85151-pheS*를 갖는 C. 아우토에타노게넘 DSM23693, 뿐만 아니라 pMTL85151를 갖는 C. 아우토에타노게넘 DSM23693의 3개의 독립적인 형질전환체를 티암페니콜이 보충된 액체 PECT 배지에서 성장시키고 CO 단독 조건하에서 37℃에서 성장시켰다. 24시간 후, 100 ul의 각각의 3개의 독립체 뿐만 아니라 대조군 pMTL85151 각각을 티암페니콜 단독, 또는 티암페니콜 및 DL-4-클로로페닐알라닌이 보충된 PETC-MES 한천에 플레이팅하고 48시간 동안 배양하였다. 48시간 후, 플레이트를 조사하였고, 티암페니콜만을 함유하는 플레이트는 4개의 균주 모두에 대해 콜로니의 잔디를 가진 반면, 이중 선별만을 함유하는 플레이트는 pheS*를 함유하는 각각의 독립적인 형질전환체에 대해 3, 4, 및 7개의 콜로니를 가지고 있었고, 그에 반해서, pMTL85151을 갖는 C. 아우토에타노게넘 형질전환체는 티암페니콜 단독 플레이트와 동일한 결과를 나타내었는데, 이는 DL-4-클로로페닐알라닌이 이 균주에 대해 효과가 없음을 제시한다.

표 2: 상응하는 CSM의 존재하에 상이한 전구약물에 대한 C. 아우토에타노게넘 형질전환접합체의 민감성

이것은 전구약물 강시클로비르 및 DL -4-클로로페닐알라닌과 조합된 HSV - Tk 및 PheS * 모두가 C. 아우토에타노게넘의 역선별에 효과적임을 입증하였다

실시예 2 - 클로스트리듐 아우토에타노게넘의 게놈 상에서의 상동 재조합 유전자 치환을 용이하게 하는 PheS * 의 용도

본 실시예는 불활성화된 2차 알코올 탈수소효소를 갖는 클로스트리듐 아우토에타노게넘 DSM23693에서 역선별 마커로서 PheS*에 의해 용이하게 된 상동 재조합을 통해 원상태 클로스트리듐 아우토에타노게넘 R-특이적 2,3-부탄디올 탈수소효소 유전자를 클렙시엘라 뉴모니애 유래의 S-특이적 2,3-부탄디올 탈수소효소 유전자로 치환하는 것을 기재하고 있다.

불활성화된 2차 알코올 탈수소효소를 갖는 C. 아우토에타노게넘 DSM23693 균주의 제작

ClosTron 시스템. (Heap et al 2007)을 이용하여 불활성화된 2차 알코올 탈수소효소 (서열번호: 55)를 갖는 클로스트리듐 아우토에타노게넘 DSM23693의 균주를 제작하였다. ClosTron.com 웹사이트에서 호스트된 인트론 설계 도구를 사용하여 344 bp 표적화 영역 (서열번호: 56)을 설계하고, 또한 센스 및 안티센스 가닥 상의 6개의 표적 부위 (도 8)를 확인하였다. 표적화 영역은 Retro-transposition Activated ermB 마커 (RAM)를 함유하는 벡터 pMTL007C-E2에서 화학적으로 합성하였다.

상기 벡터를 WO2012/053905호에 기재된 바와 같이 C.아우토에타노게넘 DSM23693 내로 도입하였다. 15 μg/ml 티암페니콜을 갖는 PETC MES 상에 성장한 단일 콜로니를 5 μg/ml 클라리트로마이신을 갖는 PETC MES 상에 스트리킹하였다. 각 표적으로부터의 콜로니를 무작위로 채취하고, 측접하는 프라이머 155F (서열번호: 57), 및 939R (서열번호: 58)을 이용하여 삽입을 스크리닝하였다. 인트론 Maxime PCR PreMix를 이용하여 증폭을 수행하였다. 783 bp의 PCR 생성물은 야생형 유전자형을 가리키는 반면, 대략 2.6 kb의 생성물 크기는 표적 부위에서 그룹 II 인트론의 삽입을 제시한다 (도 9). 내성 마커 (catP), 및 그람 양성 복제 기점 (pCB102)의 증폭에 의해 손실 플라스미드를 체크하였다. 이 균주를 PheS*에 의해 용이하게 된 상동 재조합을 통해 원상태 클로스트리듐 아우토에타노게넘 R-특이적 2,3-부탄디올 탈수소효소 유전자를 클렙시엘라 뉴모니애 유래의 S-특이적 2,3-부탄디올 탈수소효소 유전자로 치환하는 기본 균주로서 사용하였다.

플라스미드 pPheS - ErmB의 제작 . PheS* 카세트를 함유하는 단편 (서열번호 27) 및 traJ를 갖는 ColE1 (서열번호 26)을 프라이머 PheS-repH-F (서열번호 28) 및 traJ-ermB-R (서열번호 29)를 이용하여 pMTL85151-PheS* (서열번호 18)로부터 증폭시켰다. pCB102 복제 기점 (서열번호 30)을 함유하는 단편을 프라이머 RepH-ermB-F (서열번호 31) 및 RepH-pheS-R (서열번호 32)을 이용하여 pMTL80000 시리즈 (Heap 등, 2009)로부터 증폭시켰다. 에리트로마이신 내성 카세트 (서열번호 33)를 프라이머 ermB-traJ-F (서열번호 34) 및 ermB-repH-R ((서열번호 35)를 이용하여 pMTL80000 시리즈 (Heap 등, 2009)로부터 증폭시켰다. 상기 기재된 PCR 생성물은 시임리스(seamless) 조립을 용이하게 하는 오버랩을 함유하였다. 이들을 Life Technologies사의 GeneART 시임리스 클로닝 및 조립 키트를 이용하여 조립하였다. 수득한 플라스미드, pPheS*-ErmB를 제한효소 절단 및 단편 분석에 의해 확인하였다.

상동 재조합을 위한 플라스미드 부분의 PCR 증폭 . PheS* (서열번호 27)를 함유하는 벡터 골격을 프라이머 AM015 (서열번호 37) 및 AM035 (서열번호 38)를 이용하여 pPheS*-ErmB (서열번호 36)로부터 증폭시켰다. 업스트림 상동성 암(서열번호 39)을 프라이머 AM016 (서열번호 40) 및 AM017 (서열번호 41)을 이용하여 C. 아우토에타노게넘 게놈 DNA로부터 증폭시켰다. K. 뉴모니애 부탄디올 탈수소효소 유전자 (서열번호 42)를 pMTL85141-P-alsS-budA-budC (Kopke et. al. 2014)로부터, 프라이머 AM018 (서열번호 43) 및 AM019 (서열번호 44)를 이용하여 증폭시켰다. 클로르암페니콜 아세틸전달효소 발현 카세트 (서열번호 45)를 프라이머 AM020 (서열번호 46) 및 AM021 (서열번호 47)를 이용하여 pMTL80000 시리즈 (Heap 등, 2009)로부터 증폭시켰다. 다운스트림 상동성 암(서열번호 48)을 프라이머 AM022 (서열번호 49) 및 AM036 (서열번호 50)를 이용하여 C. 아우토에타노게넘 게놈 DNA로부터 증폭시켰다.

상동 재조합을 위한 pheS * 함유 플라스미드의 제작 . 상기 PCR 생성물은 시임리스 조립을 용이하게 하는 오버랩을 함유하였다. 이들을 Life Technologies사의 GeneART 시임리스 클로닝 및 조립 키트를 이용하여 조립하였다. 수득한 플라스미드, pPheS*-CaBDHXXKpBDH를 제한효소 절단 및 단편 분석에 의해 확인하였다.

플라스미드의 도입, 역선별 , 및 통합을 위한 스크리닝 . pPheS*-CaBDHXXKpBDH를 상기에서 기재된 바와 같이 위치 287에 ClosTron-불활성화된 2차 알코올 탈수소효소를 갖는 C. 아우토에타노게넘 DSM23693의 균주 내로 WO2012053905호에 기재된 바와 같이 도입하였다. 15 μg/ml 티암페니콜 (Sigma) 및 10 μg/ml 트리메토프림 (Sigma)이 보충된 PETC-한천 배지 상에서 성장하는 능력에 의해 형질전환체를 선별하였다. 성공적인 상동 재조합 이중 교차에 대해 선별하기 위해, 콜로니를 15 μg/ml 티암페니콜 및 2 mg/ml p-클로로페닐알라닌이 보충된 PETC-한천 배지에 다시 스트리킹하였다. 성장한 콜로니를 대상으로 상동성 암의 외부의 통합 부위 측면에 있는 프라이머 AM041 (서열번호 51) 및 AM042 (서열번호 52)를 이용한 PCR에 의한 통합을 스크리닝하였다. 야생형에 대한 3137 염기쌍과 비교하여 3570 염기쌍 길이의 PCR 생성물을 생성하는 것으로 성공적인 통합을 확인하였다 (도 7). 정확성을 위해 상기 PCR 생성물을 생거(Sanger) 시퀀싱에 의해 시퀀싱하여 정확하게 예측된 삽입 서열인 것을 확인하였고, 이는 pheS* 역선별 마커에 의해 용이하게 된 단편의 성공적인 통합을 확인시켜 준다.

표 3 - 실시예 2에서 사용된 프라이머

동일한 전략 및 플라스미드가 또한 C. 륭달리이 또는 C. 라그스달레이에 적용될 수 있다. 형질전환 프로토콜이 기재되었다 (WO2012/053905) (Leang, Ueki, Nevin, & Lovley, 2012).

독자들이 본 발명을 과도한 실험 없이 실행할 수 있도록, 본 발명은 특정한 바람직한 구현예를 참조하여 본원에 기재되었다. 그러나, 당해분야의 숙련자는 많은 성분 및 파라미터가 어느 정도 달라지거나 변형될 수 있거나 또는 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 공지된 등가물로 치환될 수 있음을 쉽게 인식할 것이다. 그와 같은 변형 및 등가물은 마치 개별적으로 제시된 것처럼 본원에 편입되는 것으로 인식되어야 한다. 명칭, 제목 등은 독자들이 이 문서를 이해하는 것을 향상시키기 위해 제공되고, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 이해되지 않아야 한다.

상기와 하기에 언급된 모든 출원, 특허 및 문헌의 전체 개시내용은, 만약 존재하는 경우, 본원에 참고로 편입된다. 그러나, 본 명세서에서의 어떤 출원, 특허 및 문헌의 언급은 이들이 유효한 선행기술에 해당하거나 또는 세계의 어느 국가에서 공통의 일반적인 지식을 형성한다는 것을 인정하거나 어떤 형태로 제시하는 것으로 받아들여지지 않아야 한다.

본 명세서 및 후속하는 임의의 청구항 전반에 걸쳐, 상기 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다", "포함하는" 등은 배타적인 의미와 반대되는 포괄적인 의미, 즉 "비제한적으로 포함하는" 의미로 해석되어야 한다.

<110> LanzaTech New Zealand Limited <120> Recombinant Microorganisms and Methods of Use Thereof <130> LT90US1 <140> PCT/US14/55318 <141> 2014-09-12 <150> US 61/877,272 <151> 2013-09-12 <160> 58 <170> KopatentIn 3.0 <210> 1 <211> 3418 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of plasmid pMK-RQ-Hs-tk <400> 1 ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60 attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120 gatagggttg agtggccgct acagggcgct cccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 180 gggaagggcg tttcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt 240 gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg 300 acggccagtg agcgcgacgt aatacgactc actatagggc gaattgaagg aaggccgtca 360 aggccgcatc atatggcttc gtacccctgc catcaacacg cgtctgcgtt cgaccaggct 420 gcgcgttctc gcggccatag caaccgacgt acggcgttgc gccctcgccg gcagcaagaa 480 gccacggaag tccgcccgga gcagaaaatg cccacgctac tgcgggttta tatagacggt 540 ccccacggga tggggaaaac caccaccacg caactgctgg tggccctggg ttcgcgcgac 600 gatatcgtct acgtacccga gccgatgact tactggcggg tgctgggggc ttccgagaca 660 atcgcgaaca tctacaccac acaacaccgc ctcgaccagg gtgagatatc ggccggggac 720 gcggcggtgg taatgacaag cgcccagata acaatgggca tgccttatgc cgtgaccgac 780 gccgttctgg ctcctcatat cgggggggag gctgggagct cacatgcccc gcccccggcc 840 ctcaccctca tcttcgaccg ccatcccatc gccgccctcc tgtgctaccc ggccgcgcgg 900 taccttatgg gcagcatgac cccccaggcc gtgctggcgt tcgtggccct catcccgccg 960 accttgcccg gcacaaacat cgtgttgggg gcccttccgg aggacagaca catcgaccgc 1020 ctggccaaac gccagcgccc cggtgagcgg cttgacctgg ctatgctggc cgcgattcgc 1080 cgcgtttacg ggctacttgc caatacggtg cggtatctgc agtgcggcgg gtcgtggcgg 1140 gaggattggg gacagctttc gggagcggcc ttgacgcccc agggtgccga gccccagagc 1200 aacgcgggcc cacgacccca tatcggggaa acgttattta ccctgtttcg ggcccccgag 1260 ttgctggccc ccaacggcga cctgtacaac gtgtttgcct gggccttgga cgtcttggcc 1320 aaacgcctcc gtcccatgca cgtctttatc ctggattacg accaatcgcc cgccggctgc 1380 cgggacgccc tgctgcaact tacctccggg atggtccaga cccatgtcac caccccaggc 1440 tccataccga cgatctgcga cctggcgcgc acgtttgccc gggagatggg ggaggctcac 1500 tgagctagcc tgggcctcat gggccttcct ttcactgccc gctttccagt cgggaaacct 1560 gtcgtgccag ctgcattaac atggtcatag ctgtttcctt gcgtattggg cgctctccgc 1620 ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcgggta aagcctgggg tgcctaatga 1680 gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat 1740 aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac 1800 ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct 1860 gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg 1920 ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg 1980 ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt 2040 cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg 2100 attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac 2160 ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga 2220 aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 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cttcatcctg cagctcgttc 3120 agcgcaccgc tcagatcggt tttcacaaac agcaccggac gaccctgcgc gctcagacga 3180 aacaccgccg catcagagca gccaatggtc tgctgcgccc aatcatagcc aaacagacgt 3240 tccacccacg ctgccgggct acccgcatgc aggccatcct gttcaatcat actcttcctt 3300 tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 3360 tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccac 3418 <210> 2 <211> 5821 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of plasmid pMTL83155-Hs-tk <400> 2 cctgcaggat aaaaaaattg tagataaatt ttataaaata gttttatcta caattttttt 60 atcaggaaac agctatgacc gcggccgcaa tatgatattt atgtccattg tgaaagggat 120 tatattcaac tattattcca gttacgttca tagaaatttt cctttctaaa atattttatt 180 ccatgtcaag aactctgttt atttcattaa agaactataa gtacaaagta taaggcattt 240 gaaaaaatag gctagtatat tgattgatta tttattttaa aatgcctaag tgaaatatat 300 acatattata acaataaaat aagtattagt gtaggatttt taaatagagt atctattttc 360 agattaaatt tttgattatt tgatttacat tatataatat tgagtaaagt attgactagc 420 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tatataatat tgagtaaagt attgactagc 420 aaaatttttt gatactttaa tttgtgaaat ttcttatcaa aagttatatt tttgaataat 480 ttttattgaa aaatacaact aaaaaggatt atagtataag tgtgtgtaat tttgtgttaa 540 atttaaaggg aggaaatgaa catgaaacat atgaccatga ttacgaattc gagctcggta 600 cccggggatc ctctagagtc gacgtcacgc gtccatggag atctcgaggc ctgcagacat 660 gcaagcttgg cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc 720 caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc 780 cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggcg ctagcataaa 840 aataagaagc ctgcatttgc aggcttctta tttttatggc gcgccgccat tatttttttg 900 aacaattgac aattcatttc ttatttttta ttaagtgata gtcaaaaggc ataacagtgc 960 tgaatagaaa gaaatttaca gaaaagaaaa ttatagaatt tagtatgatt aattatactc 1020 atttatgaat gtttaattga atacaaaaaa aaatacttgt tatgtattca attacgggtt 1080 aaaatataga caagttgaaa aatttaataa aaaaataagt cctcagctct tatatattaa 1140 gctaccaact tagtatataa gccaaaactt aaatgtgcta ccaacacatc aagccgttag 1200 agaactctat ctatagcaat atttcaaatg taccgacata caagagaaac attaactata 1260 tatattcaat ttatgagatt atcttaacag atataaatgt aaattgcaat aagtaagatt 1320 tagaagttta tagcctttgt gtattggaag cagtacgcaa aggctttttt atttgataaa 1380 aattagaagt atatttattt tttcataatt aatttatgaa aatgaaaggg ggtgagcaaa 1440 gtgacagagg aaagcagtat cttatcaaat aacaaggtat tagcaatatc attattgact 1500 ttagcagtaa acattatgac ttttatagtg cttgtagcta agtagtacga aagggggagc 1560 tttaaaaagc tccttggaat acatagaatt cataaattaa tttatgaaaa gaagggcgta 1620 tatgaaaact tgtaaaaatt gcaaagagtt tattaaagat actgaaatat gcaaaataca 1680 ttcgttgatg attcatgata aaacagtagc aacctattgc agtaaataca atgagtcaag 1740 atgtttacat aaagggaaag tccaatgtat taattgttca aagatgaacc gatatggatg 1800 gtgtgccata aaaatgagat gttttacaga ggaagaacag aaaaaagaac gtacatgcat 1860 taaatattat gcaaggagct ttaaaaaagc tcatgtaaag aagagtaaaa agaaaaaata 1920 atttatttat taatttaata ttgagagtgc cgacacagta tgcactaaaa aatatatctg 1980 tggtgtagtg agccgataca aaaggatagt cactcgcatt ttcataatac atcttatgtt 2040 atgattatgt gtcggtggga cttcacgacg aaaacccaca ataaaaaaag agttcggggt 2100 agggttaagc atagttgagg caactaaaca atcaagctag gatatgcagt agcagaccgt 2160 aaggtcgttg tttaggtgtg ttgtaataca tacgctatta agatgtaaaa atacggatac 2220 caatgaaggg aaaagtataa tttttggatg tagtttgttt gttcatctat gggcaaacta 2280 cgtccaaagc cgtttccaaa tctgctaaaa agtatatcct ttctaaaatc aaagtcaagt 2340 atgaaatcat aaataaagtt taattttgaa gttattatga tattatgttt ttctattaaa 2400 ataaattaag tatatagaat agtttaataa tagtatatac ttaatgtgat aagtgtctga 2460 cagtgtcaca gaaaggatga ttgttatgga ttataagcgg ccggccagtg ggcaagttga 2520 aaaattcaca aaaatgtggt ataatatctt tgttcattag agcgataaac ttgaatttga 2580 gagggaactt agatggtatt tgaaaaaatt gataaaaata gttggaacag aaaagagtat 2640 tttgaccact actttgcaag tgtaccttgt acctacagca tgaccgttaa agtggatatc 2700 acacaaataa aggaaaaggg aatgaaacta tatcctgcaa tgctttatta tattgcaatg 2760 attgtaaacc gccattcaga gtttaggacg gcaatcaatc aagatggtga attggggata 2820 tatgatgaga tgataccaag ctatacaata tttcacaatg atactgaaac attttccagc 2880 ctttggactg agtgtaagtc tgactttaaa tcatttttag 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aactgagata cctacagcgt 3780 gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc 3840 ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt 3900 tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca 3960 ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt 4020 tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt 4080 attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag 4140 tcagtgagcg aggaagcgga agagcgccca atacgcaggg ccccctgctt cggggtcatt 4200 atagcgattt tttcggtata tccatccttt ttcgcacgat atacaggatt ttgccaaagg 4260 gttcgtgtag actttccttg gtgtatccaa cggcgtcagc cgggcaggat aggtgaagta 4320 ggcccacccg cgagcgggtg ttccttcttc actgtccctt attcgcacct ggcggtgctc 4380 aacgggaatc ctgctctgcg aggctggccg gctaccgccg gcgtaacaga tgagggcaag 4440 cggatggctg atgaaaccaa gccaaccagg aagggcagcc cacctatcaa ggtgtactgc 4500 cttccagacg aacgaagagc gattgaggaa aaggcggcgg cggccggcat gagcctgtcg 4560 gcctacctgc tggccgtcgg ccagggctac aaaatcacgg 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rRNA nucleic acid sequence of LZ-pMTL83155-1 obtained using primer rP2 (PCR product of plasmid) <400> 8 cskmmtwwyr mwwkrammkt myyswawkrw mkkkrmkkss yggygttwac aaggcccggg 60 aacgtattca ccgcgacatt ctgattcgcg attactagca actccacttc atgtaggcga 120 gtttcagcct gcaatccgaa ctgggggcag tttttgaggt ttgctccacc ttgcggtctt 180 gcttctctct gtactgccca ttgtagcacg tgtgttgccc tggacataag gggcatgatg 240 atttgacgtc atccccacct tcctccgcgt taaccgcggc agtcttgcta gagtgctcaa 300 ctaaatgtta gcaactaaca acaggggttg sgctcgttgc aggacttaac ctaacatctc 360 acgacacgag ctgacgacaa ccatgcacca cctgtatccc tgccccgaag ggcttctctt 420 atctctaara tattcagggk atgtcaagtc caggwaaggt tsttcgcgtt gcttcsaatt 480 aaacmacatg ctccgctgct tgtgsgggcc sccstcaatt cctttgagtt ttaatcwtgc 540 gatcgtactt cccaggcgga gtactwattg tgtttactgc ggcacagaar aggkcgatam 600 ctcctacacc tartactcat cgtttacggc gtggastacc aggrtakcta atcctgtttg 660 ctacccacgc tttcgtgcct sakcrtcagt tacggtccas araatcgcct tcgccactgg 720 tgttsttyct aatstctacg cayytywycg ckacactarr aattmmattc tcctctcccg 780 crctctagat atccagttwg aaatgmastg mccgrgttaa gsssggsyat ttcacatctc 840 actyaatakc tgmctacgca ctctytacgc ccastaatyy ggacwksrct cgccyctacg 900 tattamyrwr rctgctggca cgtmgtagcg wgactsctsc ttgsgtacgt catatcgtcc 960 ycwmgacaga gcwkacatck aaacawcgtc acycmcscgc gtgctgcatc agywtmgmyc 1020 atstgcamaa tacmsacwgc tgcyccgtag agtytggaar grgkkycrat catkmrccga 1080 taccsktcca gwccgckryc caaygtgcct gtaggcgtac trcacgwgct atgcccgrga 1140 cactcacgga atcmcgtacg tcaggaactg aattwgggta tcattcggaw gccgtggrga 1200 rtacmgg 1207 <210> 9 <211> 1179 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16s rRNA nucleic acid sequence of LZ-pMTL83155-2 obtained using primer rP2 (PCR product of plasmid) <400> 9 tskkksyrrk syytgmrtrk rykswyawtk gcccgggaac wkattcaccg cgacattctg 60 attcgcgatt actagcaact ccaacttcat gtaggcgagt ttcagcctgc aatccgaact 120 gggggcagtt tttgaggttt gctccacctt gcggtcttgc ttctctctgt actgcccatt 180 gtagcacgtg tgttgccctg gacataaggg gcatgatgat ttgacgtcat ccccaccttc 240 ctccgcgtta accgcggcag 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tggatgctac tcattcacct atattttatc aaatggaagg cctagtagtt 660 gacaaaggta taacttttgc aaatttaaaa ggcactcttg aactatttgc taaaaagtta 720 ttcggaaatg acatacgtac aaaattcaga cctcatcatt tcccttttac agaaccttct 780 gcagaaatgg atgccagttg ctttgtatgc catggaaaag gctgcagagt atgtaaggga 840 gaagggtgga tagaactttt aggatgcgga atggttcatc ctcaggtact tagaaattgt 900 ggaatagatc ctgaagttta tagtggattt gcttttggaa tgggtgtaga taggatggtc 960 atgttaaaat acggaataga tgatataaga aacatgtatg aaagtgacat gagattttta 1020 aatcaatttt aa 1032 <210> 13 <211> 984 <212> DNA <213> Eschericia coli <400> 13 atgtcacatc tcgcagaact ggttgccagt gcgaaggcgg ccattagcca ggcgtcagat 60 gttgccgcgt tagataatgt gcgcgtcgaa tatttgggta aaaaagggca cttaaccctt 120 cagatgacga ccctgcgtga gctgccgcca gaagagcgtc cggcagctgg tgcggttatc 180 aacgaagcga aagagcaggt tcagcaggcg ctgaatgcgc gtaaagcgga actggaaagc 240 gctgcactga atgcgcgtct ggcggcggaa acgattgatg tctctctgcc aggtcgtcgc 300 attgaaaacg gcggtctgca tccggttacc cgtaccatcg accgtatcga aagtttcttc 360 ggtgagcttg gctttaccgt 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ttactatggg gaaatattat aaagaagata acaaaattat acttcctttg 540 gcaattcaag ttcatcacgc agtatgtgac ggatttcaca tttgccgttt tgtaaacgaa 600 ttgcaggaat tgataaatag t 621 <210> 24 <211> 738 <212> DNA <213> Peptoclostridium difficile <400> 24 atgaacaaaa atataaaata ttctcaaaac tttttaacga gtgaaaaagt actcaaccaa 60 ataataaaac aattgaattt aaaagaaacc gataccgttt acgaaattgg aacaggtaaa 120 gggcatttaa cgacgaaact ggctaaaata agtaaacagg taacgtctat tgaattagac 180 agtcatctat tcaacttatc gtcagaaaaa ttaaaactga atactcgtgt cactttaatt 240 caccaagata ttctacagtt tcaattccct aacaaacaga ggtataaaat tgttgggagt 300 attccttacc atttaagcac acaaattatt aaaaaagtgg tttttgaaag ccatgcgtct 360 gacatctatc tgattgttga agaaggattc tacaagcgta ccttggatat tcaccgaaca 420 ctagggttgc tcttgcacac tcaagtctcg attcagcaat tgcttaagct gccagcggaa 480 tgctttcatc ctaaaccaaa agtaaacagt gtcttaataa aacttacccg ccataccaca 540 gatgttccag ataaatattg gaagctatat acgtactttg tttcaaaatg ggtcaatcga 600 gaatatcgtc aactgtttac taaaaatcag tttcatcaag caatgaaaca cgccaaagta 660 aacaatttaa gtaccgttac ttatgagcaa gtattgtcta tttttaatag ttatctatta 720 tttaacggga ggaaataa 738 <210> 25 <211> 1275 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 25 atgtccacca acttatcagt gataaagaat ccgcgcgttc aatcggacca gcggaggctg 60 gtccggaggc cagacgtgaa acccaacaga cccctgatcg taattctgag cactgtcgcg 120 ctcgacgctg tcggcatcgg cctgattatg ccggtgctgc cgggcctcct gcgcgatctg 180 gttcactcga acgacgtcac cgcccactat ggcattctgc tggcgctgta tgcgttgatg 240 caatttgcct gcgcacctgt gctgggcgcg ctgtcggatc gtttcgggcg gcggccggtc 300 ttgctcgtct cgctggccgg cgctgctgtc gactacgcca tcatggcgac ggcgcctttc 360 ctttgggttc tctatatcgg gcggatcgtg gccggcatca ccggggcgac tggggcggta 420 gccggcgctt atattgccga tatcactgat ggcgatgagc gcgcgcggca cttcggcttc 480 atgagcgcct gtttcgggtt cgggatggtc gcgggacctg tgctcggtgg gctgatgggc 540 ggtttctccc cccacgctcc gttcttcgcc gcggcagcct tgaacggcct caatttcctg 600 acgggctgtt tccttttgcc ggagtcgcac aaaggcgaac gccggccgtt acgccgggag 660 gctctcaacc cgctcgcttc gttccggtgg gcccggggca tgaccgtcgt cgccgccctg 720 atggcggtct tcttcatcat gcaacttgtc ggacaggtgc cggccgcgct ttgggtcatt 780 ttcggcgagg atcgctttca ctgggacgcg accacgatcg gcatttcgct tgccgcattt 840 ggcattctgc attcactcgc ccaggcaatg atcaccggcc ctgtagccgc ccggctcggc 900 gaaaggcggg cactcatgct cggaatgatt gccgacggca caggctacat cctgcttgcc 960 ttcgcgacac ggggatggat ggcgttcccg atcatggtcc tgcttgcttc gggtggcatc 1020 ggaatgccgg cgctgcaagc aatgttgtcc aggcaggtgg atgaggaacg tcaggggcag 1080 ctgcaaggct cactggcggc gctcaccagc ctgacctcga tcgtcggacc cctcctcttc 1140 acggcgatct atgcggcttc tataacaacg tggaacgggt gggcatggat tgcaggcgct 1200 gccctctact tgctctgcct gccggcgctg cgtcgcgggc tttggagcgg cgcagggcaa 1260 cgagccgatc gctga 1275 <210> 26 <400> 26 000 <210> 27 <400> 27 000 <210> 28 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 28 gcaagttgaa aaattcacga aagttacacg ttactaaagg 40 <210> 29 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 29 cactatcaac acactcttaa gcttgccttg ctcgtcggtg 40 <210> 30 <400> 30 000 <210> 31 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 31 gcttttgtaa atttgcataa aaataagaag cctgcatttg 40 <210> 32 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 32 tttagtaacg tgtaactttc gtgaattttt caacttgcc 39 <210> 33 <400> 33 000 <210> 34 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 34 caccgacgag caaggcaagc ttaagagtgt gttgatagtg 40 <210> 35 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 35 gcttcttatt tttatgcaaa tttacaaaag cgactcatag 40 <210> 36 <400> 36 000 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 37 cttgccttgc tcgtcggt 18 <210> 38 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 38 aagtgatagt caaaaggcat aacagtg 27 <210> 39 <400> 39 000 <210> 40 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 40 gacgagcaag gcaagcaatt atagtgaaag atgtgaagg 39 <210> 41 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 41 acctttttca taattatctc tcctttttta taatagtatg g 41 <210> 42 <400> 42 000 <210> 43 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 43 agagataatt atgaaaaagg ttgcattagt tac 33 <210> 44 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 44 ccttacaatt taattaaata ccataccacc gtc 33 <210> 45 <400> 45 000 <210> 46 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 46 gtatttaatt aaattgtaag gatcctagtc ag 32 <210> 47 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 47 gtacttttta tgagctctta actatttatc aattc 35 <210> 48 <400> 48 000 <210> 49 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 49 agagctcata aaaagtactc atagaattga ttaaaaaatg 40 <210> 50 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 50 atgccttttg actatcactt atacatctcc tttaaatcca tttg 44 <210> 51 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 51 ctggaaaaga actcttagc 19 <210> 52 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 52 tgcggtggaa tacaatgg 18 <210> 53 <400> 53 000 <210> 54 <400> 54 000 <210> 55 <400> 55 000 <210> 56 <400> 56 000 <210> 57 <400> 57 000 <210> 58 <400> 58 000

Claims (28)

1. 페닐알라닌 유사체로 tRNA를 아미노아실화하는 변형된 페닐알라닌 tRNA 합성효소(PheS)로서, 변형된 PheS가 야생형 클로스트리듐 아우토에타노게넘(Clostridium autoethanogenum) 또는 클로스트리듐 륭달리이(Clostridium ljungdahlii) PheS(서열 번호 21)와 비교하여 기질 특이성 부위에서 하나 이상의 변이를 포함하고, 야생형 클로스트리듐 아우토에타노게넘 또는 클로스트리듐 륭달리이 PheS(서열번호 21)의 아미노산 위치 306-313에 상응하는 기질 특이성 부위에서 하나 이상의 변이를 포함하는 것인 변형된 PheS.
2. 제1항에 있어서, 상기 페닐알라닌 유사체가 클로로페닐알라닌, 플루오로페닐알라닌 및 브로모페닐알라닌으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 변형된 PheS.
3. 제2항에 있어서, 상기 페닐알라닌 유사체가 DL-4-클로로페닐알라닌, p-클로로페닐알라닌, p-플루오로-L-페닐알라닌, p-플루오로-DL-페닐알라닌, 및 p-브로모-L-페닐알라닌으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 변형된 PheS.
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 야생형 클로스트리듐 아우토에타노게넘 또는 클로스트리듐 륭달리이 PheS(서열번호 21)의 아미노산 위치 311에 상응하는 아미노산 위치에서 변이를 포함하는 것인 변형된 PheS.
6. 제5항에 있어서, 야생형 클로스트리듐 아우토에타노게넘 또는 클로스트리듐 륭달리이 PheS(서열번호 21)의 아미노산 위치 311에 상응하는 아미노산 위치에서 알라닌 대신에 글리신을 포함하는 것인 변형된 PheS.
7. 제1항의 변형된 PheS를 인코딩하는 핵산.
8. 제1항의 변형된 PheS를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 친계 미생물 내로 도입하는 단계를 포함하는, 재조합 미생물의 생산 방법.
9. 제8항에 있어서, 변형된 PheS의 발현에 반하여 선별하는 단계를 더 포함하는 방법.
10. 제9항에 있어서, 변형된 PheS의 발현에 반하여 선별하는 단계가 페닐알라닌 유사체의 존재 하에 재조합 미생물을 배양하는 것을 포함하는 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 페닐알라닌 유사체가 클로로페닐알라닌, 플루오로페닐알라닌 및 브로모페닐알라닌으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 페닐알라닌 유사체가 DL-4-클로로페닐알라닌, p-클로로페닐알라닌, p-플루오로-L-페닐알라닌, p-플루오로-DL-페닐알라닌, 및 p-브로모-L-페닐알라닌으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
13. 제8항에 있어서, 상기 벡터는, 벡터와 친계 미생물 게놈 사이의 상동성 재조합을 가능하게 하는 상동성 암(arm)을 더 포함하는 것인 방법.
14. 제8항에 있어서, 상기 벡터가 관심있는 핵산을 더 포함하는 것인 방법.
15. 제8항에 있어서, 상기 벡터가 양성 선별 마커를 더 포함하는 것인 방법.
16. 제15항에 있어서, 양성 선별 마커의 발현에 대해 선별하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
17. 제16항에 있어서, 양성 선별 마커가 CatP, ErmB 또는 TetA로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
18. 제1항에 있어서, 역선별 마커로서 사용되는 것인 변형된 PheS.
    
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