CN105723219B

CN105723219B - 重组微生物和其使用方法

Info

Publication number: CN105723219B
Application number: CN201480045661.4A
Authority: CN
Inventors: D·J·F·沃克; S·那加拉祖; M·科普克; A·P·穆勒
Original assignee: Lanzatech New Zealand Ltd
Current assignee: Lanzatech NZ Inc
Priority date: 2013-09-12
Filing date: 2014-09-12
Publication date: 2018-06-05
Anticipated expiration: 2034-09-12
Also published as: KR102282778B1; SG11201601263WA; EP3044591A1; EP3044591B1; AU2014318672B2; US20150072395A1; EP3044591A4; CN105723219A; AU2014318672A1; KR20160043983A; WO2015038853A1; DK3044591T3; CA2921430C; CA2921430A1; ES2699479T3; US9745566B2

Abstract

本发明提供用于制备重组梭菌属的选择标记、方法、核酸和载体。

Description

重组微生物和其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2013年9月12日提交的临时申请号61/877,272的优先权，该临时申请的内容特此以引用的方式并入。

技术领域

本发明涉及用于制备重组梭菌属(Clostridium spp)的选择标记。

背景技术

用于制造重组生物体的方法是已知的。所述方法通常包括用外源核酸载体转化生物体，所述外源核酸载体可与宿主基因组整合或保持在稳定的独立(例如，染色体外)状态。

将外源核酸整合至宿主基因组中涉及载体与内源核酸之间的双交叉事件。双交叉重组在过低的频率下发生以致于不能仅靠偶然来可靠地鉴定整合体。因此，选择一个或两个交叉的方法在时间和劳力上都对鉴定频率具有巨大益处。

用于筛选重组事件的选择标记是已知的。这些标记通常是赋予宿主生物体以选择性优点(正向选择)或缺点(反向选择)的蛋白质编码序列。多种正向选择和反向选择标记是已知的并且可以用于筛选其中已发生所希望的重组事件的生物体。正向选择标记通常包含当表达时允许生物体在特定生长环境中存活的基因。反向选择标记通常包含当表达时产生对生物体致命的毒素的基因。

在除梭菌之外的细菌中，存在过多的可用反向选择标记，但不幸的是由于生理或遗传原因，绝大多数在梭菌中不起作用。

本发明的一个目的是克服现有技术的一个或多个缺点，或至少向公众提供有用的选择。

发明内容

在第一方面，本发明提供ThiK和/或PheS在从亲本微生物产生重组微生物的方法中作为反向选择标记的用途，其中所述亲本微生物是梭菌属，并且其中所述PheS相比于野生型PheS包括至少一个变异以使得在使用中苯丙氨酸tRNA合成酶能够使用苯丙氨酸类似物来氨基酰化tRNA。

在第二方面，本发明提供编码ThiK和/或PheS的核酸在用于从亲本微生物产生重组微生物的质粒中的用途，其中所述亲本微生物是梭菌属，并且其中所述PheS相比于野生型PheS包括至少一个变异以使得在使用中苯丙氨酸tRNA合成酶能够使用苯丙氨酸类似物来氨基酰化tRNA。

在第三方面，本发明提供包含编码ThiK和/或PheS的核酸的质粒用于从亲本微生物产生重组微生物的用途，其中所述亲本微生物是梭菌属，并且其中所述PheS相比于野生型PheS包括至少一个变异以使得在使用中苯丙氨酸tRNA合成酶能够使用苯丙氨酸类似物来氨基酰化tRNA。

在第四方面，本发明提供用于从亲本微生物产生重组微生物的方法，所述方法包括至少如下步骤：

a)用质粒转化亲本微生物，所述质粒包含：

1.编码选自PheS和ThiK的至少一个反向选择标记的至少一个核酸序列，其中所述PheS相比于野生型PheS包括至少一个变异以使得在使用中苯丙氨酸tRNA合成酶能够使用苯丙氨酸类似物来氨基酰化tRNA；

2.编码至少一个正向选择标记的至少一个核酸序列；和

3.与所述亲本微生物的基因组内的目标位置周围的所选区域同源的两个核酸序列，其允许所述质粒与所述亲本微生物的基因组重组；

b)选择表达所述至少一个正向选择标记的一种或多种微生物；和

c)选择不表达所述至少一个反向选择标记的一种或多种微生物。

在一个实施方案中，选择步骤b)和c)是同时进行的。在另一个实施方案中，选择步骤b)和c)是依序进行的。

在一个实施方案中，所述质粒还包含有待插入亲本基因组中的至少一个所关注核酸序列。

在第四方面，本发明提供编码PheS的核酸，其中所述PheS相比于野生型PheS变异以使得在使用中苯丙氨酸tRNA合成酶能够使用苯丙氨酸类似物来氨基酰化tRNA，并且其中所述野生型PheS是源自梭菌属或者是其功能等效变异体。

在第五方面，本发明提供包含根据本发明的第四方面的核酸的核酸载体。在一个实施方案中，所述载体是质粒。

在一个实施方案中，所述载体是质粒并且还包含以下中的一种或多种：

a.编码至少一个正向选择标记的至少一个核酸序列；和

b.与亲本微生物的基因组内的目标位置周围的所选区域同源的两个核酸序列，其允许所述质粒与所述亲本微生物的基因组重组。

在一个实施方案中，所述质粒还包含希望插入亲本微生物的基因组中的至少一个所关注核酸序列。

在第六方面，本发明提供PheS，其中所述PheS相比于野生型PheS包含一个或多个变异以使得在使用中苯丙氨酸tRNA合成酶能够使用苯丙氨酸类似物来氨基酰化tRNA，并且其中所述野生型PheS是源自梭菌属或者是其功能等效变异。

在第七方面，本发明提供包含根据本发明的第四方面的核酸、根据本发明的第五方面的载体和/或根据本发明的第六方面的PheS的细胞。

在本发明的上述方面的一个实施方案中，野生型PheS和/或编码PheS的野生型核酸是源自梭菌属或者是其功能等效变异体。

在本发明的上述方面和实施方案的一个实施方案中，PheS相比于野生型的至少一个变异包括一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加。

在本发明的上述方面和实施方案的一个特定实施方案中，PheS的至少一个变异位于底物特异性位点内。在一个实施方案中，所述底物特异性位点位于相对于合成气发酵梭菌(C.autoethanogenum)的野生型PheS(SEQ ID 21)的氨基酸位置读取的氨基酸306与313之间。在一个实施方案中，所述至少一个变异是在位置311处的氨基酸取代。在一个实施方案中，所述至少一个变异是在氨基酸311处用Gly取代Ala。

在本发明的上述方面和实施方案的一个实施方案中，所述PheS是源自合成气发酵梭菌(Clostridium autoethanogenum)或者是其功能等效变异体。

在本发明的上述方面和实施方案的一个实施方案中，变异的PheS包含SEQ IDNo.21的氨基酸序列。

在本发明的上述方面和实施方案的一个实施方案中，编码相比于野生型PheS包括至少一个变异的PheS的核酸相比于编码野生型PheS的核酸包含至少一个变异。在一个实施方案中，编码PheS的核酸中的至少一个变异包括一个或多个核苷酸取代、缺失和/或添加。在一个实施方案中，核酸序列中的一个或多个变异位于编码PheS的底物特异性位点的核酸区域内。在一个实施方案中，编码底物特异性位点的核酸区域位于相对于编码合成气发酵梭菌的野生型PheS(SEQ ID 12)的基因的核苷酸位置读取的碱基918与939之间。在一个实施方案中，所述至少一个变异是在碱基932处的核苷酸取代。在一个实施方案中，所述至少一个变异是在碱基932处用G取代C。

在本发明的上述方面和实施方案的一个实施方案中，编码PheS的核酸是源自合成气发酵梭菌或者是其功能等效变异体。

在本发明的上述方面和实施方案的一个实施方案中，编码变异PheS的核酸包含SEQ ID No.14的序列。

在本发明的上述方面和实施方案的一个实施方案中，所述苯丙氨酸类似物选自氯苯丙氨酸、氟苯丙氨酸和溴苯丙氨酸。在一个特定实施方案中，所述苯丙氨酸类似物选自DL-4-氯苯丙氨酸和对氯苯丙氨酸、对氟-L-苯丙氨酸、对氟-DL-苯丙氨酸、对溴-L-苯丙氨酸。

在本发明的上述方面和实施方案的一个实施方案中，所述ThiK和/或编码ThiK的核酸是来自1型单纯疱疹病毒或2型单纯疱疹病毒(HSV-TK)、VZV、CMV、HHV7、HHV7、HHV8、EBV，或者是其中任何一种或多种的功能等效变异体。

本发明也可以概括地称为在于本申请说明书中单独地或集合地以两种或更多种部分、要素或特征的任何或所有组合形式提及或指示的所述部分、要素和特征，并且在本文提及特定整数时，其在本发明所涉及领域中具有已知等效物，这些已知等效物被视为如同单独地阐述一样并入本文中。

附图说明

根据以下说明，应在所有新颖方面考虑的本发明的这些和其他方面将变得显而易见，所述说明是仅参考附图作为实例给出的，在所述附图中：

图1：示出质粒pMTL83155-HSV-tk的图谱。

图2：示出在合成气发酵梭菌转化株中跨越pMTL83155和pMTL83155-Hsv-tk(h1和h2)上的革兰氏阳性复制子和catP标记的约1.5kb片段的PCR扩增。未被修饰的合成气发酵梭菌(C)被用作对照。筛选LZ-pMTL83155(P1和P2)和LZ-pMTL83155-Hsv-tk(h1和h2)的各2个菌落。

图3：示出来自大肠杆菌MG1655的pheS(Seq ID 13)与来自合成气发酵梭菌的pheS的逐对翻译的核苷酸序列比对，其中假定底物特异性区域呈粗体并加下划线。

图4：示出质粒pMTL85151-pheS*的图谱。

图5：示出包含HSV-tk的质粒的代表性图谱。

图6：示出包含pheS的质粒的代表性图谱。

图7：示出来自利用AM041和AM042的PCR筛选的TAE琼脂糖凝胶电泳结果。泳道1含有GeneRuler 1kb梯(Thermo)。泳道2含有不具有外加模板的PCR。泳道3是具有野生型合成气发酵梭菌基因组DNA作为模板的PCR，其显示预期野生型产物大小(3137bp)。泳道4-7含有具有对氯苯丙氨酸和甲砜霉素抗性菌落作为模板的PCR。泳道6示出用来自肺炎克雷伯菌(K.pneumonia)的丁二醇脱氢酶基因对天然丁二醇脱氢酶基因的成功双交叉置换的预期大小(3570bp)的PCR产物。

图8：示出内含子目标位点(211s、287a、388a、400s、433s和552a)的基因图谱。也示出引物结合位点(底部，水平箭头)。

图9A-9C：第II组内含子插入的证实。图9A：433s和388a(暗淡条带)，图9B：211s和287a，图9C：287a和433。

序列信息的简要说明

在下文所示的附图之前，本说明书包括与本发明相关的核酸和多肽的序列的细节。提供以下序列：

Seq.ID.1：pMK-RQ-Hsv-tk的核酸序列

Seq.ID.2：pMTL83155-Hsv-tk的核酸序列

Seq.ID.3：pMTL83155的核酸序列

Seq.ID.4：引物repHf的核酸序列

Seq.ID.5：引物catr的核酸序列

Seq.ID.6：引物fD1的核酸序列

Seq.ID.7：引物rP2的核酸序列

Seq.ID.8：使用引物rP2获得的LZ-pMTL83155-1的16s rRNA核酸序列

Seq.ID.9：使用引物rP2获得的LZ-pMTL83155-2的16s rRNA核酸序列

Seq.ID.10：使用引物rP2获得的LZ-pMTL83155-hsv-tk-1的16s rRNA核酸序列

Seq.ID.11：使用引物rP2获得的LZ-pMTL83155-hsv-tk-2的16s rRNA核酸序列

Seq.ID.12：编码合成气发酵梭菌的pheS的核酸序列

Seq.ID.13：编码大肠杆菌MG1655的pheS的核酸序列

Seq.ID.14：编码合成气发酵梭菌的变异pheS*的核酸序列

Seq.ID.15：用于证实PheS质粒的存在的正向引物序列-M13F

Seq.ID.16：用于证实PheS质粒的存在的反向引物序列-M13R

Seq.ID.17：合成启动子PpheS*

Seq.ID.18：pMTL85151-pheS*的核苷酸序列

Seq.ID.19：编码1型人类疱疹病毒(1型单纯疱疹病毒)的HSV-TK的核酸序列

Seq.ID.20：大肠杆菌MG1655的PheS的氨基酸序列

Seq.ID.21：合成气发酵梭菌的PheS的氨基酸序列

Seq.ID.22：编码1型人类疱疹病毒(1型单纯疱疹病毒)的ThiK的核酸序列

Seq.ID.23：编码产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的CatP的核酸序列

Seq.ID.24：编码艰难肽梭菌(Peptoclostridium difficile)的ErmB的核酸序列

Seq.ID.25：编码大肠杆菌的TetA的核酸序列

Seq ID 26：用于组装pPheS*-ErmB的PheS*盒和具有traJ PCR产物的ColE1的核酸序列

Seq ID 27：用于组装pPheS-CaBDHXXKpBDH的pPheS片段PCR产物的核酸序列(实施例2)

Seq ID 30：用于组装pPheS*-ErmB的pCB102复制起点PCR产物的核酸序列

Seq ID 33：用于组装pPheS*-ErmB的红霉素抗性盒PCR产物的核酸序列

Seq ID 36：用于扩增用于组装pPheS-CaBDHXXKpBDH的骨架质粒的pPhes-ErmB模板的核酸序列

Seq ID 39：用于组装pPheS-CaBDHXXKpBDH的上游同源臂PCR产物的核酸序列

Seq ID 42：用于组装pPheS-CaBDHXXKpBDH的肺炎克雷伯菌丁二醇脱氢酶基因PCR产物的核酸序列

Seq ID 45：用于组装pPheS-CaBDHXXKpBDH的氯霉素乙酰转移酶盒PCR产物的核酸序列

Seq ID 48：用于组装pPheS*-CaBDHXXKpBDH的下游同源臂PCR产物的核酸序列

Seq ID 53：合成气发酵梭菌的变异pheS*的氨基酸序列

Seq ID 54：1型人类疱疹病毒(1型单纯疱疹病毒)的氨基酸序列

Seq ID 55：合成气发酵梭菌的伯醇:仲醇脱氢酶的核酸序列

Seq ID 56：内含子打靶区域

Seq ID 57：156F的引物序列

Seq ID 58：939R的引物序列

本发明的其他相关序列描述于本文其他地方。例如，参见实施例2中的表3。

具体实施方式

以下是以一般术语给出的本发明的说明，包括其优选实施方案。根据在下文标题“实施例”下给出的公开内容进一步阐明本发明，其提供支持本发明的实验数据、本发明的各种方面的具体实施例和实施本发明的方法。

重组微生物的产生可包括将外源核酸引入亲本微生物中，其中在所述外源核酸与所述微生物的基因组之间发生双交叉重组事件以使得至少一个所希望的遗传变异可引入所述基因组中。双交叉重组在通常过低的频率下发生以致于不能仅靠偶然来可靠地鉴定整合体。因此，本发明人认为，选择一个或两个交叉的方法在时间和劳力上都对鉴定频率具有巨大益处。本发明人在其实验室中已注意到，单交叉重组频率虽然较低，但通过筛选适当数目的菌落可发现，然而第二交叉事件的情况并非如此。本发明提供通过针对引入亲本微生物中的外源核酸中存在的条件致死基因产物反向选择来选择第二事件的方法。这意味着，在反向选择剂存在下仅发生单交叉事件的任何微生物中，条件致死基因产物的表达将杀死未经历二次交叉事件并释放含有编码反向选择标记的基因的核酸的任何细胞。

反向选择标记是已知的。然而，它们未必可转移用于不同属的细菌中。不幸的是由于生理或遗传原因，绝大多数在梭菌中不起作用。本发明人已经令人惊讶地鉴定出ThiK和变异形式的PheS可用作梭菌属中的反向选择标记。

定义

“外源核酸”是源自其所引入的微生物外部的核酸。外源核酸可源自任何适当来源，包括(但不限于)有待引入它们的微生物、与有待引入它们的生物体不同的生物体的菌株或物种，或者他们可能人工地或重组地产生。

“遗传修饰”应广泛地考虑并且旨在包括例如将突变引入基因位点，向基因组添加或从基因组去除一个或多个核苷酸，用不同核苷酸取代一个或多个核苷酸，基因的取代，基因的去除，基因的添加等。

本文可提及“变异PheS”、“变异的PheS”或相比于野生型PheS包括一个或多个或至少一个“变异”的PheS以使得在使用中苯丙氨酸tRNA合成酶能够使用苯丙氨酸类似物来氨基酰化tRNA。“变异”应宽泛地考虑并且包括例如相比于野生型PheS的一个或多个氨基酸的取代、一个或多个氨基酸的缺失和/或一个或多个氨基酸的添加中的一种或组合。“变异”PheS还可包括除允许苯丙氨酸tRNA合成酶使用苯丙氨酸类似物来氨基酰化tRNA的那些之外的一个或多个变异，其条件是它仍然能够基本上执行其所希望的功能。

本文可提及相比于编码野生型PheS的核酸包含一个或多个变异的编码PheS的核酸。“变异”应宽泛地考虑并且包括例如相比于编码野生型PheS的核酸的一个或多个核苷酸的取代、一个或多个核苷酸的缺失和/或一个或多个核苷酸的添加中的一种或组合。所述核酸还可包括除允许苯丙氨酸tRNA合成酶使用苯丙氨酸类似物来氨基酰化tRNA的那些之外的一个或多个变异，其条件是PheS仍然能够基本上执行其所希望的功能。

本文可关于来自特定生物体的野生型PheS(或编码其的核酸)的特定区域或氨基酸或核苷酸位置来描述PheS或编码PheS的核酸的一个或多个变异。应理解，特定区域、氨基酸或核苷酸的确切位置在不同的PheS或编码PheS的核酸之间可轻微改变，例如在不同品系或物种的生物体中。考虑到这种变化，当本文提及特定区域、核苷酸或氨基酸的位置时，其被描述为“关于合成气发酵梭菌的野生型PheS(SEQ ID No.21)(或来自永达尔梭菌(C.ljungdahlii)DSM13528(GenBank：ADK16487.1)的野生型Phe-S)的氨基酸位置或编码合成气发酵梭菌的PheS(本文为SEQ ID 12)(或来自永达尔梭菌DSM13528(GenBank：ADK16487.1)的野生型Phe-S)的核酸的核苷酸位置读取”或“相对于合成气发酵梭菌的野生型PheS(SEQ ID No.21)(或来自永达尔梭菌DSM13528(GenBank：ADK16487.1)的野生型Phe-S)的氨基酸位置或编码合成气发酵梭菌的PheS(本文为SEQ ID 12)(或来自永达尔梭菌DSM13528(GenBank：ADK16487.1)的野生型Phe-S)的核酸的核苷酸位置读取”，其中SEQ ID21(或ADK16487.1)中的第一位置氨基酸和SEQ ID 12(或ADK16487.1)中的第一核苷酸是1位。这些短语应宽泛地考虑并且旨在涵盖其他PheS蛋白质(或编码其的核酸)的等效区域、氨基酸或核苷酸，即使它们可能处于不同位置。本发明所涉及领域的技术人员将能够通过常规序列比对并利用其中所含的信息而容易地鉴定特定PheS或编码其的核酸中的特定区域、氨基酸或核苷酸的定位或位置。

对于PheS的特定区域或两个特定氨基酸或核苷酸“之间”的核酸的提及应视为是指包含所述核苷酸或氨基酸的区域。换句话说，所述区域包括所提及的末端核苷酸或氨基酸。例如，在位置306与313处的氨基酸之间的底物特异性位点包括在位置306和313处存在的氨基酸。

术语“苯丙氨酸类似物”应宽泛地考虑并且包括可代替使微生物产生毒性的苯丙氨酸而可以并入肽和蛋白质中的苯丙氨酸的类似物或衍生物。在一个实施方案中，所述苯丙氨酸类似物选自氯苯丙氨酸、氟苯丙氨酸和溴苯丙氨酸。在一个特定实施方案中，所述苯丙氨酸类似物选自DL-4-氯苯丙氨酸和对氯苯丙氨酸、对氟-L-苯丙氨酸、对氟-DL-苯丙氨酸、对溴-L-苯丙氨酸。本领域技术人员可容易地了解用于本发明中的其他苯丙氨酸类似物。

本文可提及包括“所关注核酸序列”的核酸载体或类似短语。这些短语应宽泛地考虑并且包括一种或多种核苷酸、基因、启动子、调控序列、其他遗传元件并且可为编码或非编码的。其可包括被设计以在宿主基因组中的一个或多个目标位置引入一个或多个遗传修饰的核苷酸序列，包括一个或多个核苷酸的缺失、添加或取代中的一种或组合。在一些实施方案中，所关注的核酸或核酸序列可被设计以缺失亲本微生物基因组中存在的基因。

如本文所用的表述“目标位置”和“目标核酸序列”应宽泛地考虑以包括在希望引入一种或多种遗传修饰(包括一个或多个核苷酸的插入、缺失和/或取代)的亲本或宿主基因组中的任何位点、区域或核苷酸序列，并且包括例如基因、基因间区域、启动子和/或所关注的调控序列。

本文可提及在亲本微生物的基因组内包括“与目标位置周围的所选区域同源的两个核酸序列”的本发明载体。这些核酸序列也可在本文称为“同源臂”。

本文可提及“来自”或“源自”特定生物体的蛋白质(PheS和/或ThiK)或编码这些蛋白质的核酸。这应该宽泛地考虑以是指所述蛋白质或核酸具有所述生物体中的相关蛋白或编码所述相关蛋白的核酸的序列。这不应视为是指所述蛋白质或核酸已经从所述生物体物理获取。这些蛋白质和核酸可使用例如化学合成等制造。

“亲本微生物”是用于产生根据本发明的重组微生物的微生物。在一个实施方案中，所述亲本微生物可能是在自然界中存在者(即野生型微生物)或已经先前修饰者(遗传修饰或重组的微生物)。根据本发明，“亲本微生物”是梭菌属。

本领域技术人员将能够容易地鉴定用于本发明中的梭菌属微生物。然而，举例来说，该群组可包括：合成气发酵梭菌、永达尔梭菌、拉氏梭菌(Clostridium ragsdalei)、食一氧化碳梭菌(Clostridium carboxidivorans)、德雷克氏梭菌(Clostridium drakei)、粪味梭菌(Clostridium scatologenes)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum)、蚁酸醋酸梭菌(Clostridium formicoaceticum)、大梭菌(Clostridium magnum)、克氏梭菌(Clostridiumcoskatii)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)、糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridium sacharoperbutylacetonicum)、糖丁酸梭菌(Clostridium saccharobutylicum)、热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)、植物发酵梭菌(Clostridium phytofermentans)、巴斯德梭菌(Clostridium pasterianum)、科氏梭菌(Clostridium kluyveri)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)、产气荚膜梭菌、丙酮丁醇梭菌、溶酸梭菌(Clostridium acidisoli)、耐酸梭菌(Clostridium aciditolerans)、尿酸梭菌(Clostridium acidurici)、耐氧梭菌(Clostridium aerotolerans)、阿卡氏梭菌(Clostridium akagii)、奥德氏梭菌(Clostridium aldenense)、奥吉氏梭菌(Clostridium algidicarnis)、解木聚糖梭菌(Clostridium algidixylanolyticum)、碱纤维梭菌(Clostridium alkalicellulosi)、氨基戊酸梭菌(Clostridium aminovalericum)、苦杏仁苷梭菌(Clostridium amygdalinum)、北极梭菌(Clostridium arcticum)、阿根廷梭菌(Clostridium argentinense)、金黄丁酸梭菌(Clostridium aurantibutyricum)、巴氏梭菌(Clostridium baratii)、肉毒梭菌、鲍曼梭菌(Clostridium bowmanii)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、拜氏梭菌、尸毒梭菌(Clostridium cadaveris)、卡氏梭菌(Clostridium caminithermale)、食一氧化碳梭菌、肉梭菌(Clostridium carnis)、隐藏梭菌(Clostridium celatum)、速生梭菌(Clostridium celerecrescens)、解纤维梭菌、纤维素梭菌(Clostridium cellulosi)、瘤胃梭菌(Clostridium chartatabidum)、梭状样梭菌(Clostridium clostridioforme)、球形梭菌(Clostridium coccoides)、匙形梭菌(Clostridium cochlearium)、耳蜗形梭菌(Clostridium cocleatum)、肠道梭菌(Clostridium colinum)、艰难肽梭菌、二醇梭菌(Clostridium diolis)、双孢梭菌(Clostridium disporicum)、德雷克氏梭菌、坚韧梭菌(Clostridium durum)、酯梭菌(Clostridium esterteticum)、谲诈梭菌(Clostridiumfallax)、费新尼亚梭菌(Clostridium felsineum)、尔维梭菌(Clostridium ervidum)、菲氏梭菌(Clostridium fimetarium)、蚁酸醋酸梭菌、戈氏梭菌(Clostridium ghonii)、乙二醇梭菌(Clostridium glycolicum)、甘氨酸溶根瘤梭菌(Clostridiumglycyrrhizinilyticum)、溶血梭菌(Clostridium haemolyticum)、嗜卤梭菌(Clostridiumhalophilum)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、产气荚膜梭菌、植物发酵梭菌、梭状梭菌(Clostridium piliforme)、解多糖梭菌(Clostridium polysaccharolyticum)、包氏梭菌(Clostridium populeti)、丙酸梭菌(Clostridium propionicum)、蛋白溶解梭菌(Clostridium proteoclasticum)、解朊梭菌(Clostridium proteolyticum)、嗜冷梭菌(Clostridium psychrophilum)、紫色梭菌(Clostridium puniceum)、普瑞梭菌(Clostridium puri)、腐化梭菌(Clostridium putrefaciens)、腐败梭菌(Clostridiumputrificum)、橡树梭菌(Clostridium quercicolum)、奎尼梭菌(Clostridium quinii)、多枝梭菌(Clostridium ramosum)、玫瑰色梭菌(Clostridium roseum)、糖丁酸梭菌、解糖梭菌(Clostridium saccharolyticum)、糖乙酸多丁醇梭菌、撒丁岛梭菌(Clostridiumsardiniense)、粪堆梭菌(Clostridium stercorarium)、斯氏梭菌(Clostridiumsticklandii)、争论梭菌(Clostridium paradoxum)、类产气荚膜梭菌(Clostridiumparaperfringens)、类腐败梭菌(Clostridium paraputrificum)、帕斯崔梭菌(Clostridium pascui)、巴斯德梭菌(Clostridium pasteurianum)、诺维氏梭菌(Clostridium novyi)、败毒梭菌(Clostridium septicum)、溶组织梭菌(Clostridiumhistolyticum)、羟基苯甲酸梭菌(Clostridium hydroxybenzoicum)、海利氏梭菌(Clostridium hylemonae)、无害梭菌(Clostridium innocuum)、科氏梭菌、乳酸发酵梭菌(Clostridium lactatifermentans)、拉库氏梭菌(Clostridium lacusfiyxellense)、拉腊氏梭菌(Clostridium laramiense)、兰托氏梭菌(Clostridium lentocellum)、缓腐梭菌(Clostridium lentoputrescens)、食甲氧苯梭菌(Clostridium methoxybenzovorans)、甲基戊糖梭菌(Clostridium methylpentosum)、硝基苯酚梭菌(Clostridiumnitrophenolicum)、诺维氏梭菌、海梭菌(Clostridium oceanicum)、乳清酸梭菌(Clostridium oroticum)、草酸梭菌(Clostridium oxalicum)、第三梭菌(Clostridiumtertium)、破伤风梭菌、破伤风形梭菌(Clostridium tetanomorphum)、热醋酸梭菌(Clostridium thermaceticum)、热自养梭菌(Clostridium thermautotrophicum)、嗜热碱梭菌(Clostridium thermoalcaliphilum)、热丁酸梭菌(Clostridium thermobutyricum)、热纤梭菌、热粪梭菌(Clostridium thermocopriae)、热硫化氢梭菌(Clostridiumthermohydrosulfuricum)、热解糖梭菌(Clostridium thermolacticum)、帕姆酒耐热梭菌(Clostridium thermopalmarium)、嗜热溶纸梭菌(Clostridium thermopapyrolyticum)、热解糖梭菌(Clostridium thermosaccharolyticum)、热产硫梭菌(Clostridiumthermosulfiirigenes)、酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)、尤里氏梭菌(Clostridium uliginosum)、突那梭菌(Clostridium ultunense)、多毛梭菌(Clostridiumvillosum)、维利梭菌(Clostridium viride)、解木素梭菌(Clostridium xylanolyticum)、食木聚糖梭菌(Clostridium xylanovorans)、双酶梭菌(Clostridium bifermentans)和生孢梭菌。

在一个特定实施方案中，所述亲本生物体选自产乙酸梭菌属群组。在一个特定实施方案中，所述亲本微生物选自包含物种合成气发酵梭菌、永达尔梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、德雷克氏梭菌、粪味梭菌、醋酸梭菌、蚁酸醋酸梭菌、大梭菌和克氏梭菌的产乙酸一氧化碳营养型生物体的群组。

在一个实施方案中，所述亲本微生物选自包含物种合成气发酵梭菌、永达尔梭菌和“拉氏梭菌”和相关分离株的一氧化碳营养型梭菌群集。这些包括(但不限于)菌株合成气发酵梭菌JAI-1^T(DSM10061)((Abrini,Naveau和Nyns,1994)、合成气发酵梭菌LBS1560(DSM19630)(WO/2009/064200)、合成气发酵梭菌LBS1561(DSM23693)、永达尔梭菌PETC^T(DSM13528＝ATCC 55383)(Tanner,Miller和Yang,1993)、永达尔梭菌ERI-2(ATCC 55380)(美国专利5,593,886)、永达尔梭菌C-01(ATCC55988)(美国专利6,368,819)、永达尔梭菌O-52(ATCC 55989)(美国专利6,368,819)或“拉氏梭菌P11^T”(ATCC BAA-622)(WO 2008/028055)和相关分离株如“克氏梭菌”(美国专利2011/0229947)和其突变菌株如永达尔梭菌OTA-1(Tirado-Acevedo O.使用永达尔梭菌从合成气生产生物乙醇(Production ofBioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium ljungdahlii).博士论文,北卡罗莱纳州立大学(North Carolina State University),2010)。

这些菌株形成梭菌rRNA群集I内的子群集(Collins等,1994)，其在16S rRNA基因水平上具有至少99％同一性，但如通过DNA-DNA再结合和DNA指纹实验(WO 2008/028055、美国专利2011/0229947)确定为不同物种。

这个群集的菌株是由共同的特征限定，具有类似的基因型和表型，并且它们都共有相同的能源节约和发酵代谢模式。这个群集的菌株缺乏细胞色素并且通过Rnf复合物节约能源。

这个群集的所有菌株具有约4.2MBp的基因组大小(等,2010)和约32摩尔％的GC组成(Abrini等,1994；等,2010；Tanner等,1993)(WO 2008/028055；美国专利2011/0229947)，和编码Wood-Ljungdahl途径酶(一氧化碳脱氢酶、甲酰-四氢叶酸合成酶、亚甲基-四氢叶酸脱氢酶、甲酰-四氢叶酸环水解酶、亚甲基-四氢叶酸还原酶和一氧化碳脱氢酶/乙酰基-CoA合成酶)、氢化酶、甲酸脱氢酶、Rnf复合物(rnfCDGEAB)、丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶、醛:铁氧还蛋白氧化还原酶的保守的必要关键基因操纵子(等,2010,2011)。已发现负责气体吸收的Wood-Ljungdahl途径基因的组织和数目在所有物种中相同，但核酸和氨基酸序列不同(等,2011)。

所述群集的菌株都具有类似的形态和大小(对数生长的细胞为0.5-0.7×3-5μm)，是嗜中温(最佳生长温度为30-37℃)和严格厌氧菌(Abrini等,1994；Tanner等,1993)(WO2008/028055)。此外，它们都共有相同的主要系统发育性状，例如相同的pH范围(pH 4-7.5，最佳初始pH为5.5-6)，在含CO气体上以相似生长速率强烈自养生长，和具有乙醇和乙酸作为主要发酵最终产物的代谢分布，其中在某些条件下形成少量的2,3-丁二醇和乳酸(Abrini等,1994；等,2011；Tanner等,1993)(WO2008/028055)。对于所有物种已观测到吲哚产生。然而，所述物种在各种糖(例如鼠李糖、阿拉伯糖)、酸(例如葡糖酸盐、柠檬酸盐)、氨基酸(例如精氨酸、组氨酸)或其他底物(例如甜菜碱、丁醇)的底物利用中不同。发现一些物种对某些维生素(例如硫胺素、生物素)具营养缺陷性，而其他没有。在一系列这些生物体中已显示羧酸还原成其相应醇(Perez,Richter,Loftus和Angenent,2012)。

因此，所述性状对一种生物体如合成气发酵梭菌或永达尔梭菌不具特异性，而是一氧化碳营养型乙醇合成梭菌的一般性状。本发明可以预期不仅在这些菌株间，而且在所有梭菌物种间起作用，但性能可能存在差异。

在特定实施方案中，所述亲本微生物选自包含合成气发酵梭菌、永达尔梭菌和拉氏梭菌的群组。在一个实施方案中，所述群组还包含克氏梭菌。在一个特定实施方案中，所述亲本微生物是合成气发酵梭菌DSM23693。

亲本微生物可能含有或可能不含编码苯丙氨酸tRNA合成酶的核酸或表达苯丙氨酸tRNA合成酶。

在整个本说明书中，对于PheS、变异PheS和ThiK蛋白质/肽和编码其的核酸提供示例性序列信息。提供这种信息以鉴定可应用于本发明的示例性蛋白质/肽和核酸并且允许本领域技术人员在无过度实验的情况下实施本发明的特定实施方案。应了解，在不同微生物之间的核酸和氨基酸序列可能不同。因此，本发明不应理解为局限于这些特定实施方案，而是扩展至具有不同序列但是基本上能够执行相同功能的蛋白质/肽和核酸。对于PheS，所希望的功能(作为苯丙氨酸tRNA合成酶的亚基)是用苯丙氨酸将tRNA^Phe氨基酰化。对于变异的PheS，所希望的功能(作为苯丙氨酸tRNA合成酶的亚基)是用苯丙氨酸类似物将tRNA氨基酰化。对于ThiK，所希望的功能是催化如下反应：

Thd+ATP→TMP+ADP

其中Thd是脱氧胸苷，ATP是5'-三磷酸腺苷，TMP是5'-磷酸脱氧胸苷并且ADP是5'-二磷酸腺苷。

通常，这些替代或变异蛋白质/肽将与本文示例的PheS(包括变异PheS)或ThiK蛋白具有至少约75％氨基酸序列相似性。在特定实施方案中，这些替代蛋白将与本文示例的PheS(包括变异PheS)或ThiK具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列相似性。在特定实施方案中，这些替代蛋白将与本文示例的PheS(包括变异PheS)或ThiK具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性。在核酸水平下，编码这些替代或变异蛋白的基因通常将与编码本文示例的PheS(包括变异PheS)或ThiK的核酸具有至少约75％序列同源性。在特定实施方案中，这些变异或替代核酸将与编码本文示例的PheS(包括变异PheS)或ThiK的核酸具有至少约80％、85％、90％、95％或99％序列同源性。在一个特定实施方案中，这些核酸将与编码本文示例的PheS(包括变异PheS)或ThiK的核酸具有至少约75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性。如所述的替代或变异核酸或蛋白质/肽可在本文称为“功能等效变异体”。

此外应理解，PheS、变异PheS或ThiK的功能等效变异体无需与其为变异体的蛋白质/肽具有相同活性水平。所需要的仅是保持一定程度的所需活性。本领域技术人员将知晓用于评估PheS、变异PheS或ThiK的活性的测定法。然而，举例来说：可使用测量氨基酰化的方法来测试Phe S的功能或活性。作者使用氨基酰化速度和pheS的动力学参数来测试在利用苯丙氨酸时pheS的活性变化(Kast等,1991(分子生物学杂志(J.Mol.Biol)222:99-124))。可通过使用关于培养或生长微生物已知的方法观测在苯丙氨酸的毒性类似物的存在下的生长来进行变异PheS的功能或活性(Kast等,1991(分子生物学杂志(J.Mol.Biol)222:99-124))。可使用如Brockenbrough等(核医学生物学(Nucl Med Biol.)2007,34(6):619-23)和Jonsson和McIvor(分析生物化学(Anal Biochem.)1991,199(2):232-7)所述的活性测定法或利用如例如来自BioVendor(目录号901/902)的市售ELISA试剂盒来测试ThiK的功能或活性。

对于“转化”亲本微生物的提及应宽泛地理解为包括将外源核酸转移或引入本领域中已知的微生物中的任何方法。举例来说，“转化”包括(但不限于)转染、转导、结合和电穿孔。

本发明的方面和实施方案

本发明提供ThiK和/或PheS在用于从亲本微生物产生重组微生物的方法中作为反向选择标记的用途。其还提供编码Thik和/或PheS的核酸、包含所述核酸的核酸载体，和所述核酸和/或质粒用于从亲本微生物产生重组微生物的用途。另外，本发明提供从亲本微生物产生重组微生物的方法。根据本发明，所述亲本微生物是如上文所述的梭菌属，并且所述PheS相比于野生型PheS包括至少一个变异以使得在使用中苯丙氨酸tRNA合成酶能够使用苯丙氨酸类似物将tRNA氨基酰化。

PheS

PheS是双亚基蛋白苯丙氨酸tRNA合成酶的α亚基。苯丙氨酸tRNA合成酶负责用苯丙氨酸将tRNA^Phe氨基酰化，这对于细胞中的蛋白质产生是关键的。所述酶催化苯丙氨酸乙酰化成其同源tRNA。通过延伸因子将所得tRNA^Phe递送至核糖体，随后结合至mRNA上存在的其同源反密码子。一旦结合，氨基酸就共价连接至其前面的氨基酸，从而增加肽链。

本发明的PheS是相比于野生型PheS包括至少一个变异以使得在使用中苯丙氨酸tRNA合成酶能够使用苯丙氨酸类似物来氨基酰化tRNA者。将苯丙氨酸类似物并入细胞蛋白中导致不稳定的或非功能性蛋白。因此，包括变异PheS的任何细胞通常将不能够存活。

变异PheS的基础野生型PheS可能来自任何适当来源，包括任何数目的不同自复制生物体，例如植物、动物、真菌和微生物。在一个特定实施方案中，所述PheS是来自微生物。在一个实施方案中，所述PheS是来自梭菌属或者是其功能等效变异体。仅举例来说，所述梭菌属可包括：

合成气发酵梭菌、永达尔梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、德雷克氏梭菌、粪味梭菌、醋酸梭菌、蚁酸醋酸梭菌、大梭菌、克氏梭菌、丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌、糖丁酸梭菌、热纤梭菌、解纤维梭菌、植物发酵梭菌、巴斯德梭菌、科氏梭菌、艰难梭菌、肉毒梭菌、生孢梭菌、产气荚膜梭菌、丙酮丁醇梭菌、溶酸梭菌、耐酸梭菌、尿酸梭菌、耐氧梭菌、阿卡氏梭菌、奥德氏梭菌、奥吉氏梭菌、解木聚糖梭菌、碱纤维梭菌、氨基戊酸梭菌、苦杏仁苷梭菌、北极梭菌、阿根廷梭菌,金黄丁酸梭菌、巴氏梭菌、肉毒梭菌、鲍曼梭菌、丁酸梭菌、拜氏梭菌、尸毒梭菌、卡氏梭菌、食一氧化碳梭菌、肉梭菌、隐藏梭菌、速生梭菌、解纤维梭菌、纤维素梭菌、瘤胃梭菌、梭状样梭菌、球形梭菌、匙形梭菌、耳蜗形梭菌、肠道梭菌、艰难梭菌、二醇梭菌、双孢梭菌、德雷克氏梭菌、坚韧梭菌、酯梭菌、谲诈梭菌、费新尼亚梭菌、尔维梭菌、菲氏梭菌、蚁酸醋酸梭菌、戈氏梭菌、乙二醇梭菌、甘氨酸溶根瘤梭菌、溶血梭菌、嗜卤梭菌、破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、植物发酵梭菌、梭状梭菌、解多糖梭菌、包氏梭菌、丙酸梭菌、蛋白溶解梭菌、解朊梭菌、嗜冷梭菌、紫色梭菌、普瑞梭菌、腐化梭菌、腐败梭菌、橡树梭菌、奎尼梭菌、多枝梭菌、玫瑰色梭菌、糖丁酸梭菌、解糖梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌、撒丁岛梭菌、粪堆梭菌、斯氏梭菌、争论梭菌、类产气荚膜梭菌、类腐败梭菌、帕斯崔梭菌、巴斯德梭菌、诺维氏梭菌、败毒梭菌、溶组织梭菌、羟基苯甲酸梭菌、海利氏梭菌、无害梭菌、科氏梭菌、乳酸发酵梭菌、拉库氏梭菌、拉腊氏梭菌、兰托氏梭菌、缓腐梭菌、食甲氧苯梭菌、甲基戊糖梭菌、硝基苯酚梭菌、诺维氏梭菌、海梭菌、乳清酸梭菌、草酸梭菌、第三梭菌、破伤风梭菌、破伤风形梭菌、热醋酸梭菌、热自养梭菌、嗜热碱梭菌、热丁酸梭菌、热纤梭菌、热粪梭菌、热硫化氢梭菌、热解糖梭菌、帕姆酒耐热梭菌、嗜热溶纸梭菌、热解糖梭菌、热产硫梭菌、酪丁酸梭菌、尤里氏梭菌、突那梭菌、多毛梭菌、维利梭菌、解木素梭菌、食木聚糖梭菌、双酶梭菌和生孢梭菌。

在某些实施方案中，所述PheS是来自选自梭菌属群组的微生物或者是其功能等效变异体。在一个实施方案中，所述PheS是来自选自产乙酸梭菌属群组的微生物或者是其功能等效变异体。在一个特定实施方案中，PheS是来自选自包含物种合成气发酵梭菌、永达尔梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、德雷克氏梭菌、粪味梭菌、醋酸梭菌、蚁酸醋酸梭菌、大梭菌和克氏梭菌的产乙酸一氧化碳营养型生物体群组的微生物，或者是其中任何一种或多种的功能等效变异体。

在一个实施方案中，PheS选自上文已经描述的包含物种合成气发酵梭菌、永达尔梭菌和“拉氏梭菌”的一氧化碳营养型梭菌和相关分离株的群集。仅举例来说，适当的野生型PheS蛋白(和相应的核酸序列)包括公共数据库如GenBank中所述的那些，如下：来自永达尔梭菌DSM13528(GenBank ADK16487.1)；食一氧化碳梭菌P7(GenBank：EET86555.1)；苯丙氨酰基-tRNA合成酶亚基α[科氏梭菌]WP_012620882.1；苯丙氨酰基-tRNA合成酶亚基α[产气荚膜梭菌菌株13]GenBank：BAB81592.1；苯丙氨酰基-tRNA合成酶亚基α[肉毒梭菌A菌株ATCC 3502]GenBank：YP_001255621.1；苯丙氨酰基-tRNA合成酶亚基α[生孢梭菌]GenBank：WP_003495653.1；苯丙氨酰基-tRNA合成酶亚基α[拜氏梭菌NCIMB 8052]GenBank：YP_001308703.1；苯丙氨酰基-tRNA合成酶亚基α[丙酮丁醇梭菌ATCC 824]GenBank：NP_348973.1；苯丙氨酰基-tRNA合成酶亚基α[热纤梭菌ATCC 27405]GenBank：YP_001036648.1的PheS。在一个实施方案中，所述PheS是来自合成气发酵梭菌并且具有SEQ ID No.21的氨基酸序列。也可使用这些示例性蛋白质的功能等效变异体。

在一个实施方案中，PheS相比于野生型PheS的至少一个变异位于包含底物特异性位点的区域内。在一个实施方案中，所述底物特异性位点位于关于来自合成气发酵梭菌SEQID No.21的野生型PheS(或来自永达尔梭菌DSM13528(GenBank：ADK16487.1)的野生型Phe-S)读取的氨基酸306与313之间。

应理解，在不同的特定PheS蛋白之间，底物特异性位点的确切位置可能改变。因此，本发明应理解为包括已经在上文由氨基酸306至313限定的位点外部变异的PheS蛋白，并且在苯丙氨酸tRNA合成酶上赋予使用苯丙氨酸类似物来氨基酰化tRNA的能力。本发明所涉及领域的普通技术人员将容易地能够基于氨基酸序列与上述合成气发酵梭菌SEQ ID 21(或来自永达尔梭菌DSM13528(GenBank ADK16487.1)的野生型Phe-S)的比对来鉴定适当位点。然而，举例来说，在大肠杆菌中的PheS中，底物特异性位点由位置289至296处的氨基酸限定。

在一个实施方案中，至少一个变异是一个或多个氨基酸取代、添加和/或缺失。在一个实施方案中，至少一个变异是相对于合成气发酵梭菌PheS(SEQ ID 21)的氨基酸序列读取的位置311处的氨基酸取代。在一个实施方案中，至少一个变异是在氨基酸311处用Gly取代Ala。在其他实施方案中，变异是相对于合成气发酵梭菌PheS(SEQ ID 21)的氨基酸序列读取的位置310和312处的氨基酸取代中的一种或组合。

在一个实施方案中，变异PheS包含SEQ ID No.53的氨基酸序列或由SEQ ID No.53的氨基酸序列组成。

本发明还涉及编码本发明的变异PheS的核酸。在一个实施方案中，至少一个变异位于编码如上文所提及的底物特异性位点的核酸区域内。

在一个实施方案中，编码底物特异性位点的区域位于相对于编码合成气发酵梭菌中的PheS(本文为SEQ ID 12)(或来自永达尔梭菌DSM13528(GenBank：ADK16487.1)的野生型Phe-S)的核酸读取的碱基918与939之间。然而，不同核酸(例如来自不同物种或生物体的核酸)之间的位点可能不同，以反映如上文所述的野生型PheS蛋白上的底物特异性位点的确切位置。本领域技术人员将容易地能够经由标准序列比对来鉴定可选核酸中的适当区域。

在一个实施方案中，至少一个变异是一个或多个核苷酸取代、添加和/或缺失。

在一个实施方案中，至少一个变异是相对于编码PheS(SEQ ID12)的合成气发酵梭菌基因读取的碱基932处的核苷酸取代。在一个实施方案中，至少一个变异是在碱基932处用G取代C。在一个实施方案中，所述核酸包含SEQ ID No.14的序列或由SEQ ID No.14的序列组成。

可使用本领域中任何数目的已知方法，例如基于本文的信息、示例性野生型PheS蛋白的氨基酸序列(和/或编码所述氨基酸序列的核酸序列)和遗传密码，产生编码根据本发明的变异PheS的核酸。然而，举例来说，它们可通过化学合成或经由标准重组技术来产生。

举例来说，编码野生型PheS的示例性核酸提供于本文中和公开可用的数据库如GenBank中，如下：大肠杆菌K12(NC_000913.2)，Gene ID：946223，EcoGene:EG10709；永达尔梭菌DSM 13528，GenBank：CP001666.1，GI:300433347。

应理解，编码变异PheS的核酸可对于其所表达的特定梭菌属进行密码子优化。这可使用标准的密码子优化技术来实现。

ThiK

ThiK是用于催化如下反应的蛋白质：

Thd+ATP→TMP+ADP

其中Thd是脱氧胸苷，ATP是5'-三磷酸腺苷，TMP是5'-磷酸脱氧胸苷并且ADP是5'-二磷酸腺苷。HSV-TK例如催化脱氧胸苷的磷酸化。

用于本发明中的ThiK可源自任何适当的生物体。然而，举例来说，ThiK可能是来自1型单纯疱疹病毒或2型单纯疱疹病毒(HSV-TK)、VZV、CMV、HHV7、HHV7、HHV8、EBV。可选地，可使用来自HSV-TK的ThiK的功能等效变异体。

仅举例来说，ThiK蛋白包括公共数据库如GenBank中所述的那些，如下：AB009254.2。也可使用这种示例性蛋白的功能等效变异体。

在一个实施方案中，所述ThiK包含SEQ ID No.54的氨基酸序列。

本发明还涉及编码ThiK的核酸。考虑到本文提供的示例性ThiK蛋白的氨基酸序列和遗传密码，本领域技术人员将容易地了解编码ThiK的核酸的适当核苷酸序列。然而，举例来说，编码ThiK的示例性核酸提供于公共数据库中，例如GenBank AB009254.2、JQ895546.1、AY575235.1、AF243479.1、AY575236.2、HQ123159.1。

然而，举例来说，所述核酸可具有如本文所述的SEQ ID 19或SEQ ID 22的核苷酸序列。

在一个实施方案中，编码ThiK的核酸具有SEQ ID No.19的核苷酸序列。

可使用本领域中任何数目的已知方法，例如基于本文的信息、示例性ThiK蛋白的氨基酸序列(和/或编码所述氨基酸序列的核酸的序列)和遗传密码来产生编码根据本发明的ThiK的核酸。然而，举例来说，它们可通过化学合成或经由标准重组技术产生。

应理解，编码ThiK的核酸可对于其所表达的特定梭菌属进行密码子优化。这可使用标准密码子优化技术来实现。

核酸载体

本发明还提供包含编码根据本发明的ThiK和/或变异PheS的核酸的核酸载体。所述载体可具有如本发明所涉及领域的技术人员所了解的任何来源或性质，包括例如适于克隆和表达和转化的那些。

在一个实施方案中，核酸载体是适于产生本发明的重组微生物者。在这个实施方案中，所述核酸载体是至少包含编码如上文所述的变异PheS和/或ThiK的核酸的质粒。在一个特定实施方案中，所述载体还至少包含：

(a)编码至少一个正向选择标记的至少一个核酸序列；

(b)与亲本微生物的基因组内的目标位置或核酸序列周围的所选区域同源的两个核酸序列，其允许所述质粒与所述亲本微生物的基因组重组。

在一个实施方案中，所述载体还包含希望插入或整合至亲本微生物的基因组内的至少一个所关注核酸。

在一个实施方案中，编码正向选择标记的核酸位于同源臂外部的质粒载体上。在另一个实施方案中，编码正向选择标记的核酸位于同源臂之间。

在载体用于产生根据本发明的重组微生物时，其将在使用中改适以允许编码一个或多个选择标记的核酸的表达。因此，其还将包括能够驱动质粒中所含的选择标记表达的至少一个启动子。所述至少一个启动子可包含编码至少一个反向选择标记的至少一个核酸序列的一部分或编码至少一个正向选择标记的至少一个核酸序列的一部分，或者它可能是质粒内所含的另一种核酸，其与编码所述一个或多个选择标记的核酸通过中间核苷酸隔开。在一个实施方案中，所述启动子可能是诱导型的。在另一个实施方案中，所述启动子是组成型的。

本领域技术人员将容易地理解用于本发明质粒中的启动子。然而，举例来说，这些可包括Ppta-ack启动子(本文描述于实施例部分中)、lac启动子、ara、tet或T7系统。

在一个特定实施方案中，所述质粒包括能够驱动选择标记表达的强启动子。在一个实施方案中，所述质粒包括强启动子以驱动编码反向选择标记的至少一种核酸的表达。在变异PheS用于反向选择并且宿主基因组包括编码PheS的核酸的情况下尤其如此。理想地，相比于编码宿主基因组中存在的PheS的核酸的表达，强启动子将足以在至少相同水平下并且优选地在增加水平下驱动变异PheS的表达。可选地，除启动子之外，一种或多种其他调控元件如操纵子和/或增强子可包括在质粒上，以增加一个或多个选择标记的表达。用于本发明中的强启动子的实例包括例如T3启动子、T7启动子、PrRNA启动子、Ptrc启动子或在下文实施例部分中所示例的那些。

至少一个正向选择标记可选自将为本发明所涉及技术领域中的技术人员将容易理解的任何数目的已知正向选择标记。然而，举例来说，可使用CatP(氯霉素乙酰转移酶)、ErmB或TetA[Heap等,2009(微生物方法杂志(J Microbial Methods)；7月；78(1)；78-85)]。基于公开信息和遗传密码，本领域技术人员将容易地了解编码这些正向选择标记的核酸的核苷酸序列。然而，举例来说，GenBank：WP_002570989(CatP)；YP_007078965(ErmB),NP_957551.1(TetA)；CatP(SEQ ID 23)；ErmB(SEQ ID 24)；TetA(SEQ ID 25)。

同源臂允许载体与宿主基因组的同源重组。虽然可能优选的是，所述臂与其靶向的基因组中的区域具有100％互补性，但是这是不必要的，条件是所述序列充分互补以允许与所关注遗传区域的靶向重组。通常，所述臂将具有将允许在严格条件下与目标区域杂交的同源性水平，如Sambrook等(分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A laboratorymanual),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989)中所限定。如本领域技术人员将理解，所述同源臂可被设计成与基因组内彼此相邻或通过一个或多个核苷酸彼此间隔的核酸序列杂交。

考虑到给定亲本微生物的公开可用的序列信息，本领域技术人员将能够容易地设计足以允许靶向同源重组的同源臂。示例性信息提供于下文实施例部分中。

质粒还可包含一个或多个其他元件，包括一个或多个调控元件、一个或多个复制起点、一个或多个多克隆位点以及其他元件。在一个特定实施方案中，所述质粒适于允许例如亲本微生物的天然(或至少已经存在的)基因的破坏。在另一个实施方案中，所述质粒适于允许由所述质粒编码的一种或多种基因的整合和表达。所述质粒可呈裸核酸以及用促进向细胞递送的一种或多种药剂配制的核酸(例如，脂质体结合核酸，它是一种其中含有核酸的生物体)形式。

如上文所述，苯丙氨酸tRNA合成酶由两个亚基构成，其中一种是PheS。第二亚基可存在于有待转化的亲本微生物的基因组中。因此，在本发明载体的存在下，微生物能够产生苯丙氨酸tRNA合成酶，即使一种已变异并且能够使用苯丙氨酸类似物来氨基酰化tRNA。另外，虽然变异PheS可能是基于如本文先前所述的来自任何生物体的PheS，但是在一个优选实施方案中它应该是与由亲本微生物表达的另一个亚基相容者。如果所述亚基不相容，则它们将不会形成功能性酶。本领域技术人员将容易地能够使用如上文所述用于测试酶的活性和功能的标准测定法来鉴定苯丙氨酸tRNA合成酶亚基是否相容。然而，本发明人预期来自任何梭菌属的PheS将与来自任何其他梭菌属的PheT亚基相容。在一个特定实施方案中，所述PheS亚基是来自与亲本微生物相同的梭菌物种。在一个特定实施方案中，变异PheS是基于由有待转化的亲本微生物表达的苯丙氨酸tRNA合成酶的PheS。在另一个实施方案中，本发明的质粒还可包括编码PheT亚基的核酸，其与变异PheS一起形成活性苯丙氨酸tRNA合成酶，虽然变异PheS能够使用苯丙氨酸类似物来氨基酰化tRNA。例如在亲本微生物不含编码PheT亚基的核酸时，这可能是有用的。

质粒可能是复制的或非复制的。

可使用本领域中任何数目的标准技术来构建用于本发明中的核酸载体。例如，可使用化学合成或重组技术。这些技术描述于例如Sambrook等(分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A laboratory manual),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989)中。其他示例性技术描述于下文实施例部分中。基本上，单独的核酸(包括编码反向选择标记的核酸、编码正向选择标记的核酸、同源臂、所关注核酸和任选地其他核酸)将可操作地彼此连接，以使得它们可执行其所希望的功能。

本领域中已知的多种质粒载体中的任一种可适用于本发明中。然而，举例来说，来自PMTL80000系列的载体将是合适的。特定实例提供于下文实施例部分中。

在本发明的某些实施方案中，核酸载体是适于产生或克隆编码本发明的ThiK或变异PheS的核酸的核酸载体。在这种情况下，所述载体无需改适以表达ThiK或变异PheS。可使用任何数目的已知核酸载体，包括质粒和病毒载体。如本领域技术人员所知，这些载体可包括一个或多个调控元件、复制起点、多克隆位点和/或可选择标记，以及其他元件、位点和标记。

细胞

本发明还提供包含本发明核酸、载体、根据本发明的PheS和/或ThiK的细胞。所述细胞可能具有任何来源并且可包括用于克隆或制备根据本发明的载体的细胞。在一个实施方案中，所述细胞是大肠杆菌或梭菌属。

方法

如上文所述，本发明提供用于从亲本微生物产生重组微生物的方法。所述方法一般包括至少如下步骤：用如上文所述的质粒转化亲本微生物，选择表达至少一个正向选择标记的一种或多种微生物，和选择不表达至少一个反向选择标记的一种或多种微生物。

可使用本领域已知用于产生重组微生物的任何数目的技术用本发明质粒转化亲本微生物。仅举例来说，可通过电穿孔、电融合、超声处理、聚乙二醇介导的转化、化学或自然感受态、原生质体转化、原噬菌体诱导或结合来实现转化(包括转导或转染)。合适的转化技术描述于例如Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T:分子克隆：实验室手册(MolecularCloning:A laboratory Manual),Cold Spring Harbour Laboratory Press,Cold SpringHarbour,1989中。

仅举例来说，电穿孔已描述用于若干一氧化碳营养型产乙酸菌如永达尔梭菌(等,2010,美国科学院院刊(Poc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.)107:13087-92；Leang等,2012,应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)；PCT/NZ2011/000203；WO2012/053905)和合成气发酵梭菌(PCT/NZ2011/000203；WO2012/053905)并且是用于许多梭菌如丙酮丁醇梭菌(Mermelstein等,1992,生物技术(Biotechnology),10,190-195)、解纤维梭菌(Jennert等,2000,微生物学(Microbiology),146:3071-3080)或热纤梭菌(Tyurin等,2004,应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)70:883-890)中的标准方法。

作为其他实例，电融合已描述用于产乙酸梭菌属MT351(Tyurin和Kiriukhin,2012,生物技术杂志(J Biotech):1-12)。

另一种示例性技术包括描述由于一氧化碳营养型产乙酸菌如粪味梭菌的原噬菌体诱导(Prasanna Tamarapu Parthasarathy,2010,用于产生突变体的粪味梭菌ATCC25775中的遗传修饰系统的开发(Development of a Genetic Modification System inClostridium scatologenes ATCC 25775for Generation of Mutants),Masters ProjectWestern Kentucky University)。

作为其他实例，可使用Herbert等,2003,(FEMS Microbiol.Lett.229:103-110)和Williams等,1990(J.Gen.Microbiol.136:819-826)的结合方法。

应理解，所述质粒可以裸核酸形式递送至亲本微生物或者可用一种或多种药剂配制以促进转化过程(例如，脂质体结合核酸，这是一种其中含有核酸的生物体)。

在某些实施方案中，由于在有待转化的微生物中具活性的限制系统，有必要将有待引入微生物中的任何核酸(例如本发明的质粒)甲基化。这可使用多种技术(包括下文描述的那些)来进行。

举例来说，在一个实施方案中，本发明的重组微生物是通过包括以下步骤的方法产生的：

-向穿梭微生物中引入：(i)有待引入如本文所述的亲本微生物中的至少一个质粒，和(ii)包含甲基转移酶基因的甲基化构建体/载体；

-所述甲基转移酶基因的表达；

-从所述穿梭微生物分离所述至少一个质粒；和

-将所述至少一个质粒引入目标微生物中。

在一个实施方案中，所述甲基转移酶基因是组成型表达的。在另一个实施方案中，所述甲基转移酶基因的表达是诱导型。

所述穿梭微生物是一种微生物，优选是限制性酶阴性微生物，其促进构成本发明质粒的核酸序列的甲基化。在一个特定实施方案中，所述穿梭微生物是限制性酶阴性大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)或乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。

所述甲基化构建体/载体包含编码甲基转移酶的核酸序列。

一旦一个或多个质粒和甲基化构建体/载体被引入穿梭微生物中，就会诱导在甲基化构建体/载体上存在的甲基转移酶基因。诱导可能是通过任何合适的启动子系统，但是在本发明的一个特定实施方案中，甲基化构建体/载体包含诱导型lac启动子并且通过添加乳糖或其类似物、更优选地异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导。其他合适的启动子包括ara、tet或T7系统。在本发明的另一个实施方案中，甲基化构建体/载体启动子是组成型启动子。

在一个特定实施方案中，所述甲基化构建体/载体具有对穿梭微生物身份具特异性的复制起点，以使得所述甲基化构建体/载体上存在的任何基因在所述穿梭微生物中表达。

甲基转移酶的表达导致有待引入亲本微生物的一个或多个质粒上存在的基因的甲基化。然后可根据多种已知方法中的任一种从所述穿梭微生物分离所述质粒。例如，可根据制造商的说明书使用市售试剂盒如Qiagen或Zymo。

在一个特定实施方案中，同时分离甲基化构建体/载体与本发明的一个或多个质粒。

可使用任何数目的已知方法将指定用于亲本微生物的一个或多个质粒引入所述微生物中。然而，举例来说，可使用在上文或下文实施例部分中所述的方法。

可以设想，甲基转移酶基因可引入穿梭微生物中并且过度表达。因此，在一个实施方案中，可使用已知方法收集所得甲基转移酶并且在体外用于甲基化有待引入亲本微生物中的一个或多个质粒中。所述一个或多个质粒然后可引入目标(亲本)微生物中。在另一个实施方案中，将甲基转移酶基因引入穿梭微生物的基因组中，接着将指定用于亲本微生物的一个或多个质粒引入穿梭微生物中，从所述穿梭微生物分离所述一个或多个质粒，然后将所述一个或多个质粒引入目标(亲本)微生物中。

可以设想，指定用于亲本微生物的一个或多个质粒和如上文所定义的甲基化构建体/载体可组合以提供物质组合物。这种组合物在阻遏限制屏障机制以产生本发明的重组微生物中具有特别效用。

在一个特定实施方案中，所述甲基化构建体/载体是质粒。

本领域技术人员应了解用于产生根据本发明的微生物的多种合适的甲基转移酶。然而，举例来说，可使用枯草芽孢杆菌噬菌体ΦT1甲基转移酶和WO2012053905中描述的甲基转移酶。考虑到所希望的甲基转移酶的序列和遗传密码，将容易地理解编码合适的甲基转移酶的核酸。

可使用适于允许甲基转移酶基因表达的任何数目的构建体/载体来产生甲基化构建体/载体。然而，举例来说，可使用WO2012053905中提及的那些。

一旦质粒已引入所希望的亲本微生物中，则发生第一次选择。这涉及选择表达至少一个正向选择标记的一种或多种微生物。

考虑到所使用的正向选择标记，可使用任何数目的已知技术来鉴定和选择这些微生物。然而，作为一般实例，所述微生物可在含有毒素的培养基中或其上培养，所述毒素将杀死不表达正向选择标记的任何微生物。作为特定实例，所述微生物可在毒性抗生素存在下生长，其中本发明的质粒包括编码赋予微生物以抗生素抗性的产物的核酸。其中存在质粒的那些微生物将存活并且不存在质粒的那些微生物将死亡。

在选择表达正向选择标记的微生物中使用的方法和条件的其他实例描述于例如Sambrook等,1989(如本文先前所述)中。其他实例提供于下文实施例部分中。

本发明的方法还包括第二次选择。这涉及选择不表达至少一个反向选择标记的一种或多种微生物。

在使用ThiK作为反向选择标记的情况下，不表达这种反向选择标记的一种或多种微生物的选择包括在含有鸟苷类似物的培养基中或其上培养所述微生物。在一个特定实施方案中，所述鸟苷类似物是更昔洛韦(ganciclovir)。含有并表达编码ThiK反向选择标记的核酸的那些微生物在鸟苷类似物存在下将不会存活。因此，存活的那些微生物选择为已经历所希望的双交叉重组事件。

在使用变异PheS作为反向选择标记的情况下，不表达这种反向选择标记的一种或多种微生物的选择包括在含有苯丙氨酸类似物的培养基中或其上培养所述微生物。在一个特定实施方案中，苯丙氨酸类似物是如上文所示例。含有并表达编码变异PheS反向选择标记的核酸的那些微生物在苯丙氨酸类似物存在下将不会存活。因此，存活的那些微生物被选择为已经历所希望的双交叉重组事件。

当使用变异PheS作为反向选择标记时，可能需要在培养基中还包括苯丙氨酸。

本发明的方法包括同时和连续的选择步骤。例如，可使用正向选择标记关于单交叉事件选择微生物并且随后使用反向选择标记关于双交叉事件选择微生物。可选地，正向选择和反向选择可同时发生。作为实例，在编码正向选择标记的核酸位于同源臂外部的质粒载体上时，可连续地选择单交叉事件，然后反向选择，选择双交叉事件。作为其他实例，在编码正向选择标记的核酸位于同源臂之间(并且因此整合至亲本微生物的基因组中)时，正向选择和反向选择可同时发生；具有整合至基因组中的正向选择标记并且抵抗反向选择标记的任何细胞将发生双交叉事件。

适于培养一种或多种微生物的任何培养基可用于本发明的方法中。基于公开信息并考虑到本发明的性质和本文所述的亲本微生物，本领域技术人员将容易地了解适当的培养基。优选地，所述培养基将是其中存在很少或不存在苯丙氨酸或者至少苯丙氨酸水平不超过在反向选择期间的苯丙氨酸类似物的培养基。举例来说，任何适当的基本培养基将是合适的，例如：梭菌基本培养基、基本确定培养基(MDM)、补充确定培养基(SDM)和完全确定培养基(CDM)。特定实施例提供于下文实施例部分中。

一旦根据本发明选择一种或多种微生物，就可使用已知方法将其培养并任选地储存以供未来使用。

现在将参考以下实施例仅举例描述本发明。

实施例

以下实施例描述用于反向选择性标记HSV-Tk和PheS*的质粒的构建，用于在合成气发酵梭菌中反向选择的HSV-Tk和PheS*的功能性，和HSV-Tk和PheS*用于促进在合成气发酵梭菌的基因组上的同源重组基因安置的用途。相同原理也可应用于其他梭菌家族成员，因为在任何所测序梭菌中不存在HSV-Tk基因的同源物并且pheS基因或梭菌物种是高度保守的。

标准重组DNA和分子克隆技术被用于本发明中并且由Sambrook等,1989和Ausubel等,1987描述。使用大肠杆菌菌株TOP10(Life Technologies)和合成气发酵梭菌DSM10061和DSM23693(DSM10061的衍生物)。如由Sambrook等,1989和Ausubel等,1987所述使大肠杆菌在LB和SOB培养基中生长，而使合成气发酵梭菌在厌氧PETC培养基(表1)中生长。

表1：PETC培养基(ATCC培养基1754；atcc.org/Attachments/2940.pdf)

培养基组分	每1.0L培养基的浓度
		NH₄Cl	1g
KCl	0.1g
		MgSO₄.7H₂O	0.2g
NaCl	0.8g
		KH₂PO₄	0.1g
CaCl₂	0.02g
		痕量金属溶液	10ml
Wolfe维生素溶液	10ml
		酵母提取物	1g
刃天青(2g/L储备液)	0.5ml
		MES	2g
还原剂	0.006-0.008％(v/v)
		蒸馏水	补足1L，pH 5.5(用HCl调节)

痕量金属溶液	每L储备液
		次氮基三乙酸	2g
MnSO₄.H₂O	1g
		Fe(SO₄)₂(NH₄)₂.6H₂O	0.8g
CoCl₂.6H₂O	0.2g
		ZnSO₄.7H₂O	0.2mg
CuCl₂.2H₂O	0.02g
		NaMoO₄.2H₂O	0.02g
Na₂SeO₃	0.02g
		NiCl₂.6H₂O	0.02g
Na₂WO₄.2H₂O	0.02g
		蒸馏水	补足1L
还原剂储备液	每100mL储备液
		NaOH	0.9g
盐酸半胱氨酸	4g
		Na2S	4g
蒸馏水	补足100mL

实施例1：用于在合成气发酵梭菌中反向选择的HSV-Tk和PheS*的功能性

质粒的构建：

含有Hsv-tk的质粒的构建：人类疱疹病毒胸苷激酶(Hsv-tk)的DNA序列获自NCBI(核酸和氨基酸)。Hsv-tk基因中的密码子经过优化以适应合成气发酵梭菌并通过GeneArt合成并在其标准载体pMK-RQ(Seq.ID.1–pMK-RQ-HSV-tk)中递送。

通过用Nde1和Nhe1限制酶(New England Biolabs)消化从pMK-RQ载体释放HSV-tk并且克隆到修饰形式的大肠杆菌-梭菌穿梭载体pMTL83151(FJ797651.1；Nigel Minton,University of Nottingham；Heap等,2009)(其被称为pMTL83155(SEQ ID 3))中，介于大肠杆菌菌株TOP10(Life Technologies)的相同位点之间以产生pMTL83155-Hsv-tk(Seq.ID.2，图1)。所述pMTL83155质粒在Not1与Nde1位点之间含有合成气发酵梭菌磷酸酯乙酰转移酶基因的启动子序列(Seq.ID.3)。

突变pheS*的构建：在来自合成气发酵梭菌DSM 10061的序列(Seq.ID.12)的基因组中鉴定天然pheS。通过利用序列比对来比较大肠杆菌MG1655(Seq.ID.13)与合成气发酵梭菌的pheS的序列，基于大肠杆菌的G284与G298之间的氨基酸的氨基酸序列(来自大肠杆菌MG1655的PheS的氨基酸序列是SEQ ID 20)与合成气发酵梭菌的氨基酸G301和G315的同源性来鉴定假定底物特异性位点(图3)。在碱基932处引入单点突变，用G取代C，导致编码甘氨酸而非丙氨酸的密码子(Seq.ID.14)。

含有pheS*的质粒的构建：将修饰pheS*与起始密码子上游的合成启动子和RBS位点(PpheS*；Seq.ID.17)转录偶联以允许高组成型表达。所述构建体还侧接PmeI限制位点以实现基因克隆到可选载体中。通过GeneArt进行合成并利用限制酶PmeI亚克隆到载体pMTL85151中，产生最终载体pMTL85151-pheS*(Seq.ID.18；图4)。

敏感性测试：

DL-4-氯苯丙氨酸的毒性测试：使大肠杆菌Top10和带有空载体pMTL85151的合成气发酵梭菌DSM23693最初在DL-4-氯苯丙氨酸存在下在平板上和在液体培养基中生长以确定反向选择标记是否对生物体生长具有任何影响。注意到，化学物质不阻碍生物体在液体培养基中或在平板上的生长并且对于大肠杆菌和合成气发酵梭菌来说菌落在24/48小时后分别生长至相同尺寸。

测试大肠杆菌中的pheS*：为了测试反向选择标记在大肠杆菌中起作用的能力，将质粒pMTL85151-pheS*转化至TOP10中并且仅在氯霉素选择下生长。一旦培养已达到OD为0.5，代表指数生长期，将100ul涂在含有氯霉素和DL-4-氯苯丙氨酸以及仅具有氯霉素作为对照的LB平板上，一式三份，并且在37℃下温育24小时。在24小时后，检查平板并且注意到，在仅氯霉素平板上，如预期存在大菌落的菌苔，然而在含有氯霉素和DL-4-氯苯丙氨酸的平板上，存在小菌落的淡阴影(light shading)，这表明DL-4-氯苯丙氨酸影响带有pMTL85151-pheS*的大肠杆菌的生长。在36小时后，双重选择平板已经向外生长至与仅氯霉素平板相同的水平。

合成气发酵梭菌的转化和质粒的确定：

合成气发酵梭菌的转化：如WO2012053905中所述将pMTL83155、pMTL83155-Hsv-tk和pMTL85155-PheS质粒引入合成气发酵梭菌DSM23693(DSM10061的衍生物)中。在PETC肉汤中进行向外生长并且在补充有15μg/ml甲砜霉素(Sigma)和10μg/ml甲氧苄啶(Sigma)的PETC-琼脂培养基上扩展。在具有48％CO、2％H2、20％CO2、30％N2的20psi气体混合物的加压气体罐中在37℃下温育3天后观测到菌落。在含有15μg/ml甲砜霉素的PETC-琼脂培养基上进行单菌落的划线。

针对质粒的存在筛选转化株：通过PCR使用跨越pMTL83155和pMTL83155-Hsv-tk中的革兰氏阳性复制子和catP正向选择标记的引物repHf(Seq.ID.4)和catr(Seq.ID.5)针对pMTL83155和pMTL83155-Hsv-tk质粒的存在随机筛选来自LZ-pMTL83155和LZ-pMTL83155-hsv-tk转化结合子的2个菌落。未被修饰的合成气发酵梭菌用作这些PCR中的对照。将Maxime PCR PreMix试剂盒用于PCR。也使用引物fD1(Seq.ID.6)和rP2(Seq.ID.7)和MaximePCR PreMix试剂盒从这些转化株对16s rDNA进行PCR扩增。

利用repHF和catR引物的PCR从LZ-pMTL83155-1和LZ-pMTL83155-2以及LZ-pMTL83155-hsv-tk-1和LZ-pMTL83155-hsv-tk-2扩增约1.5kb条带(图2)。从未被修饰的合成气发酵梭菌样品未检测到扩增，证实仅在转化株中存在质粒。对于来自LZ-pMTL83155-1(Seq.ID.8)和LZ-pMTL83155-2(Seq.ID.9)以及LZ-pMTL83155-hsv-tk-1(Seq.ID.10)和LZ-pMTL83155-hsv-tk-2(Seq.ID.11)的16s rRNA的测序进一步证实克隆为合成气发酵梭菌。

在三个独立的菌落上使用对质粒具特异性的PCR引物(Seq.ID.15和16)以及引物fD1(Seq.ID.6)和rP2(Seq.ID.7)对16s rRNA测序来确定带有质粒pMTL85151-pheS*的合成气发酵梭菌转化株。

HSV-Tk和PheS*作为合成气发酵梭菌中的反向选择性标记的功能性：

合成气发酵梭菌转化株对更昔洛韦的敏感性：通过将LZ-pMTL83155和LZ-pMTL83155-hsv-tk涂在仅含有20nM更昔洛韦的PETC琼脂培养基和含有20nM更昔洛韦和15μg/ml甲砜霉素的PETC琼脂培养基上来测试其对更昔洛韦的敏感性。仅对于LZ-pMTL83155转化株而非对于LZ-pMTL83155-hvs-tk，在更昔洛韦平板上观测到菌落(表2)。Hvs-tk基因的存在赋予更昔洛韦以毒性。

带有质粒pMTL85151-pheS*的合成气发酵梭菌对DL-4-氯苯丙氨酸的敏感性：使带有pMTL85151-pheS*的合成气发酵梭菌DSM23693以及带有pMTL85151的合成气发酵梭菌DSM23693的三种独立转化株在补充有甲砜霉素的液体PECT培养基中生长并且在37℃下在仅CO条件下生长。在24小时后，将各100ul的三种独立转化株以及对照pMTL85151涂在补充有仅甲砜霉素或者甲砜霉素和DL-4-氯苯丙氨酸的PETC-MES琼脂中并温育48小时。在48小时后，检查平板并且仅含有甲砜霉素的平板对于所有4种菌株都具有菌落的菌苔，而仅含有双重选择的平板对于含有pheS*的各独立转化株具有3、4和7个菌落，相比之下，带有pMTL85151的合成气发酵梭菌转化株显示与仅甲砜霉素平板相同的结果，表明DL-4-氯苯丙氨酸对这种菌株不具有影响。

表2：在相应CSM存在下合成气发酵梭菌转化结合子对不同前药的敏感性

这显示HSV-Tk和PheS*与前药更昔洛韦和DL-4-氯苯丙氨酸组合可有效用于在合成气发酵梭菌中反向选择。

实施例2-PheS*促进在合成气发酵梭菌的基因组上同源重组基因安置的用途

本实施例描述通过由PheS*作为具有失活的仲醇脱氢酶的合成气发酵梭菌DSM23693中的反向可选择标记促进的同源重组用来自肺炎克雷伯菌的S特异性2,3-丁二醇脱氢酶基因置换天然合成气发酵梭菌R特异性2,3-丁二醇脱氢酶基因。

具有失活的仲醇脱氢酶的合成气发酵梭菌DSM23693菌株的构建

使用ClosTron系统(Heap等,2007)构建具有失活的仲醇脱氢酶(SEQ ID NO:55)的合成气发酵梭菌DSM23693菌株。将ClosTron.com网站上的内含子设计工具用来设计344bp打靶区域(SEQ ID NO:56)，以及鉴定有义和反义链上的六个目标位点(图8)。在含有逆移位激活ermB标记(RAM)的载体pMTL007C-E2中化学合成打靶区域。

如WO2012/053905中所述将载体引入合成气发酵梭菌DSM23693中。将在含15μg/ml甲砜霉素的PETC MES上生长的单菌落在含5μg/ml氯霉素的PETC MES上划线。从每个靶标随机挑取菌落，并且使用侧接引物155F(SEQ ID NO:57)和939R(SEQ ID NO:58)针对插入进行筛选。使用iNtron Maxime PCR预混物进行扩增。783bp的PCR产物指示野生型基因型，而约2.6kb的产物大小表明II组内含子插入目标位点中(图9)。通过抗性标记(catP)的扩增和革兰氏阳性复制起点(pCB102)来检查质粒损失。这种菌株被用作基础菌株，通过由PheS*促进的同源重组用来自肺炎克雷伯菌的S特异性2,3-丁二醇脱氢酶基因置换天然合成气发酵梭菌R特异性2,3-丁二醇脱氢酶基因。

质粒pPheS-ErmB的构建。利用引物PheS-repH-F(SEQ ID No.28)和traJ-ermB-R(SEQ ID No.29)从pMTL85151-PheS*(Seq ID No.18)扩增含有PheS*盒(Seq.ID 27)和具有traJ的ColE1(Seq ID No.26)的片段。使用引物RepH-ermB-F(SEQ ID No.31)和RepH-pheS-R(SEQ ID No.32)从pMTL80000系列(Heap等,2009)扩增含有pCB102复制起点(Seq IDNo.30)的片段。使用引物ermB-traJ-F(SEQ ID No.34)和ermB-repH-R(SEQ ID No.35)从pMTL80000系列(Heap等,2009)扩增红霉素抗性盒(SEQ ID No.33)。所述PCR产物含有重叠以促进无缝组装。使用来自Life Technologies的GENEART无缝克隆和组装试剂盒将它们组装。通过限制性消化和片段分析证实所得质粒pPheS*-ErmB。

用于同源重组的质粒部分的PCR扩增。使用引物AM015(SEQ ID No.37)和AM035(SEQ ID No.38)从pPheS*-ErmB(SEQ ID No.36)扩增含有PheS*(SEQ ID No.27)的载体骨架。使用引物AM016(SEQ ID No.40)和AM017(SEQ ID No.41)从合成气发酵梭菌基因组DNA扩增上游同源臂(SEQ ID No.39)。使用引物AM018(SEQ ID No.43)和AM019(SEQ IDNo.44)，从pMTL85141-P-alsS-budA-budC(Kopke等,2014)扩增肺炎克雷伯菌丁二醇脱氢酶基因(SEQ ID No.42)。使用引物AM020(SEQ ID No.46)和AM021(SEQ ID No.47)从pMTL80000系列(Heap等,2009)扩增氯霉素乙酰转移酶表达盒(SEQ ID No.45)。使用引物AM022(SEQ ID No.49)和AM036(SEQ ID No.50)从合成气发酵梭菌基因组DNA扩增下游同源臂(SEQ ID No.48)。

用于同源重组的含有pheS*的质粒的构建。上述PCR产物含有重叠以促进无缝组装。使用来自Life Technologies的GENEART无缝克隆和组装试剂盒将它们组装。通过限制性消化和片段分析证实所得质粒pPheS*-CaBDHXXKpBDH。

质粒引入、反向选择和整合筛选。如WO2012053905中所述将pPheS*-CaBDHXXKpBDH引入如上所述在位置287处具有ClosTron失活仲醇脱氢酶的合成气发酵梭菌DSM23693菌株中。通过转化株在补充有15μg/ml甲砜霉素(Sigma)和10μg/ml甲氧苄啶(Sigma)的PETC-琼脂培养基上生长的能力来选择转化株。为了选择成功的同源重组双交叉，在补充有15μg/ml甲砜霉素和2mg/ml对氯苯丙氨酸的PETC-琼脂培养基上将菌落再划线。通过用侧接同源臂外部的整合位点的引物AM041(SEQ ID No.51)和AM042(SEQ ID No.52)进行的PCR针对整合筛选生长的菌落。相比于野生型的3137个碱基对，成功的整合鉴定为得到长度为3570个碱基对的PCR产物(图7)。通过Sanger测序对PCR产物进行保真度测序并且发现其确切地为预期插入序列，这证实由pheS*反向选择性标记促进的片段的成功整合。

表3-实施例2中使用的引物

相同策略和质粒也可应用于永达尔梭菌或拉氏梭菌。已描述了转化方案(WO2012/053905)(Leang,Ueki,Nevin和Lovley,2012)。

本文已关于某些优选实施方案描述了本发明，以使得读者能够在无过度实验的情况下实施本发明。然而，本领域普通技术人员将容易地认识到，在不偏离本发明的范围的情况下，许多组分和参数可在特定程度上改变或修改或者取代已知等效物。应理解，这些修改和等效物如同单独地阐述一样并入本文中。提供名称、标题等来增强读者对本文件的理解，而不应理解为限制本发明的范围。

上文和下文引用的所有申请、专利和出版物的整个公开内容(如果存在的话)特此以引用的方式并入。然而，在本说明书中对于任何申请、专利和出版物的提及不是并且不应该被理解为承认或以任何形式表明：它们构成有效的现有技术或构成世界上任何国家的公知常识的一部分。

在整个本说明书和以下任何权利要求中，除非上下文另外需要，否则词语“包含”等应在与排他性意义相反的包括性意义上理解，也就是说，在“包括但不限于”的意义上理解。

Claims

1.一种修饰的苯丙氨酸tRNA合成酶(PheS)，其使用苯丙氨酸类似物来氨基酰化tRNA，其中所述修饰的PheS在相对于野生型合成气发酵梭菌的氨基酸位置311的氨基酸位置处包括甘氨酸而非丙氨酸；条件是PheS仍然能够执行其所希望的功能；其中所述苯丙氨酸类似物选自氯苯丙氨酸、氟苯丙氨酸和溴苯丙氨酸。

2.如权利要求1的修饰的PheS，其中所述苯丙氨酸类似物选自DL-4-氯苯丙氨酸、对氯苯丙氨酸、对氟-L-苯丙氨酸、对氟-DL-苯丙氨酸、对溴-L-苯丙氨酸。

3.一种编码权利要求1的修饰的PheS的核酸。

4.一种用于从亲本微生物产生重组微生物的方法，所述方法包括至少以下步骤：

a)用质粒转化亲本微生物，所述质粒包含：

1.编码选自PheS和ThiK的至少一个反向选择标记的至少一个核酸序列，其中所述PheS在相对于野生型合成气发酵梭菌的氨基酸位置311的氨基酸位置处包括甘氨酸而非丙氨酸，以使得在使用中苯丙氨酸tRNA合成酶能够使用苯丙氨酸类似物来氨基酰化tRNA；其中所述苯丙氨酸类似物选自氯苯丙氨酸、氟苯丙氨酸和溴苯丙氨酸；

2.编码至少一个正向选择标记的至少一个核酸序列；和

5.如权利要求4的方法，其中所述方法还包括针对修饰的PheS的表达进行选择。

6.如权利要求5的方法，其中所述针对修饰的PheS的表达而进行的选择包括在苯丙氨酸类似物的存在下培养重组微生物。

7.如权利要求4的方法，其中所述苯丙氨酸类似物选自DL-4-氯苯丙氨酸、对氯苯丙氨酸、对氟-L-苯丙氨酸、对氟-DL-苯丙氨酸、对溴-L-苯丙氨酸。

8.如权利要求4的方法，其中所述质粒还包括同源臂，所述同源臂允许载体与亲本微生物基因组之间的同源重组。

9.如权利要求4的方法，其中所述质粒还包括有待插入亲本基因组中的至少一个所关注核酸序列。

10.如权利要求4的方法，其中所述质粒还包括正向选择标记。

11.如权利要求10的方法，其中所述方法还包括选择正向选择标记的表达。

12.如权利要求11的方法，其中所述正向选择标记选自CatP、ErmB或TetA。

13.一种ThiK和/或PheS在从亲本微生物产生重组微生物的方法中作为反向选择标记的用途，其中所述亲本微生物是梭菌属，并且其中所述PheS在相对于野生型合成气发酵梭菌的氨基酸位置311的氨基酸位置处包括甘氨酸而非丙氨酸，以使得在使用中苯丙氨酸tRNA合成酶能够使用苯丙氨酸类似物来氨基酰化tRNA；其中所述苯丙氨酸类似物选自氯苯丙氨酸、氟苯丙氨酸和溴苯丙氨酸。